WO2007094325A1 - ベンズイミダゾール系骨格を有する新規蛍光物質及びその用途 - Google Patents

ベンズイミダゾール系骨格を有する新規蛍光物質及びその用途 Download PDF

Info

Publication number
WO2007094325A1
WO2007094325A1 PCT/JP2007/052529 JP2007052529W WO2007094325A1 WO 2007094325 A1 WO2007094325 A1 WO 2007094325A1 JP 2007052529 W JP2007052529 W JP 2007052529W WO 2007094325 A1 WO2007094325 A1 WO 2007094325A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
compound
substituted
alkyl
alkoxy
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/052529
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Takeshi Imanishi
Kazuyuki Miyashita
Original Assignee
The New Industry Research Organization
Osaka University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The New Industry Research Organization, Osaka University filed Critical The New Industry Research Organization
Priority to JP2008500505A priority Critical patent/JPWO2007094325A1/ja
Publication of WO2007094325A1 publication Critical patent/WO2007094325A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D235/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, condensed with other rings
    • C07D235/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, condensed with other rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D235/04—Benzimidazoles; Hydrogenated benzimidazoles
    • C07D235/20—Two benzimidazolyl-2 radicals linked together directly or via a hydrocarbon or substituted hydrocarbon radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/12—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D487/14—Ortho-condensed systems
    • H—ELECTRICITY
    • H05—ELECTRIC TECHNIQUES NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • H05B—ELECTRIC HEATING; ELECTRIC LIGHT SOURCES NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; CIRCUIT ARRANGEMENTS FOR ELECTRIC LIGHT SOURCES, IN GENERAL
    • H05B33/00—Electroluminescent light sources
    • H05B33/12—Light sources with substantially two-dimensional radiating surfaces
    • H05B33/14—Light sources with substantially two-dimensional radiating surfaces characterised by the chemical or physical composition or the arrangement of the electroluminescent material, or by the simultaneous addition of the electroluminescent material in or onto the light source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1044—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing two nitrogen atoms as heteroatoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1074—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing more than three nitrogen atoms as heteroatoms

