WO2007012494A1 - Stabile nad/nadh-derivate - Google Patents

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WO2007012494A1
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nad
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Joachim Hoenes
Dieter Heindl
Carina Horn
Claudia Gaessler-Dietsche
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F.Hoffmann-La Roche Ag
Roche Diagnostics Gmbh
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label

Definitions

  • the invention relates to stable nicotinamide adenine dinucleotide (NAD / NADH) or nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP / NADPH) derivatives, enzyme complexes of these derivatives and their use in biochemical detection methods and reagent kits.
  • NAD / NADH stable nicotinamide adenine dinucleotide
  • NADP / NADPH nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • Measuring systems for biochemical analysis are important components of clinically relevant analytical methods.
  • the measurement of analytes e.g. Metabolites or substrates in the foreground, which are determined directly or indirectly by means of an enzyme.
  • the analytes are hferbei implemented using an enzyme-coenzyme complex and then quantified.
  • the analyte to be determined is brought into contact with a suitable enzyme and a coenzyme, the enzyme usually being used in catalytic amounts.
  • the coenzyme is altered by the enzymatic reaction, e.g. oxidized or reduced. This process can be detected electrochemically or photometrically directly or through a mediator.
  • a calibration provides a direct correlation of the measured value with the concentration of the analyte to be determined.
  • Coenzymes are organic molecules that are covalently or non-covalently bound to an enzyme and are altered by the reaction of the analyte.
  • Prominent examples of coenzymes are nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP), which form NADH and NADPH by reduction.
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • NADP nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • a known measure used to increase the stability of biochemical measuring systems is the use of stable enzymes, e.g. the use of enzymes from thermophilic organisms. Furthermore, it is possible to use enzymes by chemical modification, e.g. Crosslinking, or to stabilize by mutagenesis. In addition, enzyme stabilizers, e.g. Trehalose, polyvinylpyrrolidone and serum albumin, or the enzymes e.g. be included in polymer networks by photopolymerization.
  • mediators with the lowest possible redox potential increases the specificity of tests and eliminates disturbances during the reaction.
  • a lower limit for the redox potential of mediators is the redox potentials of the enzyme / coenzyme complexes. If these are undercut, the reaction with the mediators is slowed or even stopped.
  • biochemical measuring systems without mediators may be used, in which, for example, a direct detection of coenzymes, e.g. coenzyme NADH.
  • coenzymes such as NAD and NADP, are unstable.
  • NAD and NADP are base-labile molecules whose degradation pathways in the Literature (NJ Oppenheimer in The Pyridine Nucleotide Coenzyme Academic Press New York, London 1982, ed. J. Everese, B. Anderson, K. You, Chapter 3, pages 56-65). Essentially, the degradation of NAD or NADP produces ADP-ribose by cleaving the glycosyl bonds between the ribose and the pyridine moiety. The reduced forms NADH and NADPH, however, are acid labile: for example, epimerization is a known degradation pathway.
  • NAD / NADP derivatives are used e.g. in B.M. Anderson in the Pyridine Nucleotide Coenzyme, Academic Press New York, London 1982, ed. J. Everese, B. Anderson, K. You, Chapter 4. However, most of these derivatives are not well accepted by enzymes.
  • the only derivative heretofore used for diagnostic testing is 3-acetylpyridine-adenine dinucleotide (acetyl NAD), first described in 1956 (N.O. Kaplan, J. Biol. Chem. (1956), 221, 823). Also, this coenzyme shows a low acceptance of enzymes and a change in the redox potential.
  • WO 01/94370 describes the use of further NAD derivatives with a modified pyridine group.
  • modifications of the nicotinamide group generally have a direct influence on the catalytic reaction. In most cases this influence is negative.
  • the ribose unit was altered to influence the stability of the glycosyl bond. This approach does not directly interfere with the catalytic reaction of the nicotinamide group. However, there may be an indirect influence as soon as the enzyme has strong and specific binding to the ribose unit.
  • Kaufmann et al. WO 98/33936 and US Pat. No. 5,801, 006 or WO 01/49247 disclose a series of thioribose NAD derivatives. However, a connection between the modification of the nicotinamide ribose unit and the activity of the derivatives in enzymatic reactions has not yet been shown.
  • carbaNAD a derivative without glycosyl linkage
  • the ribose is substituted herein by a carbacyclic sugar moiety.
  • carbaNAD has been described as a substrate for dehydrogenases, its activity has not previously been demonstrated in biochemical detection in the clinic.
  • the underlying object of the present invention is therefore to provide stable bioanalytical measuring systems, in particular for the determination of glucose, which avoid the hydrolysis sensitivity of NAD / NADP and at the same time are active as coenzymes in enzyme reactions.
  • test element for the determination of an analyte comprising (i) a coenzyme dependent enzyme or a substrate for such an enzyme, and (ii) as coenzyme a compound having the following general formula (I):
  • Z a radical comprising a cyclic group with 5 C atoms, which optionally contains one heteroatom selected from O 1 S and N and optionally one or more substituents, and a radical CR4 2 , wherein CR4 2 to the cyclic group and to X2 is bound with
  • R 4 each independently H, F, Cl, CH 3 , with the proviso that Z and the pyridine moiety are not linked by a glycosidic bond, or a salt or optionally a reduced form thereof.
  • W CONH 2 or COCH 3 .
  • Preferred substituents on Z are selected from the group OH, F, Cl and C 1 -C 2 -alkyl, optionally fluorinated or chlorinated and / or OH-substituted, O-C 1 -C 2 -alkyl.
  • a first radical V is OH and a second radical V is a phosphate group.
  • the one OH group and the one phosphate group having the carbon atoms to which they are attached may cycle.
  • a test element for the determination of glucose comprising a glucose dehydrogenase and a compound of general formula (I) as indicated above or a salt thereof.
  • the compounds according to the invention are hydrolysis-stable and good substrates in enzymatic detection methods and can be used for biochemical diagnosis. This finding is in contrast to that of most of the previously known NAD / NADP derivatives, since these derivatives are generally only very briefly stable in enzymatic detection methods.
  • test elements comprising a series of stable NAD / NADP derivatives having sufficient enzymatic activity for use as a coenzyme on the test element.
  • Stable NAD / NADP derivatives can be prepared in well-known synthetic procedures.
  • the amino group is converted by a cyclic amino alcohol via Zincke chemistry in the Pyridiniumderrivat.
  • the primary OH group is subsequently phosphorylated and coupled with an activated AMP derivative to the NAD derivative.
  • the primary OH group can be first phosphorylated and then the amino group can be converted by means of a zinc oxide reaction in a pyridine.
  • Another synthetic route is activation of the primary alcohol to tosylate or iodide and subsequent alkylation of ADP.
  • test element according to the invention include, for example, compounds having the following general formula (I 1 ):
  • A adenine or an analogue of it
  • V each independently OH or a phosphate group
  • Z a saturated or unsaturated carbocyclic or heterocyclic five-membered ring, in particular a compound of the general formula (II)
  • R 5 1 O, S, NH, NC 1 -C 2 -alkyl, CR 4 2 , CHOH, CHOCH 3 ,
  • Another object of the present invention are compounds having the following general formula (I 11 ):
  • A adenine or an analogue of it
  • V each independently OH or a phosphate group
  • Y NH, S, O, CH 2 ,
  • Z a saturated or unsaturated carbocyclic or heterocyclic five-membered ring, in particular compounds of the general formula (II)
  • R5 1 and R5 may be a single or double bond
  • R 4 each independently H, F, Cl, CH 3 ,
  • R5 " CR4 2, CHOH, CHOCH 3, when between R5 1 and R5" is a double bond is present
  • the compounds of this invention contain adenine analogs, such as C 8 and N 6 substituted adenine, deaza variants, such as 7-deaza, azavaries, such as 8-aza, or combinations such as 7-deaza or 8-aza or carbocyclic analogs such as formycin, wherein the 7-deaza variants may be substituted in the 7-position with halogen, Ci-Ce-alkynyl, alkenyl or alkyl.
  • the compounds contain adenosine analogs which, instead of ribose, e.g. 2-methoxy-deoxyribose, 2'-fluoro-deoxyribose, hexitol, altritol or polycyclic analogs such as bicyclo, LNA and tricyclo sugars.
  • ribose e.g. 2-methoxy-deoxyribose, 2'-fluoro-deoxyribose, hexitol, altritol or polycyclic analogs such as bicyclo, LNA and tricyclo sugars.
  • At least one radical U of the compound according to the invention is different from OH and particularly preferably at least one radical U is BH 3 .
  • Particularly preferred embodiments are the derivatives Borano carba-NAD, c-pentyl-NAD, pyrrolyl-NAD, furanyl-NAD, carbo-NAD-cyclophosphate, carba-NADP, pyrrolidinyl-NAD and test elements, including the same:
  • Biochemical detection of analytes for example parameters in body fluids such as blood, serum, plasma or urine, or in wastewater samples or foods play a major role in diagnostics.
  • the analyte to be determined is brought into contact with a suitable enzyme and a coenzyme.
  • Another object of the present invention is therefore an enzyme-coenzyme complex consisting of a compound of the invention in combination with a suitable enzyme.
  • any biological or chemical substances which can be detected by a redox reaction e.g. Substances that are substrates of a coenzyme-dependent enzyme or coenzyme-dependent enzymes themselves.
  • Preferred examples of analytes are glucose, lactic acid, malic acid,
  • Glycerine alcohol, cholesterol, triglycerides, ascorbic acid, cysteine, glutathione, peptides, urea, ammonium, salicylate, pyruvate,
  • CK creatine kinase
  • LDH lactate dehydrogenase
  • the test element preferably contains, in addition to the coenzyme, an enzyme suitable for detecting the substrate.
  • Suitable enzymes are, for example, dehydrogenases selected from a glucose dehydrogenase (EC1.1.1.47), lactate
  • dehydrogenase (EC1.1.1.27, 1.1.1.28), malate dehydrogenase (EC1.1.1.37), glycerol dehydrogenase (EC1.1.1.6), alcohol dehydrogenase (EC1.1.1.1), alpha-hydroxybutyrate dehydrogenase, sorbitol Dehydrogenase or amino acid dehydrogenase, e.g. B. L-amino acid dehydrogenase (E.C.1.4.1.5).
  • Other suitable enzymes are o oxidases, such as glucose oxidase (E.C.1.1.3.4) or cholesterol oxidase (E.C.1.1.3.6) or aminotransferases, such. Aspartate or alanine aminotransferase, 5'-nucleotidase or creatine kinase.
  • the test element preferably contains, in addition to the coenzyme, an enzyme substrate suitable for detecting the enzyme.
  • Another object of the present invention is the use of a compound of the invention or an enzyme-coenzyme complex according to the invention for the detection of an analyte in a sample o by an enzymatic reaction.
  • Particularly preferred here is the detection of glucose by means of glucose dehydrogenase (GlucDH).
  • the alteration of the coenzyme, ie the compound according to the invention, by reaction with the analyte (if the analyte is an enzyme substrate) 5 or by an analyte-catalyzed reaction (if the analyte is an enzyme) can in principle be detected in any manner.
  • all methods known from the prior art for detecting enzymatic reactions can be used here.
  • the change in the coenzyme is detected by optical methods.
  • Optical detection methods include, for example, the measurement of absorption, fluorescence, circular dichroism (CD), optical rotation dispersion (ORD), refractometry, etc.
  • Particularly preferred is the change in the Coenzyms detected by measuring fluorescence.
  • the fluorescence measurement is highly sensitive and enables the detection even of low concentrations of the analyte in miniaturized systems.
  • a liquid test may be used, the reagent being e.g. in the form of a solution or suspension in an aqueous or non-aqueous liquid or as a powder or lyophilisate.
  • a dry test may also be used wherein the reagent is applied to a carrier, a test strip.
  • the carrier may comprise a test strip comprising an absorbent and / or swellable material which is wetted by the sample liquid to be examined.
  • a gel matrix with an enzyme-coenzyme complex incorporated therein can also be used as the detection reagent (see DE 102 218 45 A1).
