WO2007023875A1 - ラミニン５を利用した間葉系幹細胞の培養技術 - Google Patents

ラミニン５を利用した間葉系幹細胞の培養技術 Download PDF

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WO2007023875A1
WO2007023875A1 PCT/JP2006/316545 JP2006316545W WO2007023875A1 WO 2007023875 A1 WO2007023875 A1 WO 2007023875A1 JP 2006316545 W JP2006316545 W JP 2006316545W WO 2007023875 A1 WO2007023875 A1 WO 2007023875A1
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laminin
mesenchymal stem
chain
cells
stem cells
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PCT/JP2006/316545
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Inventor
Kaoru Miyazaki
Junko Hashimoto
Yoshinobu Kariya
Original Assignee
Oriental Yeast Co., Ltd.
Yokohama City University
Kihara Memorial Yokohama Foundation For The Advancement Of Life Sciences
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    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources

Definitions

  • the present invention relates to a technique for growing mesenchymal stem cells using laminin 5.
  • Bone marrow mesenchymal stem cells have the ability to differentiate into cells such as bone, cartilage, fat, and muscle, and are expected to be applied to regenerative medicine such as bone damage, osteoarthritis, osteoporosis, and myopathy. Are you waiting? ). It has also become clear that mesenchymal stem cells are effective in preventing the side effects of bone marrow transplantation (graft versus host disease). Thus, mesenchymal stem cells are the most similar stem cells along with 51 ⁇ 2 blood stem cells and have already been partially clinically applied (Non-patent Document 1)
  • FGF-2 Non-patent document 2
  • HB-EGF Non-patent document 3
  • CYR61 / CCN1 Non-patent document 4
  • Patent Document 1 JP 2004-089095 A-Patent Document 2: JP 2004-242619 A
  • Non-Patent Literature 1 Nikkei Biobusiness Nikkei Business Publications, July 2004, pages 16-17: Patent Literature 2: Biochemical and Biophysical Research ommunications 288, 413-419
  • Non-Patent Document 3 Blood 106, 59-66 (2005)
  • Non-Patent Document '4 Protein Expression & Purification 42, 219-225 (2005)
  • An object of the present invention is to provide a technique for efficiently proliferating mesenchymal stem cells.
  • laminin 5 which is one of basement membrane cell adhesion molecules can promote proliferation of mesenchymal stem cells while maintaining the ability to separate them.
  • the present invention has been completed.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a method for isolating mesenchymal stem cells comprising culturing mesenchymal stem cells by the method according to any one of (2) to (4).
  • the medium for culturing mesenchymal stem cells the medium containing laminin 5 having a concentration of 0.01 g / ml or more.
  • the medium according to (6) which is a serum-free medium.
  • a container or sheet for culturing mesenchymal stem cells which is treated with a laminin 5 solution having a concentration of 0.05 / zg / ml or more, or deposited on laminin 5 producing cells.
  • mesenchymal stem cells can be efficiently proliferated.
  • FIG. 1 Shows the basic structure of laminin.
  • FIG. 2 shows electrophoresis patterns of purified laminin 5A and laminin 5B.
  • 5A-HEK cell line Laminin 5A and laminin purified from the culture supernatant of LN5B-HEK cells SDS-PAG on a 4.0-7.5% gradient gel under non-reducing conditions (-ME) or reducing conditions (+ ME)
  • CBB CBB Separated with E and stained with dye (CBB).
  • the left two lanes show each laminin 5 trimer and its molecular size (kDa), and the right two lanes show each subunit (chain) and molecular size.
  • FIG. 3 shows the results of proliferation activity on mesenchymal stem cells.
  • FIG. 4 shows the results (A) and cell morphology (B) of proliferation activity against mesenchymal stem cells cultured in serum medium with or without 5% Panexin diet.
  • FIG. 6 Glycosaminodarican accumulation when mesenchymal stem cells cultured for 8 days in the absence (Control) or presence (LN5) of laminin 5 were cultured in chondrogenic medium for 3 weeks.
  • a state (A) and a state (B) of accumulation of type II collagen are shown.
  • Also shown are alkaline phosphatase expression (C) and osteopontin expression (D; OPN) when each cell is cultured in osteoblast differentiation medium for 3 weeks.
  • FIG. 7A shows the results of the adhesion activity on mesenchymal stem cells.
  • FIG. 7B shows the results of extension activity on mesenchymal stem cells.
  • FIG. 8 shows the effect of anti-integrin-inhibiting antibodies on the activity of adhesion to mesenchymal stem cells.
  • the present invention is a drug for promoting at least one activity selected from the group consisting of proliferation activity, adhesion activity and spreading activity of mesenchymal stem cells, which contains laminin 5 as an active ingredient.
  • Mesenchymal stem cells are stem cells that exist in mammalian bone marrow and have the ability to differentiate into various cells. Differentiates into bone, cartilage, adipocytes, etc. as well as cardiomyocytes and nerve cells It is known.
  • the origin of the mesenchymal stem cells is not particularly limited, and examples include those derived from mammals such as humans, pigs, monkeys, chimpanzees, inu, ushi, rabbits, rats, mice, birds, reptiles, etc. it can. For use in regenerative medicine, those derived from humans are preferred.
  • mesenchymal stem cells can be collected from bone marrow or periosteum by a known method, they may be collected from femur, tibia, and pelvis (iliac bone).
  • human mesenchymal stem cells are commercially available (PT-2501 (Cambrex)).
  • Laminin is an important component of the basement membrane and regulates cell function by interacting with cell surface receptors.
  • a laminin molecule is a heterotrimeric protein in which three chains of ⁇ ,, and ⁇ are associated with disulfide bonds, and has a characteristic cross structure.
  • Five ⁇ chains, three ⁇ strands, the 15 kinds of ⁇ isoforms by different combinations of three ⁇ chains have been identified ( Figure 1). Each isoform represents a different tissue distribution and is thought to play a different role, but the details are not clear.
  • Laminin molecules associate with each other at the three-stranded amino ( ⁇ ) terminal part (short arm), and associate with other Matritas molecules to construct a basement membrane.
  • ⁇ three-stranded amino
  • Matritas molecules associate with other Matritas molecules to construct a basement membrane.
  • Laminin 5 is a 3-chain, beta 3 chain, I 2 chain force becomes laminin, extracellular matrix molecules epidermal cells and cancer cells produced as (Radoshin, Kalinin, Epirigurin, also referred to as Naisein) I found it.
  • This molecule plays a central role in the binding of the epidermis to the dermis and is the force that binds preferentially to integrin a 3 j3 1 in most cells.
  • integrin 6 iS 1, a'6 j3 Combines with 4.
  • Laminin 5 contains a 3 chain that is short chain ( ⁇ 3 ⁇ ) is called laminin 5 (or laminin 5A), and a 3 chain is long chain ( ⁇ 3B) It is called laminin 5B ( Figure 1).
  • the 3A chain has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, or an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added or substituted in this sequence
  • the a 3B chain is 'Has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added or substituted in this sequence
  • the ⁇ 3 chain is SEQ ID NO: 4
  • the y2 chain is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6. Or one or more amino acid residues in this sequence are deleted, added or substituted.
  • Laminin 5 used in the present invention may be one in which G4 and G5 domains are cleaved by a proteolytic enzyme immediately after being secreted. a 3A chain force G4 and G5 domains cleaved are called ⁇ 3 ⁇ # 3 chain, and G3 and G5 domains cleaved from ⁇ 3 ⁇ chain are called ⁇ 3 ⁇ # 3 chain.
  • the laminin 5 used in the present invention is ⁇ ; 3 ⁇ # 3 chain, j3 3 It may be a laminin 5A protein composed of subunits of chain and ⁇ 2 chain, and a laminin 5B protein composed of subunits of ⁇ 3 ⁇ # 3 chain, j3 3 chain, and ⁇ 2 chain.
  • the a3A # 3 chain has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, or an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added or substituted in this sequence.
  • ⁇ ; 3 ⁇ # 3 chain has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, or an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added or substituted in this sequence,
  • i3 The 3 chain has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, or the amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added or substituted in this sequence
  • the y 2 chain is SEQ ID NO: It has the amino acid sequence shown by 6, or an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added or substituted in this sequence.
  • FIG. 1 shows the structures of laminin 5A (LN5A) protein and lamun 5B (LN5B) protein.
  • Laminin 5A is composed of a 3A chain, ⁇ 3 chain, and ⁇ 2 chain
  • laminin 5 ⁇ is composed of a 3B chain, ⁇ 3 chain, and ⁇ 2 chain force.
  • the ⁇ 3 ⁇ chain is about twice as large as the ⁇ 3 ⁇ chain
  • the structure of the ⁇ 3 ⁇ chain about half the C-terminal side is the same as the ⁇ 3 ⁇ chain.
  • laminin 5A or laminin 5B When laminin 5A or laminin 5B is secreted, most molecules are immediately cleaved between G3 and G4 by endogenous proteases. Therefore, laminin 5A or laminin 5B lacking G4 and G5 is secreted into the culture medium. In addition, partial cleavage also occurs at the heel end of the ⁇ 3 ⁇ chain, ⁇ 3 ⁇ chain, and ⁇ 2 chain.
  • the laminin 5 protein (including laminin 5 and 5) used in the present invention is a human or V strain that secretes these laminin 5 or an animal cell culture supernatant or a natural laminin 5 purified therefrom. It may be. However, these laminin 5 can be produced in large quantities and effectively as recombinant proteins by expressing each subunit using recombinant DNA technology known in the art.
  • the cDNA encoding each subunit of laminin 5 ⁇ is designed based on the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 9, 3 or 5, and primers are designed, and an appropriate cDNA library is used as a template. It can be produced by amplifying the target sequence by polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the cDNA encoding each subunit of laminin 5B is • Primers are designed based on the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3 or 5 and produced by amplifying the target sequence by polymerase chain reaction (PCR) using an appropriate cDNA library as a template. Can do.