Definitions

  • Novel fluorescent substance having benzimidazole skeleton and use thereof
  • the present invention relates to a novel fluorescent substance having a benzimidazole skeleton and its use.
  • Heptamethine cyanine dye is known as a fluorescent substance having both a high fluorescence quantum yield and a large stochastic shift (Non-patent Document 1).
  • fluorescent labels are now the mainstream in place of radioactive isotope labels, and the development of fluorescent materials with both higher sensitivity and superior properties is desired.
  • Non-Patent Document 1 J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 4170-4171
  • An object of the present invention is to provide a fluorescent substance capable of detecting a very small amount of a biological component, an environmental substance, and the like with high sensitivity, and a use thereof.
  • Ring A is a halogen atom, C alkyl group, C alkenyl group, C alkynyl group, C
  • Nitro group carboxyl group, C alkoxy carbonyl group, C aryloxy
  • Rubamoyl group each substituted with a selected substituent, may be an aryl ring or an aromatic heterocyclic ring;
  • R 1 is a C alkyl group, a C alkyl group, a C alkyl group, an aralkyl group or
  • R 2 and R 3 are the same or different and each represents a halogen atom, a hydroxyl group, C alkoxy
  • Aralkyloxy-carbocycle group may be substituted with each selected substituent.
  • R 4 is a halogen atom, C alkyl group, C alkyl group, C alkyl group, C alkyl group, C
  • 1 is 0 or an integer from 1 to 3;
  • R 5 is a C alkyl group, C alkyl carbo group, substituted benzyl group, substituted silyl group
  • Ring A is selected from C alkoxy group, acyloxy group, cyano group and -tro group
  • R 1 is a C alkyl group or a linker
  • R 2 and R 3 are the same or different and each represents a C alkoxy group, an acyloxy group, and
  • a aralkyl group, or R 2 and R 3 may combine to form a 5- to 6-membered ring;
  • R 4 is a C alkyl group or a C alkoxy group;
  • 1 is 0 or 1;
  • R 5 is a C alkyl carbo group, a phosphonoxy group or a substituted phosphonoxy group.
  • a fluorescently labeled molecule comprising the compound according to [1] or [2] above and a biological molecule selected from the group consisting of nucleic acids, peptides, sugars and lipids.
  • Fluorescence resonance energy transfer comprising, as a donor fluorescent molecule, a compound according to the above [1] or [2], a biological molecule selected from the group consisting of nucleic acids, peptides, sugars and lipids, and an acceptor fluorescent molecule Fluorescent indicator that utilizes
  • [7] A method for measuring an environmental substance or a biological molecule, wherein the compound according to [1] or [2] is used as a fluorescent label.
  • [8] A method for intracellular molecular imaging, comprising using the compound according to [1] or [2] as a fluorescent label.
  • a method for measuring a biological molecule which comprises using the fluorescent indicator according to [4] above.
  • the compound of the present invention When used in fluorescence analysis, the compound of the present invention has such a large stochastic shift that the background such as excitation light and Raman scattering can be ignored. It can be detected with high sensitivity.
  • the fluorescently labeled molecule or fluorescent indicator of the present invention can detect a trace component with high sensitivity and specificity by selecting a biologically derived molecule that specifically acts on the detection target. Since the method for measuring environmental substances or biological molecules or the molecular imaging method of the present invention uses the compound of the present invention as a fluorescent substance, it can provide a highly sensitive and specific measurement environment.
  • halogen atom examples include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom.
  • C alkyl group for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl
  • Examples thereof include straight chain or branched chain C alkyl groups such as n-butynole, isobutyl, sec butyl, tert-butinole, pentinole and hexyl.
  • C alkenyl group examples include bur, 1-probe, 2-probe, 1
  • Examples thereof include straight chain or branched chain C alkenyl groups such as butyl, 2-butyl, 3-butyl, 1-pentyl, and 1-hexenyl.
  • Examples of the “C alkyl group” include, for example, Etul, 1 Probule, 2-Probule,
  • Examples thereof include linear or branched C alkynyl groups such as 1-butynyl, 2 butynyl, 3 butynyl, 1 pentynyl, and 1 monohexynyl.
  • Examples of the "c aryl group” include phenyl, naphthyl and the like.
  • C aralkyl group examples include benzyl, 1-phenylethyl, 2-phenyl-
  • C alkoxy group includes, for example, methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropyl
  • Examples thereof include linear or branched C alkoxy groups such as poxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, tert-butoxy, pentinoreoxy and hexyloxy.
  • Examples of the “c alkyl carbonyl group” include acetyl, propionyl, butyryl.
  • c alkoxy carbonyl group for example, methoxycarbonyl, ethoxy
  • Examples of the “c aryloxycarbonyl group” include phenoxycarbonyl,
  • Examples of the “c aralkyloxy carbonyl group” include benzyloxycarboxyl.
  • the "substituent power ruberamoyl group” includes, for example, mono- or di-C alkyl power ruberamoyl groups such as methylcarbamoyl, ethylcarbamoyl, dimethylcarbamoyl;
  • Rubamoyl group mono- or di-C aralkyl power Luba such as benzylcarbamoyl
  • a moyl group is mentioned.
  • acyloxy group examples include linear or branched C alkyl carbo-rooyl such as acetyloxy, propionyloxy, butyryloxy, bivalyloxy and the like.
  • Xyl group C-aryl such as phenol, naphthylcarboxoxy, etc.
  • Ring A is a halogen atom, a C alkyl group, a C alkenyl group, a C alkynyl group,
  • Substituted carbamoyl group power Each substituted with a selected substituent may be an aryl ring or an aromatic heterocyclic ring.
  • aryl ring examples include C aryl rings such as benzene and naphthalene.
  • aromatic heterocycle examples include, for example, a 5- to 7-membered monocyclic aromatic heterocycle having 1 to 4 heteroatoms selected from a nitrogen atom, an oxygen atom and a sulfur atom in addition to a carbon atom, and A condensed aromatic heterocycle is mentioned.
  • condensed aromatic heterocycle examples include a condensed ring of 5- to 7-membered monocyclic aromatic heterocycles and a condensed ring of a 5- to 7-membered monocyclic aromatic heterocycle and a benzene ring.
  • Examples of the “5- to 7-membered monocyclic aromatic heterocycle” include pyridine, pyridazine, pyrimidine, pyrazine, furan, thiophene, pyrrole, oxazole, isoxazole, thiazole, isothiazole, imidazole, pyrazole, trobolone and the like. Can be mentioned.
  • fused aromatic heterocycle examples include quinoline, isoquinoline, indole and the like.
  • the “aryl ring” or “aromatic heterocycle” represented by ring A may have! / ⁇ .
  • the number of substituents is not particularly limited. When two or more substituents are present, the substituents may be the same or different. An unsubstituted aryl ring or aromatic heterocyclic ring is also preferable.
  • Ring A is preferably a substituent which also has C alkoxy group and acyloxy group strength.
  • An aryl ring or aromatic heterocyclic ring, each of which may be substituted, is more preferably an aryl ring.
  • R 1 represents a C alkyl group, a C alkyl group, a C alkyl group, or a C aralkyl group.
  • Linker is a part that acts to bind a compound of the present invention to a binding target such as a nucleic acid sequence, amino acid sequence, sugar chain sequence, etc.
  • a binding target such as a nucleic acid sequence, amino acid sequence, sugar chain sequence, etc.
  • the linker may have an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, or a mercapto group at the terminal in order to be used for binding with the binding target.
  • C hydrocarbon group examples include C alkyl group, C alkenyl group, C
  • Examples include 1-10 1-10 2-10 2-alkynyl group.
  • C alkyl group for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl
  • n examples include linear or branched C alkyl groups such as butynole, isobutinole, sec butinole, tert butinole, pentinole, hexinole, heptyl, octyl, nonyl, decyl, etc.
  • C alkyl group examples include bur, 1-probe, 2-probe,
  • Examples thereof include straight-chain or branched-chain C alkenyl groups such as 1-buture, 2-buture, 3-buture, 1-pentyl, and 1-hexenyl.
  • C alkyl group examples include ethul, 1-propyl, 2-propyl.
  • Straight-chain or branched C alkynyl groups such as 1-butul, 2 butur, 3 butur, 1 pentyl, and 1-hexyl.
  • polyethylenedioxy group examples include 1 to 5 polyethylenedioxy groups having an ethyleneoxy group strength.
  • R 1 is preferably a C alkyl group or a linker, and more preferably C alkyl.
  • R 2 and R 3 are the same or different and each represents a halogen atom, a hydroxyl group, or a C alkoxide.
  • aralkyloxy-carbonyl group is substituted with a substituent selected from
  • R 2 and R 3 may combine to form a 5- to 9-membered ring.
  • the 5- to 9-membered ring formed by combining R 2 and R 3 includes, for example,
  • R 2 and R 3 are preferably the same or different from each other, and are a halogen atom, a hydroxyl group, a ⁇ alkoxy group, an acyloxy group, an amino group, a strong rubamoyl group, a substituted rubamoyl group,
  • a aralkyl group or R 2 and R 3 may be combined to form a 5- to 9-membered ring.
  • R 2 and R 3 are more preferably a C alkyl group, or R 2 and R 3, respectively.
  • R 4 represents a halogen atom, a C alkyl group, a C alkenyl group, a C alkynyl group, C
  • a rubermoyl group, 1 is 0 or an integer of 1 to 3;
  • R 4 may be the same or different from each other! /.
  • R 4 is preferably a C alkyl group or a C alkoxy group, more preferably C
  • 1 is preferably 0 or 1, more preferably 0.
  • substitution position of 0- or OR 5 is not particularly limited, but the following general formulas ( ⁇ ), ( ⁇ ,), ( ⁇ 1) or ( ⁇ '— 1):
  • R 5 represents a C alkyl group, a C alkyl carbo ol group, a substituted benzyl group, a substituted silyl group,
  • substituted benzyl group examples include benzo substituted with C alkoxy, nitro and the like.
  • a zircyl group is mentioned.
  • substituted silyl group examples include trimethylsilyl, triethylsilyl, tert-butyldimethylsilyl and the like.
  • substituted phosphonoxy group examples include dimethylphosphonoxy, jetylphosphonoxy and the like.
  • R 5 are preferably, C alkylcarboxy - group, substituted silyl group, Hosuhonookishi group
  • a substituted phosphonoxy group more preferably a C alkyl carbonyl group, a phospho group.
  • a nooxy group and a substituted phosphonooxy group are identical to each other.
  • counter-on examples include halogen ions such as chlorine ion, bromine ion and iodine ion; inorganic acid ions such as sulfate ion, nitrate ion, perchlorate ion and phosphate ion; methanesulfonate ion , Trifluoromethanesulfonic acid ion, p-toluenesulfonic acid ion, organic acid ion such as benzene sulphonate ion, and the like.
  • halogen ions such as chlorine ion, bromine ion and iodine ion
  • inorganic acid ions such as sulfate ion, nitrate ion, perchlorate ion and phosphate ion
  • methanesulfonate ion Trifluoromethanesulfonic acid ion, p-toluenesulfonic acid ion
  • it is a trifluoromethanesulfonic acid ion, a chlorine ion, a bromine ion, or a iodine ion, and more preferably a trifluoromethanesulfonic acid ion or a chlorine ion. is there.
  • Ring A is selected from C alkoxy group, acyloxy group, cyano group and -tro group force.
  • R 1 is a C alkyl group or a linker
  • R 2 and R 3 are the same or different and each represents a C alkoxy group, an acyloxy group, and
  • a aralkyl group, or R 2 and R 3 may combine to form a 5- to 6-membered ring;
  • R 4 is a C alkyl group or a C alkoxy group;
  • 1 is 0 or 1;
  • R 5 is a C alkyl carbo group, a phosphonoxy group or a substituted phosphonoxy group.
  • B_ is trifluoromethanesulfonic acid ion or chlorine ion
  • R 1 is a C alkyl group
  • R 2 and R 3 are each a C alkyl group, or R 2 and R 3 are
  • the product obtained in each of the following steps is crystallized, recrystallized, column chromatography, regenerated It can be purified by conventional methods such as precipitation.
  • a compound in the following formula is commercially available, a commercially available product can be used.
  • P 1 and P 2 are each a protecting group for a hydroxyl group, X is a leaving group, and other symbols are as defined above.]
  • protecting group for hydroxy group represented by P 1 or P 2 is, for example, Asechiru, propionic - Le C alkyl carbocyclic groups such as; benzoyl carboyl carbo
  • silyl groups such as trimethylsilyl, triethylsilyl, tert-butyldimethylsilyl
  • C_aralkyl groups such as benzyl, p-methoxybenzyl, and p-trobenzyl.
  • the "leaving group" represented by X may be, for example, a halogen atom such as chlorine, bromine or iodine; or a halogenated group such as a methanesulfuroxy group or a trifluoromethanesulfuroxy group.
  • a halogen atom such as chlorine, bromine or iodine
  • a halogenated group such as a methanesulfuroxy group or a trifluoromethanesulfuroxy group.
  • P 1 is preferably a C alkyl carboyl such as acetyl and propiol.
  • P 2 is preferably a silyl group such as trimethylsilyl, triethylsilyl, tert-butyldimethylsilyl.
  • Step 1 is a step in which compound (V) is obtained by reducing compound (V).
  • the starting compound (V) is a known compound or a method known per se (for example, Han, G .; Shin, KJ; Kim, D.C; Yoo, KH; Kim, DJ; Park, SW Heterocycles, 1996, 43, 2496. and Panteleon, V .; Marakos, P .; Pouli, N .; Mikros, M .; Andreadou, I. Chem. Pharm. Bull. 2003, 51, 522.) Can be manufactured.
  • This step can be performed, for example, by a catalytic reduction method; a reduction method using a reducing agent such as iron, zinc, tin, or the like, and is preferably a catalytic reduction method.
  • the catalytic reduction reaction is carried out in a solvent in the presence of a catalyst and under normal pressure using hydrogen gas.
  • the catalyst used for the reaction include noradium carbon, Raney nickel, platinum oxide, etc., preferably palladium-carbon. It is.
  • the amount of the catalyst to be used is 10 to 100% by weight, preferably 50 to 70% by weight, relative to compound (V).
  • Solvents used in the reaction include alcohols such as methanol, ethanol, and propanol. Examples include alcohols; esters such as ethyl acetate; acetic acid and the like, and alcohols such as methanol and ethanol are preferable.
  • the reaction time is usually 12 to 60 hours, preferably 36 to 48 hours.
  • the reaction temperature is usually 10 ° C to 30 ° C, preferably 15 ° C to 25 ° C.
  • the compound (VI) obtained in this step can be purified by a conventional method such as recrystallization or column chromatography, but can also be used in the next reaction without purification.
  • Step 2 is a step of obtaining compound (VII) by dehydrating compound (VI).
  • This step can be performed, for example, by a method of dehydrating in a solvent in the presence of an acid.
  • the acid used in the reaction include p-toluenesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and sulfuric acid.
  • the amount of the acid used is 1 to 5 mol, preferably 1 mol, relative to 1 mol of compound (VI).
  • Examples of the solvent used in the reaction include alcohols such as methanol, ethanol, and propanol; aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene, and xylene; or a mixed solvent thereof, preferably methanol, ethanol, and the like.
  • a mixed solvent of alcohols such as benzene and aromatic hydrocarbons such as toluene.
  • the reaction time is usually 6 to 48 hours, preferably 10 to 24 hours.
  • the reaction temperature is usually 100 ° C to 200 ° C, preferably 100 ° C to 150 ° C. It can also be promoted by removing the water produced using a Dean-Stark still.
  • Step 3 is a step in which compound (VII) is deprotected and a desired protecting group is introduced to obtain compound (VIII).
  • P 1 and P 2 are different, it is carried out as necessary.
  • the deprotection reaction and the protection reaction vary depending on the type of protecting group, but are known per se (for example, the method described in Protective uroups in Organic Syntnesis (Theodora W. ureene, 1981, published by A Wiley-Interscience Publication)). ).
  • the corresponding alcohol By reacting in the presence of a base, the corresponding alcohol is obtained.
  • the solvent used in the reaction include alcohols such as methanol, ethanol and propanol; ethers such as tetrahydrofuran; water; or a mixed solvent thereof.
  • Examples of the base used for the reaction include sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, potassium bicarbonate and the like.
  • the amount of the base to be used is 5 to 50 mol, preferably 10 to 20 mol, per 1 mol of compound (VII).
  • the reaction time is usually 0.5 to 5 hours, preferably 2 to 4 hours.
  • the reaction temperature is usually 10 ° C to 30 ° C, preferably 15 ° C to 25 ° C.
  • compound (VIII) can be obtained by reacting the alcohol obtained above with the corresponding silyl halide in the presence of a base in a solvent.
  • a base examples include organic amines such as triethylamine, imidazole, diisopropylethylamine and pyridine.
  • the amount of the base to be used is 1 to 10 mol, preferably 2 to 5 mol, per 1 mol of alcohol or compound (VII).
  • the amount of silyl halide to be used is 1 to 10 mol, preferably 1.2 to 3 mol, per 1 mol of the alcohol or compound (VII).
  • solvent used for the reaction examples include amides such as N, N-dimethylformamide and N, N-dimethylacetamide; halogen-containing hydrocarbons such as dichloromethane; ethers such as tetrahydrofuran; or a mixed solvent thereof.
  • the reaction time is usually 3 to 48 hours, preferably 5 to 24 hours.
  • the reaction temperature is usually 10 ° C to 30 ° C, preferably 15 ° C to 25 ° C.
  • Step 4 is a step of obtaining compound (IX) by reacting compound (VIII) with compound ( ⁇ ) in the presence of a base.
  • Bases used in the reaction include alkali metal hydrides such as sodium hydride and potassium hydride; metal amides such as lithium diisopropylamide, sodium amide and lithium hexamethyldisilazide; metal alkoxides such as potassium tert-butoxide Among them, sodium hydride is preferable.
  • the amount of the base to be used is 1 to 3 mol, preferably 1.1 to 1.6 mol, per 1 mol of compound (VIII).
  • the amount of compound (XXIII) to be used is 1.0 to 1.3 mol, preferably 1.0 to L1 mol, per 1 mol of compound (VIII).
  • Examples of the solvent used in the reaction include ethers such as jetyl ether, tetrahydrofuran, and 1,4 dioxane; amides such as N and N dimethylformamide; or a mixed solvent thereof. Ethers such as ether, tetrahydrofuran and 1,4-dioxane.
  • the reaction time is usually 1 to 5 hours, preferably 1 to 3 hours.
  • the reaction temperature is usually 0 ° C to 30 ° C, preferably 15 ° C to 25 ° C.
  • step 5 compound (IX) is reacted with nitrite in the presence of a base to obtain an oxime, and then the oxime is dehydrated in the presence of an acid to give compound (X). It is a process to obtain.
  • Bases used in the reaction include alkali metal hydrides such as sodium hydride and potassium hydride; metal amides such as lithium diisopropylamide, sodium amide and lithium hexamethyldisilazide; metal alkoxides such as potassium tert butoxide And lithium diisopropylamide is preferable.
  • the amount of the base to be used is 2 to 3 mol, preferably ⁇ 2.2 to 2.6 mol, per 1 mol of compound (IX).
  • nitrite used in the reaction examples include ethyl nitrite, isopropyl nitrite, butyl nitrite and the like.
  • the amount of the nitrite ester to be used is 2 to 10 mol, preferably 3 to 5 mol, per 1 mol of compound (IX).
  • Examples of the solvent used in the reaction include ethers such as jetyl ether, tetrahydrofuran, and 1,4 dioxane; or a mixed solvent thereof, and preferably ethers such as jet ether, tetrahydrofuran, and 1,4 dioxane. It is.
  • the reaction time is usually 0.2 to 5 hours, preferably 0.5 to 2.5 hours.
  • the reaction temperature is usually 100 ° C to 0 ° C, preferably 80 ° C to 1-50 ° C.
  • the oxime obtained in this reaction can be purified by conventional methods such as recrystallization and column chromatography, but can also be used in the next reaction without purification.
  • Examples of the solvent used in the reaction for dehydrating the oxime compound include aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene and xylene; halogen-containing hydrocarbons such as dichloromethane and dichloroethane; or a mixed solvent thereof.
  • Aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene and xylene are preferred.
  • Examples of the acid used in the reaction for dehydrating the oxime compound include sodium chloride and phosphorus oxychloride, and preferably sodium chloride.
  • the amount of the acid to be used is 1 to 3 mol, preferably 1.1 to 1.3 mol, per 1 mol of the oxime compound or compound (IX).
  • the reaction time is usually 0.5 to 3 hours, preferably 1 to 2 hours.
  • the reaction temperature is usually 60 ° C to 120 ° C, preferably 70 ° C to 100 ° C.
  • Step 6 is a step of obtaining compound (XI) by reacting compound (X) with compound (XXIV).
  • a base such as potassium carbonate or sodium carbonate
  • an acid such as hydrochloric acid-hydrogen-methanol.
  • the amount of compound (XXIV) to be used is 1 to 3 mol, preferably 1.1 to 2 mol, per 1 mol of compound (X).
  • Examples of the solvent used in the reaction include alcohols such as methanol, ethanol and propanol; or a mixed solvent thereof.
  • the reaction time is usually 5 to 24 hours, preferably 6 to 12 hours.
  • the reaction temperature is usually 10 ° C to 30 ° C, preferably 15 ° C to 25 ° C.
  • Step 7 is a step of obtaining compound (XII) or compound ( ⁇ ) by reacting compound (XI) with compound (XXV) in a solvent.
  • the amount of compound (XXV) to be used is 1 to 1.5 mol, preferably 1 to 1.2 mol, per 1 mol of compound (XI).
  • Examples of the solvent used for the reaction include ethers such as jetyl ether, tetrahydrofuran, and 1,4-dioxane; halogen-containing hydrocarbons such as dichloromethane and dichloroethane; or a mixed solvent thereof, preferably dichloromethane.
  • ethers such as jetyl ether, tetrahydrofuran, and 1,4-dioxane
  • halogen-containing hydrocarbons such as dichloromethane and dichloroethane
  • a mixed solvent thereof preferably dichloromethane.
  • Dichloroethane Any halogen-containing hydrocarbons.
  • the amount of the compound (XXV) used is 1 to 1.5 mol, preferably 1 with respect to 1 mol of the compound (XI). ⁇ 1.2 mol.
  • Solvents used for the reaction include halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane; ethers such as jetyl ether, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane; or a mixed solvent thereof.
  • halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, chloroform, and 1,2-dichloroethane.
  • the reaction time is usually 1 to: LO time, preferably 3 to 7 hours.
  • the reaction temperature is usually 78 ° C to 10 ° C, preferably 20 ° C to 0 ° C.
  • the product obtained in this step has two imidazole rings into which R 1 is introduced, it becomes a mixture of the compound ( ⁇ ) and the compound ( ⁇ ).
  • These positional isomers can be separated by conventional methods such as recrystallization and column chromatography.
  • Step 8 is a step of obtaining compound (I) or compound (II) by deprotecting compound ( ⁇ ) or compound ( ⁇ ), respectively.
  • the deprotection reaction varies depending on the type of protecting group, but is a method known per se (for example, the method described in “Protective Groups in Organic synthesis” Can be performed.
