CN117561276A - 抗cd98抗体及其应用 - Google Patents

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CN117561276A CN202180099629.4A CN202180099629A CN117561276A CN 117561276 A CN117561276 A CN 117561276A CN 202180099629 A CN202180099629 A CN 202180099629A CN 117561276 A CN117561276 A CN 117561276A
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Abstract

本公开内容提供了结合小鼠CD98(mCD98)或hCD98(hCD98)的抗体及其抗原结合片段。具体地，本公开内容的抗体以pH依赖性的方式与其靶标结合。还提供了编码所述抗体或其片段的核苷酸、包含所述抗体或其片段的组合物或组合，以及通过使用所述抗体或其片段治疗疾病如癌症的方法。

Description

抗CD98抗体及其应用
技术领域
本文公开提供单克隆抗体，特别是特异性结合人或小鼠CD98的单克隆抗体。还提供编码抗CD98抗体的核酸分子，以及包含所述核酸分子的表达载体以及宿主细胞。还公开了包含抗CD98抗体的药物组合物、偶联物以及多特异性抗体。还提供用于治疗各种疾病，特别是肿瘤，例如表达CD98的肿瘤的方法。
背景技术
II型跨膜蛋白CD98(也被称为CD98重链(CD98hc)或4F2hc，由SLC3A2基因编码)与多种轻链相互作用，形成不同的异二聚体氨基酸转运体(HAT)。轻链在氨基酸转运过程中发挥作用，而CD98通过稳定轻链结构并帮助轻链定位到细胞膜的方式参与转运活性。CD98已被证明通过促进氨基酸转运活性参与肿瘤发生、肿瘤发展和转移，以促进细胞的存活，增强整合素信号传导，并增加细胞的扩散、迁移、存活和生长。在过去的十年中，CD98已成为开发癌症治疗方法的一个有吸引力的靶点，因为它在多种类型的实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤中表达上调，并与不良的临床结果相关。值得注意的是，CD98蛋白在正常组织中广泛表达，包括脑、脾、肾、小肠、睾丸、造血系统等。
在Hayes等人(Int J Cancer 137(2015),710-720)中，抗人CD98(hCD98)抗体IGN523在白血病、淋巴瘤和肺癌的异种移植肿瘤模型中显示出强大的抗肿瘤活性。
CN105385694B公开了一种与CD98结合的单克隆抗体，并教导了其作为载体递送抗肿瘤或抗炎剂的应用。CN105385694B的公开内容仅提供了体外数据，表明抗CD98抗体能够在细胞裂解中与肺癌细胞结合，而没有显示体内数据。抗体在体内的表现，如肿瘤特异性结合活性或药代动力学性质均未知。
WO2007114496A公开了多种抗CD98抗体，其中一些抗体对膀胱癌细胞系中亮氨酸摄取有抑制作用，对携带表达hCD98/hLAT1-EGFP的小鼠CT26结肠癌细胞系的小鼠展现出抗肿瘤作用。克隆之一C2IgG1在移植了人类伯基特(Burkitt)淋巴瘤细胞系Ramos的小鼠中显示出抗肿瘤作用。
还有其他专利申请公开，包括AbbVie的WO2017214456A1、WO2017214458A2、WO2017214462A2和第一三共株式会社(Daiichi Sankyo Co Ltd.)的WO2015146132A1，提供了包括抗CD98抗体和药物如Bcl-xL抑制剂的偶联物。
然而，上述文件中都没有讨论正常组织中抗CD98抗体与CD98结合可能引起的问题。这个问题在携带经基因工程化改造以表达hCD98的癌细胞系的动物模型或异种移植模型中不存在，因为动物模型的正常组织表达小鼠CD98，而其不是抗体的靶标。抗CD98抗体的上靶/脱靶肿瘤(On target/off tumor)结合，一方面可能会破坏正常组织中存在的CD98的功能，另一方面可能会减弱抗体对靶标肿瘤细胞的抗肿瘤作用。
事实上，CD98在正常组织中的广泛表达为临床应用带来了几个主要挑战。靶向破坏CD98基因导致胚胎死亡(Tsumura等人，(2003)，Biochemical and biophysicalresearch communications 308，第847-851页)。条件性敲除CD98损害造血干细胞和祖细胞的增殖和再生能力(Bajaj等人，(2016)，Cancer Cell 30，第792-805页)。因此，靶向性副作用和“抗原沉没(antigen sink)”问题是开发靶向CD98的抗体疗法的主要关注点。
目前对抗CD98抗体作为抗肿瘤疗法的需求尚未得到满足。此外，希望能够开发出对CD98正常生理功能的影响较小，并减少“抗原沉没”现象的副作用的抗CD98抗体。
发明内容
本发明人成功地鉴定了一种抗CD98抗体(S1-F4)，该抗体在异种移植和CD98人源化小鼠构建的同源肿瘤模型中引起广谱的Fc依赖性抗肿瘤活性，且不依赖于干扰CD98的生理功能。S1-F4的抗肿瘤活性需要先天免疫和适应性免疫组分，包括FcγRs、巨噬细胞、树突状细胞和CD8+T细胞。随后，为了克服在正常组织中CD98抗体结合的“抗原沉没”问题，本发明人解析了S1-F4/CD98复合物结构，并生成了一系列pH依赖性结合变体，从而通过增加肿瘤特异性结合和显著改善药代动力学特征来促进整体抗肿瘤活性。
在第一方面，本公开内容涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人或小鼠CD98，其中所述抗体或其抗原结合片段包括：
重链CDR1(HCDR1)，包括选自SEQ ID NO:10、20、30、40、50、60和70的氨基酸序列或由其组成；
重链CDR2(HCDR2)，包括选自SEQ ID NO:11、21、31、41、51、61和71的氨基酸序列或由其组成；
重链CDR3(HCDR3)，包括选自SEQ ID NO:12、22、32、42、52、62和72的氨基酸序列或由其组成；
轻链CDR1(LCDR1)，包括选自SEQ ID NO:15、25、35、45、55、65和75的氨基酸序列或由其组成；
轻链CDR2(LCDR2)，包括选自SEQ ID NO:16、26、36、46、56、66和76的氨基酸序列或由其组成；
轻链CDR3(LCDR3)，包括选自SEQ ID NO:17、27、37、47、57、67和77的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，所述抗体或其片段包括以下(a)至(g)中的任一项：
(a)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其分别包括SEQ ID NO:10、11和12的氨基酸序列或由其组成；和LCDR1、LCDR2、LCDR3，其包括SEQ ID NO:15、16和17的氨基酸序列或由其组成；
(b)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其分别包括SEQ ID NO:20、21和22的氨基酸序列或由其组成；和LCDR1、LCDR2、LCDR3，其包括SEQ ID NO:25、26和27的氨基酸序列或由其组成；
(c)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其分别包括SEQ ID NO:30、31和32的氨基酸序列或由其组成；和LCDR1、LCDR2、LCDR3，其包括SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列或由其组成；
(d)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其分别包括SEQ ID NO:40、41和42的氨基酸序列或由其组成；和LCDR1、LCDR2、LCDR3，其包括SEQ ID NO:45、46和47的氨基酸序列或由其组成；
(e)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其分别包括SEQ ID NO:50、51和52的氨基酸序列或由其组成；和LCDR1、LCDR2、LCDR3，其包括SEQ ID NO:55、56和57的氨基酸序列或由其组成；
(f)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其分别包括SEQ ID NO:60、61和62的氨基酸序列或由其组成；和LCDR1、LCDR2、LCDR3，其包括SEQ ID NO:65、66和67的氨基酸序列或由其组成；
(g)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其分别包括SEQ ID NO:70、71和72的氨基酸序列或由其组成；和LCDR1、LCDR2、LCDR3，其包括SEQ ID NO:75、76和77的氨基酸序列或由其组成；
其中包含以上(a)至(f)中任一项的抗体或其片段特异性结合hCD98，并且包含(g)的抗体或其片段特异性结合小鼠CD98。
在一个实施方案中，抗体或其片段包括：
重链可变区(VH)，其包括与选自SEQ ID NO:13、23、33、43、53、63和73的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同源性的氨基酸序列；和/或
轻链可变区(VL)，其包括与选自SEQ ID NO:18、28、38、48、58、68和78的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，抗体或其片段包括：
VH，其包括选自SEQ ID NO:13、23、33、43、53、63和73的氨基酸序列，和/或
VL，其包括选自SEQ ID NO:18、28、38、48、58、68和78的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，抗体或其片段包括以下(a)至(g)中的任一项：
(a)VH，其包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列或由其组成，和VL，其包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列或由其组成；
(b)VH，其包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列或由其组成，和VL，其包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列或由其组成；
(c)VH，其包括SEQ ID NO:33的氨基酸序列或由其组成，和VL，其包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列或由其组成；
(d)VH，其包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列或由其组成，和VL，其包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列或由其组成；
(e)VH，其包括SEQ ID NO:53的氨基酸序列或由其组成，和VL，其包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列或由其组成；
(f)VH，其包括SEQ ID NO:63的氨基酸序列或由其组成，和VL，其包括SEQ ID NO:68的氨基酸序列或由其组成；
(g)VH，其包括SEQ ID NO:73的氨基酸序列或由其组成，和VL，其包括SEQ ID NO:78的氨基酸序列或由其组成；
其中包含以上(a)至(f)中任一项的抗体或其片段特异性结合hCD98，并且包含(g)的抗体或其片段特异性结合小鼠CD98。
在一个实施方案中，抗CD98抗体或其片段结合hCD98具有pH依赖性，其中抗体或其片段在酸性pH下与hCD98的结合活性高于在中性pH下的结合活性。例如，与中性pH下的结合活性相比，酸性pH下的结合活性高至少2倍、3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。结合活性可以通过现有技术中已知的任何方法测定，例如ELISA、FACS或表面等离子共振(如)。例如，当采用ELISA法测定与hCD98的结合活性时，抗体或其片段在酸性pH下的EC50比在中性pH下的EC50低至少2倍、3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。酸性pH为5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7或6.8，特别是6.5。中性pH为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6，特别是7.4。在一个实施方案中，抗体或其片段在酸性pH下具有需要的结合活性，而在中性pH下没有结合活性或相当低的结合活性。
在一个实施方案中，相对于不在肿瘤细胞上或肿瘤细胞内的hCD98，抗CD98抗体或其片段表现出与在肿瘤细胞上或肿瘤细胞内的hCD98优先结合。具体地，这种结合偏好是通过抗体或其片段与hCD98的pH依赖性结合来实现的。例如，在受试者例如人的肿瘤微环境中的pH下，抗CD98抗体或其片段与hCD98的结合活性显著大于受试者例如人中正常生理pH下的结合活性。例如，当采用ELISA法测定与hCD98的结合活性时，抗体或其片段在肿瘤微环境pH下的EC50比正常生理pH下的EC50低至少2倍、3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、或100倍。在一个实施方案中，肿瘤微环境中的pH可以是约为6.0至7.0的pH，比如pH 7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0或更低，例如pH6.5。在另一个实施方案中，正常生理pH可以是正常血液或血清的pH，例如pH 7.4。在一个实施方案中，抗体或其片段在肿瘤微环境中具有需要的结合活性，并且在正常生理pH下无结合活性或具有相当低的结合活性。
在一个实施方案中，本申请涉及一种抗体或其片段，其与上述抗体或其抗原结合片段中的任一个结合的hCD98上的相同表位结合。具体地，所述抗体或其片段与hCD98的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)的第135、376-384和391-399位氨基酸残基中的表位结合。更具体地，抗体或其片段直接结合其中氨基酸残基H135、E384、E392、D397直接参与结合抗体的表位。
在一个实施方案中，抗CD98抗体包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚类的重链恒定区或其变体，以及κ或λ类型的轻链恒定区或其变体。在一个优选的实施方案中，抗CD98抗体包含IgG1的重链恒定区。