  • the enzyme can either be polymerized into the matrix together with the compound according to the invention or the matrix can be brought into contact after the polymerization in the presence of the enzyme with a solution of the coenzyme, so that the corresponding enzyme-coenzyme complex is formed.
  • the reagent kit may contain a compound of the invention, a suitable enzyme and a suitable reaction buffer. Suitable enzymes have already been described.
  • the reagent kit according to the invention is versatile and can be used for the determination of analytes, such as. As glucose, lactic acid, malic acid, glycerol, alcohol, cholesterol, triglycerides, ascorbic acid, cysteine, glutathione, peptides, urea, ammonium, salicylate, pyruvate, 5'-nucleotidase, CK, LDH, carbon dioxide, etc., can be used.
  • Preferred is a reagent kit, which is a Compound of the invention and glucose dehydrogenase (EC1.1.1.47) contains, for the detection of glucose in the blood.
  • the reagent kit of the invention can be used to detect an analyte in a dry or liquid assay.
  • a further subject of the present invention comprises a test strip for the fluorometric or photometric detection of an analyte.
  • a test strip contains a compound as previously indicated as a coenzyme and a suitable enzyme or enzyme substrate immobilized on an absorbent or / and swellable material. Suitable materials may e.g. be selected from celluloses, plastics, etc.
  • a further subject of the present invention comprises a method for detecting an analyte, comprising the steps:
  • a further advantage of the invention is that the fluorescence emission of the coenzyme exhibits a bathochromic shift, so that there is little interference with the fluorescence emission of other materials of the test element or / and the sample.
  • FIG. 1 A first figure.
  • Figure 6A76B Absorption spectra of NAD and pNAD ( Figure 6A) and NADH and pNADH, respectively ( Figure 6B).
  • FIG. 7 is a diagrammatic representation of FIG. 7
  • NAD / NADH derivatives The preparation of stable NAD / NADH derivatives is exemplified by the preparation of carbaNAD (compound 9, FIG. 1) and pyrrolidine NAD (compound 18, FIG. 5). Further derivatives can be prepared by appropriate synthesis methods.
  • the corresponding amino alcohols as starting reagents are known from the literature: 2-amino-1,4-anhydro-2,3-dideoxy-L-threo-pentitol: Huryn, Donna M .;
  • the solvents are distilled off on a rotary evaporator. It is stirred with 100 ml and distilled off again on a rotary evaporator. It is then dissolved in 600 ml of deionized water and mixed with 35 g of activated carbon. The mixture is stirred vigorously for 1 h and then filtered through a Seitz depth filter K 250. From the filtrate, the water is distilled off on a rotary evaporator. The product is used without further purification.
  • TDM reagent Solution 1: 10 g of N, N, N ', N'-tetramethyl-4,4'-diaminodiphenylmethane in 40 ml of glacial acetic acid and 200 ml of deionized water.
  • Solution 2 20 g of potassium chloride in 400 ml of deionized water.
  • Solution 3 Dissolve 0.3 g of ninhydrin in 10 ml of glacial acetic acid and add 90 ml of deionized water.
  • Ready reagent mixture of solution 1 and 2 and addition of 6 ml of solution 3.
  • the crude product 1 is refluxed for 1 h in 200 ml of absolute ethanol. After adding 400 ml (3.26 mol) of dimethoxypropane and 250 mg (2.2 mmol) of pyridine hydrochloride, the mixture is boiled under reflux for a further 15 min heated. After addition of 10 ml of saturated sodium bicarbonate solution, the solution is Rotary evaporator concentrated under vacuum to dryness. The residue is combined with 500 ml of chloroform, 150 ml of saturated sodium chloride solution and 75 ml of saturated sodium bicarbonate solution and transferred to a separating funnel. After shaking it is allowed to stand overnight, with the phase separation takes place.
  • the organic phase is separated off and the aqueous phase is extracted twice more with 200 ml of chloroform each time.
  • the crude product 3 is dissolved with stirring in 400 ml of tetrahydrofuran and 80 ml of deionized water was added. After cooling to 4 ° C., 5.3 g of sodium borohydride are added in one portion and stirred overnight, during which the mixture is allowed to warm slowly to room temperature. 100 ml of ethanol are added and the mixture is stirred at room temperature for 6 hours. The solvents are distilled off under reduced pressure on a rotary evaporator. There are added 300 ml of saturated sodium chloride solution and 650 ml of ethyl acetate and transferred to a separating funnel.
  • the organic phase is separated and the aqueous phase washed again with 350 ml of ethyl acetate.
  • the combined organic phases are dried over magnesium sulfate. After filtering off the drying agent, the solvent is distilled off under reduced pressure on a rotary evaporator.
  • the filtrate is applied to a Dowex 1X8 (100-200 mesh, OH-form) ion exchange column (15 x 4.9 cm) and eluted with water, the product being eluted after about 150 ml in a volume of 300 ml. (pH 10.4).
  • the solvent is distilled off on a rotary evaporator in vacuo, yield: 5.2 g of colorless oil.
  • the separated aqueous phase is mixed with 300 ml and 50 g of activated charcoal, stirred for 1 h at room temperature and then filtered through a Seitz depth filter K 700.
  • the filtrate is concentrated on a rotary evaporator in vacuo to about 100 ml, the bath temperature may not rise above 20 0 C. It is diluted with 300 ml of water and 70 g of sodium tetrafluoroborate are added with stirring at room temperature.
  • the precipitate is recrystallized from methanol / water. The crystals are filtered off with a little acetone and then washed with diethyl ether and dried under high vacuum at 40 0 C for 24 h, yield 21, 1 g 23%).
  • the solvent is distilled off on a rotary evaporator in vacuo.
  • the saline residue is boiled with 500 ml of hot ethanol. It is filtered hot and allowed to stand for 12 h at Jardintempertur.
  • the precipitate is filtered off and the solvent is distilled off from the filtrate under reduced pressure on a rotary evaporator. Yield 7 g.
  • a 10 mM solution of carbaNAD or NAD is loaded at pH 8 in 0.1 M potassium phosphate buffer. The content is determined after 0.25, 75 and 175 h by means of HPLC chromatography.
  • Buffer A 10OmM KHPO 4 + 1OmM tetrabutylammonium hydrogen sulfate, pH 6.9
  • Buffer B buffer A + acetone itri 1 1: 1 flow rate 1, 0 ml / min detection: 254 nm RP18 column L 125 diameter 4.6 mm
  • FIGS. 2 and 3 show the HPLC area percentages after loading at different times.
  • decomposition products (nicotinic acid amide, ADP-ribose, AMP, ADP and the unknown decomposition products for NAD and the unknown decomposition products Y1 and Y2 for cNAD) shows that cNAD is very stable compared to NAD.
  • trans-Nt-BOC-O-mesyl-4-hydroxy-L-prolinol (35.4 g, 120 mmol) was initially charged dissolved in 500 mL of DMF, sodium azide (15.6 g, 240 mmol) dissolved in 75 mL of water was added and heated to 70 0 C for 5 h. The mixture was then stirred overnight at room temperature, the mixture in 1000 ml of sat. Saline solution and extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate was dried with Na 2 SO 4 and then evaporated.
  • the ethyl acetate phase contained the byproduct dinitroaniline, the water phase contained product and residual zinc salt.
  • the aqueous phase was evaporated in vacuo at room temperature and the residue obtained with 10 ml of water, 10 min on a magnetic stirrer and stirred and filtered off insoluble parts. The product remained solved.
  • This solution was applied to a water-rinsed Diaion HP20 column (1000 ml) and rinsed twice with 1000 ml of water. It was then rinsed with water / 5% isopropanol and positive fractions (detected with DC RP8 MeOH / W 9/1) were evaporated at room temperature. The residue was triturated with isopropanol and filtered with suction with the aid of diethyl ether.
  • AMP acid (adenosine monophosphate-free acid) (10 g, 27.5 mmol) in 60 mL of methanol (dried with sodium) and 5.3 mL (60 mmol) of morpholine (freshly distilled) was stirred until clear Solution was created. Subsequently, 17 g (82.5 mmol) of N 1 N 1 -dicyclohexylcarbodiimide (DCC) were added and stirred overnight at room temperature with exclusion of moisture. The resulting precipitate (DCH) was filtered off and the filtrate at 30 0 C evaporated. The mixture was then stirred with 150 ml of H 2 O / 150 ml of diethyl ether and filtered again.
  • DCC N 1 N 1 -dicyclohexylcarbodiimide
  • the purification was carried out in 2 portions of 200 mg and 300 mg in 2 separation steps each:
  • Diaion HP20, column D (inside) 30 mm L (packing) 130 mm eluted with 100 ml H 2 O and 100 ml H 2 O / 5% isopropanol 5 substance already comes with the water phase, in the isopropanol part is only contamination ,
  • GlucDH glucose dehydrogenase
  • a glucose DH activity assay was performed in 0.1 M Tris / 0.2 M NaCI (pH 8.5) buffer. The concentration of glucose was 80 mM. PNAD or NAD concentrations of 0.05-0.5 mM were used. To this was added 10 (pNAD) or 0.002 mg / ml (NAD), [83 or 0.017 ⁇ m] GlucDH. The assay was at room temperature carried out, wherein the enzymatic reaction was monitored by recording absorption spectra at regular intervals. The values given in Table 1 refer to an absorption measurement after 4 min.
  • NAD and pNAD show an absorption maximum at 260 nm.
  • PNADH i. pNAD after GlucDH activity assay, shows a red shift of the absorption maximum of about 10 nm in comparison to NADH (FIG. 6B).
  • FIGS. 7 and 8 also show fluorescence spectra of NADH and pNADH as the GlucDH complex. The spectra were each taken after GlucDH activity assay.
  • Figure 7 shows emission spectra of NADH / pNADH-GlucDH complexes at excitation wavelengths of 340 or 370 nm. The emission spectra of NADH and pNADH at 370 nm excitation wavelength are similar.
  • FIG. 8 shows an excitation spectrum for an NADH / pNADH-Gluc-DH complex at an emission wavelength of 460 nm.
  • PNADH shows a broader excitation spectrum than NADH. The spectra were again recorded after GlucDH activity assays. Stability study of pNAD
  • the elution was monitored by detection at 260 nm.
  • the major fraction was collected and lyophilized 5x to remove the triethylammonium acetate.
  • the triethylammonium salt was converted to the free acid with Dowex 50 WX2 and then to the lithium salt. Yield: 10 mg.
  • a glucose dehydrogenase activity assay for cNAD was performed in comparison to NAD.
  • glucose dehydrogenase concentrations of 0.1 (cNAD) or 0.002 mg / ml (NAD) 1 [0.83 or 0.017 ⁇ m] were used. The amounts and results used are shown in Table 2.
  • Figures 10A, 10B and 10C show absorption spectra of NAD and cNAD. Both NAD and cNAD have an absorption maximum at 260 nm.
  • Figure 10B shows absorption spectra of NADH and cNADH, the spectra of which were each taken after a glucose dehydrogenase activity assay. The absorption maximum of cNADH shows a redshift of 20 nm. Further absorption spectra for NADH and cNADH are shown in Figure 10C, with different conditions for the associated glucose dehydrogenase activity assays as indicated in the legend.
  • Figure 11 also shows fluorescence spectra of NADH and cNADH as the GlucDH complex.
  • the spectra were at an excitation wavelength of Recorded at 370 nm after glucose dehydrogenase activity assay. Both NADH and cNADH show an increase in the fluorescence signal when treated with GlucDH.

Abstract

Die Erfindung betrifft stabile Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD/NADH)- bzw. Nicotinamid-Adenin-Dinukleotidphosphat (NADP/NADPH)-Derivate der Formel (I), Enzym-Komplexe dieser Derivate und ihre Verwendung in biochemischen Nachweisverfahren und Reagenzienkits.