  • deprotection can be carried out by treating compound ( ⁇ ) or compound ( ⁇ ) with fluoride ion in a solvent.
  • Fluoride ions used in the reaction include sodium fluoride-hydrogen fluoride buffer, tetrabutylammonium fluoride, and the like.
  • the amount of fluoride ion to be used is 5 to 50 mol, preferably 10 to 15 mol, per 1 mol of compound ( ⁇ ) or compound ( ⁇ ).
  • Examples of the solvent used in the reaction include ethers such as tetrahydrofuran and 1,4 dioxane; alcohols such as methanol and ethanol; water; or a mixed solvent thereof, preferably ethers such as tetrahydrofuran and 1,4 dioxane. It is kind.
  • the reaction time is usually 0.5 to 5 hours, preferably 1 to 3 hours.
  • the reaction temperature is usually 5 ° C to 10 ° C, preferably 0 ° C to 5 ° C.
  • R 1C is a C alkyl group
  • m is an integer of 15
  • n is represented by (m-1).
  • P 3 is a protecting group for a hydroxyl group, and other symbols are as defined above o]
  • the “hydroxyl-protecting group” represented by P 3 is the “hydroxyl-protecting group” represented by P 1 or P 2. Like can be mentioned and, in view of the deprotection carried out in step 13, it is preferable that different from P 2.
  • Step 9 is a step of obtaining compound (XIV) by reacting compound (VIII) with compound (XXVI) in the presence of a base.
  • Examples of the base used in the reaction include alkali metal hydrides such as sodium hydride and potassium hydride; metal alkoxides such as potassium tert butoxide, and sodium hydride is preferred.
  • the amount of the base to be used is 1 to 3 mol, preferably 1.1 to 1.6 mol, per 1 mol of compound (VIII).
  • the amount of compound (XXVI) to be used is 1.0 to 1.3 mol, preferably 1.0 to L1 mol, per 1 mol of compound (VIII).
  • Examples of the solvent used in the reaction include ethers such as jetyl ether, tetrahydrofuran, and 1,4 dioxane; amides such as N and N dimethylformamide; or a mixed solvent thereof. Ethers such as ether, tetrahydrofuran and 1,4-dioxane.
  • the reaction time is usually 0.2 to 1.5 hours, preferably 0.5 to 1 hour.
  • the reaction temperature is usually ⁇ 10 ° C. to 20 ° C., preferably 0 ° C. to 10 ° C.
  • Step 10 is a step in which compound (XIV) is reduced to obtain compound (XV). This step can be performed by a method of reducing using a reducing agent.
  • Examples of the reducing agent used in the reaction include lithium borohydride, calcium borohydride, lithium aluminum hydride, and the like, preferably calcium borohydride.
  • the amount of the reducing agent to be used is 1 to 5 mol, preferably 1.5 to 2.5 monolayer, per 1 mol of compound (XIV).
  • Examples of the solvent used in the reaction include alcohols such as methanol, ethanol and propanol; ethers such as jetyl ether, tetrahydrofuran and 1,4 dioxane; or a mixed solvent thereof, preferably methanol, Alcohols such as ethanol and propanol.
  • the reaction time is usually 0.5 to 2 hours, preferably 1 to 1.5 hours.
  • the reaction temperature is usually 20 ° C to 10 ° C, preferably 10 ° C to 0 ° C.
  • Step 11 is a step of obtaining compound (XVI) by protecting compound (XV).
  • the protection reaction varies depending on the type of protecting group, a method known per se (for example, the method described in “Protect! Ve Groups in Organic synthesis” (Theodora W. Greene, 1981, published by A Wiley-Interscience Publication)) Can be performed.
  • compound (XVI) can be obtained by reacting compound (XV) with the corresponding silylino or ride in the presence of a base in a solvent.
  • Examples of the base used for the reaction include organic amines such as triethylamine, imidazole, diisopropylethylamine and pyridine.
  • the amount of the base to be used is 1 to 10 mol, preferably 2 to 5 mol, per 1 mol of compound (XV).
  • the amount of silyl halide to be used is 1 to 10 mol, preferably 1.2 to 3 mol, per 1 mol of compound (XV).
  • solvent used for the reaction examples include amides such as N, N dimethylformamide and N, N dimethylacetamide; halogen-containing hydrocarbons such as dichloromethane; ethers such as tetrahydrofuran; or a mixed solvent thereof.
  • the reaction time is usually 0.1 to 2 hours, preferably 0.2 to 1 hour.
  • the reaction temperature is usually ⁇ 10 ° C. to 20 ° C., preferably 0 ° C. to 10 ° C.
  • Step 12 compound (XVII) is reacted with nitrite in the presence of a base to obtain an oxime form, and then the oxime form is dehydrated in the presence of a base and an acid to give compound (XVII ).
  • Bases used in the reaction include alkali metal hydrides such as sodium hydride and potassium hydride; metal amides such as lithium diisopropylamide, sodium amide and lithium hexamethyldisilazide; metal alkoxides such as potassium tert butoxide And lithium diisopropylamide is preferable.
  • the amount of base used is compound (XVI) It is 2 to 3 moles, preferably 2.2 to 2.6 moles per mole.
  • nitrite used in the reaction examples include ethyl nitrite, isopropyl nitrite, butyl nitrite and the like.
  • the amount of nitrite used is 2 to 10 mol, preferably 3 to 5 mol, per 1 mol of compound (XVI).
  • Examples of the solvent used in the reaction include ethers such as jetyl ether, tetrahydrofuran, and 1,4 dioxane; or a mixed solvent thereof, and preferably ethers such as jet ether, tetrahydrofuran, and 1,4 dioxane. It is.
  • the reaction time is usually 0.2 to 5 hours, preferably 0.5 to 2.5 hours.
  • the reaction temperature is usually 100 ° C to 0 ° C, preferably 80 ° C to 1-50 ° C.
  • the oxime obtained in this reaction can be purified by conventional methods such as recrystallization and column chromatography, but can also be used in the next reaction without purification.
  • Examples of the base used in the reaction for dehydrating the oxime compound include 4-dimethylaminopyridine and pyridine, and 4-dimethylaminopyridine is preferred.
  • the amount of the base to be used is 1 to 5 mol, preferably 3 to 4 mol, per 1 mol of the oxime compound or compound (XVI).
  • Examples of the acid used in the reaction for dehydrating the oxime compound include sodium chloride and phosphorus oxychloride, and preferably sodium chloride.
  • the amount of the acid to be used is 1 to 5 mol, preferably 1 to 3 mol, per 1 mol of the oxime compound or compound (XVI).
  • Examples of the solvent used in the reaction for dehydrating the oxime compound include halogen-containing hydrocarbons such as dichloromethane and dichloroethane; aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene, and preferably halogen-containing hydrocarbons such as dichloromethane and dichloroethane. It is kind.
  • the reaction time is usually 1 to 5 hours, preferably 2 to 3 hours.
  • the reaction time is usually ⁇ 20 ° C. to 35 ° C., preferably ⁇ 10 ° C. to 20 ° C.
  • Step 13 is a step of deprotecting compound (XVII) to obtain compound (XVIII).
  • the deprotection reaction varies depending on the type of protecting group, but a method known per se (for example, the method described in “Protective Groups in Organic synthesis (arriving at Theodora W. ureene, 1981, published by A Wiiey-Interscience Publication))” only force protecting group P 3 can be carried out by It is preferable to select conditions that can be removed.
  • Step 14 is a step of obtaining compound (XIX) by reacting compound (XVIII) with compound (XXVII) in the presence of a base in a solvent.
  • Examples of the base used in the reaction include potassium carbonate and sodium carbonate, and potassium carbonate is preferred.
  • the amount of the base to be used is 0.1 to 1.5 mol, preferably 0.5 to 1 mol, per 1 mol of compound (XVIII).
  • the amount of compound (XXVII) to be used is 1 to 3 mol, preferably 1 to 1.5 mol, per 1 mol of compound (XVIII).
  • Examples of the solvent used in the reaction include alcohols such as methanol, ethanol and propanol; or a mixed solvent thereof.
  • the reaction time is usually 1 to 5 hours, preferably 1.5 to 3 hours.
  • the reaction temperature is usually 10 ° C to 30 ° C, preferably 15 ° C to 25 ° C.
  • Step 15 is a step of obtaining compound (XX) by subjecting compound (XIX) to a ring-closing reaction.
  • This step can be carried out by, for example, a method using the Mitsunobu reaction; an intramolecular nucleophilic substitution reaction or the like, and is preferably a method using the Mitsunobu reaction.
  • the Mitsunobu reaction is usually carried out in the presence of phosphines such as triphenylphosphine and tributylphosphine, and azodicarboxylic acid esters such as jetyl azodicarboxylate, ditert-butyl azodicarboxylate, and dibenzyl azodicarboxylate.
  • phosphines such as triphenylphosphine and tributylphosphine
  • azodicarboxylic acid esters such as jetyl azodicarboxylate, ditert-butyl azodicarboxylate, and dibenzyl azodicarboxylate.
  • the amount of the phosphine to be used is 1 to 3 mol, preferably 1.1 to 2 mol, per 1 mol of compound (XIX).
  • Solvents used for the reaction include tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, jetyl ether. Ethers such as ter; and mixed solvents thereof, and the like. Preferred are ethers such as tetrahydrofuran, 1,4 dioxane, and jetyl ether.
  • the reaction time is usually 0.5 to 3 hours, preferably 0.5 to 1.5 hours.
  • the reaction temperature is usually 10 ° C to 30 ° C, preferably 15 ° C to 25 ° C.
  • Step 16 is a step of obtaining compound (XXI) or compound ( ⁇ ) by reacting compound (XX) with compound (XXV) in a solvent, and can be carried out in the same manner as in Step 7 above. wear.
  • Step 17 is a step of obtaining compound (III) or compound (IV) by deprotecting compound (XXI) or compound (IV), and can be carried out in the same manner as in step 8 above.
  • the compound of the present invention thus produced is a fluorescent substance having at least one of the following characteristics. Preferably it has two or more properties, more preferably all of the following properties.
  • the stochastic shift in the present invention refers to the difference between the excitation wavelength and the fluorescence wavelength of the compound of the present invention in an aqueous solution, which is usually lOOnm or more, preferably 110 to 250 nm, more preferably 120 to 250 nm. It is.
  • a compound exhibiting such a staggered shift can ignore backgrounds such as excitation light and Raman scattering, and can detect trace components with high sensitivity.
  • the fact that the compound of the present invention is soluble in water is advantageous for detection of trace components in vivo.
  • the compound of the present invention has a high fluorescence quantum yield in addition to the magnitude of the stochastic shift.
  • the fluorescence quantum yield is the ratio between the number of absorbed photons and the number of emitted photons, and is non-radiated from the excited state. It means the probability of being deactivated by fluorescence rather than the mechanism, and is usually 0.1 or more, preferably 0.1 to 1.0.
  • a compound with such a fluorescence quantum yield and a large stochastic shift can be expected to have a sensitivity equivalent to or higher than that of a detection method using a radioisotope, and can detect a minute component with high sensitivity. Can do.
  • the compound of the present invention emits stable fluorescence without depending on pH in the range of pH 3 to: LO. Therefore, it can also be suitably used for the measurement of fluorescence intensity under conditions where the pH changes greatly within the above range.
  • the compound of the present invention is highly stable as a fluorescent substance even when various modifications are made because it is bound to a biological molecule such as a nucleic acid or a peptide or used as an enzyme substrate. Therefore, it is expected to be used for various purposes.
  • the fluorescent color of the compound of the present invention varies depending on the solvent to be dissolved.
  • a change in fluorescence hue can be confirmed with the naked eye. This property can be used to predict the moisture content.
  • the change in hue in a water-methanol mixed solution having a ratio of water ⁇ to 10 v / v% is described in Test Example 2.
  • the compound of the present invention can be combined with various substances and used as a fluorescent label.
  • the substance to be bound is not particularly limited, and examples thereof include natural or synthetic low molecular compounds and natural or synthetic polymer compounds. In particular, it is expected to be used for detection of substances derived from living bodies including nucleic acids and proteins.
  • the present invention provides a fluorescently labeled molecule comprising the compound of the present invention and a biological molecule selected from the group consisting of nucleic acids, peptides, sugars and lipids.
  • a biologically derived molecule is covalently bonded to a linker moiety of the compound of the present invention.
  • the nucleic acid contained in the fluorescently labeled molecule of the present invention and to which the compound of the present invention is to be bound may be a natural nucleic acid such as DNA or RNA, a synthetic nucleic acid, or a nucleic acid analog. It is not particularly limited. It may contain peptides or lipids that are bound or complexed with nucleic acids. [0088] Similarly, the peptide may be a natural or synthetic peptide, and the length of the peptide is not particularly limited. It may include nucleic acids, sugars, lipids, etc. that are bound or complexed with peptides.
  • the sugar includes peptides, lipids, and the like that are combined or complexed with sugars that may be either monosaccharides, oligosaccharides, or polysaccharides, which may be natural or synthetic sugars. Also good.
  • the lipid may contain a nucleic acid, a peptide, a sugar, or the like bound or complexed with a lipid, which may be a natural or synthetic lipid.
  • the present invention provides fluorescence utilizing fluorescence resonance energy transfer, which comprises a compound of the present invention as a donor fluorescent molecule, a biological molecule selected from the group consisting of nucleic acids, peptides, sugars and lipids, and an acceptor fluorescent molecule. Provide an indicator.
  • FRET Fluorescence resonance energy transfer
  • the donor fluorescent molecule (the compound of the present invention), the biological molecule, and the acceptor fluorescent molecule are preferably covalently bonded at regular intervals in order to cause FRET.
  • the acceptor fluorescent molecule preferably has a fluorescent spectrum that overlaps with the fluorescent spectrum of the donor fluorescent molecule and has a dipole orientation substantially parallel to the dipole orientation of the donor fluorescent molecule.
  • acceptor fluorescent molecules include Acridine, AMCA, BO DIPY, ascade Blue, y2, Cy3, Cy5, Cy7, DabcyU Edans, Eosin, Erythrosin, Fluo rescein, 6-Fam, TET, Joe, HEX, LightCycler NBD, Oregon Green, Rhodamine t>, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Rhodol Green, TAMRA, ROX, Texas Red, NE D, VIC and the like.
  • the distance between the donor fluorescent molecule and the acceptor fluorescent molecule in the fluorescent indicator is usually preferably about 1 to: LOnm.
  • the fluorescently labeled molecule and fluorescent indicator of the present invention are preferably bound to a carrier in order to facilitate the detection of biological components and the like.
  • a carrier include sepharose, agarose, polyacrylic acid derivatives, polystyrene, and the like.
  • the force applied to the lens, stick, or flat plate is not limited to this.
  • the fluorescent labeling molecule and fluorescent indicator of the present invention may contain known additives and the like!
  • the additive include preservatives such as sodium azide, sodium benzoate, sodium hydrogen sulfite, methylparaben, propylparaben, diluents such as water, physiological saline, and buffer, methanol, ethanol, dimethyl Forces including organic solvents such as sulfoxide, dimethylformamide, glycerol and the like are not limited thereto.
  • the content of the fluorescent component contained in the fluorescently labeled molecule and the fluorescent indicator of the present invention can be appropriately set within a range in which a desired detection effect can be obtained, but is usually 0.01 to 100 wt. 0/0, preferably from 0.1 to 99.9 weight 0/0, more preferably from 0.5 to 99.5 by weight%.
  • the present invention provides a method for measuring trace components such as environmental substances or biological molecules, characterized by using the compound of the present invention as a fluorescent label.
  • trace components such as environmental substances or biological molecules
  • an antibody that specifically recognizes an environmental substance for the measurement of the environmental substance it can be performed according to the following method for measuring a biological molecule.
  • the present invention provides a method for measuring a biological molecule, characterized by using the fluorescently labeled molecule or the fluorescent indicator.
  • the method of measuring a biological molecule comprises a step of preparing a sample solution by mixing the fluorescently labeled molecule or fluorescent indicator and a sample containing a measurement target;
  • the sample including the measurement target may be any sample as long as the measurement target may exist in the sample.
  • the method of mixing the fluorescently labeled molecule or fluorescent indicator and the sample containing the measurement target may be performed under conditions that allow the reagent and the measurement target to be contacted in a solution suitable for the reagent to be used.
  • a solution suitable for the reagent to be used for example, it can be mixed in a solvent in which the reagent and the measurement target can be dissolved at a temperature of about 0 to 40 ° C. for a few minutes to a day.
  • a stationary means is also included.
  • the prepared sample solution is subjected to the following measurement process.
  • the fluorescence detection system can be any known detection system, and is not particularly limited.
  • the fluorescence detection system it is possible to qualitatively or quantitatively measure the intensity of the entire fluorescence signal, the change of the fluorescence signal over time, or the degree of fluorescence polarization.
  • the signal obtained by the measurement step is compared with the signal in the control sample, and in some cases, the signal is compared with the signal in the sample including the measurement target having a certain known concentration, and is included in the detection target sample. Can be detected qualitatively or quantitatively.
  • a detection reagent supported on a carrier it is preferable to use a detection reagent supported on a carrier from the viewpoint of ease of detection and sensitivity.
  • the present invention provides an intracellular molecular imaging method characterized by using the compound of the present invention as a fluorescent label. Such a method is carried out by adding a molecule labeled with the compound of the present invention to cells cultured in vitro or in vivo by a predetermined method and observing the behavior in the cell or in vivo under a fluorescence microscope. be able to.
  • Compound 6 colorless crystals.
  • Compound 7 colorless crystals.
  • Compound 8 colorless crystals.
  • Compound 9a colorless crystals.
  • Compound 9b colorless crystals.
  • diisopropylamine (251 ⁇ L, 1.79 mmol) and n-butyllithium hexane solution (1.50 M, 1.19 mL, 1.79 mmol) force.
  • butyl nitrite (429 ⁇ L, 3.58 mmol) was added and stirred at ⁇ 78 ° C. for 45 minutes.
  • a saturated aqueous solution of ammonium chloride was added to return to room temperature, and the reaction solution was extracted with ethyl acetate and washed with water and saturated brine. After drying, the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a crude oxime product.
  • the obtained crude oxime was used for the following reaction immediately after purification.
  • a solution of the crude oxime in benzene (2 mL) was heated to reflux for 15 minutes.
  • Thionyl chloride (65.3 ⁇ L, 0.895 mmol) was added dropwise, and the mixture was further refluxed for 1 hour. After returning to room temperature, water was added, the mixture was extracted with ethyl acetate, and washed with water and saturated brine.
  • Compound 10a Slightly yellow needles.
  • Compound 10b colorless crystals.
  • Example 6 Synthesis of Compound 11 Under a nitrogen stream, potassium carbonate (45.0 mg, 0.352 mmol) was added to an anhydrous methanol solution (6.0 mL) of compound 10b (85.0 mg, 0.296 mmol) at room temperature, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes. After adjusting the pH to 6 with a hydrogen chloride-methanol solution, N-methyl-1,2-phenylenediamine (67 L, 0.59 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 9 hours. Saturated aqueous sodium bicarbonate was added, and the methanol was distilled off under reduced pressure, followed by extraction with ethyl acetate.
  • Compound 11 colorless crystals.
  • Compound 12 White powder.
  • pH 12 sodium fluoride-hydrogen fluoride buffer solution (0.50 mL) was added to an anhydrous THF solution (1.0 mL) of compound 12 (14.0 mg, 0.0344 mmol) under ice cooling, and the mixture was stirred for 1.5 hours under the same conditions. Stir. After dilution with ether, the resulting precipitate was collected by centrifugation. The precipitate was washed with ether and dried under reduced pressure to obtain Compound 1 (6.0 mg, 60%).
  • Compound 1 Yellow powder.
  • Compound 2 Yellow powder.
  • Compound 14 slightly yellow powder. mp 64.0-66.0 ° C.
  • Compound 16 colorless oily substance.
  • diisopropylamine (1.68 mL, 12.0 mmol) and n-butyllithium hexane solution (1.54 M, 7.8 mL, 12.0 mmol) force.
  • a solution of compound 16 (2.02 g, 4.80 mmol) in anhydrous THF (17 mL) was added dropwise, and the mixture was stirred for 1 hour under the same conditions.
  • Butyl nitrite (2.88 mL, 24.0 mmol) was added, and the mixture was stirred for 2 hours while cooling at _78 ° C.
  • a saturated aqueous ammonium chloride solution was added and the temperature was returned to room temperature, and then the reaction mixture was extracted with ethyl acetate and washed with water and saturated brine. After drying over anhydrous sodium sulfate, the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a crude oxime. The crude oxime was immediately used in the following reaction without purification.
  • Compound 17 Yellow oily substance.
  • Compound 3 Yellow powder.
  • Compound 4 Yellow powder.
  • Test Example 1 Evaluation of fluorescence characteristics (1)
  • the fluorescence spectrum was measured at room temperature in a quartz cell (10 ⁇ 10 mm) using a fluorescence spectrophotometer RF-5300PC (manufactured by Shimadzu Corporation). For measurement, first measure the absorption spectrum, determine the excitation wavelength from the maximum absorption, and measure the fluorescence spectrum based on the obtained excitation wavelength.
  • the compound of the present invention exhibits a large value, particularly in water, with a large stochastic shift.
  • Test Example 2 Evaluation of fluorescence characteristics
  • Test Example 3 Evaluation of fluorescence characteristics (3)
  • the present invention is a fluorescent substance capable of detecting a very small amount of a biological component or environmental substance with high sensitivity, such as a fluorescently labeled molecule, a fluorescent indicator, a method for measuring an environmental substance or a biological molecule, an intracellular molecular imaging method, etc. Useful as.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