在一个实施方案中，抗原结合片段为单链可变区，Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、dsFv或ds-scFv。
在一个实施方案中，抗体可以是多特异性抗体，例如，双特异性、三特异性抗体、双体或微抗体。
在一个优选的实施方案中，抗体或其片段包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，其分别具有SEQ ID NO:10、11和12的氨基酸序列；以及LCDR1、LCDR2、LCDR3，其具有SEQ ID NO:15、16和17的氨基酸序列；其中，六个CDR的任一个中的一个或多个氨基酸突变为天冬氨酸(D)，或谷氨酸(E)，或突变为组氨酸(H)，并且抗体或其片段显示与hCD98的pH依赖性结合。优选地，突变为D或E的氨基酸位于与hCD98上结合表位内或结合表位附近的组氨酸密切相互作用的位置，或者突变为H的氨基酸位于与hCD98上结合表位内或结合表位附近的天冬氨酸或谷氨酸密切相互作用的位置。
在一个实施方案中，抗体或其片段用于基于抗体的治疗。
在第二方面，本公开内容提供一种分离的多核苷酸，其编码第一方面的抗体或其片段。在一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包括与选自SEQ ID NO:14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69、74或79的核苷酸序列具有至少80％同源性、至少85％同源性、至少90％同源性、至少95％同源性、至少98％同源性或100％同源性的核苷酸序列。
在第三方面，本公开内容涉及一种表达载体，其包括第二方面的分离的多核苷酸。
在第四方面，本公开内容涉及一种宿主细胞，其包括第二方面的分离的多核苷酸或第三方面的表达载体。
在第五方面，本公开内容涉及一种组合物，例如，药物组合物，其包括第一方面的抗CD98抗体或其片段，以及药学上可接受的载体。优选地，所述药物组合物包括治疗有效量的抗CD98抗体或其片段。
在第六方面，本公开内容提供一种在有需要的受试者中减少肿瘤、抑制肿瘤细胞生长、治疗癌症或预防癌症复发的方法，包括向受试者施用治疗有效量的第一方面的抗CD98抗体或其片段或第五方面的组合物。
在第七方面，本公开内容提供一种在有需要的受试者中治疗自身免疫性疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的第一方面的抗CD98抗体或其片段或第五方面的组合物。
在第八方面，本公开内容提供第一方面的所述抗CD98抗体或其片段在制备药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于减少肿瘤、抑制肿瘤细胞生长、治疗癌症、预防癌症复发。在一个实施方案中，所述药物用于治疗自身免疫性疾病。
在第六方面或第八方面的一个实施方案中，所述肿瘤或癌症表达CD98，特别是hCD98。在第六方面或第八方面的一个实施方案中，所述肿瘤或癌症的微环境的pH低于受试者的正常生理pH。例如，所述肿瘤或癌症的微环境具有酸性pH，比如pH 7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0或更低，例如约pH 6.5，且受试者的正常生理pH为正常血液或血清的pH，例如pH 7.4。更具体地，所述癌症选自淋巴瘤、急性骨髓性白血病、急性早幼粒细胞白血病、肝细胞癌、胰腺癌、胰腺上皮样癌、乳腺癌、结直肠腺癌、皮肤表皮样癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、非小细胞肺癌、胃癌、急性髓系白血病、胶质瘤、舌癌、下咽鳞状细胞癌、胆管癌、骨软化症、骨肉瘤、肾癌和神经母细胞瘤。
在第七方面或第八方面的一个实施方案中，所述自身免疫性疾病由免疫细胞如T细胞或B细胞的异常扩增引起。在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病选自多发性硬化症、I型糖尿病或类风湿性关节炎。
在最近的研究中，CD98hc被确定为一种强大的受体介导的胞质转运(RMT)靶点，可促进增强治疗性抗体的脑递送(Y.Joy Yu Zuchero等人，Neuron 89，第70-82页，2016年1月6日)。血脑屏障(BBB)穿透性差的抗体可与抗CD98抗体配对作为双特异性抗体，以改善它们穿过血脑屏障的转运和脑积累。
因此，在第九方面，本公开内容涉及一种融合蛋白，例如双特异性抗体，其包括第一抗原结合片段，其为第一方面的特异性结合hCD98的抗原结合片段，以及第二抗原结合片段，其特异性结合与第一方面的抗原结合片段所结合不同的第二抗原。在一个实施方案中，双特异性抗体是治疗性抗体或诊断性抗体。在一个实施方案中，在系统施用后，与特异性结合第二抗原的单特异性抗体相比，所述双特异性抗体显示出更高的脑积累。
在第十方面，本申请涉及一种治疗肿瘤的组合、偶联物或组合物，其包含(a)第一方面的抗hCD98抗体，和(b)第二抗肿瘤试剂。在一个实施方案中，所述第二抗肿瘤试剂可以是调节免疫检查点蛋白的试剂，包括但不限于PD-1、PD-L1、CTLA-4、4-1BB、4-1BBL、CD28、CD40、CD40L、CD47、OX40、OX40L、TIM-3、TIGIT、NKG2A、B7-H3、B7-H4、VISTA、LAG3、2B4。在一个实施方案中，调节免疫检查点蛋白的试剂是一种特异性结合免疫检查点蛋白的抗体。
本发明人发现，本申请的抗hCD98抗体需要巨噬细胞和CD8+T细胞才能发挥其抗肿瘤作用。因此，在第十方面的优选的实施方案中，第二抗肿瘤剂可以是增强巨噬细胞吞噬功能的试剂，或可以是增强CD8+T细胞作用的试剂。在一个实施方案中，所述第二抗肿瘤试剂是通过靶向吞噬抑制因子(如CD47)来增强巨噬细胞吞噬功能的试剂。在一个具体的实施方案中，增强巨噬细胞吞噬功能的试剂为抗CD47抗体。在另一个实施方案中，所述第二抗肿瘤试剂增强CD8+T细胞的作用，例如通过阻断或逆转细胞介导的免疫应答的负调控，例如通过靶向抑制性受体，来增强CD8+T细胞的作用。在一个具体的实施方案中，所述第二抗肿瘤试剂是特异性结合PD-1、CTLA-4、PD-L1或4-1BB的抗体。在另一个实施方案中，本申请的抗CD98抗体不能与耗竭巨噬细胞的剂剂(如抗CSF1R抗体)联合使用。
附图说明
图1显示了HN2-G9和作为对照的IGN523在Raji肿瘤模型中的抗肿瘤活性。将携带Raji肿瘤的NOD SCID小鼠随机分为平均肿瘤体积相似的三组。测试10mg/kg抗体的抗肿瘤活性。肿瘤体积显示为平均值±SEM。(n.s.，不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；双因素方差分析)。相同的统计方法和图例适用于下文所述的与肿瘤体积相关的所有带线的散点图。
图2显示了利用FACS测定的IGN523、HN2-G9和S1-F4的结合特异性及亲和力(avidity)。野生型(WT)CHO或CHO-hCD98细胞与所示浓度的各个抗体孵育，然后用FITC偶联的抗人IgG二抗标记。根据FITC的荧光强度确定结合。
图3显示了利用SPR分析所示抗hCD98抗体与hCD98 ECD之间的结合动力学。
图4显示了S1-F4在Raji肿瘤模型中与作为对照的利妥昔单抗和IGN523的抗肿瘤活性。将携带Raji肿瘤的NOD SCID小鼠随机分为平均肿瘤体积相似的三组。测试10mg/kg抗体的抗肿瘤活性。
图5为列出用于建立异种移植肿瘤模型的人源细胞系的表格。
图6和图7显示了S1-F4在HepG2(图6)和Ramos(图7)肿瘤模型中的抗肿瘤活性。将携带HepG2肿瘤的CB-17SCID小鼠或携带Ramos肿瘤的NOD SCID小鼠随机分为平均肿瘤体积相似的4-5组，并用所示剂量的S1-F4处理。
图8显示了S1-F4在HL60、HCT-8、BxPC-3和PANC-1肿瘤模型中的抗肿瘤活性。将携带HL60、BxPC-3或HCT-8肿瘤的CB-17SCID小鼠或携带PANC-1肿瘤的NOD SCID小鼠随机分为肿瘤体积相似的两组：对照组或S1-F4(15mg/kg)给药组。抗体处理的时间点用箭头标记。
图9显示了S1-F4在MDA-MB-231-LN肿瘤模型中的抗肿瘤活性。将携带MDA-MB-231-LN肿瘤的CB-17SCID小鼠随机分为平均肿瘤体积相似的两组：溶媒(vehicle)和S1-F4(15mg/kg)。示意图显示肿瘤接种的时间线和S1-F4处理方案。于肿瘤接种后第8、18、29、41天进行生物发光成像分析。
图10显示了S1-F4在HCT 116、A549、A-431、Hep3B和HT-29肿瘤模型中的抗肿瘤活性。将携带HCT 116、A549或A-431肿瘤的CB-17SCID小鼠或携带Hep3B或HT-29肿瘤的NODSCID小鼠随机分为平均肿瘤体积相似的两组：溶媒或S1-F4(15mg/kg)。抗体处理的时间点用箭头标记。肿瘤体积显示为平均值±SEM表示。(n.s.，不显著；双因素方差分析)。
图11A-F显示出了CD98人源化小鼠的构建策略和CD98表达的分析。(A)示意图显示将hCD98 ECD盒插入小鼠Slc3a2基因座的策略。显示了sgRNA-CD98和所示的PCR引物在靶等位基因和野生型等位基因中的位置。(B-D)来自F0代小鼠基因组DNA模板的PCR反应产物的凝胶电泳。使用的引物对(见表S2)为Y1-F/Y1-R(B)、WT1-F/WT1-R(C)，和IF-1/Y1-R(D)。(E)抗小鼠CD98抗体BC8与小鼠CD98(mCD98)ECD结合的动力学分析。(F)通过FACS检测BC8的结合特异性及亲和力。将WT HEK293T和HEK293T-mCD98细胞与所示浓度的BC8孵育，然后用FITC偶联的抗人IgG二抗标记。根据FITC的荧光强度确定结合。
图12显示了通过免疫荧光染色方法分析小鼠肾脏上CD98的表达。来自野生型C57BL/6小鼠和CD98人源化小鼠的肾脏样品与BC8(mCD98特异性抗体，15μg/ml)或IGN523(hCD98特异性抗体，15μg/ml)孵育，然后用FITC偶联的抗人IgG二抗标记。放大倍数×1.3。
图13显示了通过FACS分析的小鼠白细胞上CD98的表达。将C57BL/6小鼠和CD98人源化小鼠的白细胞与BC8或S1-F4(10μg/ml)孵育，然后用FITC偶联的抗人IgG二抗标记。
图14显示了通过FACS分析的小鼠癌细胞上hCD98和mCD98的表达。细胞用S1-F4或BC8(15μg/ml)孵育，然后用FITC偶联的抗人IgG二抗标记。
图15A-B显示了S1-F4在CD98人源化小鼠(50mg/kg)(A)和携带同源肿瘤的C57BL/6小鼠(15mg/kg)(B)中的抗肿瘤活性。
图16A-B显示了S1-F4及其Fc变体诱导的ADCC效应功能。用LDH释放法测定ADCC活性。数据显示为平均值±SEM。(A)使用NK92-MIhCD16细胞作为效应细胞，使用Raji或HepG2细胞作为靶细胞。E:T比值为7:1。测试所示浓度的抗体。(n.s.，不显著，****p<0.0001；双因素方差分析)。(B)使用Raji细胞作为靶细胞。左：使用mBMDM作为效应细胞。测试所示浓度的对照IgG或S1-F4。E:T比值为1:1。(****p<0.0001；双因素方差分析)。右：使用hPBMC作为效应细胞。溶媒或S1-F4(10μg/ml)。E:T比值为10:1。(**p<0.01；双尾非配对Student t检验)。
图17A-B显示了S1-F4及其Fc变体诱导的ADCP效应功能。(A)Raji细胞(靶细胞)用CFSE荧光染料标记，然后与用抗F4/80-Alexa Fluor 633抗体标记的小鼠骨髓源性巨噬细胞(mBMDM)混合。E:T比值为1:2。通过荧光显微镜监测ADCP活性，以每100个效应细胞中CFSE阳性的靶细胞的数目测定吞噬指数。比例尺，100μm。(B)使用hPBMC作为效应细胞。Raji细胞(靶细胞)用CFSE荧光染料标记，然后与深红(Deep-Red)标记的hPBMC混合。对照IgG或S1-F4(10μg/ml)。E:T比值为1.5:1。通过荧光显微镜监测ADCP活性。展示了代表性的显微照片。比例尺，100μm。
图18A-B显示了S1-F4及其变体的CDC效应功能(A)和与人C1q的结合(B)。(A)在10％人补体血清存在下，Raji细胞与所示抗体进行孵育。用LDH释放法测定CDC活性。以10μg/ml测试抗体。(B)S1-F4、S1-F4的Fc变体、利妥昔单抗与人C1q的结合基于ELISA法的测定。
图19显示了S1-F4对HepG2和Raji细胞转运HPG的影响。HepG2细胞或Raji细胞分别与对照IgG(15μg/ml)、S1-F4(15μg/ml)或BCH(10mM)孵育，然后在含HPG(70μM)的培养基中培养。随后，对细胞裂解物中的HPG进行生物素标记，并用基于ELISA法的检测方法，用链酶亲和素-HRP检测被生物素化的HPG。HPG摄取活性表示为待测样本的HPG摄取量占对照IgG处理组HPG摄取量的百分比。数据显示为平均值±SEM。(n.s.，不显著，**p<0.01，***p<0.001；双尾非配对学生(Student)t检验)。
图20显示了S1-F4对Raji、Ramos、HepG2和HCT-8细胞生长的影响。使用WST-8细胞计数试剂盒-8(WST-8Cell Counting Kit-8)分析细胞生长。细胞与对照IgG或S1-F4孵育72小时。细胞生长百分比表示为待测样本组与未处理组检测值的百分比。Raji细胞或Ramos细胞与所示浓度的对照IgG或S1-F4孵育。(****p<0.0001；双因素方差分析)。HepG2细胞或HCT-8细胞与对照IgG或S1-F4(15μg/ml)孵育。数据显示为平均值±SEM。(n.s.，不显著；双尾非配对Student t检验)。
图21显示了S1-F4及其Fc变体在携带EL4-hCD98或MC38-hCD98肿瘤(S1-F4或S1-F4DANA，50mg/kg)的CD98人源化小鼠中的抗肿瘤活性；在携带Raji肿瘤的NOD SCID小鼠或携带HepG2肿瘤的CB-17SCID小鼠(对照IgG、S1-F4、S1-F4KA或S1-F4DANA，15mg/kg)中的抗肿瘤活性。
图22显示了S1-F4抗体处理在随后的肿瘤攻击中诱导抗肿瘤免疫。经S1-F4处理后达到完全应答(CR)的携带EL4-hCD98肿瘤的C57BL/6小鼠中，在最初接种肿瘤细胞后第77天，分别再次用EL4-hCD98、EL4、B16F10-hCD98或B16F10肿瘤细胞攻击。年龄相似的未进行过试验的小鼠作为对照小鼠。(再)接种肿瘤细胞后，评估肿瘤大小。肿瘤体积显示为平均值±SEM。显示出无肿瘤小鼠的比例。
图23A-B显示了S1-F4在猴和小鼠体内的药代动力学和生物分布。食蟹猴和小鼠的血清中S1-F4浓度相对时间的曲线图。S1-F4处理时间用箭头标记。用ELISA法检测S1-F4的血清浓度，表示为平均值±SEM。对猴子S1-F4的单次给药剂量(i.v.)为20mg/kg(A)；对C57BL/6或CD98人源化小鼠S1-F4的单次给药剂量(i.p.)为15mg/kg(B)。
