WO2007011055A1 - 糖鎖誘導体の製造方法、構造解析方法、及び糖鎖誘導体 - Google Patents

糖鎖誘導体の製造方法、構造解析方法、及び糖鎖誘導体 Download PDF

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sugar
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Kazuaki Kakehi
Mitsuhiro Kinoshita
Yuki Matsuno
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Otsuka Chemical Co., Ltd.
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    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a sugar chain derivative from a mixture of sugar chains, and a method for analyzing the structure of a sugar chain. Furthermore, the present invention relates to a novel sugar derivative derived by the method for producing a sugar chain derivative of the present invention.
  • sugar chains in glycoproteins have been thought to play a role in maintaining the three-dimensional structure of the protein and acquiring resistance to prevent degradation from proteases. Recently, it has been clarified that sugar chains in glycoproteins are involved in life phenomena such as fertilization, differentiation, signal transduction, canceration, intracellular transport of proteins and regulation of physiological activities. In addition, the relationship between sugar chains such as cell surface adhesion molecules and glycoprotein hormones and their functions has been clarified, and the Glycoscience Consortium concept has been compiled.
  • glycosyl functions is mainly focused on glycosyltransferases (glycan genes) that control their biosynthesis. However, glycosyltransferases are also preserved by genome information and can be compared with other proteins. Given that it is involved in vital functions through collaborative work, it is necessary to proceed with the functional analysis of glycans using a structural glycomic approach that captures and analyzes the entire image of the cocoon chain expressed in cells and tissues.
  • the role of structural glycocomitas in glycan science is to comprehensively analyze the glycan recognition mechanisms that play an important role in many life phenomena, and is an indispensable element for functional glycomics.
  • the technical elements required for structural glycocomitas are high completeness, high throughput, high sensitivity, and high accuracy.
  • Non-Patent Documents 1 to 4 structural analysis of glycoprotein glycans includes fluorescent labeling of glycans excised from proteins, followed by high-performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry (M The analysis method using S) has become an effective means due to dramatic technological advances in mass spectrometry (Non-Patent Documents 1 to 4), and anion-exchange column chromatography is used exclusively for separation of sialaroglycans. (Non-Patent Document 5).
  • Non-Patent Document 2 An a l B i o c h em. 206: 278-287 (992)
  • Non-Patent Document 3 B i o c h em S o T Tra n s 21: 1 21-1
  • Non-Patent Document 4 Ch em Re v. 102: 321 -369 (2002)
  • Non-Patent Document 5 B i o c h i m B i o phy s Ac t a. 705: 1 67- 173 (1 982)
  • An object of the present invention is to provide means for separating and acquiring each sugar chain from a state in which various sugar chains are mixed, such as a chain in a cell or tissue.
  • Another object of the present invention is to provide means for analyzing the structure of each separated sugar chain compound. .
  • an object of the present invention is to provide a novel sugar chain derivative. Disclosure of the invention The present invention relates to the following inventions.
  • a method for producing a sugar chain derivative from a sugar chain mixture comprising: (a) introducing a lipophilic group into a sugar chain in the sugar chain mixture to obtain a mixture of sugar chain derivatives; and (b) the sugar A method for producing a sugar chain derivative, comprising a step of treating a mixture of chain derivatives with serotonin affinity column chromatography.
  • a method for analyzing the structure of a sugar chain in a sugar chain mixture comprising: (a) introducing a lipophilic group into the sugar chain in the sugar chain mixture to obtain a mixture of sugar chain derivatives;
  • a method for analyzing the structure of a sugar chain comprising a step of treating a mixture of sugar chain derivatives with a serotonin affinity column chromatography, and a step of (e) mass spectrometry.
  • step (c) a normal phase chromatography using an amino column or an amide column after the step (b).
  • R 1 is a 2-carboxyphenenole group, a 3-force noreoxyphene-nore group, a 4-force noreoxypheneineno group
  • p represents an ethoxycarbonyl phenyl group or a 2-pyridyl group.
  • R 2 represents a hydroxyl group, a group 1 A sn or a group 1 A sn—R 3 .
  • a sn represents a wasparagine group
  • R 3 represents a carbamate-based or amide-based protecting group.
  • Ac represents a acetyl group.
  • the present inventors have introduced a fat-soluble group into a sugar chain and introduced a sugar chain derivative. After that, it is processed by affinity chromatography using serotonin having affinity for sialic acid as a ligand to separate the sugar glycans from the sugar glycans, and in addition to the monosia in the sialic glycans. It was found that mouth, disia mouth, tricia mouth and tetrasialo sugar chain can be separated by the number of sialic acid residues.
  • sugar chain derivatives having different branch structures can be separated in detail by subjecting the fraction separated by affinity column chromatography to chromatography using an amino column or an amide column, respectively. It was possible to produce a large number of sugar chains with a structure.
  • each separated sugar chain derivative which is isolated by chromatography using an amino column or an amide column, and the resulting sugar chain derivative is subjected to mass spectrometry.
  • the inventors have found that sugar chain structures can be analyzed accurately and comprehensively, and have completed the present invention.
  • the sugar chain of the sugar chain mixture used in the production method of the present invention is not particularly limited, and is paragine-linked sugar chain (N-glycoside-linked sugar chain), mucin-type sugar chain (Oichi glycoside-linked sugar) Chain), free sugar chains, and sugar chains to which amino acids are bound such as sugar chain-bound asparagine.
  • sugar chains may be sugar chains prepared by chemical methods.
  • a sugar chain derived from a natural glycoprotein is a sugar chain in which sugar residues at the non-reducing end are randomly deleted. It is preferable to use a mixture of these chain chains. Moreover, it is preferable to use a sugar chain mixture containing a sugar chain having a sialic acid residue as a sugar chain residue.
  • Examples of the natural sugar chain mixture include natural raw materials such as milk, sushi-derived futuin, eggs, and sugar chain mixtures derived from living tissues and cells.
  • natural raw materials such as milk, sushi-derived futuin, eggs
  • sugar chain mixtures derived from living tissues and cells such as milk, sushi-derived futuin, eggs
  • sugar chain mixtures derived from cancer tissue or cancer cells such as cancer tissue or cancer cells.
  • sugar chain mixtures can be preferably exemplified, but a sugar chain mixture containing a sialo sugar chain is particularly preferred.
  • a mixture of glycoprotein and Z or glycopeptide is obtained from the natural raw material by a known method, and the peptide portion is cleaved by acting a proteolytic enzyme or the like on the mixture to obtain a gel filtration power and a ramion exchange capacity. It is possible to use a mixture of sugar chain-bound asparagine obtained by purification by chromatography using ram or the like.
  • the cell membrane fraction was treated with 2 monomercaptoethanol.
  • a mixture of sugar chains obtained by reacting N-glycanase can be used.
  • a mixture of free sugar chains obtained by homogenizing cultured tissues and cultured cells and collecting the centrifuged supernatant can be used.
  • these sugar chains high mannose type sugar chains and various sialo sugar chains are included as neutral sugar chains, which is suitable for the production of various sugar chains.
  • Lipid-soluble groups are introduced into the sugar chains in the resulting mixture of sugar chains to form a mixture of sugar chain derivatives.
  • the fat-soluble group is a fat-soluble substituent formed by reacting with the ring-opening aldehyde at the reducing end of the sugar chain, the asparagamino group or the carboxyl group of the sugar chain-bound asparagine, for example, 2-, 3-, or 4 —Carboxyphenylamino group, p-ethoxycarbonylaminoamino group, 2-pyridylamino group and other substituents commonly used as fluorescent labels, 9-fluorenylmethoxycarbonyl (F moc) group, tert-butoxycarbonyl (BOC) Examples thereof include substituents used as carbamate-type or amide-type protective groups such as a group, benzyl group, allyl group, allyloxycarboxyl group, and acetyl group.
  • fat-soluble groups can be carried out by known methods, and it is easy to operate, the stability of the resulting sugar chain derivative, and the excitation light is compatible with mercury light sources and laser light sources. Preference is given to using phenolamino groups, Fmoc groups or BOC groups.
  • 9_fluorenylmethyl-N-succinimidyl carbonate is reacted with a sugar chain-bound aparagine in the presence of sodium bicarbonate to form a F moc group that is carbamate-bound to the amino group of the asparagine. Can be introduced.
  • the resulting mixture of sugar chain derivatives is separated by a serotonin affinity column chromatography.
  • the serotonin affinity column chromatography in the present invention uses a affinity column having serotonin having affinity for sialic acid as a ligand.
  • the serotonin absorptivity column may be prepared by fixing serotonin to the packing material, or a commercially available column may be used.
  • commercially available columns include L A-serotonin columns (manufactured by Jichi Oil Mills Co., Ltd.).
  • Chromatographic separation conditions are set as appropriate. For example, using a fluorescence detector, the excitation wavelength is 3500 nm, the fluorescence wavelength is 42.5 nm, and the flow rate is 0.5. m 1 Zmin, Separation can be achieved by making the mobile phase a linear gradient elution using ultrapure water and aqueous ammonium acetate solution.
  • a mixture of sugar chain derivatives can be separated based on the number of sialic acid residues in the sugar chain derivative, and a sialic acid sugar chain derivative having no sialic acid residue is obtained. It elutes earliest and can then be separated and dissolved in proportion to an increase in the number of sialic acid residues, such as monosialo sugar chain derivatives and disia sugar chain derivatives.