  • PCR techniques are well known in the art and are described, for example, in "PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications", Academic Press, Michael, et al., Eds., 1990 ⁇ . Yes. .
  • a DNA encoding each laminin 5 ⁇ or 5 ⁇ strand gene is incorporated into an appropriate expression vector and introduced into either a eukaryotic or prokaryotic cell to express the respective strand.
  • a desired protein can be obtained.
  • host cells that can be used to express the protein of the present invention include, but are not limited to, prokaryotic hosts such as E. coli and Bacillus subtilis, and eukaryotics such as yeast, fungi, insect cells and mammalian cells.
  • a biological host may be mentioned.
  • Mammalian cells useful as hosts include HeLa cells, cells derived from fibroblasts such as VERO or CHO-Kl, cells derived from lymphocytes, and derivatives thereof.
  • Preferred mammalian host cells include SP2 / 0 and J55 8L, and neuroblastoma cell lines such as IMR332.
  • plant cells and insect cells such as Drosophila cells can also be used as hosts.
  • a vector refers to a single-stranded or double-stranded nucleic acid molecule that can be transfected into a cell and can replicate in or independently of the cell genome.
  • the expression vector contains a promoter region that drives DNA expression, and further includes transcription and translation control sequences, such as TATA box, cabling sequence, CAAT arrangement (J, 3, non-coding region, enhancer, etc.).
  • promoters include the bla promoter, cat promoter, and lacZ promoter when used in prokaryotic hosts, and the promoter of the mouse metamouthonein I gene sequence when used in eukaryotic hosts. 1.
  • vectors include, but are not limited to, pBR322, pUC118, pUC119, e gtlO, L gtl l, pMAM-neo, pKRC, BPV, ⁇ Chi-char, SV40, 2-micron etc. are included.
  • the expression vector is 1 or so that a host cell containing it can be selected. It is preferable to have more markers.
  • markers those that give nutrition to an auxotrophic host, antibiotic resistance (for example, ampicillin, tetracycline, neomycin, hygromycin, etc.), or heavy metal resistance (for example, the same) can be used.
  • the vector can be constructed so that the protein of the present invention is secreted and expressed using a signal sequence, or the protein of the present invention is expressed in the form of a fusion protein with another protein. .
  • a fusion protein By using a fusion protein, the stability of the protein can be improved or purification can be facilitated.
  • the construction of such expression vectors is well known in the art. ,
  • DNA encoding each strand of Ramien 5A or 5B can be incorporated into one expression vector, expressed in a separate expression vector, or incorporated into separate expression vectors, and these vectors can be transferred to the same cell. You can also express it.
  • the ⁇ 3 chain,] 3 3 chain op 2 and 2 chain subunits are both very large polypeptides, so the latter method is preferably used.
  • a vector constructed to express laminin 5 ⁇ or 5 ⁇ can be obtained by transformation, transformation, conformation, protoplast fusion, electoral positioning, particle gun technology, calcium phosphate precipitation, direct microinjection, etc. Can be introduced into a suitable host cell. Cells containing the vector can be grown in an appropriate medium to produce the protein of the present invention, and the desired recombinant protein can be collected and purified by obtaining the cell or medium force. Thus, laminin 5 ⁇ or laminin 5 ⁇ protein can be obtained. it can. Purification can be performed using size exclusion chromatography, HPLC, ion exchange chromatography, immunoaffinity chromatography, and the like.
  • Each chain of laminin 5A or 5B may have an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added or substituted in the amino acid sequence represented by the corresponding SEQ ID NO. .
  • Such a protein homologous to a natural protein is also used in the present invention. Can be used.
  • substitutions include replacing an amino acid with a residue having similar physicochemical properties, e.g., one aliphatic residue (Ile, Val, Leu or Ala) with another, or basic Includes substitution between residues Lys and Arg, acidic residues Glu and Asp, amide residues Gin and Asn, hydroxyl residues Ser and Tyr, or aromatic residues Phe and Tyr.
  • Ramun 5 used in the present invention has an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 (at least 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90 with J) %, 95%, 9 ⁇ % or 99% identity, and promotes at least one activity selected from the group consisting of cell proliferation activity, adhesion activity and spreading activity of mesenchymal stem cells. Identity may be calculated by dividing the number of identical residues by the total number of residues in a known sequence or domain of a known sequence and multiplying by 100. Standard Some computer programs for determining sequence identity using various parameters such as Gapped BLAST or PSI—BLAST (Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Res.
  • laminin 5A ⁇ 3 ⁇ and laminin 5 ⁇ ⁇ 3 ⁇ chains have the ability to cleave and remove G4 and G5 by proteases, as long as they have activity as laminin 5 and 5 respectively. Regardless of cutting type, it can be used in the present invention.
  • a protein having the same activity as human laminin 5 or 5 derived from an organism other than human species may be used.
  • the gene encoding such a protein is SEQ ID NO: 1 (in the case of a protein having the same activity as laminin 5 ⁇ ) or SEQ ID NO: 9 (in the case of a protein having the same activity as laminin 5 ⁇ ), 3, 5 or 7
  • a polynucleotide having the sequence shown in FIG. 5 or a fragment thereof as a probe or primer It can be easily isolated using techniques such as Chillon or PCR.
  • the homologous gene obtained in this way is at least 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, and still more preferably with respect to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 9, 9, 5 or 7. Is 80% or more, particularly preferably 90% or more, and most preferably 95 ° /. Has the above homology.
  • the homologous gene can be hybridized with the gene having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 9, 3, 5 or 7 under stringent high-precipitation conditions.
  • hybridize means binding to another DNA or RNA molecule by hydrogen bonding interaction in DNA or a corresponding RNA force solution or on a solid support.
  • the strength of such interaction can be evaluated by changing the stringency of the high pre-crystallization condition.
  • various stringency high-prisidization conditions can be used, and stringency can be adjusted by changing the salt concentration or denaturant concentration. Can do.
  • stringency regulation methods are well known in the art, eg, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2nd Edition. Old Spring Harbor Laboratory, Sambrook, Fritsch, & Maniatis, eds. 1 989).
  • Stringent high-pridition conditions refer to conditions of 42 ° C in 7 OO mM NaCl in the presence of 50% formamide or equivalent.
  • An example of stringent hybridization conditions is 50% formamide, 5XSSC, 50 mM NaHPO, pH 6.
  • Laminin 5 can promote at least one activity selected from the group consisting of proliferation activity, adhesion activity and spreading activity of mesenchymal stem cells.
  • the cell growth promoting activity of laminin 5 can be assessed by adding laminin 5 to the cell culture medium and measuring the cell growth rate compared to the control (no laminin 5 added). it can. It can be determined that laminin 5 promotes cell growth activity when the cell growth rate is increased compared to the control. You can.
  • Cell adhesion-promoting activity can be assessed by coating the plate with Ramun 5 and inoculating the plate with cells and incubating for a predetermined time, and then measuring the number of cells that have adhered.
  • laminin 5 promotes cell adhesion activity when the number of adherent cells is increased and decreased compared to the control (without laminin 5 added).
  • the cell spreading promoting activity can be assessed by coating laminin 5 on a plate, seeding cells on this plate, incubating for a predetermined time, and then observing the morphology of the adhered cells. If cell flattening has occurred, it can be determined that cell spreading activity is promoted.
  • Laminin 5 In order to promote laminin 5 and promote at least one activity selected from the group consisting of proliferation activity, adhesion activity and spreading activity of mesenchymal stem cells, It may be added to the solution, or applied or fixed on a culture vessel or culture sheet such as a culture plate.
  • Laminin 5 added to the culture medium may be either a recombinant type or a natural type, and may be purified or unpurified.
  • Laminin 5 min conditioned medium conditioned medium can also be used as laminin 5 solution.
  • Laminin 5 fixation can be performed by directly treating these various laminin 5 containing solutions in a culture vessel or culture sheet.
  • laminin 5 producing cells deposited on a culture vessel or culture sheet may be used.
  • laminin 5 has both cell adhesion activity and growth promoting activity as a growth factor, it is effective as a growth promoting agent for mesenchymal stem cells. Therefore, it can be used for culturing mesenchymal stem cells.
  • the concentration of laminin 5 in the culture solution is not particularly limited, but a concentration of 0.01 / ig / ml or more is usually appropriate, and 0.1 to 1 ⁇ g / ml The optimal growth effect can be obtained at a concentration of.
  • Other components in the culture solution are not particularly limited as long as they are suitable for culturing mesenchymal stem cells.
  • fixed laminin 5 is saturated with laminin 5 producing cells (eg, LN5-HEK cells, LN5B-HEK cells, epidermis cells, squamous cell carcinoma cells, gastric cancer cells, etc.) on an appropriate culture vessel or sheet.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • F12 DMEM / F12