图24A-B显示了注射S1-F4-Cy7(15mg/kg)或溶媒53小时后处死的CD98人源化小鼠的代表性解剖图像(A)。通过免疫荧光染色分析肾脏中S1-F4的富集(B)。C57BL/6小鼠和CD98人源化小鼠用溶媒或S1-F4(50mg/kg)处理，2天后收获小鼠肾脏样品，用FITC偶联的抗人IgG二抗孵育。然后根据FITC的荧光强度测定S1-F4富集。放大倍数X1.3。
图25显示了S1-F4 scFv和hCD98 ECD在正交视图中的条带状示意图，以及S1-F4-CD98界面的详细视图。
图26为S1-F4 scFv与hCD98 ECD的界面放大图，显示了CD98的E384、D391、E392、D397的位置，以及S1-F4的HCDR2、HCDR3、LCDR1。
图27显示了采用ELISA法分析的S1-F4、S1-F4 Y97E和H15L54，在pH 6.5或pH 7.4与hCD98 ECD的结合。
图28显示了采用FACS分析的S1-F4、H15L1、H15L35和H15L54，在pH 6.5和pH 7.4与A-431的结合。
图29和图30显示了H15L54优先与肿瘤中的CD98结合。用S1-F4-Cy7或H15L54-Cy7(15mg/kg)处理携带EL4-hCD98肿瘤的CD98人源化小鼠。在注射后46小时、90小时和160小时，对器官进行成像分析。(A)代表性图像。(B)量化的组织生物分布。平均发光强度表示为平均值±SEM。
图31显示了所示抗体在CD98人源化小鼠的小鼠肾细胞上的富集。用15mg/kg的所示抗体处理小鼠。两天后收获小鼠肾脏样品，并与FITC偶联的抗人IgG二抗孵育。然后根据FITC的荧光强度测定S1-F4富集。通过Inform软件将图像转换为IHC图像。放大倍数X20。
图32显示了在CD98人源化小鼠血清中抗体浓度随时间变化的曲线图。第0天用所示抗体(15mg/kg,i.p.)处理小鼠。采用ELISA法检测S1-F4或H15L54的血清浓度，并显示为平均值±SEM。
图33A-D显示了H15L54或S1-F4在携带EL4-hCD98肿瘤(A)、MC38-hCD98肿瘤(B)、B16F10-hCD98肿瘤(C)的CD98人源化小鼠和携带A-431肿瘤(D)的CB-17SCID小鼠中的抗肿瘤活性。S1-F4或H15L54(15mg/kg)(A和C)；H15L54(20mg/kg)(B)；S1-F4或H15L54(15mg/kg)(D)。
图34显示了Ab8332(8332)或S1-F4在携带EL4-hCD98肿瘤的CD98人源化小鼠中的抗肿瘤活性。箭头表示给药。剂量：15mg/kg。
图35显示了通过ELISA法测定的，S1-F4和Ab8332在pH 6.5和pH 7.4与hCD98ECD-His6-Avi-Biotin蛋白的结合。
图36显示了通过ELISA法测定的，不同抗体在pH 6.5和pH 7.4与hCD98ECD-His6-Avi-Biotin蛋白的结合。
图37显示了通过IVIS检测的，S1-F4和Ab8332在携带MC38-hCD98肿瘤的hCD98ECD小鼠中的分布。
具体实施方案
除非在本文的其他地方明确定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
材料和方法
实验模型和实验对象详情
按照批准的IACUC方案在北京昭衍实验室(JOINN Laboratories(Beijing))进行食蟹猴实验。
遵循中国国家实验动物饲养和护理指南，并在批准的IACUC方案下，在北京生命科学研究所进行小鼠实验。C57BL/6、CB-17SCID和NOD SCID小鼠购自查士利华(CharlesRiver)。CD11c-DTR小鼠购自杰克逊(Jackson)实验室。CD98人源化小鼠在北京生命科学研究所的动物护理设施中饲养和维持。
CHO或CHO衍生细胞系、HEK293T或HEK293T衍生细胞系、Raji、Ramos、HepG2、Hep3B、MDA-MB-231-LN、A549、PANC-1、EL4-hCD98和B16F10-hCD98细胞在补充10％胎牛血清(FBS)的杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco's Modification of Eagle's Medium，DMEM)中培养。Raji、Ramos、HL60、BxPC-3、HCT-8、HT-29、HCT 116、A-431、MC38-hCD98和MCA205-hCD98细胞在补充10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养。这些细胞在37℃、5％CO2气氛的加湿培养箱中培养。FreeStyle 293F细胞来自Life Technologies，按照制造商的说明进行培养。
蛋白的表达和纯化
通过瞬时转染FreeStyle 293F细胞，产生带His6-Avi标签的融合蛋白CD98 ECD或FcγRs，并通过亲和色谱纯化。对于全长IgG抗体，包括GC33(Ishiguro等人，2008)和IGN523(Hayes等人，2015)，分别将VH和VL的编码序列亚克隆到人IgG1 H链(HC)表达载体和L链(LC)表达载体中。将两种IgG表达质粒(HC质粒+LC质粒)按1:1比例共转染293F细胞。转染3-6天后，收集细胞培养上清液，通过蛋白A(Protein A)亲和色谱纯化IgG1。
抗体文库淘选和抗CD98抗体筛选
为了生成抗hCD98抗体(如HN2-G9)或抗小鼠CD98抗体(如BC8)，将人或小鼠CD98的ECD与His6-Avi标签融合，并通过BirA连接酶进行生物素标记。这两种蛋白在利用人类非免疫抗体文库(Li等人，2017)进行的淘选实验中用作抗原。经过两轮与CD98 ECD特异性结合的淘选，筛选出噬菌体-scFv。随机选取共约400个单克隆，并通过ELISA法筛选与人或鼠CD98结合的单克隆。所选择的克隆产生纯化的噬菌体-scFv颗粒或转化为全长人IgG1形式，以用于进一步表征。
VH链置换子文库的构建与选择
将HN2-G9的VL基因克隆到噬菌体载体中，其中该噬菌体载体含有来自93名健康供体的非免疫VH基因(～1×1010)的全能文库(repertoire)。构建的链置换子文库的大小为～1×108。与上文利用捕获的CD98 ECD-His6Avi进行抗体文库选择相似，文库选择进行了3轮，不同之处在于在第3轮淘选中引入了HN2-G9 IgG1作为竞争抗体。随机选取共约400个单克隆，通过ELISA法筛选与hCD98结合的单克隆。选择出来的克隆产生纯化的噬菌体-scFv颗粒或转化为全长人IgG1形式，以用于进一步表征。
从噬菌体展示的人非免疫Fab文库中筛选pH依赖性抗hCD98抗体
为了筛选pH依赖性抗体，我们将构建的噬菌体-Fab文库与hCD98 ECD-His6-Avi-Biotin蛋白在pH 6.5的溶液中孵育，并用pH 6.5的洗涤缓冲液洗涤，然后用pH 7.4的缓冲液洗脱。然后随机选取单克隆，并用ELISA法筛选在pH 6.5和pH 7.4与hCD98结合的单克隆。将在pH 6.5与CD98结合显著好于pH 7.4的克隆转化为全长人IgG1形式，以用于进一步表征。
基于ELISA法的结合测定
为进行基于ELISA法的抗体与抗原的结合分析，用链酶亲和素(Sigma-Aldrich)包被的96孔板(Nunc,MaxiSorpTM)捕获生物素化的蛋白抗原。然后，加入连续稀释的抗体，通过添加HRP标记的山羊抗人IgG Fc多克隆抗体(Thermo Fisher Scientific)进行检测。
为进行基于ELISA法的抗体与人C1q的结合分析，将连续稀释的抗体包被在96孔板(Nunc,MaxiSorpTM)上。然后，加入3％来自人的补体血清(Sigma-Aldrich)，通过添加HRP标记的绵羊多克隆抗人C1q(Abcam)进行检测。
通过表面等离子体共振(SPR)进行的结合动力学分析
在Biacore T200仪器(Biacore,GE Healthcare)上进行抗CD98抗体，与CD98的ECD和FcγRs的ECD结合的动力学分析。使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)，将抗hFc抗体或蛋白A/G(Thermo Fisher Scientific)共价连接到CM5传感器芯片表面。在芯片上捕获最佳浓度的抗体，然后流经2倍连续稀释浓度的分析物(CD98或FcγRs)。采用1:1朗格缪尔(Langmuir)结合模型评价结合动力学。采用Biacore T200评价软件计算ka、kd和KD值。
细胞系的流式细胞术分析
为检查肿瘤细胞系中CD98的表达：用抗CD98抗体对肿瘤细胞进行标记，随后用山羊抗人IgG Fc FITC多克隆抗体(Thermo Fisher Scientific)进行标记。通过FITC检测肿瘤细胞系上的CD98表达。
为检查与CD98变体结合的抗体：构建了含有不同丙氨酸突变的hCD98-GL表达质粒。然后用这些质粒转染CHO细胞。两天后，用IGN523(Hayes等人，2015)、S1-F4或抗GL抗体(GC33)(Ishiguro等人，(2008)Cancer Res 68,第9832-9838页)对转染的CHO细胞进行标记，随后用山羊抗人IgG Fc FITC多克隆抗体(Thermo Fisher Scientific)进行标记。
组织处理和免疫细胞的流式细胞术分析
当肿瘤体积大于500mm3时，用抗体处理异种移植模型小鼠。处理3天后，从小鼠收获肿瘤，并用单细胞悬液进行FACS分析。简单地说，将肿瘤分离并用红细胞裂解液(RedBlood Cell Lysis Buffer)处理。细胞悬液通过40μm细胞过滤器，获得单细胞悬液。然后用各种抗体(关键资源表(Key Resource Table))对细胞进行标记。
人或鼠CD98表达细胞系的构建
首先，通过插入人或鼠CD98编码DNA，构建表达质粒。然后将表达质粒转染到HEK293T、CHO、EL4、MC38、MCA205或B16F10细胞中。为生成稳定表达hCD98的细胞系，转染后用FACS对表达hCD98的细胞进行分选，并在含G418的培养基中培养。
细胞增殖测定
使用WST-8细胞计数试剂盒-8(Dojindo Molecular Technologies)分析细胞生长。将悬浮在含有1％FBS的RPMI 1640培养基中的细胞(10,000-25,000个细胞/孔)接种于96孔板，并孵育72小时。然后向每孔加入CCK-8溶液(10μl)，并将培养物在37℃孵育1-4小时。用酶标仪测量450nm处的吸光度。细胞生长百分比表示为待测样本组与未处理组的细胞总数的百分比。
氨基酸摄取测定
在生长培养基中，将细胞与15μg/ml抗体孵育24小时。然后用不含Met的DMEM在37℃下平衡细胞30分钟。向细胞中加入终浓度为70μM的HPG(Thermo Fisher Scientific)。在加入HPG的同时，加入终浓度为10μM的BCH(2-氨基-2-降冰片烷-羧酸)(Sigma-Aldrich)作为阳性对照。2-3小时后，用PBS洗涤细胞，并用含完全蛋白酶抑制剂(Roche)的裂解缓冲液(含1％SDS的50mM Tris-HCl，pH 8.0)裂解细胞。根据制造商说明书(Thermo FisherScientific)，对细胞裂解中的HPG进行生物素标记。然后将细胞裂解液转移到96孔板(Nunc,MaxiSorpTM)中，并在4℃下孵育过夜。然后通过基于ELISA法的测定，用链酶亲和素HRP(Thermo Fisher Scientific)检测细胞裂解物中HGP的量。
ADCC、ADCP和CDC测定
为进行ADCC测定，将靶细胞(10,000-20,000个细胞/孔)接种到U形底96孔细胞培养板的孔中，并与各浓度的不同抗体短暂孵育。然后，将效应细胞(E:T＝4:1-10:1)加入到含有靶细胞和抗体的孔中，并在补充5％FBS的RPMI 1640培养基中，在37℃下孵育4-8小时。根据CytoTox非放射性细胞毒性测定试剂盒(Promega)的说明书，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放来测定ADCC活性。根据制造商的说明书计算细胞毒性百分比。
为进行ADCP测定，采用小鼠骨髓源性巨噬细胞(mBMDM)和人外周血单核细胞(hPBMC)作为效应细胞。从C57BL/6小鼠的胫骨和股骨收集小鼠骨髓细胞，在L929上清液中通过GM-CSF诱导3天，以制备mBMDM。Raji细胞用CFSE(Thermo Fisher Scientific)标记，并用作靶细胞。用抗小鼠F4/80-Alex Fluor647(Thermo Fisher Scientific)标记mBMDM，然后与靶细胞孵育。将CFSE标记的靶细胞与不同抗体在室温下孵育15min，然后以1:2的E:T比率，添加到在补充10％热灭活FBS的DMEM培养基中的标记的mBMDM，在37℃下孵育2小时。使用尼康A1R共聚焦显微镜，记录抗小鼠F4/80抗体标记的巨噬细胞对CFSE标记的靶细胞的吞噬作用。用20ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(PeproTech)诱导hPBMC分化9天，然后将其作为效应巨噬细胞使用。利用hPBMC进行的ADCP测定与上述类似，除了hPBMC用Deep-Red染料(Thermo Fisher Scientific)标记。
为进行CDC测定，将靶细胞以400,000个细胞/孔接种于U形底的96孔板中，在5％的人血清(Sigma-Aldrich)存在下与各种抗体孵育。孵育2小时后，使用CytoTox 非放射性细胞毒性测定试剂盒(Promega)分析每孔上清液中的LDH释放。/>
猴子体内S1-F4的药代动力学和安全性评估
体重约为3kg的健康食蟹猴(3-4岁)，在第0天和第15天静脉(i.v.)注射S1-F4。在不同时间点采集血样，用hCD98结合ELISA法测量抗体的血清浓度。然后在Graphpad Prism6中计算抗体血清浓度并绘图。利用WinNonlin软件对PK数据进行评价。在北京昭衍实验室(JOINN Laboratories(Beijing))，评估预先确定的时间点的体重、体温、血液生化(谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和肌酐)、红细胞含量(RBC)和白细胞含量(WBC)。
小鼠体内的药代动力学分析
将6-8周龄的C57BL/6或CD98人源化小鼠用于本实验。在单次腹腔(i.p.)注射待分析抗体后，在不同时间点采集血液。用人IgG ELISA定量试剂盒(Bethyl Laboratories)，测量血清中的抗体浓度。然后在Graphpad Prism 6中计算抗体血清浓度并绘图。利用WinNonlin软件对PK数据进行评价。
S1-F4 scFv和hCD98 ECD复合物的结构表征