  • the sugar chain derivative separated by the serotonin-affinity column is converted into a normal phase using a polymer-based amino column or a silica-based amide column.
  • HPLC high-density liquid phase
  • Normal phase chromatography is a chromatography that uses a polar stationary phase such as an amino group, an aminopropyl group, or an acetylamide group as a packing material, and is based on the difference in the distribution of the sample component from the stationary phase to the mobile phase. Separation is achieved.
  • This mode is basically separated based on the hydrophilicity of the sugar chain, and can also be preferably used for separation of sugar chain isomers to which sialic acid is bound. In addition, it can be preferably used for separation of a cashmere type sugar chain treated with dilute acid neuraminidase.
  • the polymer-based amino column to be used is a column using a stationary phase in which an amino group is bonded to a polymer such as a polybutyl alcohol base gel as a filler, and may be prepared by itself, but is commercially available. You can use a column.
  • a commercially available amino column AsahiShodhoxNH2P-504E (made by Showa Denko KK) can be mentioned.
  • silica-based amide column a column in which an amide group such as acrylamide is chemically bonded to a filler having silica as a stationary phase may be prepared by itself, or a commercially available column may be used. May be used.
  • Chromatographic separation conditions are set as appropriate.
  • the excitation wavelength is 3500 nm
  • the fluorescence wavelength is 425 nm
  • the flow rate is 1 m 1 / min
  • mobile phase can be separated by linear gradient elution using acetic acid-containing acetonitrile and aqueous solution containing acetic acid and triethylamine.
  • the sugar chain derivative obtained by isolation as described above can be analyzed for its sugar chain structure by application of sugar hydrolase and analysis by mass spectrometry.
  • sugar hydrolase a known enzyme can be used.
  • sialidase galactosidase, mannosidase, N-acetinoregenorecosamidase, fuco Sidase etc. can be mentioned.
  • the mass spectrometric method is performed by a mass spectroscope employing a conventionally known mass spectrometric method. However, it is preferable to measure by using MA L D I—TOFMS which has been used particularly in recent years for sugar chain analysis.
  • a specific sugar hydrolase is allowed to act, and then processed by normal-phase HPLC using a polymer-based amino column or a siri force-based amid column.
  • the glycan structure can be analyzed by repeating this operation in consideration of the mass lost by analysis and the characteristics of the hydrolase.
  • the resulting sugar chain derivative can be obtained easily and in large quantities by various means by removing its lipophilic group.
  • a conventionally known method can be applied to remove the fat-soluble group.
  • removal of 2-force loxyphenylamino groups can be achieved by reacting with hydrogen peroxide in acetic acid at room temperature and can be easily recovered as a free sugar chain.
  • the removal of the Fmoc group can be achieved by adding morpholine to a sugar chain derivative in N, N-dimethylformamide and reacting, and the removal of the BOC group by reacting with a weak acid.
  • the asparagine residue can be removed by a method of acetylating after reacting with anhydrous hydrazine, a method of heating to reflux in a basic aqueous solution, and then a method of acetylating.
  • sugar chains are very useful in the field of drug development, such as cancer actin synthesis, and the resulting sugar chains are newly combined with chemical reactions and reactions with glycosyltransferases. It is possible to develop new vaccines by linking and derivatizing various sugar residues.
  • the present inventors succeeded in isolating sugar chains represented by the following formulas (1) to (6), which have not been observed in various cancer cells, by the structural analysis method and the production method of the present invention. did.
  • R 1 represents a 2-carboxyphenyl group, a 3-stroxyphenyl group, a 4-carboxyphenyl group, a p-ethoxycarbophenyl group, or a 2-pyridyl group.
  • R 2 represents a hydroxyl group, a group 1 Asn or a group 1 A sn—R 3 .
  • a sn represents a asparagine group
  • R 3 represents a carbamate-based or amide-based protecting group.
  • a c represents a acetyl group.
  • novel sugar chains are considered to be specifically expressed in cancer cells, and these sugar chains can be used as cancer markers. '
  • a polyclonal antibody or a monoclonal antibody that specifically recognizes a specific sugar chain in these cancer cells is prepared, and the sugar chain is detected by an immunological technique.
  • Polyclonal antibodies can be prepared from mice, hamsters, guinea pigs, chickens, rats, rabbits, dogs, dogs, and the like using the sugar chain or a conjugate obtained by binding the sugar chain hapten and a polymer compound (carrier) such as a protein as an antigen. It is possible to immunize mammals such as Gi, Hidge and Ushi, collect blood from the mammal, and prepare antiserum containing polyclonal antibodies.
  • the monoclonal antibody can be obtained, for example, by preparing a hybridoma obtained by cell fusion between an antibody-producing cell and a Myechima cell line. In this way The obtained hybridoma may be cultured and the produced monoclonal antibody may be purified.
  • FIG. 1 is an affinity column chromatogram of the sugar derivative obtained in Example 1.
  • FIG. 2 is an affinity column chromatogram of the sugar chain derivative obtained in Example 2.
  • FIG. 3 is a HPLC chromatogram of the sugar chain derivative obtained in Example 3.
  • FIG. 4 is a HP LC chromatogram of the sugar chain derivative obtained in Example 3.
  • FIG. 5 is a chromatogram by HPLC of the sugar chain derivative obtained in Example 3.
  • FIG. 6 is a HPLC chromatogram of the sugar chain derivative obtained in Example 3. •
  • FIG. 7 is an HPLC chromatogram of the sugar chain derivative obtained in Example 3.
  • FIG. 8 is an affinity column chromatogram of the sugar chain derivative obtained in Example 4.
  • FIG. 9 is an HP LC kumatogram of the sugar chain derivative obtained in Example 5.
  • FIG. 10 is an affinity column chromatogram of the sugar chain derivative obtained in Example 6. '
  • FIG. 11 is an affinity column chromatogram of the long chain derivative obtained in Example 7.
  • FIG. 12 is a HPLC chromatogram of the long chain derivative obtained in Example 7.
  • AGP Acid glycoprotein
  • Fig. 1 shows the results of separation using the affinity column chromatography.
  • ACHN and A549 are DMEM (Du lbecco 's Modified E) containing 10% of urine serum [NEWBORN CALF SERUM (NCS), manufactured by Sigma-Aldrich Japan] that has been immobilized by heating at 50 ° C for 30 minutes in advance.
  • NCS urine serum
  • agle Medium Sigma Aldrich Japan
  • U937 and MKN45 using RPMI—1640 Sigma Aldrich Japan
  • Cells other than U937 were 80% confluent. Cells in culture were washed with isotonic phosphate buffer (PBS), added with trypsin solution, treated at 37 ° C for 5 minutes, and then detached. Cells were collected, washed with PBS and subcultured.
  • PBS isotonic phosphate buffer
  • the cell membrane fraction was prepared using 80% confluent cells and collected from the incubator using a cell scraper. The collected cells were washed with PBS and homogenized with a glass homogenizer in 1 OmM Na 2 HP0 4 (pH 7.5) containing 1% protease inhibitor to a concentration of 1 X 10 8 eell / 5 ml. Add 10 ml of 2 OmM Tris—HC 1 buf .fer (pH 7.5) containing 0.5 M sucrose, centrifuge at 4 ° C and 3000 rpm for 15 minutes, collect the supernatant, and C, centrifuged at 1 9000 rpm, and the resulting precipitate was used as the cell membrane fraction.
  • Example 3 (Separation and structural analysis of cancer cell-derived sugar chains using normal phase amide columns) • Cancer cell-derived sugar chain derivatives of each fraction obtained in Example 2 (corresponding to 1 X 10 7 ce 1 1) was dissolved in 20 mM acetate buffer (pH 5.0) 20 ⁇ 1 and sialidase 4 ⁇ 1 (2 mU, manufactured by Malkin Bio) was added and reacted at 37 ° C. for 24 hours. After the reaction, it was boiled at 100 ° C. for 3 minutes, and the supernatant after centrifugation was collected.
  • the obtained supernatant was subjected to normal phase HP LC using an amide column, and sugar chain derivatives were collected.
  • the results of separation with HPLC are shown in Figs.
  • Fluorescence wavelength 4 2 5 nm
  • Mobile phase Acetonitrile solution containing 0.2% acetic acid as solution A and an aqueous solution containing 0.1% acetic acid and 0.1% triethylamine as solution B were used.
  • the sugar chain derivative (a) was dissolved in 2 OmM citrate buffer (pH 5. 0) 2 0 ⁇ 1,] 3-N-acetylethylhexaminidase 1 ⁇ 1 (1 OmU, manufactured by Seikagaku Corporation) ) was added and reacted at 37 ° C for 24 hours. After the reaction, the mixture was boiled at 100 ° C. for 3 minutes, and the supernatant after centrifugation was collected. The resulting supernatant was analyzed in the same manner as described above. As a result, a sugar chain derivative (b) having a molecular weight of 190 6 was obtained. It was.
  • peak 31 was a sugar chain derivative represented by the following formula.
  • the sugar chain derivative of peak 35 was treated with j3-galactosidase, i3-N-acetyl hexaminidase, and then ⁇ -galactosidase, and was found to be a sugar chain derivative represented by the following formula.
  • Ga l D—galactose
  • G 1 c NA c N—acetylyldarcosamine
  • Man D-mannose
  • Fuc fucose
  • 2-AA 2-aminobenzoic acid
  • NeuAc sialic acid.