　本発明は、微量な生体成分や環境物質などを高感度に検出することが可能な蛍光物質及びその用途を提供することを目的とする。具体的には、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（Ｉ－１）又は（ＩＩ－１）で表される化合物。   [式中の各記号は、明細書中と同義を示す。]

Description

ベンズイミダゾール系骨格を有する新規蛍光物質及びその用途
技術分野
[0001] 本発明は、ベンズイミダゾール系骨格を有する新規蛍光物質及びその用途に関す る。
背景技術
[0002] 蛍光分析によって微量な生体成分や環境物質などを高感度に検出するためには、 高い蛍光量子収率を持ち、かつ励起光やラマン散乱などのバックグラウンドが無視で きるほどの大きなスト一タスシフトを有する蛍光物質の利用が望ましい。現在、 Fluores ceinや BODIPY、 Cy3など、数多くの蛍光物質が実用化されている力 スト一タスシフト と蛍光量子収率の両方の特性を満足できるものは得られて ヽな ヽ。
[0003] [化 1]
Figure imgf000003_0001
[0004] 高い蛍光量子収率と大きなスト一タスシフトを併せもつ蛍光物質としては、例えば、 Heptamethine cyanine dyeが知られている（非特許文献 1)。生体成分などの検出は、 現在放射性同位体標識に代わって、蛍光標識が主流となってきており、さらなる高感 度と優れた特性を併せもつ蛍光物質の開発が望まれている。
非特許文献 1 :J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 4170-4171
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、微量な生体成分や環境物質などを高感度に検出することが可能な蛍光 物質及びその用途を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段 [0006] 本発明者らは、 2, 2' ビスべンズイミダゾール骨格を有する化合物の構造変化や 水素結合に着目して鋭意検討した結果、下記構造を有する化合物が大きなストーク スシフトを示す蛍光を発することを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、 本発明は、以下の通りである。
〔1〕一般式 (1)、 （11)、 （I 1)又は (II 1)で表される化合物。
[0007] [化 2]
Figure imgf000004_0001
(I) (II)
Figure imgf000004_0002
(1-1 ) (11-1 )
[0008] [式中、
環 Aは、ハロゲン原子、 C アルキル基、 C アルケニル基、 C アルキニル基、 C
1-6 2-6 2-6
ァリール基、 c ァラルキル基、 C アルコキシ基、ァシルォキシ基、シァノ基、
6-14 7-16 1-6
ニトロ基、カルボキシル基、 C アルコキシ カルボニル基、 C ァリールォキシ
1 -6 6-14
カルボニル基、 C ァラルキルォキシ カルボニル基、力ルバモイル基及び置換力
7-16
ルバモイル基力 選ばれる置換基でそれぞれ置換されて 、てもよ 、、ァリール環又 は芳香族複素環であり；
R1は、 C アルキル基、 C ァルケ-ル基、 C アルキ-ル基、ァラルキル基又は
1-6 2-6 2-6
リンカ一であり；
R2及び R3は、同一又は異なってそれぞれ、ハロゲン原子、水酸基、 C アルコキシ
1-6
基、ァシルォキシ基、アミノ基、力ルバモイル基、置換力ルバモイル基、カルボキシル 基、 C アルコキシ カルボ-ル基、 C ァリールォキシ カルボ-ル基及び C
1—6 6— 14 7—1 ァラルキルォキシ—カルボ-ル基カゝら選ばれる置換基でそれぞれ置換されていても
6
よ！/、、 C アルキル基、 C アルケニル基、 C アルキニル基又は C ァラルキル
1—6 2-6 2-6 7-16 基であるか、或いは R2及び R3が結合して、 5〜9員の環を形成してもよく；
R4は、ハロゲン原子、 C アルキル基、 C ァルケ-ル基、 C アルキ-ル基、 C
1 -6 2-6 2-6 6- ァリール基、 c ァラルキル基、 C アルコキシ基、ァシルォキシ基、シァノ基、二
14 7- 16 1 -6
トロ基、カルボキシル基、 c アルコキシ カルボ-ル基、 C ァリールォキシ一力
1 -6 6- 14
ルボニル基、 C ァラルキルォキシ カルボ-ル基、力ルバモイル基又は置換カル
7- 16
バモイル基であり；
1は、 0又は 1〜3の整数であり；
R5は、 C アルキル基、 C アルキル カルボ-ル基、置換べンジル基、置換シリ
1 -6 1 -6
ル基、ホスホノォキシ基又は置換ホスホノォキシ基であり；
ΒΊま、対ァ-オンである。 ]
〔2〕環 Aが、 C アルコキシ基、ァシルォキシ基、シァノ基及び-トロ基から選ばれる
1 -6
置換基でそれぞれ置換されていてもよい、ァリール環又は芳香族複素環であり；
R1が、 C アルキル基又はリンカ一であり；
1 -6
R2及び R3が、同一又は異なってそれぞれ、 C アルコキシ基、ァシルォキシ基及び
1 -6
ァミノ基から選ばれる置換基でそれぞれ置換されて 、てもよ 、、 C アルキル基又は
1 -6
ァラルキル基であるカゝ、或いは R2及び R3が結合して、 5〜6員の環を形成してもよく； R4が、 C アルキル基又は C アルコキシ基であり；
1 -6 1 -6
1が、 0又は 1であり；
R5が、 C アルキル カルボ-ル基、ホスホノォキシ基又は置換ホスホノォキシ基で
1 -6
あり；
B一が、トリフルォロメタンスルホン酸イオン又は塩素イオンである、上記〔1〕に記載の 化合物。
〔3〕上記〔1〕又は〔2〕に記載の化合物と、核酸、ペプチド、糖及び脂質からなる群より 選ばれる生体由来分子とを含む、蛍光標識分子。
〔4〕ドナー蛍光分子として上記〔1〕又は〔2〕に記載の化合物と、核酸、ペプチド、糖 及び脂質からなる群より選ばれる生体由来分子と、ァクセプター蛍光分子とを含む、 蛍光共鳴エネルギートランスファーを利用する蛍光指示薬。
〔5〕担体に結合されている、上記〔3〕に記載の蛍光標識分子。 〔6〕担体に結合されている、上記〔4〕に記載の蛍光指示薬。
〔7〕上記〔1〕又は〔2〕に記載の化合物を蛍光標識として使用することを特徴とする、 環境物質又は生体由来分子の測定方法。
〔8〕上記〔1〕又は〔2〕に記載の化合物を蛍光標識として使用することを特徴とする、 細胞内分子イメージング方法。
〔9〕上記〔3〕に記載の蛍光標識分子を使用することを特徴とする、生体由来分子の 測定方法。
〔10〕上記〔4〕に記載の蛍光指示薬を使用することを特徴とする、生体由来分子の測 定方法。
発明の効果
[0009] 本発明の化合物は、蛍光分析に用いた場合、励起光やラマン散乱などのバックグ ラウンドが無視できるほどの大きなスト一タスシフトを有するものであり、微量な生体成 分や環境物質などを高感度に検出することができる。本発明の蛍光標識分子又は蛍 光指示薬は、検出対象に特異的に作用する生体由来分子を選択することにより、高 感度かつ特異的に微量成分を検出することができる。本発明の環境物質もしくは生 体由来分子の測定方法又は分子イメージング方法は、本発明の化合物を蛍光物質 として利用するものであることから、高感度かつ特異的な測定環境を提供することが できる。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本明細書において使用する各基及び各記号の定義は次の通りである。
[0011] 「ハロゲン原子」としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子が挙げ られる。
「C アルキル基」としては、例えば、メチル、ェチル、 n—プロピル、イソプロピル、
1- 6
n—ブチノレ、イソブチル、 sec ブチル、 tert—ブチノレ、ペンチノレ、へキシルなどの直 鎖又は分枝鎖の C アルキル基が挙げられる。
1-6
「C ァルケ-ル基」としては、例えば、ビュル、 1—プロべ-ル、 2—プロべ-ル、 1
2- 6
ーブテュル、 2 ブテュル、 3 ブテュル、 1 ペンテ-ル、 1一へキセニルなどの直 鎖又は分枝鎖の C ァルケ-ル基が挙げられる。 「C アルキ-ル基」としては、例えば、ェチュル、 1 プロビュル、 2—プロビュル、
2-6
1ーブチニル、 2 ブチニル、 3 ブチニル、 1 ペンチニル、 1一へキシニルなどの 直鎖又は分枝鎖の C アルキニル基が挙げられる。
2-6
[0012] 「c ァリール基」としては、例えば、フエニル、ナフチルなどが挙げられる。
6- 14
「C ァラルキル基」としては、例えば、ベンジル、 1 フエ-ルェチル、 2—フエ-
7- 16
ルェチルなどが挙げられる。
[0013] 「C アルコキシ基」としては、例えば、メトキシ、エトキシ、 n—プロポキシ、イソプロ
1-6
ポキシ、 n ブトキシ、イソブトキシ、 sec ブトキシ、 tert ブトキシ、ペンチノレォキシ 、 へキシルォキシなどの直鎖又は分枝鎖の C アルコキシ基が挙げられる。
1-6
「c アルキル カルボニル基」としては、例えば、ァセチル、プロピオニル、ブチリ
1-6
ル、ビバロイルなどの直鎖又は分枝鎖の C アルキル カルボニル基が挙げられる
-6
[0014] 「c アルコキシ カルボニル基」としては、例えば、メトキシカルボニル、エトキシ
1-6
カルボニルなどの直鎖又は分枝鎖の c アルコキシ カルボニル基が挙げられる。
1 -6
「c ァリールォキシ カルボニル基」としては、例えば、フエノキシカルボニル、
6- 14
ナフトキシカルボニルなどが挙げられる。
「c ァラルキルォキシ カルボニル基」としては、例えば、ベンジルォキシカルボ
7- 16
-ルなどが挙げられる。
[0015] 「置換力ルバモイル基」としては、例えば、メチルカルバモイル、ェチルカルバモイ ル、ジメチルカルバモイルなどのモノー又はジー C アルキル力ルバモイル基；フエ
1-6
二ルカルバモイル、ジフエ二ルカルバモイルなどのモノー又はジー C ァリール力
6-14
ルバモイル基；ベンジルカルバモイルなどのモノ一又はジ C ァラルキル力ルバ
7- 16
モイル基が挙げられる。
[0016] 「ァシルォキシ基」としては、例えば、ァセチルォキシ、プロピオニルォキシ、ブチリ ルォキシ、ビバロイルォキシなどの直鎖又は分枝鎖の C アルキル カルボ-ルォ
1-6
キシ基；フエ-ルカルポ-ルォキシ、ナフチルカルボ-ルォキシなどの C ァリール
6-14 カルボ-ルォキシ基；ベンジルカルボ-ルォキシなどの c ァラルキル カルボ
7- 16
-ルォキシ基が挙げられる。 [0017] 環 Aは、ハロゲン原子、 C アルキル基、 C アルケニル基、 C アルキニル基、
1-6 2-6 2-6
C ァリール基、 C ァラルキル基、 C アルコキシ基、ァシルォキシ基、シァノ
6-14 7-16 1-6
基、ニトロ基、カルボキシル基、 C アルコキシ カルボ-ル基、 c ァリールォキ
1-6 6- 14
シ カルボ-ル基、 C ァラルキルォキシ カルボ-ル基、力ルバモイル基及び置
7- 16
換カルバモイル基力 選ばれる置換基でそれぞれ置換されて 、てもよ 、、ァリール環 又は芳香族複素環である。
[0018] 「ァリール環」としては、例えば、ベンゼン、ナフタレンなどの C ァリール環が挙げ
6-14
られる。
「芳香族複素環」としては、例えば、炭素原子以外に、窒素原子、酸素原子及び硫 黄原子より選ばれるヘテロ原子を 1〜4個有する 5〜7員の単環式芳香族複素環及 び縮合芳香族複素環が挙げられる。縮合芳香族複素環としては、例えば、 5〜7員の 単環式芳香族複素環同士の縮合環や、 5〜7員の単環式芳香族複素環とベンゼン 環との縮合環が挙げられる。
「5〜7員の単環式芳香族複素環」としては、例えば、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン 、ピラジン、フラン、チォフェン、ピロール、ォキサゾール、イソキサゾール、チアゾー ル、イソチアゾール、イミダゾール、ピラゾール、トロボロンなどが挙げられる。
「縮合芳香族複素環」としては、例えば、キノリン、イソキノリン、インドールなどが挙 げられる。
[0019] 環 Aで示される「ァリール環」又は「芳香族複素環」が有して!/ヽてもよ ヽ置換基の数 は特に限定されない。置換基が 2個以上の場合、置換基はそれぞれ同一又は異なつ ていてもよい。また、無置換のァリール環又は芳香族複素環も好ましい。
[0020] 環 Aは、好ましくは、 C アルコキシ基及びァシルォキシ基力も選ばれる置換基で
1-6
それぞれ置換されていてもよい、ァリール環又は芳香族複素環であり、より好ましくは 、ァリール環である。
[0021] R1は、 C アルキル基、 C ァルケ-ル基、 C アルキ-ル基、 C ァラルキル
1—6 2— 6 2— 6 7— 16 基又はリンカ一である。
「リンカ一」としては、本発明の化合物を標識として、核酸配列、アミノ酸配列、糖鎖 配列などの結合対象と結合させるように作用する部分であり、結合対象により適宜選 択することができるが、例えば、 C 炭化水素基、ポリエチレンジォキシ基などが挙
1 - 10
げられる。
また、リンカ一は、結合対象との結合に供するために、末端にアミノ基、カルボキシ ル基、水酸基、メルカプト基を有していてもよい。
[0022] 「C 炭化水素基」としては、例えば、 C アルキル基、 C アルケニル基、 C
1 - 10 1 - 10 2- 10 2- アルキニル基などが挙げられる。
10
「C アルキル基」としては、例えば、メチル、ェチル、 n—プロピル、イソプロピル、
1 - 10
n ブチノレ、イソブチノレ、 sec ブチノレ、 tert ブチノレ、ペンチノレ、へキシノレ、へプチ ル、ォクチル、ノニル、デシルなどの直鎖又は分枝鎖の C アルキル基が挙げられ
1 - 10
る。
「C ァルケ-ル基」としては、例えば、ビュル、 1—プロべ-ル、 2—プロべ-ル、
2- 10
1ーブテュル、 2 ブテュル、 3 ブテュル、 1 ペンテ-ル、 1一へキセニルなどの 直鎖又は分枝鎖の C アルケニル基が挙げられる。
2- 10
「C アルキ-ル基」としては、例えば、ェチュル、 1—プロビュル、 2—プロピ-ル
2- 10
、 1ーブチュル、 2 ブチュル、 3 ブチュル、 1 ペンチ-ル、 1一へキシュルなどの 直鎖又は分枝鎖の C アルキニル基が挙げられる。
2- 10
「ポリエチレンジォキシ基」としては、 1〜5個のエチレンォキシ基力 なるポリェチレ ンジォキシ基が挙げられる。
[0023] R1は、好ましくは、 C アルキル基又はリンカ一であり、より好ましくは、 C アルキ
1 -6 1 -6 ル基である。
[0024] R2及び R3は、同一又は異なってそれぞれ、ハロゲン原子、水酸基、 C アルコキ
1 - 6 シ基、ァシルォキシ基、アミノ基、力ルバモイル基、置換力ルバモイル基、カルボキシ ル基、 C アルコキシ カルボ-ル基、 C ァリールォキシ カルボ-ル基及び C
1 -6 6- 14 7 ァラルキルォキシ—カルボニル基カゝら選ばれる置換基でそれぞれ置換されてい
- 16
てもよい、 C アルキル基、 C アルケニル基、 C アルキニル基又は C ァラル
1 -6 2-6 2-6 7- 16 キル基である力、或いは R2及び R3が結合して、 5〜9員の環を形成してもよい。
[0025] ここで、 R2及び R3が結合して形成する 5〜9員の環としては、例えば、
[0026] [化 3] N
N N N N N
N N- — N N
- NvN \ _ /
、
Figure imgf000010_0001
[0027] などが挙げられる。
[0028] R2及び R3は、好ましくは、それぞれ同一又は異なって、ハロゲン原子、水酸基、 ^ アルコキシ基、ァシルォキシ基、アミノ基、力ルバモイル基、置換力ルバモイル基、
-6
カルボキシル基、 C アルコキシ カルボニル基、 C ァリールォキシ カルボ二
1-6 6-14
ル基及び c ァラルキルォキシ—カルボニル基カゝら選ばれる置換基でそれぞれ置
7-16
換されて!/、てもよ!/、、 C アルキル基、 C アルケニル基、 C アルキニル基又は C
2-6 2-6
ァラルキル基であるカゝ、或いは R2及び R3が結合して、 5〜9員の環を形成しても
7-16
よい。
[0029] R2及び R3は、より好ましくは、それぞれ C アルキル基である力、或いは R2及び R3
1-6
が結合して、 5〜6員の環を形成してもよい。
[0030] R4は、ハロゲン原子、 C アルキル基、 C アルケニル基、 C アルキニル基、 C
1-6 2-6 2-6 6 ァリール基、 c ァラルキル基、 C アルコキシ基、ァシルォキシ基、シァノ基、
- 14 7-16 1-6
ニトロ基、カルボキシル基、 C アルコキシ カルボ-ル基、 リールォキシ
1 -6 c ァ
6-14
カルボ-ル基、 C ァラルキルォキシ カルボ-ル基、力ルバモイル基又は置換力
7-16
ルバモイル基であり、 1は、 0又は 1〜3の整数である。
1が 2以上である場合、 R4はそれぞれ同一又は異なって 、てもよ!/、。
[0031] R4は、好ましくは、 C アルキル基又は C アルコキシ基であり、より好ましくは、 C
1-6 1-6
アルキル基である。
1 -6
1は、好ましくは、 0又は 1であり、より好ましくは、 0である。
[0032] また、化合物（1)、（Π)、（I 1)又は (Π— 1)において、 0—又は OR5の置換位 置は特に限定されないが、以下の一般式 (Γ)、 (Π，）、 (Γ 1)又は (Π'— 1) :
[0033] [化 4]
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000011_0002
[0034] [式中、各記号は上記と同義である。 ]
で表される位置で置換されて 、ることが好まし 、。
[0035] R5は、 C アルキル基、 C アルキル カルボ-ル基、置換べンジル基、置換シリ
1 -6 1 -6
ル基、ホスホノォキシ基又は置換ホスホノォキシ基である。
[0036] 「置換べンジル基」としては、例えば、 C アルコキシ、ニトロなどで置換されたベン
1 -6
ジル基が挙げられる。
「置換シリル基」としては、例えば、トリメチルシリル、トリェチルシリル、 tert—ブチル ジメチルシリルなどが挙げられる。
「置換ホスホノォキシ基」としては、例えば、ジメチルホスホノォキシ、ジェチルホスホ ノォキシなどが挙げられる。
[0037] R5は、好ましくは、 C アルキル カルボ-ル基、置換シリル基、ホスホノォキシ基
1 -6
、置換ホスホノォキシ基であり、より好ましくは、 C アルキル カルボ-ル基、ホスホ
1 -6
ノォキシ基、置換ホスホノォキシ基である。
[0038] ΒΊま、対ァニオンである。
「対ァ-オン」としては、例えば、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオンなどのハロゲ ンイオン;硫酸イオン、硝酸イオン、過塩素酸イオン、リン酸イオンなどの無機酸ィォ ン；メタンスルホン酸イオン、トリフルォロメタンスルホン酸イオン、 p トルエンスルホン 酸イオン、ベンゼンスノレホン酸イオンなどの有機酸イオン；などが挙げられる。
ΒΊま、好ましくは、トリフルォロメタンスルホン酸イオン、塩素イオン、臭素イオン、ョ ゥ素イオンであり、より好ましくは、トリフルォロメタンスルホン酸イオン、塩素イオンで ある。
[0039] 化合物 (1)、（11)、（I 1)又は (II 1)としては、
環 Aが、 C アルコキシ基、ァシルォキシ基、シァノ基及び-トロ基力 選ばれる置
1 - 6
換基でそれぞれ置換されていてもよい、ァリール環又は芳香族複素環であり；
R1が、 C アルキル基又はリンカ一であり；
1 -6
R2及び R3が、同一又は異なってそれぞれ、 C アルコキシ基、ァシルォキシ基及び
1 -6
ァミノ基から選ばれる置換基でそれぞれ置換されて 、てもよ 、、 C アルキル基又は
1 -6
ァラルキル基であるカゝ、或いは R2及び R3が結合して、 5〜6員の環を形成してもよく； R4が、 C アルキル基又は C アルコキシ基であり；
1 -6 1 -6
1が、 0又は 1であり；
R5が、 C アルキル カルボ-ル基、ホスホノォキシ基又は置換ホスホノォキシ基で
1 -6
あり；
B_が、トリフルォロメタンスルホン酸イオン又は塩素イオンである；
化合物が好ましい。
[0040] このうち、一般式 (Γ，）又は (Π，，）：
[0041] [化 5]
Figure imgf000012_0001
[0042] [式中、
R1が、 C アルキル基であり、
1 -6
R2及び R3が、それぞれ C アルキル基である力、或いは R2及び R3が結合して、 6員
1 -6
の環を形成してもよ ヽ。 ]
で表される化合物がより好まし 、。
[0043] 以下、本発明の化合物の製造方法について説明するが、本発明の化合物の製造 方法はこれらに限定されるものではない。
以下の各工程で得られる生成物は、結晶化、再結晶、カラムクロマトグラフィー、再 沈殿などの常法により精製することができる。また、以下の式中の化合物が市販され て 、る場合には市販品を用いることができる。
[0044] 本発明の化合物 (I)及び (Π)は、以下に示す A法により製造することができる。
[0045] [化 6]
A法
Figure imgf000014_0001
工程 工程 2 工程 3
(V) (VI)
>
工程 4 工程 5
Figure imgf000014_0002
(VIII) (IX) (X)
Figure imgf000014_0003
(XI)
R1~X
工程
(XXV)
Figure imgf000014_0004
(XII) (XIII)
工程 8 工程 8
Figure imgf000014_0005
[0046] [式中、 P1及び P2は、それぞれ水酸基の保護基であり、 Xは、脱離基であり、その他 の記号は、上記と同義である。 ]
[0047] P1又は P2で示される「水酸基の保護基」としては、例えば、ァセチル、プロピオ-ル などの c アルキル カルボ-ル基；ベンゾィルなどの c ァリール カルボ-ル
1-6 6- 14
基；トリメチルシリル、トリェチルシリル、 tert—ブチルジメチルシリルなどのシリル基； ベンジル、 p—メトキシベンジル、 p 二トロべンジルなどの置換されていてもよい C _ ァラルキル基などが挙げられる。
6
[0048] Xで示される「脱離基」としては、例えば、塩素、臭素、ヨウ素などのハロゲン原子;メ タンスルホ-ルォキシ基、トリフルォロメタンスルホ-ルォキシ基などのハロゲン化さ れて 、てもよ 、C アルキルースルホ -ルォキシ基；トルエンスルホ-ルォキシ基、
1-6
ベンゼンスルホ-ルォキシ基などの置換されて 、てもよ 、c ァリールスルホ-ル
6-14
ォキシ基などが挙げられる。
[0049] P1としては、好ましくは、ァセチル、プロピオ-ルなどの C アルキル カルボ-ル
1-6
基である。
P2としては、好ましくは、トリメチルシリル、トリェチルシリル、 tert—ブチルジメチルシ リルなどのシリル基である。
[0050] 以下、 A法の各工程につき、詳細に説明する。
[0051] 工程 1
工程 1は、化合物 (V)を還元して、化合物 (VI)を得る工程である。
原料の化合物 (V)は、公知化合物であるか、又は自体公知の方法 (例えば、 Han, G.; Shin, K. J.; Kim, D. C; Yoo, K. H.; Kim, D. J.; Park, S. W. Heterocycles, 1996 , 43, 2496.及び Panteleon, V.; Marakos, P.; Pouli, N.; Mikros, M.; Andreadou, I. C hem. Pharm. Bull. 2003, 51, 522.に記載の方法）に従って製造することができる。 本工程は、例えば、接触還元する方法;鉄、亜鉛、スズなどの還元剤で還元する方 法などにより行うことができ、好ましくは、接触還元による方法である。
接触還元反応は、溶媒中、触媒の存在下、水素ガスを使用して常圧下で行われる 反応に使用する触媒としては、ノラジウム 炭素、ラネーニッケル、酸化白金などが 挙げられ、好ましくは、パラジウム—炭素である。触媒の使用量は、化合物 (V)に対し て、 10〜100重量％、好ましくは 50〜70重量％である。
反応に使用する溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノールなどのアルコ ール類；酢酸ェチルなどのエステル類；酢酸などが挙げられ、好ましくは、メタノール 、エタノールなどのアルコール類である。
反応時間は、通常、 12〜60時間、好ましくは、 36〜48時間である。
反応温度は、通常、 10°C〜30°C、好ましくは、 15°C〜25°Cである。
本工程で得られた化合物 (VI)は、再結晶、カラムクロマトグラフィーなどの常法によ り精製することができるが、精製することなく次の反応に使用することもできる。
[0052] 工程 2
工程 2は、化合物 (VI)を脱水することにより、化合物 (VII)を得る工程である。 本工程は、例えば、溶媒中、酸存在下で脱水する方法により行うことができる。 反応に使用する酸としては、 p トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、硫酸な どが挙げられる。酸の使用量は、化合物 (VI) 1モルに対して、 1〜5モル、好ましくは
1〜1. 5モノレである。
反応に使用する溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノールなどのアルコ ール類;ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素類;又はこれらの混合溶 媒などが挙げられ、好ましくは、メタノール、エタノールなどのアルコール類とベンゼン 、トルエンなどの芳香族炭化水素類の混合溶媒である。
反応時間は、通常、 6〜48時間、好ましくは 10〜24時間である。
反応温度は、通常、 100°C〜200°C、好ましくは 100°C〜150°Cである。 また、 Dean-Stark蒸留器を用いて、生成する水を除去することにより、反応を促進 することちでさる。
[0053] 工程 3
工程 3は、化合物 (VII)を脱保護し、所望の保護基を導入して化合物 (VIII)を得る 工程であり、 P1と P2が異なる場合、必要に応じて行われる。
脱保護反応及び保護反応は、保護基の種類によって異なるが、自体公知の方法（ 例 ば、 Protective uroups in Organic Syntnesis (Theodora W. ureene着、 1981年 、 A Wiley- Interscience Publication発行)に記載の方法）により行うことができる。
[0054] 例えば、 P1が、 C アルキル カルボ-ル基である場合、化合物（VII)を溶媒中、
1 -6
