CN102659947A

CN102659947A - 新型抗cd98抗体

Info

Publication number: CN102659947A
Application number: CN2012101356743A
Authority: CN
Inventors: 田原知幸; 金井好克; 远藤仁; 片冈之郎; 长谷川和正; 吉野哲也
Original assignee: Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 2006-04-06
Filing date: 2007-04-05
Publication date: 2012-09-12
Anticipated expiration: 2027-04-05
Also published as: US9688770B2; CN101460623A; US20100143367A1; CN101460623B; PT2011869E; TWI390034B; US9051374B2; JP4324637B2; JP2009189376A; EP2011869A1; EP2011869A4; US20150307621A1; ES2489641T3; WO2007114496A1; EP2527437A1; JPWO2007114496A1; TW200808962A; CA2648618C; US8486402B2; CN102659947B

Abstract

本发明公开了与来自癌细胞的细胞膜、且与具有氨基酸转运活性的蛋白质(例如，LAT1)形成复合体的CD98具有特异性结合能力的人抗体或其功能性片段。该抗体与在癌细胞表面与LAT1形成二聚体的CD98结合，使用ADCC或CDC的免疫系统对表达CD98的癌细胞特异性攻击，并且抑制经LAT1介导的癌细胞对氨基酸的摄取，由此抑制其增殖。本发明继而提供含有该抗体或其抗体片段的、作用于多种癌症、或对癌为特异性的、没有副作用的癌症的预防或治疗药。

Description

新型抗CD98抗体

本申请为分案申请，原申请的申请日为2007年4月5日，申请号为200780021089.8(PCT/JP2007/057680)，发明名称为“新型抗CD98抗体”。

相关申请的参照

本专利申请主张享有在先申请的日本国专利特愿2006-105013号(申请日：2006年4月6日)的优先权。日本特愿2006-105013号的全部公开内容均通过引用的方式成为本说明书的一部分。

发明背景

本发明是涉及独立行政法人科学技术振兴机构的“氨基酸转运蛋白抗体抗癌药物”相关新技术开发委托中的开发成果的发明。

技术领域

本发明涉及与来自癌细胞的细胞膜、且与具有氨基酸转运活性的蛋白质形成复合体的CD98具有特异性结合能力的单克隆抗体、以及使用该抗体的肿瘤生长抑制或癌症治疗的药物用途。

背景技术

癌症(恶性肿瘤)在日本占死亡原因的第一位。其患者数目逐年增加，强烈需求有效性和安全性高的药物或治疗方法的开发。目前的抗癌药常常是特异性杀死癌细胞的能力低，也作用于正常的细胞，引起较多的药物有害反应。近年来，以在癌细胞中高表达的分子(癌相关抗原)为靶的抗癌药物的开发得到进展，在白血病、乳癌、肺癌等中成为有效的治疗手段。

与在细胞的细胞膜上表达的癌相关抗原特异性结合的抗体经由抗体依赖性细胞毒活性(ADCC)或补体依赖性细胞毒活性(CDC)等介导的免疫反应攻击癌细胞，或者抑制癌细胞生长所必须的细胞生长信号传递，对癌症治疗有效。

但是，抗体可在治疗中涉及的癌症种类仅限于乳癌、难治性慢性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病等的癌症种类，另外，一种抗体可以应用于多种癌症种类治疗的抗体尚未出现。因此，人们需求可以与多种癌细胞强烈结合、具有抗癌活性的抗体的获得。

CD98(4F2)是已知在多种癌细胞中高表达的、含有529个氨基酸残基、约80kDa的II型跨膜糖蛋白链。CD98通过二硫键与具有氨基酸转运活性的约40kDa的蛋白质形成异源二聚体，在细胞膜上表达。作为可能与CD98结合的氨基酸转运蛋白已知有6种。CD98鉴定为淋巴细胞的活化抗原，与细胞生长信号传递、整联蛋白的活化、细胞融合等很多生物学功能有关(Haynes B.F.等人.，J.Immunol.，(1981)，126，1409～1414；Lindsten T.等人.，Mol.Cell Biol.，(1988)，8，3820～3826；Teixeira S.等人.，Eur.J.Biochem.，(1991)，202，819～826；L.A.Diaz Jr.等人.，J Biol Regul Homeost Agents，(1998)12，25～32)。

癌细胞为了确保生长的优势而具有各种机理。例如，癌细胞为了比周围细胞优先摄入生长所必要的必需氨基酸而过量表达中性氨基酸转运蛋白即是其中一种。近年来，在癌细胞中特异性高表达的氨基酸转运蛋白——L型氨基酸转运蛋白1(LAT1)已得到克隆(Kanai等人.，J.Biol.Chem.(1998)，273，23629～23632)。LAT1与CD98形成复合体，钠离子非依赖性地转运亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、组氨酸等具有大型的支链的中性氨基酸。还已知LAT1在除脑、胎盘、骨髓、睾丸之外的几乎所有正常组织中虽然表达低或未见表达，但在结肠直肠癌、胃癌、乳癌、胰腺癌、肾癌、喉头癌、食道癌、肺癌等人恶性肿瘤组织中与CD98一起表达亢进(Yanagida等人.，Biochem.Biophys.Acta，(2001)，1514，291～302)。如果降低LAT1的表达、抑制氨基酸的摄入，则可以抑制肿瘤的生长，这在癌症移植小鼠模型中有报道(日本特开2000-157286号公报)，可以认为抑制LAT1的活性有望作为癌症的治疗方法。

关于人CD98的抗体，报道的有通过将人CD98表达细胞株免疫小鼠等非人哺乳动物而制备的小鼠单克隆抗体(上述文献Haynes等人，Masuko T.等人.，Cancer Res.，(1986)，46，1478～1484，以及FreidmanAW等人.，Cell.Immunol.，(1994)，154，253～263)。但是，这些抗CD98抗体是否抑制LAT1的氨基酸摄取则尚未所知。并且，LAT1的细胞内区域的抗体虽已获得，但是可以与活细胞膜上的LAT1结合的抗体尚未见报道。因此，如果可以获得与在癌细胞膜上表达的CD98或LAT1结合、抑制LAT1的氨基酸摄取的抗体，则可以得到广范围的癌症的优异的治疗药物。

发明内容

本发明人等成功地获得了与CD98具有特异性结合能力的抗体，该CD98来自癌细胞的细胞膜、且与具有氨基转运活性的蛋白质形成复合体。该抗体具有抑制癌细胞生长的作用，因此利用该性质，可用作药物组合物的有效成分，更具体地说，可用作肿瘤的预防或治疗药的有效成分。本发明基于上述发现完成。

本发明的目的在于提供与CD98具有特异性结合能力的人抗体及其功能性片段，其中，该CD98来自癌细胞的细胞膜、且与具有氨基酸转运活性的蛋白质形成复合体。

本发明的目的还在于提供以上述本发明的人抗体及其功能性片段作为有效成分的药物组合物或肿瘤的预防或治疗药。

本发明的人抗体及其功能性片段的特征在于：与CD98具有特异性结合能力，其中，该CD98来自癌细胞的细胞膜、且与具有氨基酸转运活性的蛋白质形成复合体。

本发明的药物组合物或肿瘤的预防或治疗药含有上述本发明的人抗体或其功能性片段作为有效成分。

附图简述

图1是表示人抗CD98单克隆抗体与表达人CD98/人LAT1的CT26细胞株的结合性的图。

图2A是表示人抗CD98单克隆抗体与表达人CD98的L929细胞株的结合性的图。

图2B是表示人抗CD98单克隆抗体与表达人CD98的L929细胞株的结合性的图。

图3是表示人抗CD98单克隆抗体与经衣霉素处理的K562人细胞株的结合性的图。

图4A是表示人抗CD98单克隆抗体与表达各种小鼠、人嵌合体CD98的L929细胞株的结合性的图。

图4B是表示人抗CD98单克隆抗体与表达各种小鼠、人嵌合体CD98的L929细胞株的结合性的图。

图5是表示人抗CD98单克隆抗体对抑制T24人膀胱癌细胞株的氨基酸摄取的活性的图。

图6A是表示人抗CD98单克隆抗体与人末梢血T细胞、B细胞、单核细胞的结合性的图。

图6B是表示人抗CD98单克隆抗体与人末梢血T细胞、B细胞、单核细胞的结合性的图。

图7是表示人抗CD98单克隆抗体与PHA活化人末梢血T细胞、B细胞的结合性的图。

图8是表示人抗CD98单克隆抗体与人主动脉内皮细胞(HAEC)和人结肠直肠癌细胞株(DLD-1)的结合性的图。

图9A是表示人抗CD98单克隆抗体与各种癌细胞株的结合性的图。

图9B是表示人抗CD98单克隆抗体与各种癌细胞株的结合性的图。

图10A是表示人抗CD98单克隆抗体与各种癌细胞株的结合性的图。

图10B是表示人抗CD98单克隆抗体与各种癌细胞株的结合性的图。

图11是表示将人抗CD98单克隆抗体K3、3-69-6、C2IgG1给予移植了肿瘤细胞的裸小鼠时各小鼠中的肿瘤块的大小的图。

图12是表示对具有生长至90mm³的肿瘤的担癌小鼠以100μg/小鼠个体隔日给予三次人抗CD98单克隆抗体C2IgG1时测定肿瘤大小的结果的图。

图13是表示人抗CD98单克隆抗体K3、C2IgG1与猴细胞株COS-7的交叉反应性的图。

图14是表示在移植了伯基特淋巴瘤细胞株Ramos的担癌小鼠中，在肿瘤生长至30～140mm³之后分别以100mg/小鼠个体、以3次/周给予人抗CD98单克隆抗体C2IgG1和利妥昔单抗时测定肿瘤大小的结果的图。

图15是表示通过HPLC测定的、人抗CD98单克隆抗体C2IgG1NS氨基酸修饰抗体的纯化后的聚集物含有率的图。

图16A是表示人抗CD98单克隆抗体K3和C2IgG1、以及C2IgG1的各氨基酸修饰抗体与强制表达人CD98或人LAT1的L929细胞的结合性的图。

图16B是表示人抗CD98单克隆抗体K3和C2IgG1、C2IgG1的各氨基酸修饰抗体与人结肠直肠癌细胞株(DLD-1)、伯基特淋巴瘤细胞株(Ramos)、人结肠直肠癌细胞株(Colo205)和人主动脉内皮细胞(HAEC)的结合性的图。

发明的具体说明

微生物的保藏

本发明提供的含有编码人抗体可变区的核酸序列的质粒载体C2IgG1/pCR4和K3/pCR4分别以FERM BP-10551(用于识别的标记为：C2IgG1/pCR4)和FERM BP-10552(用于识别的标记为：K3/pCR4)于2006年3月14日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番1中央第6)。

定义

本说明书或附图中，用于标记氨基酸而使用的单一英文字母分别表示以下的氨基酸。(G)甘氨酸、(A)丙氨酸、(V)缬氨酸、(L)亮氨酸、(I)异亮氨酸、(S)丝氨酸、(T)苏氨酸、(D)天冬氨酸、(E)谷氨酸、(N)天冬酰胺、(Q)谷氨酰胺、(K)赖氨酸、(R)精氨酸、(C)半胱氨酸、(M)甲硫氨酸、(F)苯丙氨酸、(Y)酪氨酸、(W)色氨酸、(H)组氨酸、(P)脯氨酸。用于标记DNA的单一英文字母的含义分别如下。(A)腺嘌呤、(C)胞嘧啶、(G)鸟嘌呤、(T)胸腺嘧啶。

CD98及其单克隆抗体

与本发明的人单克隆抗体及其功能性片段(如无特别说明，以下在本说明书中简称为“本发明的抗体”)具有特异性结合能力的CD98，如上所述，是含有529个氨基酸残基的II型跨膜糖蛋白链，与具有氨基酸转运活性的蛋白质在细胞膜上形成异源二聚体。其中，具有氨基酸转运活性的蛋白质的优选具体例子有LAT1。根据本发明的优选方案，CD98为人CD98。人CD98的蛋白质的一级结构是公知的(SEQ IDNO.66；GenBank/EMBL/DDBJ accession No.AB018010)，人LAT1的蛋白质也是公知的(SEQ ID NO.68；GenBank/EMBL/DDBJ accessionNo.AB018009)。

本发明的抗体与来自癌细胞的细胞膜、且与具有氨基酸转运活性的蛋白质形成复合体的CD98具有特异性结合能力，而不与人正常细胞例如正常人血管内皮细胞、正常人末梢血单核细胞和淋巴细胞结合。具有结合能力的癌细胞的例子有：构成结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、黑素瘤、脑肿瘤、淋巴瘤、膀胱癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、白血病、T细胞淋巴瘤、胃癌、胰腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、头颈部扁平上皮细胞癌、皮肤癌、尿道癌、前列腺癌、绒毛癌、咽癌、喉癌、胸膜肿瘤、男性细胞瘤、子宫内膜增生症、子宫内膜异位症、胚胎瘤、纤维肉瘤、卡波济氏肉瘤、血管瘤、海绵状血管瘤、血管母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、神经纤维瘤、少突胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质细胞瘤、横纹肌瘤、胶质母细胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌瘤、甲状腺肉瘤或肾母细胞瘤等的癌细胞，更具体地说，例如有结肠直肠癌细胞株(DLD-1、Colo205、SW480、SW620、LOVO、LS180和HT29)、肺癌细胞株(H226)、前列腺癌细胞株(DU145)、黑素瘤细胞株(G361、SKMEL28和CRL1579)、非霍奇金淋巴瘤细胞株(Ramos)、膀胱癌细胞株(T24)、乳腺癌细胞株(MCF和MDA-MB-231)、胰腺癌细胞株(HS766T)、多发性骨髓瘤细胞株(IM9)、成红细胞白血病细胞株(K562)。本发明的抗体与上述各种各样的癌细胞具有结合能力，因此有利。