Description

Stabile NAD/NADH-Derivate
Beschreibung
Die Erfindung betrifft stabile Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD/NADH)- bzw. Nicotinamid-Adenin-Dinukleotidphosphat (NADP/NADPH)-Derivate, Enzym-Komplexe dieser Derivate und ihre Verwendung in biochemischen Nachweisverfahren und Reagenzienkits.
Messsysteme zur biochemischen Analytik sind wichtige Bestandteile klinisch relevanter Analyseverfahren. Hierbei steht die Messung von Analyten, z.B. Metaboliten oder Substraten, im Vordergrund, welche mit Hilfe eines Enzyms direkt oder indirekt bestimmt werden. Die Analyten werden hferbei mit Hilfe eines Enzym-Coenzym-Komplexes umgesetzt und anschließend quantifiziert. Dabei wird der zu bestimmende Analyt mit einem geeigneten Enzym und einem Coenzym in Kontakt gebracht, wobei das Enzym meist in katalytischen Mengen eingesetzt wird. Das Coenzym wird durch die enzymatische Reaktion verändert, z.B. oxidiert bzw. reduziert. Dieser Vorgang kann direkt oder durch einen Mediator elektrochemisch oder photometrisch erfasst werden. Eine Kalibrierung liefert einen direkten Zusammenhang des Messwerts mit der Konzentration des zu bestimmenden Analyten.
Coenzyme sind organische Moleküle, die kovalent oder nicht-kovalent an ein Enzym gebunden sind und durch die Umsetzung des Analyten verändert werden. Prominente Beispiele für Coenzyme sind Nicotinamid-Adenin- Dinukleotid (NAD) bzw. Nicotinamid-Adenin-Dinukleotidphosphat (NADP), aus denen durch Reduktion NADH bzw. NADPH entstehen.
Aus dem Stand der Technik bekannte Messsysteme zeichnen sich durch eine zeitlich begrenzte Haltbarkeit sowie durch spezielle Anforderungen an die Umgebung, wie Kühlung oder trockene Lagerung, zur Erzielung dieser
Haltbarkeit aus. Bei bestimmten Anwendungsformen, z.B. bei Tests, die vom Endverbraucher selbst durchgeführt werden, wie etwa beim Blutglucose- Selbstmonitoring, können daher Fehlergebnisse durch falsche, unbemerkte Fehllagerung vorkommen. Besonders die Erschöpfung von Trocknungsmitteln durch zu langes öffnen der Primärverpackungen kann zu Fehlmessungen führen, die bei manchen Systemen vom Verbraucher kaum zu erkennen sind.
Eine bekannte Maßnahme, die zur Erhöhung der Stabilität von biochemischen Messsystemen eingesetzt wird, ist die Verwendung stabiler Enzyme, z.B. die Verwendung von Enzymen aus thermophilen Organismen. Weiterhin besteht die Möglichkeit, Enzyme durch chemische Modifizierung, z.B. Quervemetzung, oder durch Mutagenese zu stabilisieren. Darüber hinaus können auch Enzymstabilisatoren, wie z.B. Trehalose, Polyvinylpyrrolidon und Serumalbumin, zugesetzt werden oder die Enzyme z.B. durch Photopolymerisation in Polymernetzwerke eingeschlossen werden.
Weiterhin wird versucht, die Haltbarkeit biochemischer Messsysteme durch Verwendung stabiler Mediatoren zu verbessern. So wird durch die Verwendung von Mediatoren mit möglichst niedrigem Redoxpotential die Spezifität von Tests erhöht und Störungen während der Reaktion eliminiert. Eine untere Grenze für das Redoxpotential von Mediatoren bilden jedoch die Redoxpotentiale der Enzym/Coenzymkomplexe. Werden diese unterschritten, wird die Reaktion mit den Mediatoren verlangsamt oder gar unterbunden.
Alternativ können auch biochemische Messsysteme ohne Mediatoren verwendet werden, bei denen beispielsweise eine direkte Detektion von Coenzymen, z.B. des Coenzyms NADH, erfolgt. Ein Nachteil solcher Messsysteme besteht jedoch darin, dass Coenzyme, wie NAD und NADP, instabil sind.
NAD und NADP sind basenlabile Moleküle, deren Abbauwege in der Literatur beschrieben sind (N.J. Oppenheimer in The Pyridine Nucleotide Coenzyms Academic Press New York, London 1982, Hrsg. J. Everese, B. Anderson, K. You, Kapitel 3, Seiten 56-65). Im wesentlichen entsteht beim Abbau von NAD bzw. NADP ADP-Ribose, indem die Glycosyl-Bindungen zwischen der Ribose und der Pyridineinheit gespalten wird. Die reduzierten Formen NADH und NADPH sind hingegen säurelabil: z.B. ist die Epimerisierung ein bekannter Abbauweg. In beiden Fällen liegt der Instabilität von NAD/NADP und NADH/NADPH die Labilität der Glykosyl- Bindung zwischen der Ribose- und der Pyridineinheit zugrunde. Aber auch unter nicht drastischen Bedingungen, wie z.B. in wässriger Lösung, geschieht die Hydrolyse der Coenzyme NAD bzw. NADP allein schon durch die Umgebungsfeuchte. Diese Instabilität kann zu Ungenauigkeiten bei der Messung von Analyten führen.
Eine Reihe von NAD/NADP-Derivaten wird z.B. in B. M. Anderson in the Pyridine Nucleotide Coenzymes, Academic Press New York, London 1982 , Hrsg. J. Everese, B. Anderson, K. You, Kapitel 4 beschrieben. Die meisten dieser Derivate werden allerdings nicht gut von Enzymen akzeptiert. Das einzige Derivat, das daher bisher für diagnostische Tests verwendet wurde, ist 3-Acetylpyridin-Adenin-Dinukleotid (Acetyl NAD), welches erstmals 1956 beschrieben wurde (N.O. Kaplan, J. Biol. Chem. (1956), 221 , 823). Auch dieses Coenzym zeigt eine geringe Akzeptanz von Enzymen und eine Änderung im Redoxpotential.
In WO 01/94370 ist die Verwendung weiterer NAD-Derivate mit einer modifizierten Pyridin-Gruppe beschrieben. Modifikationen der Nicotinamid- Gruppe haben jedoch generell direkten Einfluss auf die katalytische Reaktion. In den meisten Fällen ist dieser Einfluss negativ.
In einem weiteren Stabilisierungskonzept wurde die Ribose-Einheit verändert, um dadurch die Stabilität der Glycosyl-Bindung zu beeinflussen. Dieses Vorgehen interferiert nicht direkt mit der katalytischen Reaktion der Nicotinamid-Gruppe. Es kann jedoch ein indirekter Einfluss bestehen, sobald das Enzym eine starke und spezifische Bindung an die Ribose- Einheit aufweist. Kaufmann et al. offenbaren diesbezüglich in WO 98/33936 und US 5,801 ,006 bzw. in WO 01/49247 eine Reihe von Thioribose-NAD Derivaten. Ein Zusammenhang zwischen der Modifizierung der Nicotinamid- Riboseeinheit und der Aktivität der Derivate in enzymatischen Reaktionen wurde bisher jedoch nicht gezeigt.
carbaNAD, ein Derivat ohne Glycosyl-Bindung, wurde erstmals 1988 beschrieben (J.T. Slama, Biochemistry 1989, 27, 183 und Biochemistry 1989, 28, 7688). Die Ribose wird hierin durch eine carbazyklische Zucker- Einheit substituiert. carbaNAD wurde zwar als Substrat für Dehydrogenasen beschrieben, seine Aktivität wurde bisher jedoch nicht in biochemischen Nachweisverfahren in der Klinik nachgewiesen.
Ein ähnlicher Ansatz wurde später von G. M. Blackburn, Chem. Comm., 1996, 2765 beschrieben, um carbaNAD mit einer Methylenbisphosphonat- Verbindung an Stelle des natürlichen Pyrophosphats herzustellen. Das Methylenbisphosphonat zeigt erhöhte Stabilität gegen Phosphatasen und wurde als Inhibitor für ADP-Ribosylcyclase verwendet. Eine Stabilitätserhöhung gegenüber Hydrolyse war nicht das Ziel (J.T. Slama, G.M. Blackburn).
Die zugrunde liegende Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, stabile bioanalytische Messsysteme, insbesondere zur Bestimmung von Glucose, bereitzustellen, die die Hydrolyseempfindlichkeit von NAD/NADP vermeiden und gleichzeitig als Coenzyme in Enzymreaktionen aktiv sind.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Testelement zur Bestimmung eines Analyten, umfassend (i) ein Coenzym abhängiges Enzym oder ein Substrat für ein derartiges Enzym, und (ii) als Coenzym eine Verbindung mit folgender allgemeiner Formel (I):
Figure imgf000006_0001
(I)
mit A = Adenin oder ein Analog davon, T = jeweils unabhängig O, S, U = jeweils unabhängig OH, SH, BH3 ", BCNH2 ", V = jeweils unabhängig OH oder eine Phosphatgruppe, W W == COOR1 CON(R)2, COR, CSN(R)2 mit R = jeweils unabhängig H oder Ci-C2-Alkyl,
X1 , X2 = jeweils unabhängig O, CH2, CHCH3, C(CH3)2, NH, NCH3, Y = NH, S, O, CH2,
Z = ein Rest, umfassend eine cyclische Gruppe mit 5 C-Atomen, die gegebenenfalls ein Heteroatom ausgewählt aus O1 S und N sowie gegebenenfalls einen oder mehrere Substituenten enthält, und einen Rest CR42, wobei CR42 an die cyclische Gruppe und an X2 gebunden ist, mit
R4 = jeweils unabhängig H, F, Cl, CH3, mit der Maßgabe, dass Z und der Pyridin-Rest nicht durch eine glycosidische Bindung verknüpft sind, oder ein Salz oder gegebenenfalls eine reduzierte Form davon.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist W = CONH2 oder COCH3.
Bevorzugte Substituenten an Z sind ausgewählt aus der Gruppe OH, F, Cl sowie Ci-C2-Alkyl, gegebenenfalls fluoriert oder chloriert oder/und OH- substituiert, O-Ci-C2-Alkyl.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein erster Rest V OH und ein zweiter Rest V eine Phosphatgruppe. Gegebenenfalls können die eine OH- Gruppe und die eine Phosphatgruppe mit den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, einen Zyklus bilden.
In einer bevorzugten Ausfϋhrungsform wird ein Testelement zur Bestimmung von Glucose bereitgestellt, umfassend eine Glucose- Dehydrogenase und eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie oben angegeben oder ein Salz davon.
Überraschenderweise sind die erfindungsgemäßen Verbindungen Hydrolyse-stabil und gute Substrate in enzymatischen Nachweisverfahren und können zur biochemischen Diagnostik eingesetzt werden. Dieser Befund steht im Gegensatz zu dem der meisten der bisher bekannten NAD/NADP-Derivate, da diese Derivate in enzymatischen Nachweisverfahren in der Regel nur sehr kurz stabil sind.
Die Vorteile der erfindungsgemässen Verbindungen gegenüber dem Stand der Technik sind:
- hohe Stabilität, hohe enzymatische Aktivität, - einfache und kostengünstige Synthese,
- Anwendbarkeit in allen bisher bekannten biochemischen Nachweisverfahren.
Durch die Bereitstellung stabiler NAD/NADP-Derivate mit der vorliegenden Erfindung bevorzugt in Kombination mit einer stabilisierenden Rezeptur, wie z.B. durch den Einschluss von Enzymen in Polymernetzwerke, können die Nachteile der bisher bekannten biochemischen Nachweisverfahren weitgehend vermieden werden. Weiterhin müssen keine stabilisierenden Zusätze eingesetzt werden. Dieses ist insbesondere vorteilhaft, da, je geringer die Anzahl der beteiligten, reaktiven Substanzen ist, die Chance höher ist, eine stabile Rezeptur für die Analyten-Bestimmung zu erhalten.
Mit der vorliegenden Erfindung werden Testelemente, umfassend eine Reihe stabiler NAD/NADP-Derivate, die für den Einsatz als Coenzym auf dem Testelement eine ausreichende enzymatische Aktivität besitzen, zur Verfügung gestellt.