塩基存在下反応させることにより、対応するアルコール体が得られる。 反応に使用する溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノールなどのアルコ ール類;テトラヒドロフランなどのエーテル類;水；又はこれらの混合溶媒などが挙げら れる。
反応に使用する塩基としては、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、 炭酸水素カリウムなどが挙げられる。塩基の使用量は、化合物 (VII) 1モルに対して、 5〜50モル、好ましくは 10〜20モルである。
反応時間は、通常、 0.5〜5時間、好ましくは 2〜4時間である。
反応温度は、通常、 10°C〜30°C、好ましくは 15°C〜25°Cである。
[0055] P2が、シリル基である場合、上記で得られたアルコール体を、溶媒中、塩基存在下 、対応するシリルノヽライドと反応させることにより、化合物 (VIII)を得ることができる。 反応に使用する塩基としては、トリェチルァミン、イミダゾール、ジイソプロピルェチ ルァミン、ピリジンなどの有機ァミンなどが挙げられる。塩基の使用量は、アルコール 体又は化合物（VII) 1モルに対して、 1〜10モル、好ましくは 2〜5モルである。
シリルハライドの使用量は、アルコール体又は化合物（VII) 1モルに対して、 1〜10 モル、好ましくは 1.2〜3モルである。
反応に使用する溶媒としては、 N, N—ジメチルホルムアミド、 N, N—ジメチルァセ トアミドなどのアミド類；ジクロロメタンなどの含ハロゲン炭化水素類；テトラヒドロフラン などのエーテル類;又はこれらの混合溶媒などが挙げられる。
反応時間は、通常、 3〜48時間、好ましくは 5〜24時間である。
反応温度は、通常、 10°C〜30°C、好ましくは 15°C〜25°Cである。
[0056] 工程 4
工程 4は、化合物 (VIII)を、塩基存在下、化合物 (ΧΧΠΙ)と反応させることにより、 化合物 (IX)を得る工程である。
反応に使用する塩基としては、水素化ナトリウム、水素化カリウムなどの水素化アル カリ金属；リチウムジイソプロピルアミド、ナトリウムアミド、リチウムへキサメチルジシラジ ドなどの金属アミド;カリウム tert—ブトキシドなどの金属アルコキシド類などが挙げら れ、好ましくは、水素化ナトリウムである。塩基の使用量は、化合物 (VIII) 1モルに対 して、 1〜3モル、好ましくは 1.1〜1.6モルである。 化合物（XXIII)の使用量は、化合物（VIII) 1モルに対して、 1.0〜1.3モル、好まし くは 1.0〜： L1モルである。
反応に使用する溶媒としては、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、 1, 4 ジォキ サンなどのエーテル類; N, N ジメチルホルムアミドなどのアミド類；又はこれらの混 合溶媒などが挙げられ、好ましくは、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、 1, 4ージ ォキサンなどのエーテル類である。
反応時間は、通常、 1〜5時間、好ましくは 1〜3時間である。
反応温度は、通常、 0°C〜30°C、好ましくは 15°C〜25°Cである。
[0057] 工程 5
工程 5は、化合物 (IX)を、塩基存在下、亜硝酸エステルと反応させることにより、ォ キシム体を得て、ついで当該ォキシム体を、酸存在下で脱水することにより、化合物（ X)を得る工程である。
[0058] まず、ォキシム体を得る反応について説明する。
反応に使用する塩基としては、水素化ナトリウム、水素化カリウムなどの水素化アル カリ金属；リチウムジイソプロピルアミド、ナトリウムアミド、リチウムへキサメチルジシラジ ドなどの金属アミド;カリウム tert ブトキシドなどの金属アルコキシド類などが挙げら れ、好ましくは、リチウムジイソプロピルアミドである。塩基の使用量は、化合物 (IX) 1 モルに対して、 2〜3モル、好まし <は 2.2〜2.6モルである。
反応に使用する亜硝酸エステルとしては、亜硝酸ェチル、亜硝酸イソプロピル、亜 硝酸ブチルなどが挙げられる。亜硝酸エステルの使用量は、化合物（IX) 1モルに対 して、 2〜10モル、好ましくは 3〜5モルである。
反応に使用する溶媒としては、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、 1, 4 ジォキ サンなどのエーテル類;又はこれらの混合溶媒などが挙げられ、好ましくは、ジェチ ルエーテル、テトラヒドロフラン、 1, 4 ジォキサンなどのエーテル類である。
反応時間は、通常、 0.2〜5時間、好ましくは 0.5〜2.5時間である。
反応温度は、通常、 100°C〜0°C、好ましくは 80°C〜一 50°Cである。 本反応で得られたォキシム体は、再結晶、カラムクロマトグラフィーなどの常法により 精製することができるが、精製することなく次の反応に使用することもできる。 [0059] ォキシム体を脱水する反応で使用する溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレン などの芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、ジクロロェタンなどの含ハロゲン炭化水素 類;又はこれらの混合溶媒などが挙げられ、好ましくは、ベンゼン、トルエン、キシレン などの芳香族炭化水素類である。
ォキシム体を脱水する反応で使用する酸としては、塩ィ匕チォニル、ォキシ塩化リン などが挙げられ、好ましくは、塩ィ匕チォ-ルである。酸の使用量は、ォキシム体又は 化合物（IX) 1モルに対して、 1〜3モル、好ましくは 1.1〜 1.3モルである。
反応時間は、通常、 0.5〜3時間、好ましくは 1〜2時間である。
反応温度は、通常、 60°C〜120°C、好ましくは 70°C〜100°Cである。
[0060] 工程 6
工程 6は、化合物 (X)を化合物 (XXIV)と反応させることにより、化合物 (XI)を得る 工程である。
本反応は、炭酸カリウム、炭酸ナトリウムなどの塩基、及び塩ィ匕水素—メタノールな どの酸を使用して、適切な pH (例えば、 pH = 6)に調整して行うことが好ましい。 化合物（XXIV)の使用量は、化合物（X) 1モルに対して、 1〜3モル、好ましくは 1. 1〜 2モルである。
反応に使用する溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノールなどのアルコ ール類；又はこれらの混合溶媒などが挙げられる。
反応時間は、通常、 5〜24時間、好ましくは 6〜12時間である。
反応温度は、通常、 10°C〜30°C、好ましくは 15°C〜25°Cである。
[0061] 工程 7
工程 7は、化合物 (XI)を、溶媒中、化合物 (XXV)と反応させることにより、化合物（ XII)又は化合物 (ΧΠΙ)を得る工程である。
化合物（XXV)の使用量は、化合物（XI) 1モルに対して、 1〜1.5モル、好ましくは 1〜 1.2モルである。
反応に使用する溶媒としては、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、 1, 4—ジォキ サンなどのエーテル類；ジクロロメタン、ジクロロェタンなどの含ハロゲン炭化水素類； 又はこれらの混合溶媒などが挙げられ、好ましくは、ジクロロメタン、ジクロロエタンな どの含ハロゲン炭化水素類である。
[0062] Xがトリフルォロメタンスルホ-ルォキシである化合物（XXV)を使用した場合、化合 物（XXV)の使用量は、化合物（XI) 1モルに対して、 1〜1.5モル、好ましくは 1〜1.2 モルである。
反応に使用する溶媒としては、ジクロロメタン、クロ口ホルム、 1, 2—ジクロロェタンな どのハロゲン化炭化水素類；ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、 1, 4-ジォキサン などのエーテル類;又はこれらの混合溶媒などが挙げられ、好ましくは、ジクロロメタン 、クロ口ホルム、 1, 2—ジクロロェタンなどのハロゲン化炭化水素類である。
反応時間は、通常、 1〜： LO時間、好ましくは 3〜7時間である。
反応温度は、通常、 78°C〜10°C、好ましくは 20°C〜0°Cである。
[0063] 本工程で得られる生成物は、 R1が導入されるイミダゾール環が 2つあるため、化合 物 (ΧΠ)と化合物 (ΧΙΠ)との混合物となる。これら位置異性体は、再結晶、カラムクロ マトグラフィーなどの常法により分離することができる。
[0064] 工程 8
工程 8は、化合物 (ΧΠ)又は化合物 (ΧΙΠ)を脱保護することにより、化合物 (I)又は 化合物 (II)をそれぞれ得る工程である。
脱保護反応は、保護基の種類によって異なるが、自体公知の方法 (例えば、 "Prote ctive Groups in Organic synthesis (Theodora W. ureene着、 1981年、 A Wiley— Inte rscience Publication発行)に記載の方法）により行うことができる。
例えば、 P2が、シリル基である場合、化合物 (ΧΠ)又は化合物 (ΧΠΙ)を、溶媒中、フ ッ化物イオンで処理することにより、脱保護を行うことができる。
反応に使用するフッ化物イオンとしては、フッ化ナトリウム—フッ化水素緩衝液、テト ラブチルアンモ -ゥムフルオリドなどが挙げられる。フッ化物イオンの使用量は、化合 物（ΧΠ)又は化合物（ΧΠΙ) 1モルに対して、 5〜50モル、好ましくは 10〜 15モルであ る。
反応に使用する溶媒としては、テトラヒドロフラン、 1, 4 ジォキサンなどのエーテル 類;メタノール、エタノールなどアルコール類;水；又はこれらの混合溶媒などが挙げら れ、好ましくはテトラヒドロフラン、 1, 4 ジォキサンなどのエーテル類である。 反応時間は、通常、 0.5〜5時間、好ましくは 1〜3時間である。
反応温度は、通常、 5°C〜10°C、好ましくは 0°C〜5°Cである。
[0065] R2及び R3が結合して環を形成して 、る化合物 (ΠΙ)及び (IV)は、以下に示す B法 により製造することができる。
[0066] [化 7]
B法
り
(XVIII)
(XXVII)
工程 14
Figure imgf000022_0001
R1-X
(XXV) 工程 16
Figure imgf000022_0002
(XXI) (XXII)
工程 17 工程 17
Figure imgf000022_0003
(IV)
[0067] [式中、 R1C)は、 C アルキル基であり、 mは、 1 5の整数であり、 nは、（m— 1)で表
1-6
される整数であり、 P3は、水酸基の保護基であり、その他の記号は上記と同義である o ]
[0068] P3で示される「水酸基の保護基」としては、 P1又は P2で示される「水酸基の保護基」 と同様のものが挙げられ、工程 13で行われる脱保護の観点から、 P2とは異なるもの であることが好ましい。
[0069] 工程 9
工程 9は、化合物 (VIII)を、塩基存在下、化合物 (XXVI)と反応させることにより、 化合物 (XIV)を得る工程である。
反応に使用する塩基としては、水素化ナトリウム、水素化カリウムなどの水素化アル カリ金属；カリウム tert ブトキシドなどの金属アルコキシド類などが挙げられ、好まし くは、水素化ナトリウムである。塩基の使用量は、化合物 (VIII) 1モルに対して、 1〜3 モル、好ましくは 1.1〜 1.6モルである。
化合物（XXVI)の使用量は、化合物（VIII) 1モルに対して、 1.0〜1.3モル、好まし くは 1.0〜： L1モルである。
反応に使用する溶媒としては、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、 1, 4 ジォキ サンなどのエーテル類; N, N ジメチルホルムアミドなどのアミド類；又はこれらの混 合溶媒などが挙げられ、好ましくは、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、 1, 4ージ ォキサンなどのエーテル類である。
反応時間は、通常、 0.2〜1.5時間、好ましくは 0.5〜1時間である。
反応温度は、通常、—10°C〜20°C、好ましくは 0°C〜10°Cである。
[0070] 工程 10
工程 10は、化合物 (XIV)を還元して、化合物 (XV)を得る工程である。 本工程は、還元剤を使用して還元する方法により行うことができる。
反応に使用する還元剤としては、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素カルシウム、 水素化アルミニウムリチウムなどが挙げられ、好ましくは、水素化ホウ素カルシウムで ある。還元剤の使用量は、化合物 (XIV) 1モルに対して、 1〜5モル、好ましくは 1.5 〜2.5モノレである。
反応に使用する溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノールなどのアルコ ール類；ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、 1, 4 ジォキサンなどのエーテル類； 又はそれらの混合溶媒などが挙げられ、好ましくは、メタノール、エタノール、プロパノ ールなどのアルコール類である。 反応時間は、通常、 0.5〜2時間、好ましくは 1〜1.5時間である。
反応温度は、通常、 20°C〜10°C、好ましくは 10°C〜0°Cである。
[0071] 工程 11
工程 11は、化合物 (XV)を保護することにより、化合物 (XVI)を得る工程である。 保護反応は、保護基の種類によって異なるが、自体公知の方法 (例えば、 "Protect! ve Groups in Organic synthesis '(Theodora W. Greene 、 1981年、 A Wiley- Intersc ience Publication発行)に記載の方法）により行うことができる。
P3が、シリル基である場合、化合物 (XV)を、溶媒中、塩基存在下、対応するシリル ノ、ライドと反応させること〖こより、化合物 (XVI)を得ることができる。
反応に使用する塩基としては、トリェチルァミン、イミダゾール、ジイソプロピルェチ ルァミン、ピリジンなどの有機ァミンなどが挙げられる。塩基の使用量は、化合物 (XV ) 1モルに対して、 1〜10モル、好ましくは 2〜5モルである。
シリルハライドの使用量は、化合物（XV) 1モルに対して、 1〜10モル、好ましくは 1. 2〜3モルである。
反応に使用する溶媒としては、 N, N ジメチルホルムアミド、 N, N ジメチルァセ トアミドなどのアミド類；ジクロロメタンなどの含ハロゲン炭化水素類；テトラヒドロフラン などのエーテル類;又はこれらの混合溶媒などが挙げられる。
反応時間は、通常、 0.1〜2時間、好ましくは 0.2〜1時間である。
反応温度は、通常、—10°C〜20°C、好ましくは 0°C〜10°Cである。
[0072] 工程 12
工程 12は、化合物 (XVI)を、塩基存在下、亜硝酸エステルと反応させることにより 、ォキシム体を得て、ついで当該ォキシム体を、塩基及び酸存在下で脱水することに より、化合物 (XVII)を得る工程である。
[0073] まず、ォキシム体を得る反応について説明する。
反応に使用する塩基としては、水素化ナトリウム、水素化カリウムなどの水素化アル カリ金属；リチウムジイソプロピルアミド、ナトリウムアミド、リチウムへキサメチルジシラジ ドなどの金属アミド;カリウム tert ブトキシドなどの金属アルコキシド類などが挙げら れ、好ましくは、リチウムジイソプロピルアミドである。塩基の使用量は、化合物 (XVI) 1モルに対して、 2〜3モル、好ましくは 2.2〜2.6モルである。
反応に使用する亜硝酸エステルとしては、亜硝酸ェチル、亜硝酸イソプロピル、亜 硝酸ブチルなどが挙げられる。亜硝酸エステルの使用量は、化合物 (XVI) 1モルに 対して、 2〜10モル、好ましくは 3〜5モルである。
反応に使用する溶媒としては、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、 1, 4 ジォキ サンなどのエーテル類;又はこれらの混合溶媒などが挙げられ、好ましくは、ジェチ ルエーテル、テトラヒドロフラン、 1, 4 ジォキサンなどのエーテル類である。
反応時間は、通常、 0.2〜5時間、好ましくは 0.5〜2.5時間である。
反応温度は、通常、 100°C〜0°C、好ましくは 80°C〜一 50°Cである。 本反応で得られたォキシム体は、再結晶、カラムクロマトグラフィーなどの常法により 精製することができるが、精製することなく次の反応に使用することもできる。
[0074] ォキシム体を脱水する反応で使用する塩基としては、 4ージメチルァミノピリジン、ピ リジンなどが挙げられ、好ましくは、 4ージメチルァミノピリジンである。塩基の使用量 は、ォキシム体又は化合物（XVI) 1モルに対して、 1〜5モル、好ましくは 3〜4モル である。
ォキシム体を脱水する反応で使用する酸としては、塩ィ匕チォニル、ォキシ塩化リン などが挙げられ、好ましくは、塩ィ匕チォ-ルである。酸の使用量は、ォキシム体又は 化合物（XVI) 1モルに対して、 1〜5モル、好ましくは 1〜3モルである。
ォキシム体を脱水する反応で使用する溶媒としては、ジクロロメタン、ジクロロェタン など含ハロゲン炭化水素類;ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類などが挙げ られ、好ましくは、ジクロロメタン、ジクロロェタンなどの含ハロゲン炭化水素類である。 反応時間は、通常、 1〜5時間、好ましくは 2〜3時間である。
反応時間は、通常、—20°C〜35°C、好ましくは— 10°C〜20°Cである。
[0075] 工程 13
工程 13は、化合物 (XVII)を脱保護して、化合物 (XVIII)を得る工程である。
脱保護反応は、保護基の種類によって異なるが、自体公知の方法 (例えば、 "Prote ctive Groups in Organic synthesis (Theodora W. ureene着、 1981年、 A Wiiey-Inte rscience Publication発行)に記載の方法）により行うことができる力 保護基 P3のみを 除去できる条件を選択することが好ま 、。
例えば、 P2が tert—ブチルジメチルシリル基であり、 P3がトリェチルシリル基である 場合、ァセトニトリルなどの溶媒中、塩ィ匕セリウム七水和物存在下反応させることによ り、 P3のみを除去することができる。
[0076] 工程 14
工程 14は、化合物 (XVIII)を、溶媒中、塩基存在下、化合物 (XXVII)と反応させ ることにより、化合物 (XIX)を得る工程である。
反応に使用する塩基としては、炭酸カリウム、炭酸ナトリウムなどが挙げられ、好まし くは、炭酸カリウムである。塩基の使用量は、化合物 (XVIII) 1モルに対して、 0.1〜1 .5モル、好ましくは 0.5〜1モルである。
化合物（XXVII)の使用量は、化合物（XVIII) 1モルに対して、 1〜3モル、好ましく は 1〜 1.5モルである。
反応に使用する溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノールなどのアルコ ール類；又はこれらの混合溶媒などが挙げられる。
反応時間は、通常、 1〜5時間、好ましくは 1.5〜3時間である。
反応温度は、通常、 10°C〜30°C、好ましくは 15°C〜25°Cである。
[0077] 工程 15
工程 15は、化合物 (XIX)を閉環反応させることにより、化合物 (XX)を得る工程で ある。
本工程は、例えば、光延反応による方法;分子内求核置換反応などにより行うこと ができ、好ましくは、光延反応による方法である。
光延反応は、通常、トリフエ-ルホスフィン、トリブチルホスフィンなどのホスフィン類 、及びァゾジカルボン酸ジェチル、ァゾジカルボン酸ジ tert—ブチル、ァゾジカルボ ン酸ジベンジルなどのァゾジカルボン酸エステルの存在下行われる。ホスフィン類の 使用量は、化合物（XIX) 1モルに対して、 1〜3モル、好ましくは、 1.1〜2モルである 。ァゾジカルボン酸エステルの使用量は、化合物（XIX) 1モルに対して、 1〜3モル、 好ましくは 1.1〜 2モルである。
反応に使用する溶媒としては、テトラヒドロフラン、 1, 4—ジォキサン、ジェチルエー テルなどのエーテル類;又はこれらの混合溶媒などが挙げられ、好ましくは、テトラヒド 口フラン、 1, 4 ジォキサン、ジェチルエーテルなどのエーテル類である。
反応時間は、通常、 0.5〜3時間、好ましくは、 0.5〜1.5時間である。
反応温度は、通常、 10°C〜30°C、好ましくは、 15°C〜25°Cである。
[0078] 工程 16
工程 16は、化合物 (XX)を、溶媒中、化合物 (XXV)と反応させることにより、化合 物 (XXI)又は化合物 (ΧΧΠ)を得る工程であり、上記工程 7と同様にして行うことがで きる。
本工程で得られる生成物は、 R1が導入されるイミダゾール環が 2つあるため、化合 物 (XXI)と化合物 (ΧΧΠ)との混合物となる。これら位置異性体は、再結晶、カラムク 口マトグラフィーなどの常法により分離することができる。
[0079] 工程 17
工程 17は、化合物 (XXI)又は化合物 (ΧΧΠ)を脱保護することにより、化合物 (III) 又は化合物 (IV)をそれぞれ得る工程であり、上記工程 8と同様にして行うことができ る。
[0080] このようにして製造された本発明の化合物は、以下の特性の少なくとも 1つを有する 蛍光物質である。好ましくは 2以上の特性を有し、より好ましくは以下のすべての特性 を有する。
A)水に可溶であり、水溶液中でのスト一タスシフトが大きい。
本発明におけるスト一タスシフトとは、水溶液中での本発明の化合物の励起波長と 蛍光波長との差をいい、通常 lOOnm以上であり、好ましくは 110〜250nmであり、よ り好ましくは 120〜250nmである。このようなスト一タスシフトを示す化合物は、励起 光やラマン散乱などのバックグランドを無視することができ、高感度で微量成分を検 出することができる。また、本発明の化合物が水に可溶であることは、生体内の微量 成分の検出に有利である。
[0081] B)蛍光量子収率が高い。
本発明の化合物は、スト一タスシフトの大きさに加え、蛍光量子収率も高い。ここで 、蛍光量子収率とは、吸収光子数と放出光子数の比率であり、励起状態から非放射 メカニズムではなく蛍光により失活する確率をいい、通常 0. 1以上であり、好ましくは 0. 1〜1. 0である。このような蛍光量子収率を有し、かつスト一タスシフトの大きいィ匕 合物は、放射性同位体を用いた検出法と同等以上の感度が期待でき、高感度で微 量成分を検出することができる。
[0082] C)蛍光物質として安定性が高い。
本発明の化合物は、 pH3〜： LOの範囲では、 pHに依存することなく安定な蛍光を 発する。したがって、前記範囲内で pHが大きく変化する条件下での蛍光強度の測定 にも好適に使用することができる。
[0083] D)修飾されても安定性が高い。
本発明の化合物は、核酸又はペプチドなどの生体由来分子に結合させるため、又 は酵素基質として用いるため、種々の修飾がなされた場合でも、蛍光物質としての安 定性が高い。したがって、様々な用途に供することが期待される。
[0084] E)溶媒により蛍光の色が変化する。
本発明の化合物は、溶解させる溶媒により蛍光の色が変化する。特に、低濃度の 水を含む溶媒では蛍光の色相の変化を肉眼でも確認することができる。この性質を 利用して、水分の割合を予想することができる。例えば、水の割合力^〜 10v/v%の 水—メタノール混合溶液中の色相の変化は、試験例 2に記載されている。
[0085] 本発明の化合物は、様々な物質と結合させ、蛍光標識として使用することができる 。結合対象の物質としては、特に限定されるものではないが、天然又は合成の低分 子化合物、天然又は合成の高分子化合物などがあげられる。中でも、核酸及びタン パク質を始めとする生体由来の物質の検出に利用されることが期待される。
[0086] 本発明は、本発明の化合物と、核酸、ペプチド、糖及び脂質からなる群より選ばれ る生体由来分子とを含む、蛍光標識分子を提供する。前記蛍光標識分子は、生体由 来分子が本発明の化合物のリンカ一部分と共有結合していることが好ましい。
[0087] 本発明の蛍光標識分子中に含まれ、本発明の化合物の結合対象となる前記核酸 は、 DNA、 RNAなどの天然核酸もしくは合成核酸又は核酸類似体であってもよぐ 核酸の長さも特に限定されるものではな 、。核酸と結合又は複合体を形成したぺプ チドもしくは脂質などを含んで 、てもよ 、。 [0088] 同様に、前記ペプチドは、天然もしくは合成ペプチドであってもよぐペプチドの長 さも特に限定されるものではない。ペプチドと結合又は複合体を形成した核酸、糖、 脂質などを含んで 、てもよ 、。
[0089] 同様に、前記糖は、天然もしくは合成の糖であってもよぐ単糖、オリゴ糖、多糖の いずれでもよぐ糖と結合又は複合体を形成したペプチド、脂質などを含んでいても よい。
[0090] 同様に、前記脂質は、天然もしくは合成脂質であってもよぐ脂質と結合又は複合 体を形成した核酸、ペプチド、糖などを含んでいてもよい。
[0091] 本発明は、ドナー蛍光分子として本発明の化合物と、核酸、ペプチド、糖及び脂質 からなる群より選ばれる生体由来分子と、ァクセプター蛍光分子とを含む、蛍光共鳴 エネルギートランスファーを利用する蛍光指示薬を提供する。
[0092] 「蛍光共鳴エネルギートランスファー (FRET)」とは、ドナー蛍光分子が励起し、励 起したエネルギーを放出する際に共鳴によるエネルギーの移動によりそのエネルギ 一を受け取ったァクセプター蛍光分子が励起される現象をいう。
[0093] 前記ドナー蛍光分子 (本発明の化合物）と、生体由来分子と、ァクセプター蛍光分 子とは、 FRETを起こすためには、一定の間隔で共有結合していることが好ましい。
[0094] 前記ァクセプター蛍光分子としては、前記ドナー蛍光分子の蛍光スペクトルと重な る蛍光スペクトルを有し、ドナー蛍光分子の双極子配向とほぼ平行の双極子配向で あるものが好ましい。このようなァクセプター蛍光分子としては、 Acridine、 AMCA、 BO DIPY、 し ascade Blue、 し y2、 Cy3、 Cy5、 Cy7、 DabcyU Edans、 Eosin、 Erythrosin、 Fluo rescein、 6— Fam、 TET、 Joe、 HEX、 LightCycler、 NBD、 Oregon Green、 Rhodamine t> 、 Rhodamine Green、 Rhodamine Red、 Rhodol Green、 TAMRA、 ROX、 Texas Red、 NE D、 VICなどがあげられる。
[0095] FRETを効率良く起こすためには、蛍光指示薬中のドナー蛍光分子とァクセプター 蛍光分子との距離は、通常、 1〜： LOnm程度であることが好ましい。