  • sugar chain in which 2-aminobenzoic acid is bound to the sugar chain reducing end for example, the sugar chain partial structure represented by the following formula is expressed as 1 4G 1 cNAc 1 -4 G 1 cNAc-2 2 To do.
  • Vo yager DE-PRO (PEB iosystrans, Framingham, MA) is used as the equipment. Acceleration voltage 20 kV, grid voltage 96.3%, Delayime 1 000 nsec, Measured with Lens Offset 1.25 and laser intensity (one nitrogen laser) 2700. A sample 0.5 ⁇ L dissolved in water and 0.5 L of a 20 mg / mL methanolate solution of 2,5-dihydroxy benzoicacid (DHB) were mixed, dried, and used as a sample for measurement.
  • DHB 2,5-dihydroxy benzoicacid
  • Fig. 8 shows the results of separation by affinity column chromatography.
  • the obtained fractions were separated by normal phase HPLC using an amino column to obtain a free sugar chain derivative.
  • the obtained free sugar chain derivative is appropriately reacted with a sugar hydrolase (sialidase, c3 ⁇ 4mannosidase, —galactosidase, / 3-N-acetylethylhexaminidase, etc.) and subjected to normal phase HPLC using the amino column. After separation, the obtained fraction was freeze-dried and analyzed by MALD I-TOF MS to angularly analyze the structure of the free sugar chain derivative.
  • a sugar hydrolase sialidase, c3 ⁇ 4mannosidase, —galactosidase, / 3-N-acetylethylhexaminidase, etc.
  • the treatment with a-mannosidase was performed by dissolving the sugar chain derivative in 20 ⁇ l of 20 mM citrate buffer ( ⁇ 4.5) and ⁇ -mannosidase 2 i 1 (1 OmU, manufactured by Seikagaku Corporation). The reaction is carried out for 24 hours at 37 ° C. After the reaction, the mixture is boiled for 3 minutes at 100 ° C and the supernatant after centrifugation is recovered. Treatment with other sugar hydrolases was the same as described in the previous examples. The obtained sugar chain derivatives are shown in Tables 6 and 7.
  • the free sugar chains in Tables 6 and 7 are novel compounds.
  • a sugar chain derivative having a molecular weight of 1 32 1 of No. 1 is represented by the following formula.
  • a free sugar chain mixture was obtained in the same manner as in Example 4 except that human T cell lymphoma Jurkat 27 (glycan-introduced cell line) was used instead of human gastric cancer cell MKN45.
  • the obtained fractions were separated by normal phase HPLC using an amide column to obtain a free sugar chain derivative.
  • FIG. 9 shows the results of separation with HPLC.
  • the obtained free sugar chain derivative was operated in the same manner as in Example 4 to analyze the structure of the free sugar chain derivative.
  • the obtained sugar chain derivatives are shown in Table 8.
  • Human cervical cancer cells HeLa was cultured in DMEM containing 10% of NCS that had been immobilized by heating for 30 minutes at 50 ° C. In 80% confluent state, wash cells in culture with PBS, add trypsin solution, treat at 37 ° C for 5 minutes, collect detached cells, wash with PBS, and subculture.
  • the cell membrane fraction described in Example 2 was prepared and treated in the same manner as the release of sugar chains from the cell membrane fraction to obtain a cell membrane-derived sugar chain mixture. After introducing 2-AA in the same manner as in Example 1 above, Each sugar chain derivative fraction was obtained by treatment with a tonality column chromatography.
  • Figure 10 shows the results of separation using column chromatography.
  • the obtained saccharide chain derivative, monosialose saccharide derivative fraction, and disia glycan derivative fraction were subjected to sialidase treatment, and then separated by normal phase HPLC using an amino column to obtain saccharide derivatives.
  • the HPLC conditions were the same as in Example 4.
  • the resulting sugar chain derivative is allowed to act on a sugar hydrolase (sialidase, ⁇ -mannosidase, ⁇ -galatatosidase, jS- ⁇ -acetylhexaminidase, etc.) as appropriate, and separated by normal phase HPLC using the above amino column.
  • the resulting fraction was freeze-dried and analyzed by MALD I-TOF MS to analyze the structure of the sugar chain derivative.
  • the obtained sugar chain derivatives are shown in Tables 9-12.
  • PB S was washed with lm l to remove non-adsorbed components, and after centrifugation, a dissociation solution (25 OmM Tris—HC 1 buffer pH 6.8 / 4.6% was added to anti-CD 98 antibody immobilized A garose. SDS, 20% G 1 ycerin) and 2-mercaptoethanol 9: 1 mixed solution 20 ⁇ 1 was added, and the supernatant was boiled for 5 minutes and centrifuged at 15000 rpm as CD98-HC and subjected to SDS-PAGE.
  • a dissociation solution 25 OmM Tris—HC 1 buffer pH 6.8 / 4.6% was added to anti-CD 98 antibody immobilized A garose.
  • SDS, 20% G 1 ycerin 20% G 1 ycerin
  • 2-mercaptoethanol 9 1 mixed solution 20 ⁇ 1 was added, and the supernatant was boiled for 5 minutes and centrifuged at 15000 rpm as CD98-HC and subjected to SDS-PAGE.
  • Both the gel electrophoresis apparatus and the power source were manufactured by BioRad.
  • a 7.5% gel was used as the electrophoresis gel.
  • the electrophoresis was carried out using 25 mM Tris, 198 mM G 1 cycine, 1% (w / v) SDS as the running buffer. The first hour was 5 mA per gel, followed by 1 OmA to the bottom of the gel.
  • the protein sample in the gel was transferred to a PVDF membrane using a semi-dry blotting apparatus (Transblot SD cell) manufactured by 8IO-RAD.
  • P VDF membrane is pre-soaked in methanol for 60 seconds, then soaked in 48 mM Tris, 39 mM Glycine, 20% Methano 1 (pH 9.0) for 1 hour, and then at 10 O mA constant current for 1 hour. Transfer was performed by applying voltage. After transfer, the PVDF membrane was blocked with PBS containing 5% skim milk and 0.05% Tween 20 and then containing 5 g of anti-CD98 antibody.
  • the decolorizing solution was replaced with water, and the target band was cut out and placed in an Eppendorf tube. Then add 100 ⁇ l of acetonitrile and leave it for 30 minutes to dehydrate the gel. After removing the acetonitrile, add Tris—HC 1 bufferp H 7.5 containing 2 units of N—g 1 ycanase F to 1 0 0 ⁇ 1 was added and incubated at 37 ° C. for incubation to excise the sugar chain. Thereafter, the extract was collected, and further 20 ⁇ l of water was added and stirred for 30 minutes to obtain a sugar chain mixture from the gel.
  • Figure 11 shows the results of separation by column chromatography.
  • the obtained monosial glycan derivative and disia glycan derivative fractions were subjected to a sialidase treatment, and then separated by normal phase HPLC using an amino column to obtain a glycan derivative.
  • HP LC conditions were the same as in Example 4.
  • the results of separation with HPLC are shown in Fig. 12.
  • the resulting sugar chain derivative is subjected to sugar chain hydrolase (sialidase, hi-mannosidase, —galactosidase, / 3_ ⁇ -acetylhexaminidase, etc.) as appropriate, and separated by normal phase HPLC using the above amino column.
  • sugar chain hydrolase sialidase, hi-mannosidase, —galactosidase, / 3_ ⁇ -acetylhexaminidase, etc.
  • a sugar chain mixture in cells or tissues can be separated in detail, and the sugar chain structure can be comprehensively analyzed. It was possible to search for sugar chains and their functions that had not been identified, and to make a great contribution to future sugar chain research.