  • mesenchymal stem cells can be grown in a serum-containing medium or a serum-free medium.
  • mesenchymal stem cells were seeded at a density of 5,000 to 6,000 fine • cells / cm 2 laminin 5 added growth medium and cultured under 37 D C, 5% CO, saturated in the normal 5-6 day . ',
  • the subculture method is classified into a monolayer stationary culture method, a roller bottle culture method, a stirring culture method, a carrier culture method, and the like, but any culture method may be used in the present invention.
  • the amount of laminin 5 is not particularly limited, and is appropriately determined depending on the size of the incubator or culture sheet. Adjust it. Usually, good growth is obtained when treated with a laminin 5 solution of 0.05 / ig / ml or more, preferably 0.5-3 ⁇ g / ml.
  • Laminin 5 is applied or fixed to a culture vessel or culture sheet at a concentration of 5 ng m 2 or more, preferably applied or fixed to a culture vessel or culture sheet at a concentration of 50 to 300 ng / cm 2.
  • a basic medium such as Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) or DMEM / F12 can be used.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • FCS rabbit fetal serum
  • human serum horse serum
  • antibiotics eg, penicin, streptomycin, etc.
  • growth factors eg, FGF-2, HB-EGF, CYR61 / CCN1
  • mesenchymal stem cells can be grown in a serum-containing medium or a serum-free medium.
  • the mesenchymal stem cells on plates coated with laminin-5 were seeded at a density of m 2 N 5,000 to 6,000 cells, under 37 ° C, 5% CO in
  • laminin 5 Since laminin 5 effectively adheres mesenchymal stem cells, it can also be used to isolate and prepare mesenchymal stem cells such as bone marrow. For example, cultivating laminin 5 coated (immobilized) A cell mixture containing mesenchymal stem cells such as bone marrow is seeded on a culture vessel or culture sheet and incubated for 5 minutes to 2 hours. The mesenchymal stem cells that have adhered to the plate are separated from other cells by removing cells that have not yet adhered. Mesenchymal stem cells grown on this plate can be recovered by ordinary trypsin treatment.
  • Laminin 5A was prepared by the method already reported (Kariya, K. et al., J. Biochem., 132 (2002), 607-612). Proteins contained in the serum-free culture supernatant collected from human fetal kidney cell line ⁇ 293 (LN5-HEK) into which ⁇ 3 ⁇ , 3, or ⁇ 2 chain cDNA has been introduced are concentrated by ammonium sulfate precipitation, and then a Sepharose 4B column (Amersham) The product was fractionated by gel filtration.
  • This laminin 5A-containing fraction is passed through a gelatin column to remove fipronectin, and further passed through an affinity column to which an anti-laminin ⁇ 3 chain monoclonal antibody (LSa3) is immobilized, to adsorb lamiene 5A. Eluted. Purified lamien 5A was confirmed to be almost pure by reducing SDS-P AGE using 6% gel and immunoblotting ( Figure 2). Immunoblotting was performed using a 3 chain antibody (LS ⁇ 3, self-made), ⁇ 3 chain antibody (Kalinip Bl, Transduction Labora tories), and ⁇ 2 chain antibody (D4B5, self-made).
  • laminin 5B The preparation and purification of laminin 5B was performed using the culture supernatant collected from the human fetal kidney cell line HEK293 (LN5B-HEK) into which cDNA of ⁇ 3 ⁇ ,] 33, ⁇ 2 chain was introduced. (Kariya, Y. et al., J. Biol. Chem., 279 (2004), 24774-24784) 0
  • the purified ⁇ 2 chain of purified laminin 5B is about half cut. It was double stranded ( Figure 2).
  • ⁇ 3 ⁇ chain is G4-G5 region Since the pre-excluded cDNA is introduced, the 335 kDa truncated version (the C3 terminal sequence of this a 3B chain # 3 is shorter than the C terminal sequence (Gln2957) generated by protease cleavage. There is also a force that is a major component) and a 145 kDa a 3B chain cleaved at the N-terminal part. This cleavage occurs between Lys (1811) and Asp (1812) (Kariya, Y. et al., J. Biol. Chem., 279 (2004), 24774-24784).
  • laminin 5 refers to lamin 5A prepared in this example unless otherwise specified.
  • hMSC Human mesenchymal stem cell
  • (A) Laminin 5 was coated on a 24 well plate as follows. 0.5 ⁇ l (0.5 g ramun 5 / well) of 1.0 ⁇ g / ml laminin 5 solution (diluted with physiological saline PBS) per well was added and left at 4 ° C. for 1 hour. After removing the solution, 0.5 ml of a 12 mg / ml urine serum albumin (BSA) solution was added and treated at room temperature for 2 hours (BSA procking). Each well was washed twice with PBS before seeding the cells. Control was treated with PBS. BSA Prokking is not always necessary for actual use of Laminin 5! /.
  • a culture medium supplemented with a commercially available serum-free additive for stem cells Panexin (PAN-biotech) was used.
  • hMS C cells were washed once with serum-free MSCBM medium (Cambrex), then suspended in serum-free M SCBM medium containing 5% Panexin and treated with no treatment or laminin 5 (0,5 g / ml) (LN5). They were seeded on the coated plates and cultured for 8 days.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • MSCBM + MSCGM maintenance medium
  • laminin 5 showed a certain growth promotion compared to serum-free MSCBM medium alone (Control), but the growth promoting activity of bFGF was more remarkable.
  • HMSC cells cultured in serum-containing maintenance medium (MSCBM + MSCGM) (Cambrex) are detached from the dish and incomplete cartilage differentiation medium (dexamethasone, ascorbate, insulin ⁇ transferrin N sodium selenite, sodium without addition of TGF- ⁇ 3) pyruvate proline ⁇ L—glut
  • incomplete cartilage differentiation medium (dexamethasone, ascorbate, insulin ⁇ transferrin N sodium selenite, sodium without addition of TGF- ⁇ 3) pyruvate proline ⁇ L—glut
  • the suspension was suspended in complete cartilage differentiation medium (Cambrex) supplemented with 10 ng / ml TGF-33.
  • the cell pellet was incubated at 37 ° C. for 24 hours or longer to form a spherical cell mass.
  • Laminin 5 (1 ⁇ g / ml) was added and cultured after the cell mass was formed. The medium was exchanged with a complete cartilage-containing medium supplemented with laminin 5 once every 2-3 days. After culturing for 3 weeks, sections were prepared, and cartilage-specific glycosaminoglycan was stained with Alcian blue, and type II collagen was stained with a specific antibody (Lab Vision).
  • laminin 5 supplemented medium LN5
  • lame complete cartilage differentiation medium Control
  • laminin 5 significantly suppressed the accumulation of glycosaminodarican (Fig. 5A) and type II collagen (Fig. 5B), and incomplete cartilage differentiation medium (TGF- ⁇ 3 (-)) without TGF-3 addition.
  • the degree of staining was shown.
  • hMSC cells were cultured on plates (LN5) coated with untreated (Control) or laminin 5 (1 ⁇ g / ml) for 8 days using the maintenance medium V. Each cell was peeled off on the plate and examined for differentiation of hMSC cells into cartilage and osteoblasts in the absence of laminin-5. In the absence of laminin 5 (Control), hMSC cells cultured in the presence (LN5) were cultured in complete chondrogenic medium (containing TGF-3) for 3 weeks. There was no difference in the accumulation of glycans (Fig.
  • Fig. 6A type II collagen
  • Fig. 6B type II collagen
  • each cell is cultured for 3 weeks in osteoblastic cell culture medium.
  • No difference was seen in the expression of alkaline phosphatase (Fig. 6C) and osteopontin (Fig. 6D; OPN).
  • laminin 5 treatment did not affect the ability of hMSC cells to separate cartilage and osteoblasts. From the above results, it was shown that laminin 5 promotes cell proliferation while maintaining the ability of hMSC cells to separate.
  • a 96-well plate was coated with 0.1 ml (0.25 IX gm 2 ) of g / ml laminin 5 (LN5) solution, and then blocked with 12 mg / ml BSA.
  • Each well was seeded with 2 ⁇ 10 4 cells / well of hMSC washed twice with serum-free DMEM medium (Nissui).
  • non-adherent cells were floated by light portex and removed from the surface of the well by percoll treatment.
  • Adherent cells were fixed with formalin, stained with Hoechst 33432, and the relative cell number was quantified.
  • a plate treated with PBS instead of Ramun solution and then Bocked with BSA was used as a control (None).
  • Lamune 5 was found to have significantly stronger adhesive activity.
  • the hMSC potent laminin 5 receptor was examined. Prior to seeding the cells onto laminin-5 (LN 5), the hMSC anti-integrin inhibitory antibody (anti-alpha 3 integrin antibody (P1B5), anti-beta 1 integrin antibody (6S6), anti-beta 4 integrin antibody (3E1), or The cells were preincubated with Chemicon; anti- ⁇ 6 integrin antibody (GoH3), Pharaiingen) for about 5 minutes, and the cell adhesion activity was measured in the same manner as in Example 3. PBS instead of laminin solution The plate treated with was used as a control (None).
  • P1B5 anti-alpha 3 integrin antibody
  • 6S6 anti-beta 1 integrin antibody
  • 3E1 anti-beta 4 integrin antibody
  • mesenchymal stem cells can be efficiently cultured.
  • Mesenchymal stem cells have the ability to dissociate into cells such as bone, cartilage, fat and muscle, and are expected to be applied to regenerative medicine for bone damage, osteoarthritis, osteoporosis, muscle disorders, etc.
  • SEQ ID NO: 1 shows the full-length base sequence of human Ramun a 3B chain.
  • SEQ ID NO: 2 shows the full-length amino acid sequence of human Ramun a 3B chain.
  • SEQ ID NO: 3 shows the full-length base sequence of human laminin
  • SEQ ID NO: 4 shows the full-length amino acid sequence of human laminin] 33 chain.
  • SEQ ID NO: 5 shows the full-length base sequence of human laminin ⁇ 2 chain.
  • SEQ ID NO: 6 shows the full-length amino acid sequence of human laminating ⁇ 2 chain.
  • SEQ ID NO: 7 shows the nucleotide sequence of human lamin a 3 ⁇ # 3 chain.
  • SEQ ID NO: 8 shows the amino acid sequence of the 7 traminin 3B # 3 chain.
  • SEQ ID NO: 9 shows the base sequence of human laminin ⁇ 3A chain.
  • SEQ ID NO: 10 shows the amino acid sequence of human laminin a 3 chain.
  • SEQ ID NO: 11 shows the nucleotide sequence of human laminin 3 ⁇ # 3 chain (human laminin ⁇ 3 ⁇ chain forces G3 and G4 are cleaved).
  • SEQ ID NO: 12 shows the amino acid sequence of human laminin ⁇ 3 ⁇ # 3 chain.