为进行X射线晶体学分析，使用了S1-F4-scFv-His6和hCD98 ECD重组蛋白。hCD98ECD的氨基酸序列对应于hCD98的Glu111-Ala529残基。S1-F4-scFv-His6在FreeStyle 293F细胞中表达，hCD98 ECD在大肠杆菌中表达。采用Ni-NTA琼脂糖微珠(QIAGEN)，通过固定化金属离子亲和色谱(IMAC)纯化S1-F4-scFv-His6，并先用相同的微珠随后通过HiTrap Q HP阴离子交换色谱柱(GE Healthcare)纯化hCD98 ECD。然后将S1-F4-scFv-His6与hCD98 ECD混合形成复合物，并采用Superdex S200 10/300GL柱(GE Healthcare)的尺寸排阻色谱进行纯化。通过将1μL蛋白(以10mg/mL的浓度溶解于10mM Tris-HCl pH 8.0和150mM NaCl中)和1μL含有0.1M柠檬酸三钠二水合物(pH 5.0、9％PEG20000、5％PEG400、9％甘油)的储备溶液混合，并采用悬滴气相扩散法，在20℃下将纯化的S1-F4-scFv-His6/hCD98 ECD复合物浓缩并结晶。
7天后出现片状晶体。在上海同步辐射光源的光束线BL19U1上采集X射线衍射数据，并通过XDS进行处理。以hCD98 ECD(PDB 2DH2)结构为起始模型，在分辨率下用相位器分子置换法确定结构。在Phenix中进一步完善分子替换的最初模型，并用Coot手工重建。最终模型包括S1-F4 scFv的235个残基和hCD98 ECD的第115-526位残基。MolProbity分析表明，96.55％的残基位于合理区(favored region)，3.41％的残基位于合适区(allowedregion)。
体内肿瘤测定
对于小鼠肿瘤模型，6-8周龄小鼠皮下接种(在100μL DPBS或培养基中的)各种肿瘤细胞。除了MDA-MB-231-LN细胞接种于雌性小鼠乳腺脂肪垫上之外，其余细胞均接种于右侧。对于异种移植肿瘤模型，根据相似的平均肿瘤体积，将小鼠随机分组(n＝2-6/组)，并接受各种抗体的腹腔注射。对于同源肿瘤模型，在肿瘤细胞(含1×105个细胞的DPBS)接种后，将小鼠随机分组(n＝3-10/组)，并接受各种抗体的腹腔注射。用电子卡尺测量肿瘤体积，用修正的椭球公式1/2×(长×宽2)计算肿瘤体积。当肿瘤长度达到2cm或观察到虚弱时，处死小鼠。关于异种移植肿瘤模型的其他信息列于以下表1中。
表1.异种移植肿瘤模型的建立
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为了清除CD4+或CD8+T细胞，在S1-F4处理前1天，给携带瘤CD98人源化小鼠注射15mg/kg抗CD4抗体(克隆GK1.5，BioXCell)或10mg/kg抗CD8α抗体(克隆2.43，BioXCell)，每3-5天注射一次。为了清除NK细胞，在S1-F4处理前1天，给小鼠注射2.5mg/kg抗Asialo-GM1多克隆抗体(Poly21460，Biolegend)，每6天注射一次。为了清除中性粒细胞，在S1-F4处理前1天，给小鼠注射20mg/kg抗Ly6G抗体(克隆1A8，BioXCell)，每3天注射一次。为了清除巨噬细胞，在S1-F4处理前1-2天，给小鼠注射25mg/kg抗CSF1R抗体(克隆AFS98，BioXCell)，每3天注射一次。为了清除树突状细胞，在S1-F4处理前1天，给小鼠注射4μg/kg白喉毒素(Sigma-Aldrich)，每2天注射一次。上述免疫细胞耗竭方法的有效性通过用肿瘤未知(tumor-naive)小鼠得到证实。
为进行肿瘤再攻击研究，将1×105个肿瘤细胞，接种于经S1-F4处理后显示EL4-hCD98肿瘤完全应答(CR)的C57BL/6小鼠和年龄相似的未进行过试验的C57BL/6小鼠的胁腹(左侧接种EL4和EL4-hCD98，右侧接种B16F10和B16F10-hCD98)。如上所述测量肿瘤。
免疫荧光标记测定
为了检测抗体在小鼠肾脏中的富集，在注射各种抗体后2-3天处死小鼠。然后收获小鼠肾脏，制备冷冻切片。肾切片用山羊抗人IgG Fc FITC(Thermo Fisher Scientific)多克隆抗体标记。采用Vectra Polaris仪器(PerkinElmer)，通过FITC检测肾细胞表面上的CD98表达。
为了检查肿瘤中的CD98表达，收获肿瘤制备冷冻切片。肿瘤切片用BC8或IGN523(10μg/ml)标记，随后用山羊抗人IgG Alexa Fluor 633多克隆抗体(Thermo FisherScientific)标记。采用尼康A1R共聚焦显微镜，通过Alexa Fluor 633检测肿瘤细胞表面上的CD98表达。
为了检查小鼠组织上的CD98表达，收获各种小鼠组织制备冷冻切片。切片用BC8或IGN523(10μg/ml)标记，随后用山羊抗人IgG Fc FITC多克隆抗体(Thermo FisherScientific)标记。采用FITC检测小鼠组织中的CD98表达。
荷瘤小鼠的光学成像
采用IVIS光谱仪(PerkinElmer)对荷瘤小鼠进行光学成像，并使用Live Image4.4软件(PerkinElmer)进行分析。使用相同的照明设置来获取一个实验的所有图像，并按照生物发光成像中的常规操作对将荧光发射光谱进行归一化处理。
为进行CD98人源化小鼠中的抗体-Cy7分布的荧光成像，对荷瘤CD98人源化小鼠(n＝2-3/组)腹腔注射溶媒或Cy7标记的抗体(S1-F4-Cy7(Cy7/抗体＝0.845)或H15L54-Cy7(Cy7/抗体＝1.076))。解剖小鼠，并获得不同时间点的荧光图像。由配备745nm激发和800nm发射滤光片的IVIS光谱仪获得荧光图像。
对于MDA-MB-231-LN肿瘤模型的生物发光成像，给携带MDA-MB-231-LN肿瘤的小鼠(腹腔)注射150mg/kg D-荧光素(PerkinElmer)。在D-荧光素注射10min后，测定肿瘤的生物发光。每4-5天进行一次成像，直到全部组中的全部小鼠均存活的最后一天。
统计分析
本文中，使用GraphPad Prism 6(GraphPad)进行具体比较，p值示于相关图例中。采用双因素方差分析或双尾非配对学生(Student)t检验。采用双因素方差分析来分析抗肿瘤活性。p<0.05被认为有统计学显著性；(n.s.，不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。
实施例
实施例1.抗hCD98抗体S1-F4的生成
产生了含有hCD98胞外结构域(hCD98 ECD)的重组蛋白，用于从非免疫噬菌体展示单链Fv(scFv)人抗体文库(Li等人，(2017)Elife 6)中选择抗hCD98抗体。对结合表达hCD98的CHO细胞(CHO-hCD98)的抗体，进行基于FACS的分析，以筛选表现最好的抗体。从7个候选物中鉴定出HN2-G9，并使用异种移植小鼠肿瘤模型(Raji，Burkitt淋巴瘤)评估其抗肿瘤活性。HN2-G9显现出与上述现有技术抗CD98抗体IGN523(Hayes等人，2015)相当的抗肿瘤活性(图1)。然而，表面等离子体共振(SPR)分析表明，与IGN523相比，HN2-G9对CD98的结合亲和性(affinity)相对较低(1.29μM)(图3)。
为了提高HN2-G9对CD98的结合亲和性，采用可变区重链(VH)链置换方法，对HN2-G9进行了基因工程化改造(Li等人，2017)。在FACS和SPR分析中，均鉴定到一抗体(S1-F4)与HN2-G9相比具有显著更高的结合亲和力(58.2nM)(图2-3)。
随后测试了S1-F4对Raji异种移植肿瘤的抗肿瘤活性，结果表明它发挥了比IGN523显著更强的抗肿瘤作用，并与利妥昔单抗(FDA批准的用于治疗B细胞淋巴瘤的抗CD20抗体)的抗肿瘤作用相似(图4)。
实施例2.S1-F4在异种移植肿瘤模型中的广谱抗肿瘤活性
由于CD98在许多肿瘤类型中均高表达，因此评估了S1-F4在各种异种移植肿瘤模型中的抗肿瘤作用。
在体内研究之前，检测了不同组织来源的13种人类肿瘤细胞系(包括Raji)中的CD98表达(图5)。所有被测试的细胞系都表达了高水平的CD98。因此，利用这些细胞系在免疫缺陷的CB-17SCID或NOD SCID小鼠中建立了异种移植肿瘤模型，以评估S1-F4的治疗作用。
S1-F4处理在13种异种移植模型的8种模型中显示出广泛的抗肿瘤作用(图4、图6-图10)。特别值得注意的是，低剂量(1mg/kg)的S1-F4处理在HepG2(肝细胞癌)肿瘤模型中导致肿瘤完全消退(图6)。
实施例3.表达hCD98的小鼠模型的生成(CD98人源化小鼠)
发现S1-F4与人和猴CD98结合，但不与小鼠CD98(mCD98)结合(表1)。鉴于CD98在人的许多正常组织中广泛表达，从上述具有人类异种移植物的小鼠模型获得的结果可能无法准确反映S1-F4对人的潜在效果和/或安全性。
表1.S1-F4与不同来源的CD98的结合亲和性
ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
人 9.90E+05 5.76E-02 5.82E-08
猴 4.69E+05 8.82E-02 1.88E-07
小鼠 n.m. n.m. n.m.
为了解决这一问题，通过CRISPR/Cas9，将C57BL/6遗传背景中(使用C57BL/6小鼠作为受体)的mCD98 ECD替换成其人的对应部分，生成了CD98人源化小鼠模型(图11A-D)。使用靶向第一内含子内的序列的sgRNA(sgRNA-CD98：ccgcgctgccgtgagctgcctgt；SEQ ID NO:1)，用于将hCD98 ECD(第107-529位氨基酸)序列整合到C57BL/6小鼠生殖细胞的Slc3a2基因座中，并导致小鼠Slc3a2基因的消除。作为同源定向修复(HDR)模板，构建了靶向载体，该靶向载体包含编码hCD98的第107-529位氨基酸的1272bp序列，polyA元件，从sgRNA-CD98靶向位点延伸出的829bp的上游片段和945bp的下游片段(图11A)。将Cas9蛋白、sgRNA-CD98和靶向载体原核显微注射到C57BL/6受精卵中，获得2只活体小鼠(F0)。通过多对引物验证了hCD98 ECD在两只F0小鼠中的正确插入(图11A-D，表2)。将杂合F0小鼠与野生型C57BL/6小鼠杂交，得到F1代小鼠。然后使杂合F1动物杂交，产生纯合的hCD98敲入小鼠(命名为CD98人源化小鼠)。
表2.用于CD98人源化小鼠鉴定的PCR引物
所生成的CD98人源化小鼠模型保留了mCD98的生理功能，从而能够在正常组织中用S1-F4检测CD98的表达且免疫系统完整。通过免疫荧光标记测定，检测了hCD98在建立的CD98人源化小鼠不同组织中的表达谱，证实了hCD98在组织中的表达模式与野生型小鼠中的mCD98表达相似(图12-13)。
实施例4.S1-F4对侵袭性和难治性肿瘤的抗肿瘤活性
利用CD98人源化小鼠，评估了S1-F4在四种侵袭性和难以治疗的小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤活性。采用稳定表达hCD98的小鼠肿瘤细胞系建立模型(图14)。
S1-F4处理显示出对四种肿瘤模型中的三种，EL4-hCD98、MC38-hCD98和MCA205-hCD98具有显著的抗肿瘤作用；对B16F10-hCD98肿瘤无明显作用(图15A)。这些结果表明，S1-F4在免疫缺陷性异种移植和免疫活性的同源小鼠模型中，对多种恶性肿瘤发挥了有效的广谱性抗肿瘤活性。
值得注意的是，在野生型C57BL/6小鼠(即，非肿瘤组织中没有任何hCD98表达的小鼠)中测试S1-F4处理对EL4-hCD98和B16F10-hCD98肿瘤的效果时，S1-F4处理在两种肿瘤模型中均诱导了对肿瘤生长的显著抑制(图15B)。S1-F4在野生型小鼠中表现出对B16F10-hCD98的抗肿瘤作用，而在CD98人源化小鼠中无此作用，表明野生型小鼠中缺乏“抗原沉没”可能有助于S1-F4在这种高侵袭性肿瘤模型中的抗肿瘤作用。“抗原沉没”是指抗原介导的靶向细胞膜抗原的抗体的清除。这些结果表明，在具有人类异种移植物的野生型小鼠中观察到的抗CD98抗体的抗肿瘤作用，并不总能合理预期其在人类中的抗肿瘤作用。
实施例5.S1-F4的抗肿瘤活性依赖于Fc-FcγR相互作用
本实施例研究了抗hCD98抗体的抗肿瘤活性是否依赖于Fc介导的免疫应答，例如补体依赖的细胞毒性作用(CDC)、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)或吞噬作用(ADCP)。
为了剖析S1-F4的Fc相关功能，生成了两个S1-F4变体，S1-F4KA和S1-F4DANA(图3)。S1-F4KA携带K322A(KA)突变以消除Fc与C1q的结合，导致CDC功能的消失。S1-F4DANA携带D265A/N297A(DANA)突变，其消除Fc与FcγRs的结合，导致ADCC和ADCP的功能消失。测试了S1-F4及其两个变体介导ADCC、ADCP和CDC的能力。体外测定显示，S1-F4和S1-F4KA诱导了针对Raji和/或HepG2细胞的ADCC(图16A，图16B)和ADCP杀伤效应(图17A，图17B)，而S1-F4DANA变体则没有。S1-F4和测试的突变体都不能与人C1q结合，也不能引起针对Raji细胞的CDC杀伤效应(图18A，图18B)。
这些结果表明S1-F4可以结合FcγRs并诱导ADCC和ADCP杀伤效应，而不能结合C1q或诱导CDC杀伤效应。
实施例6.S1-F4对CD98功能的影响
本实施例研究了，S1-F4是否干扰CD98在早先发现的对S1-F4处理高度敏感的肿瘤细胞系中的生化或细胞生物学功能。
进行氨基酸摄取测定，以分析S1-F4在氨基酸转运中的作用。L-高炔丙基甘氨酸(HPG)，一种甲硫氨酸模拟分子，用作LAT1(L型/大型中性氨基酸转运体1)/CD98异二聚体HAT复合物的可追踪底物，而LAT1/CD98复合物抑制剂BCH(2-氨基-2-降冰片烷-羧酸)用作破坏转运功能的阳性对照。
如图19所示，对比了对照IgG、S1-F4和BCH处理的细胞的HPG摄取效率，只有BCH损害了HAT复合物的转运活性。这些结果表明S1-F4不影响氨基酸转运。
由于CD98通过增强整合素信号传导来增加细胞增殖，在细胞增殖测定中测试了S1-F4对HepG2、HCT-8、Raji和Ramos细胞(四种高度S1-F4敏感的细胞系)生长的抑制作用。
如图20所示，S1-F4表现出以剂量依赖性方式抑制了Raji和Ramos细胞生长，但未观察到S1-F4介导的对HepG2和HCT-8细胞生长的影响。这些结果表明，抑制细胞生长并非是S1-F4的抗肿瘤活性所需的。
本发明人还通过比较S1-F4及其两种Fc变体在异种移植和同源肿瘤模型中的抗肿瘤功效，来探究S1-F4的作用机制(MOA)。对于异种移植肿瘤模型，选择HepG2和Raji肿瘤分别代表对S1-F4抑制细胞生长的耐受性细胞和敏感性细胞。对于同源肿瘤模型，选择EL4-hCD98和MC38-hCD98细胞在CD98人源化小鼠中建立肿瘤。