[0096] 本発明の蛍光標識分子及び蛍光指示薬は、生体成分などの検出の便宜に供する ため、担体に結合されていることが好ましい。ここで、担体としては、セファロース、ァ ガロース、ポリアクリル酸誘導体、ポリスチレンなどがあげられ、これらは好ましくはビ ーズ状又はスティック状又は平板状にカ卩ェされる力 これに限定されない。
[0097] 本発明の蛍光標識分子及び蛍光指示薬は、公知の添加剤などを含んでもよ!、。前 記添加剤としては、例えば、アジ化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリ ゥム、メチルパラベン、プロピルパラベンなどの保存剤、水、生理食塩水、緩衝液など の希釈剤、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、グリ セロールなどの有機溶媒などが挙げられる力 それらに限定されるものではない。
[0098] 本発明の蛍光標識分子及び蛍光指示薬中に含まれる蛍光成分の含有量は、所望 の検出効果を奏することができる範囲で適宜設定することができるが、通常、 0. 01 〜100重量0 /0であり、好ましくは 0. 1〜99. 9重量0 /0、より好ましくは 0. 5〜99. 5重 量％である。
[0099] 本発明は、本発明の化合物を蛍光標識として使用することを特徴とする、環境物質 又は生体由来分子などの微量成分を測定する方法を提供する。環境物質の測定の ため、環境物質を特異的に認識する抗体を用いる場合、下記生体由来分子の測定 方法に準じて行うことができる。
[0100] 本発明は、前記蛍光標識分子又は蛍光指示薬を使用することを特徴とする、生体 由来分子の測定方法を提供する。
[0101] 前記生体由来分子の測定方法は、前記蛍光標識分子又は蛍光指示薬と測定対象 を含む試料とを混合して試料溶液を調製する工程、及び
蛍光検出系を用いて前記試料溶液の蛍光信号全体の強さ、蛍光信号の時間経過に よる変化又は蛍光偏光の度合!/、を計測する工程
を含む。
[0102] 1)試料溶液を調製する工程
測定対象を含む試料とは、試料中に測定対象が存在する可能性がある限り、いか なる試料であってもよい。
[0103] 前記蛍光標識分子又は蛍光指示薬と測定対象を含む試料とを混合する方法は、 用いる試薬に適した溶液中で、当該試薬と測定対象とが接触できるような条件下で 行えばよい。例えば、試薬と測定対象とが溶解可能な溶媒中で、約 0〜40°C程度の 温度で数分〜 1日程度混合させることができる。前記混合には、機械的に混合する 手段の他、静置させる手段も含まれる。調製された試料溶液は、下記計測工程に供 される。
[0104] 2)蛍光検出系を用いて前記試料溶液の蛍光信号全体の強さ、蛍光信号の時間経 過による変化又は蛍光偏光の度合いを計測する工程
本発明において、蛍光検出系とは、公知のあらゆる検出系を使用することができ、 特に限定されるものではない。
[0105] 前記蛍光検出系において、蛍光信号全体の強さ、蛍光信号の時間経過による変 化又は蛍光偏光の度合いを定性的又は定量的に計測することができる。
[0106] 前記計測工程により得られた信号は、対照試料における信号と比較し、場合によつ ては一定の既知濃度の測定対象を含む試料における信号と対比させ、検出対象の 試料中に含まれる物質を定性的又は定量的に検出することができる。
[0107] 本発明においては、検出の容易性及び感度の観点から、担体に担持された検出 試薬を用いることが好まし 、。
[0108] 本発明は、本発明の化合物を蛍光標識として使用することを特徴とする、細胞内分 子イメージング方法を提供する。かかる方法は、本発明の化合物により蛍光標識され た分子をインビトロで培養した細胞又は生体内に所定の方法により加え、細胞内又 は生体内の挙動を蛍光顕微鏡下で観察することなどにより、行うことができる。
実施例
[0109] 以下に、実施例を示し、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれら に限定されるものではない。
以下の実施例 1〜9は次に示す合成経路に従って実施した。
[0110] [化 8] 1) NaHC03l Na2C03 NHAc ノ NHAc
H2， Pd-C TsOH-H20 eOH-H20, rt
-Me
AcO N02 EtOH, rt AcO, 、NH2 C6H6l reflux AcO 2) TBDMSCI, imidazole
DMF, rt
76% from 5
78%
Figure imgf000032_0001
10b
1) MeOTf, CH2CI2
-70 °C to -20 °C
2) separation
Figure imgf000032_0002
12 36% 13 41 %
HF-NaF buffer HF-NaF buffer
THF. O °C THF, 0。C
60%
Figure imgf000032_0003
実施例 1 :化合物 6の合成
Pd-C (1.8 g)のエタノール懸濁液（25 mL)を、常圧にて水素気流下 4時間撹拌した 。文献 (Han, G.; Shin, K. J.; Kim, D. C; Yoo, K. H.; Kim, D. J.; Park, S. W. Heter ocycles, 1996, 43, 2496.)に従い調製した化合物 5 (3.0 g, 0.013 mol)のエタノール 溶液 (150 mL)を加え、同条件下 2日間撹拌した。触媒を濾去した後、濾液を減圧濃 縮し、化合物 6の粗結晶を得た。本ィ匕合物は精製することなく次の反応に用いたが、 分析用試料はエタノール力も再結晶することにより得た。
化合物 6 :無色結晶.
mp 155-157°C (EtOH).
IR v (KBr)： 3224, 1754, 1669, 1532, 1209, 1157cm"1. Ή-NMR (CD OD) δ ： 2.13 (3H, s), 2.22 (3H, s), 6.39 (1H, dd, J = 8.5, 2.5 Hz), 6.
3
54 (1H, d, J = 2.5 Hz), 7.06 (1H, d, J = 8.5 Hz).
13C-NMR (CD OD) δ c : 21.0, 23.0, 110.6, 111.6, 122.0, 127.9, 144.7, 151.1, 170
3
.9, 172.2.
EI- MS (m/z, %) : 208 (M+, 31), 124(100).
Anal. Calcd for C H N O : C, 57.69; H, 5.81; N, 13.45. Found: C, 57.31; H, 5.82
10 12 2 3
； N, 13.39.
[0112] 実施例 2 :化合物 7の合成
化合物 6のエタノール溶液（50 mL)に、ベンゼン（200 mL)及び p-トルエンスルホン 酸 1水和物（2.47 g, 0.013 mol)を加え、 Dean- Stark蒸留器を用いて 12時間加熱還 流した。反応液を飽和重曹水、水、飽和食塩水で洗浄し、乾燥後、溶媒を減圧留去 し、化合物 7 (1.88 g, 76% from化合物 5)を得た。
化合物 7 :無色結晶.
mp 192-195°C (AcOEt).
IR v (KBr)： 3334, 2695, 1755, 1370, 1134, 1019 cm"1.
JH-NMR (CDC1 ) δ ： 2.34 (3H, s), 2.52 (3H, s), 6.92 (1H, dd, J = 8.5, 2 Hz), 7.20
3
(1H, d, J = 2 Hz), 7.43 (1H, d, J = 8.5 Hz).
13C-NMR (CDC1 ) δ c： 15.0, 21.3, 107.4, 114.7, 116.0, 136.3, 138.3, 145.9, 152.
3
1, 170.4.
EI- MS (m/z, %) : 190 (M+, 26), 148 (100).
Anal. Calcd for C H N O : C, 63.15; H, 5.30; N, 14.73. Found: C, 63.04; H, 5.39
10 10 2 2
； N, 14.59.
[0113] 実施例 3 :化合物 8の合成
炭酸ナトリウム（660 mg)及び重曹（743 mg)の水懸濁液（7.5 mL)に、化合物 7 (63 mg, 0.33 mmol)のメタノール溶液 (7.5 mL)を滴下し、室温で 3時間撹拌した。メタノ ールを減圧留去後、飽和シユウ酸水を加え酸性にし、酢酸ェチルで抽出した。有機 層を水、飽和食塩水で洗浄後、乾燥、溶媒を減圧留去し、フ ノール体（58 mg)を得 た。得られたフエノール体は精製することなくただちに次の反応に用いた。フエノール 体（58 mg)の DMF (2 mL)溶液に、イミダゾール（132 mg, 1.94 mmol)及び TBDMSC
1 (176 mg, 1.16 mmol)を加え、室温で 12時間撹拌した。反応液をエーテルで希釈後
、水を加え、エーテルで抽出し、水、飽和食塩水で洗浄した。乾燥後、溶媒を減圧留 去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン:メタノール = 30： 1) により精製し、化合物 8 (67.5 mg, 78%)を得た。
化合物 8 :無色結晶.
mp 148.5-150.5°C (AcOEt).
IR v (KBr) : 2930, 2857, 1728, 1628, 1458, 1408, 1254, 1167 cm"1.
'H-NMR (CDCl ) δ ： 0.18 (6H, s), 0.98 (9H, s), 2.61 (3H, s), 6.76 (1H, dd, J =9, 2
3
Hz), 6.99 (1H, d, J = 2 Hz), 7.38 (1H, d, J = 9 Hz), 10.24 (1H, br s).
13C-NMR (CDCl ) δ c： -4.3, 15.0, 18.3, 25.8, 104.5, 114.8, 115.8, 134.0, 138.5,
3
151.0, 151.3.
EI- MS (m/z, %) : 262 (M+, 42), 205 (100).
Anal. Calcd for C H N OSi： C, 64.08; H, 8.45; N, 10.67. Found: C, 64.08; H, 8.
14 22 2
40; N, 10.66.
実施例 4:化合物 9の合成
窒素気流下、あらかじめ無水へキサンで洗浄した水素化ナトリウム (60% in oil, 68.6 mg, 1.71 mmol)の無水 THF (1 mL)懸濁液中に、化合物 8 (300 mg, 1.14 mmol)の 無水 THF溶液 (1.5 mL)を加え、室温で 30分間撹拌した。さらに、ヨウ化メチル (78.3 μ L, 1.26 mmol)を加え、室温で 2時間撹拌した。反応液に氷水を加えた後、エーテ ルで抽出し、水、飽和食塩水で洗浄した。乾燥後、溶媒を減圧留去し、化合物 9 (279 mg, 88%)を得た。
なお、化合物 9a (1-メチル体）と化合物 9b (3-メチル体）はシリカゲルカラムクロマト グラフィー（クロ口ホルム:アセトン = 10 : 1)により分離可能である力 混合物のまま次 の反応に用いた。
化合物 9a:無色結晶.
mp 130- 131。C (AcOEt- hexane).
IR v (KBr)： 3428, 2932, 2858, 1622, 1587, 1514, 1481, 1397, 1257, 1162 cm"1. UV λ nm ( ε ) : 290 (6000), 256 (6100).
max
1H-NMR (CDC1 ) δ ： 0.19 (6H, s), 0.99 (9H, s), 2.56 (3H, s), 3.68 (3H, s), 6.80 (1
3
H, dd, J = 9, 3 Hz), 7.09 (1H, d, J = 9 Hz), 7.14 (1H, d, J = 3 Hz).
13C-NMR (CDC1 ) δ c： -4.4, 13.9, 18.3, 25.8, 29.9, 108.6, 109.1 , 115.7, 130.9, 1
3
43.0, 151.0, 152.0.
EI- MS (m/z, %) : 276 (M+, 41), 219 (100).
Anal. Calcd for C H N OSi： C, 65.17; H, 8.75; N, 10.13. Found : C, 65.25; H, 8.
15 24 2
67; N, 10.10.
化合物 9b :無色結晶.
mp 141.5- 145。C (AcOEt- hexane).
IR v (KBr)： 3466, 2934, 2859, 1626, 1476, 1400, 1254, 1209, 1093 cm"1.
UV λ MeCNnm ( ε ) : 284 (7900), 258 (4500).
max
'H-NMR (CDCl ) δ ： 0.20 (6H, s), 1.01 (9H, s), 2.56 (3H, s), 3.65 (3H, s), 6.70 (1
3
H, d, J = 2 Hz), 6.75 (1H, dd, J = 9, 2 Hz), 7.49 (1H, d, J = 9 Hz).
13C-NMR (CDCl ) δ c： -4.3, 13.9, 18.3, 25.8, 29.9, 99.8, 115.2, 118.9, 136.2, 13
3
7.2, 150.9, 151.3.
EI- MS (m/z, %) : 276 (M+, 78), 219 (100).
Anal. Calcd for C H N OSi： C, 65.17; H, 8.75; N, 10.13. Found : C, 65.00; H, 8.
15 24 2
69; N, 10.06.
実施例 5 :化合物 10の合成
常法に従い、ジイソプロピルアミン（251 μ L, 1.79 mmol)及び n-ブチルリチウムへ キサン溶液（1.50 M, 1.19 mL, 1.79 mmol)力 調製した LDAの THF溶液（2.4 mL) に、窒素気流下、 - 78°Cで化合物 9 (198 mg, 0.716 mmol)の THF (1.2 mL)溶液を滴 下し、 - 78°Cで 30分間撹拌した。さらに、亜硝酸ブチル (429 μ L, 3.58 mmol)をカロえ 、 - 78°Cで 45分間撹拌した。飽和塩ィ匕アンモニゥム水溶液を加え室温に戻した後、反 応液を酢酸ェチルで抽出し、水、飽和食塩水で洗浄した。乾燥後、溶媒を減圧留去 し、粗ォキシム体を得た。得られた粗ォキシム体は精製することなぐただちに以下の 反応に用いた。 粗ォキシム体のベンゼン（2 mL)溶液を 15分間加熱還流した。塩化チォニル (65.3 μ L, 0.895 mmol)を滴下し、さらに 1時間加熱還流した。室温に戻した後、水を加え、 酢酸ェチルで抽出し、水、飽和食塩水で洗浄した。乾燥後、溶媒を減圧留去し、残 渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸ェチル：へキサン = 1 : 10)により分離精 製し、化合物 10b (3-メチル体， 49.9 mg, 24%)及び化合物 10a (1-メチル体， 46.8 mg, 23%)を得た。
化合物 10a :微黄色針状晶.
mp 170.5- 173.5°C (AcOEt- hexane).
IR v (KBr) : 3467, 2931 , 2859, 2237, 1622, 1486, 1266, 1169 cm"1.
UV λ MeCNnm ( ε ) : 316 (7600), 274 (12000).
max
'H-NMR (CDCl ) δ ： 0.22 (6H, s), 1.00 (9H, s), 3.97 (3H, s), 7.06 (IH, dd, J =9, 2
3
Hz), 7.24 (IH, d, J = 2 Hz), 7.28 (IH, d, J = 9 Hz).
13C-NMR (CDCl ) δ c： -4.4, 18.3, 25.7, 31.5, 110.2, 110.3, 111.0, 121.5, 126.7,
3
129.9, 143.1 , 153.2.
EI- MS (m/z, %) : 287 (M+, 73), 230 (100).
Anal. Calcd for C H N OSi： C, 62.68; H, 7.36; N, 14.62. Found : C, 62.61 ; H, 7.
15 21 3
34; N, 14.58.
化合物 10b :無色結晶.
mp 109.5- 111。C (AcOEt- hexane).
IR v (KBr) : 3443, 2930, 2858, 2239, 1624, 1497, 1467, 1397, 1268 cm"1.
UV λ MeCNnm ( s ) : 310 (20000).
max
1H-NMR (CDCl ) δ ： 0.24 (6H, s), 1.02 (9H, s), 3.93 (3H, s), 6.79 (IH, d, J = 2 H
3
z), 6.95 (IH, dd, J = 9, 2 Hz), 7.68 (IH, d, J = 9 Hz).
13C-NMR (CDCl ) δ c： -4.3, 18.3, 25.7, 31.2, 99.8, 111.2, 119.3, 122.0, 125.9, 1
3
35.6, 137.4, 155.1.
EI— MS (m/z, %) : 287 (M+, 29), 230 (100). Anal. Calcd for C H N OSi： C, 62.68;
15 21 3
H, 7.36; N, 14.62. Found : C, 62.66; H, 7.33; N, 14.66.
実施例 6 :化合物 11の合成 窒素気流下、化合物 10b (85.0 mg, 0.296 mmol)の無水メタノール溶液（6.0 mL)に 、室温下、炭酸カリウム（45.0 mg, 0.352 mmol)を加え、室温で 15分間攪拌した。塩 化水素-メタノール溶液により pH 6に調整したのち、 N-メチル -1,2-フエ-レンジアミ ン（67 L, 0.59 mmol)を加え、室温で 9時間攪拌した。飽和重曹水を加え、メタノー ルを減圧留去後、酢酸ェチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水 硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラム クロマトグラフィー（n-へキサン：酢酸ェチル = 6 : 1)により精製し、化合物 11 (44.0 mg, 38%)を得た。
化合物 11 :無色結晶.
mp 110- 115°C.
IR v (KBr)： 2953, 2857, 1622, 1463 cm"1.
JH-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ： 0.26 (6H, s), 1.08 (9H, s), 4.25 (3H, s), 4.29 (3H,
3
s), 6.91 (2H, m), 7.03-7.46 (3H, m), 7.70 (1H, d, J = 9 Hz), 7.85 (1H, d, J = 9 Hz). 13C-NMR (75.45 MHz, CDC1 ) δ c :—4.4, 18.2, 25.6, 32.3, 32.3, 100.3, 110.0, 117.
3
1, 120.1, 120.5, 122.7, 123.7, 136.1, 137.0, 137.6, 142.5, 142.7, 143.3, 153.1.MS ( FAB) m/z : 393 (M+H+).
HRMS Calcd for C H N OSi: 393.2111. Found: 393.2097.
22 29 4
実施例 7 :化合物 12及び 13の合成
窒素気流下、化合物 11 (45.0 mg, 0.115 mmol)の無水ジクロロメタン溶液（2.30 mL )に、 -78°C冷却下、メチルトリフラート（13 μ L, 0.12 mmol)を加え、 - 10°C冷却下 5時 間攪拌した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体をシリカゲルクロマトグラフィー（ クロ口ホルム：メタノール = 30： 1)により分離精製し、化合物 12 (26.0 mg, 36%)及 び化合物 13 (23.0 mg, 41%)を得た。
化合物 12 : 白色粉末.
mp 287-290°C.
IR v (KBr)： 2930, 1621, 1530, 1465, 1260, 1160 cm"1.
'H-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ： 0.28 (6H, s), 1.05 (9H, s), 4.06 (3H, s), 4.13 (6H,
3
s), 6.95 (1H, d, J = 2 Hz), 7.03 (1H, dd, J = 2, 9 Hz), 7.75 (1H, d, J = 9 Hz), 7.77-7 .86 (4H, m).
13C-NMR (75.45 MHz, CDCl ) δ c :—4.3, 19.1, 26.1, 32.3, 34.0, 102.3, 114.7, 120.
3
6, 122.4, 129.4, 134.0, 134.9, 138.7, 139.6, 141.6, 156.3.
MS (FAB) m/z : 407 (M
HRMS Calcd for C H N OSi : 407.2267. Found : 407.2278.
23 31 4
化合物 13 : 白色粉末.
mp 189-192°C.
IR v (KBr)： 2930, 1632, 1500, 1276, 1159 cm"1.
'H-NMR (300 MHz, CDCl ) δ： 0.30 (6H, s), 1.04 (9H, s), 4.03 (3H, s), 4.09 (3H,
3
s), 7.13 (IH, d, J = 2 Hz), 7.27 (IH, dd, J = 2, 9 Hz), 7.47-7.64 (3H, m), 7.69 (IH, d, J = 9 Hz), 7.91 (IH, d, J = 8 Hz).
13C-NMR (75.45 MHz, CDCl ) δ c :—4.6, 19.1, 26.1, 32.3, 33.8, 34.0, 104.3, 112.7
3
, 115.7, 121.2, 123.8, 125.6, 127.2, 129.0, 135.2, 135.7, 137.3, 137.7, 144.2, 157.8 MS (FAB) m/z : 407 (M^.
HRMS Calcd for C H N OSi : 407.2267. Found : 407.2262.
23 31 4
実施例 8 :化合物 1の合成
窒素気流下、化合物 12 (14.0 mg, 0.0344 mmol)の無水 THF溶液 (1.0 mL)に、氷 冷下 pH 5フッ化ナトリウム-フッ化水素緩衝液 (0.50 mL)を加え、同条件下 1.5時間攪 拌した。エーテルで希釈後、生じた沈殿を遠心分離により集めた。沈殿をエーテルで 洗浄し、減圧下乾燥し、化合物 1 (6.0 mg, 60%)を得た。
化合物 1 :黄色粉末.
mp 114-119°C.
IR v (KBr)： 1617, 1573, 1522 cm"1.
1H-NMR (300 MHz, CDCl ) δ： 3.84 (3H, s), 4.11 (6H, s), 6.82 (IH, d, J = 2 Hz),
3
6.94 (IH, dd, J = 2, 9 Hz), 7.59 (IH, d, J = 9 Hz), 7.85 (2H, dd, J = 3, 6 Hz), 8.08 (
2H, dd, J = 3, 6 Hz).
MS (FAB) m/z : 293 (M+H+). HRMS Calcd for C H N O : 293.1402. Found: 293.1397.
17 17 4
[0119] 実施例 9 :化合物 2の合成
化合物 1の合成と同様の操作により、化合物 13 (40.0 mg, 0.0982 mmol)を用い、氷 冷下 20時間攪拌し、化合物 2 (16.2 mg, 56%)を得た。
化合物 2 :黄色粉末.
mp 180-184°C.
IR v (KBr)： 2924, 1610, 1514, 1468 cm"1.
JH-NMR (300 MHz, CD OD) δ： 3.89 (3H, s), 3.95 (3H, s), 3.99 (3H, s), 6.86 (IH,
3
d, J = 2 Hz), 7.12 (IH, dd, J = 2, 9 Hz), 7.47-7.61 (2H, m),7.65 (IH, d, J = 9 Hz), 7.78 (IH, d, J = 8 Hz), 7.89 (IH, d, J = 8 Hz).
MS (FAB) m/z: 293 (M+H+).
HRMS Calcd for C H N O : 293.1402. Found: 293.1393.
17 17 4
[0120] 以下の実施例 10〜19は次に示す合成経路に従って実施した。
[0121] [化 9]
Figure imgf000040_0001
20 21 47% 22 50%
HF-NaF buffer HF-NaF buffer
THF, rt THF, rt
65% 70%
Figure imgf000040_0002
実施例 10 :化合物 14の合成
窒素気流下、あら力じめ無水へキサンで洗浄した水素化ナトリウム (60% in oil, 264 mg, 6.6 mmol)の無水 THF (5 mL)懸濁液中に、化合物 8 (1.15 g, 4.4 mmol)の無水 THF (8 mL)溶液を氷冷下滴下し、同温で 30分攪拌した。氷冷下、ブロモ酢酸ェチ ル（532 μ L, 4.80 mmol)を加え、同温にてさらに 30分攪拌した後、反応液に氷水を 加え、エーテルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム で乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフ ィー（クロ口ホルム：メタノール = 60： 1)により精製し、 1位置換体及び 3位置換体の 混合物 (約 1 ： 1)として化合物 14 (1.38 g, 90%)を得た。両位置異性体は分離するこ となく以下の反応に用いた。
化合物 14:微黄色粉末. mp 64.0-66.0°C.
IR v (KBr)： 3395, 2933, 2857, 1749, 1623, 1478, 1260, 1202, 1161 cm"1.
1H-NMR (270 MHz, CDC1 ) δ： 0.19 (12H, s), 0.98 (9H, s), 0.99 (9H, s), 1.25 (6H,
3