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Abstract

間葉系幹細胞の増殖活性、接着活性及び伸展活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を促進するための薬剤であって、ラミニン５を有効成分として含有する前記薬剤。間葉系幹細胞を培養する方法、間葉系幹細胞の単離方法、間葉系幹細胞を培養するための培地、容器及びシートも提供される。

Description

明 細 書
ラミニン 5を利用した間葉系幹細胞の培養技術
技術分野
[0001] 本発明は、ラミニン 5を利用して、間葉系幹細胞を増殖させる技術に関する。
背景技術
[0002] 骨髄の間葉系幹細胞は骨、軟骨、脂肪、筋肉などの細胞へ分化する能力をもって おり、骨損傷、変形性関節症、骨粗しょう症、筋障害などの再生医療への応用が期 待されてい？)。また、間葉系幹細胞が骨髄移植の副作用 (移植片対宿主病)の防止 に有効であることも明らかになつている。このように、間葉系幹細胞は 5½血系幹細胞と 並んで、最も応用に近い幹細胞であり、既に一部臨床応用されている (非特許文献 1
)。 '
[0003] このため、この細胞を効率よく調製し、増殖させる技術の開発が試みられている（特 許文献 1及ぴ 2)。 '
これまで間葉系幹細胞の増殖因子として FGF- 2 (非特許文献 2)、 HB-EGF (非特 -許文献 3)、 CYR61/CCN1 (非特許文献 4)が見出されているが、他の有効な因子は知 られていない。
[0004] 特許文献 1 :特開 2004- 089095号 報 - 特許文献 2：特開 2004- 242619号公報
非特許文献 1：日経バイオビジネス 日経 BP社 2004年 7月号第 16頁〜第 17頁 ^特許文献 2： Biochemical and Biophysical Research し ommunications 288, 413—419
(2001)
非特許文献 3 : Blood 106, 59-66 (2005)
非.特許文献' 4 : Protein Expression & Purification 42, 219-225 (2005)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、間葉系幹細胞を効率よく増殖させる技術を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段 [0006] 本発明者らは、基底膜型細胞接着分子の一つであるラミニン 5を利用することにより 、間葉系幹細胞'を分ィ匕能を維持したままで増殖を促進できることを見出し、本発明を 完成させるに至った。
[0007] 本発明の要旨は以下の通りである。
(1)間葉系幹細胞の増殖活性、接着活性及び伸展活性からなる群より選択される少 タくとも 1つの活性を促進するための薬剤であって、ラミニン 5を有効成分として含有 する前記薬剤。
'(2)ラミニン 5の存在下で間葉系幹細胞を培養する方法。
(3)無血清培地中で間葉系幹細胞を培養する（2)記載の方法。
(4)無血清培也が繊維芽細胞増殖因子を含有する（3)記載の方法。
[0008] (5) (2)〜 (4)のレヽずれかに記載の方法で間葉系幹細胞を培養することを含む、間 葉系幹細胞の単離方法。
(6)間葉系幹細胞を培養するための培地であって、濃度が 0.01 g/ml以上のラミニ ン 5を含有する前記培地。
(7)無血清培地である（6)記載の培地。
(8)さらに繊維芽細胞増殖因子を含有する（7)記載の培地。
(9)間葉系幹細胞を培養するための容器又はシートであって、濃度が 0.05 /z g/ml以 上のラミニン 5溶液で処理することにより、あるいはラミニン 5産生細胞に沈着させるこ とにより、ラミニン 5が 5 ng/cm2以上の濃度で塗布又は固定されている前記容器又は シート。
発明の効果
[0009] 本発明により、間葉系幹細胞を効率よく増殖できるようになった。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願 2005- 240814号の 明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]ラミニンの基本構造を示す。
[図 2]精製したラミニン 5Aおよびラミニン 5Bの電気泳動パターンを示す。左パネル： LN
5A-HEK細胞おょぴ LN5B-HEK細胞の培養液上清から精製したラミニン 5Aとラミニン 5Bを、非還元条件下 (-ME)又は還元条件下 (+ME)、 4.0- 7.5%勾配ゲル上の SDS- PAG
Eで分離し、色素（CBB)で染色した。左の 2レーンは各ラミニン 5の 3量体とその分子 サイズ (kDa)を、右 2レーンは各サブュ-ット (鎖）と分子サイズを示す。右パネル:精 製したラミュン 5Aとラミュン 5Bのひ 3鎖、 3鎖、 γ 2鎖をィムノブロッテイングで分析し た。各サブユニットと分子サイズを示す。 145 kDaの OL 3A/B鎖及ぴ 105 kDaの Ί 2鎖
'はプロテアーゼにより切断された型である。 '
[図 3]間葉系幹細胞に対する増殖活性のアツセィの結果を示す。
[図 4]5% Panexin食有無血清培地中で培養した間葉系幹細胞に対する増殖活性のァ ッセィの結果 (A)及ぴ細胞形態 (B)を示す。
[図 5]間葉系幹細胞をラミュン 5非存在下 (Control)あるいは存在下 (LN5)の軟骨分化 培地にて 3週間培養した時のグリコサミノダリカン (GAG)の蓄積の様子 (A)及び II型コ ラーゲンの蓄積の様子 (B)を示す。
[図 6]ラミニン 5非存在下 (Control)あるいは存在下 (LN5)で 8日間培養された間葉系幹 細胞を軟骨分ィヒ培地にて 3週間培養した時のグリコサミノダリカンの蓄積の様子 (A) 及び II型コラーゲンの蓄積の様子 (B)を示す。また、それぞれの細胞を骨芽細胞分 化培地中で 3週間培養した時のアルカリフォスファターゼの発現（C)とォステオポン チンの発現 (D； OPN)を示す。
[図 7A]間葉系幹細胞に対する接着活性のアツセィの結果を示す。
[図 7B]間葉系幹細胞に対する伸展活性のアツセィの結果を示す。
[図 8]抗インテグリン阻害抗体が間葉系幹細胞に対する接着活性のアツセィに及ぼす 影響を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
本発明は、間葉系幹細胞の増殖活性、接着活性及び伸展活性カゝらなる群より選択 される少なくとも 1つの活性を促進するための薬剤であって、ラミニン 5を有効成分とし て含有する前記薬剤を提供する。
[0012] 間葉系幹細胞は、哺乳類の骨髄などに存在し、様々な細胞に分化する能力を持つ た幹細胞である。骨、軟骨、脂肪細胞などの他、心筋細胞や神経細胞にも分化する ことが知られている。間葉系幹細胞の由来は特に限定されず、ヒト、ブタ、サル、チン パンジー、ィヌ、ゥシ、ゥサギ、ラット、マウスなどの哺乳動物、鳥類、爬虫類などに由 来するものを挙げることができる。再生医療に用いるためには、ヒト由来のものが好ま しい。間葉系幹細胞は、公知の方法により骨髄又は骨膜から採取することができるが 、大腿骨、頸骨、骨盤 (腸骨)から採取してもよい。また、ヒト間葉系幹細胞は市販され ； Cいる（PT-2501 (Cambrex社））。
[0013] ラミニンは基底膜の重要な成分であり、細胞表面レセプターと相互作用することによ つて細胞機能を調節している。ラミニン分子は、 α、 、, γの 3つの鎖がジスルフイド 結合で会合したヘテロ三量体蛋白質であり、特徴的な十字架構造をとつている。現 在までに、 5種類の α鎖、 3種類の β鎖、 3種類の Ί鎖の異なる組み合わせによって 15種類のァイソフォームが同定されている（図 1)。各アイソフォームは異なる組織分 布を示し、それぞれ異なる役割分担を果たすと考えられるが、その詳細は明らかでは ない。
[0014] ラミニン分子は、 3本鎖のァミノ (Ν)末端部分 (短腕)で互いに会合し り、他のマトリ タス分子と会合して、基底膜を構築する。一方、 α鎖のカルボキシル (C)末端には 5 つの相同な球状ドメイン（G1— G5ドメインまたは LG1— LG5)が存在し、主にこの部 分でインテグリンやその他のレセプターと結合する。
[0015] ラミニン 5は、 a 3鎖、 β 3鎖、 Ί 2鎖力 なるラミニン分子であり、表皮細胞や癌細胞 が産生する細胞外マトリクス分子（ラドシン、カリニン、ェピリグリン、ナイセインとも称さ れる）として見いだされた。この分子は、表皮の真皮への結合に中心的な役割を果た しており、ほとんどの細胞においてインテグリン a 3 j3 1に優先的に結合する力 細胞 によってはインテグリン 6 iS 1、 a'6 j3 4にも結合する。ラミニン 5における 3鎖 G2ド メインの a 3G2A配列（RERFNISTPAFRGCMKNLKKTS)や G3ドメインの KR D配列がインテグリンに対する主要な結合部位であることが解明されている。また、 a 3鎖の C末端に存在する G4および G5ドメインはラミニン 5が分泌された直後にプロテ ァーゼによって切断除去されることが知られている（図 1)。通常の方法で単離される ラミニン 5には G4、 G5ドメインが存在しない。このような ο; 3鎖切断型ラミニン 5は非切 断型ラミニン 5に比べて高い細胞接着促進活性、運動促進活性、および神経再生促 進活性を有することが知られている（J. Biol. Chem. , 280 (2005), 14370 - 14377)。また 、 γ 2鎖（150 kDa)は短腕部分で切断され、 105 kDaのサイズになる（図 1)。切断の程 度は細胞により異なるが、後述の実施例で使用した γ 2鎖は大部分が切断型になつ ている（図 2)。 γ 2鎖の切断によってラミニン 5の細胞接着活性は低下し、逆に運動 活性が増加することが知られている（J. Cell. Biochem., 92(2004), 701 - 704)。 β 3鎖 ' 切断されにくいが、表皮細胞などでは短腕部分で切断されることがある. (J. Bioche m.， (2005), in press) D後述の実施例で使用した j3 3鎖は切断されていない（図 2, 13 5 kDa) 0
[0016] ラミニン 5に含まれるひ 3鎖には短鎖型（ a 3A)と長鎖型 ( α 3Β)が存 し、それらの 各組織における発現パターンが異なることが報告されていた (J. Biol. Chem., 270 (1.9 95)， 21820-21826)。 a 3A鎖はひ 3B鎖の N末端側が欠失した構造を有する（図 1)。 最近、ヒト α 3Β鎖の全長 cDNA力クロ一ユングされ、この α 3Β鎖と、 β 3鎖おょぴ γ 2鎖からなる新規ラミュン 5の性質が明らかにされた (J. Biol. Chem., 279 (2004), 247 74-24784)。ラミニン 5に含まれる a 3鎖が短鎖型（ α 3 Α)であるものはラミニン 5 (また はラミニン 5A)と呼ばれており、 a 3鎖が長鎖型（ α 3B)であるものはラミニン 5Bと呼 ばれている（図 1)。ここで、 o; 3A鎖は、配列番号 10で示されるアミノ酸配列、または この配列において 1またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されてい るアミノ酸配列を有し、 a 3B鎖は、'配列番号 2で示されるアミノ酸配列、またはこの配 列において 1またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミ ノ酸配列を有し、 β 3鎖は、配列番号 4で示されるアミノ酸配列、またはこの配列にお いて 1またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配 列を有し、 y 2鎖は、配列番号 6で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において 1 またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されてレ、るアミノ酸配列を有 する。