S1-F4DANA在四种模型的任一种模型中均无治疗作用(图21)，说明S1-F4的抗肿瘤活性依赖于Fc-FcγR的相互作用。此外，在Raji异种移植肿瘤模型中，S1-F4和S1-F4KA对肿瘤生长的抑制作用相似(图21，左下图)，证实了CDC功能并非S1-F4的抗肿瘤活性所需。总之，这些结果表明S1-F4的抗肿瘤活性依赖于由Fc-FcγR相互作用介导的ADCC和ADCP。
实施例7.免疫细胞参与S1-F4的抗肿瘤活性
为了确定哪些免疫细胞亚群参与S1-F4的抗肿瘤作用，使用HepG2肿瘤模型进行了实验，在S1-F4治疗之前和治疗期间，使用亚群特异性抗体分别清除巨噬细胞、NK细胞或中性粒细胞。发现巨噬细胞的清除使S1-F4的抗肿瘤活性丧失，而中性粒细胞的清除和NK细胞的清除未影响S1-F4的抗肿瘤活性。可以推断，在HepG2异种移植模型中，S1-F4的抗肿瘤活性依赖巨噬细胞。
两种(A549，A-431)异种移植模型对S1-F4处理具有耐受性，检测了S1-F4处理对巨噬细胞浸润的影响。发现S1-F4处理使HepG2肿瘤中巨噬细胞的比例显著增加了超过2倍。相比之下，S1-F4处理并没有增加对S1-F4耐受的A-431肿瘤或HCT 116肿瘤中浸润的巨噬细胞的数量。这些结果表明，缺乏肿瘤内巨噬细胞浸润可能是肿瘤细胞对S1-F4处理具有耐受性的原因之一。
除了免疫缺陷性异种移植肿瘤模型外，还在用CD98人源化小鼠建立的EL4-hCD98同源肿瘤模型中，评估了耗竭巨噬细胞、NK细胞或中性粒细胞对S1-F4抗肿瘤功效的效果。与HepG2肿瘤模型中获得的结果一致，仅巨噬细胞的清除影响了S1-F4的抗肿瘤效果；中性粒细胞的清除和NK的清除均未影响S1-F4的抗肿瘤活性。因此，在异种移植和同源肿瘤两种模型中，巨噬细胞对S1-F4的抗肿瘤作用至关重要。
CD98人源化小鼠具有完整的免疫系统，因此为研究T细胞免疫应答在S1-F4抗肿瘤功效中的作用提供了合适的模型系统。为了测试S1-F4是否能够调动T细胞攻击肿瘤细胞，利用了在CD98人源化小鼠中建立的EL4-hCD98肿瘤模型，来评估清除CD4+T细胞或CD8+T细胞对S1-F4抗肿瘤活性的影响。结果，清除CD4+T细胞并没有改变S1-F4的抗肿瘤活性，说明CD4+T细胞显然没有参与S1-F4的抗肿瘤作用。清除CD8+T细胞显著减弱了S1-F4对EL4-hCD98肿瘤生长的抑制作用。因此，CD8+T细胞参与了S1-F4的抗肿瘤活性，并且仅巨噬细胞不足以诱导长期的抗肿瘤作用。
本发明人还研究了，树突状细胞(DC)是否在S1-F4处理的过程中起到交叉活化(prime)CD8+T细胞的APC的作用。具体地，在S1-F4处理之前(和过程中)，用白喉毒素(DT)处理携带EL4-hCD98肿瘤的CD11c-DTR(白喉毒素受体)(Itgax-DTR/EGFP)小鼠以清除DC。清除DC细胞显著影响了S1-F4对EL4-hCD98肿瘤生长的抑制作用。因此，DC对于S1-F4诱导的完全的抗肿瘤应答至关重要。
最后，发现经过S1-F4处理表现出对EL4-hCD98肿瘤完全应答(CR)的C57BL/6小鼠，在随后受到相同肿瘤细胞EL4-hCD98，或受到EL4、B16F10或B16F10-hCD98肿瘤细胞攻击时会受到保护，表现出肿瘤生长的显著延迟或完全的肿瘤排斥，表明S1-F4具有防止肿瘤复发的效果(图22)。如预期的，CR小鼠不能在B16F10肿瘤细胞的攻击中存活下来(图22)，B16F10肿瘤细胞与EL4-hCD98不太可能有共同的抗原，这支持了S1-F4处理可以诱导抗原特异性的抗肿瘤免疫记忆。
综合考虑这些结果，本发明人提出了S1-F4的MOA包括以下步骤：1)S1-F4通过其Fc与巨噬细胞上的FcγRs结合，诱导ADCC和ADCP攻击表达CD98的肿瘤细胞；2)步骤1)导致的肿瘤细胞死亡，产生肿瘤细胞相关抗原，这些抗原随后通过DC被交叉呈递给CD8+T细胞；3)激活CD8+T细胞，以攻击肿瘤细胞。在这一过程中，巨噬细胞在启动抗肿瘤应答中发挥作用，而细胞毒性CD8+T细胞是在启动抗肿瘤应答后被诱导，特别是DC介导的增加的交叉呈递导致细胞毒性CD8+T细胞的诱导。因此，S1-F4处理可能桥连固有免疫系统与适应性T细胞免疫系统来攻击肿瘤细胞，并诱导长期免疫记忆。
实施例8.pH依赖性抗hCD98抗体的生成
本发明人评估了S1-F4在食蟹猴中的安全性和药代动力学(PK)特性。两剂S1-F4处理(第0天20mg/kg和第15天10mg/kg)没有引起明显的副作用，表明S1-F4在治疗有效剂量下具有所需的安全性。
然而，随着时间的推移，S1-F4血清浓度在猴中迅速下降(图23A)，半衰期很短(t1/2～29.5hr)。还测量了单剂给药后，C57BL/6和CD98人源化小鼠中的S1-F4血清浓度。发现其在CD98人源化小鼠中迅速下降(t1/2～69.6hr)，而在C57BL/6小鼠中下降缓慢(t1/2～341.5hr)(图23B)。
与小鼠CD98在肾脏中的强表达一致，在给予带荧光标记的S1-F4(S1-F4-Cy7)处理后，在CD98人源化小鼠的肾脏中观察到了强荧光信号(图24A)。免疫荧光标记也显示，经S1-F4处理后，S1-F4大量富集在CD98人源化小鼠的肾脏中，而在C57BL/6小鼠中则没有(图24B)。可以推测，食蟹猴和CD98人源化小鼠中S1-F4的快速清除是由于“抗原沉没”现象(S1-F4与正常组织中存在的CD98蛋白结合)导致的。
为了寻求克服抗原沉没效应的影响并改善PK特征，本发明人创造性地对S1-F4进行基因工程化改造，使其成为pH依赖性抗体，在酸性条件(如肿瘤微环境)下(pH 6.5-6.9)与CD98强结合，但在大多数正常组织的中性(pH 7.2-7.5)条件下弱结合(或根本不结合)。理想的pH依赖性抗体既能保留S1-F4抗肿瘤活性，又能优先与实体瘤中的抗原结合。
为了支持S1-F4的合理的基因工程化改造，对hCD98 ECD与S1-F4复合物的晶体结构进行解析，获得了关于结合界面的准确信息(图25)。以分辨率解析S1-F4scFv-hCD98 ECD复合物的晶体结构，显示S1-F4识别hCD98 ECD上的构象表位，该构象表位包括来自两个环状区域的第376-384位和第391-399位残基(图24)。该结构表明，7个hCD98 ECD残基(L378、P379、V387、L389、F395、I398和V402)形成了疏水核心，使两个环的构象稳定，促使构象表位的形成(图25)。
对表位与S1-F4的VH和可变轻(VL)链结合的特定结构的评估，显示hCD98 ECD第391-399位残基与S1-F4的LCDR1、LCDR3和HCDR3结合。S1-F4 LCDR1的Y27d和Y32残基的侧链羟基分别与CD98 ECD残基E392和P396的主链酰胺基团形成氢键。此外，S1-F4 LCDR1的Y32和LCDR3的Y92的芳香侧链通过非极性相互作用夹住CD98 ECD的P399残基(图25)。CD98 ECD的D397侧链与S1-F4 HCDR3区的R100d的主链形成氢键。此外，S1-F4 VH介导抗体与CD98ECD第376-384位残基的相互作用。在这个环中，由P379和G380形成的扭结紧紧地嵌合到疏水沟中，该疏水沟包括分别位于HCDR1、HCDR2和HCDR3上的S1-F4 VH残基Y33、I50和I100f。在该表位附近，CD98 ECD的H135的侧链与S1-F4 HCDR3的Y97以氢键键合(图25)。
基于FACS的结合分析，显示了位于结合界面的两个氨基酸的丙氨酸取代(L389A和P399A)显著降低了S1-F4与hCD98的结合，这支持了该构象表位确实介导S1-F4 scFv-hCD98ECD复合物的结合。L378A、F395A和D397A突变也减弱了结合，支持了这些疏水核心的残基对S1-F4 scFv-hCD98 ECD结合亲和性的稳定有影响。值得注意的是，这些丙氨酸取代突变都没有影响IGN523与hCD98的结合，这表明S1-F4和IGN523与不同的表位结合。
先前的研究已显示可电离残基如组氨酸(H)的质子化可以促进pH依赖性结合(Chaparro-Riggers等人，2012；Johnston等人，2019；Sarkar等人，2002)。因此，本发明人假设，增加H和酸性氨基酸(天冬氨酸(D)或谷氨酸(E))之间相互作用的程度可促进S1-F4与CD98之间的pH依赖性结合。结构显示，4个酸性残基(E384、D391、E392、D397)位于hCD98 ECD上的S1-F4表位内(图26)，H135位于表位附近，与S1-F4 HCDR3的Y97形成密切接触(图25)，从而为pH依赖性S1-F4变体抗体的合理基因工程化改造提供了分子基础。
首先，在S1-F4 HCDR3上引入Y97E突变，生成S1-F4 Y97E。在ELISA法测定中，S1-F4对CD98 ECD的结合活性在pH 6.5(EC50＝0.059nM)和pH 7.4(EC50＝0.046nM)下是相当的。相比之下，S1-F4 Y97E与CD98在pH 6.5的结合(EC50＝1.686nM)显著强于在pH 7.4的结合(EC50＝4.527nM)(图27)，验证了将与表位中酸性残基密切接触的残基变为酸性残基是获得具有pH依赖性抗原结合的抗体变体的有效策略。
此外，为了获得结合活性和pH依赖性提高的抗CD98抗体，本发明人筛选了源自S1-F4 VH Y97E的噬菌体展示子文库，其反映了面向CD98的四个酸性残基的位置处的突变：HCDR3-面向D397，HCDR2-面向E384，LCDR1-面向D391和E392(图26)。鉴定到了另一pH依赖性抗hCD98抗体H15L54。
H15L54在pH 6.5的结合活性(EC50＝0.247nM)比S1-F4 Y97E(EC50＝1.686nM)高约7倍，并且其结合pH依赖性(EC50比值，pH 7.4/6.5＝38.0)比S1-F4 Y97E(EC50比值，pH7.4/6.5＝2.7)高约14倍(图27)。FACS显示，在pH 6.5或pH 7.4下，S1-F4与A-431细胞的结合无明显差异，而H15L54在pH 6.5下与A-431细胞的结合显著强于在pH 7.4下的结合(图28)。
PyMOL人工构建的模型结构表明，S1-F4经基因工程化改造后，H15L54与CD98之间形成了4对H-D/E相互作用：H15L54的VH H54、VH E97、VH H100d和VL H27f分别与CD98 ECD的E384、H135、D397和E392相互作用。这四对H-D/E相互作用可能有助于H15L54和CD98之间高度选择性地在低pH下结合。
实施例9.pH依赖性抗hCD98抗体与肿瘤中的CD98的优先结合和提高的抗肿瘤活性
通过将荧光标记的H15L54-Cy7抗体处理携带EL4-hCD98肿瘤的CD98人源化小鼠，研究了抗体的分布。与S1-F4-Cy7在肾脏中积累形成鲜明对比的是，H15L54-Cy7主要积聚到肿瘤中(图29-30)。采用免疫荧光标记，检测S1-F4和H15L54抗体在CD98人源化小鼠肾脏中的富集。与之前的发现一致，S1-F4处理的小鼠在其肾脏中有强的FITC信号，而利用H15L54或对照IgG处理的小鼠肾脏中只有很弱的FITC信号(图31)。S1-F4和H15L54在CD98人源化小鼠中的PK特性的比较，显示了H15L54的血清浓度(t1/2～217.1hr)比S1-F4(t1/2～69.6hr)下降得慢得多(图32)。这些结果支持了，H15L54的pH依赖性结合特性使其与体内生理pH的正常组织相比，更优先结合肿瘤中的CD98。
在多种肿瘤模型中评价了H15L54的抗肿瘤活性。在CD98人源化小鼠中建立的EL4-hCD98和MC38-hCD98肿瘤模型(均对S1-F4处理敏感)中，H15L54表现出显著的抗肿瘤活性(图33A-B)。此外，在对S1-F4处理耐受的肿瘤模型中，包括在CD98人源化小鼠中建立的B16F10-hCD98肿瘤模型和A-431异种移植肿瘤模型，H15L54也显示出显著的抗肿瘤活性(图33C-D)。因此，pH依赖性抗hCD98抗体H15L54通过其在肿瘤微环境的相对低pH条件中的优先抗原结合，避免了S1-F4可能的“抗原沉没”问题，赋予了提高的抗肿瘤活性和所需的PK特性。
实施例10.pH依赖性抗CD98抗体
除了H15L54之外，pH依赖性抗体Ab8332、H15L1和H15L35也通过相同的方法被鉴定出来。在小鼠模型中研究了其结合活性、pH依赖性和抗体分布。
当以所示时间(箭头)和15mg/kg的剂量(图34)施用时，Ab8332在CD98人源化小鼠中建立的EL4-hCD98肿瘤模型中显示出与S1-F4相当的肿瘤生长抑制作用。
通过使用ELISA法，检测了S1-F4和Ab8332在pH 6.5和pH 7.4，与hCD98 ECD-His6-Avi-Biotin蛋白的结合，证实了Ab8332的pH依赖性结合特性。如图35中所示，Ab8332的EC50比值(pH7.4/6.5)高达50.7，而S1-F4没有显示任何显著差异。在ELISA法测定中，H15L1和H15L35的EC50比值(pH7.4/6.5)分别为11.8和16.0(图36)。此外，FACS检测的H15L1和H15L35与A-431肿瘤模型的结合也支持pH依赖性结合(图28)。
与H15L54相似，在施用后第2天和第6天，对携带MC38-hCD98肿瘤的hCD98ECD小鼠中的Ab8332-Cy7进行荧光成像，显示其主要富集于肿瘤而不是肾脏(图37)。
序列表
S1-F4、H15L54和Ab8332可变区的氨基酸序列和核苷酸序列可参见序列表，其具有下表标示的SEQ ID NO。在本申请中，CDR是基于Kabat编号方案确定的。
表3.S1-F4、H15L1、H15L35、H15L54和8332抗CD98抗体的序列信息
/>
/>
序列表
<110> 华辉安健（北京）生物科技有限公司
<120> 抗CD98抗体及其应用
<130> CR12877HHH33WO
<160> 79
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向CD98的小向导RNA
<400> 1
ccgcgctgcc gtgagctgcc tgt 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Y1-F引物
<400> 2
gggtcaagtt caccggctta 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Y1-R引物
<400> 3
ctcaggtaat cgagacgccc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WT1-F引物
<400> 4
gtgaagatca aggtggcgga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WT1-R引物
<400> 5
aaaaagcagc agaatgcccg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MS2-F引物
<400> 6
gggtcaagtt caccggctta 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MS2-R引物
<400> 7