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Abstract

糖鎖混合物から糖鎖誘導体を製造する方法であって、(a)糖鎖混合物中の糖鎖に脂溶性基を導入して糖鎖誘導体の混合物を得る工程、及び(b)該糖鎖誘導体の混合物をセロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーで処理する工程を備えたことを特徴とする糖鎖誘導体の製造方法。

Description

明 細 書 糖鎖誘導体の製造方法、 構造解析方法、 及び糖鎖誘導体 技術分野
本発明は、 糖鎖の混合物からの糖鎖誘導体の製造方法、 及び糖鎖の構造解析方 法に関する。 更に本発明の糖鎖誘導体の製造方法によつて製造された新規糖鎮誘 導体に関する。 背景技術
糖タンパク質中の糖鎖はタンパク質の立体構造の保持、 プロテアーゼからの分 解を防ぐ抵抗性の獲得などの働きを担っていると考えられてきた。 最近になり、 糖タンパク質中の糖鎖が受精や分化、 シグナル伝達、 癌化、 タンパク質の細胞内 輸送や生理活性の調節などの生命現象に関与することが明らかにされつつある。 また、 細胞表面の接着分子や糖タンパク質性ホルモンなどの糖鎖とその機能との 関係が明らかにされ、 糖質科学コンソーシアム構想がまとめられている。 現在、 糖鎖機能研究の中心はその生合成を司る糖転移酵素 （糖鎖遺伝子） に関する研究 が中心となっているが、 糖転移酵素もまたゲノム情報により保存され、 他のタン パク質との協調作業により生命機能に関与することを考えれば、 細胞、 組織中に 発現する糠鎖の全体像を捉え解析する構造グライコミクス手法により糖鎖の機能 解析を進める必要がある。
糖鎖科学における構造グライコミタスの役割は、 多くの生命現象で重要な役割 を担っている糖鎖認識機構を網羅的に解析することであり、 機能グライコミクス に不可欠な要素である。 構造グライコミタスに要求される技術的要素としては高 い網羅性、 高スループット、 高感度および高精度である。
現在、 糖タンパク質糖鎖の構造解析法としては、 タンパク質から切り出した糖 鎖を蛍光標識後、 高速液体クロマトグラフィー （H P L C ) や質量分析法 （M S) を用いて解析する方法が質量分析の劇的な技術進歩により有力な手段となつ ており （非特許文献 1〜4)、 シァロ糖鎖の分離には陰イオン交換カラムクロマ トグラフィ一がもっぱら用いられてきた （非特許文献 5)。
【非特許文献 1】 B 1 o m e d Ch r oma t o g r 6 ： 103-1 1 5 (2002)
【非特許文献 2】 An a l B i o c h em. 206 : 278-287 ( 992)
【非特許文献 3】 B i o c h em S o c T r a n s 21 ： 1 21-1
25 (1993)
【非特許文献 4】 Ch em Re v. 102 : 321 -369 (2002) 【非特許文献 5】 B i o c h i m B i o p hy s Ac t a. 705 : 1 67- 173 (1 982)
• しかしながら、 細胞や組織中の糖鎖を網羅的に解析する場合、 シアル酸ゃフコ ースなどの非還元末端修飾の多様性と糖鎖の分枝という問題が存在するために、 混在する糖鎖を十分に分離することができず、 満足のいく結果を得ることができ なかった。 特にイオン交換カラム等を用いると、 特異的な分離能を有していない ために十分な分離が得られないばかり力、 分離操作後に脱塩処理を施さなければ ならず、 実用的な方法とはいえない。
よって、 これらの糠鎖不均一性情報に配慮しながら、 細胞、 組織に特徴的な糖鎖 構造を詳細に解析できる実用的な手法が熱望されていた。
本発明は、 細胞や組織中の糠鎖のように種々の糖鎖が混在している状態から、 各糖鎖を分離し、 取得する手段を提供することを課題とする。
また、 本発明は、 分離した各糖鎖化合物の構造を解析する手段を提供すること を課題とする。 .
更に、 本発明は、 新規な糖鎖誘導体を提供することを課題とする。 発明の開示 本発明は以下の発明に係る。
1. 糖鎖混合物から糖鎖誘導体を製造する方法であって、 （a) 糖鎖混合物中の 糖鎖に脂溶性基を導入して糖鎖誘導体の混合物を得る工程、 及び （b) 該糖鎖誘 導体の混合物をセロトニンァフィニティーカラムクロマトグラフィ一で処理する 工程を備えたことを特徴とする糖鎖誘導体の製造方法。
2. (b) 工程の後に （c) ァミノカラム又はアミドカラムを用いる順相クロマ トグラフィ一で処理する工程を備えた上記記載の糖鎖誘導体の製造方法。
3. (c) 工程の前に （d) 糠加水分解酵素で処理する工程を備えた上記記載の 糖鎖誘導体の製造方法。
4. 糖鎖混合物中の糖鎖の構造を解析する方法であって、 （a) 糖鎖混合物中の 糖鎖に脂溶性基を導入して糖鎖誘導体の混合物を得る工程、 （b) 該糖鎖誘導体 の混合物をセロトニンァフィニティーカラムクロマトグラフィ一で処理する工程、 及ぴ （e) 質量分析法に処理する工程を備えたことを特徴とする糖鎖の構造解析 方法。
5. (b) 工程の後に （c) ァミノカラム又はアミドカラムを用いる順相クロマ トグラフィ一で処理する工程を備えた上記記載の糖鎖の構造解析方法。
6. (c) 工程の前に （d) 糖加水分解酵素で処理する工程を備えた上記記載の 糖鎖の構造解析方法。
7. 質量分析法が、 MALD I— TOF MSによる質量分析法である上記 4記 载の糖鎖の構造解析方法。
8. 後述の式 （1) 〜 （6) で表される糖鎖誘導体 [式中 R1は 2—カルボキシ フエ二ノレ基、 3—力ノレボキシフエ-ノレ基、 4一力ノレボキシフエ二ノレ基、 p—エト キシカルポニルフヱニル基、 又は 2—ピリジル基を表す。 R2は水酸基、 基一A s n又は基一A s n— R3を表す。 ここで A s nはァスパラギン基を表し、 R3 はカーバメート系又はアミド系保護基を表す。 Acはァセチル基を表す。]。
9. 式 （1) 〜 （6) で表される糖鎖誘導体から誘導される癌マーカー。
本発明者等は、 鋭意検討を重ねた結果、 糖鎖に脂溶性基を導入して糖鎖誘導体 とした後、 シアル酸と親和性を有するセロトニンをリガンドとするァフィ二ティ 一力ラムクロマトグラフィ一に処理することにより、 ァシァ口糖鎖とシァロ糖鎖 との分離、 加えてシァロ糖鎖中のモノシァ口、 ジシァ口、 トリシア口及びテトラ シァロ糖鎖等をシアル酸残基の数によって分離できることを見出した。
更に該ァフィニティーカラムクロマトグラフィーによって分離した画分を、 そ れぞれァミノカラム又はアミドカラムを使用したクロマトグラフィ一に供するこ とで分枝構造の異なる糖鎖誘導体を詳細に分離できることを見出し、 単一構造の 糖鎖を大量に製造することを可能とした。
また、 分離した各糖鎖誘導体に適当な糖加水分解酵素を作用させ、 ァミノカラ ム又はアミ ドカラムを使用したクロマトグラフィーに供して単離し、 得られた糖 鎖誘導体を質量分析法に処することで高精度かつ網羅的に糖鎖構造を解析できる ことを見出し、 本発明を完成した。
•本発明の製造方法において使用する糖鎖混合物の糖鎖は、 特に制限されずァス パラギン結合型糖鎖 （ N—グリコシド結合型糖鎖）、 ムチン型糖鎖 （〇一グリコ シド結合型糖鎖）、 遊離型糖鎖、 更には糖鎖結合ァスパラギンのようにアミノ酸 が結合している糖鎖を包含する。
これら糖鎖は化学的手法によつて調製された糖鎖であってもよいが、 例えば天 然の糖タンパク質に由来する糖鎖は非還元末端の糖残基がランダムに欠失した糖 鎖の混合物となっており、 これら糠鎖の混合物を使用するのが好ましい。 また、 糖鎖残基にシアル酸残基を有する糖鎖を含有する糖鎖混合物を使用するのが好ま しい。
天然糖鎖の混合物としては、 天然原料、 例えば乳汁、 ゥシ由来フチュイン、 卵 又は生体の組織や細胞に由来する糖鎖混合物が挙げられる。 特に癌組織又は癌細 胞に由来する糖鎖混合物を使用することは、 大変興味深い結果が期待できるので 好ましい。
本発明で使用できる天然糖鎖の混合物としては、 次に示す糖鎖混合物を好まし く例示できるが、 シァロ糖鎖が含まれる糖鎖混合物が特に好ましい。 該天然原料から公知の方法によつて糖タンパク質及び Z又は糖ぺプチドの混合 物を得、 当該混合物にタンパク質分解酵素等を作用させてぺプチド部分を切断し、 ゲルろ過力ラムゃィオン交換力ラム等を用いたクロマトグラフィ一で精製して得 られた糖鎖結合ァスパラギンの混合物を使用することができる。
また、 例えば生体の組織や細胞、 特に培養組織や培養細胞を用いて、 培養液中 の組織又は細胞をホモジネートし、 次いで遠心分離して得られた細胞膜画分を 2 一メルカプトエタノールで処理した後、 N—グリカナーゼを作用させて得られた 糖鎖の混合物を使用することができる。
また、 培養組織や培養細胞をホモジネートし、 遠心分離した上清を採取するこ とで得られた遊離糖鎖の混合物を使用することができる。 これらの糖鎖の中には 中性糖鎖として高マンノース型糖鎖や多様なシァロ糖鎖を含むので、 各種の糖鎖 の製造に適している。
• 得られた糖鎖の混合物中の糖鎖に脂溶性基を導入して糖鎖誘導体の混合物とす る。
脂溶性基は、 糖鎖の還元末端の開環アルデヒド、 糖鎖結合ァスパラギンのァス パラギンァミノ基又はカルボキシル基に反応して形成する脂溶性を有する置換基 であり、 例えば 2—、 3—または 4—カルボキシフエニルァミノ基、 p—ェトキ シカルボ二ルフヱニルァミノ基、 2—ピリジルァミノ基等の通常蛍光標識として 使用される置換基や 9一フルォレニルメ トキシカルボニル （F m o c ) 基、 t e r t 一ブトキシカルボニル （B O C) 基、 ベンジル基、 ァリル基、 ァリルォキシ カルボ-ル基、 ァセチル基等のカーバメート系又はアミ ド系保護基として使用さ れる置換基を挙げることができる。
.これら脂溶性基の導入は公知の方法によって行うことができ、 操作の簡便さ、 得られる糖鎖誘導体の安定性、 励起光が水銀光源やレーザー光源に対応している ことなどから 2—カルボキシフエ-ルァミノ基、 F m o c基又は B O C基を好ま しく使用できる。