[0017] 本発明で用いるラミニン 5は、分泌された直後に蛋白質分解酵素によって G4およ ぴ G5ドメインが切断されたものであってもよレ、。 a 3A鎖力 G4および G5ドメインが 切断されたものを α 3Α # 3鎖と呼び、 α 3Β鎖から G4および G5ドメインが切断された ものを α 3Β # 3鎖と呼ぶことにする。本発明で用レ、るラミニン 5は、 ο; 3Α# 3鎖、 j3 3 鎖及び γ 2鎖の各サブユニットから構成されるラミニン 5A蛋白質、 α 3Β # 3鎖、 j3 3 鎖及び γ 2鎖の各サブユニットから構成されるラミュン 5B蛋白質であってもよい。ここ で、 a 3A # 3鎖は、配列番号 12で示されるアミノ酸配歹 ϋ、またはこの配列において 1 またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されてレ、るアミノ酸配列を有 し、 ο; 3Β # 3鎖は、配列番号 8で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において 1ま はそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されてレ、るアミノ酸配列を有し 、 i3 3鎖は、配列番号 4で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において 1またはそ れ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されてレヽるアミノ酸配列を有し、 y 2鎖 は、配列番号 6で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において 1ま はそれ以上 のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有する。
[0018] 図 1に、ラミニン 5A(LN5A)蛋白質及ぴラミュン 5B (LN5B)蛋白質の構造を示す 。ラミニン 5Aは a 3A鎖、 β 3鎖、および γ 2鎖からなり、ラミニン 5Βは a 3B鎖、 β 3 鎖、および γ 2鎖力 なる。 α 3Β鎖は α 3Α鎖の約 2倍の大きさをもち、 α 3Β鎖の C 末端側約半分の構造は α 3Α鎖と共通である。 α 3Β鎖と a 3A鎖の 端部分には 球状（G)ドメインが存在し、それは 5つのサブドメイン (またはモジュール）（G1〜G5) に分かれてレ、る。ラミニン 5Aやラミニン 5Bが細胞力 分泌されると殆どの分子が直ち に内在性のプロテアーゼにより G3と G4の間で切断される。従って、培養液中には G 4と G5を欠損するラミニン 5Aまたはラミニン 5Bが分泌される。また、 α 3Β鎖、 α 3Α鎖 、および γ 2鎖の Ν末端部分でも部分的な切断が起こる。
[0019] 本発明で使用するラミニン 5 (ラミニン 5Α及び 5Βを含む)蛋白質は、これらラミニン 5 を分泌するヒト或 Vヽは動物細胞の培養液上清、あるいはそこから精製した天然型ラミ ニン 5であってもよい。しかし、これらラミニン 5は、当該技術分野において知られる組 換え DNA技術を用いて各サブユニットを発現させることにより遺伝子組換え蛋白質 として大量かつ効果的に製造することができる。
[0020] ラミニン 5Αの各サブユニットをコードする cDNAは、配列番号 9、 3または 5に記載さ れる塩基配列に基づ!/ヽてプライマーを設計し、適当な cDNAライブラリーをテンプレ ートとして、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)により目的とする配列を増幅することにより 製造することができる。同様に、ラミニン 5Bの各サブユニットをコードする cDNAは、 配列番号 1、 3または 5に記載される塩基配列に基づいてプライマーを設計し、適当 な cDNAライブラリーをテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)により目的と • する配列を増幅することにより製造することができる。このような PCR手法は当該技術 分野においてよく知られており、例えば、" PCR Protocols, A Guide to Meth ods and Applications", Academic Press, Michael, et al. , eds.， 1990ίこ Ϊ己載されている。 .
[0021] ラミニン 5Α又は 5Βの各鎖遺伝子をコードする DNAを、適当な発現ベクター中に 組み込み、これを真核生物または原核生物細胞のいずれかに導入して、それぞれの 鎖を発現させることにより所望の蛋白質を得ることができる。本発明の蛋白質を発現 させるために用いることができる宿主細胞の例としては、限定されないが、大腸菌、拈 草菌等の原核生物宿主、および酵母、真菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核生 物宿主が挙げられる。宿主として有用な哺乳動物細胞には、 HeLa細胞、線維芽細 胞由来の細胞、例えば VEROまたは CHO— Kl、また リンパ球由来の細胞、およ びこれらの誘導体が含まれる。好ましい哺乳動物宿主細胞には、 SP2/0および J55 8L、ならびに神経芽細胞腫細胞株、例えば IMR332が含まれる。さらに、植物細胞 および昆虫細胞、例えばショウジヨウバエの細胞もまた宿主として利用可能である。
[0022] ベクターとは、細胞にトランスフエクトすることができ、細胞ゲノム中でまたはそれとは 独立に複製しうる一本鎖または二本鎖の核酸分子を表す。発現ベクターは、 DNAの 発現を駆動するプロモーター領域を含み、さらに転写おょぴ翻訳の制御配列、例え ば TATAボックス、キヤッビング配列、 CAAT配歹 (J、 3，非コード領域、ェンハンサー 等を含んでいてもよい。プロモーターの例としては、原核生物宿主中で用いる場合に は、 blaプロモーター、 catプロモーター、 lacZプロモータ一、真核生物宿主中で用い る場合には、マウスメタ口チォネイン I遺伝子配列のプロモータ一、ヘルぺスウィルス の TKプロモーター、 SV40初期プロモーター、酵母解糖系酵素遺伝子配列プロモ 一ター等が挙げられる。ベクターの例には、限定されないが、 pBR322、 pUC118、 pUC119、 え gtlO、 L gtl l、 pMAM-neo, pKRC、 BPV、ヮクチ-ァ、 SV40、 2 —ミクロン等が含まれる。
[0023] 発現ベクターは、これを含有する宿主細胞を選択することができるように、 1または それ以上のマーカーを有することが好ましい。マーカーとしては、栄養要求性宿主に 対する栄養、抗生物質耐性 (例えばアンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン、ハ ィグロマイシン等）、または重金属耐性 (例えば同)を与えるものを用いることができる
[0024] さらに、シグナル配列を用いて本発明の蛋白質を分泌発現させるように、あるいは、 本発明の蛋白質を別の蛋白質との融合蛋白質の形で発現させるように、ベクターを 構築することができる。融合蛋白質を用いることにより、蛋白質の安定性を改良し、ま たは精製を容易にすることができる。そのような発現ベクターの構築は当該技術分野 においてよく知られている。 ,
[0025] ラミエン 5A又は 5Bの各鎖をコードする DNAは、一つの発現ベクター内に組み込 , んで発現させてもよぐまたは別個の発現ベクターに組み込んで、これらのベクターを 同じ細胞にトランスフエタトして発現させてもよレ、。 α 3鎖、 ]3 3鎖おょぴ 2鎖の各サ プユニットはいずれも非常に大きなポリペプチドであるため、好ましくは後者の方法を 用いる。
[0026] ラミニン 5Α又は 5Βを発現するよう構築したベクターは、トランスフォーメーション、ト ランスフエクシヨン、コンジユゲーシヨン、プロトプラスト融合、エレクト口ポレーシヨン、粒 子銃技術、リン酸カルシウム沈澱、直接マイクロインジェクション等により、適当な宿主 細胞中に導入することができる。ベクターを含む細胞を適当な培地中で成長させて 本発明の蛋白質を産生させ、細胞または培地力 所望の組換え蛋白質を回収し、精 製することにより、ラミニン 5Α又はラミニン 5Β蛋白質を得ることができる。精製は、サイ ズ排除クロマトグラフィー、 HPLC、イオン交換クロマトグラフィー、および免疫ァフィ二 ティークロマトグラフィー等を用いて行うことができる。
[0027] ラミニン 5Aの生産方法は、 J. Biochem. 132(2002), 607-612に記載されている。
[0028] ラミニン 5Bの生産方法は、 WO00/66731及ぴ Kariya, Y. et al., J. Biol. Chem., 279( 2004) 24774- 24784に記載されている。
[0029] ラミニン 5A又は 5Bの各鎖は、対応する配列番号で示されるアミノ酸配列において 1またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を 有するものであってもよい。このような天然の蛋白質と相同の蛋白質も本発明におい て使用可能である。
[0030] アミノ酸の保存的変更を行って、元の機能を保持してレ、る蛋白質またはポリべプチ ドを得ることができることは、当該技術分野においてよく知られている。そのような置換 には、アミノ酸を類似の物理化学的特性を有する残基で置き換えること、例えば、 1つ の脂肪族残基 (Ile、 Val、 Leuまたは Ala)を別のもので、または塩基性残基 Lysと Ar g、酸性残基 Gluと Asp、アミド残基 Ginと Asn、ヒドロキシル残基 Serと Tyr、または芳 香族残基 Pheと Tyrとの間で置き換えることが含まれる。
[0031] また、本発明で用いるラミュン 5は、配列番号 2、 4、 6または 8に記載されるアミノ酸 配歹 (Jと、少なくとも 50%、 60%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 9§%または 99% の同一性を有し、かつ間葉系幹細胞の細胞増殖活性、接着活性及び伸展活性から. なる群より選択される少なくとも 1つの活性を促進することができる蛋白質であってもよ い。同一性は、同一である残基の数を、既知の配列または既知の配列のドメイン中の 残基の総数で割り、 100を乗ずることにより計算する。標準的なパラメータを用いて配 列の同一性を決定するためのいくつかのコンビュ―タプログラム、例えば、 Gapped BLASTまたは PSI— BLAST (Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 : 3389-3402) , BLAST (Altsc ul, et al. (1990) Mol. Biol. 215 :403 —410)、ぉょぴスミス一ウォーターマン（Smith— Waterman) (Smith, et al. (19 81)J. Mol. Biol. 147: 195— 197)力 S禾 IJ用可能である。好ましくは、これらのプログ ラムのデフォルト設定を用いる力 S、所望によりこれらの設定を変更してもよレ、。
[0032] また、ラミニン 5A又は 5Bを構成する各鎖の一部が欠失している蛋白質を用いても よレ、。例えば、ラミニン 5Aの α 3Α鎖及ぴラミニン 5Βの <χ 3Β鎖は、プロテアーゼによ つて G4および G5が切断除去される力 それぞれ、ラミニン 5Α及ぴ 5Βとしての活性 を有する限り、切断型または非切断型を問わず本発明にお!/、て用いることができる。
[0033] さらに、ヒト以外の種の生物に由来する、ヒトラミニン 5Α又は 5Βと同様の活性を有 する蛋白質を用いてもよい。このような蛋白質をコードする遺伝子は、配列番号 1 (ラミ ニン 5Βと同様の活性を有する蛋白質の場合)若しくは配列番号 9 (ラミニン 5Αと同様 の活性を有する蛋白質の場合)、 3、 5または 7に示される配列を有するポリヌクレオチ ドまたはそのフラグメントをプローブまたはプライマーとして用いて、ハイプリダイゼー シヨンまたは PCR等の手法を用いて容易に単離することができる。このようにして得ら れる相同遺伝子は、配列番号 1若しくは 9、 3、 5または 7に記載の塩基配列に対して 少なくとも 50%以上、好ましくは 60%以上、より好ましくは 70%以上、さらに好ましく は 80%以上、特に好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95°/。以上の相同性を有する 。あるいは、相同遺伝子は、ストリンジ工ントなハイプリダイゼーシヨン条件下で配列番 .号 1若しくは 9、 3、 5または 7に記載の塩基配列を有する遺伝子とハイブリダィズする ことができる。