ctgggccaga atgccaaac 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF-1引物
<400> 8
gtgtaagccc cgaggagaat 20
<210> 9
<211> 529
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
Met Ser Gln Asp Thr Glu Val Asp Met Lys Glu Val Glu Leu Asn Glu
1 5 10 15
Leu Glu Pro Glu Lys Gln Pro Met Asn Ala Ala Ser Gly Ala Ala Met
20 25 30
Ser Leu Ala Gly Ala Glu Lys Asn Gly Leu Val Lys Ile Lys Val Ala
35 40 45
Glu Asp Glu Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Lys Phe Thr Gly Leu Ser
50 55 60
Lys Glu Glu Leu Leu Lys Val Ala Gly Ser Pro Gly Trp Val Arg Thr
65 70 75 80
Arg Trp Ala Leu Leu Leu Leu Phe Trp Leu Gly Trp Leu Gly Met Leu
85 90 95
Ala Gly Ala Val Val Ile Ile Val Arg Ala Pro Arg Cys Arg Glu Leu
100 105 110
Pro Ala Gln Lys Trp Trp His Thr Gly Ala Leu Tyr Arg Ile Gly Asp
115 120 125
Leu Gln Ala Phe Gln Gly His Gly Ala Gly Asn Leu Ala Gly Leu Lys
130 135 140
Gly Arg Leu Asp Tyr Leu Ser Ser Leu Lys Val Lys Gly Leu Val Leu
145 150 155 160
Gly Pro Ile His Lys Asn Gln Lys Asp Asp Val Ala Gln Thr Asp Leu
165 170 175
Leu Gln Ile Asp Pro Asn Phe Gly Ser Lys Glu Asp Phe Asp Ser Leu
180 185 190
Leu Gln Ser Ala Lys Lys Lys Ser Ile Arg Val Ile Leu Asp Leu Thr
195 200 205
Pro Asn Tyr Arg Gly Glu Asn Ser Trp Phe Ser Thr Gln Val Asp Thr
210 215 220
Val Ala Thr Lys Val Lys Asp Ala Leu Glu Phe Trp Leu Gln Ala Gly
225 230 235 240
Val Asp Gly Phe Gln Val Arg Asp Ile Glu Asn Leu Lys Asp Ala Ser
245 250 255
Ser Phe Leu Ala Glu Trp Gln Asn Ile Thr Lys Gly Phe Ser Glu Asp
260 265 270
Arg Leu Leu Ile Ala Gly Thr Asn Ser Ser Asp Leu Gln Gln Ile Leu
275 280 285
Ser Leu Leu Glu Ser Asn Lys Asp Leu Leu Leu Thr Ser Ser Tyr Leu
290 295 300
Ser Asp Ser Gly Ser Thr Gly Glu His Thr Lys Ser Leu Val Thr Gln
305 310 315 320
Tyr Leu Asn Ala Thr Gly Asn Arg Trp Cys Ser Trp Ser Leu Ser Gln
325 330 335
Ala Arg Leu Leu Thr Ser Phe Leu Pro Ala Gln Leu Leu Arg Leu Tyr
340 345 350
Gln Leu Met Leu Phe Thr Leu Pro Gly Thr Pro Val Phe Ser Tyr Gly
355 360 365
Asp Glu Ile Gly Leu Asp Ala Ala Ala Leu Pro Gly Gln Pro Met Glu
370 375 380
Ala Pro Val Met Leu Trp Asp Glu Ser Ser Phe Pro Asp Ile Pro Gly
385 390 395 400
Ala Val Ser Ala Asn Met Thr Val Lys Gly Gln Ser Glu Asp Pro Gly
405 410 415
Ser Leu Leu Ser Leu Phe Arg Arg Leu Ser Asp Gln Arg Ser Lys Glu
420 425 430
Arg Ser Leu Leu His Gly Asp Phe His Ala Phe Ser Ala Gly Pro Gly
435 440 445
Leu Phe Ser Tyr Ile Arg His Trp Asp Gln Asn Glu Arg Phe Leu Val
450 455 460
Val Leu Asn Phe Gly Asp Val Gly Leu Ser Ala Gly Leu Gln Ala Ser
465 470 475 480
Asp Leu Pro Ala Ser Ala Ser Leu Pro Ala Lys Ala Asp Leu Leu Leu
485 490 495
Ser Thr Gln Pro Gly Arg Glu Glu Gly Ser Pro Leu Glu Leu Glu Arg
500 505 510
Leu Lys Leu Glu Pro His Glu Gly Leu Leu Leu Arg Phe Pro Tyr Ala
515 520 525
Ala
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1-F4 HCDR1
<400> 10
Ser Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1-F4 HCDR2
<400> 11
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1-F4 HCDR3
<400> 12
Gly Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Ser Arg Pro Ile Phe Phe Asp Ile
1 5 10 15
<210> 13
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1-F4 VH氨基酸序列
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Ser Arg Pro Ile Phe Phe
100 105 110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 14
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S1-F4 VH DNA seq
<400> 14
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagggggtat 300
tacgatattt tgactggttc ccgacctatt ttttttgata tctggggcca agggacaatg 360
gtcaccgtct cttca 375
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1-F4 LCDR1
<400> 15
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1-F4 LCDR2
<400> 16
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1-F4 LCDR3
<400> 17
Gln Gln Tyr Tyr Asn Thr Pro Ile Thr
1 5
<210> 18
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1-F4 VL氨基酸序列
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 19
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S1-F4 VL DNA seq
<400> 19
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagttgctca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttataatact 300
ccgatcacct tcggccaagg gacacgactg gagattaaa 339
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L54 HCDR1
<400> 20
Ser Tyr Gln Met His
1 5
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L54 HCDR2
<400> 21
Ile Ile Asn Asp Lys His Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L54 HCDR3
<400> 22
Gly Tyr Glu Asp Ser Asn Thr His Gln His Pro Ile Phe Phe Asp Ile
1 5 10 15
<210> 23
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L54 VH氨基酸序列
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gln Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Asp Lys His Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Glu Asp Ser Asn Thr His Gln His Pro Ile Phe Phe
100 105 110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 24
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L54 VH DNA seq
<400> 24
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctaccaga tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacgaca agcacggtag cacaagctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagggggtat 300
gaggatagca acactcacca gcacccgatt ttttttgata tctggggcca agggacaatg 360
gtcaccgtct cttca 375
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L54 LCDR1
<400> 25
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Arg His Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L54 LCDR2
<400> 26
Trp Ala Ser Thr Ser Glu Ser
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L54 LCDR3
<400> 27
Gln Gln Tyr Tyr Asn Thr Pro Ile Thr
1 5
<210> 28
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L54 VL氨基酸序列
<400> 28
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Arg
20 25 30
His Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Ser Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 29
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L54 VL DNA seq
<400> 29
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtgctg tacaggcaca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagttgctca tttactgggc atctaccagc 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttataatact 300
ccgatcacct tcggccaagg gacacgactg gagattaaa 339
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 8332 HCDR1
<400> 30
Ser Tyr Gln Met His
1 5
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 8332 HCDR2
<400> 31
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 32
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 8332 HCDR3
<400> 32
Gly Tyr Glu Asp Ser Asn Thr His Gln His Pro Ile Phe Phe Asp Ile