例えば、 2—ァミノ安息香酸を用いて、 シァノホウ素化水素ナトリウムゃジメ チルァミノ化ホゥ素等の還元剤の存在下で糖鎖と反応させることで、 ァミノアル ジトール誘導体とすることができる。
また、 例えば 9 _フルォレニルメチルー N—スクシ二ミヂルカーボネートを用 いて、 炭酸水素ナトリウム存在下、 糖鎖結合ァスパラギンと反応させることで、 ァスパラギンのァミノ基にカーバメート様に結合した F m o c基を導入すること ができる。
以上のような操作によって、 脂溶性基が導入された糖鎖誘導体の混合物を得る ことができる。
得られた糖鎖誘導体の混合物をセロトニンァフィニティーカラムクロマトダラ フィ一により分離する。
本発明におけるセロトニンァフイエティーカラムクロマトグラフィ一はシアル 酸と親和性を有するセロトニンをリガンドとするァフィ二ティーカラムを使用す る。
セロトニンアブイ二ティーカラムとしては、 セロトニンを充填剤に固定ィ匕して 作成してもよく、 市販されているカラムを使用してもよい。 市販のカラムとして は、 L A—セロトニンカラム (株式会社 J一オイルミルズ製) 等が挙げられる。 クロマトグラフィーの分離条件は適宜設定されるものであるが、 その一例を挙 げると、 蛍光検出器を用いて、'励起波長 3 5 0 n m、 蛍光波長 4 2 5 n mとし、 流速 0 . 5 m 1 Zm i n、 移動相を超純水と酢酸ァンモ-ゥム水溶液とを使用し て直線グラジェント溶出とすることで分離を達成することができる。
セロトニンァフィニティーカラムクロマトグラフィ一により、 糖鎖誘導体の混 合物を糖鎖誘導体のシアル酸残基の数によつて分離することができ、 シアル酸残 基を有さないァシァ口糖鎖誘導体が最も早く溶出し、 次いでモノシァロ糖鎖誘導 体、 ジシァ口糖鎖誘導体という具合にシアル酸残基の数の増加に比例して分離溶 出することができる。
以上のようにセロトニンァフイエティーカラムによって分離した糖鎖誘導体を、 ポリマーベースのァミノカラム又はシリカベースのアミ ドカラムを使用した順相 H P L Cに処理することで、 極めて優れた糖鎖誘導体間の分離を可能とすること ができる。 順相クロマトグラフィーとは、 アミノ基、 ァミノプロピル基、 アタリ ルアミ ド基など極性固定相を充填剤として用いるクロマトグラフィーであって、 試料成分の固定相-移動相に対する試料成分の分配度の差に基づいて分離が達成 されることを特徴する。 基本的に糖鎖の親水性に基づいて分離されるモードであ り、 シアル酸が結合した糖鎖の異性体の分離にも好ましく用いることができる。 また、 希酸ゃノイラミニダーゼにより処理されたァシァ口型の糖鎖の分離にも好 ましく用いることができる。
使用するポリマーベースのァミノカラムとしては、 アミノ基をポリビュルアル コール系基材ゲル等のポリマーに結合させた固定相を充填剤として用いたカラム であって、 自ら作成してもよいが、 市販されているカラムを使用してもよレ、。 市販のァミノカラムとしては、 A s a h i S h o d e x NH 2 P—5 0 4 E (昭和電工株式会社製） を挙げることができる。
シリカベースのアミ ドカラムとしては、 ァクリルアミ ド等のアミ ド基をシリカを 固定相とする充填剤に化学結合させて導入したカラムであって、 自ら作成しても よいが、 市販されているカラムを使用してもよい。
市販のアミ ドカラムとしては、 T S K— G E L Am i d e— 8 0 (T O S〇
H C o r p製） を挙げることができる。
クロマトグラフィーの分離条件は適宜設定されるものであるが、 その一例を挙 げると、 蛍光検出器を用いて、 励起波長 3 5 0 n m、 蛍光波長 4 2 5 n mとし、 流速 1 m 1 /m i n、 移動相を酢酸含有ァセトニトリルと酢酸及びトリェチルァ ミン含有水溶液とを使用して直線グラジェント溶出とすることで分離することが できる。
以上のようにして単離して得られる糖鎖誘導体は、 糖加水分解酵素の適用、 質 量分析法による分析により、 その糖鎖構造を解析することができる。
糖加水分解酵素としては、 公知の酵素を使用することができ、 例えばシァリダー ゼ、 ガラク トシダーゼ、 マンノシダーゼ、 N—ァセチノレグノレコサミダーゼ、 フコ シダーゼ等を挙げることができる。
質量分析方法としては、 従来公知の質量分析法を採用した質量分析装置によつ てなされるが、 近年特に糖鎖分析に用いられている MA L D I— T O F M Sに より測定するのが好ましい。
糖鎖構造を解析するには、 特定の糖加水分解酵素を作用させた後、 ポリマーべ 一スのァミノカラム又はシリ力ベースのァミドカラムを使用した順相 H P L Cで 処理し、 得られた画分を質量分析して消失した質量分と加水分解酵素の特性とを 考慮し、 更にこの操作を繰り返すことで糖鎖構造を解析することができる。 得られる糖鎖誘導体は、 その脂溶性基を除去することで種々の糖鎖を、 人工的 に容易にかつ大量に得ることができる。
脂溶性基の除去は従来公知の方法を適用することができる。
例えば、 2—力ルポキシフエニルァミノ基の除去は、 酢酸中で過酸化水素と室温 で反応させることで達せられ、 容易に遊離型糖鎖として回収することができる。 また、 F m o c基の除去は、 N, N—ジメチルホルムアミド中、 糖鎖誘導体にモ ルホリンを加えて反応させることで達せられ、 B O C基の除去には弱酸を反応さ せることで達せられる。
糖鎖が糖鎖結合ァスパラギンである場合、 無水ヒドラジンと反応させた後、 ァ セチル化する方法、 塩基性水溶液中加熱還流後、 ァセチルイヒする方法等により、 ァスパラギン残基を除去することができる。
かかる糖鎖類は、 医薬品開発等の分野において非常に有用であり、 例えば癌の ヮクチン合成が挙げられ、 得られた糖鎖類を化学的な反応や糖転移酵素による反 応等を組み合わせて新たな糖残基を結合させて誘導体化し、 新規ワクチンの開発 を可能とする。
本発明者等は、 本発明の構造解析方法及び製造方法により、 各種癌細胞中にこ れまで認められなかった下記式 （1 ) 〜 （6 ) で示される糖鎖を単離することに 成功した。
Figure imgf000010_0001
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(3)
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( 6 )
[式中 R 1は 2 _カルボキシフエニル基、 3—力ルポキシフエニル基、 4—カル ボキシフエニル基、 p—エトキシカルボユルフェニル基、 又は 2—ピリジル基を 表す。 R 2は水酸基、 基一A s n又は基一 A s n— R 3を表す。 ここで A s nは ァスパラギン基を表し、 R 3はカーバメート系又はアミド系保護基を表す。 A c はァセチル基を表す。]
これら新規な糖鎖は、 癌細胞中に特異的に発現するものと考えられ、 これら糖 鎖を癌マーカーとして利用することができる。 '
例えばこれら癌細胞中の特異的な糖鎖と特異的に認識するポリクローナル抗体 又はモノクローナル抗体を作製し、 免疫学的手法により該糖鎖の検出を行うこと で成される。
ポリクローナル抗体は、 該糖鎖又は該糖鎖のハプテンとタンパク質等の高分子 化合物 （担体） と結合させた結合体を抗原としてマウス、 ハムスター、 モルモッ ト、. ニヮトリ、 ラット、 ゥサギ、 ィヌ、 ャギ、 ヒッジ、 ゥシ等の哺乳動物を免疫 感作し、 該哺乳動物から血液を採取し、 ポリクローナル抗体を含む抗血清を調製 することができる。
モノクローナル抗体は、 例えば、 抗体産生細胞とミエ口一マ細胞株との細胞融 合により得られるハイプリ ドーマを調製して得ることができる。 このようにして 得られたハイプリ ドーマを培養し、 産生されるモノクローナル抗体を精製すれば よい。 図面の簡単な説明
図 1は実施例 1で得られた糖鎮誘導体のァフィニティーカラムクロマトグラム である。
図 2は実施例 2で得られた糖鎖誘導体のァフィニティーカラムクロマトグラム である。
図 3は実施例 3で得られた糖鎖誘導体の H PLCでのクロマトグラムである。 図 4は実施例 3で得られた糖鎖誘導体の HP LCでのクロマトグラムである。 図 5は実施例 3で得られた糖鎖誘導体の H PLCでのクロマトグラムである。 図 6は実施例 3で得られた糖鎖誘導体の H PLCでのクロマトグラムである。 •図 7は実施例 3で得られた糖鎖誘導体の HPLCでのクロマトグラムである。 図 8は実施例 4で得られた糖鎖誘導体のァフィニティーカラムクロマトグラム である。
図 9は実施例 5で得られた糖鎖誘導体の HP LCでのク口マトグラムである。 図 10は実施例 6で得られた糖鎖誘導体のァフィニティーカラムクロマトダラ ムである。 '
図 1 1は実施例 7で得られた糠鎖誘導体のァフィニティーカラムクロマトダラ ムである。
図 1 2は実施例 7で得られた糠鎖誘導体の H PLCでのクロマトグラムである。
発.明を実施するための最良の形態
以下に参考例及び実施例を示すが、 本発明は下記実施例に限定されるものでは ない。
実施例 1 セロトニンァフィニティークロマトグラフィーによるヒ ト血清由来
[1—酸性糖タンパク質 （AGP)] 糖鎖の分離 ヒ ト血清由来 AGP (シグマアルドリッチジャパン製） l mgを 2 0mMリン 酸緩衝溶液 （ p H 7. 5 ) 5 0 μ Iに溶解し、 N— g l y c a n a s e F (2
Un i t , 4 μ I ) を加え、 3 7°Cで 1 2時間反応させた。 反応後 1 0 0°Cで 3 分間煮沸し遠心分離後の上清を回収した。
回収した上清に 2—ァミノ安息香酸 （2— AA) およびシァノ水素化ホゥ素ナ トリウムをそれぞれ 3 %となるように 2 %ホウ酸、 4 %酢酸ナトリウム混液 （ 5
0 0 1 ) に溶解して 1 0 0 1加え、 8 0°Cで 1時間反応させた。 反応混合物 を 5 0%メタノール水溶液で平衡ィ匕した S e p h a d e X LH— 2 0カラム （