[0034] ハイブリダィズという用語は、 DNAまたはこれに対応する RNA力 溶液中でまたは 固体支持体上で、別の DNAまたは RNA分子と水素結合相互作用により結合するこ とを意味する。このような相互作用の強さは、ハイプリダイゼーシヨン条件のストリンジ. エンシーを変化させることにより評価することができる。所望の特異性および選択性に よって、種々のストリンジエンシーのハイプリダイゼ一シヨン条件を用レ、ることができ、 ストリンジエンシーは、塩濃度または変性剤の濃度を変化させることにより調節するこ とができる。そのようなストリンジエンシーの調節方法は当該技術分野においてよく知 られており、例えば、 "Molecular Cloning : A Laboratory Manual",第 2版. C old Spring Harbor Laboratory, Sambrook, Fritsch, &Maniatis, eds. , 1 989)に記載されている。
[0035] ストリンジェントなハイプリダイゼーシヨン条件とは、 50%ホルムアミドの存在下で、 7 OOmMの NaCl中 42°C、またはこれと同等の条件をいう。ストリンジェントなハイブリダ ィゼーシヨン条件の一例は、 50%ホルムアミド、 5XSSC、 50mMNaH PO、 pH6.
2 4
8、 0. 5%SDS、 0. lmgZmL超音波処理サケ精子 DNA、および 5Xデンハルト溶 液中で 42°Cで一夜のハイブリダィゼーシヨン； 2XSSC、 0. 1%SDSで 45°Cでの洗 浄；および 0. 2XSSC、0. 1%SDSで 45°Cでの洗浄である。
[0036] ラミニン 5は、間葉系幹細胞の増殖活性、接着活性及び伸展活性からなる群より選 択される少なくとも 1つの活性を促進することができる。ラミ^ン 5の細胞増殖促進活 性は、細胞を培養する培養液中にラミニン 5を添加して、対照 (ラミニン 5無添加）と比 較した細胞増殖速度を測定することによりアツセィすることができる。対照と比較して、 細胞増殖速度が上昇してレヽれば、ラミニン 5が細胞増殖活性を促進すると判定するこ とができる。細胞接着促進活性は、プレートにラミュン 5をコーティングし、このプレー トに細胞を播種 ύ所定時間インキュベートした後に接着した細胞の数を測定するこ とによりアツセィすることができる。対照 (ラミニン 5無添加）と比較して、接着した細胞 の数が増加してレヽれば、ラミニン 5が細胞接着活性を促進すると判定することができ る。細胞伸展促進活性は、プレートにラミニン 5をコーティングし、このプレートに細胞 播種し、所定時間インキュベートした後に接着した細胞の形態を観察することにより アツセィすることができる。細胞の扁平化が起きていれば、細胞伸展活性を促進する と判定することができる。
[0037] ラミニン 5を用いて、間葉系幹細胞の増殖活性、接着活性及び伸展活性からなる群 より選択される少なくとも 1つの活性を促進するためには、ラミュン 5を間葉系幹細胞 の,培養液中に添加するか、または培養プレートなどの培養容器もしくは培養シート上 に塗布または固定ィヒするとよい。培養液中に添加されるラミニン 5は、遺伝子組換え 型、天然型のいずれでも、また精製したものでも未精製のものでもよい。ラミニン 5分 泌細胞の培養液上清（conditioned medium)をラミニン 5溶液として使用することもでき る。ラミニン 5の固定ィ匕はこれら各種ラミニン 5含有液を培養容器もしくは培養シートに 直接処理することによって行うことができる。また、ラミニン 5産生細胞を培養容器もし くは培養シート上に沈着させたもの（ラミニン 5マトリックス)を使用してもよい。殆どの 動物細胞は生存条件として基質 (足場）に接着することが必須であり、さらに増殖因 子の刺激を受けて分裂する。下記の実施例 2の結果力 分力るように、正常細胞は 一般に増殖速度が低い。ラミニン 5は細胞接着活性と、増殖因子としての増殖促進活 性の両方をもつことから、間葉系幹細胞の増殖促進剤として有効である。従って、間 葉系幹細胞の培養に使用できる。
[0038] ラミニン 5を培養液中に添加する場合、培養液中におけるラミニン 5の濃度は特に 限定されないが、通常、 0.01 /i g/ml以上の濃度が適当であり、 0.1〜1 μ g/mlの濃度 で最適な増殖効果が得られる。培養液中の他の成分は、間葉系幹細胞の培養に適 するものであれば、特に限定されない。また、固定ィ匕ラミニン 5は、ラミニン 5産生細胞 (例、 LN5- HEK細胞、 LN5B- HEK細胞、表皮細胞、扁平上皮癌細胞、胃癌細胞など )を適当な培養容器もしくは培養シート上で飽和状態で数時間以上 (好ましくは 2日 以上)培養した後、細胞を EDTA処理などにより除！/ヽて作製することもできる。培養液 .としてはダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)、 DMEM/F12などの基本培地を用いる ことができる。さらに、グルコース、ゥシ胎児血清 (FCS)、ヒト血清、ゥマ血清、抗生物質 (例えば、ぺニシン、ストレプトマイシンなど)、増殖因子 (例えば、 FGF- 2、 HB- EGF、 CYR61/CCN1)などを添加してもよい。
[0039] jラミュン 5を利用することにより、血清含有培地又は無血清培地で間葉系幹細胞を 増殖させることができる。間葉系幹細胞をラミニン 5添加増殖培地に 5，000〜6,000細 • 胞 /cm2の密度で播種し、 37DC、 5%CO下で培養するとき、通常 5〜6日間で飽和す る。 ' ,
[0040] 一般に、細 培養法は、単層静止培養法、ローラーボトル培養法、撹拌培養法、坦 体培養法などに分類されるが、本発明においては、いずれの培養法を用いてもよい
[0041] ラミュン 5を塗布又は固定した培養プレートなどの培養容器又は培養シート上で間 葉系幹細胞を培養する場合、ラミニン 5の量は特に限定されず、培養 器又は培養 シートの大きさによって適宜調整するとよい。通常、 0.05 /i g/ml以上、好ましくは 0.5 〜3 μ g/mlのラミニン 5溶液で処理された場合、良好な増殖が得られる。ラミニン 5は 、 5 ngん m2以上の濃度で培養容器又は培養シートに塗布又は固定されているとよぐ 好ましくは 50〜300 ng/ cm2の濃度で培養容器又は培養シートに塗布又は固定され る。間葉系幹細胞を培養するための培地は、ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)、 DMEM/F12などの基本培地を用いることができる。さらに、グルコース、ゥシ胎児血清 (FCS)、ヒト血清、ゥマ血清、抗生物質 (例えば、ぺニシン、ストレプトマイシンなど)、増 殖因子（例えば、 FGF- 2、 HB- EGF、 CYR61/CCN1)などを添加してもよい。
[0042] いずれかの方法で固定化されたラミニン 5を利用することにより、血清含有培地又は 無血清培地で間葉系幹細胞を増殖させることができる。ラミニン 5をコートしたプレー ト上に間葉系幹細胞を 5，000〜6,000細胞ん m2の密度で播種し、 37°C、 5%CO下で
2 培養するとき、通常 5〜6日間で飽和する。
[0043] また、ラミニン 5は間葉系幹細胞を効果的に接着させることから、骨髄など力 の間 葉系幹細胞の単離'調製にも利用できる。例えば、ラミニン 5をコート（固定化)した培 養容器又は培養シート上に、骨髄などの、間葉系幹細胞を含む細胞混合物を播種し 、 5分〜 2時間インキュベートする。まだ接着していない細胞を除き、プレートに接着し た間葉系幹細胞を他の細胞力 分離する。このプレート上で増殖させた間葉系幹細 胞は通常のトリプシン処理によって回収することができる。
実施例 ·
[0044] ,以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に 限定されるものではない。
[0045] '〔実施例 1〕遺伝子組換えヒトラミニン 5A及ぴ 5Bの調製.
ラミニン 5Aは既に報告した方法（Kariya, K. et al., J. Biochem.， 132(2002), 607-61 2)により調製した。 α 3Α、 3、 γ 2鎖の cDNAを導入したヒト胎児腎細胞株 ΗΕΚ293 ( LN5-HEK)から回収した無血清培養液上清の含有タンパク質を硫安沈殿により濃縮 後、 Sepharose 4Bカラム (Amersham社)を用レ、るゲルろ過により分画した。このラミニ ン 5A含有画分をゼラチンカラムに通してフィプロネクチンを除去し、さらに抗ラミニン α 3鎖モノクローナル抗体 (LS a 3)を固定化したァフィ二ティーカラムに通してラミエン 5Aを吸着、次いで溶出した。精製されたラミエン 5Aは 6%ゲルを用いる還元 SDS— P AGEとィムノブロッテイングによってほぼ純粋であることを確認した（図 2)。ィムノプロ ッティングは a 3鎖抗体（LS α 3、自作）、 β 3鎖抗体（Kalinip Bl， Transduction Labora tories社)、 γ 2鎖抗体 (D4B5、自作)を用いて行った。なお、培養液上清を直接ゼラ チンカラムと抗体カラムで分画しても、上記に近い精製標品が得られた。以上のよう に調製及ぴ精製されたラミニン 5Aの a 3鎖は完全に切断して 160kDaになっており、 γ 2鎖は大部分が 105kDaの切断型（配列番号 6のアミノ酸配列中の Asp(435)と Glu(43 6)の間で切断）になっていた。なお、 a 3鎖の切断は G4ドメインと G5ドメインの間の Gin (1337)と Asp(1338)の間で起こる（Tsubota, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commu n.， 278(2000)， 614—620)。
[0046] ラミニン 5Bの調製及ぴ精製は、 α 3Β、 ]3 3、 γ 2鎖の cDNAを導入したヒト胎児腎細 胞株 HEK293 (LN5B-HEK)から回収した培養液上清を用いて上記と同様に調製及 ぴ精製した（Kariya, Y. et al., J. Biol. Chem., 279(2004), 24774-24784) 0精製された ラミニン 5Bの γ 2鎖は約半分が切断型 y 2鎖であった（図 2)。 α 3Β鎖は G4- G5領域を 予め除いた cDNAを導入しているため 335 kDaの切断型（伹し、この a 3B鎖 # 3の C末 端配列はプロテアーゼによって切断されて生じる C末端配列 (Gln2957)よりも短レヽ Ph e2944となっている）が主要成分である力 さらに N末端部分で切断された 145 kDa a 3B鎖も見られる。この切断は Lys(1811)と Asp(1812)の間で起こる（Kariya, Y. et al.， J. Biol. Chem., 279(2004), 24774—24784)。
[0047] 以下の実施例において、ラミニン 5とは、特に断りのない限り、本実施例で調製した ラミュン 5Aを指す。
[0048] 〔実施例 2〕間葉系幹細胞に対する増殖活性のアツセィ
ヒト間葉系幹細胞 (hMSC (Human mesenchymal stem cell) ) (Cambrex社製）を 5 X 1 03細胞/ゥエルの密度で 24ゥェルプレートに播種し、維持培地 (Cambrex社製）にて 12 日間培養した。その際、以下のように細胞を処理した。細胞数は、 4曰ごとにカウントし た。
[0049] (A)ラミニン 5を 24ゥエルプレートに次のようにコートした。 1ゥエル当たり 1.0 μ g/mlの ラミニン 5溶液（生理食塩水 PBSで希釈）0.5 ml (0.5 gラミュン 5/ゥエル)を加え、一 晚 4°Cで放置した。溶液を除いた後、 12 mg/mlのゥシ血清アルブミン (BSA)溶液 0.5 mlを加え、室温で 2時間処理した (BSAプロッキング)。各ゥエルを PBSで 2回洗浄した 後、細胞を播種した。 Control (対照）は PBSで処理した。なお、 BSAプロッキングはラミ ニン 5の実際の利用にあたっては必ずしも必要ではな！/、。