Stabile NAD/NADP-Derivate können in allgemein bekannten Syntheseverfahren hergestellt werden. Hierzu wird von einem cyclischen Aminoalkohol die Aminogruppe via Zincke Chemie in das Pyridiniumderrivat überführt. Die primäre OH-Gruppe wird anschließend phosphoryliert und mit einem aktivierten AMP-Derivat zum NAD-Derivat gekoppelt. Alternativ kann auch die primäre OH-Gruppe zuerst phosphoryliert werden und dann die Aminogruppe mittels Zinckereaktion in einem Pyridin überführt werden.
Eine weitere Syntheseroute ist die Aktivierung des primären Alkohols zum Tosylat oder Jodid und die anschließende Alkylierung von ADP.
Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Testelements umfassen z.B. Verbindungen mit folgender allgemeiner Formel (I1):
Figure imgf000008_0001
(I1) mit
A = Adenin oder ein Analog davon,
T = jeweils unabhängig O, S, U = jeweils unabhängig OH, SH, BH3 ', BCNH2 ',
V = jeweils unabhängig OH oder eine Phosphatgruppe,
W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 mit R = jeweils unabhängig H oder Ci-C2-Alkyl,
X1 , X2 = jeweils unabhängig O, CH2, CHCH3, C(CH3)2, NH, NCH3, Y = NH1 S1 O1 CH2,
Z = ein gesättiger oder ungesättigter carbocyclischer oder heterocyclischer Fünfring, insbesondere eine Verbindung der allgemeinen Formel (II)
Figure imgf000009_0001
(II) wobei zwischen R51 und R5" eine Einfach- oder Doppelbindung vorliegen kann,
R4 = jeweils unabhängig H, F, Cl, CH3, R5 = CR42, wenn zwischen R51 und R5" eine Einfachbindung vorliegt, ist
R51 = O, S, NH, NC1-C2-AIkVl, CR42, CHOH, CHOCH3,
R5" = CR42, CHOH, CHOCH3, wenn zwischen R51 und R5" eine Doppelbindung vorliegt, ist R5'=R5"=CR4, R6, R61 = jeweils unabhängig CH, CCH3, oder ein Salz oder gegebenenfalls eine reduzierte Form davon.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen mit folgender allgemeiner Formel (I11):
Figure imgf000010_0001
(I")
mit
A = Adenin oder ein Analog davon,
T = jeweils unabhängig O, S1
U = jeweils unabhängig OH, SH, BH3\ BCNH2-,
V = jeweils unabhängig OH oder eine Phosphatgruppe,
W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 mit R = jeweils unabhängig H oder Ci-C2-Alkyl, X1 , X2 = jeweils unabhängig O1 CH2, CHCH3, C(CH3)2, NH, NCH3,
Y = NH, S, O, CH2,
Z = ein gesättiger oder ungesättigter carbocyclischer oder heterocyclischer Fünfring, insbesondere Verbindungen der allgemeinen Formel (II)
Figure imgf000010_0002
(H)
wobei zwischen R51 und R5" eine Einfach- oder Doppelbindung vorliegen kann,
R4 = jeweils unabhängig H, F, Cl, CH3,
R5 = CR42, wenn zwischen R5' und R5" eine Einfachbindung vorliegt, ist R51 = O, S, NH, NCi-C2-AIkVl, CR42) CHOH, CHOCH3,
R5" = CR42, CHOH, CHOCH3, wenn zwischen R51 und R5" eine Doppelbindung vorliegt, ist R5'=R5"=CR4, R6, R61 = jeweils unabhängig CH, CCH3, mit der Maßgabe, dass wenn R5 = CH2, T = O, U = jeweils OH, V = OH1 W =
CONH2, X = O und Y = O sind, dann sind R51 und R5" nicht gleichzeitig
CHOH, oder ein Salz oder gegebenenfalls eine reduzierte Form davon.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen Verbindungen Adenin-Analoga, wie z.B. C8- und N6-substituiertes Adenin, Deaza-Varianten wie 7-Deaza, Azavarianten wie 8-Aza oder Kombinationen wie 7-Deaza oder 8-Aza oder carbocyclische Analoga, wie Formycin, wobei die 7-Deazavarianten in der 7-Position mit Halogen, Ci-Ce-Alkinyl, -Alkenyl oder -Alkyl substituiert sein können.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthalten die Verbindungen Adenosin-Analoga, welche statt Ribose z.B. 2-Methoxy-deoxyribose, 2'-Fluoro-deoxyribose, Hexitol, Altritol bzw. polycyclische Analoga, wie Bicyclo-, LNA- und Tricyclo-Zucker enthalten.
Insbesondere können auch (Di-)-Phosphatsauerstoffe isotronisch ersetzt sein, wie z.B. O- durch S" bzw. BH3-, O durch NH, NCH3 bzw. CH2 und =O durch =S.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist mindestens ein Rest U der erfindungsgemäßen Verbindung verschieden von OH und besonders bevorzugt ist mindestens ein Rest U = BH3.
Insbesondere bevorzugte Ausführungsformen sind die Derivate Borano carba-NAD, c-Pentyl-NAD, Pyrrolyl-NAD, Furanyl-NAD, carba- NADcyclophosphat, carba-NADP, Pyrrolidinyl-NAD sowie Testelemente, umfassend dieselben:
Figure imgf000012_0001
Borano carba NAD
Figure imgf000012_0002
Cyclopentyl NAD
Figure imgf000012_0003
Pyrrolyl NAD
Figure imgf000013_0001
Furanyl NAD
Figure imgf000013_0002
carba NADcyclophosphat
Figure imgf000013_0003
carba NADP
Figure imgf000014_0001
Pyrrolidinyl NAD
Biochemische Nachweise von Analyten, beispielsweise Parametern in Körperflüssigkeiten, wie etwa Blut, Serum, Plasma oder Urin, bzw. in Abwasserproben oder Lebensmitteln spielen eine große Rolle in der Diagnostik. Dabei wird der zu bestimmende Analyt mit einem geeigneten Enzym und einem Coenzym in Kontakt gebracht.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Enzym- Coenzym-Komplex bestehend aus einer erfindungsgemässen Verbindung in Kombination mit einem geeigneten Enzym.
Als Analyten können beliebige biologische oder chemische Substanzen bestimmt werden, die durch eine Redoxreaktion nachgewiesen werden können, z.B. Substanzen, bei denen es sich um Substrate eines Coenzym- abhängigen Enzyms handelt oder Coenzym-abhängige Enzyme selbst.
Bevorzugte Beispiele für Analyten sind Glucose, Milchsäure, Äpfelsäure,
Glycerin, Alkohol, Cholesterin, Triglyceride, Ascorbinsäure, Cystein, Glutathion, Peptide, Harnstoff, Ammonium, Salicylat, Pyruvat,
5'-Nukleotidase, Creatinkinase (CK), Lactat-Dehydrogenase (LDH),
Kohlendioxid etc. Beim Nachweis von Enzymsubstraten enthält das Testelement vorzugsweise neben dem Coenzym ein zum Nachweis des Substrats geeignetes Enzym. Geeignete Enzyme sind z.B. Dehydrogenasen, ausgewählt aus einer Glucose-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.47), Lactat-
5 Dehydrogenase (E.C.1.1.1.27, 1.1.1.28), Malat-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.37), Glycerin-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.6), Alkohol- Dehydrogenase (E.C.1.1.1.1 ), alpha-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase, Sorbitol-Dehydrogenase oder Aminosäure-Dehydrogenase, z. B. L- Aminosäure-Dehydrogenase (E.C.1.4.1.5). Weitere geeignete Enzyme sind o Oxidasen, wie etwa Glucoseoxidase (E.C.1.1.3.4) oder Cholesterinoxidase (E.C.1.1.3.6) bzw. Aminotransferasen, wie z.B. Aspartat oder Alanin Aminotransferase, 5'-Nukleotidase oder Creatin-Kinase.
Beim Nachweis von Enzymen enthält das Testelement vorzugsweise neben 5 dem Coenzym ein zum Nachweis des Enzyms geeignetes Enzym-Substrat.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen Verbindung oder eines erfindungsgemäßen Enzym-Coenzym-Komplexes zum Nachweis eines Analyten in einer Probe o durch eine enzymatische Reaktion. Besonders bevorzugt ist hierbei der Nachweis von Glucose mit Hilfe von Glucose-Dehydrogenase (GlucDH).
Die Veränderung des Coenzyms, d.h. der erfindungsgemäßen Verbindung, durch Reaktion mit dem Analyten (wenn der Analyt ein Enzymsubstrat ist) 5 bzw. durch eine Analyt-katalysierte Reaktion (wenn der Analyt ein Enzym ist) kann grundsätzlich auf beliebige Art und Weise nachgewiesen werden. Hier können grundsätzlich alle aus dem Stand der Technik bekannten Methoden zum Nachweis enzymatischer Reaktionen eingesetzt werden. Vorzugsweise wird jedoch die Veränderung des Coenzyms durch optische o Methoden nachgewiesen. Optische Nachweismethoden umfassen beispielsweise die Messung von Absorption, Fluoreszenz, Circulardichroismus (CD), optische Rotationsdispersion (ORD), Refraktometrie etc. Besonders bevorzugt wird die Veränderung des Coenzyms durch Messung der Fluoreszenz nachgewiesen. Die Fluoreszenzmessung ist hochsensitiv und ermöglicht den Nachweis selbst geringer Konzentrationen des Analyten in miniaturisierten Systemen.
Zum Nachweis eines Analyten kann ein Flüssigtest verwendet werden, wobei das Reagenz z.B. in Form einer Lösung oder Suspension in einer wässrigen oder nichtwässrigen Flüssigkeit oder als Pulver oder Lyophilisat vorliegt. Es kann jedoch auch ein Trockentest verwendet werden, wobei das Reagenz auf einem Träger, einem Teststreifen, aufgebracht ist. Der Träger kann beispielsweise einen Teststreifen, umfassend ein saugfähiges oder/und quellbares Material, umfassen, das von der zu untersuchenden Probeflüssigkeit benetzt wird.
Als Nachweisreagenz kann aber auch eine Gelmatrix mit einem darin eingelagerten Enzym-Coenzym-Komplex verwendet werden (siehe DE 102 218 45 A1).
Das Enzym kann hierbei entweder zusammen mit der erfindungsgemäßen Verbindung in die Matrix einpolymerisiert werden oder die Matrix kann nach der Polymerisation in Gegenwart des Enzyms mit einer Lösung des Coenzyms in Kontakt gebracht werden, so dass sich der entsprechende Enzym-Coenzym-Komplex bildet.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfasst einen Reagenzienkit sowie dessen Verwendung zum Nachweis von Analyten. Der Reagenzienkit kann eine erfindungsgemäße Verbindung, ein geeignetes Enzym sowie einen geigneten Reaktionspuffer enthalten. Geeignete Enzyme wurden bereits beschrieben. Der erfindungsgemäße Reagenzienkit ist vielseitig anwendbar und kann zur Bestimmung von Analyten, wie z. B. Glucose, Milchsäure, Äpfelsäure, Glycerin, Alkohol, Cholesterin, Triglyceride, Ascorbinsäure, Cystein, Glutathion, Peptide, Harnstoff, Ammonium, Salicylat, Pyruvat, 5'-Nukleotidase, CK, LDH, Kohlendioxid etc., verwendet werden. Bevorzugt ist ein Reagenzienkit, welcher eine erfindungsgemäße Verbindung und Glucose-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.47) enthält, zum Nachweis von Glucose im Blut.