0. 7 c m i . d. , 3 0 c m) を用いて分画し、 分光光度計 （日立製、 F— 4 0 1 0型） を用いて、 励起波長 3 3 5 nm, 蛍光波長 4 1 0 nmで各分画を測定 して、 最初に溶出される蛍光性分画を回収し、 糖鎖誘導体の混合物とした。
得られた混合物をセロトニンァフィニティーカラムクロマトグラフィ一に供し 分離した糖鎖誘導体を得た。 ァフィユティーカラムクロマトグラフィ一での分離 結果を図 1に示す。
セロ トニンァフィニティーカラムクロマトグラフィーの条件
カラム ： LA_S e r o t o n i nカラム (4. 6 X 1 5 0 mm, J a p a n
O i 1 m i 1 1 s製）
ポンプ： J AS CO PU— 9 8 0型
流速： 0. 5 m 1 / m i n
検出器： J AS CO F P— 9 2 0型蛍光検出器
励起波長： 3 5 0 n m
蛍光波長： 4 2 5 n m
移動相：溶液 Aとして超純水、 溶液 Bとして 4 OmM酢酸アンモニゥム水溶液を 用いた。
グラジェント条件：試料注入後 2分間を溶液 B 5 %とし、 3 7分後に酢酸ァンモ ニゥム濃度が 3 OmMとなるように、 直線グラジェント溶出を行い、 その後 1 0 分間で 40 mMになるように行った。 なお、 セロ トニンァフィニティークロマトグラフィーの分離条件は以下の実施 例においても同様とした。
実施例 2 (ヒ ト癌細胞由来糖鎖のセロ トニンァフィニティークロマトグラフィー による分離）
細胞培養
ヒト腎腺癌細胞 ACHN、 ヒト肺癌細胞 A 549、 ヒト胃癌細胞 MKN45及 ぴヒト組織球性リンパ腫 U 937を用いた。 ACHN及ぴ A 549は予め 50°C で 30分間加熱することにより非動化したゥシ血清 [NEWBORN CALF SERUM (NCS)、 シグマアルドリッチジャパン製]を 10%含む DMEM (Du l b e c c o' s Mo d i f i e d E a g l e Me d i um、 シグ マアルドリッチジャパン製） を用い、 U 937及び MKN45では 10%NC S を含む RPMI— 1640 (シグマアルドリッチジャパン製） を用い、 5% C O 2存在下 37 °Cで組織培養シャーレ中で培養した。 U 937を除く細胞は 8 0 %コンフルェント状態において、 培養中の細胞を等張化リン酸緩衝液 (PB S) で洗浄後、 トリプシン溶液を加え、 37 °Cで 5分間処理した後、 剥離した細 胞を回収し、 PBSで洗浄後継代培養した。
細胞膜画分の調製
細胞膜分画の調製には 80%コンフルェント状態の細胞を用い、 セルスクレー パーを用い、 培養器より回収した。 回収した細胞は P B Sで洗浄後、 1 X 108 e e l l/5mlの濃度となるように 1%のプロテアーゼインヒビターを含む 1 OmM Na 2HP04 (pH7. 5) 中、 グラスホモジナイザーを用いてホモジ ナイズ後、 0. 5Mの S u c r o s eを含む 2 OmMの T r i s— HC 1 b u f .f e r (pH7.5) を 10m l加え、 4°C、 3000 r p mで 15分間遠心 分離後上清を回収後、 4°C、 1 9000 r pmで遠心分離し、 得られた沈殿を細 胞膜画分とした。
細胞膜画分からの糖鎖の遊離
細胞膜画分 （ 1 X 107 c e 1 1 ) に 1 % S D S溶液 40 μ 1を加え、 2—メ ルカプトエタノールを 1 %になるように加えた後、 1 0 0°Cの沸騰水浴上で 5分 間加熱することにより可溶化を行つた。 膜画分を含む溶液を室温まで冷却し、 N P— 4 0を 1 %になるように加え、 終濃度が 2 0 mMになるようにリン酸緩衝液 (p H 7. 5) をカロえた。 さらに、 N— g l y c a n a s e F 4 μ 1 (2U n i t、 R o c h e d i a g n o s t i c s製） を力 Dえ、 3 7°Cでー晚ィンキ ュペートし、 1 0 0 °Cの沸縢水浴上で 5分間煮沸し、 9 5 %エタノ一ルを終濃度 が 7 5 %になるように加えた後、 4°C、 1 5 0 0 0 r p mで遠心分離し上清を減 圧乾固し、 細胞膜由来糖鎖とした。
調製した各細胞膜由来糖鎖に、 上記実施例 1と同様に 2— AAを導入後、 セロ トニンァフィニティーカラムクロマトグラフィーで処理し、 各糖鎖誘導体画分を 得た。 カラムクロマトグラフィーでの分離結果を図 2に示す。
実施例 3 (順相型アミドカラムによる癌細胞由来糖鎖の分離及び構造解析） •実施例 2で得られた各画分の癌細胞由来糖鎖誘導体 （ 1 X 1 07 c e 1 1相 当） を 2 0 mM酢酸緩衝液 （ p H 5. 0 ) 2 0 ^ 1に溶解し、 シァリダーゼ 4 μ 1 (2mU, マルキンバイオ製） を加えて 3 7 °Cで 24時間反応させた。 反応後 1 0 0°Cで 3分間煮沸し、 遠心分離後の上清を回収した。
得られた上清をアミドカラムを用いた順相 HP LCに供し、 糖鎖誘導体を分取 した。 H P L Cでの分離結果を図 3〜 7に示す。
HP L C条件
カラム： T SK— GE L Am i d e— 8 0 (TO S OH COR PORAT I ON, J a p a n ; 4. 6 X 2 5 Omm)
カラム温度： 4 0°C
ポ.ンプ： J AS CO PU— 9 8 0型
流速： 1 m 1 / m 1 n
検出器： J AS CO F P 9 2 0型蛍光検出器
励起波長： 3 5 0 n m
蛍光波長： 4 2 5 nm 移動相：溶液 Aとして 0. 2 %酢酸を含むァセトニトリル溶液、 溶液 Bとして 0. 1 %酢酸及び 0. 1 %トリェチルァミンを含む水溶液を用いた。
グラジェント条件：試料注入後 2分間を溶液 B 3 0 %とし、 6 0分後に溶液 Bが 6 5 %となるように直線ダラジェント溶出を行つた。
糖加水分解酵素と質量分析法による構造解析
U 9 3 7由来のピーク 3 1の糠鎖誘導体を 2 0 mMクェン酸緩衝液 ( p H 3. 5) 2 0 μ 1に溶解し、 ；3—ガラクトシダーゼ 1 μ 1 (2 5 mU、 生化学ェ 業社製） を加えて 3 7°Cで 24時間反応させた。 反応後 1 0 0°Cで 3分間煮沸し 遠心分離後の上清を回収した。 得られた上淸をアミ ドカラムを用いた順相 HP L Cに供して得た画分の一部を MA LD I — TO F M Sにより分析した。 結果、 分子量 2 7 1 8の糖鎖誘導体 （a ) が得られた。
その糖鎖誘導体 （a ) を 2 OmMクェン酸緩衝液 (p H 5. 0) 2 0 ^ 1に溶 解し、 ]3— N—ァセチルへキサミニダーゼ 1 μ 1 (1 OmU, 生化学工業社製） を加えて 3 7 °Cで 24時間反応させた。 反応後 1 0 0でで 3分間煮沸し遠心分離 後の上清を回収し、 得られた上清を上記と同様に分析した結果、 分子量 1 9 0 6 の糖鎖誘導体 （b) が得られた。
更に糖鎖誘導体 （b) を β—ガラクトシダーゼで処理した結果、 分子量 1 5 8 2の糖鎖誘導体 （c) が得られた。
以上の結果より、 ピーク 3 1は下記式で表される糖鎖誘導体であることが判明 した。
Figure imgf000018_0001
同様にピーク 35の糖鎖誘導体も、 j3—ガラクトシダーゼ、 i3— N—ァセチル へキサミニダーゼ、 次いで ^—ガラクトシダーゼで処理し、 下記式で表される糖 鎖誘導体であることが判明した。
Figure imgf000018_0002
他のピークの誘導体についても加水分解酵素を適宜使用し、 MALD I— TO F MS分析等を行い、 図 3〜 7に示すピークに相当する糠鎖構造を表 1〜5に 示した。 なお、 表 1〜 14中の分子量は糖鎖還元末端に 2—アミノ安息香酸が結 合した状態での分子量 （MW) を示し、 記号は次のものを示す。
Ga l : D—ガラクトース、 G 1 c NA c ： N—ァセチルダルコサミン、 Ma n : D—マンノース、 F u c ： フコース、 2—AA： 2—ァミノ安息香酸、 N e u A c ： シアル酸。
ここで糖鎖還元末端に 2—ァミノ安息香酸が結合した糖鎖、 例えば、 次式で表さ れる糖鎖部分構造は、 一 4G 1 cNAc 1 -4 G 1 cNAc— 2—ΑΑと表す こととする。
Figure imgf000019_0001
MALD I— TOF MS分析
装置には Vo y a g e r DE— PRO (P E B i o s y s t erns, F r a m i n g h am, MA) を用い、 リエアー Zネガティブイオンモードにより、 加 速電圧 20 k V、 グリツド電圧 96. 3%、 D e l a y t i me 1 000 n s e c, L e n s O f f s e t 1.25、 レーザー強度 （窒素レーザ 一） 2700で測定した。 水に溶解したサンプル 0. 5 ^ Lと 2, 5— D i h y d r o xy b e n z o i c a c i d (DHB) の 20mg /m Lメタノ一ノレ溶液 0. 5 L を混和し、 乾燥後、 測定用試料として用いた。
【表 1
Figure imgf000020_0001
【表 2】
Figure imgf000021_0001
【表 3】
Figure imgf000022_0001
【表 4】
Figure imgf000023_0001
【表 5】
Figure imgf000024_0001
実施例 4 (細胞内に存在する遊離糖鎖 1 )
ヒト胃癌細胞 MKN 45を P B Sで洗浄後、 l X l 08 c e l l Z5 m lの濃 度となるようにグラスホモジナイザーを用いて 1 %のプロテアーゼインヒビター を含む 1 0mM N a 2HP04 (pH 7. 5) 中でホモジナイズ後、 0. 5Mの S u c r o s eを含む 2 OmMの T r i s— HC 1 b u f f e r (p H 7.