d, J = 7 Hz), 2.54 (3H, s), 2.55 (3H, s), 4.22 (4H, q, J = 7 Hz), 4.72 (2H, s), 4.75 ( 2H, s), 6.64 (1H, d, J = 2 Hz), 6.76 (1H, dd, J = 2, 9 Hz), 6.78 (1H, dd, J = 2, 9 Hz ), 7.03 (1H, d, J = 9 Hz), 7.15 (1H, d, J = 2 Hz), 7.51 (1H, d, J = 9 Hz).
13C-NMR (67.8 MHz, CDC1 ) δ c :—4.4,—4.4, 13.7, 13.8, 14.1, 18.3, 18.3, 25.8, 25
3
.8, 45.1, 45.1, 62.0, 100.0, 108.4, 109.3, 115.6, 116.1, 119.2, 130.2, 135.7, 137.1, 142.9, 150.8, 151.3, 151.7, 152.0, 167.0, 167.0.
Ms (EI) m/z : 348 (M+,87), 291 (100).
Anal. Calcd for C H N O Si: C, 62.03; H, 8.10; N, 8.04. Found: C, 62.02; H, 8.0
18 28 2 3
4; N, 7.97.
実施例 11 :化合物 15の合成
窒素気流下、塩化カルシウム（811 mg, 7.31 mmol)の無水エタノール（14 mL)溶 液に、 - 10°C冷却下、水素化ホウ素ナトリウム（531 mg, 14.1 mmol)の無水エタノール (14 mL)懸濁液を滴下した。本反応液中に化合物 14 (1.96 g, 5.62 mmol)の無水ェ タノール (30 mL)溶液を- 10°C冷却下で滴下し、同温で 1時間攪拌した。酢酸ェチル で希釈後、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒 を減圧留去し、化合物 15 (1.47 g, 86%)を得た。
化合物 15 :無色油状物.
IR V (KBr)： 4347, 3222, 2932, 2857, 1622, 1478, 1408, 1258, 1163 cm"1.
1H-NMR (270 MHz, CDC1 ) δ： 0.16 (6Η, s), 0.17 (6H, s), 0.98 (9H, s), 0.99 (9H,
3
s), 2.19 (3H, s), 2.21 (3H, s), 3.94 (4H, br t, J = 5 Hz), 4.05 (4H, br t, J = 5 Hz), 6. 60 (1H, dd, J = 2, 9 Hz), 6.66 (1H, d, J = 2 Hz), 6.68 (1H, dd, J = 2, 9 Hz), 6.87 (1 H, s), 7.04 (1H, d, J = 9 Hz), 7.12 (1H, d, J = 9 Hz).
13C-NMR (67.8 MHz, CDC1 ) δ c :—4.4,—4.3, 13.6, 13.6, 18.3, 18.3, 25.8, 25.8, 45
3
.6, 62.0, 62.1, 100.2, 108.4, 109.1, 115.4, 115.8, 118.2, 129.9, 135.1, 136.2, 142.2 , 151.0, 151.3, 151.3, 152.3. Ms (EI) m/z: 306 (M+,100).
Anal. Calcd for C H N O Si: C, 62.70; H, 8.55; N, 9.14. Found: C, 62.55; H, 8.3
16 26 2 2
8; N, 9.04.
[0124] 実施例 12 :化合物 16の合成
窒素気流下、化合物 15 (1.84 g, 6.00 mmol)及びイミダゾール（613 mg, 9.00 mmol) の DMF (12 mL)溶液に、氷冷下、 TESC1 (1.21 mL, 7.20 mmol)を滴下し、同条件下 10分撹拌した。室温にした後、さらに 14時間攪拌した。反応液をエーテルで希釈後、 水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。 得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（n-へキサン：酢酸ェチル = 1 ： 1)により精製し、化合物 16 (2.07 g, 82%)を得た。
化合物 16 :無色油状物質.
IR V (KBr)： 2954, 1622, 1477 cm"1.
JH-NMR (270 MHz, CDC1 ) δ： 0.19 (6Η, s), 0.20 (6H, s), 0.38—0.50 (12H, m), 0.7
3
7-0.85 (18H, m), 1.00 (9H, s), 1.02 (9H, s), 3.86-3.92 (4H, m), 4.13-4.20 (4H, m), 6.69-6.78 (3H, m), 7.08 (1H, d, J = 9 Hz), 7.13 (1H, d, J = 2 Hz), 7.48 (1H, d, J = 9 Hz).
[0125] 実施例 13 :化合物 17の合成
常法に従い、ジイソプロピルアミン（1.68 mL, 12.0 mmol)及び n-ブチルリチウムへ キサン溶液（1.54 M, 7.8 mL, 12.0 mmol)力 調製した LDAの THF (15 mL)溶液に、 - 78°C冷却下、化合物 16 (2.02 g, 4.80 mmol)の無水 THF (17 mL)溶液を滴下し、同 条件下 1時間攪拌した。亜硝酸ブチル (2.88 mL, 24.0 mmol)を加え、 _78°C冷却下 2 時間攪拌した。飽和塩化アンモ-ゥム水溶液を加え、室温に戻した後、反応液を酢 酸ェチルで抽出し、水、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒 を減圧留去し、粗ォキシム体を得た。粗ォキシム体は精製することなくただちに以下 の反応に用いた。
窒素気流下、 4-ジメチルァミノピリジン（2.05 g, 16.8 mmol)の無水ジクロロメタン (30 mL)溶液に、 - 10°C冷却下、 10%塩化チォ-ル-ジクロロメタン溶液（5.30 mL, 7.20 m mol)を滴下し同温にて 5分間攪拌した。 - 10°C冷却下、上記粗ォキシム体の無水ジク ロロメタン (20 mL)溶液を反応液中に滴下し、同条件下さらに 5分間攪拌した。室温に 戻し、 2時間攪拌した後、飽和重曹水を加え酢酸ェチルで抽出した。有機層を飽和 食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成 績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（n-へキサン：ベンゼン：酢酸ェチル = 7
: 7 : 1)により精製し、化合物 17 (1.42 g, 69%)を得た。
化合物 17 :黄色油状物質.
IR V (KBr)： 2953, 2859, 2235, 1620 cm"1.
JH-NMR (270 MHz, CDC1 ) δ： 0.21 (6Η, s), 0.24 (6H, s), 0.37—0.49 (12H, m), 0.7
3
4-0.85 (18H, m), 1.00 (9H, s), 1.01 (9H, s), 3.39-3.98 (4H, m), 4.39-4.47 (4H, m), 6.83 (IH, d, J = 2 Hz), 6.92 (IH, dd, J = 2, 9 Hz), 7.01 (IH, dd, J = 2, 9 Hz), 7.24 ( IH, d, J = 2 Hz), 7.34 (IH, d, J = 9 Hz), 7.66 (IH, d, J = 9 Hz).
実施例 14:化合物 18の合成
化合物 17 (380 mg, 0.880 mmol)のァセトニトリル (18 mL)溶液に塩化セリウム七水 和物（656 mg, 1.76 mmol)を加え、 9時間加熱還流した。室温に戻した後、反応液に 水を加え、酢酸ェチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥 後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（n -へキサン：酢酸ェチル = 3 : 1)により分離精製し、化合物 18a (117 mg, 42%)及び 化合物 18b (113 mg, 41%)を得た。
化合物 18a: 白色固体.
mp 107.0-107.5°C.
IR v (KBr)： 3345, 2932, 2858, 1620, 1578, 1483, 1269, 1168 cm"1.
1H-NMR (270 MHz, CDC1 ) δ： 0.20 (6H, s), 1.00 (9H, s), 4.04 (2H, t, J = 5 Hz), 4
3
.46 (IH, t, J = 5 Hz), 7.01 (IH, dd, J = 2, 9 Hz), 7.13 (IH, d, J = 2Hz), 7.33 (IH, d, J = 9 Hz).
13C-NMR (67.8 MHz, CDC1 ) δ：—4.4, 18.3, 25.8, 47.9, 61.1, 110.2, 110.9, 111.2,
3
121.1, 126.8, 129.5, 143.3, 153.1.
MS (EI) m/z : 317 (M+,32), 260 (100).
HRMS Calcd for C H N O : 317.1559; Found: 317.1562. 化合物 18b : 白色固体.
mp 112.0— 113.0°C.
IR v (KBr)： 3289, 2933, 2858, 1621, 1495, 1408, 1260 cm"1.
1H-NMR (270 MHz, CDCl ) δ： 0.23 (6H, s), 1.00 (9H, s), 4.05 (2H, t, J = 5 Hz), 4
3
.44 (IH, t, J = 5 Hz), 6.87 (IH, d, J = 2Hz), 6.91 (IH, dd, J = 2, 9 Hz), 7.62 (IH, d, J = 9 Hz).
13C-NMR (67.8 MHz, CDCl ) δ c :—4.3, 15.1, 18.3, 25.7, 47.6, 61.1, 100.4, 111.3,
3
119.3, 121.9, 126.0, 135.2, 137.4, 155.1.
MS (EI) m/z : 317 (M+,100).
HRMS Calcd for C H N O Si : 317.1559; Found: 317.1559.
16 23 3 2
実施例 15 :化合物 19の合成
窒素気流下、化合物 18b (100.0 mg, 0.315 mmol)の無水メタノール (3.2 mL)溶液 に、室温下、炭酸カリウム（30.0 mg, 0.221 mmol)を加え、氷冷下 30分間攪拌した。 1, 2-フエ-レンジァミン（80.0 mg, 0.442 mmol)を加え、室温にてさらに 2時間攪拌した 。飽和重曹水を加え、メタノールを減圧留去後、酢酸ェチルで抽出した。有機層を水 、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られ た粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロ口ホルム）により精製し、化合物 19 (62.0 mg, 48%)を得た。
化合物 19 : 白色固体.
mp 230-235°C.
IR v (KBr)： 3127, 2956, 2858, 1623, 1489 cm"1.
1H-NMR (300 MHz, CDCl ) δ： 0.21 (6H, s), 1.00 (9H, s), 4.30 (2H, t, J = 5 Hz), 5
3
.00 (2H, t, J = 5 Hz), 6.82 (IH, dd, J = 2, 9 Hz), 6.90 (IH, d, J = 2 Hz), 7.25-7.31 ( 2H, dd, J = 3, 6 Hz), 7.49 (IH, d, J = 9 Hz), 7.61 (2H, brs).
13C-NMR (75.45 MHz, CDCl ) δ c :—4.4, 18.3, 25.7, 47.2, 62.1, 100.7, 118.2 (2C),
3
119.7 (2C), 123.8 (2C), 136.5, 136.6 (2C), 143.1 (2C), 143.3, 153.7.
MS (EI) m/z : 408 (M+,100).
HRMS Calcd for C H N O Si : 408.1982; Found: 408.1994. [0128] 実施例 16 :化合物 20の合成
窒素気流下、化合物 19 (45.0 mg, 0.110 mmol)の無水 THF (1.4 mL)溶液に、室温 下、トリフエ-ルホスフィン（43.0 mg, 0.165 mmol)を加えた。氷冷下、ジ- tert-ブチル ァゾジカルボキシラート（38.0 mg, 0.165 mmol)を加え、同条件下 1時間攪拌した。酢 酸ェチルで希釈後、水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を 減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ク ロロホルム）により精製し、化合物 20 (41.0 mg, 95%)を得た。
化合物 20 : 白色固体.
mp >300°C.
IR v (KBr)： 3060, 2928, 2892, 2856, 1624, 1600 cm"1.
'H-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ： 0.24 (6H, s), 1.02 (9H, s), 4.56-4.67 (4H, m), 6.83
3
(1H, d, J = 2 Hz), 6.90 (1H, dd, J = 2, 9 Hz), 7.31-7.44 (3H, m), 7.73 (1H, d, J = 9 Hz) 7.87-7.92 (1H, m).
13C-NMR (75.45 MHz, CDC1 ) δ c :—4.2, 18.3, 25.8, 40.6, 40.7, 99.7 (2C), 109.3 (
3
2C), 117.7 (2C), 120.7, 121.3, 123.4, 124.2, 133.7 (2C), 134.6, 153.5.
MS (FAB) m/z : 391 (M+H+).
HRMS Calcd for C H N OSi : 391.1954. Found : 391.1949.
22 27 4
[0129] 実施例 17 :化合物 21及び 22の合成
化合物 12及び化合物 13の合成と同様の操作により、化合物 20 (40.0 mg, 0.102 mm ol)を用い、 - 10°C下 2時間攪拌し、化合物 21 (26.7 mg, 47%)及び化合物 22 (28.3 mg , 50%)を得た。
化合物 21 : 白色固体.
mp 245-249°C.
IR v (KBr)： 2927, 1605, 1547, 1471 cm"1.
1H-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ： 0.29 (6H, s), 1.04 (9H, s), 4.61 (3H, s), 4.89 (2H, t
3
, J = 6 Hz), 5.17 (2H, t, J = 6 Hz), 6.95 (1H, d, J = 2 Hz), 7.00 (1H, dd, J = 2, 9 Hz ), 7.69-7.78 (4H, m), 8.04 (1H, d, J = 7 Hz).
13C-NMR (67.80 MHz, CD OD) δ c : -4.4, 19.0, 26.0, 33.7, 42.2, 43.2, 101.4, 113. 6, 113.9, 120.7, 122.8, 128.5, 128.6, 131.9, 134.0, 135.6, 136.1, 138.9, 140.3, 156. 6.
MS (FAB) m/z: 405 (M
HRMS Calcd for C H N OSi: 405.2211. Found: 405.2111.
23 29 4
化合物 22 : 白色固体.
mp 239-241°C.
IR v (KBr)： 2946, 1625, 1551, 1504, 1474 cm"1.
'H-NMR (300 MHz, CDCl ) δ： 0.30 (6H, s), 1.02 (9H, s), 4.61 (3H, s), 4.99 (2H, t
3
, J = 5 Hz), 5.09 (2H, t, J = 5 Hz), 7.19 (IH, dd, J = 2, 9 Hz), 7.33 (IH, d, J = 2 Hz
), 7.42-7.61 (3H, m), 7.62 (IH, d, J = 9 Hz), 7.90 (IH, d, J = 8 Hz).
13C-NMR (67.80 MHz, CD OD) δ c:—4.6, 19.1, 26.0, 34.0, 41.4, 43.3, 103.9, 112.
3
1, 115.2, 122.2, 123.1, 125.9, 127.9, 129.3, 133.4, 135.2, 136.7, 138.8, 145.2, 157. 6.
MS (FAB) m/z: 405 (M^.
HRMS Calcd for C H N OSi: 405.2211. Found: 405.2128.
23 29 4
[0130] 実施例 18 :化合物 3の合成
化合物 1の合成と同様の操作により、化合物 21 (15.0 mg, 0.032 mmol)を用い、氷 冷下 1時間攪拌し、化合物 3 (7.0 mg, 65%)を得た。
化合物 3 :黄色粉末.
mp 196-203°C.
IR v (KBr)： 3368, 1595 cm"1.
1H-NMR (270 MHz, CD OD) δ： 4.52 (3H, s), 4.69 (2H, t, J = 6 Hz), 4.91 (2H, t, J
3
= 6 Hz), 6.65 (IH, d, J = 2 Hz), 6.77 (IH, dd, J = 2, 9 Hz), 7.46 (IH, d, J = 9 Hz), 7.70-7.75 (2H, m), 7.92-7.96 (2H, m).
MS (FAB) m/z: 291 (M+H+).
HRMS Calcd for C H N O : 291.1246. Found: 291.1245.
17 15 4
[0131] 実施例 19 :化合物 4の合成
化合物 1の合成と同様の操作により、化合物 22 (11.0 mg, 0.027 mmol)を用い、氷 冷下 30分攪拌し、化合物 4 (5.5 mg, 70%)を得た。
化合物 4:黄色粉末.
mp 255-260°C.
IR v (KBr)： 1609, 1441 cm"1.
1H-NMR (300 MHz, DMSO) δ： 4.36 (3H, s), 4.68 (2H, t, J = 5 Hz), 4.78 (2H, t, J = 5 Hz), 6.30 (IH, brs), 6.59 (IH, d, J = 9 Hz), 7.36-7.49 (3H, m), 7.80 (IH, d, J = 8 Hz), 7.85 (IH, d, J = 8 Hz).
[0132] 試験例 1 :蛍光特性の評価（1)
蛍光スペクトルは、蛍光分光光度計 RF-5300PC (島津製作所製)を用い、石英セル (10 X 10mm)中、室温で測定を行った。測定に当たっては、まず吸収スペクトルを測 定し、極大吸収から励起波長を求め、得られた励起波長を基に蛍光スペクトルを測 し 7こ。
化合物 1〜4の蛍光の測定結果を表 1に示す。
[0133] [表 1]
Figure imgf000047_0001
[0134] 以上より、本発明の化合物は、スト一タスシフトが大きぐ特に水中でより大きな値を 示すことがわかった。
[0135] 試験例 2 :蛍光特性の評価 (2)
種々の割合の水—メタノール混合溶液 (v/v%)を調製し、水の割合の変化による 化合物 3の蛍光の変化を調べた。化合物 3の濃度は全て 48. 4 (nM)であり、励起波 長は 383 (nm)にて測定した。測定結果を表 2に示す。
[0136] [表 2] 水の割合 蛍光強度 蛍光強度
(4 5 0 η τη) (5 5 5 n mj
0 9 9 5 8 2
> 1 7 64 8 9
2 6 7 1 1 1 1
4 4 94 1 3 7
6 3 64 1 5 0
8 2 8 0 1 5 5
1 0 2 2 8 1 64
[0137] 以上のように、水 メタノール混合溶液 (vZv%)中の水の割合が増加するに従つ て、 450nmにおける蛍光強度が減少し、 555nmにおける蛍光強度が増加し、蛍光 の色が青色から黄色へと変化する。
[0138] 試験例 3:蛍光特性の評価 (3)
蛍光量子収率（Φ)の決定
硫酸キニーネを標準物質（ Φ = 0.54 in 1.0 N H SO aq)に用い、以下の式により相 st 2 4
対蛍光量子収率（Φ )を算出した [参考文献: Demas, J. Ν,; Crosby, G. A. J. Phys. C hem.1997, 75, 991;木下一彦，御橋廣眞， "蛍光測定"，学会出版センター， 2002]。 φ =φ -(FA / FA )·(Α /Α)·(η2/η 2)
FA：スペクトルの積分面積
A：励起波長での試料の吸光度
n：溶媒の屈折率
添字の Xと stはそれぞれ未知試料と標準物質を意味する。結果を表 3に示す。
[0139] [表 3]
Figure imgf000048_0001
[0140] 化合物 3のスト一タスシフトは、水中で 162nmと大きな値を示した。また、蛍光量子収 率（Φ )は水中で 0.15、 DMSO中で 0.98と非常に高い値が得られた。 産業上の利用可能性
本発明は、微量な生体成分や環境物質などを高感度に検出することが可能な蛍光 物質であり、蛍光標識分子、蛍光指示薬、環境物質又は生体由来分子の測定方法 、細胞内分子イメージング方法などとして有用である。
本出願は、日本で出願された特願 2006— 035860 (出願日： 2006年 2月 13日）を 基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲
一般式 (1)、 （11)、 （I 1)又は (Π— 1)で表される化合物。
Figure imgf000050_0001
(I) (II)
Figure imgf000050_0002
中、
環 Aは、ハロゲン原子、 C アルキル基、 C アルケニル基、 C アルキニル基、 C
1-6 2-6 2-6
ァリール基、 c ァラルキル基、 C アルコキシ基、ァシルォキシ基、シァノ基、
6-14 7-16 1-6
ニトロ基、カルボキシル基、 C アルコキシ カルボニル基、 C ァリールォキシ
1 -6 6-14
カルボニル基、 C ァラルキルォキシ カルボニル基、力ルバモイル基及び置換力
7-16
ルバモイル基力 選ばれる置換基でそれぞれ置換されて 、てもよ 、、ァリール環又 は芳香族複素環であり；
R1は、 C アルキル基、 C ァルケ-ル基、 C アルキ-ル基、 C ァラルキル基
1—6 2—6 2—6 7—16
又はリンカ一であり；
R2及び R3は、同一又は異なってそれぞれ、ハロゲン原子、水酸基、 C アルコキシ
1-6
基、ァシルォキシ基、アミノ基、力ルバモイル基、置換力ルバモイル基、カルボキシル 基、 C アルコキシ カルボ-ル基、 C ァリールォキシ カルボ-ル基及び C
1-6 6- 14 7-1 ァラルキルォキシ—カルボ-ル基カゝら選ばれる置換基でそれぞれ置換されていても
6
よ！/、、 C アルキル基、 C アルケニル基、 C アルキニル基又は C ァラルキル
1—6 2-6 2-6 7-16 基であるか、或いは R2及び R3が結合して、 5〜9員の環を形成してもよく；
R4は、ハロゲン原子、 C アルキル基、 C ァルケ-ル基、 C アルキ-ル基、 C ァリール基、 c ァラルキル基、 C アルコキシ基、ァシルォキシ基、シァノ基、二
14 7- 16 1 -6
トロ基、カルボキシル基、 c アルコキシ カルボ-ル基、 C ァリールォキシ一力
1 -6 6- 14
ルボニル基、 C ァラルキルォキシ カルボ-ル基、力ルバモイル基又は置換カル
7- 16
バモイル基であり；
1は、 0又は 1〜3の整数であり；
R5は、 C アルキル基、 C アルキル カルボ-ル基、置換べンジル基、置換シリ
1 -6 1 -6
ル基、ホスホノォキシ基又は置換ホスホノォキシ基であり；
ΒΊま、対ァ-オンである。 ]
[2] 環 Aが、 C アルコキシ基、ァシルォキシ基、シァノ基及び-トロ基力 選ばれる置
1 -6
換基でそれぞれ置換されていてもよい、ァリール環又は芳香族複素環であり；
R1が、 C アルキル基又はリンカ一であり；
1 -6
R2及び R3が、同一又は異なってそれぞれ、 C アルコキシ基、ァシルォキシ基及び
1 -6
ァミノ基から選ばれる置換基でそれぞれ置換されて 、てもよ 、、 C
1 -6アルキル基又は ァラルキル基であるカゝ、或いは R2及び R3が結合して、 5〜6員の環を形成してもよく； R4が、 C アルキル基又は C アルコキシ基であり；
1 -6 1 -6
1が、 0又は 1であり；
R5が、 C アルキル カルボ-ル基、ホスホノォキシ基又は置換ホスホノォキシ基で
1 -6
あり；
B一が、トリフルォロメタンスルホン酸イオン又は塩素イオンである、請求項 1に記載の 化合物。
[3] 請求項 1又は 2に記載の化合物と、核酸、ペプチド、糖及び脂質力 なる群より選ば れる生体由来分子とを含む、蛍光標識分子。
[4] ドナー蛍光分子として請求項 1又は 2に記載の化合物と、核酸、ペプチド、糖及び 脂質からなる群より選ばれる生体由来分子と、ァクセプター蛍光分子とを含む、蛍光 共鳴エネルギートランスファーを利用する蛍光指示薬。
[5] 担体に結合されている、請求項 3に記載の蛍光標識分子。
[6] 担体に結合されている、請求項 4に記載の蛍光指示薬。
[7] 請求項 1又は 2に記載の化合物を蛍光標識として使用することを特徴とする、環境 物質又は生体由来分子の測定方法。
[8] 請求項 1又は 2に記載の化合物を蛍光標識として使用することを特徴とする、細胞 内分子イメージング方法。
[9] 請求項 3に記載の蛍光標識分子を使用することを特徴とする、生体由来分子の測 定方法。
[10] 請求項 4に記載の蛍光指示薬を使用することを特徴とする、生体由来分子の測定 方法。
PCT/JP2007/052529 2006-02-13 2007-02-13 ベンズイミダゾール系骨格を有する新規蛍光物質及びその用途 WO2007094325A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008500505A JPWO2007094325A1 (ja) 2006-02-13 2007-02-13 ベンズイミダゾール系骨格を有する新規蛍光物質及びその用途