[0050] (B) 0.5、 1.0、 2.0 g/mlのラミニン 5溶液を上記のようにコートした（それぞれ、 0.25， 0 .5， 1.0 /ゥエル)。
[0051] (C) 1.0 g/mlのラミニン 5溶液の 0,5 ml (0.5 μ g/ゥエル）を上記のようにコートしたプ レート上で細胞を培養するか（Insoluble)、もしくは培地に 0.5 ^u g/mlになるようにラミ ニン 5を添加して培養した（Soluble)。
[0052] (D) 1.0 g/mlのラミュン 5(LN5)溶液 (0.5 μ g/ゥェル）、もしくは 2.0 μ g/ml (1.0 μ g/ ゥエル）のラミニン l(LNl) (Chemicon社製）、ラミニン 2/4(LN2/4) (Chemicon社製）、ラ ミニン 10/11(LN10/11) (Sigma- Aldrich社製）をコートしたプレート上で細胞を培養し た。
[0053] (E) 1.0 μ g/mlのラミュン 5溶液及ぴ 1.5 μ g/mlのラミニン 5Β溶液の 0.5 ml (それぞれ 0.5 ^ g/ゥエルと 0.75 g/ゥヱル）を上記のようにコートし、そのプレート上で細胞を 培養した (Soluble)。
[0054] (A)〜（E)を通し、 Control (対照）はラミュン溶液の代わりに PBSのみで処理した。図 3Aより、 Controlと比較して、ラミニン 5をコートしたプレート上で hMSC細胞は増殖速 度が高くなつていることが明らかとなった。さらに、図 3Bより、その効果が濃度依存的 あることが示された。この増殖促進効果はラミニン 5を培地中に直接添加した場合 にも同様に観察された（図 3C)。ラミニン 5の増殖促進活性は他のラミュンと比較して も高いことが示された（図 3D)。また、ラミニン 5Bをラミニン 5 (ラミニン 5A)と同じモル濃 度で処理したとき、両者はほぼ同等の増殖促進活性を示した（図 3E)。，
[0055] 次に、無血清培地におけるラミニン 5の増殖促進活性を明らかにするために、市販. の幹細胞用無血清添加物 Panexin (PAN- biotech社)を添加した培地を用レ、た。 hMS C細胞を無血清 MSCBM培地（Cambrex社)で 1度洗った後、 5%Panexin含有無血清 M SCBM培地中に懸濁して無処理またはラミニン 5 (0,5 g/ml) (LN5)でコートしたプレ ート上に播種し、 8日間培養した。またそれぞれにっき、 bFGF (basic fibroblast growt h factor) (Wako Pure Chemical社)を最終濃度 1 ng/mlで培地に添加し、その効果も調 ベた（図 4A，B)。また比較のため、無血清培地で 1度洗浄した hMSC細胞を、 5°/0血清 を含有する維持培地（MSCBM+MSCGM) (Cambrex社）に同様に播種し、 8日間培養 した（Serum)。その結果、無血清 MSCBM培地単独（Control)に比べてラミニン 5添加 は一定の増殖促進を示したが、 bFGFの増殖促進活性がより顕著であった。ラミニン 5 と bFGFの両方の存在下では、相乗的に細胞増殖が促進され、血清含有培地とほぼ 同等の増殖促進が見られた（図 4A)。形態的にはラミニン 5上で細胞が扁平になるの に対して、ラミニン 5と bFGFの共存下ではやや細くて明瞭な細胞形態が得られた（図 4B)。これらの結果力 ラミニン 5と bFGFおよび他の増殖因子との併用により、 hMSC 細胞を無血清培地中で増殖できることが明らかになった。
[0056] さらに、 hMSC細胞の軟骨およぴ骨芽細胞への分ィ匕に及ぼすラミュン 5の効果を調 ベた。血清含有維持培地（MSCBM+MSCGM) (Cambrex社）中で培養した hMSC細胞 をディッシュから剥がし、 TGF- β 3を添加しない不完全軟骨分化培地（dexamethason e、 ascorbate、 insulin ^ transferrin N sodium selenite、 sodium pyruvate proline^ L— glut amine) (Cambrex社)で 1回洗った後、 10 ng/ml TGF- 3 3を添カ卩した完全軟骨分化' .培地（Cambrex社).に懸濁した。 2.5 X 105cells/tubeの濃度でポリプロピレンチューブ に移して遠心した後、細胞のペレットを 37°Cで 24時間以上インキュベートして球状の 細胞塊を形成させた。ラミニン 5 (1 μ g/ml)は細胞塊が形成された後に添カ卩し、培養 した。 2〜3日に一度ラミニン 5を添加した完全軟骨分ィ匕培地で培地交換を行った。 3 週間培養した後、切片を作成し、 Alcian blueを用いて軟骨特異的なグリコサミノグリカ ンを、また特異抗体 (Lab Vision社)を用いて II型コラーゲンを染色した。その結果、ラ ミ-ン 5を含まなレヽ完全軟骨分化培地（Control)に比べて、ラミニン 5添加培地 (LN5) では、細胞塊の成長が阻害された（図 5A，B)。また、ラミニン 5によってグリコサミノダリ カン (図 5A)と； II型コラーゲン (図 5B)の蓄積が顕著に抑制され、 TGF - 3を添加し ない不完全軟骨分化培地 (TGF- β 3( -))の染色度を示した。これらの結果力 ラミュ ン 5が hMSC細胞の軟骨分化を抑制することが示された。
[0057] 次に、 hMSC細胞の骨芽細胞分ィ匕に及ぼすラミニン 5の影響を調べた。細胞を骨芽 細胞分ィ匕培地、dexamethasone、 ascorbate、 β -glycerophosphate) (Cambrex社)に分 散し、 3 10 3ん!^の密度で無処理またはラミニン5 (0.5 μ g/ml)でコートしたプレ ート上に播種し、 3週間培養した。骨芽細胞分ィ匕マーカーであるアルカリフォスファタ ーゼ（alkaline phosphatase)は naphth ASBIと Fast Red TRの、混合液（Sigma— Aldrich社 )で検出し、ォステオポンチン (osteopontin)は IBL社の特異抗体を用いる免疫プロッ ティングで検出した。その結果、ラミニン 5はこれらの蛋白質の産生、すなわち hMSC 細胞の骨芽細胞分化に影響を与えないことが示された。
[0058] ラミニン 5が軟骨細胞分ィヒを抑制することから、ラミニン 5処理が hMSC細胞の分ィ匕能 に影響を与えるかどうかを調べた。このために、先ず hMSC細胞を無処理 (Control)あ るいはラミニン 5 (1 μ g/ml)でコートしたプレート (LN5)上で、維持培地を用 V、て 8日 間培養した。それぞれの細胞をプレート上力 剥がし、ラミニン 5非存在下での hMSC 細胞の軟骨および骨芽細胞への分化を調べた。ラミニン 5非存在下 (Control)あるレヽ は存在下 (LN5)で培養された hMSC細胞を完全軟骨分ィ匕培地 (TGF - 3含有）にて 3 週間培養した時、両者の間でグリコサミノグリカン (図 6A)と II型コラーゲン (図 6B)の蓄 積に差は見られな力 た。またそれぞれの細胞を骨芽細胞分ィ匕培地中で 3週間培養 した時、アルカリフォスファターゼ（図 6C)とォステオポンチン（図 6D; OPN)の発現に 差は見られなかった。すなわち、ラミニン 5処理は hMSC細胞の軟骨と骨芽細胞への 分ィヒ能に影響を与えな力 た。以上の結果から、ラミニン 5は hMSC細胞の分ィヒ能を 保った状態で細胞増殖を促進することが示された。
[0059] 〔実施例 3〕間葉系幹細胞に対する接着活性のアツセィ
濃度が 1.6 μ g/mlのラミニン 1 (LN1)、ラミュン 2/4 (LN2/4)、ラミニン 10/11 (LN10/1 1)溶液の 0.1 ml (0.5 ^ g/cm2 )、もしくは 0.8 μ g/mlのラミニン 5 (LN5)溶液の 0.1 ml ( 0.25 IX gん m2 )で 96ゥエルプレートをコートし、その後 12 mg/ml BSAでブロッキング処 理した。各ゥエルに、無血清の DMEM培地 (Nissui)で 2回洗った hMSCを 2xl04細胞/ ゥェルの濃度で播種した。約 5分後、接着していない細胞を軽いポルテックスにより浮 遊させ、パーコール処理にてゥエル表面から除いた。接着した細胞をホルマリンで固 定し、 Hoechst 33432により染色し、相対細胞数を定量した。ラミュン溶液の代わりに P BSで処理し、その後 BSAでプロッキングしたプレートを対照（None)とした。
[0060] 結果を図 7Aに示す。他のラミニンと比較して、ラミュン 5は著しく接着活性が強レ、こと が明らかとなった。
[0061] 〔実施例 4〕間葉系幹細胞に対する伸展活性のアツセィ
実施例 3と同濃度の各ラミニンでコートしたプレートに、 hMSCを 3.1xl03 cells/cm2の 濃度で播種し、 10分後の細胞形態を観察した。ラミニン溶液の代わりに PBSで処理し たプレートを対照（None)とした。
[0062] 結果を図 7Bに示す。 None,ラミニン 1、ラミニン 2/4ではほとんどの細胞が球状を示し 、伸展が見られないが、ラミニン 5ではほとんどの細胞がプレート上に広がり、伸展し ている様子が観察できた。ラミニン 10/11もラミュン 5に近い伸展活性を示した。
[0063] 〔実施例 5〕抗インテグリン阻害抗体の影響
抗インテグリン阻害抗体を用いて、 hMSC力 つラミニン 5受容体を調べた。ラミニン 5 (LN5)上に細胞を播種する前に、 hMSCを抗インテグリン阻害抗体 (抗 α 3インテグリ ン抗体 (P1B5)、抗 β 1インテグリン抗体 (6S6)、抗 β 4インテグリン抗体 (3E1)、以上 C hemicon社製;抗 α 6インテグリン抗体 (GoH3)、 Pharaiingen社製）と 5分ほどプレインキ ュペートし、実施例 3と同様に細胞接着活性を測定した。ラミニン溶液の代わりに PBS で処理したプレートを対照（None)とした。
[0064] 結果を図 8に示す。抗ひ 3インテグリン抗体及ぴ抗 β 1インテグリン抗体で処理すると 、図 7Αで示したようなラミニン 5の接着促進活性が著しく阻害された。このことから、ラミ ニン 5による細胞接着促進活性は、インテグリン ct 3 β 1との結合に拠ることが明らかと なった。
' 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。 ·
産業上の利用可能性
[0065] ラミュン 5を利用することにより、間葉系幹細胞を効率よく培養することができるように った。間葉系幹細胞は骨、軟骨、脂肪、筋肉などの細胞へ分ィ匕する能力をもって · おり、骨損傷、変形性関節症、骨粗しょう症、筋肉障害などに対する再生医療への応 用が期待される。
配列表フリーテキスト ·
[0066] <配列番号 1 >
配列番号 1は、ヒトラミュン a 3B鎖の全長塩基配列を示す。
<配列番号 2 >
配列番号 2は、ヒトラミュン a 3B鎖の全長アミノ酸配列を示す。 、
<配列番号 3 > '
配列番号 3は、ヒトラミニン |3 3鎖の全長塩基配列を示す。
<配列番号 4>
配列番号 4は、ヒトラミニン ]3 3鎖の全長アミノ酸配列を示す。
<配列番号 5 >
配列番号 5は、ヒトラミニン γ 2鎖の全長塩基配列を示す。
<配列番号 6 >
配列番号 6は、ヒトラミ-ン γ 2鎖の全長アミノ酸配列を示す。
<配列番号 7>
配列番号 7は、ヒトラミ-ン a 3Β # 3鎖の塩基配列を示す。
<配列番号 8 > 配列番号 8は、七トラミニン 3B # 3鎖のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 9 > '
配列番号 9は、ヒトラミニン α 3A鎖の塩基配列を示す。
<配列番号 10 >
配列番号 10は、ヒトラミニン a 3Α鎖のアミノ酸配列を示す。
^配列番号 11 >
配列番号 11は、ヒトラミニン 3Α # 3鎖 (ヒトラミニン α 3Α鎖力 G3と G4が切断さ れたもの）の塩基配列を示す。
<配列番号 12 >
配列番号 12は、ヒトラミニン α 3Α# 3鎖のアミノ酸配列を示す。