5) を 1 ◦ m 1加え、 4°C、 3 000 r p mで 1 5分間遠心分離後、 上清を集め、 さらに、 4°C、 1 9000 r pmで遠心分離し、 その上清を減圧乾固し遊離型糖 鎖混合物を得た。
得られた遊離型糖鎖混合物に実施例 1に記載の方法と同様に、 2 _AAを導入 して遊離型糖鎖誘導体の混合物を得、 セロトニンアブイ二ティーカラムクロマト グラフィ一で分画して遊離型糖鎖誘導体を得た。
ァフィ二ティーカラムク口マトグラフィ一による分離結果を図 8に示す。
得られた各画分をァミノカラムを用いた順相 H P L Cで分離し、 遊離型糖鎖誘導 体を得た。
HP LC条件
カラム： A s a h i S h o d e x NH2 P— 5 0 4 E (S h owa D e n k o, T o k y o, J a p a n ; 4. 6x250 mm)
カラム温度： 50°C '
ポンプ： J AS CO PU—9 80型
流速 : 1 m l /m i n
検出器： J AS CO FP— 9 20型蛍光検出器
励起波長： 3 5 0 n m
蛍光波長： 42 5 n m
移動相：溶液 Aとして 2 %酢酸を含むァセトニトリル溶液、 溶液 Bとして 5 %酢 酸及び 3 %トリェチルァミンを含む水溶液を用いた。
グラジェント条件：試料注入後 2分間を溶液 B 30 %とし、 80分後に溶液 Bが 9 5 %となるように直線グラジェント溶出を行い、 1 00分まで溶液 Bを 9 5 % となるように保った。
得られた遊離型糖鎖誘導体を、 糖加水分解酵素 （シァリダーゼ、 c¾一マンノシ ダーゼ、 —ガラクトシダーゼ、 /3— N—ァセチルへキサミニダーゼ等） を適宜 作用させ、 上記アミノカラムを用いた順相 HPLCで分離後、 得られた画分を凍 結乾燥後、 MALD I— TOF MSで分析することにより、 遊離型糖鎖誘導体 の構造を角军析した。
なお、 a—マンノシダーゼでの処理は、 糖鎖誘導体を 20 mMクェン酸緩揮 ί液 (ρΗ4. 5) 20 μ 1に溶解し、 α—マンノシダーゼ 2 i 1 (1 OmU, 生化 学工業社製） を加えて 37°Cで 24時間反応させ、 反応後 100°Cで 3分間煮沸 して遠心分離後の上清を回収することでなされる。 その他の糖加水分解酵素での 処理は前記実施例での記載と同様とした。 得られた糖鎖誘導体を表 6及び 7に示 す。
表 6及び 7の遊離型糖鎖は新規化合物であり、 例えば N o . 1の分子量 1 32 1である糖鎖誘導体は下記式で表される。
Figure imgf000026_0001
【表 6
Figure imgf000027_0001
【表 7】
Figure imgf000028_0001
実施例 5 (細胞内に存在する遊離糖鎖 2)
ヒ ト胃癌細胞 MKN45に替えて、 ヒ ト T細胞リンパ腫 J u r k a t 27 (糖 鎖導入細胞株） を用いた以外は、 実施例 4と同様に操作して、 遊離型糖鎖混合物 を得た。
得られた遊離型糖鎖混合物に実施例 1に記載の方法と同様に、 2一 AAを導入 して遊離型糖鎖誘導体の混合物を得、 セロトニンァフィ二ティーカラムクロマト グラフィ一で分画して遊離型糖鎖誘導体を得た。
得られた各画分をアミ ドカラムを用いた順相 HPLCで分離し、 遊離型糖鎖誘 導体を得た。
HPLC条件 ' '
カラム： TSK— GEL Am i d e— 80 (TO S OH CORPORAT I ON, J a p a n ; 4.6x250mm)
カラム温度： 40°C
ポンプ： JASCO PU—980型
流速： 1 m 1 Z m i n
検出器： JASCO FP— 920型蛍光検出器
励起波長： 350 n m 蛍光波長： 4 2 5 n m
移動相：溶液 Aとして 0 . 1 %酢酸を含むァセトニトリル溶液、 溶液 Bとして
0 . 2 %酢酸及び 0 . 2 %トリェチルァミンを含む水溶液を用いた。
グラジェント条件：試料注入後 2分間を溶液 B 3 0 %とし、 6 0分後に溶液 Bが
6 5 %となるように直線グラジェント溶出を行った。
H P L Cでの分離結果を図 9に示す。
得られた遊離型糖鎖誘導体を、 実施例 4と同様に操作して、 遊離型糖鎖誘導体 の構造を解析した。 得られた糖鎖誘導体を表 8に示す。
【表 8】
Figure imgf000029_0001
実施例 6 (ヒ ト子宮頸都癌細胞の糖鎖）
ヒト子宫頸部癌細胞 He L aをあらかじめ 50°Cで 30分間加熱することによ り非動化した NCSを 10%含む DMEMを用いて培養した。 80%コンフルェ ント状態において、 培養中の細胞を P B Sで洗浄後、 トリプシン溶液を加え、 3 7 °Cで 5分間処理した後、 剥離した細胞を回収し、 PB Sで洗浄後継代培養し、 実施例 2に記載の細胞膜画分の調製、 細胞膜画分からの糖鎖の遊離と同様に処理 して細胞膜由来の糖鎖混合物を得、 上記実施例 1と同様に 2— AAを導入後、 セ 口トニンァフィニティーカラムク口マトグラフィ一に処理し、 各糖鎖誘導体画分 を得た。
カラムクロマトグラフィ一での分離結果を図 10に示す。
得られたァシァ口糖鎖誘導体画分、 モノシァロ糖鎖誘導体画分及びジシァ口糖 鎖誘導体画分をシァリダーゼ処理した後、 ァミノカラムを用いた順相 HP L Cで 分離して糖鎖誘導体を得た。 H P L C条件は実施例 4と同様にした。
得られた糖鎖誘導体を、 糖加水分解酵素 （シァリダーゼ、 α—マンノシダーゼ、 β—ガラタ トシダーゼ、 jS— Ν—ァセチルへキサミニダーゼ等） を適宜作用させ、 上記ァミノカラムを用いた順相 H PLCで分離後、 得られた画分を凍結乾燥後、 MALD I— TOF MSで分析することにより、 糖鎖誘導体の構造を解析した。 得られた糖鎖誘導体を表 9〜 1 2に示す。
【表 9】
ァシァ口糖鎖誘導体
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
φ瓮纏聽 α 、 ,士
【0 I挲】
ZUn£/900Zd£/13d SS0TT0/.00Z OAV 【表 1 1】
ジシァ口糖鎖誘導体一
Figure imgf000033_0001
【表 1 2】
ジシァ口糖鎖誘導体一 2
Figure imgf000034_0001
実施例 7 (癌細胞特異的抗原 CD98の糖鎖）
免疫沈降法による CD 98— HCの調製
P r o t e i n A— Ag a r o s e 50 μ 1 (シグマアルドリツチジヤノ ン製） を P B S 200 μ 1により洗浄後、 PB S 50 i 1および抗 CD 98抗体 を 10 μ gノ 10 μ 1加え、 室温にて 60分間反応させた。 反応後、 P B S 1 m lにより非吸着成分の除去し、 抗 CD 98抗体固定化 A g a r o s eを得た。 抗 CD 98抗体固定ィ匕 Ag a r o s eに、 1%NP— 40 (400μ 1) により 可溶化した He L a細胞の膜分画 （2 X 1 07 c e 1 1 ) を加え、 ロータリーシ エイカーを用いて 4 °Cで一晚インキュベートした。 その後、 PB Sを lm lによ り洗浄し、 非吸着成分を除去し、 遠心分離後、 抗 CD 98抗体固定化 A g a r o s eに解離溶液 （25 OmM T r i s— HC 1 b u f f e r pH6. 8/ 4.6% SDS， 20%G 1 y c e r i n) と 2—メルカプトエタノールとの 9 : 1混液を 20 μ 1加え、 5分間煮沸し 15000 r p mで遠心した上清を C D98— HCとし、 SDS— PAGEに供した。
S D Sポリアクリルアミ ドゲル電気泳動
ゲル電気泳動装置および電源は共に B i o R a d製を用いた。 泳動ゲルは 7. 5 %ゲルを用いた。 泳動緩衝液として 25 mM T r i s, 1 98 mM G 1 y c i n e, 1 % (w/v) SDSを用いて行った。 最初の 1時間はゲル 1枚 あたり 5mAで、 続いて 1 OmAでゲル下辺部まで泳動を行った。