Der erfindungsgemäße Reagenzienkit kann zum Nachweis eines Analyten in einem Trocken- oder Flüssigtest verwendet werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfasst einen Teststreifen zum fluorometrischen oder photometrischen Nachweis eines Analyten. Ein solcher Teststreifen enthält eine Verbindung wie zuvor angegeben als Coenzym und ein geeignetes Enzym oder ein Enzymsubstrat immobilisiert auf einem saugfähigen oder/und quellbaren Material. Geeignete Materialien können z.B. aus Cellulosen, Kunststoffen etc. ausgewählt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten, umfassend die Schritte:
(a) Inkontaktbringen einer Probe mit einem erfindungsgemäßen Testelement oder Reagenzienkit, umfassend ein Coenzym und
(b) Nachweisen des Analyten, z.B. anhand der Veränderung des Coenzyms.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die Fluoreszenzemissiαn der Coenzyme eine bathochrome Verschiebung zeigt, so dass eine geringe Interferenz mit der Fluoreszenzemission anderer Materialien des Testelements oder/und der Probe besteht.
Alle dargestellten bevorzugten Ausführungsformen eines Gegenstands der vorliegenden Erfindung sollen für die weiteren Gegenstände der Erfindung gelten, wie z.B. bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verbindungen. Die Erfindung soll durch die nachfolgenden Figuren und Beispiele näher erläutert werden.
Figuren
Figur 1
Darstellung des Syntheseverfahrens von carbaNAD (cNAD).
Figur 2 Darstellung der Ergebnisse der Belastung von NAD bei 8 0C und 37 0C
Figur 3
Darstellung der Ergebnisse der Belastung von carbaNAD bei 8 0C und 37 0C
Figur 4
Darstellung des Syntheseverfahrens von Borano NAD durch Alkylierung von ADP, mit Y = BH3 nur Alkylierung an beta-Phosphat des ADP.
Figur 5 Darstellung des Syntheseverfahrens von Pyrrolidinyl-NAD (pNAD). Neben den Strukturformeln sind Verbindungsnummern und Ausbeuten der jeweiligen Reaktionsschritte angegeben.
Figur 6A76B Absorptionsspektren von NAD und pNAD (Figur 6A) und NADH bzw. pNADH (Figur 6B).
Figur 7:
Fluoreszenzpektren von NADH und pNADH als GlucDH-Komplex (Emissionsspektren)
Figur 8
Fluoreszenzpektren von NADH und pNADH als GlucDH-Komplex (Anregungsspektren)
Figur 9
Stabilitätsvergleich von NAD und pNAD
Figur 10A/1 OB/1 OC
Absorptionsspektren von NAD und cNAD (Figur 10A) bzw. von NADH und cNADH (Figuren 10B und 10C)
Figur 11
Fluoreszenzpektren von NADH und cNADH als GlucDH-Komplex
Beispiele
Experimentelle Herstellung stabiler NAD/NADH-Derivate
Die Herstellung stabiler NAD/NADH-Derivate wird exemplarisch an der Herstellung von carbaNAD (Verbindung 9, Figur 1) und Pyrrolidin-NAD (Verbindung 18, Figur 5) dargestellt. Weitere Derivate können mit entsprechenden Syntheseverfahren hergestellt werden. Die entsprechenden Amiπoalkohole als Ausgangsreagenzien sind literaturbekannt: 2-Amino-1 ,4-Anhydro-2,3-Dideoxy-L-threo-Pentitol: Huryn, Donna M.;
Sluboski, Barbara C; Tarn, Steve Y.; Todaro, Louis J.; Weigele, Manfred. Tetrahedron Letters (1989), 30(46), 6259-62. 3-Amino-, (1 R,3S)-Cyclopentanemethanol, Beres, J.; Sagi, G.; Tomoskozi, I.; Gruber, L.; Gulacsi, E.; Otvos, L.: Tetrahedron Letters (1988), 29(22), 2681-4
A) Herstellung von carbaNAD
I. 1 R-^-exo-c/s-S.e-Dihydroxy^-azabicyclo^^.ilheptan-S-on (1)
In einem 1 I Rundkolben wird zu einer Lösung von 22,5 g (167 mmol) N- methylmorpholin-N-oxid in 80 ml deionisiertem Wasser eine Lösung von 16,4 g (147 mmol) 1 R-(-)-2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-on in 400 ml Aceton gegeben. Unter Eiskühlung werden innerhalb von 15 min 15 ml (1 ,2 mmol) einer 2,5 % Lösung von Osmiumtetraoxid in te/f-Butanol gegeben. Die Mischung wird anschließend bei Raumtemperatur über Nacht gerührt.
Die Lösemittel werden am Rotationsverdampfer abdestilliert. Es wird mit 100 ml gerührt und nochmals am Rotationsverdampfer abdestilliert. Anschließend wird in 600 ml deionisiertem Wasser gelöst und mit 35 g Aktivkohle versetzt. Die Mischung wird heftig für 1 h gerührt und dann über einen Seitz Tiefenfilter K 250 filtriert. Vom Filtrat wird das Wasser am Rotationsvedampfer abdestilliert. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung eingesetzt.
DC (Merck Silica gel 60 F-254): Essigsäureethylester/Methanol/Eisessig 7:2:1 Rf 0,75 (Ausgangsmaterial), 0,53 (1). Anfärben mit TDM/Entwicklung Chlorkammer
* TDM Reagenz: Lösung 1 : 10 g N,N,N',N'-Tetramethyl-4,4'-diamino- diphenylmethan in 40 ml Eisessig und 200 ml deionisiertem Wasser. Lösung 2: 20 g Kaliumchlorid in 400 ml deionisiertem Wasser. Lösung 3: 0,3 g Ninhydrin in 10 ml Eisessig lösen und 90 ml deionisiertes Wasser zugeben. Fertiges Reagenz: Mischung aus Lösung 1 und 2 und Zugabe von 6 ml von Lösung 3.
II. IR-f-J-exo-cts-S.β-Dimethylmethylendioxy^-azabicyclo^.Z.I] heptan-3-on (2)
Das Rohprodukt 1 wird für 1 h in 200 ml absolutem Ethanol unter Rückfluss zum Sieden erhitzt Nach Zugabe von 400 ml (3,26 mol) Dimethoxypropan und 250 mg (2,2 mmol) Pyridinhydrochlorid wird die Mischung für weitere 15 min unter Rückfluss zum Sieden erhitzt. Nach Zugabe von 10 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung wird die Lösung am Rotationsverdampfer unter Vakuum zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird mit 500 ml Chloroform, 150 ml gesättigter Kochsalzlösung und 75 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung versetzt und in einen Scheidetrichter überführt. Nach Ausschütteln wird über Nacht stehengelassen, wobei die Phasentrennung stattfindet.
Die organische Phase wird abgetrennt und die wässrige Phase noch zweimal mit je 200 ml Chloroform extrahiert Die vereinigten organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Abfiltrieren des Trockungsmittels wird das Lösungsmittel unter reduziertem Druck am Rotationsverdampfer abdestilliert. Das Rohprodukt (24,9 g = 92 %) wird ohne weitere Reinigung eingesetzt.
DC (Merck silica gel 60 F-254): Essigsäureethylester/Methanol/Eisessig 7:2:1 Rf 0,84. Anfärben mit TDM/Entwicklung Chlorkammer).
III. 1R-(-)-4-N-tert-butyloxycarbonyl-exo-c/s-5,6-dimethylmetrιylen- dioxy-2-azabicyclo[2.2.1]heptan-3-on (3)
Zu einer Lösung von 24,9 g (135,7 mmol) Rohprodukt 2 in 450 ml abs. Chloroform werden unter Argon 41 ,5 g (190 mmol) Di-te/t-Butyldicarbonat und 0,83 g (6.8 mmol) 4-Dimethylaminopyridin gegeben. Die Mischung wird unter Rühren solange unter Rückfluss zum Sieden erhitzt, bis die Gasentwicklung aufhört. Die Mischung wird über eine Säule, die mit 40 g Silica Gel 60 gefüllt und mit Chloroform äquilibriert ist, gefiltert. Es wird mit 100 ml Chloroform gewaschen. Vom Filtrat wird das Lösungsmittel unter reduziertem Druck am Rotationsverdampfer abdestilliert. Das Rohprodukt wird 60 min bei 10 mbar und 40 0C getrocknet Es wird ohne weitere Reinigung eingesetzt.
DC (Merck Silica gel 60 F-254): Essigsäureethylester/Hexan 3:2 Rf =0,85. Anfärben mit TDM/Entwicklung Chlorkammer). IV. (-)-(1R,2R,3S,4R)-4-(N-fert-butyloxycarbonyl)amino-2,3-dimethyl- methylendioxy-1 -(hydroxymethyl)cyclopentan (4)
Bei Raumtemperatur wird das Rohprodukt 3 unter Rühren in 400 ml Tetrahydrofuran gelöst und 80 ml deionisiertes Wasser zugegeben. Nach Kühlen auf 4 0C werden auf einmal 5,3 g Natriumborhydrid zugegeben und über Nacht gerührt, wobei man die Mischung sich langsam auf Raumtemperatur erwärmen lässt. Es werden 100 ml Ethanol zugegeben und 6 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösemittel werden unter reduziertem Druck am Rotationsverdampfer abdestilliert. Es werden 300 ml gesättigter Natriumchloridlösung und 650 ml Essigester zugeben und in einen Scheidetrichter überführt. Die organische Phase wird abgetrennt und die wässrige Phase nochmals mit 350 ml Essigester gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Abfiltrieren des Trockungsmittels wird das Lösungsmittel unter reduziertem Druck am Rotationsverdampfer abdestilliert. Das Rohprodukt (42,2 g) wird mittels Säulenchromatographie und Silica Gel 60 (Säule h = 93 cm, d = 10 cm) Eluent THF/Hexan 1 :3, dann THF/Hexan 2:3) Fluss 3 l/h. Es werden 40 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen werden mit DC (Merck Silica Gel 60 F-254: Essigsäureethylester/Hexan 3:2 Rf = 0.45. Anfärben mit TDM/Entwicklung Chlorkammer) kontrolliert. Von den vereinigten Produktfraktionen wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer im Vakuum abdestilliert, Ausbeute: 24,9 g.
V. (-)-(1R,2R,3S,4R)-4-Amino-2,3-dihydroxy-1-(hydroxymethyl)cyclo- pentan (5)
Zu 11 ,09 (38,6 mmol) 4 werden 8 ml deionisiertes Wasser und dann 80 ml Trifluoroessigsäure gegeben. Es wird für 6 h bei Raumtemperatur kräftig gerührt, wobei sich eine klare, schwach gelbe Lösung bildet. Es werden 200 ml deionisiertes Wasser hinzugegeben und unter Vakuum am Rotationsverdampfer evaporiert. Es werden nochmals 200 ml deionisiertes Wasser hinzugegeben und wieder unter Vakuum am Rotationsverdampfer evaporiert Das Rohprodukt wird in 100 ml deionisiertem Wasser im Ultraschallbad gelöst und filtriert. Das Filtrat wird auf eine Dowex 1X8 (100- 200 mesh, OH- Form) lonenaustauschersäule (15 x 4,9 cm) aufgetragen und mit Wasser eluiert, wobei das Produkt nach ca. 150 ml in einem Volumen von 300 ml eluiert. (pH 10,4). Die Fraktionen werden mit DC (Merck Silica Gel 60 F-254: Butanol/Eisessig/Wasser 5:2:3 Rf = 0,42, Anfärben mit TDM/Entwicklung Chlorkammer) kontrolliert. Von den vereinigten Produktfraktionen wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer im Vakuum abdestilliert, Ausbeute: 5,2 g farbloses öl.