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006035860 2006-02-13
JP2006-035860 2006-02-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007094325A1 true WO2007094325A1 (ja) 2007-08-23

Family

ID=38371505

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2007/052529 WO2007094325A1 (ja) 2006-02-13 2007-02-13 ベンズイミダゾール系骨格を有する新規蛍光物質及びその用途

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2007094325A1 (ja)
WO (1) WO2007094325A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5657851A (en) * 1979-10-02 1981-05-20 Hoechst Ag Quarternary bridged benzimidazolyllbenzimidazole* its manufacture and use
JP2004317398A (ja) * 2003-04-18 2004-11-11 Amersham Bioscience Kk Kk 質量分析法
JP2005227440A (ja) * 2004-02-12 2005-08-25 Konica Minolta Medical & Graphic Inc 光熱写真画像形成材料

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5657851A (en) * 1979-10-02 1981-05-20 Hoechst Ag Quarternary bridged benzimidazolyllbenzimidazole* its manufacture and use
JP2004317398A (ja) * 2003-04-18 2004-11-11 Amersham Bioscience Kk Kk 質量分析法
JP2005227440A (ja) * 2004-02-12 2005-08-25 Konica Minolta Medical & Graphic Inc 光熱写真画像形成材料

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2007094325A1 (ja) 2009-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6351511B2 (ja) 非対称Ｓｉローダミン及びロドールの合成
JP5526124B2 (ja) 近赤外蛍光化合物
Zhang et al. Targetable N-annulated perylene-based colorimetric and ratiometric near-infrared fluorescent probes for the selective detection of hydrogen sulfide in mitochondria, lysosomes, and serum
JP5733760B2 (ja) 蛍光発生分子および標的核酸検出方法
Roubinet et al. New insights into the water-solubilization of thiol-sensitive fluorogenic probes based on long-wavelength 7-hydroxycoumarin scaffolds
JP5419278B2 (ja) 蛍光発生分子
CN1939978B (zh) 水溶性荧光菁染料
US20150079625A1 (en) Naphthalene-based two-photon fluorescent probes, preparation method and use thereof
JP5068535B2 (ja) 蛍光ラベル化剤
JP7481122B2 (ja) 蛍光色素及びその利用
EP2397464B1 (en) Synthesis of novel azo-dyes and their use in oligonucleotide synthesis
CN111393401A (zh) 一种基于罗丹明衍生物检测心肌黄酶的荧光探针分子及制备方法和用途
JP2009014369A (ja) 生体分子標識用蛍光試薬
WO2007094325A1 (ja) ベンズイミダゾール系骨格を有する新規蛍光物質及びその用途
CN104478984A (zh) 两亲性Tb(III)配合物及其制备方法以及螺旋状荧光纳米纤维的制备方法和应用
CN110669350B (zh) 一种哌啶基bodipy类红光荧光染料及其制备方法和应用
JPWO2018043579A1 (ja) ホスファローダミン化合物若しくはその塩、並びにそれを用いた蛍光色素
JP4929461B2 (ja) 高蛍光量子収率型疎水性蛍光プローブ、それを用いる生体高分子検出法ならびに生体高分子間相互作用検出法
US8084627B2 (en) Hydroxymethyl fluorescein derivatives for use as biological markers and dyes
JP4545370B2 (ja) キラルセンサー
US20220412983A1 (en) Luminescent compounds
Kasiotis et al. 2-Pyridin-2-yl-1H-indole derivatives: Synthesis, estrogen receptor binding affinity, and photophysical properties
KR101130128B1 (ko) α-아미노산 음이온 검출용 형광 트리플루오로아세토페논계유도체 화합물
CN116239482A (zh) 一种近红外型荧光探针及其在制备阿尔兹海默症早期诊断试剂中的应用
CN115873011A (zh) 一种癌细胞靶向的响应线粒体内硝基还原酶的荧光探针及其制备方法和用途

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008500505

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 07714111

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1