本发明的抗体与癌细胞的特异性结合能力使得本发明的抗体的有效性高。即，如后所述，本发明的优选方案的抗体显著抑制氨基酸摄入到经由LAT1介导的细胞内，因此只与癌细胞结合，较为有利，还可以将本发明的抗体与其它药物结合，有利地用作将药物传递至癌细胞的靶向药物。

本发明的抗体具有抗肿瘤活性。本发明的优选方案的抗体具有显著抑制氨基酸摄入到经由LAT1介导的细胞内的性质。因此，本发明的抗体的抗肿瘤活性除通过ADCC和CDC的使用免疫系统进行特异性毒性之外，通过抑制上述氨基酸的摄取也可带来该活性。根据本发明的具体方案，本发明的抗体显著抑制膀胱癌细胞株T24细胞的氨基酸摄入。

根据本发明的优选方案，本发明的抗体具有后述(a)SEQ IDNO.29和31、(b)SEQ ID NO.41和47、以及(c)SEQ ID NO.43和47中的任意一对序列作为重链可变区和轻链可变区。并且，根据另一方案，本发明的抗体具有含在质粒载体K3/pCR4(FERM BP-10552)或C2IgG1/pCR4(FERM BP-10551)中的、由来自载体pCR4的序列以外的序列编码的序列作为可变区。该方案的抗体可变区的氨基酸序列是由从上述任意的质粒载体中得到的、不含有来自载体pCR4的序列的Bg1II-BsiWI片段(轻链可变区)和SlI-NheI片段(重链可变区)所编码。

本发明的抗体的功能性片段是指与本发明的抗体特异性结合的抗原可特异性结合的抗体的片段。更具体地说，有F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、二硫键抗体(disulphide-linked FV，dsFV)、单链FV(Single-ChainFV，scFV)以及它们的聚合物等(D.J.King.，Applications andEngineering of Monoclonal Antibodies.，1998，T.J.International Ltd)。上述抗体片段可通过常用方法例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白酶进行抗体分子的消化或通过公知的遗传工程方法获得。

本发明中，“人抗体”是指作为来自人的抗体基因的表达产物的抗体。如后所述，人抗体可通过对具有导入人抗体基因座、生产来自人的抗体的能力的转基因动物给予抗原获得。该转基因动物例如有小鼠，可生产人抗体的小鼠的制备方法例如如国际公开WO02/43478号公报中所记载。

本发明的抗体也包含下述单克隆抗体：由具有在构成抗体的重链和/或轻链的各氨基酸序列中有一或多个氨基酸缺失、置换或附加所得到的氨基酸序列的重链和/或轻链形成。上述氨基酸的部分修饰(缺失、置换、插入、附加)可通过将编码该氨基酸序列的核苷酸序列部分修饰而导入到本发明的抗体的氨基酸序列中。该核苷酸序列的部分修饰可采用已知的位点特异性诱变法、按照常规方法导入(Proc Natl Acsd SciUSA.，1984，8卷，15662；Sambrook等人.，Molecular Cloning ALaboratory Manual(1989)Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press)。

根据本发明的优选方案，本发明的抗体是轻链第117号的异亮氨酸被置换为其它氨基酸残基，例如甲硫氨酸、天冬酰胺、亮氨酸或半胱氨酸。上述抗体的优选例子有：具有(d)SEQ ID NO.43和77、(e)SEQID NO.43和79、(f)SEQ ID NO.43和81、以及(g)SEQ ID NO.43和83的任意一对序列作为重链可变区和轻链可变区。

本发明的抗体也包含具有任意免疫球蛋白类和亚类的抗体，根据本发明的优选方案，是具有人免疫球蛋白类和亚类的抗体，优选的类、亚类有免疫球蛋白G(IgG)，特别是IgG1，优选的轻链是κ。

本发明的抗体也包含通过本领域技术人员周知的基因工程修饰(例如EP0314161号公报)而变换为不同的亚类的抗体。即，使用编码本发明的抗体可变区的DNA，通过基因工程方法，可获得与原有的亚类不同亚类的抗体。

ADCC是指经由在巨噬细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞等的表面表达的Fc受体介导，与抗体的恒定区结合，由此识别细胞，通过活化识别的细胞而诱导的细胞毒活性。而CDC是指通过抗体与抗原结合，由活化的补体系统引发的细胞毒活性，已经了解这些活性根据抗体的亚类不同而活性强弱各异，并且这起因于抗体的恒定区结构的不同(Charles A.Janeway，等人.Immunobiology，1997，Current BiologyLtd/Garland Publishing Inc.)。

因此，例如将本发明的抗体的亚类变换为IgG2或IgG4，则可以获得与Fc受体结合度低的抗体。相反，将本发明的抗体的亚类变换为IgG1或IgG3，则可以获得与Fc受体结合度高的抗体。希望得到上述ADCC和CDC活性时，优选抗体亚类为IgG1。

将不同的亚类抗体变换为IgG1时，例如可从抗体生成杂交瘤中只分离可变区，导入到含有人IgG1的恒定区的载体、例如N5KG1-ValLark载体(IDEC Pharmaceuticals，N5KG1(美国专利6001358))中制备。

通过将本发明的抗体恒定区的氨基酸序列进行基因工程修饰、或者与具有上述序列的恒定区序列结合，可以改变与Fc受体的结合度(参照Janeway CA.Jr.和Travers P.(1997)，Immunobiology，ThirdEdition，Current Biology Ltd./Garland Publishing Inc.)，或者可以改变与补体的结合度(参照Mi-Hua Tao，等人.，1993，J.Exp.Med)。例如，将编码重链恒定部分的EU编号系统(参照Sequences of proteins ofimmunological interest，NIH Publication No.91～3242)的第331号脯氨酸(P)的序列CCC突变为T编码丝氨酸(S)的TCC，将脯氨酸置换为丝氨酸，由此可以改变与补体的结合度。

例如，假设本发明的抗体单独没有细胞死亡诱导活性，则优选具有经Fc受体介导的抗体依赖性细胞毒活性(ADCC)或补体依赖性细胞毒活性(CDC)产生的抗肿瘤活性的抗体，如果单独的抗体具有细胞死亡诱导活性，则更优选与Fc受体的结合度低的抗体。

考虑免疫抑制药物时，优选只对T细胞和抗原呈递细胞的结合有空间位阻时等、不具有ADCC活性或CDC活性的抗体。ADCC活性或CDC活性可能成为毒性的原因时，优选通过突变Fc区域或变更亚类来避免成为毒性原因的活性的抗体。

考虑以上，如果需要，通过对不同的亚类进行基因工程修饰，则可将本发明的抗体制成通过ADCC或CDC特异性伤害癌细胞的抗体。

根据本发明的另一优选方案，本发明的抗体优选识别由人CD98的氨基酸序列(SEQ ID NO.66)中的连续或不连续的至少8个氨基酸残基构成的表位。根据本发明的更优选方案，本发明的抗体优选与人CD98的氨基酸序列中的第371～529号氨基酸的区域的一部分具有结合性，或者与第1～371号氨基酸的区域的一部分具有结合性。

根据本发明的另一方案，提供具有与人CD98和猴CD98显示交叉反应的性质的抗体作为本发明的抗体。可以想到：上述抗体在人CD98和猴CD98中识别同一或极为类似的表位结构，在对人进行临床实验之前可以以猴作为实验动物进行各种实验，因此具有优势。

CD98抗体的制备

本发明的抗体例如可通过以下所述方法制备。将细胞表面大量表达人CD98/人LAT1或其一部分、或为提高抗原的抗原性而与适当的物质(例如牛血清白蛋白等)的缀合物、或人CD98/人LAT1的细胞根据需要与免疫刺激剂(弗氏佐剂等)等一起免疫小鼠、兔、山羊、马等非人哺乳动物，或者将整合了人CD98/人LAT1的表达载体给予非人哺乳动物进行免疫致敏。本发明的抗体如下获得：从由免疫致敏动物得到的抗体生成细胞和没有自身抗体生成能力的骨髓瘤系细胞(骨髓瘤细胞)中制备杂交瘤，将杂交瘤克隆，选择可生成与免疫中使用的抗原显示特异性亲和性的单克隆抗体的克隆。

以下进一步对本发明的抗体的制备方法进行详述，抗体的制备方法并不限于此，例如可以使用脾细胞以外的抗体生成细胞和骨髓瘤细胞。

抗原可以将编码CD98的DNA整合到动物细胞用表达载体中，将该表达载体导入动物细胞，使用获得的转化细胞株本身。

CD98在很多癌细胞表面上与LAT1形成异源二聚体，因此将编码LAT1的DNA同样整合到表达载体中，使用CD98和LAT1共表达的转化细胞株作为抗原，由此，有望获得抑制LAT1的氨基酸摄入的抗体。

动物细胞用表达载体例如可使用pEGF-N1(Becton DickinsonBioscience Clontech公司制备)等载体，用适当的限制酶使插入位点切断，将用同一酶切断的人CD98或人LAT1连接，由此可以制备用于导入目标基因的载体。通过将制备的表达载体例如导入到作为宿主的L929细胞(American Type Culture Collection No.CCL-1)中，可以制备高表达人CD98和人LAT1的细胞。

将基因导入宿主的方法是公知的，例如有任意的方法(例如使用钙离子的方法、电穿孔法、原生质球法、乙酸锂法、磷酸钙法、脂转染法等)。

这样制备的转化细胞可以作为制备CD98抗体的免疫原。还可以将表达载体本身作为免疫原。

人CD98可根据公知的核苷酸序列或氨基酸序列，除基因重组技术之外，还可适当使用化学合成法、细胞培养方法等的技术领域中已知的方法制备。可以以这样得到的人CD98蛋白质作为抗原制备CD98抗体。人CD98的部分序列可按照在后述的技术领域中已知的方法，通过基因重组技术或化学合成法制备，还可以使用蛋白分解酶等将人CD98适当切断来制备。

上述得到的抗原如下进行免疫。即，将制备的抗原与用于提高抗原性的适当的物质(例如牛血清白蛋白等)、以及根据需要与免疫刺激剂(弗氏完全或不完全佐剂等)一起混合，对小鼠、兔、山羊、马等非人哺乳动物进行免疫。优选保持未重新排序的人抗体基因，使用通过免疫致敏、生成对该免疫原为特异性的人抗体的非人动物，则本发明的抗体也可以是人抗体。此时，生成人抗体的动物例如有富等人的文献[Tomizuka等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97卷：722]中记载的生成人抗体的转基因小鼠。

分泌单克隆抗体的杂交瘤的制备可按照Kohler和Milstein的方法(Nature，1975，256卷：495～497)以及与其相近的方法进行。即，将从如上所述的免疫致敏的动物中获得的脾脏、淋巴结、骨髓或扁桃体等、优选淋巴结或脾脏中所含的抗体生成细胞，和优选来自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔或人等哺乳动物的没有自身抗体生成能力的骨髓瘤细胞通过细胞融合来制备。细胞融合例如可在聚乙二醇(例如分子量1500～6000)等高浓度的聚合物溶液中、在通常约30～40℃下，将抗体生成细胞和骨髓瘤细胞混合、进行约1～10分钟。生成单克隆抗体的杂交瘤克隆的筛选可如下进行：将杂交瘤例如在微量滴定板中培养，例如采用ELISA等酶联免疫测定法、放射免疫、荧光抗体法等免疫学方法测定在可见到生长的孔中的培养上清对免疫抗原的反应性。

由杂交瘤制备单克隆抗体时，可以将杂交瘤进行体外培养，由培养上清中分离。还可以在小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或兔等腹水中等进行体内培养，从腹水中分离。还可以从杂交瘤等的抗体生成细胞中克隆编码单克隆抗体的基因，整合到适当的载体中，将其导入到宿主(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞等哺乳类细胞株、大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞等)中，采用基因重组技术制备重组抗体(P.J.Delves.ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.，1997，WILEY，P.Shepherd和C.Dean.，Monoclonal Antibodies.，2000，OXFORD UNIVERSITY PRESS，J.W.Goding，Monoclonal Antibodies：principles and practice.，1993，ACADEMIC PRESS)。还可以采用转基因动物制备技术，制备目标抗体基因整合到内源性基因中所得的转基因的牛、山羊、绵羊或猪，从该转基因动物的乳汁中可大量获得来自该抗体基因的单克隆抗体。将杂交瘤在体外培养时，配合培养的细胞种类的特性、实验研究的目的和培养方法等各种条件，可以使杂交瘤生长、维持和保存，使用在培养上清中用于生成单克隆抗体的已知的营养培养基或由已知的基础培养基诱导制备的所有营养培养基来实施。