VI. Zincke Salz des Nicotinamids (6)
Unter Stickstoff werden 58,6 g Dinitrochlorbenzol geschmolzen und dann zu der Schmelze 29,32 g Nicotinamid gegeben. Es wird für 2,5 h bei 110 0C erhitzt. Durch einen Rückflusskühler werden 500 ml eines 3:2(v/v) Ethanol/Wasser-Gemisches zugegeben und unter Rückfluss zum Sieden erhitzt bis eine Lösung entsteht. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur werden 150 ml 50 % Ethanol/Wasser und 100 ml Wasser zugegeben, in eine Scheidetrichter überführt und dreimal mit je 500 ml Chloroform gewaschen. Die abgetrennte wässrige Phase wird mit 300 ml und 50 g Aktivkohle versetzt, für 1 h bei Raumtemperatur gerührt und dann über einen Seitz Tiefenfilter K 700 filtriert. Das Filtrat wird am Rotationsvedampfer im Vakuum auf ca. 100 ml konzentriert, wobei die Badtemperatur nicht über 20 0C steigen darf. Es wird mit 300 ml Wasser verdünnt und unter Rühren bei Raumtemperatur werden 70 g Natriumtetrafluorborat zugegeben. Das Präzipitat wird aus Methanol/Wasser umkristallisiert. Das Kristallisat wird abfiltriert mit wenig Aceton und dann mit Diethylether gewaschen und im Hochvakuum bei 40 0C 24 h getrocknet, Ausbeute 21 ,1 g 23 %). Die Fraktionen werden mit DC (Merck Silica Gel 60 F-254: Butanol/Eisessig/Wasser 5:2:3 Rf = 0,56) kontrolliert. VII. (-)-(1R,2R,3S,4R)-4-(3-Carboxamidopyridin-1-yl)-2,3-dihydroxy-1- (hydroxymethyl)cyclopentan (6) = Carba Nicotinamidmono- nukleosid = carbaNMN
Unter Rühren bei Raumtemperatur wird eine Lösung von 4,5 g (31 mmol) Cylcopentylamin 5 in 110 ml abs. Methanol innerhalb 90 min zu einer Lösung von 15,3 g (40,7 mmol) des Zincke Salzes 6 in 110 ml abs. Methanol getropft. Es wird 1 ml Diisopropylethylamin zugegeben und dann zwei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Es werden 500 ml Wasser zugegeben, in einen Scheidetrichter überführt und zweimal mit je 200 ml Methylenchlorid gewaschen. Von der abgetrennte wässrigen Phase wird das Wasser am Rotationsverdampfer unter Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird in 100 ml Wasser aufgenommen und mittels Säulenchromatographie Sephadex C25 (Na+ form) gereinigt: Säule 70 x 7,5 cm Elution von Puffer A (deionisiertes Wasser) auf Puffer B) 0,35 M NaCI in Wasser, Fluss 200 ml/h. Es werden 15 ml Fraktionen gesammelt und mit DC kontrolliert (Merck silica gel 60 F-254: Butanol/Eisessig/Wasser 5:2:3 Rf 0,22).
Von den vereinigten Produktfraktionen wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer im Vakuum abdestilliert. Der salzhaltige Rückstand wird mit 500 ml heißem Ethanol ausgekocht. Es wird heiß filtriert und 12 h bei Raumtempertur stehen gelassen. Der Niederschlag wird abfiltriert und vom Filtrat das Lösungsmittel unter Vakuum am Rotationsverdampfer abdestilliert. Ausbeute 7 g.
VIII. (-)-(1R,2R,3S,4R)-4-(3-Carboxamidopyridin-1-yl)-2,3-dihydroxy-1- phosphatoylmethyl)cyclopentan (6) = carba NMN-Monophosphat
Zu einer Suspension von 7 g (27,7 mmol) carba NMN in 80 ml trockenem Phosphorsäuretrimethylester wird bei 0 0C eine Mischung aus 20 ml Phosphoroxychlorid und 50 ml Phosphorsäuretrimethylester gegeben. Es wird 2 h bei 0 0C und dann 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Unter Eiskühlung werden 300 ml Wasser zugegeben und die Mischung am Rotationsverdampfer unter Vakuum auf 10 ml eingeengt. Es wird in 100 ml Wasser aufgenommen, filtriert und mittels Säulenchromatographie an Sephadex C25 (NEt3H+ Form) gereinigt: Säule 66 x 9 cm Elution von Puffer A (deionisiertes Wasser) auf Puffer B) 0,60 M Ammoniumacetat, Fluss 200 ml/h. Es werden 15 ml Fraktionen gesammelt und mit DC kontrolliert (Merck silica gel 60 F-254 plates: Isobuttersäure/Ammoniak/Wasser 66:1 :33, Rf 0,25). Von den vereinigten Produktfraktionen wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird in 100 ml Wasser gelöst und lyophilisiert. Diese Prozedur wird dreimal wiederholt. Ausbeute: 4,0 g.
IX. carbaNAD (9)
Bei Raumtemperatur wird innerhalb 1 h eine Lösung von 1 ,25 g (30 mmol) AMP Morpholidat in 40 ml absolutem DMF zu einer Mischung aus einer Lösung von 3,31 g (10 mmol) carbaNMN-Monophosphat in 40 ml absolutem DMF und 78 ml (39 mmol) 3,5 % Tetrazol in abs. Acetonitril getropft. Die Mischung wird 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt.
Unter Kühlung mit Trockeneis/Aceton wird der pH mit einer wässrigen 10 % KHCO3-Lösung auf 6,5 eingestellt. Es wird mit 500 ml Wasser verdünnt und im Vakuum am Rotationsverdampfer vorsichtig bis zur Trocknung eingeengt. Der Rückstand wird in 150 ml deionisiertem Wasser gelöst und mittels Säulenchromatographie an Sephadex QAE 25 (NEt3H+ Form) gereinigt: Säule 65 x 4,5 cm. Elution von Puffer A (deionisiertes Wasser) auf Puffer B) 1 M Triethylammoniumcarbonat, Fluss 200 ml/h: Es werden 15 ml Fraktionen gesammelt und mit DC kontrolliert (Merck silica gel 60 F-254 plates: Isobuttersäure/Ammoniak/Wasser 66:1 :33, Rf 0,47).
Von den vereinigten Produktfraktionen wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer im Vakuum abdestilliert Der Rückstand wird in 100 ml Wasser gelöst und lyophilisiert. Diese Prozedur wird dreimal wiederholt. Ausbeute: 1 ,1 g. Stabilitätsuntersuchung von carbaNAD
Eine 1O mM Lösung von carbaNAD bzw NAD wird bei pH 8 in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer belastet. Der Gehalt wird nach 0,25, 75 und 175 h mittels HPLC-Chromatographie ermittelt.
Puffer A: 10O mM KHPO4 + 1O mM Tetrabutylammoniomhydrogensulfat, pH 6,9
Puffer B: Puffer A + Aceton itri 1 1 :1 Flussrate 1 ,0 ml/min Detektion: 254 nm RP18 Säule L 125 diameter 4,6 mm
Gradient: in 40 min auf 35 % Puffer B halten, für 2 min dann innerhalb 3 min auf 0 % Puffer A
In den Figuren 2 und 3 werden die HPLC Flächenprozente nach Belastung zu unterschiedlichen Zeiten dargestellt.
Anhand des Auftretens von Zersetzungsprodukten (Nicotinsäureamid, ADP- Ribose, AMP, ADP und die unbekannten Zersetzungsprodukte für NAD sowie die unbekannten Zersetzungsprodukte Y1 und Y2 für cNAD) zeigt sich, dass cNAD im Vergleich zu NAD sehr stabil ist.
B) Herstellung von Pyrrolidinyl-NAD
I. Synthese pNAD 1. Stufe (Verbindung 10)
Figure imgf000027_0002
Figure imgf000027_0001
(10)
trans-N-t-BOC-O-mesyl-4-hydroxy-L-prolinol (35,4 g, 120 mmol) wurden in 500 ml DMF gelöst vorgelegt, Natriumazid (15,6 g, 240 mmol) gelöst in 75 ml Wasser zugegeben und 5 h auf 70 0C erwärmt. Anschließend wurde über Nacht bei Raumtemperatur nachgerührt, das Gemisch in 1000 ml ges. Kochsalzlösung gegossen und mit Essigester extrahiert. Der Essigester wurde mit Na2SO4 getrocknet und anschließend eingedampft.
Es ergaben sich 32,8 g (> 100 %) Rückstand (theoretischer Wert: 29 g).
Das Rohprodukt wurde nach DC und MS-Kontrolle direkt weiter verarbeitet. Zur Kontrolle wurde Dünnschichtchromatographie auf einer KG 60 F254 Platte (Laufmittel: Essigester/besprüht mit Ninhydrin) durchgeführt: trans-N-t-BOC-O-mesyl-4-hydroxy-L-prolinol RF. 0,49 Produkt RF. 0,78 MS ESI ES+ 242 Die Identität des Produkts wurde ferner durch NMR-Untersuchung bestätigt.
*trans-N-t-BOC-O-mesyl-4-hydroxy-L-prolinol ist käuflich erhältlich bei Sanochemia Pharmazeutika AG, Kat.-Nr. P -719 II. Synthese pN AD 2. Stufe (Verbindung 11 )
N
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000028_0002
(10) (11)
Verbindung 10 (120 mmol) wurde in 500 ml Methanol mit 2,0 g Pd-Kohle (10%ig) vermischt und 12 h bei 30 mbar hydriert. Dabei wurde der Reaktionskolben mehrmals mit H2 gespült, der Katalysator abgesaugt und eingedampft.
Es ergab sich ein farbloses Öl (sollte wegen hoher Luftempfindlichkeit sofort weiter verarbeitet werden). MS ESI ES+217 vorhanden DC (Isohexan/Essigester 1/1 / KG 254 F/Ninhydrin): Produkt bleibt am Start Die Identität des Produkts wurde ferner durch NMR-Untersuchung bestätigt.
III. Synthese pNAD 3. Stufe (Verbindung 12)
Figure imgf000029_0001
(11) (12)
120 mmol der Verbindung 11 (MG: 216,28) wurden in 500 ml Dioxan mit
NaHCO3 (11,0 g, 130 mmol) und Fmoc-chlorid (33,8 g, 130 mmol) vermischt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Sich dabei ergebende Salze wurden abfiltriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand über eine
Kieselgel-Säule (Isohexan und Isohexan/EE 8/2 - 1/1) gereinigt.
Die Hauptfraktion ergab 39,0 g = 74,1 % * (theoretischer Wert = 52,6 g).
DC (KG 60 F254 Laufmittel Isohexan/Essigester 2:1): RF 0,13
MS ESI ES + 439 / + 339
Die Identität des Produkts wurde ferner durch NMR-Untersuchung bestätigt.
*Ausbeute bezieht sich auf Edukt 1. Stufe IV. Synthese pNAD 4. Stufe (Verbindung 13)
Figure imgf000030_0001
(12) (13)
Verbindung 12 aus Stufe 3 (7,08 g, 16,1 mmol) wurde in 80 ml Trimethylphosphat gelöst und anschließend im Eisbad auf 0 0C gekühlt. POCI3 mit Trimethylphosphat gemischt (13 ml frisch destilliertes POCI3 in 13 ml Trimethylphosphat) wurde in einen Tropftrichter geben und unter Argon innerhalb von 20 min portionsweise dazugeben. Die Temperatur stieg in einer exothermen Reaktion bis auf 5 0C an. Anschließend wurden 2,6 ml Pyridin dazugeben und 40 min bei 0 0C und unter Argon nachgerührt.
Die Reaktionslösung wurde in 800 ml eisgekühlte 1 M Triethylammoniumhydrogencarbonat-Lösung (pH = 8) vorsichtig eingetropft. Nach vollständiger Zugabe wurde noch 1 h weiter gerührt. Die leicht trübe Lösung wurde anschließend auf 1 I gesättigte NaCI-Lösung getropft (schnell). Zum besseren Auskristallisieren wurde über Nacht nachgerührt. Der Niederschlag wurde abfiltriert. Der Rückstand wurde über eine Diaion- Säule entsalzt. Dazu wurden 500 g Diaion in Isopropanol/Wasser 1/1 gegeben und man ließ über Nacht quellen. Diaion wurde in die Säule gefüllt und mit Wasser gespült. Der Rückstand wurde in 100 ml Wasser pH 3,5 (Essigsäure) angeschlämmt, anschließend auf eine Säule aufgetragen und so lange mit Wasser (pH 3,5) gespült bis er frei von Kochsalz war. Dann wurde die Substanz aus der Säule mit 25 % Isopropanol (pH 3,5) eluiert. Die Lösung wurde im Hochvakuum bei Raumtemperatur eingedampft.