C o o ma s s i e B r i l l i a n t B l u e染色
SDS— P a g e終了後、 40% (v/v) Me t h a n o l , 10% (v/ v) Ac e t i c a c i d /0.2%C o oma s s i e B r i l l i a n t B l u e R 250中にてタンパク質の染色を行った。 1時間後、 Me t h a n o l ： Ac e t i c a c i d : Wa t e r (=4 : 1 : 5) を用いて脱 色した。
We s t e r n B l o t
303— 八0£後のゲルを8 I O— RAD製セミ ドライ式ブロッテイング装 置 （トランスブロット SDセル） を用いて、 ゲル中のタンパク試料を PVDF膜 に転写した。 P VDF膜は予めメタノールに 60秒浸し、 その後 48mM T r i s, 39 mM G l y c i n e, 20 %M e t h a n o 1 (pH9.0) に 1 時間浸したものを使用し、 10 O mA定電流にて 1時間電圧を印加し転写を行つ た。 転写後、 PVDF膜を 5%スキムミルクおよび 0.05%Tw e e n 20 を含む PB Sにてブロッキング操作を行った後、 抗 CD 98抗体 5 gを含む
0. 05%Tw e e n 20/P B S (5m l ) を加えー晚反応させた。 反応後、 PVDF膜を 0. 05%Tw e e n 20を含む PBS (20m l ) で 4回洗浄 後、 HRP標識 P r o t e i n A 5 μ 1を含む 0. 0 5 %T w e e n 2 0 /P B S (5m l ) を加え、 1時間反応させた。 反応後、 PVDF膜を 0. 0 5 %Tw e e n 2 0を含む PB S (2 0m l ) で 4回洗浄し、 0. 0 5 %DA B (3, 3 — D i a m i n o b e n z i d r i n e , t e t r a h y d r o c n 1 o r i d e) を含む 1 0 0 mM T r i s— HC 1 b u f f e r p H 7. 5 , 0. 0 0 3 1 %過酸化水素溶液 2 0m lを加え発色させた。
N- g l y c a n a s e Fによるゲノレ内消ィ匕
CB B染色によりバンドを確認した後、 脱色液を水に置換し、 目的のバンドを 切り取り、 エツペンドルフチューブへ入れた。 その後ァセトニトリル 1 0 0 μ 1 を加え 3 0分間放置することでゲルを脱水し、 ァセトニトリルを除去後 2 u n i t sの N— g 1 y c a n a s e Fを含む T r i s— HC 1 b u f f e r p H 7. 5を 1 0 0 μ 1加え 3 7 °Cでー晚インキュベートし糖鎖を切り出した。 そ の後、 抽出液を回収しさらに水 2 0 0 μ Iを加え 3 0分間攪拌しゲルより糖鎖混 合物を得た。
以上のようにして得られた糖鎖混合物に上記実施例 1と同様に 2— A Αを導入 後、 セロト-ンァフィニティーカラムクロマトグラフィーに処理し、 各糖鎖誘導 体画分を得た。
カラムクロマトグラフィーでの分離結果を図 1 1に示す。
得られたモノシァ口糖鎖誘導体画分及びジシァ口糖鎖誘導体画分をシァリダー ゼ処理した後、 ァミノカラムを用いた順相 HP L Cで分離して糖鎖誘導体を得た。 HP L C条件は実施例 4と同様にした。 H P L Cでの分離結果を図 1 2に示す。 得られた糖鎖誘導体を、 糖鎖加水分解酵素 （シァリダーゼ、 ひ一マンノシダ一 ゼ、 —ガラクトシダーゼ、 /3 _Ν—ァセチルへキサミニダーゼ等） を適宜作用 させ、 上記ァミノカラムを用いた順相 H P L Cで分離後、 得られた画分を凍結乾 燥後、 MA L D I — T O F MSで分析することにより、 糖鎖誘導体の構造を解 祈した。
得られた糖鎖誘導体を表 13〜 14に示す。 【表 1 3】
Figure imgf000037_0001
【表 1 4
Figure imgf000038_0001
産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、 特に細胞又は組織中の糖鎖混合物を詳細に分離するこ とができ、 網羅的にその糖鎖構造を解析することを可能としたことで、 従来知ら れていなかった糖鎖及ぴその機能を探求することができ、 今後の糖鎖研究におけ る多大なる貢献が期待できる。

Claims

請求の範囲
1. 糖鎖混合物から糖鎖誘導体を製造する方法であって、 （a) 糖鎮混 合物中の糖鎖に脂溶性基を導入して糖鎖誘導体の混合物を得る工程、 及び （b) 該糖鎖誘導体の混合物をセロトニンァフィ二ティーカラムクロマトグラフィ一で 処理する工程を備えたことを特徴とする糖鎖誘導体の製造方法。
2. (b) 工程の後に （c) ァミノカラム又はアミドカラムを用いる順 相クロマトグラフィ一で処理する工程を備えた請求の範囲第 1項に記載の糖鎖誘 導体の製造方法。
3. (c) 工程の前に （d) 糖加水分解酵素で処理する工程を備えた請 求の範囲第 2項に記載の糖鎖誘導体の製造方法。
4. 脂溶性基が 2—カルボキシフエニルァミノ基又はフルォレニルメ トキシカルボニル基である請求の範囲第 1項に記載の糖鎖誘導体の製造方法。
5. ァミノカラムがポリマ一べ一スのァミノカラムである請求の範囲 第項 2に記載の糖鎖誘導体の製造方法。
6. アミドカラムがシリカベースのアミドカラムである請求の範囲第 2項 2に記載の糖鎖誘導体の製造方法。
7. 糖鎖混合物が、 '天然糖鎖の混合物である請求の範囲第 1項に記載 の糖鎖誘導体の製造方法。
8. 糖鎖混合物が、 細胞由来糖鎖の混合物である請求の範囲第 1項に 記載の糖鎖誘導体の製造方法。
9. 糖鎖混合物が、 シァロ糖鎖を含んでなる糖鎖混合物である請求の 範西第 1項に記載の糖鎖誘導体の製造方法。
1 0. 糖鎖混合物中の糖鎖の構造を解析する方法であって、 （a) 糖鎖混 合物中の糖鎖に脂溶性基を導入して糖鎖誘導体の混合物を得る工程、 （b) 該糖 鎖誘導体の混合物をセロトニンァフィニティーカラムクロマトグラフィーで処理 する工程、 及び （e) 質量分析法に処理する工程を備えたことを特徴とする糖鎖 の構造解析方法。
1 1. (b) 工程の後に （c) ァミノカラム又はアミ ドカラムを用いる順 相クロマトグラフィーで処理する工程を備えた請求の範囲第 10項に記載の糖鎖 の構造解析方法。
12. (c) 工程の前に （d) 糠加水分解酵素で処理する工程を備えた請 求の範囲第 10項に記載の糖鎖の構造解析方法。
1 3. 質量分析法が、 MA LD I—TOF MSによる質量分析法であ る請求の範囲第 10項に記載の糖鎖の構造解析方法。
14. 式 （1) 〜 （6) で表される糖鎖誘導体 [式中 R1は 2—カル ボキシフエ二ノレ基、 3—カルボキシフエ二ノレ基、 4 _力ノレボキシフエ二ノレ基、 p 一エトキシカルボエルフヱニル基、 又は 2—ピリジル基を表す。 R2は水酸基、 基一 A s n又は基一 A s n_R3を表す。 ここで A s nはァスパラギン基を表し、 R 3はカーバメート系又はアミ ド系保護基を表す。 Acはァセチル基を表す。]
Figure imgf000041_0001
(1)
Figure imgf000042_0001
Figure imgf000042_0002
(3)
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000043_0002
(5)
Figure imgf000044_0001
(6) で表される糖鎖誘導体から誘導される癌マーカ
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