生成的单克隆抗体可通过将本领域所周知的方法例如蛋白A柱的层析、离子交换层析、疏水层析、硫酸铵盐析法、凝胶过滤、亲和层析等适当组合来制备。

抗体的药物用途

本发明的抗体，首先，由于与来自该癌细胞的细胞膜、且与具有氨基酸转运活性的蛋白质形成复合体的CD98的特异性结合能力，因此通过与治疗用药物缀合，可以形成可用于向癌细胞送达药物或在可用于导弹疗法等的治疗目的复合体。

对与抗体缀合的治疗用药物的例子没有特别限定，例如有碘(¹³¹碘：¹³¹I，¹²⁵碘：¹²⁵I)、钇(⁹⁰钇：⁹⁰Y)、铟(¹¹¹铟：¹¹¹In)、锝(^99m锝：^99mTc)铟等放射核素(J.W.Goding.Monoclonal Antibodies：principles andpractice.，1993，ACADEMIC PRESS)，绿脓杆菌毒素(Pseudomonaltoxin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、蓖麻毒素(Ricin)等细菌毒素，以及甲氨喋呤(Methopterin)、丝裂霉素(mitomycin)、加利车霉素(calicheamicin)等化学疗法药物(D.J.King.，Applications andEngineering of Monoclonal Antibodies.，1998，T.J.International Ltd，M.L.Grossbard.，Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer.，1998，Marcel Dekker Inc)等，更优选诱导自由基生成的硒化合物。

抗体与治疗用药物的结合可以是共价或非共价键(例如离子键)的任意形式。例如，利用抗体分子中的反应性基团(例如氨基、羧基、羟基等)或配位性基团，根据需要使反应性的基团结合或者变换为反应性基团，然后使具有可在可与该反应性基团反应形成络合物的官能团(为细菌毒素、化学疗法药物时)或该配位性基团之间形成络合物的离子性基团(为放射性核素时)的治疗用药物与抗体接触，可得到本发明的复合体。或者在形成复合体时可利用生物素-亲和素系统。

治疗用药物为蛋白质或肽时，可通过基因工程的方法，以抗体与上述蛋白质或与肽融合的蛋白质的形式生产。

另外，由于本发明的抗体具有抗肿瘤活性，因此可以将该本身作为抗肿瘤药物使用。可进一步用作药物组合物、尤其是用作肿瘤的预防或治疗药的有效成分。

因此，本发明的抗体或药物组合物可适用具有起因于表达人CD98/人LAT1的细胞的可能性的各种疾病或症状的治疗或预防。该疾病或症状例如有各种恶性肿瘤，肿瘤的例子有：结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、黑素瘤、脑肿瘤、淋巴瘤、膀胱癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、白血病、T细胞淋巴瘤、胃癌、胰腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、头颈部扁平上皮细胞癌、皮肤癌、尿道癌、前列腺癌、绒毛癌、咽癌、喉癌、胸膜肿瘤、男性细胞瘤、子宫内膜增生症、子宫内膜异位症、胚胎瘤、纤维肉瘤、卡波济氏肉瘤、血管瘤、海绵状血管瘤、血管母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、神经纤维瘤、少突胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质细胞瘤、横纹肌瘤、胶质母细胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌瘤、甲状腺肉瘤或肾母细胞瘤等，适用本发明的抗体时的肿瘤不限于一种，可以是多种肿瘤并发。另外，本发明的人单克隆抗体可适用于罹患了原发性局部癌的患者的寿命延长。另外，对于表达CD98的免疫活性细胞可以选择性地使本发明的药物组合物与其作用。

含有本发明的抗体或与治疗用药物结合的抗体的药物优选以药物组合物的形式提供。

上述药物组合物含有治疗上有效量的治疗用药物，可以制成口服、非口服给药用的各种形式的制剂。这里，治疗上有效量是指对于给予的症状或给予的计划是可以获得治疗效果的量。

本发明的组合物除抗体之外，可以含有生理学上可接受的制剂上的添加物，例如稀释剂、防腐剂、溶解剂、乳化剂、佐剂、抗氧化剂、等渗剂、赋形剂和载体的一种或多种。还可以制成与其它抗体或抗生素等其它药物的混合物。

适当的载体中可以含有生理盐水、磷酸缓冲生理盐水、磷酸缓冲生理盐水葡萄糖液、以及缓冲生理盐水，但并不限于此。也可以含有该领域中周知的氨基酸、糖类、表面活性剂等稳定剂，防止与表面吸附的防吸附剂。

制剂的形式可以根据治疗目的、治疗计划选择包含冻干制剂(这种情况下，可以通过添加上述缓冲水溶液重构后使用)、缓释制剂、肠溶性制剂、注射剂或输液剂等的制剂。

给药途径可适当确定，例如可以是口服途径、以及包含静脉内、肌内、皮下和腹腔内注射或配药的非肠道途径。或者也可以是使本发明的组合物与患者的患部直接接触的方法。

给药量根据使用动物的试验、临床实验的实施来适当确定，但通常应考虑患者的状态或严重程度、年龄、体重、性别等。通常在口服给药时，成人每天约为0.01mg～1000mg，可将其一次或分多次给药。非口服给药时，可以通过皮下注射、肌肉注射或静脉注射每次给药约0.01mg～1000mg。

本发明也包含使用本发明的抗体或药物组合物进行上述疾病的预防或治疗的方法，本发明还包含本发明的抗体在上述疾病的预防或治疗药的制备中的应用。

根据本发明的优选方案，本发明的抗体可以以溶解于水或除此之外的药理学可接受的溶液而得到的无菌性溶液或悬浮液的安瓿剂的形式使用。还可以将无菌粉末制剂(优选将本发明的分子冷冻干燥)填充到安瓿瓶中，在使用时用药理学可接受的溶液稀释。

实施例

以下，通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不受这些实施例记载的方案的限定。

实施例1：人CD98或人LAT1表达载体的制备

以保有人CD98(hCD98，GenBank/EMBL/DDBJ accession no.AB018010；SEQ ID NO.65)和人LAT1(hLAT1，GenBank/EMBL/DDBJaccession no.AB018009；SEQ ID NO.67)的DNA的质粒载体pcDNA3.1-hCD98和pcDNA3.1-hLAT1为模板，进行聚合酶链反应(PCR)。为了在全长人CD98cDNA的5′末端附加EcoRI序列、在其3′末端附加NocI序列和终止密码予，使用引物5’-CCG GAA TTC CCACCA TGA GCC AGG ACA CCG AGG TGG ATA TGA-3’(SEQ IDNO.59)和5’-AAG GAA AAA AGC GGC CGC TCA TCA GGC CGCGTA GGG GAA GCG GAG CAG CAG-3’(SEQ ID NO.60)，以KOD-PlusDNA聚合酶(东洋纺公司制备)和hCD98cDNA(约20ng)为模板，进行94℃15秒、55℃30秒和68℃1分30秒的30个循环的PCR反应。将经修饰的hCD98序列以EcoRI-NotI片段的形式分离，然后连接到用相同的酶切断的pTracer-EF/Bsd载体(Invitrogen公司制备)上。以所得质粒为模板，使用CD98v2U(5’-AGT CTC TTG CAA TCGGCT AAG AAG AAG AGC ATC CGT GTC ATT CTG-3’(SEQ IDNO.61))引物和CD98v2L(5’-CAG AAT GAC ACG GAT GCT CTTCTT CTT AGC CGA TTG CAA GAG ACT-3’(SEQ ID NO.62))引物，将hCD98DNA的第591和第594号(SEQ ID NO.65中的第702号和第705号)的A变为G。由所得质粒制备EcoRI-hCD98-NotI片段，与用相同的酶切断的pEF6myc-His/Dsd(Invitrogen)载体连接。将所得质粒命名为pEF6/hCD98。

同样，为了在全长人LAT1cDNA的5′末端附加EcoRI序列、在其3′末端附加Kpn1序列，使用引物5’-CCG GAA TTC CCA CCA TGGCGG GTG CGG GCC CGA AGC GGC-3’(SEQ ID NO.63)和5’-CGGGGT ACC GTC TCC TGG GGG ACC ACC TGC ATG AGC TTC-3’(SEQ ID NO.64)，以KOD-Plus DNA聚合酶和hLAT1cDNA(约20ng)为模板，进行94℃15秒、55℃30秒和68℃1分30秒的30个循环的PCR反应。将经修饰的hLAT1序列以EcoRI-KpnI片段的形式分离，然后连接到用相同的酶切断的pEGFP-N1(Clontech公司制备)载体上。再将所得质粒以EcoRI-NotI片段的形式分离，然后连接到用相同的酶切断的pEF1V5His/Neo(Invitrogen公司制备)载体上。将所得质粒命名为pEF1/hLAT1-EGFP。

实施例2：hCD98/hLAT1表达细胞的制备

hCD98/hLAT1表达细胞的制备是使用Invitrogen公司制备的脂转染试剂和Plus试剂，将实施例1中制备的表达载体pEF6/hCD98和pEF1/hLAT1-EGFP(hLAT1-E)导入到Colon26(CT26)细胞和L929细胞(American Type Culture Collection No.CCL-1)中。基因导入按照手册说明书的方法进行。导入了基因的细胞使用细胞培养板(6孔板，BectonDickinson公司制备)、在37℃、5％CO2下培养24小时后，如果为CT26细胞株，则用含有5μg/mL杀稻瘟素和500μg/mL G418的培养基，如果为L929细胞株，则用含有5μg/mL杀稻瘟素和1mg/mL G418的培养基进一步培养三天。接着，用RPE荧光标记小鼠抗人CD98抗体(Becton Dickinson公司制备，Ca.No.556076)的FACS Vantage分离hLAT1-E和CD98阳性细胞。用同样的方法制备表达hCD98的L929细胞或表达hLAT1-E的L929细胞。

实施例3：生成人抗体的小鼠的制备

免疫中使用的小鼠对于内源性Ig重链和κ轻链的破坏两者均具有同型接合体的遗传背景，并且同时保有含有人Ig重链基因座的14号染色体片段(SC20)和人Igκ链转基因(kCo5)。该小鼠是通过具有人Ig重链基因座的系统A的小鼠和具有人Igκ链转基因的系统B的小鼠的交配来制备。系统A对于内源性Ig重链和κ轻链的破坏两者为同型接合体，是保有可进行子代传递的14号染色体片段(SC20)的小鼠系统，例如记载于富

的报告(Tomizuka.等人.，Proc Natl Acad Sci USA，2000，97卷：722)中。另外，系统B是对于内源性Ig重链和κ轻链的破坏两者为同型接合体，是保有人Igκ链转基因(kCo5)的小鼠系统(转基因小鼠)，例如记载于Fishwild的报告(Nat Biotechnol.，1996，14卷：845)。

系统A的雄性小鼠和系统B的雌性小鼠、或系统A的雌性小鼠与系统B的雄性小鼠交配得到的子代小鼠用富

的报告(Tomizuka等人.，Proc Natl Acad Sci USA，2000，97卷：722)的方法进行分析，筛选在血清中同时检测出人Ig重链和κ轻链的个体(生成人抗体的小鼠)(Ishida和Lonberg，IBC&apos；s 11th Antibody Engineering，Abstract，2000；Ishida，I.等人.，Cloning&Stem Cells 4，85～96(2002))，用于以下的免疫实验。免疫实验也使用了使上述小鼠的遗传背景改变的小鼠等(石田功(2002)实验医学20，6846851)。

实施例4：人单克隆抗体的制备

人单克隆抗体的制备是按照单克隆抗体实验操作入门(安东民卫等人著作，讲谈社发行1991)等记载的一般方法进行。

作为免疫原的hCD98/hLAT1，使用实施例2制备的表达hCD98/hLAT1-E的CT26细胞和确认有hCD98表达的人结肠直肠癌细胞株Colo205细胞。

被免疫动物使用实施例3中制备的生产人免疫球蛋白的生成人抗体的小鼠。

使用表达hCD98/hLAT1-E的CT26细胞时，将5×10⁶个细胞与IRBI佐剂(Corixa公司制备)混合，在腹腔内初次免疫。自初次免疫后的第7、24天，腹腔内追加免疫5×10⁶个细胞/小鼠。并且在获得下述的脾脏细胞之前3天时同样地腹腔内追加免疫5×10⁶个细胞/小鼠。

使用Colo205细胞时，腹腔内初次免疫5×10⁶个细胞。自初次免疫后的第14天，腹腔内追加免疫5×10⁶个细胞/小鼠，3天后获得以下所述的脾脏细胞。

由免疫的小鼠中外科取得脾脏，将回收的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0(ATCC No.CRL1581)按照5∶1混合，使用聚乙二醇1500(Roche公司制备)作为融合剂，进行细胞融合，制备大量杂交瘤。杂交瘤的选择通过在含有10％胎牛血清(FCS)和次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)、胸腺嘧啶核苷(T)的含HAT的DMEM培养基(Gibco公司制备)中培养、进行。再使用含有HT的DMEM培养基，通过极限稀释法进行单一克隆。培养是在96孔微量滴定板(Becton Dickinson公司制备)中进行。生成目标人单克隆抗体的杂交瘤的选择(筛选)以及各杂交瘤所生成的人单克隆抗体的特征可通过后述的荧光活化细胞分选仪(FACS)测定来进行。