Rückstand = 2,6 g = 31 ,3 % DC RP8 F254 / MeOH / Wasser 9/1 MS ESI ES - 517,13 Die Identität des Produkts wurde ferner durch NMR-Untersuchung bestätigt.
V. Synthese pNAD 5. Stufe (Verbindung 14)
Figure imgf000031_0001
(13) (14)
Ein Gemisch aus Verbindung 13 aus Stufe 4 (4,10 g, 7,9 mmol) in 250 ml Methanol und 83 ml 25 % Ammoniak wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und bei Raumtemperatur im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde in 200 ml Wasser aufgenommen und 3 x mit 100 ml Essigester ausgerührt. Unlösliche Teile wurden abfiltriert, die klare Wasserphase abgetrennt und wiederum bei Raumtemperatur eingedampft.
Rückstand = 2,56 g = 100 % MS ESI ES - 295
Zum Entfernen der NH3-Kationen wurde der Rückstand 2 x in Hünigbase gelöst und im Hochvakuum jeweils wieder eingedampft
VI. Synthese pNAD 6. Stufe (Verbindung 15)
Figure imgf000032_0001
(14) (15)
Zinke-Salz (2,66 g, 8,99 mmol) wurde angelöst in 50 ml Methanol vorgelegt und unter Rühren Verbindung 14 aus Stufe 5 (2,56 g, 8,31 mmol) gelöst in
50 ml Methanol zugetropft. Die Mischung färbte sich rot und ging allmählich in Lösung. Es wurde über Nacht bei Raumtemperatur nachgerührt und ausgefallener Niederschlag abfiltriert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingedampft, in 100 ml Wasser aufgenommen und mit Essigester 3 x extrahiert.
Die Essigesterphase enthielt das Nebenprodukt Dinitroanilin, die Wasserphase enthielt Produkt und restliches Zincke Salz. Die Wasserphase wurde im Vakuum bei Raumtemperatur eingedampft und der erhaltene Rückstand mit 10 ml Wasser versetzt, 10 min auf einem Magnetrührer und gerührt und unlösliche Teile abfiltriert. Das Produkt blieb gelöst. Diese Lösung wurde auf eine mit Wasser gespülte Diaion HP20-Säule (1000 ml) gegeben und 2 x mit 1000 ml Wasser gespült. Anschließend wurde mit Wasser/5 % Isopropanol gespült und positive Fraktionen (detektiert mit DC RP8 MeOH/W 9/1) bei Raumtemperatur eingedampft. Der Rückstand wurde mit Isopropanol verrieben und mit Hilfe von Diethylether abgesaugt.
Rückstand = 1 ,60 g = 47,9 % DC RP8 254 MeOH/W 9/1
MS ES - 400,1 / ES + 402,0 -zeigt auch doppelte Masse
Die Identität des Produkts wurde ferner durch NMR-Untersuchung bestätigt.
VtIa. Synthese pNAD 7a. Stufe (Verbindung 16)
Figure imgf000033_0001
(16)
Ein Gemisch aus AMP-Säure (Adenosinmonophosphat-frei Säure) (10 g, 27,5 mmol) in 60 ml Methanol (getrocknet mit Natrium) und 5,3 ml (60 mmol) Morpholin (frisch destilliert) wurde solange gerührt bis eine klare Lösung entstand. Anschließend wurden 17 g (82,5 mmol) N1N1- Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur unter Feuchtigkeitsausschluss gerührt. Der entstandene Niederschlag (DCH) wurde abgesaugt und das Filtrat bei 30 0C einrotiert. Anschließend wurde mit 150 ml H2O/150 ml Diethylether ausgerührt und nochmals filtriert. Nach Phasentrennung wurde die wässrige Phase noch zweimal mit je 75 ml Diethylether extrahiert. Die wässrige Phase wurde anschließend bei Raumtemperatur einrotiert. Den Rückstand wurde noch zweimal in Pyridin gelöst und jeweils wieder im Hochvakuum abrotiert. VII. Synthese pNAD 7. Stufe (Verbindung 17)
Figure imgf000034_0001
(15) (16) (17)
Ein Gemisch aus AMP-morpholidat (Verbindung 16 aus Stufe 7a) (2,53 g, 3,61 mmol), Verbindung 15 aus Stufe 6 (1,60 g, 3,98 mmol), MnCI2-Lösung in Formamid 0,2 M* (27,1 ml, 5,42 mmol) und MgSO4 wasserfrei (0,87 g, 7,95 mmol) wurde über Nach bei Raumtemperatur gerührt und war nach dieser Zeit wie durch DC bestimmt (RP8 MeOH/W 9/1) großteils umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Acetonitril ausgefällt und abgesaugt.
Rückstand = 5,3 g (Th. 2,64 g)** MS, ESI ES - 729,3 = Produkt, ES -415 = Kation von AMP-morpholidat, ES -400,2/ES +402,1 Reste von Verbindung 15 (Stufe 6) DC RP 8 F254 RF 0,085
*Zur Herstellung dieser Lösung wurden 2516 mg MnCI2 wasserfrei unter Rühren gelöst in 100 ml Formamid 99,99%ig und anschließend mit 4A Molekularsieb versetzt.
**Der Rückstand wurde als Rohprodukt weiter verarbeitet. VIII. Synthese pNAD 8. Stufe (Verbindung 18, Pyrrolidinyl-NAD)
Figure imgf000035_0001
(17) (18)
500 mg Verbindung 17 aus Stufe 7 (Rohprodukt, enthält ca. 50 % Salze) wurden mit 5,0 ml Trifluoressigsäure (TFA) versetzt und 1 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend eingedampft. Als Rückstand ergaben sich etwa 500 mg farbloses Öl. MS ESI ES - 729,24 (Zusatz von NH3 erforderlich)
Die Aufreinigung erfolgte in 2 Portionen von 200 mg und 300 mg in jeweils 2 Trennschritten:
1 Trennschritt:
Fraktogel EMD SO3- s Säule: D (innen) = 14 mm L (Packung) = 85 mm
I. Konditionierung
(Flussrate 5 ml/min) a) 100 ml H2O b) 200 ml 0,25 M H2SO4 c) 100 ml H2O d) 200 ml 1 M Ammoniak-Lösung e) 100 ml H2O
II. Trennung : a) 200 mg Substanz gelöst in 5 ml H2O aufgegeben b) eluiert mit Gradient H2O → 0,2 M NH4HCO3-L-Sg. (Laufmittel A = 250 ml H2O in Erlenmeyerkolben vorgelegt und auf Magnetrührer gerührt, mit 5 ml/min auf Säule gepumpt Laufmittel B = 0,2 M NH4HCO3-LSg. Mit 2,5 ml/min zu A gepumpt.)
5 III. Fraktionierung: a) Fraktionen von jeweils 3 ml b) 1. Peak Verunreinigungen c) 2. Peak nach ca. 70 ml Vorlauf Substanz
IV. Rekonditionierung: a) 100 ml 1 M Ammoniak-Lsg. o b) 100 ml H2O
2. Trennschritt:
Diaion HP20, Säule D (innen) = 30 mm L (Packung) 130 mm eluiert mit 100 ml H2O und 100 ml H2O/5 % Isopropanol 5 Substanz kommt bereits mit der Wasserphase, im Isopropanol-Teil ist nur noch Verunreinigung.
Nach analytischer HPLC wurden 3 Fraktionen erhalten: F1 = 13,5 mg
F2 = 5,5 mg o F3 = 11 ,5 mg
Gesamt = 30,5 mg = 12,2 %
Die Identität von Pyrrolidinyl-NAD (Verbindung 18) wurde durch NMR- Untersuchungen bestätigt. 5
Glucosedehydrogenase-Assay für pNAD
Um die Rolle von pNAD als Cofaktor für Glucosedehydrogenase (GlucDH) zu untersuchen, wurde eine GlucoseDH-Aktivitätsassay in 0,1 m Tris/0,2 M o NaCI (pH 8,5) Puffer durchgeführt. Die Konzentration Glucose betrug 80 mM. Es wurden pNAD- bzw. als NAD-Konzentrationen von 0,05-0,5 mM eingesetzt. Hierzu wurden 10 (pNAD) oder 0,002 mg/ml (NAD), [83 bzw. 0,017 μm] GlucDH hinzugegeben. Der Assay wurde bei Raumtemperatur durchgeführt, wobei die enzymatische Reaktion durch Aufnahme von Absorptionsspektren in regelmäßigen Zeitabständen verfolgt wurde. Die in Tabelle 1 angegebenen Werte beziehen sich auf eine Absorptionsmessung nach 4 min.
Tabelle 1
Figure imgf000037_0001
Absorptionsspektren von pNAD und pNADH
Absorptionsspektren von NAD und pNAD bzw. NADH und pNADH sind in den Figuren 6A und 6B gezeigt. NAD und pNAD zeigen ein Absorptionsmaximum bei 260 nm. pNADH, d.h. pNAD nach GlucDH- Akitivitätsassay, zeigt im Vergleich zu NADH eine Rotverschiebung des Absorptionsmaximums von ca. 10 nm (Figur 6B).
In den Figuren 7 und 8 sind ferner Fluoreszenzpektren von NADH und pNADH als GlucDH-Komplex gezeigt. Die Spektren wurden jeweils nach GlucDH-Aktivitätsassay aufgenommen. Figur 7 zeigt Emissionsspektren von NADH/pNADH-GlucDH-Komplexen bei Anregungswellenlängen von 340 oder 370 nm. Die Emissionsspektren von NADH und pNADH bei 370 nm Anregungswellenlänge sind ähnlich. Figur 8 zeigt ein Anregungsspektrum für einen NADH/pNADH-Gluc-DH-Komplex bei einer Emissionswellenlänge von 460 nm. pNADH zeigt dabei ein breiteres Anregungsspektrum als NADH. Die Spektren wurden wiederum nach GlucDH-Aktivitätsassays aufgenommen. Stabilitätsuntersuchung von pNAD
Zur Untersuchung der Stabilität von pNAD im Vergleich zu NAD wurden gleiche Mengen NAD und pNAD in jeweils 0,15 M KPO4, 1 M NaCI-Puffer (pH 7,0) aufgenommen und bei 50 0C inkubiert. Der Zerfall von NAD bzw. pNAD wurde per HPLC verfolgt. Figur 9 zeigt den Prozentflächenbereich der (p)NAD-Mengen im Vergleich zu den (p)NAD-Mengen zur Zeit Null. Die Figur zeigt, dass pNAD im Vergleich zu NAD sehr stabil ist.
C) Herstellung von carbaNADcyclophosphat (19)
Figure imgf000038_0001
Zu 0,74 ml einer 0,2 Manganchloridlösung in absolutem Formamid wurden 79 mg (0,1 mmol) O5l-(Hydroxy-morphormo-phosphoryl)-O2 1 IO3I-hydroxy- phosphoryl-adenosin, N-cyclohexyl-morpholin-4-carbonimidsäurecyclohexyl- amindsalzdihydrat (getrocknet durch Coverdampfung mit Pyridin (Morphat et al. J. Am. Chem. Soc; 83; 1961; 663-675), 44 mg (0,105 mmol) carba-NMN- monophospaht und anschließend 25 mg trockenes Magnesiumsulfat zugegeben. Das Gemisch wurde für 3 Tage in einem geschlossenen Reaktionsgefäß unter Argon gerührt und anschließend unter Rühren in 10 ml Acetonitril eingegeben. Das Präzipitat wurde durch Filtration entfernt, durch RP-Chromatographie an einer RP 18 Hypersil ODS, 250 x 21 ,2 mM, 5 μm Säule unter Verwendung eines 0 % B bis 100 % B-Gradienten über 60 min gereinigt: Eluent A: 0,1 M Triethylammoniumacetat: Eluent B: 1:4- Gemisch von 0,1 M Triethylammoniumacetat und Acetonitril; Flussrate: 10 ml/min. Die Elution wurde durch Detektion bei 260 nm überwacht. Die Hauptfraktion wurde gesammelt und 5x liophylisiert, um das Triethylammoniumacetat zu entfernen. Das Triethylammoniumsalz wurde mit Dowex 50 WX2 in die freie Säure und anschließend in das Lithiumsalz umgewandelt. Ausbeute: 10 mg.