1 5 10 15
<210> 33
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 8332 VH氨基酸序列
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gln Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Glu Asp Ser Asn Thr His Gln His Pro Ile Phe Phe
100 105 110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 34
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 8332 VH DNA seq
<400> 34
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctaccaga tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagggggtat 300
gaggatagca acactcacca gcacccgatt ttttttgata tctggggcca agggacaatg 360
gtcaccgtct cttca 375
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 8332 LCDR1
<400> 35
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 8332 LCDR2
<400> 36
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 8332 LCDR3
<400> 37
Gln Gln Tyr Tyr Asn Thr Pro Ile Thr
1 5
<210> 38
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 8332 VL氨基酸序列
<400> 38
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 39
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 8332 VL DNA seq
<400> 39
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagttgctca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttataatact 300
ccgatcacct tcggccaagg gacacgactg gagattaaa 339
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L1 HCDR1
<400> 40
Ser Tyr Gln Met His
1 5
<210> 41
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L1 HCDR2
<400> 41
Ile Ile Asn Asp Lys His Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 42
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L1 HCDR3
<400> 42
Gly Tyr Glu Asp Ser Asn Thr His Gln His Pro Ile Phe Phe Asp Ile
1 5 10 15
<210> 43
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L1 VH氨基酸序列
<400> 43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gln Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Asp Lys His Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Glu Asp Ser Asn Thr His Gln His Pro Ile Phe Phe
100 105 110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 44
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L1 VH DNA seq
<400> 44
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctaccaga tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacgaca agcacggtag cacaagctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagggggtat 300
gaggatagca acactcacca gcacccgatt ttttttgata tctggggcca agggacaatg 360
gtcaccgtct cttca 375
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L1 LCDR1
<400> 45
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Arg His Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L1 LCDR2
<400> 46
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L1 LCDR3
<400> 47
Gln Gln Tyr Tyr Asn Thr Pro Ile Thr
1 5
<210> 48
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L1 VL氨基酸序列
<400> 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Arg
20 25 30
His Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 49
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L1 VL DNA seq
<400> 49
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtgctg tacaggcaca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagttgctca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttataatact 300
ccgatcacct tcggccaagg gacacgactg gagattaaa 339
<210> 50
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L35 HCDR1
<400> 50
Ser Tyr Gln Met His
1 5
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L35 HCDR2
<400> 51
Ile Ile Asn Asp Lys His Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 52
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L35 HCDR3
<400> 52
Gly Tyr Glu Asp Ser Asn Thr His Gln His Pro Ile Phe Phe Asp Ile
1 5 10 15
<210> 53
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L35 VH氨基酸序列
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gln Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Asp Lys His Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Glu Asp Ser Asn Thr His Gln His Pro Ile Phe Phe
100 105 110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 54
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L35 VH DNA seq
<400> 54
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctaccaga tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacgaca agcacggtag cacaagctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagggggtat 300
gaggatagca acactcacca gcacccgatt ttttttgata tctggggcca agggacaatg 360
gtcaccgtct cttca 375
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L35 LCDR1
<400> 55
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Arg His Asn Asn Asn Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L35 LCDR2
<400> 56
Trp Ala Ser Thr Ser Glu Ser
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L35 LCDR3
<400> 57
Gln Gln Tyr Tyr Asn Thr Pro Ile Thr
1 5
<210> 58
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L35 VL氨基酸序列
<400> 58
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Arg
20 25 30
His Asn Asn Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Ser Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 59
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H15L35 VL DNA seq
<400> 59
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtgctg tacaggcaca acaataacaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagttgctca tttactgggc atctaccagc 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttataatact 300
ccgatcacct tcggccaagg gacacgactg gagattaaa 339
<210> 60
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HN2-G9 HCDR1
<400> 60
Ser Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 61
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HN2-G9 HCDR2
<400> 61
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 62
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HN2-G9 HCDR3
<400> 62
Gly Tyr Cys Ser Gly Gly Arg Cys Tyr Ser Asp Phe Gln His
1 5 10
<210> 63
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HN2-G9 VH氨基酸序列
<400> 63
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Cys Ser Gly Gly Arg Cys Tyr Ser Asp Phe Gln His
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 64
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HN2-G9 VH DNA seq
<400> 64
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt atttctgtgc gagaggatat 300
tgtagtggcg gtaggtgcta ctctgacttc cagcactggg gccagggcac cctggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 65
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HN2-G9 LCDR1
<400> 65
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HN2-G9 LCDR2
<400> 66
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HN2-G9 LCDR3