生成人单克隆抗体的杂交瘤的筛选如下进行。即，通过下述FACS分析，获得200个以上生成具有人免疫球蛋白μ链(hIgμ)、γ链(hIgγ)和人免疫球蛋白轻链κ(hIgκ)、且与表达hCD98/hLAT1-E的CT26细胞具有特异性反应性的人单克隆抗体的杂交瘤。

需要说明的是，本说明书的实施例中，在表示结果的表或图中，用符号对生成人单克隆抗体的杂交瘤克隆进行命名。以下的杂交瘤克隆表示单一克隆：4-35-14(C2)、4-32-9(K3)，7-95-8，10-60-7，3-69-6，5-80-1(以上克隆，免疫原是表达hCD98/hLAT1-E的CT26细胞)，1-40-1(所述克隆，免疫原是Colo205细胞)。

实施例5：各单克隆抗体的亚类的鉴定

通过FACS分析，对实施例4中获得的各单克隆抗体的亚类进行鉴定。将2×10⁶/mL的Colo205细胞悬浮于含有1mM EDTA、0.1％NaN₃、5％FCS的PBS的SB(染色缓冲液)中。将细胞悬浮液分注在96孔圆底板中(Becton Dickinson公司制备，50μL/孔)。再加入50μL实施例4培养的杂交瘤的培养上清，进行搅拌，在冰点温度下反应30分钟，然后离心(2000rpm，4℃，2分钟)，除去上清。将沉淀物(pellet)用100μL/孔的SB清洗一次，然后将FITC荧光标记兔抗人IgμF(ab′)₂抗体(Dako Cytomation公司制备)用SB稀释为50倍，或者将RPE荧光标记山羊抗人IgγF(ab′)₂抗体(SuthernBiotech公司制备)用SB稀释为200倍，或者将RPE荧光标记兔抗人IgκF(ab′)₂抗体(DakoCytomation公司制备)用SB稀释为200倍，加入，在冰点温度下反应30分钟。用SB清洗一次，然后悬浮于300μL SB中，通过FACS(FACSCan，Becton Dickinson公司制备)测定表示抗体结合的荧光强度。所得抗体的一部分结果如表1所示。C2是重链为μ链、轻链为κ链，K3、3-69-6、7-95-8、10-60-7、1-40-1和5-80-1均是重链为γ链、轻链为κ链。

[表1]各抗体的亚类

实施例6：编码单克隆抗体的基因的制备和重组抗体表达载体的构建

按照以下方法实施C2、K3、7-95-8、10-60-7、3-69-6和1-40-1各抗体基因的克隆和表达载体的构建。

(1)抗体基因的cDNA克隆和表达载体的制备

将杂交瘤在含有10％FCS的DMEM培养基(Gibco公司制备)中培养，通过离心收集细胞，然后添加ISOGEN(Nippon Gene公司制备)，按照使用说明书提取总RNA。抗体cDNA的可变区的克隆是使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech公司制备)，按照所附说明书进行。

以5μg总RNA为模板，制备单链cDNA。

(a)单链cDNA的合成

将含有5μg/3μL总RNA、1μL 5′CDS和1μL SMART oligo的组成的反应液在70℃下温育2分钟，然后加入2μL5×缓冲液、1μL DTT、1μL dNTP mix，然后加入1μL Superscirpt II，在42℃下温育15小时。再加入100μL Tricine缓冲液(两性离子缓冲液)，然后在72℃下温育7分钟，获得单链cDNA。

(b)通过PCR进行重链基因、轻链基因的扩增，以及重组抗体表达载体的构建

cDNA的扩增使用东洋纺公司制备的KOD-Plus。

将含有15μL cDNA、5μL 10xKOD-Plus缓冲液、5μL dNTP mix、1μL KOD-Plus、3μL 25mM MgSO₄、引物1和引物2组成的反应液用重蒸馏水定容为终容量50μL，供给PCR。

对于K3、1-40-1、3-69-6、C2给出具体实验例，如下所示。

K3

为了扩增轻链，使用UMP和hk-2(5’-GTT GAA GCT CTT TGTGAC GGG CGA GC-3’(SEQ ID NO.1))引物，进行5次94℃5秒、75℃3分钟的循环，接着进行5次94℃5秒、70℃10秒、72℃3分钟的循环，再进行25次94℃5秒、68℃10秒、72℃3分钟的循环。再以1μL该反应液的5倍稀释液为模板，使用NUMP和hk5(5’-AGG CAC ACAACA GAG GCA GTT CCA GAT TTC-3’(SEQ ID NO.2))引物，进行30次94℃15秒、60℃30秒、68℃1分钟的循环。将该反应液供给2％琼脂糖凝胶电泳，将扩增的PCR产物用QIA quick凝胶纯化试剂盒(Quiagen公司制备)纯化。将纯化的PCR产物与pCR4Blunt-TOPO载体(Invitrogen公司制备)连接，按照所附说明书进行亚克隆。接着以T3(5’-ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA-3’(SEQ ID NO.3))和hk5作为引物，进行核苷酸序列的确定。基于序列信息合成DNPL15Bglp(5’-AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGG AAG CCC CAG CTCAGC TTC TCT-3’(SEQ ID NO.4))，以在pCR4Blunt-TOPO载体中亚克隆得到的轻链基因作为模板，使用DNPL15Bglp和202LR(5’-AGAGAG AGA GCG TAC GTT TAA TCT CCA GTC GTG TCC CTTGGC-3’(SEQ ID NO.5))作为引物，进行30次94℃15秒、55℃30秒、68℃1分钟的循环。将该反应液供给2％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒(Quiagen公司制备)纯化约400bp的片段。将轻链扩增cDNA片段用BglII、BsiWI消化，导入到用相同的酶切断的N5KG 1-Val Lark载体(IDEC Pharmaceuticals，a modified vector ofN5KG1(美国专利6001358))中。将所得载体命名为N5KG1-Val K3L。

为了扩增重链，使用UMP和IgG1p(5’-TCT TGT CCA CCT TGGTGT TGC TGG GCT TGT G-3’(SEQ ID NO.6))引物，进行5次94℃5秒、72℃3分钟的循环，接着进行5次94℃5秒、70℃10秒、72℃3分钟的循环，再进行25次94℃5秒、68℃10秒、72℃3分钟的循环。再以1μL该反应液的5倍稀释液为模板，使用NUMP和IgG2p(5’-TGCACG CCG CTG GTC AGG GCG CCT GAG TTC C-3’(SEQ ID NO.7))，进行30次94℃15秒、60℃30秒、68℃1分钟的循环。将该反应液供给2％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化扩增的PCR产物。将纯化的PCR产物与pCR4Blunt-TOPO载体连接，进行亚克隆。接着以T3和hh2(5’-GCT GGA GGG CAC GGT CAC CACGCT G-3’(SEQ ID NO.8))作为引物，进行核苷酸序列的确定。根据序列信息合成K3HcSalI(5’-AGA GAG AGA GGT CGA CCA CCA TGGGGT CAA CCG CCA TCC TCG CCC TCC TC-3’(SEQ ID NO.9))，以在pCR4Blunt-TOPO载体中亚克隆得到的重链基因作为模板，使用K3HcSalI和F24HNhe (5’-AGA GAG AGA GGC TAG CTG AGG AGACGG TGA CCA GGG TTC-3’(SEQ ID NO.10))，进行25次94℃15秒、55℃30秒、68℃1分钟的循环。将该反应液供给2％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化约450bp的片段。将重链扩增cDNA片段用SalI、NheI消化，导入到用相同的酶切断的N5KG1-ValK3L中。确定插入部分的DNA核苷酸序列，进行PCR扩增，确认插入的序列与作为模板的基因序列没有不同。将所得载体命名为N5KG1-Val K3IgG1。为了确认将N5KG1-Val K3IgG1基因导入到后述的FreeStyle293细胞中得到的重组体K3抗体是否与来自K3杂交瘤的抗体相同，通过研究与表达hCD98/hLAT1的细胞株的结合活性来进行。

1-40-1

为了扩增重链，使用UMP和IgG1p引物，进行5次94℃5秒、72℃3分钟的循环，接着进行5次94℃5秒、70℃10秒、72℃3分钟的循环，再进行25次94℃5秒、68℃10秒、72℃3分钟的循环。再以1μL该反应液的5倍稀释液为模板、使用NUMP和IgG2p引物，进行30次94℃15秒、60℃30秒、68℃1分钟的循环。将该反应液供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化扩增的PCR产物。将纯化的PCR产物与pCR4Blunt-TOPO载体连接，进行亚克隆。接着以T3和hh2为引物，进行核苷酸序列的确定。根据序列信息合成205HP5SalI(5’-AGA GAG AGA GGT CGA CCA CCATGG AGT TTG GGC TGA GCT GGG TTT-3’(SEQ ID NO.11))，以在pCR4Blunt-TOPO载体中亚克隆得到的重链基因作为模板，使用205HP5SalI和F24Hnhe引物，进行25次94℃15秒、55℃30秒、68℃1分钟的循环。将该反应液供给2％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化约450bp的片段。将重链扩增cDNA片段用SalI、NheI消化，导入到用相同的酶切断的N5KG1-Val Lark载体中。将所得载体命名为N5KG1-Val1-40-1H。

为了扩增轻链，使用UMP和hk-2引物，进行5次94℃5秒、75℃3分钟的循环，接着进行5次94℃5秒、70℃10秒、72℃3分钟的循环，再进行25次94℃5秒、68℃10秒、72℃3分钟的循环。再以1μL该反应液的5倍稀释液为模板，使用NUMP和hk5，进行30次94℃15秒、60℃30秒、68℃1分钟的循环。将该反应液供给2％琼脂糖凝胶电泳，将扩增的PCR产物用QIA quick凝胶纯化试剂盒纯化。将纯化的PCR产物与pCR4Blunt-TOPO载体连接，进行亚克隆。接着以T3和hk5作为引物，进行核苷酸序列的确定。基于序列信息合成A27RN202(5’-AGA GAG AGA GCG TAC GTT TGA TTT CCA CCTTGG TCC CTT GGC-3’(SEQ ID NO.12))，以在pCR4Blunt-TOPO载体中亚克隆得到的轻链基因作为模板，使用DNPL15Bglp和A27RN202，进行25次94℃15秒、55℃30秒、68℃1分钟的循环。将该反应液供给2％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化约400bp的片段。将轻链扩增cDNA片段用BglII、BsiWI消化，导入到用相同的酶切断的N5KG1-Val 1-40-1H载体中。确定插入部分的DNA核苷酸序列，进行PCR扩增，确认插入的序列与作为模板的基因序列没有不同。将所得载体命名为N5KG1-Val 1-40-1IgG1。为了确认将N5KG1-Val 1-40-1IgG1基因导入到后述的FreeStyle293细胞中得到的重组体1-40-1抗体是否与来自1-40-1杂交瘤的抗体相同，通过研究与表达hCD98/hLAT1的细胞株的结合活性来进行。

3-69-6

为了扩增轻链，使用UMP和hk-2引物，进行5次94℃15秒、75℃3分钟的循环，接着进行5次94℃15秒、70℃10秒、72℃3分钟的循环，再进行25次94℃15秒、68℃15秒、72℃3分钟的循环。再以2μL该反应液的5倍稀释液为模板，使用NUMP和hk5，进行30次94℃15秒、60℃30秒、68℃1分钟的循环。将该反应液供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，将扩增的PCR产物用QIA quick凝胶纯化试剂盒纯化。将纯化的PCR产物与pCR4Blunt-TOPO载体连接，进行亚克隆。接着以M13正向(-20)引物(5’-GTA AAA CGA CGG CCA G-3’(SEQID NO.13))和M13反向引物(5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’(SEQ ID NO.14))、hk5(5’-AGG CACACA ACA GAG GCAGTTCCAGA TTT C-3’(SEQ ID NO.2))作为引物，进行核苷酸序列的确定。基于序列信息合成A27_F(5’-AGA GAG AGA GAT CTC TCACCA TGG AAA CCC CAG CGCAGC TTC TCT TC-3’(SEQ ID NO.15))和39_20_L3Bsi(5’-AGA GAG AGA GCG TAC GTT TGA TCT CCAGCT TGG TCC CCT G-3’(SEQ ID NO.16))，以在pCR4Blunt-TOPO载体中亚克隆得到的轻链基因作为模板，使用A27_F和39_20_L3Bsi，进行25次94℃30秒、55℃30秒、68℃1分钟的循环。将该反应液供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化约400bp的片段。将轻链扩增cDNA片段用BglII、BsiWI消化，导入到用相同的酶切断的N5KG1-Val Lark载体中。将所得载体命名为N5KG1-Val3-69-6L。