Claims

請求の範囲
[1] 間葉系幹細胞の増殖活性、接着活性及び伸展活性からなる群より選択される少なく とも 1つの活性を促進するための薬剤であって、ラミニン 5を有効成分として含有する 記薬斉！]。
[2] ラミュン 5の存在下で間葉系幹細胞を培養する方法。
[3] 無血清培地中で間葉系幹細胞を培養する請求項 2記載の方法。
[4] 無血清培地が繊維芽細胞増殖因子を含有する請求項 3記載の方法。
[5] 請求項 2〜4のいずれかに記載の方法で間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉 系幹細胞め単離方法。
[6] 間葉系幹細胞を培養するための培地であって、濃度が 0.01 μ g/ml以上のラミュン 5 を含有する前記培地。
[7] 無血清培地である請求項 6記載の培地。
[8] さらに繊維芽細胞増殖因子を含有する請求項 7記載の培地。
[9] 間葉系幹細胞を培養するための容器又はシートであって、濃度が 0.05 μ g/ml以上 のラミニン 5溶液で処 することにより、あるいはラミニン 5産生細胞に沈着させること により、ラミニン 5が 5 ng/cm2以上の濃度で塗布又は固定されてレヽる前記容器又はシ ート。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009123349A1 (ja) 2008-03-31 2009-10-08 オリエンタル酵母工業株式会社 多能性幹細胞を増殖させる方法
WO2011125860A1 (ja) 2010-03-31 2011-10-13 オリエンタル酵母工業株式会社 ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法
US8877493B2 (en) 2009-10-08 2014-11-04 Osaka University Culture substrate for human pluripotent stem cells and use thereof
WO2017094879A1 (ja) * 2015-12-03 2017-06-08 タカラバイオ株式会社 間葉系幹細胞の製造方法
JP2017535259A (ja) * 2014-10-24 2017-11-30 ライフライン サイエンティフィック インコーポレイテッドＬｉｆｅｌｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｎｃ． 凍結保存後の細胞生存率および保持率を改善させるための、細胞外マトリックス成分および／またはマトリックス細胞タンパク質の選択法
WO2018150841A1 (ja) * 2017-02-20 2018-08-23 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法、及び細胞培養システム
WO2019198674A1 (ja) * 2018-04-13 2019-10-17 日機装株式会社 細胞の培養方法、細胞支持複合体の製造方法、培養細胞および細胞支持複合体

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012137970A1 (ja) 2011-04-08 2012-10-11 国立大学法人大阪大学 改変ラミニンおよびその利用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004089095A (ja) 2002-08-30 2004-03-25 Marubishi Baioenji:Kk 細胞組織の自動培養装置及び方法
JP2004242619A (ja) 2003-02-17 2004-09-02 Marubishi Baioenji:Kk 細胞培養容器
JP2005515777A (ja) * 2002-01-25 2005-06-02 ジェンザイム・コーポレーション 軟骨細胞のための無血清培地およびその使用法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE342348T1 (de) * 1998-11-09 2006-11-15 Consorzio Per La Gestione Del Serum-freies medium für chondrozyt-ähnliche zellen
DE10025691A1 (de) 2000-05-24 2001-11-29 Abb Patent Gmbh Isolierstück für eine Rohrleitung

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005515777A (ja) * 2002-01-25 2005-06-02 ジェンザイム・コーポレーション 軟骨細胞のための無血清培地およびその使用法
JP2004089095A (ja) 2002-08-30 2004-03-25 Marubishi Baioenji:Kk 細胞組織の自動培養装置及び方法
JP2004242619A (ja) 2003-02-17 2004-09-02 Marubishi Baioenji:Kk 細胞培養容器

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 288, 2001, pages 413 - 419
BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 313, 2004, pages 503 - 508
BLOOD, vol. 106, 2005, pages 59 - 66
HIROSAKI T. ET AL.: "Saibogai Matrix Tanpakushitsu to Gan no Akusei Zoshoku - Laminin-5 o Rei to shite", EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 20, no. 14, 2002, pages 2156 - 2161, XP003008673 *
KARIYA Y. ET AL.: "Saibogai Matrix Bunshi ni yoru Gansaibo Kino no Chosetsu Laminin-5 ni yoru Setchaku to Undo no Seigyo", EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 21, no. 15, 2003, pages 2064 - 2070, XP003008672 *
KLEES .R.F ET AL.: "Laminin-5 induces osteogenic gene expression in human mesenchymal stem cells through an ERK-dependent pathway", MOL. BIOL. CELL, vol. 16, no. 2, February 2005 (2005-02-01), pages 881 - 890, XP003008671 *
MIZUSHIMA H. ET AL.: "Identification of integrin-dependent and -independent cell adhesion domains in COOH-terminal globular region of laminin-5 alpha 3 chain", CELL GROWTH DIFFER., vol. 8, no. 9, 1997, pages 979 - 987, XP008032382 *
NIKKEI BIOTECHNOLOGY & BUSINESS, July 2004 (2004-07-01), pages 16 - 17
PROTEIN EXPRESSION & PURIFICATION, vol. 42, 2005, pages 219 - 225
See also references of EP1930413A4
TAKAHASHI H.: "Zairyo, Gijutsu, Hohoron no Kenkyu Kaihatsu 2. Saibo Baiyo Kanren Zairyo (Gijutsu 3) Mukessei Baichi", GENE & MEDICINE MOOK, no. 1, 2004, pages 176 - 180, XP003006149 *
TSUTSUMI S. ET AL.: "Retention of multilineage differentiation potential of mesenchymal cells during proliferation in response to FGF", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 288, no. 2, 2001, pages 413 - 419, XP002907958 *

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5464443B2 (ja) * 2008-03-31 2014-04-09 オリエンタル酵母工業株式会社 多能性幹細胞を増殖させる方法
CN102131919B (zh) * 2008-03-31 2017-05-03 东方酵母工业株式会社 一种增殖多能性干细胞的方法
WO2009123349A1 (ja) 2008-03-31 2009-10-08 オリエンタル酵母工業株式会社 多能性幹細胞を増殖させる方法
US8877493B2 (en) 2009-10-08 2014-11-04 Osaka University Culture substrate for human pluripotent stem cells and use thereof
WO2011125860A1 (ja) 2010-03-31 2011-10-13 オリエンタル酵母工業株式会社 ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法
JP5882198B2 (ja) * 2010-03-31 2016-03-09 オリエンタル酵母工業株式会社 ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法
JP2017535259A (ja) * 2014-10-24 2017-11-30 ライフライン サイエンティフィック インコーポレイテッドＬｉｆｅｌｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｎｃ． 凍結保存後の細胞生存率および保持率を改善させるための、細胞外マトリックス成分および／またはマトリックス細胞タンパク質の選択法
WO2017094879A1 (ja) * 2015-12-03 2017-06-08 タカラバイオ株式会社 間葉系幹細胞の製造方法
CN108495924A (zh) * 2015-12-03 2018-09-04 宝生物工程株式会社 用于产生间充质干细胞的方法
WO2018150841A1 (ja) * 2017-02-20 2018-08-23 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法、及び細胞培養システム
JP2018134007A (ja) * 2017-02-20 2018-08-30 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法、及び細胞培養システム
WO2019198674A1 (ja) * 2018-04-13 2019-10-17 日機装株式会社 細胞の培養方法、細胞支持複合体の製造方法、培養細胞および細胞支持複合体
JPWO2019198674A1 (ja) * 2018-04-13 2021-04-22 日機装株式会社 細胞の培養方法、細胞支持複合体の製造方法、培養細胞および細胞支持複合体
JP7062052B2 (ja) 2018-04-13 2022-05-02 日機装株式会社 細胞の培養方法および細胞支持複合体の製造方法
US12031158B2 (en) 2018-04-13 2024-07-09 Nikkiso Co., Ltd. Method of culturing cells, method of manufacturing cell support composite, cultured cells, and cell support composite

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