<400> 67
Gln Gln Tyr Tyr Asn Thr Pro Ile Thr
1 5
<210> 68
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HN2-G9 VL氨基酸序列
<400> 68
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 69
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HN2-G9 VL DNA seq
<400> 69
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagttgctca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttataatact 300
ccgatcacct tcggccaagg gacacgactg gagattaaa 339
<210> 70
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC8 HCDR1
<400> 70
Asn Asn Tyr Met Ser
1 5
<210> 71
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC8 HCDR2
<400> 71
Val Ile Tyr Ser Gly Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC8 HCDR3
<400> 72
Val Ser Gly Leu Gly Trp Phe Asp Pro
1 5
<210> 73
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC8 VH氨基酸序列
<400> 73
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Asn Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Ser Gly Leu Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 74
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BC8 VH DNA seq
<400> 74
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccgtcagt aataattaca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gactggagtg ggtctcagtt atttatagtg gtgggaaaac atactacgcg 180
gactccgcga agggcagatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac ggtgtttctt 240
caaatgaaca gcctgagagt cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agtttcaggc 300
cttggctggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351
<210> 75
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC8 LCDR
<400> 75
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Tyr
1 5 10
<210> 76
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC8 LCDR2
<400> 76
Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 77
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC8 LCDR3
<400> 77
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Trp Val
1 5 10
<210> 78
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC8 VL氨基酸序列
<400> 78
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 79
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BC8 VL DNA seq
<400> 79
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaattatg tatactggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat aggaataatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240
tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgag tggttgggtg 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330

Claims (16)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人或小鼠CD98，其中所述抗体或其抗原结合片段包括：
重链CDR1(HCDR1)，包括选自SEQ ID NO:10、20、30、40、50、60和70的氨基酸序列或由其组成；
重链CDR2(HCDR2)，包括选自SEQ ID NO:11、21、31、41、51、61和71的氨基酸序列或由其组成；
重链CDR3(HCDR3)，包括选自SEQ ID NO:12、22、32、42、52、62和72的氨基酸序列或由其组成；
轻链CDR1(LCDR1)，包括选自SEQ ID NO:15、25、35、45、55、65和75的氨基酸序列或由其组成；
轻链CDR2(LCDR2)，包括选自SEQ ID NO:16、26、36、46、56、66和76的氨基酸序列或由其组成；
轻链CDR3(LCDR3)，包括选自SEQ ID NO:17、27、37、47、57、67和77的氨基酸序列或由其组成。
2.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其包括以下(a)至(g)中的任一项：
(a)HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别包括SEQ ID NO:10、11和12的氨基酸序列或由其组成；和，LCDR1、LCDR2、LCDR3，包括SEQ ID NO:15、16和17的氨基酸序列或由其组成；
(b)HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别包括SEQ ID NO:20、21和22的氨基酸序列或由其组成；和，LCDR1、LCDR2、LCDR3，包括SEQ ID NO:25、26和27的氨基酸序列或由其组成；
(c)HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别包括SEQ ID NO:30、31和32的氨基酸序列或由其组成；和，LCDR1、LCDR2、LCDR3，包括SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列或由其组成；
(d)HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别包括SEQ ID NO:40、41和42的氨基酸序列或由其组成；和，LCDR1、LCDR2、LCDR3，包括SEQ ID NO:45、46和47的氨基酸序列或由其组成；
(e)HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别包括SEQ ID NO:50、51和52的氨基酸序列或由其组成；和，LCDR1、LCDR2、LCDR3，包括SEQ ID NO:55、56和57的氨基酸序列或由其组成；
(f)HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别包括SEQ ID NO:60、61和62的氨基酸序列或由其组成；和，LCDR1、LCDR2、LCDR3，包括SEQ ID NO:65、66和67的氨基酸序列或由其组成；
(g)HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别包括SEQ ID NO:70、71和72的氨基酸序列或由其组成；和，LCDR1、LCDR2、LCDR3，包括SEQ ID NO:75、76和77的氨基酸序列或由其组成；
其中包含以上(a)至(f)中任一项的抗体或其片段特异性结合hCD98，并且包含(g)的抗体或其片段特异性结合小鼠CD98。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其片段，其包括：
重链可变区(VH)，包括与选自SEQ ID NO:13、23、33、43、53、63和73的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列；和/或
轻链可变区(VL)，包括与选自SEQ ID NO:18、28、38、48、58、68和78的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的抗体或其片段，其包括：
VH，包括选自SEQ ID NO:13、23、33、43、53、63和73的氨基酸序列，和/或
VL，包括选自SEQ ID NO:18、28、38、48、58、68和78的氨基酸序列。
5.根据权利要求3所述的抗体或其片段，其包括以下(a)至(g)中的任一项：
(a)VH，包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列或由其组成；和，VL，包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列或由其组成，
(b)VH，包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列或由其组成，和，VL，包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列或由其组成，
(c)VH，包括SEQ ID NO:33的氨基酸序列或由其组成，和，VL，包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列或由其组成，
(d)VH，包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列或由其组成，和，VL，包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列或由其组成，
(e)VH，包括SEQ ID NO:53的氨基酸序列或由其组成，和，VL，包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列或由其组成，
(f)VH，包括SEQ ID NO:63的氨基酸序列或由其组成，和，VL，包括SEQ ID NO:68的氨基酸序列或由其组成，
(g)VH，包括SEQ ID NO:73的氨基酸序列或由其组成，和VL，包括SEQ ID NO:78的氨基酸序列或由其组成，
其中包含以上(a)至(f)中任一项的抗体或其片段特异性结合hCD98，并且包含(g)的抗体或其片段特异性结合小鼠CD98。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的抗体或其片段，其结合hCD98具有pH依赖性，其中所述抗体或其片段在酸性pH下的结合活性高于在中性pH下的结合活性。
7.根据权利要求6所述的抗体或其片段，其中当通过ELISA法测量结合活性时，当测量抗体与hCD98的结合时，所述抗体或其片段在酸性pH下的EC50比在中性pH下的EC50低至少2倍、3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍。
8.根据权利要求6或7所述的抗体或其片段，其中所述酸性pH为5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7或6.8，和所述中性pH为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6，优选地，所述酸性pH为6.5和所述中性pH为7.4。
9.一种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1～8中任一项所述的抗体或其片段。
10.一种表达载体，其包括根据权利要求9所述的分离的多核苷酸。
11.一种宿主细胞，其包括根据权利要求10所述的表达载体。
12.一种组合物，其包括：根据权利要求1～8中任一项所述的抗体或其片段；和，药学上可接受的载体。
13.一种在有需要的受试者中减少肿瘤、抑制肿瘤细胞生长、治疗癌症或预防癌症复发的方法，包括向受试者施用治疗有效量的根据权利要求1～8中任一项所述的抗体或其片段，或权利要求12所述的组合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述肿瘤或癌症为表达CD98的肿瘤或癌症。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述肿瘤或癌症具有呈酸性pH的微环境，所述酸性pH例如pH 7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0或更低，和所述受试者的正常生理pH为约pH 7.4。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述肿瘤或癌症选自淋巴瘤、急性早幼粒细胞白血病、肝细胞癌、胰腺癌、胰腺上皮样癌、乳腺癌、结直肠腺癌、皮肤表皮样癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、非小细胞肺癌、胃癌、急性髓系白血病、胶质瘤、舌癌、下咽鳞状细胞癌、胆管癌、骨软化症、骨肉瘤、肾癌和神经母细胞瘤。
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