为了扩增重链，使用UMP和IgG1p(5’-TCT TGT CCA CCT TGGTGT TGC TGG GCT TGT G-3’(SEQ ID NO.6))引物，进行5次94℃15秒、72℃3分钟的循环，接着进行5次94℃15秒、70℃10秒、72℃3分钟的循环，再进行30次94℃15秒、68℃15秒、72℃3分钟的循环。再以2μL该反应液的5倍稀释液为模板、使用NUMP和IgG2p(IgG1.3.4)(5’-TGC ACG CCG CTG GTCAGG GCG CCT GAG TTCC-3’(SEQ ID NO.7))，进行25次94℃30秒、55℃30秒、68℃1分钟的循环。将该反应液供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化扩增的PCR产物。将纯化的PCR产物与pCR4Blunt-TOPO载体连接，进行亚克隆。接着以M13F、M13R和IgG2p为引物，进行核苷酸序列的确定。根据序列信息合成Z3HP5Sal(5’-AGA GAG AGA GGT CGA CCCACCATG GAC TGG AGCATCCTT TT-3’(SEQ ID NO.17))和F24HNhe(5’-AGA GAG AGA GGCTAG CTG AGG AGA CGG TGA CCA GGG TTC-3’(SEQ ID NO.10))，以在pCR4Blunt-TOPO载体中亚克隆得到的重链基因作为模板，使用Z3HP5SalF和F24HNhe，进行25次94℃30秒、55℃30秒、68℃1分钟的循环。将该反应液供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化约450bp的片段。将重链扩增cDNA片段用SalI、NheI消化，导入到用相同的酶切断的N5KG1-Val 3-69-6L载体中。确定插入部分的DNA核苷酸序列，进行PCR扩增，确认插入的序列与作为模板的基因序列没有不同。将所得载体命名为N5KG1-Val3-69-6IgG1。为了确认将N5KG1-Val 3-69-6IgG1基因导入到后述的FreeStyle293细胞中得到的重组体3-69-6抗体是否与来自3-69-6杂交瘤的抗体相同，通过研究与表达hCD98/hLAT1的细胞株的结合活性来进行。

C2IgG1

生成杂交瘤的C2的亚类是IgM，因此，使用设计成含有设想的可变区的引物，通过PCR，由来自相同种系的IgG分离C2抗体可变区(C2IgG1)。

为了扩增轻链，使用UMP和hk-2引物，进行5次94℃5秒、75℃3分钟的循环，接着进行5次94℃5秒、70℃10秒、72℃3分钟的循环，再进行25次94℃5秒、68℃10秒、72℃3分钟的循环。再以1μL该反应液的5倍稀释液为模板，使用NUMP和hk5，进行30次94℃15秒、60℃30秒、68℃1分钟的循环。将该反应液供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，将扩增的PCR产物用QIA quick凝胶纯化试剂盒纯化。将纯化的PCR产物与pCR4Blunt-TOPO载体连接，进行亚克隆。接着以M13F、M13R和hk5作为引物，进行核苷酸序列的确定。基于序列信息合成C2-1Lc Bgl II F(5’-AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGG AAACCC CAG CGCAGC TTC TCT TC-3’(SEQ ID NO.18))和C2-1LcBsiWI R (5’-AGA GAG AGA GCG TAC GTT TGA TAT CCA CTTTGG TCC CAG GG-3’(SEQ ID NO.19))，以在pCR4Blunt-TOPO载体中亚克隆得到的轻链基因作为模板，使用C2-1Lc Bgl II F和C2-1LcBsiWI R，进行25次94℃15秒、60℃30秒、68℃1分钟的循环。将该反应液供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化约400bp的片段。将轻链扩增cDNA片段用BglII、BsiWI消化，导入到用相同的酶切断的N5KG1-Val Lark载体中。将所得载体命名为N5KG1-Val C2L。

为了扩增重链，使用UMP和M655R (5’-GGC GAA GAC CCGGAT GGC TAT GTC-3’(SEQ ID NO.20))引物，进行30次94℃15秒、68℃30秒、68℃1分钟的循环。再以1μL该反应液的5倍稀释液为模板、使用NUMP和M393R (5’-AAA CCC GTG GCC TGG CAG ATGAGC-3’(SEQ ID NO.21))，进行30次94℃15秒、60℃30秒、68℃1分钟的循环。将该反应液供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化扩增的PCR产物。将纯化的PCR产物与pCR4Blunt-TOPO载体连接，进行亚克隆。接着以M13正向(-20)引物(5’-GTA AAA CGA CGG CCA G-3’(SEQ ID NO.13))、M13反向引物(5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’(SEQ ID NO.14))和M393R作为引物，进行核苷酸序列的确定。基于序列信息合成C2hcSalIF(5’-AGAGAG AGA GGT CGA CCA CCA TGA AGCACC TGT GGT TCT TCCTCC TGC T-3’(SEQ ID NO.22))和C2hcNheI(5’-AGA GAG AGA GGCTAG CTG AGG AGA CGG TGA CCA GGG TTC CCT GG-3’(SEQ IDNO.58))，以在pCR4Blunt-TOPO载体中亚克隆得到的重链基因作为模板，使用C2hcSalIF和C2hcNheI，进行25次94℃15秒、60℃30秒、68℃30秒的循环。将该反应液供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化约450bp的片段。将重链扩增cDNA片段用SalI、NheI消化，导入到用相同的酶切断的N5KG1-Val C2L载体中。确定插入部分的DNA核苷酸序列，进行PCR扩增，确认插入的序列与作为模板的基因序列没有不同。将所得载体命名为N5KG1-Val C2IgG1。

C2IgG1NS

在上述克隆的C2IgG1基因中，重链的构架区有原有的种系中未曾见过的突变。因此，按照以下方法分离具有原有种系的序列的C2的可变区序列。

以上述得到的载体N5KG1-Val C2IgG1为模板，使用C2hc NSF(5’-CGT CCA AGA ACC AGT TCT CCC TGA AGC TGA-3’(SEQ IDNO.23))引物和C2hc NS R(5’-TCA GCT TCA GGG AGA ACT GGTTCT TGG ACG-3’(SEQ ID NO.24))引物，将C2抗体重链的第290和第299号的G和T分别变化为A和C，制备N5KG1-Val C2IgG1NS。将N5KG1-Val C2IgG1和N5KG1-Val C2IgG1NS基因导入后述的FreeStyle293细胞中，对于由此得到的重组体C2IgG1和C2IgG1NS抗体与来自C2杂交瘤的IgM抗体的特异性是否相同的确认可通过研究与表达hCD98/hLAT1的细胞株的结合活性来进行。C2IgG1和C2IgG1NS的结合活性大致相同。

C2IgμG1

如果为上述C2IgG1中使用的方法，则重链与轻链的结合部位的形式可能与原有的IgM不同，因此进行了以下的序列转换。即，将由IgG的γ链和IgM的μ链的位于CH1恒定区的共通序列(GCL序列)朝向可变区一侧方向上相邻的26个氨基酸作为μ链序列，由GCL序列将恒定区一侧的全部转换成γ链(C2IgμG1)。按以下方法进行以上的序列转换。

为了扩增C2cDNA的重链，使用UMP和M655R引物，进行30次94℃15秒、68℃30秒、68℃1分钟的循环。再以1μL该反应液的5倍稀释液为模板、使用NUMP和M393R，进行30次94℃15秒、60℃30秒、68℃1分钟的循环。将该反应液供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化扩增的PCR产物。将纯化的PCR产物与pCR4Blunt-TOPO载体连接，进行亚克隆。接着以M13正向(-20)引物(5’-GTA AAA CGA CGG CCA G-3’(SEQ ID NO.13))、M13反向引物(5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’(SEQ ID NO.14))和M393R作为引物，进行核苷酸序列的确定。基于序列信息合成C2hcSalIF(5’-AGA GAG AGA GGT CGA CCA CCA TGA AGCACC TGT GGTTCT TCC TCC TGC T-3’(SEQ ID NO.22))和Mu-GCL-Gamma L(5’-CAC CGG TTC GGG GAA GTA GTC CTT GAC GAG GCA GCAAAC GGC CAC GCT GCT CGT-3’(SEQ ID NO.25))，以在pCR4Blunt-TOPO载体中亚克隆得到的重链基因作为模板，使用C2hcSalIF和MU-GCL-Gamma L，进行25次94℃15秒、60℃30秒、68℃1分钟的循环。将该反应液供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化PCR扩增产物。将该PCR扩增产物命名为C2Vμ。接着，以N5KG1-Val Lrak载体为模板，使用Mu-GCL-Gamma U (5’-ACG AGC AGC GTG GCC GTT GGC TGCCTC GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG-3’(SEQ IDNO.26))和hIgG1 BamHI L(5’-CGC GGA TCC TCA TCA TTT ACCCGG AGA CAG GGA GAG GCT-3’(SEQ ID NO.27))，进行25次94℃15秒、60℃30秒、68℃90秒的循环。将该反应液供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化PCR扩增产物。将该PCR扩增产物命名为Cγ1。各加入5μl C2Vμ和Cγl的3倍稀释液，无引物，进行3次94℃15秒、55℃30秒、68℃2分钟的循环。将该反应液在99℃加热5分钟后稀释10倍，以5μl为模板，使用C2hcSalIF和hIgG1BamHI L，进行25次94℃15秒、60℃30秒、68℃2分钟的循环。将该反应液供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化PCR扩增产物。将该PCR扩增cDNA片段用SalI、SamI消化，导入到含有用相同的酶切断的上述C2轻链基因的N5KG1-ValLark载体中。确定插入部分的DNA核苷酸序列，进行PCR扩增，确认插入的序列与作为模板的基因序列没有不同。将所得载体命名为N5KG1-Val C2IgμG1。C2IgμG1抗体的结合活性，通过研究将N5KG1-Val C2IgμG1基因导入到后述的FreeStyle293细胞中得到的重组体与表达hCD98/hLAT1的细胞株的结合活性来进行。

含有K3、1-40-1和3-69-6的重链可变区和轻链可变区的DNA序列、以及含有重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别是以下SEQID NO.的序列。

<K3重链可变区核酸序列>(SEQ ID NO.28)

GTCTGGAGCAGAAGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGGTTTACCGACTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCTTCTATCCTGGTGACTCTGATGCCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAACACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTATTGTGCGAGACGGCGAGATATAGTGGGAGGTACTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGGGTCAACCGCCATCCTCGCCCTCCTCCTGGCTGTTCTCCAAGGAGTCTGTGCCGAGGTGCAGCTGGTGCA

<K3重链可变区氨基酸序列>(SEQ ID NO.29)

MGSTAILALLLAVLQGVCAEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYRFTDYWIGWVRQM PGKGLEWMGIFYPGDSDARYSPSFQGQVTISADKSINTAYLQWSS LKAS DTAMYYCARRRDIVGGTDYWGQGTLVTVSS

<K3轻链可变区核酸序列>(SEQ ID NO.30)

AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAG CTACTTAGACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA

<K3轻链可变区>(SEQ ID NO.31)

MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLDWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIK

<1-40-1重链可变区核酸序列>(SEQ ID NO.32)

AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTGTGGTACGGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTG GATTCACCTTTGATGATTATGGCATGACCTGGGTCCGCCAAGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCTACTATTAGTTGGAATGGTGGTGGCACAGGTTATGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCGGGATATTGTATTATTACCGGCTGCTATGCGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

<1-40-1重链可变区氨基酸序列>(SEQ ID NO.33)

MEFGLSWVFLVAILKGVQCEVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMTWVRQAPGKGLEWVSTISWNGGGTGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAGYCIITGCYADYWGQGTLVTVSS

<1-40-1轻链可变区核酸序列>(SEQ ID NO.34)

AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA

<1-40-1轻链可变区氨基酸序列>(SEQ ID NO.35)

MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWWTFGQGTKVEIK

<3-69-6重链可变区核酸序列>(SEQ ID NO.36)

GTCGACCCACCATGGACTGGACCTGGAGCATCCTTTTCTTGGTGGCAGCAGCAACAGGTGCCCACTCCCAGGTTCAACTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGTAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCAGCTATGGTATCAGCTGGATGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTTACAATGGTAATACGAACTATGTACAGAAGTTCCAGGACAGAGTCACCATGACCAGAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGGGGCAGCAATTGGTATGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

<3-69-6重链可变区>(SEQ ID NO.37)

RRPTMDWTWSILFLVAAATGAHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWMRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYVQKFQDRVTMTRDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDRGSNWYGWFDPWGQGTLVTVSS

<3-69-6轻链可变区核酸序列>(SEQ ID NO.38)

AGATCTCTCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA

<3-69-6的轻链可变区氨基酸序列>(SEQ ID NO.39)

RSLTMETPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSYTFGQGTKLEIK

含有C2重链可变区和轻链可变区的DNA、以及含有重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如下所示。

<C2IgG1重链可变区核酸序列>(SEQ ID NO.40)

GTCGACCACCATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTAGTAGTTACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATTATAGTGGGAGTACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAGCCAGTTCTTCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACAAGGGACGGGGCTCGCCCTATTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

<C2IgG1重链可变区氨基酸序列>(SEQ ID NO.41)

STTMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKSQFFLKLSSVTAADTAVYYCARQGTGLALFDYWGQGTLVTVSS

<C2IgG1NS重链可变区核酸序列>(SEQ ID NO.42)

GTCGACCACCATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTAGTAGTTACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATTATAGTGGGAGTACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACAAGGGACGGGGCTCGCCCTATTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

<C2IgG1NS重链可变区氨基酸序列>(SEQ ID NO.43)

STTMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWI RQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYN PSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARQGTGLALFDYWGQGTLVTVSS