D) Herstellung von carbaNADP (20)
Figure imgf000039_0001
Zu einer Lösung von 2,2 mg carbaNADcyclophosphat Lithiumsalz (19) in 1 ml bis-Tris-Propanpuffer (0,02 M, pH 7,5) wurden innerhalb von 6 h dreimal vier Units Ribonuklease T2 bei 37 0C zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei 37 0C gehalten. Das Enzym wurde durch Erhitzen auf 65 0C für 20 min denaturiert. Nach Filtration wurde eine Reinigung durch RP-Chromatographie an einer RP 18 Hypersil ODS, 250 x 21 ,2 mm, 5 μm Säule unter Verwendung eines Gradienten von 0 % B bis 100 % B über 60 min hinweg durchgeführt: Eluent A: 0,1 M Triethylammoniumacetat; Eluent B: 1 :4-Gemisch von 0,1 M Triethylammoniumacetat und Acetonitril; Flussrate: 10 ml/min. Die Elution wurde durch Detektion bei 260 nm überwacht. Die Hauptfraktion wurde gesammelt und 5x liophylisiert, um das Triethylammoniumacetat zu entfernen.
Massenspektrum (MALDI Applied Biosystems Voyager System 6327: berechnet 742,45, gefunden: 743,17)
E) Glucosedehydrogenase-Aktivitätsassay für cNAD
Wie für pNAD unter B) beschrieben, wurde ein Glucosedehydrogenase- Aktivitätsassay für cNAD im Vergleich zu NAD durchgeführt. Hierzu wurden Glucose-dehydrogenasekonzentrationen von 0,1 (cNAD) oder 0,002 mg/ml (NAD)1 [0,83 bzw. 0,017 μm] eingesetzt. Die eingesetzten Mengen und Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Figure imgf000040_0001
F) Absorptionsspektren von cNAD und cNADH
Die Figuren 10A, 10B bzw. 10C zeigen Absorptionsspektren von NAD und cNAD. Sowohl NAD als auch cNAD weisen bei 260 nm ein Absorptionsmaximum auf. Figur 10B zeigt Absorptionsspektren von NADH und cNADH, wobei die Spektren jeweils nach einem Glucosedehydrogenase-Aktivitätsassay aufgenommen wurden. Das Absorptionsmaximum von cNADH zeigt ein Rotverschiebung von 20 nm. Weitere Absorptionsspektren für NADH und cNADH sind in Figur 10C gezeigt, wobei wie in der Legende angegeben, unterschiedliche Bedingungen für die zugehörigen Glucosedehydrogenase-Aktivitätsassays gewählt wurden.
Figur 11 zeigt ferner Fluoreszenzpektren von NADH und cNADH als GlucDH-Komplex. Die Spektren wurden bei einer Anregungswellenlänge von 370 nm nach Glucosedehydrogenase-Aktivitätsassay aufgenommen. Sowohl NADH als auch cNADH zeigt bei Behandlung mit GlucDH eine Erhöhung des Fluoreszenzsignals.

Claims

Ansprüche
1. Testelement zur Bestimmung eines Analyten, umfassend (i) ein Coenzym abhängiges Enzym oder ein Substrat für ein derartiges Enzym und (ii) als Coenzym eine Verbindung mit folgender allgemeiner Formel
(I):
Figure imgf000042_0001
(I) mit A = Adenin oder ein Analog davon, T = jeweils unabhängig O, S, U = jeweils unabhängig OH, SH, BH3 ", BCNH2 ',
V = jeweils unabhängig OH oder eine Phosphatgruppe, W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 mit R = jeweils unabhängig H oder Ci-C2-Alkyl, X1 , X2 = jeweils unabhängig O, CH2, CHCH3, C(CH3)2, NH, NCH3,
Y = NH, S, O, CH2, Z = ein Rest umfassend eine cyclische Gruppe mit 5 C-Atomen, die gegebenenfalls ein Heteroatom ausgewählt aus O, S und
N sowie gegebenenfalls einen oder mehrere Substituenten enthält, und einen Rest CR42, wobei CR42 an die cyclische Gruppe und an
X2 gebunden ist, mit
R4 = jeweils unabhängig H, F1 Cl1 CH3, mit der Maßgabe, dass Z und der Pyridin-Rest nicht durch eine glycosidische Bindung verknüpft sind, oder ein Salz oder gegebenenfalls eine reduzierte Form davon.
2. Testelement nach Anspruch 1 zur Bestimmung von Glucose, umfassend eine Glucose-Dehydrogenase und als Coenzym eine Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) oder ein Salz davon.
3. Testelement nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Substituenten an Z ausgewählt sind aus der Grupppe F, Cl sowie d-C∑-Alkyl, gegebenenfalls fluoriert oder chloriert oder/und OH- substituiert, O-Ci-C2-Alkyl.
4. Testelement nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend als Coenzym eine Verbindung mit folgender allgemeiner Formel (I1):
Figure imgf000043_0001
mit A = Adenin oder ein Analog davon, T = jeweils unabhängig O, S, U = jeweils unabhängig OH, SH1 BH3 ", BCNH2 ', V = jeweils unabhängig OH oder eine Phosphatgruppe, W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 mit R = jeweils unabhängig H oder Ci-C2-Alkyl,
X1. X2 jeweils unabhängig O, CH2, CHCH3, C(CH3)2, NH, NCH3, Y = NH, S, O, CH2, Z = ein gesättiger oder ungesättigter carbocyclischer oder heterocyclischer Fünfring, insbesondere eine Verbindung der allgemeinen Formel (II)
Figure imgf000044_0001
(H) wobei zwischen R51 und R5" eine Einfach- oder
Doppelbindung vorliegen kann, mit
R4 = jeweils unabhängig H, F, Cl, CH3, R5 = CR42) wenn zwischen R51 und R5" eine Einfachbindung vorliegt, ist
R51 = O, S, NH, NCi-C2-AIkVl, CR42, CHOH, CHOCH3,
R5" = CR42) CHOH, CHOCH3, wenn zwischen R51 und R5" eine Doppelbindung vorliegt, ist R5'=R5"=CR4,
R6, R6' = jeweils unabhängig CH, CCH3, oder ein Salz oder gegebenenfalls eine reduzierte Form davon.
5. Testelement nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit W = CONH2 oder COCH3.
6. Testelement nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in Form eines Teststreifens.
7. Testelement nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Dehydrogenase ist, ausgewählt aus einer
Glucose-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.47), Lactat-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.27, 1.1.1.28), Malat-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.37), Glycerin- Dehydrogenase (E.C.1.1.1.6), Alkohol-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.1), alpha-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase, Sorbitol-Dehydrogenase oder Aminosäure-Dehydrogenase, wie etwa L-Aminosäure-Dehydrogenase (E.C.1.4.1.5).
8. Testelement nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zum Nachweis von Glucose, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Glucose-Dehydrogenase ist.
9. Verbindung der allgemeinen Formel (I"):
Figure imgf000045_0001
mit
A = Adenin oder ein Analog davon,
T = jeweils unabhängig O, S,
U = jeweils unabhängig OH, SH, BH3-, BCNH2 ",
V = jeweils unabhängig OH oder eine Phosphatgruppe,
W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 mit R = jeweils unabhängig
H oder d-C2-Alkyl, X1.X2 = jeweils unabhängig O, CH2, CHCH3, C(CH3)2, NH, NCH3,
Y = NH, S, O, CH2,
Z = ein gesättiger oder ungesättigter carbocyclischer oder heterocyclischer Fünfring, insbesondere Verbindungen der allgemeinen Formel (II)
Figure imgf000046_0001
(II) wobei zwischen R5' und R5" eine Einfach- oder
Doppelbindung vorliegen kann, 5 R4 = jeweils unabhängig H, F, Cl, CH3,
R5 = CR42, wenn zwischen R51 und R5" eine Einfachbindung vorliegt, ist
R51 = O, S, NH, NC1-C2-AIkYl, CR42, CHOH, CHOCH3,
R5" = CR42, CHOH, CHOCH3, o wenn zwischen R5' und R5" eine Doppelbindung vorliegt, ist
R51=R5"=CR4,
R6, R6' = jeweils unabhängig CH, CCH3, mit der Maßgabe, dass wenn R5 = CH2, T = O, U = jeweils
OH, V = OH, W = CONH2, X = O und Y = O sind, dann sind 5 R51 und R5" nicht gleichzeitig CHOH, oder ein Salz oder gegebenenfalls eine reduzierte Form davon.
10. Verbindung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, o dass mindestens ein Rest U verschieden von OH ist.
11. Verbindung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Rest U = BH3 " ist.
12. Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 11 mit W = CONH2 oder COCH3.
13. Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, o welche Borano-NAD, Borano-NADP oder ein Salz oder eine reduzierte Form davon ist.
14. Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, welche cPentyl-NAD, cPentyl-NADP oder ein Salz oder eine reduzierte Form davon ist.
15. Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, welche Pyrrolyl-NAD, Pyrrolyl-NADP oder ein Salz oder eine reduzierte Form davon ist.
16. Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, welche Furanyl-NAD, Furanyl-NADP oder ein Salz oder eine reduzierte Form davon ist.
17. Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, welche Pyrrolidinyl-NAD, Pyrrolidinyl-NADP oder ein Salz oder eine reduzierte Form davon ist.
18. Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, welche carbaNADcyclophosphat, carbaNADP oder ein Salz oder eine reduzierte Form davon ist.
19. Enzym-Coenzym-Komplex, bestehend aus einer Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 16 in Kombination mit einem geeigneten Enzym.
20. Komplex nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Dehydrogenase ist, ausgewählt aus einer Glucose-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.47), Lactat-Dehydrogenase
(E.C.1.1.1.27, 1.1.1.28), Malat-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.37), Glycerin- Dehydrogenase (E.C.1.1.1.6), Alkohol-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.1 ), alpha-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase, Sorbitol-Dehydrogenase oder Aminosäure-Dehydrogenase, ausgewählt aus L-Aminosäure- Dehydrogenase (E.C.1.4.1.5).
21. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 18 oder eines Komplexes nach Anspruch 19 oder 20 zum Nachweis eines
Analyten in einer Probe durch eine enzymatische Reaktion.
22. Reagenzienkit, beinhaltend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 18 und gegebenenfalls ein geeignetes Enzym oder einen Enzym- Coenzym-Komplex nach Anspruch 19 oder 20 sowie einen geeigneten
Reaktionspuffer.
23. Reagenzienkit nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Dehydrogenase ist, ausgewählt aus einer
Glucose-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.47), Lactat-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.27, 1.1.1.28), Malat-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.37), Glycerin- Dehydrogenase (E.C.1.1.1.6), Alkohol-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.1), alpha-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase, Sorbitol-Dehydrogenase oder Aminosäure-Dehydrogenase, ausgewählt aus L-Aminosäure-
Dehydrogenase (E.C.1.4.1.5).
24. Verwendung des Testelements nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder des Reagenzienkits nach Anspruch 22 oder 23 zur Bestimmung von Analyten, ausgewählt aus Glucose, Milchsäure, Äpfelsäure, Glycerin,
Alkohol, Cholesterin, Triglyceride, Ascorbinsäure, Cystein, Glutathion, Peptide, Harnstoff, Ammonium, Salicylat, Pyruvat, 5'-Nukleotidase, Creatinkinase (CK), Lactat-Dehydrogenase (LDH) und Kohlendioxid.
25. Verfahren zum Nachweis eines Analyten, umfassend die Schritte
(a) In kontaktbringen einer Probe mit einem Testelement nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder einem Reagenzienkit nach Anspruch 22 oder 23, umfassend ein Coenzym und (b) Nachweisen des Analyten.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis des Analyten photometrisch oder fluorometrisch erfolgt.
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