<C2IgμG1重链可变区与人IgG1的结合部位的核酸序列>(SEQ IDNO.44)

GTCGACCACCATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTAGTAGTTACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATTATAGTGGGAGTACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAGCCAGTTCTTCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACAAGGGACGGGGCTCGCCCTATTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTTTTCCCCCTCGTCTCCTGTGAGAATTCCCCGTCGGATACGAGCAGCGTGGCCGTT

<C2IgμG1重链可变区与人IgG1的结合部位的氨基酸序列>(SEQ IDNO.45)

STTMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKSQFFLKLSSVTAADTAVYYCARQGTGLALFDYWGQGTLVTVSSGSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAV

<C2IgG1和C2IgμG1的轻链可变区核酸序列>(SEQ ID NO.46)

AGATCTCTCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTTCTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTCGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTATATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA

<C2IgG1和C2IgμG1的轻链可变区氨基酸序列>(SEQ ID NO.47)

RSLTMETPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPIFTFGPGTKVDIK

上述各抗体序列内，将K3和C2IgG1的轻链可变区和重链可变区(即SEQ ID NO.28和30以及SEQ ID NO.40和46的序列的核酸)导入pCR4Blunt-TOPO载体中，将所得保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，其保藏号分别为FERM BP-10552(用于识别的标记：K3/pCR4)和FERM BP-10551(用于识别的标记：C2IgG1/pCR4)。

上述各抗体可变区除重链和轻链部分之外，还可以含有结合和分离中使用的限制酶识别序列，分离各抗体的轻链可变区时可使用限制酶BglII和BsiWI进行分离，分离重链可变区时使用限制酶SalI和NheI进行分离。以下给出含有插入到pCR4Blunt-TOPO载体中的各抗体可变区和限制酶识别位点等的基因序列。

<K3/pCR4>(SEQ ID NO.48)

AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGTACGCTCTCTCTCTAGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGGGTCAACCGCCATCCTCGCCCTCCTCCTGGCTGTTCTCCAAGGAGTCTGTGCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAAGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGGTTTACCGACTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCTTCTATCCTGGTGACTCTGATGCCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAACACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTATTGTGCGAGACGGCGAGATATAGTGGGAGGTACTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCCTCTCTCTCT

<C2IgG1/pCR4>(SEQ ID NO.49)

AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTTCTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTCGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAG CTCACCTATATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACGCTCTCTCTCTAGAGAGAGAGGTCGACCACCATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTAGTAGTTACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATTATAGTGGGAGTACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAGCCAGTTCTTCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACAAGGGACGGGGCTCGCCCTATTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCCTCTCTCTCT

实施例7：重组型抗体的制备

将实施例6中构建的重组型抗体表达载体导入宿主细胞，制备重组型抗体表达细胞。用于表达的宿主细胞使用CHO细胞的dhff缺损株(ATTC CRL-9096)。载体向宿主细胞的导入通过电穿孔实施。将约2μg抗体表达载体用限制酶实行线状化，使用Bio-Rad electrophoreter、在350V、500μF的条件下，向4×10⁶个CHO细胞中导入基因，接种于96孔培养板中。添加与表达载体的选择标记对应的试剂继续培养。确认有集落后，按照实施例4所示的方法筛选抗体表达株。由筛选的细胞进行抗体纯化，该纯化按照实施例8进行。按照所附说明书，将重组型抗体表达载体导入FreeStyle293细胞(Invitrogen公司制备)中，使重组型抗体表达。

实施例8：抗体的纯化

含有人IgG抗体的杂交瘤培养上清的制备按以下方法进行。将生成抗体的杂交瘤在含有牛胰岛素(5μg/mL，Gibco公司制备)、人转铁蛋白(5μg/mL，Gibco公司制备)、乙醇胺(0.01mM，Sigma公司制备)、亚硒酸钠(2.5×10^-5mM，Sigma公司制备)的eRDF培养基(极东制药公司制备)中驯化。在组织培养瓶中培养，在杂交瘤的活细胞率达到90％时回收培养上清，回收的上清供给10μm和0.2μm的滤器(GelmanScience公司制造)，除去杂交瘤等的杂质。将含有抗体的培养上清用蛋白A (Amersham公司制造)、使用PBS作为吸附缓冲液、20mM柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0)作为洗脱缓冲液进行亲和纯化。洗脱组分是添加50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，调节至pH 6.0附近。制备的抗体溶液使用透析膜(截止分子量10,000，Spectrum Laboratories公司制造)置换成PBS，用孔径0.22μm的膜滤器MILLEX-GV(Millpore公司制造)过滤灭菌，得到纯化抗体。纯化抗体的浓度是测定280nm的吸光度，以1mg/mL作为1.45优化密度(Optimal density)进行计算。

实施例9：各单克隆抗体的特异性

按照与实施例5所标记的FACS分析同样的方法进行实施例4中获得的各单克隆抗体的反应性研究。实施例2中制备的细胞株用染色缓冲液(SB)制备成2×10⁶/mL，将该细胞悬浮液分注在96孔圆底板(Becton Dickinson公司制造)中(50μL/孔)。将实施例4至实施例8中制备的各重组体抗体用SB制备成5μg/mL，将50μL加入到各孔中进行搅拌。阴性对照是使用用KM小鼠制备的抗二硝基苯基(DNP)人IgG1抗体。在冰点温度下反应30分钟，然后离心(2000rpm，4℃，2分钟)，除去上清。将沉淀物用100μL/孔的SB洗涤一次，然后添加50μL/孔稀释为200倍的RPE荧光标记兔抗人IgκF(ab′)₂抗体(Dako Cytomation公司制备)，在冰点温度下反应30分钟。用SB洗涤一次，然后悬浮于300μL的SB中，用FACS测定表示抗体结合的荧光强度。

结果，任何抗体均对表达hCD98/hLAT1-E的CT26细胞(图1)或表达hCD98/hLAT1-E的L929细胞(图2)具有强的结合活性，而未观察到对CT26细胞和L929细胞的结合活性。并且，任何抗体均未与表达hLAT1-E的L929细胞结合，而与表达hCD98的L929细胞结合，由此表明，C2、K3、7-95-8、10-60-7、3-69-6和1-40-1抗体的结合部位位于hCD98(图2)。

实施例10：与各单克隆抗体的抗原结合相关的hCD98蛋白的区域

对各单克隆抗体结合中重要的hCD98的分子的区域进行了研究。

首先，通过对与衣霉素处理的K562细胞株的反应性进行了研究。将2×10⁵个K562细胞接种于6孔板中(4mL/孔)，在5μg/mL衣霉素(Sigma公司制备)的存在下、非存在下、在37℃下、在5％CO₂下培养72小时。该条件下，通过蛋白质印迹确认了约为80Kda的hCD98的分子量为获得了N-link糖链时的理论值约60kDa。培养后，回收细胞，将2×10⁶/mL的细胞株悬浮于染色缓冲液(SB)中。将细胞悬浮液分注到96孔圆底板中(50μL/孔)(Becton Dickinson公司制造)。加入50μL/孔用SB制备为5μg/mL的各重组体抗体，在冰点温度下反应30分钟。阴性对照使用抗DNP人IgG1抗体。用SB洗涤一次，然后将RPE荧光标记山羊抗人IgγF(ab′)₂抗体(SuthernBiotech公司制备)，用SB稀释为200倍加入，在冰点温度下温育30分钟。用SB洗涤一次，然后悬浮于300μL的FACS缓冲液中，用FACS测定表示抗体结合的荧光强度。

其结果，与衣霉素未处理的K562细胞比较，任何抗体均未观察到处置细胞的结合活性降低(图3)。由以上结果表明，各抗体的结合部位均不是N-link糖链，强烈显示这些单克隆抗体为hCD98的抗体。并在实施例11中研究了各单克隆抗体的结合中重要的hCD98的区域。

实施例11：各抗体结合反应中重要的人CD98蛋白质的区域

各抗体对于小鼠CD98(mCD98)不显示交叉反应性，因此利用将mCD98和hCD98人工结合而成的嵌合体CD98，对各抗体结合反应中重要的人CD98蛋白质的区域进行了研究。

嵌合体CD98如下制备。由mCD98和hCD98的序列信息合成以下序列：

EcoRI hCD98U(5′-CCG GAA TTC cCa cCa TGA GCC AGG ACACCG AGG TGG ATA TGA-3′(SEQ ID NO：50))，NotI hCD98(5′-AAG GAA AAA AGC GGC CGC TCA TCA GGC CGC GTA GGG GAAGCG GAG CAG CAG-3′(SEQ ID NO：51))，EcoRI mCD98(5′-CCG GAA TTC CCA CCA TGA GCC AGG ACA CCG AAG TGG ACATGA AA-3′(SEQ ID NO：52))，NotI mCD98L(5′-AAG GAA AAAAGC GGC CGC TCA TCA GGC CAC AAA GGG GAA CTG TAA CAGCA-3′(SEQ ID NO：53))，cCD98D2-F(5′-TCA TTC TGG ACC TTACTC CCA ACT ACC-3′(SEQ ID NO：54))，cCD98D2-R(5′-GGTAGT TGG GAG TAA GGT CCA GAA TGA-3′(SEQ ID NO：55))，cCD98D3-F(5′-TGC TCT TCA CCC TGC CAG GGA CCC CTG TTTT-3′(SEQ ID NO：56))，and cCD98D3-R(5′-AAA ACA GGG GTCCCT GGC AGG GTG AAG AGC A-3′(SEQ ID NO：57))

在进行PCR时作为模板使用的是保有编码mCD98(GenBank/EMBL/DDBJ accession no.U25708)和人CD98的cDNA的质粒载体pcDNA3.1-mCD98和实施例1中制备的pEF6/hCD98。

cDNA的扩增使用东洋纺公司制备的KOD-Plus。将含有15μLcDNA、5μL 10xKOD-Plus缓冲液、5μL dNTP mix、1μL KOD-Plus、3μL 25mM MgSO₄、F引物和R引物的组成的反应液用重蒸馏水定容为终容量50μL，供给PCR。

使用cDNA1和F引物1和R引物1、或者cDNA2和F引物2和R引物2，进行25次94℃15秒、60℃30秒、68℃90秒(94℃15秒、55℃30秒、68℃50秒)的循环。将该反应液供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化PCR扩增产物。将该PCR扩增产物分别命名为P1、P2。接着各加入5μL P1和P2的2～3倍稀释液，在无引物下进行3次94℃15秒、55℃30秒、68℃2分钟的循环。将该反应液在99℃加热5分钟后稀释5～10倍，以5μL作为模板，使用F引物1和R引物2，进行25次94℃15秒、60(55℃)30秒、68℃2分钟的循环。将该反应液供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化PCR产物。

嵌合体CD98-1、嵌合体CD98-2、嵌合体CD98-3分别按照(cDNA1：F引物1：R引物1；cDNA2和F引物2：R引物2)以下组合(pEF6/hCD98：EcoRIhCD98U：cCD98D2-R；pcDNA3.1-mCD98：cCD98D2-F：NotImCD98L)、(pEF6/hCD98：EcoRIhCD98U：cCD98D3-R；pcDNA3.1-mCD98：cCD98D3-F：NotImCD98L)；(pcDNA3.1-mCD98：EcoRImCD98U：cCD98D2-R；pEF6/hCD98：cCD98D2-F：NotIhCD98L)制备。将各PCR扩增cDNA片段用EcoRI、NotI消化，与用相同的酶切断的pEF6myc-His/Bsd载体(Invitrogen公司制备)连接。确定插入部分的DNA核苷酸序列，进行PCR扩增，确认插入的序列与作为模板的基因序列没有不同。按照与实施例2同样的方法，将各载体与在实施例1中制备的pEF1/hLAT1-EGFP载体一起在L929细胞中表达，按照与实施例10相同的FACS分析，研究各FITC标记抗体的结合。其结果(图4)，K3、7-95-8、10-60-7和3-69-6抗体与市售的FITC标记抗人CD98抗体(克隆UM7F8，BectonDickinson公司制备的Ca.No.556076)同样，只与表达嵌合CD98-3的L929细胞结合，显示由hCD98的第372号氨基酸残基至第530号氨基酸残基的区域对于这些抗体的结合是重要的。另一方面，C2抗体和1-40-1中和抗体只与嵌合体CD98-2强烈结合，表明hCD98的第104号氨基酸残基至第371号氨基酸残基对于这些抗体的结合是重要的。

实施例12：各单克隆抗体的抑制氨基酸摄取的活性

为了研究各单克隆抗体是否影响人膀胱癌细胞株T24细胞摄取氨基酸，使用亮氨酸作为底物，按照金井等人的方法(Kim等人.，Biochim.Biophys.Acta 1565：112～122，2002)，进行如下所述的底物的摄取实验。将1×10⁵的T24细胞株接种于24孔培养板中，在含有10％FCS的MEM培养基(SIGMA ALDRICH公司制备)、在37℃下、5％CO₂下培养2天。培养后除去培养基，添加0.25mL/孔含有200μg/mL抗体的HBSS(-)(不含Na⁺)，再在37℃、5％CO₂下培养10分钟。C2、K3、7-95-8、10-60-7、3-69-6、1-40-1和抗DNP人抗体是使用重组体抗体，5-80-1使用来自杂交瘤的抗体。然后除去上清，加入0.5mL/孔含有1μM的¹⁴C-Leu(MORAVEK BIOCHEMICALS制备)的HBSS(-)(不含Na⁺)，培养1分钟。用冰冷却HBSS(-)(不含Na⁺)溶液洗涤3次，然后以0.5mL/孔添加0.1N氢氧化钠，回收细胞。回收的溶液中¹⁴C-Leu的量通过液体闪烁计数器型号LSC-5100(ALOKA公司制造)测定。各细胞的¹⁴C-Leu的摄取量是通过BCA法测定回收的溶液中的蛋白质浓度，以蛋白质量进行标准化。其结果(图5)，与对照抗体(DNP人抗体)相比，1-40-1、K3、C2IgG1、10-60-7和3-69-6显著抑制亮氨酸的摄取。以下的实验使用显著抑制亮氨酸的摄取的1-40-1、K3、C2IgG1、10-60-7和3-69-6来实施。

实施例13：各单克隆抗体的抗hCD98/hLAT1抗体的荧光标记

各抗体的荧光标记按以下方法进行。按照所附说明书，将荧光物质异硫氰酸荧光素(FITC，Sigma公司制备)与实施例4至实施例8中制备的各重组体抗体结合。将溶解于二甲基甲酰胺的FITC以抗体分子的20～40倍的量添加到用200mM的碳酸钠缓冲液(pH 8.3～8.5)制成的1～2mg/mL的抗体中，边搅拌边在室温下反应2～3小时。将混合液供给用PBS平衡的凝胶过滤柱(NAP5，Amersham PharmaciaBiotech)，除去与抗体未结合的FITC。在该条件下，约3个FITC与1分子抗体结合。荧光标记的抗体与均确认了hCD98表达的人结肠直肠癌细胞株DLD-1细胞株结合。

实施例14：各单克隆抗体与来自人末梢血的T细胞、B细胞、单核细胞和正常人主动脉内皮细胞(HAEC)的反应性

已知CD98在单核细胞、活化T细胞、培养的正常内皮细胞中表达。由此研究各抗体与来自人末梢血的T细胞、B细胞、单核细胞和人主动脉内皮细胞(HAEC)的反应性。来自人末梢血的细胞按以下方法制备。将10mL含有1mL肝素(Novo公司制备)的人末梢血用PBS稀释为2倍，铺在20mL的Ficoll-Paque PLUS液上(Amersham PharmaciaBiotech公司制备)，以1500rpm离心30分钟后回收。用PBS洗涤2次，制备单核细胞。一部分单核细胞用含有10μg/ml植物血凝素(Sigma公司制备，PHA)、10％FCS、0.1mM非必需氨基酸溶液(Gibco制备)、5.5×10^-6M 2-巯基乙醇(Gibco公司制备)、青霉素/链霉素/谷氨酰胺(Gibco公司制备)的RPMI培养基(Gibco公司制备)，在5％CO₂、37℃下培养72小时。通过PHA刺激，在来自人末梢血的T细胞、B细胞中观察到作为活化标志的CD25的表达(使用FITC标记抗人CD25抗体(Becton Dickinson公司制备的Ca.555431)的FACS分析)。制备的各细胞在染色缓冲液(SB)中以2×10⁶/mL悬浮，将细胞悬浮液分注到96孔圆底板(Becton Dickinson公司制备)中(50μL/孔)。将实施例13中制备的各FITC标记抗体以5μg/mL的浓度与抗人CD3抗体(BectonDickinson公司制备的Ca.No.555340)或抗人CD14抗体(BectonDickinson公司制备的Ca.No.347497)或抗人CD 19抗体(Immunotech公司制备的Ca.No.IM1285)一起在冰点温度下反应30分钟。使用市售的FITC标记抗人CD98抗体(克隆UM7F8)作为阳性对照，使用FITC标记抗DNP人IgG1抗体作为阴性对照。用SB洗涤一次，然后悬浮于300μL的FACS缓冲液中，用FACS研究各抗体的反应性。

结果，C2IgG1以外的抗体显示与UM7F8同样的结合方式，与单核细胞、活化T细胞、活化B细胞显著结合(图6和图7)。而C2IgG1对于各种细胞均未观察到显著结合(图6和图7)。

HAEC(Cambrex公司制备)按照所附说明书培养，使用继代数为四以内的细胞。C2IgG1、K3、7-95-8、10-60-7、3-69-6和1-40-1抗体与培养的HAEC的反应性按照与上述同样的方法进行研究。以3.2ng/mL-50μg/mL的浓度进行各抗体的反应，结果K3、7-95-8、10-60-7、3-69-6和1-40-1与HAEC结合，但C2IgG1不与HAEC结合(图8)。

另一方面，在相同条件下与人结肠直肠癌细胞株DLD-1反应，则任何抗体均在某种条件下(本实施例中为3μg/mL以下的抗体浓度)显示比UM7F8高的DLD-1癌细胞特异性(图8)。特别是C2IgG1强烈显示为癌症特异性高的抗体。以下实验使用C2IgG1、K3、3-69-6来实施。

实施例15：各单克隆抗体与癌细胞株的反应性

按照与实施例9相同方法的FACS分析进行C2IgG1、K3以及3-69-6与结肠直肠癌细胞株(DLD-1)、肺癌细胞株(H226)、前列腺癌细胞株(DU145)、黑素瘤细胞株(G361、SKMEL28、CRL1579)、非霍奇金淋巴瘤株(Ramos)、膀胱癌细胞株(T24)、乳腺癌细胞株(MCF、MDA-MB-231)、胰腺癌细胞株(HS766T)、多发性骨髓瘤细胞株(IM9)、成红细胞白血病细胞株(K562，参照图3)的各抗体反应性的研究。将细胞株用染色缓冲液(SB)制备成2×10⁶/mL，将该细胞悬浮液分注到96孔圆底板(Becton Dickinson公司制备)中(50μL/孔)。加入50μL/孔制备成5μg/mL的抗体或FITC标记抗体，在冰点温度下反应30分钟。阴性对照是使用抗DNP人IgG1抗体或FITC标记抗DNP人IgG1抗体。用SB洗涤一次，然后加入50μL用SB将RPE荧光标记山羊抗人IgγF(ab′)₂抗体(SuthernBiotech公司制备)稀释为200倍所得，在冰点温度下孵育30分钟。采用FITC标记抗体时不实施该操作。用SB洗涤一次，然后悬浮于300μL FACS缓冲液中，用FACS测定各细胞的平均荧光强度。

结果可知，任何抗体均是与各种癌细胞株具有结合活性的抗体(图9、图10)。任何抗体均与Colo205、SW480、SW620、LOVO、LS180和HT29的人结肠直肠癌细胞株强烈结合。

实施例16：小鼠癌症模型中K3、C2IgG1和3-69-6的抗肿瘤效果

按照以下所述方法，使用小鼠癌症模型对实施例4至实施例8中制备的重组体单克隆抗体K3、C2IgG1和3-69-6的抗肿瘤效果进行研究。

将5周龄的Balb/c裸小鼠(购自日本Clea(株)公司)根据各个体的体重以5只为一组进行分组。在100μL PBS中混合5×10⁶的结肠直肠癌细胞Colo205和5μg抗体，将所得移植到腹部皮下。移植后第2天、第4天、第6天，将100μg/100μL的溶解于溶剂(含1％小鼠血清的PBS)的抗体给予小鼠腹腔内，测定肿瘤大小。使用溶剂作为抗体的阴性对照。

以上实验结果如图11所示。图中的各折线表示各小鼠的数据。对照组中，在第5天，在所有的个体中均观察到癌细胞株的移入物生长(engraftment)，第12天，肿瘤的平均体积(以长径×短径×短径×0.5计算)±SE为165.55±31.71mm³。而C2IgG1组只有一个个体显示与对照组同样的肿瘤生长(第12天肿瘤块为169.44mm³)，其它个体通过给予C2IgG1抗体而观察到强的抗肿瘤活性，第28天，对照组的肿瘤块平均体积±SE为1977.64±442.04，而C2IgG1抗体给药组为775.31±622.47，C2IgG1抗体显著抑制来自Colo205癌细胞的肿瘤的生长(p＜0.01)。K3组和3-69-6组中，所有个体即使经过30天以上也未见癌的移入物生长。另外，各组的平均体重只有对照组中降低(移植第30天时比K3组约低20％)。

由这些结果可以观察到，K3、C2IgG1和3-69-6是具有癌细胞生长抑制活性的抗体。

实施例17：C2IgG1单克隆抗体对于小鼠同系担癌模型的抗肿瘤效果

按照以下所述方法，使用小鼠同系癌症模型，对实施例4至实施例8中制备的重组体单克隆抗体C2IgG1的抗肿瘤效果进行研究。

将移植了5×10⁶个细胞的实施例2中制备的表达hCD98/hLAT1-E的CT26细胞的Balb/c(雌性)按照肿瘤的体积分成两组，每组5只。肿瘤体积生长至约90mm³(以长径×短径×短径×0.5计算)时(第0天)和第3天、第5天，小鼠腹腔内给予溶解于溶剂(含1％小鼠血清的PBS)的100μg/100μL的C2IgG1。对照是给予溶剂。其结果，观察到C2IgG1具有显著的强烈抑制移入的肿瘤生长的活性(图12)。

实施例18：C2IgG1和K3抗体与猴细胞的交叉反应性

通过FACS分析，研究C2IgG1和K3与猴细胞(COS-7细胞)的交叉反应性。将2×10⁶/mL细胞悬浮于染色缓冲液(SB)中。将细胞悬浮液分注到96孔圆底板(Becton Dickinson公司制造)中(50μL/孔)。加入50μL用SB制备成5μg/mL的抗体，在冰点温度下反应30分钟。阴性对照是使用DNP人IgG1抗体。用SB洗涤一次，然后加入50μL/孔用SB稀释为200倍的RPE荧光标记山羊抗人IgγF(ab′)₂抗体(SuphernBiotech公司制备)，在冰点温度下反应30分钟。用SB洗涤一次，然后悬浮于300μL的FACS缓冲液中，通过FACS测定表示抗体结合的荧光强度。其结果，任何抗体均与COS-7细胞株结合，C2IgG1、K3是与猴细胞具有交叉反应性的抗体(图13)。

实施例19：C2IgG1对小鼠担癌模型的效果

按照以下所述方法，使用小鼠担癌模型对C2IgG1的抗肿瘤活性进行研究。

将伯基特淋巴瘤细胞株Ramos(购自ATCC)以3×10⁶/小鼠个体移植到6周龄的Balb/c-SCID小鼠(购自日本Clea(株)公司)的背部皮下。移植13天后，测定移入的肿瘤大小，将肿瘤大小为30～140mm³的担癌小鼠分为一组，每组6只。在担癌小鼠的腹腔内分别以3次/周给药100mg/小鼠个体C2IgG1(溶解于200mL的PBS中)。阳性对照是使用利妥昔单抗(全药工业株式会社)，阴性对照使用PBS。每周测定三次肿瘤体积和体重。测定肿瘤块的长径、短径、高度，以(长径)×(短径)×(高度)÷2的值作为肿瘤体积。

结果如图14所示。通过给予C2IgG1，自肿瘤移植后第16天，可见显著的抑制肿瘤生长的效果。

实施例20：C2IgG1NS氨基酸修饰体

C2IgG1和C2IgG1NS在制备重组抗体时其聚集物含量均高。因此，在SEQ ID NO.47所示的C2IgG1NS的轻链可变区序列中，以相当于翻译起始密码子ATG的第5号M(甲硫氨酸)作为1位氨基酸，将由其计数的第117号的I(异亮氨酸)置换为其它的氨基酸，进行修饰体的制备。

C2IgG1NS/I117N载体的制备

为了制备将轻链117位异亮氨酸置换为天冬酰胺的C2IgG1NS/I117N，以实施例6中制备的N5KG1-Val C2IgG1NS载体作为模板，使用GeneEditor^TM体外位点定向诱变系统(Promega公司的No.Q9280)，通过位点特异性突变导入法制备编码氨基酸置换体的各种突变DNA。

突变导入用的寡核苷酸(5′末端已进行磷酸化)是使用C2NS Lc117I/HYND-p：(5’-TCAGTATGGT AGCTCACCTN ATTTCACTTTCGGCCCTGGG ACC-3’(N＝A·T·G·C)(SEQ ID NO.69))。将作为目标的突变导入用寡核苷酸和上述试剂盒附属的选择寡核苷酸与模板DNA退火，合成突变导入链，然后在GeneEditor^TM AntibioticSelection Mix的存在下，利用只有突变体生长来选择突变体。更具体地说，在碱性条件下(0.2M NaOH、0.2mM EDTA(终浓度))、在室温下将dsDNA模板温育5分钟，然后加入十分之一容量的2M乙酸铵(pH 4.6)，进行中和，然后通过乙醇沉淀来回收。进行了碱性改性处理的模板DNA中加入突变导入用的寡核苷酸和新的用于获得抗生素抗性的选择寡核苷酸(Bottom Select Oligo，5’-末端磷酸化的5’-CCGCGAGACC CACCCTTGGA GGCTCCAGAT TTATC-3’(SEQID NO.85))、以及试剂盒所附的退火缓冲液，然后在75℃下保温5分钟，缓慢降至37℃，由此进行退火。接着，为了进行突变链的合成和连接，加入试剂盒所附的合成10×缓冲液、T4DNA聚合酶和T4DNA连接酶，在37℃下进行90分钟的反应。在GeneEditor^TM AntibioticSelection Mix的存在下，转化感受态BMH71-18mutS，由所培养的转化体大肠杆菌中制备质粒DNA，再通过电穿孔法转化ElectroMAX.DH10B细胞(Invitrogen公司的No.18290-015)后，将该DNA接种于含有GeneEditor^TM Antibiotic Selection Mix的LB板上。培养在板上生成的转化体，纯化质粒DNA，分析DNA核苷酸序列。DNA核苷酸序列的结果显示，获得了导入有目标氨基酸突变的C2IgG1NS突变体的表达载体。将得到的表达一个氨基酸置换突变体蛋白的质粒DNA命名为N5KG1-Val C2IgG1NS/I117N载体。

C2IgG1NS/I117C载体的制备

为了制备将轻链117位异亮氨酸置换为半胱氨酸的C2IgG1NS/I117C，以实施例6中制备的N5KG1-Val C2IgG1NS载体作为模板，使用GeneEditor^TM体外位点定向诱变系统(Promega公司的No.Q9280)，通过位点特异性突变导入法制备编码氨基酸置换体的各种突变DNA。

突变导入用的寡核苷酸(5′末端已进行磷酸化)是使用C2NS Lc117I/GRC-p：(5’-TCAGTATGGT AGCTCACCTB GTTTCACTTTCGGCCCTGGG ACC-3’(B＝C.G·T)(SEQ ID NO.70))。将作为目标的突变导入用寡核苷酸和上述试剂盒附属的选择寡核苷酸与模板DNA退火，合成突变导入链，然后在GeneEditor^TM Antibiotic SelectionMix的存在下，利用只有突变体生长来选择突变体。更具体地说，在碱性条件下(0.2M NaOH、0.2mM EDTA(终浓度))、在室温下将dsDNA模板温育5分钟，然后加入十分之一容量的2M乙酸铵(pH 4.6)，进行中和，然后通过乙醇沉淀来回收。进行了碱性改性处理的模板DNA中加入突变导入用的寡核苷酸和新的用于获得抗生素抗性的选择寡核苷酸(Bottom Select Oligo，5’-末端磷酸化的5’-CCGCGAGACCCACCCTTGGA GGCTCCAGAT TTATC-3’(SEQ ID NO.85))、以及试剂盒所附的退火缓冲液，然后在75℃下保温5分钟，缓慢降至37℃，由此进行退火。接着，为了进行突变链的合成和连接，加入试剂盒所附的合成10×缓冲液、T4DNA聚合酶和T4DNA连接酶，在37℃下进行90分钟的反应。在GeneEditor^TM Antibiotic Selection Mix的存在下，转化感受态BMH71-18mutS，由所培养的转化体大肠杆菌中制备质粒DNA，再通过电穿孔法转化ElectroMAX.DH10B细胞(Invitrogen公司的No.18290-015)后，将该DNA接种于含有GeneEditor^TMAntibiotic Selection Mix的LB板上。培养在板上生成的转化体，纯化质粒DNA，分析DNA核苷酸序列。DNA核苷酸序列的结果显示，获得了导入有目标氨基酸突变的C2IgG1NS突变体的表达载体。将得到的表达一个氨基酸置换突变体蛋白的质粒DNA命名为N5KG1-ValC2IgG1NS/I117C载体。

C2IgG1NS/117IL载体的制备

以实施例6中制备的N5KG1-Val C2IgG1NS载体作为模板，按照以下方法制备将轻链117位异亮氨酸置换为亮氨酸的C2IgG1NS/I117L。

DNA的扩增是使用东洋纺公司的KOD-Plus。将含有1μL cDNA、5μL 10xKOD-Plus缓冲液、5μL dNTP mix、1μL KOD-Plus、2μL 25mM MgSO₄、F引物和R引物组成的反应液用重蒸馏水定容为终容量50μL，供给PCR。

合成C2NS Lc 117IL R(5’-GGTCCCAGGG CCGAAAGTGAATAGAGGTGA GCTACCATAC TGCTG-3’(SEQ ID NO.71))，使用C2NS Lc 117IL R和C2-1Lc Bgl II F(5’-AGA GAG AGA GAT CTCTCA CCA TGG AAA CCC CAG CGCAGC TTC TCT TC-3’(SEQ IDNO.18))，以N5KG1-Val C2IgG1NS载体为模板，进行25次94℃15秒、60℃30秒和68℃1分钟的循环。将该反应液供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化PCR扩增产物。将该PCR扩增产物命名为C2NSI117L-F。接着，使用C2NS Lc 117IL F(5’-GCAGTATGGT AGCTCACCTC TATTCACTTT CGGCCCTGGGACC-3’(SEQ ID NO.72))和C2NS EcoRI R(5’-CCGGAATTCAACACTCTCCC CTGTTGAAGC TCTTTGTGAC GG-3’(SEQ IDNO.73))，以N5KG1-Val C2IgG1NS载体为模板，进行25次94℃15秒、60℃30秒和68℃1分钟的循环。将该反应液供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化该反应液。将该PCR扩增产物命名为C2NSI117L-R。接着，各加入5μl C2NSI117L-F和C2NSI117L-R的2倍稀释液，无引物，进行3次94℃15秒、55℃30秒、68℃60秒的循环。将该反应液在99℃加热5分钟后稀释5倍，以5μl为模板，使用C2-1Lc Bgl II F引物和C2NS EcoRI R引物，进行25次94℃15秒、55℃30秒、68℃60秒的循环。将该反应液供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化PCR扩增产物。将该PCR扩增cDNA片段用BglII、EcoRI消化，导入到含有用相同的酶切断的上述C2重链基因的N5KG1-Val Lark载体中。确定插入部分的DNA核苷酸序列，进行PCR扩增，确认插入的序列与作为模板的基因序列没有不同。将所得表达1个氨基酸置换突变体蛋白的质粒DNA命名为N5KG1-Val C2IgG1NS/I117L载体。

C2IgG1NS/117IM载体的制备

以实施例6中制备的N5KG1-Val C2IgG1NS载体作为模板，按照以下方法制备将轻链117位异亮氨酸置换为甲硫氨酸的C2IgG1NS/I117M。

合成C2NS Lc 117IM R(5’-GGTCCCAGGG CCGAAAGTGAACATAGGTGA GCTACCATAC TGCTG-3’(SEQ ID NO.74))，使用C2NS Lc 117IM R和C2-1Lc Bgl II F(5’-AGA GAG AGA GAT CTCTCA CCA TGG AAA CCC CAG CGCAGC TTC TCT TC-3’(SEQ IDNO.18))，以N5KG1-Val C2IgG1NS载体为模板，进行25次94℃15秒、60℃30秒和68℃1分钟的循环。将该反应液供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化PCR扩增产物。将该PCR扩增产物命名为C2NSI117M-F。接着，使用C2NS Lc117IM F(5’-GCAGTATGGT AGCTCACCTA TGTTCACTTT CGGCCCTGGGACC-3’(SEQ ID NO.75))和C2NS EcoRI R(5’-CCGGAATTCAACACTCTCCC CTGTTGAAGC TCTTTGTGAC GG-3’(SEQ IDNO.76))，以N5KG1-Val C2IgG1NS载体为模板，进行25次94℃15秒、60℃30秒和68℃1分钟的循环。将该反应液供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化PCR扩增产物。将该PCR扩增产物命名为C2NSI117M-R。接着，各加入5μ1C2NSI117M-F和C2NSI117M-R的2倍稀释液，无引物，进行3次94℃15秒、55℃30秒、68℃60秒的循环。将该反应液在99℃加热5分钟后稀释5倍，以5μl为模板，使用C2-1Lc Bgl II F引物和C2NS EcoRI R引物，进行25次94℃15秒、55℃30秒、68℃60秒的循环。将该反应液供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化PCR扩增产物。将该PCR扩增cDNA片段用BglII、EcoRI消化，导入到含有用相同的酶切断的上述C2重链基因的N5KG1-Val Lark载体中。确定插入部分的DNA核苷酸序列，进行PCR扩增，确认插入的序列与作为模板的基因序列没有不同。将所得表达1个氨基酸置换突变体蛋白的质粒DNA命名为N5KG1-Val C2IgG1NS/I117M载体。

C2IgG1NS氨基酸修饰体的制备

按照实施例7所示的方法，按照所附说明书，将C2IgG1NS/I117L载体、C2IgG1NS/I117M载体、C2IgG1NS/I117N载体和C2IgG1NS/I117C载体导入FreeStyle293细胞(Invitrogen公司制备)中，使重组型抗体表达。抗体的纯化是将实施例8所示的方法部分改良来进行。回收第6天的培养上清，用Steriflip-GP(MILLIPORE，SCGP00525)进行过滤，由此排除细胞等杂质。使用蛋白A(Amersham公司制造)，使用PBS作为吸附缓冲液、20mM柠檬酸钠缓冲液(pH 3.4)作为洗脱缓冲液，对含有抗体的培养上清进行亲和纯化。洗脱组分是添加200mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，调节成pH 5.5附近。制备的抗体溶液使用vivascin6(截止分子量10KMV，VIVA SCIENCE，VS0601)进行浓缩(3000rpm)，再添加PBS，通过离心获得置换为PBS的纯化抗体。纯化抗体的浓度是测定280nm的吸光度，以1mg/mL为1.45优化密度进行计算。

C2IgG1NS氨基酸修饰体的聚集物含有率的测定

使用10μg(0.1mg/mL)所得氨基酸修饰抗体，测定各纯化抗体的聚集物含有率。

抗体溶液的聚集物含有率是使用高效液相色谱装置(岛津制造)和TSK-G3000SW柱(Toso公司制造)，使用20mM磷酸钠、500mM NaC1pH7.0作为溶剂进行分析。将洗脱位置与凝胶过滤HPLC用分子量标志(Oriental酵母公司)(Cat No.40403701)比较，鉴定抗体蛋白的单体和聚集物的峰。由各峰面积计算聚集物的含有率。

结果如图15所示。由图15可知，通过进行上述氨基酸的修饰，聚集物含有率减少。

C2IgG1NS氨基酸修饰体的聚集物含量的测定

按照实施例14和15的方法，通过FACS分析C2IgG1NS氨基酸修饰体与肿瘤细胞株、人CD98/人LAT1强制表达株以及HAEC的反应性。

结果如图16A和图16B所示。上述氨基酸修饰抗体、特别是C2IgG1NS/I117L与强制表达人CD98和LAT1的L929细胞结合，与未经处理的L929不结合(图16A)。这些氨基酸修饰抗体不与HAEC结合，对于Colo205、Ramos、和DLD-1等各种癌细胞显示结合性(图16B)。

这些结果显示，图2A和图8所示的C2IgG1的结合特性同样，由此可以说，上述氨基酸修饰抗体、特别是C2IgG1NS/I117L的聚集物含有率低，对癌细胞具有与C2IgG1同样的结合特异性，且是有望获得与C2IgG1同样的抗肿瘤活性的抗体。

<C2IgG1NS氨基酸修饰体的重链可变区氨基酸序列(与C2IgG1重链可变区氨基酸序列相同)>(SEQ ID NO.43)

STTMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKSQFFLKLSSVTAADTAVYYCARQGTGLALFDYWGQGTLVTVS8

<C2IgG1NS氨基酸修饰体的重链可变区核酸序列(与C2IgG1NS重链可变区核酸序列相同)>(SEQ ID NO.42)

GTCGACCACCATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTAGTAGTTACTACTGGGGGTGGATCGGGGAGCCCCGAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATTATAGTGGGAGTACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACAAGGGACGGGGCTCGCCCTATTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

<C2IgG1NS/117IL的轻链可变区氨基酸序列>(SEQ ID NO.77)

RSLTMETPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLFTFGPGTKVDIK

<C2IgG1NS/117IL的轻链可变区核酸序列>(SEQ ID NO.78)

AGATCTCTCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTTCTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTCGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTCTATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA

<C2IgG1NS/117IM的轻链可变区氨基酸序列>(SEQ ID NO.79)

RSLTMETPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPMFTFGPGTKVDIK

<C2IgG1NS/117IM的轻链可变区核酸序列>(SEQ ID NO.80)

AGATCTCTCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTTCTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGGTCCTCATCTATGGTGGATGCAGCAGGGCCAGTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTCGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTATGTTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA

<C2IgG1NS/117IN的轻链可变区氨基酸序列>(SEQ ID NO.81)

RSLTMETPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPNFTFGPGTKVDIK

<C2IgG1NS/117IN的轻链可变区核酸序列>(SEQ ID NO.82)

AGATCTCTCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTTCTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTCGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTAATTTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA

<C2IgG1NS/117IC的轻链可变区氨基酸序列>(SEQ ID NO.83)

RSLTMETPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPCFTFGPGTKVDIK

<C2IgG1NS/117IC的轻链可变区核酸序列>(SEQ ID NO.84)

AGATCTCTCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTTCTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTCGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTTGTTTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA