WO2006123789A1 - 酵素分析方法 - Google Patents

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WO2006123789A1
WO2006123789A1 PCT/JP2006/310055 JP2006310055W WO2006123789A1 WO 2006123789 A1 WO2006123789 A1 WO 2006123789A1 JP 2006310055 W JP2006310055 W JP 2006310055W WO 2006123789 A1 WO2006123789 A1 WO 2006123789A1
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enzyme
substrate
analyzed
labeled
insoluble carrier
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PCT/JP2006/310055
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Inventor
Tomoko Ono
Minoru Ogura
Original Assignee
Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc.
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing an enzyme contained in a sample. More specifically, for example, the amount of the substrate fragment cleaved by the enzyme by reacting the immobilized substrate obtained by binding the substrate of the enzyme to be measured to the insoluble carrier with the sample after the enzyme measuring method for measuring the enzyme activity.
  • the present invention relates to a method for analyzing an enzyme that detects odor.
  • Bio components that serve as indicators for diagnosing diseases are diverse, such as proteins, nucleic acids, enzymes, polysaccharides, lipids, and so on. Means capable of measuring a trace concentration of biological components are important.
  • the synthetic substrate method can detect and quantify active factors by detecting dyes and fluorescent substances released by the action of the target enzyme.
  • thrombin is a kind of endoprotease related to blood coagulation. It is an important enzyme that acts on fibrinogen to produce fibrin, and its synthetic substrate is Bz—Phe Val—Arg—pNA (Non-patent Document 1) ), Tos— Gly— Pro— Arg— pNA (Patent Document 1) H—D—Phe—Pip—Arg—pNA (Patent Document 2) and the like are known.
  • the enzyme reacts with the release of para-troa-rin (pNA) to produce a yellow color, which can be colorimetrically measured at 405 nm to measure thrombin factor activity. Can be expressed in terms of enzyme activity.
  • tissue factor tissue Factor: hereinafter referred to as TF
  • TF tissue factor
  • thrombin and TF In addition to thrombin and TF, plasmin, antithrombin III (A ⁇ ), von Willebrand factor cleaving enzyme (also known as ADAMTS13), factor X, factor XI, factor ⁇ , Active factors such as protein plasma kallikrein, tissue strength lyrein, tissue plasminogen activator, urokinase have been measured using synthetic substrates.
  • a ⁇ antithrombin III
  • ADAMTS13 von Willebrand factor cleaving enzyme
  • factor X factor XI
  • factor ⁇ Active factors such as protein plasma kallikrein, tissue strength lyrein, tissue plasminogen activator, urokinase have been measured using synthetic substrates.
  • an enzyme measurement method can be specifically selected from a mixture having a complicated composition by an enzyme substrate reaction. Pre-treatment to separate the sample force is unnecessary, and the force can be quantified with high sensitivity and high accuracy.
  • enzyme measurement methods characterized by fluorescence or enzyme labeling are cheaper and less dangerous than radioenzyme measurement methods using radioisotopes, and are sensitive and accurate. It's so versatile that it is widely used.
  • the sample liquid is affected by the turbidity or coloring of the sample liquid. If there is a miscellaneous substance, it will be affected and inaccurate.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 52-3492
  • Patent Document 2 JP-A-52-24590
  • Non-Patent Document 1 “Thrombosis Research” (Ireland), 197 2 years, 1 ⁇ , p. 267-278
  • Non-Patent Document 2 "Tali-Cal 'Chemistry” (USA), 1989, 35 ⁇ , P.1897
  • Non-Patent Document 3 “Clinical Pathology”, 1995, 43 ⁇ , p. 137
  • an object of the present invention is to provide an enzyme analysis method having excellent operability and sensitivity in an enzyme analysis method using a substrate.
  • test sample that may contain an enzyme to be analyzed, and an immobilized substrate in which an enzyme substrate that can be cleaved by the enzyme to be analyzed is bound to an insoluble carrier.
  • a step of contacting the liquid in a liquid hereinafter referred to as a contact step
  • the enzyme substrate that binds to the insoluble carrier is labeled with a labeling substance on the substrate fragment side that is released from the insoluble carrier by cleavage of the enzyme to be analyzed.
  • a labeled partner that specifically binds to a neoantigen produced by cleavage of the enzyme substrate with the enzyme to be analyzed and is labeled with a labeling substance.
  • the above step (3) is analyzed using
  • the labeled partner is a labeled antibody.
  • “neoantigen” means a substrate fragment bound to an insoluble carrier or an enzyme substrate cleavage site of a released substrate fragment, which is generated after the enzyme substrate is cleaved by the target enzyme.
  • Enzyme substrate cleavage sites include peptide sequences and fermentation that has been altered by cleavage. Includes the three-dimensional structure of the substrate.
  • the labeling substance is a fluorescent substance, a luminescent substance, a coloring substance, or an enzyme.
  • the insoluble carrier is a particle.
  • the particles are latex particles or magnetic particles.
  • the present invention is an immobilized substrate obtained by binding an enzyme substrate that can be cleaved by an enzyme to be analyzed to an insoluble carrier, and the enzyme substrate is insoluble by being cleaved by the enzyme to be analyzed.
  • Physical strength Labeled immobilized substrate labeled with a labeling substance on the side of the released substrate fragment
  • the present invention provides an immobilized substrate in which an enzyme substrate that can be cleaved by an enzyme to be analyzed is bound to an insoluble carrier,
  • analysis in the present specification includes “detection” for determining the presence or absence of an analyte, and “quantitative or semi-quantitative determination of the amount or activity of the analyte. Measurement ”.
  • Fig. 1 is a graph showing the results of measurement of plasma thrombin activity by the enzyme analysis method of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of measuring ADAMTS13 activity in plasma by the enzyme analysis method of the present invention.
  • the enzyme analysis method of the present invention uses at least a fixed substrate in which an enzyme substrate that can be cleaved by an enzyme to be analyzed is bound to an insoluble carrier.
  • an enzyme substrate that can be cleaved by an enzyme to be analyzed is bound to an insoluble carrier.
  • the enzyme analysis method of the present invention based on the labeling mode of the labeling substance to be used, for example,
  • the enzyme substrate specifically binds to neoantigen produced by cleavage with the target enzyme.
  • immunoassay an embodiment using a labeling partner labeled with a labeling substance (hereinafter sometimes referred to as immunoassay)
  • the enzyme to be analyzed that can be analyzed by the enzyme analysis method of the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme capable of cleaving a substrate at a specific site.
  • enzymes that increase or decrease in various diseases for humans, enzymes that are not related to human diseases, or enzymes of various animals other than humans can be mentioned.
  • test sample is not particularly limited as long as it is a sample that may contain an enzyme to be analyzed.
  • a biological fluid sample particularly blood, serum, plasma, urine, or spinal fluid And so on.
  • the enzyme substrate used in the present invention can be appropriately selected according to the enzyme to be analyzed as long as it is a substance that can be specifically cleaved by the enzyme to be analyzed, and is not particularly limited.
  • the enzyme substrate can be prepared by a well-known method, for example, a method for collecting a crude parasite extract or purified product from human body fluids, artificially cultivating a biologically derived crude product or a purified product. And the like, a method for obtaining a biological force, a method for producing a nucleic acid or a protein by a gene recombination technique or a cell culture technique, or a method for synthesizing a polypeptide hapten by a chemical synthesis technique.
  • a peptide containing, for example, Gly-Pro-Arg can be used for thrombin.
  • factor XII for example, Gin-Gly-Arg
  • plasmin for example, Glu-Lys-Lys
  • factor X for example, , Ile-Glu-Gly-Arg
  • mitochondrial plasminogen activator inhibitors for example, peptides containing Pyr-Gly-Arg, for ADAMTS13, for example, von Willebrand factor (von
  • any form of insoluble carrier can be used as long as it can fix the enzyme substrate.
  • adsorbable material for example, polystyrene
  • a magnetic carrier for example, a magnetic carrier
  • a latex particle or a membrane.
  • a membrane a membrane.
  • the use of particles is preferred because the operation for separating the immobilized substrate from the reaction system is simple. The above separation operation can be performed using a machine, and therefore insoluble magnetic particles are preferably used. ,.
  • the particle size of the insoluble magnetic particles is usually 0.05 ⁇ m to 5 ⁇ m, and insoluble magnetic particles having a particle size in the range of 0.3 m to 3 m are preferable.
  • Examples of the physical adsorption method include a method of directly immobilizing a substrate on insoluble magnetic particles.
  • a method of chemically supporting for example, an amino group, a carboxyl group, a mercapto group, a hydroxyl group, an aldehyde group, an epoxy group, etc. existing on the surface of the magnetic particle are chemically modified to bind to the substrate.
  • Examples include a method of directly immobilizing on a particle using a functional group that can be formed, and a method of immobilizing by introducing a spacer molecule between the particle and a substrate molecule by a chemical bond.
  • an immobilized substrate by chemically immobilizing avidin or streptavidin on the insoluble magnetic particles as a spacer molecule and binding a pyotin substrate to this.
  • the antibody or antigen is chemically bound to other proteins such as albumin
  • the protein is chemically bound to the particles.
  • the amount of substrate supported depends on the surface area, functional Force that can be appropriately determined depending on the amount of base etc.
  • 1 mg to 500 mg per lg of carrier particles preferably 10 mg to LOO mg.
  • the partner substance used in the immunoassay in the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that can specifically bind to neoantigen produced by cleavage of the enzyme substrate with the enzyme to be analyzed.
  • Examples include antibodies, or concananoline A or lectin that recognizes a specific sugar chain when a sugar chain is added to the substrate.
  • the neoantigen may be neoantigen generated on the free substrate fragment side or neoantigen generated on the substrate fragment side remaining on the insoluble carrier, but neoantigen generated on the substrate fragment side remaining on the insoluble carrier is preferable. .
  • the antibody When an antibody is used as a partner substance, the antibody can be appropriately selected depending on the enzyme to be analyzed, and is obtained by immunizing a substrate or a fragment thereof in advance in humans, mice, rabbits, rats, goats, and hidges.
  • the antiserum obtained, a purified polyclonal antibody, or a monoclonal antibody can be used. It is preferable to use a monoclonal antibody to avoid non-specific binding.
  • the labeling substance used in the present invention various known labeling substances can be used.
  • a fluorescent substance for example, europium
  • a luminescent substance for example, luciferin
  • a coloring substance for example, nora- Troia-phosphorus (pNA)
  • an enzyme for example, peroxidase
  • the enzyme is preferable in terms of the stability and sensitivity of the reagent.
  • the enzyme include peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, 13 galactosidase, urease, or luciferase.
  • the activity measurement method using alkaline phosphatase using 1,2-dioxetane as a substrate is very strong and shows a signal, so that high detection sensitivity can be obtained, and therefore it is suitable for the measurement of trace components.
  • an enzyme substrate (immobilized substrate) immobilized on an insoluble carrier is labeled with a labeling substance
  • a partner substance particularly an antibody
  • Label with substance In the case of labeling on the immobilized substrate, it is at a site different from the site cleaved by the enzyme and released from the insoluble carrier by being cleaved by the enzyme to be analyzed (for example, the end opposite to the immobilized end). Bind the labeling substance.
  • Labeling substrate (preferably enzyme labeling substrate) or labeling partner (preferably enzyme labeling partner substance, especially The preparation method of the enzyme-labeled antibody) is well known, and any method can be selected.
  • enzyme labeling can be performed by introducing a maleimide group into an enzyme, introducing a thiol group into a substrate or antibody, and reacting both.
  • the maleimide group introduction reagent N-hydroxysulfosuccinimide ester or the like is preferably used.
  • a reagent for introducing a thiol group for example, S-acetylmethyl-ptosuccinic anhydride is preferably used.
  • an enzyme-labeled substrate or enzyme-labeled antibody can be prepared by reacting the introduced maleimide group and thiol group overnight at 4 ° C at a pH of 7 or less.
  • the means for detecting the change in signal intensity derived from the labeling substance is appropriately selected depending on the type of the labeling substance and the characteristics of the measuring instrument, and is a well-known method such as a colorimetric method, a fluorescence method, or a luminescence method. Can be used.
  • peroxidase when used as a labeling substance, it can also be detected by chemiluminescence using luminol as a substrate, and is particularly suitable for microscopic measurement (for example, Koichiro Tanaka, Junji Ishikawa: Western Sabi Peroxidase) Comparison of fluorescence and luminescence methods in enzyme-linked immunosorbent assay using ribonucleic acid labeling, clinical laboratory equipment 'reagents, 11: 567-569, 1988).
  • a known substrate such as [1,2-dioxetane (CDP-Star; Tropics)] because it can be detected with higher sensitivity.
  • the non-immunoassay method which is one embodiment of the enzyme analysis method of the present invention is not limited to the following steps. For example, one end of a specific substrate for the target enzyme is labeled and the other end is labeled with another end. After the insoluble carrier (for example, insoluble magnetic particles) is immobilized on a solid substrate and the sample containing the enzyme is allowed to react for a certain period of time, the immobilized substrate is washed to cleave the immobilized substrate. The labeled substrate fragment and specimen are separated from the immobilized substrate. Next, the enzyme activity contained in the specimen can be analyzed by measuring the amount of the labeling substance of the substrate that has not been cleaved and remains on the insoluble magnetic particles.
  • the insoluble carrier for example, insoluble magnetic particles
  • (Al) (a) a test sample that may contain the enzyme to be analyzed; (b) An immobilized substrate in which an enzyme substrate that can be cleaved by the enzyme to be analyzed is bound to an insoluble carrier, and the enzyme substrate is released from the insoluble carrier force by cleavage of the enzyme to be analyzed. And a labeling substance that is labeled with a labeling substance
  • (A3) A step of analyzing the substrate remaining on the insoluble carrier without being cleaved and the substrate fragment in the solution released from Z or the insoluble carrier.
  • the label-immobilized substrate used in the step (A1) is an enzyme substrate bound to an insoluble carrier and further labeled with a labeling substance.
  • the enzyme substrate portion of the labeled immobilization substrate has a specific cleavage site for the enzyme to be analyzed, is a site different from the cleavage site, and is insoluble by being cleaved by the enzyme to be analyzed.
  • the site released from the carrier (for example, the end opposite to the fixed end) is labeled with a labeling substance.
  • the enzyme to be assayed removes the substrate at the specific cleavage site of the labeled enzyme.
  • the labeled substrate fragment is released from the insoluble carrier to cleave, while the immobilized substrate that has not been cleaved by the enzyme to be analyzed remains in the insoluble carrier.
  • the contact time in this step is not particularly limited as long as the reaction between the enzyme to be analyzed that may be contained in the test sample and the immobilized substrate can be performed.
  • the amount of reagent and sample used, temperature, pH, etc. can be determined as appropriate, but it is usually 3 minutes to 24 hours, preferably 15 minutes to 1 hour.
  • the insoluble carrier after the step (A1) is separated from other fractions (that is, a liquid fraction containing a free substrate fragment and a test sample).
  • the separation operation can be performed by a conventional method.
  • the separation can be performed by using, for example, a magnet or by a centrifugal operation.
  • latex particles When latex particles are used as the carrier, they can be separated by, for example, centrifugation or filtration.
  • Labeled substance contained in insoluble carrier in the next step (A3) When analyzing the quality, it is preferable to sufficiently remove free substrate fragments by washing the insoluble carrier after the separation.
  • either the substrate fragment remaining on the insoluble carrier or the substrate fragment in the solution released from the insoluble carrier, or both can be analyzed.
  • the amount of free substrate fragments can be determined by measuring the amount of labeling substance contained in the free substrate fragments. Furthermore, for example, a calibration curve is prepared. Thus, the amount or activity of the enzyme to be analyzed contained in the test sample can be determined. When the analyte is contained in the test sample, the amount of free substrate fragments increases depending on the amount or activity of the enzyme.
  • the amount of the remaining labeled substrate (that is, the immobilized labeled substrate) can be determined by measuring the amount of the remaining labeled substance. Furthermore, for example, by creating a calibration curve, the amount or activity of the enzyme to be analyzed contained in the test sample can be determined. When the target enzyme is contained in the test sample, the amount of the immobilized labeled substrate decreases according to the amount or activity of the enzyme.
  • the immunoassay method which is another embodiment of the enzyme analysis method of the present invention is not limited to the following steps. For example, the immobilized substrate and the sample are reacted for a certain time, and then cleaved. A labeled antibody that specifically binds to the generated fragment is added, allowed to react for a certain period of time, and after washing, the amount of labeled antibody that binds to the immobilized substrate is measured. Elementary activity can be analyzed.
  • the immunoassay method of the present invention an analysis is performed using a labeling partner that specifically binds to neoantigen generated by cleavage of the enzyme substrate with the enzyme to be analyzed and is labeled with a labeling substance. Perform the process.
  • the immunoassay method of the present invention will be described mainly in the case where neoantigen is neoantigen generated on the substrate fragment side remaining in the insoluble carrier. In this case, it can be implemented as appropriate.
  • the labeling partner is added to the reaction system, for example, in the contact process, separation process, or analysis process. It can be a gap.
  • a labeling partner is added in the contact step, before the contact between the test sample and the fixed substrate (that is, either the test sample or the fixed substrate) and the target. After contacting the sensing partner, the remaining one of the test sample or the immobilized substrate is further contacted), simultaneously with the contact (ie, the test sample, the immobilized substrate, and the labeling partner are simultaneously contacted) Or after contact (ie, contacting the test sample and the immobilized substrate and then further contacting the labeled partner).
  • the labeling partner specifically binds to neoantigen that is generated when the enzyme substrate is cleaved by the enzyme to be analyzed, so it does not bind to the immobilized substrate before the enzyme cleavage, and the enzyme reaction in the contacting step is performed by the labeling partner. It progresses regardless of the presence or absence.
  • a labeling partner is added in the contact step, a substrate fragment (an immobilized substrate fragment or a free substrate) is not included until the analyte to be analyzed is contained in the test sample and the immobilized substrate is cleaved by the enzyme. Fragment) and a labeled partner (preferably labeled antibody) to form a complex (preferably an immune complex).
  • the labeling partner when added in the separation step, it can be added before the separation operation or after the separation operation.
  • the labeling partner when a labeled partner is added after the separation operation, and the labeling partner is a partner that recognizes neoantigen generated on the side of the substrate fragment remaining on the insoluble carrier, it can be obtained by the separation operation. After adding to the obtained insoluble carrier, the unreacted labeled partner can be removed by washing the insoluble carrier.
  • a labeling partner is added in the analysis step, for example, after adding the labeling partner to the insoluble carrier obtained in the separation step, the insoluble carrier is washed to remove unreacted labeling partner. And the analysis of the labeling substance can be performed.
  • the labeling partner is added in the contact step or before the separation operation in the separation step in that the separation operation of the reacted labeling partner and the unreacted labeling partner can be omitted. It is preferable.
  • the labeling partner is a partner that recognizes neoantigen generated on the substrate fragment side remaining on the insoluble carrier, it is not used.
  • the amount or activity of the analyte enzyme contained in the test sample can be determined. That is, by measuring the amount of the labeling substance of the labeled partner that specifically binds to the substrate fragment remaining on the insoluble carrier, the amount of the immobilized substrate fragment can be determined.
  • the amount or activity of the analyte enzyme contained in the test sample can be determined.
  • the target enzyme is contained in the test sample, the amount of the immobilized substrate fragment increases depending on the amount or activity of the enzyme. Therefore, the amount of the labeled partner that specifically binds to the substrate fragment is also increased. To increase.
  • the enzyme analysis kit of the present invention includes at least an immobilized substrate in which an enzyme substrate that can be cleaved by an enzyme to be analyzed is bound to an insoluble carrier.
  • the enzyme analysis kit of the present invention includes a kit that can be used in the non-immunoassay method of the present invention (hereinafter referred to as a non-immunoassay kit) and a kit that can be used in the immunoassay method of the present invention ( Hereinafter referred to as an immunoassay kit).
  • the kit for non-immunoanalysis in the present invention is an immobilized substrate obtained by binding at least an enzyme substrate that can be cleaved by an enzyme to be analyzed to an insoluble carrier, and has the enzyme substrate power.
  • the insoluble carrier force is included on the side of the substrate fragment to be released and labeled with a labeling substance.
  • the immunoassay kit according to the present invention includes at least an immobilized substrate obtained by binding an enzyme substrate that can be cleaved by an enzyme to be analyzed to an insoluble carrier, and a neoantigen that is produced by cleaving the enzyme substrate by the enzyme to be analyzed. And a labeling partner that specifically binds and is labeled with a labeling substance.
  • the enzyme analysis kit of the present invention can further contain, for example, an enzyme substrate, a washing solution, a sample diluent, and Z or a reaction amplification agent, depending on the labeling substance and the detection system.
  • the first reagent can contain an immobilized substrate
  • the second reagent can contain a substance that expresses the signal of the substance labeled on the substrate.
  • the first reagent a fixed substrate substrate solution (labeled with alkaline phosphatase)
  • Second reagent chemiluminescent substrate (eg AMPPD)
  • First reagent Immobilized substrate solution
  • Second reagent Labeled antibody that specifically recognizes the cleaved fragment (labeled alkaline phosphatase)
  • chemiluminescent substrate eg AMPPD
  • composition of the reagent can also be exemplified, and the composition can be changed as appropriate depending on the labeling substance and the detection system, and various configurations can be obtained.
  • a sample solution that is considered to contain the enzyme to be measured together with a first reagent, such as an insoluble magnetic particle carrier containing a site that is cleaved by the enzyme and carrying an enzyme-labeled substrate. And reacting in the liquid medium of the reaction vessel.
  • a sample solution that is considered to contain the enzyme to be measured, the first reagent, and a second reagent comprising an enzyme-labeled antibody against the cleavage site of the substrate on the insoluble magnetic particle to be measured are liquids in the reaction vessel. React in medium.
  • the first reagent and the second reagent are added to the liquid medium in the reaction vessel, they may be added simultaneously or separately. The order of addition may be determined from any reagent.
  • the reaction is usually performed at a pH of 5 to 10, preferably at a pH of 6 to 7, as in a general immunochemical reaction.
  • the reaction can usually be carried out in the range of 2 to 50 ° C, but the reaction is preferably carried out at room temperature or 37 to 45 ° C.
  • the reaction time is arbitrary from immediately after the reaction to 1 day and night, but is usually set in the range of 3 to 60 minutes in consideration of sensitivity and operability.
  • a buffer solution is usually used.
  • the buffer for example, MES (2-Morpholinoethansulphonic Acid), phosphoric acid and the like are used, but most buffers which are commonly used from weakly acidic to neutral can be used.
  • salts such as sodium chloride and proteins such as bovine serum albumin are added to avoid non-specific reactions.
  • the insoluble magnetic particles are usually 0.0001 to 1% by weight, preferably 0.001 to 0.1% by weight, and the enzyme-labeled antibody is usually 0.0001 to 0. lmAbs, preferred Or it is used so that it may become 0.0001-0. OlmAbs.
  • N-Gly Pro-Arg biotin is composed of 1,2-diaminoethanetrityl resin and N-a-tert-butoxycarbo as the N-terminal amino acid residue of the peptide.
  • -Synthesis was performed using an automatic peptide synthesizer according to Fmoc chemistry using luglycine. After removing the C-terminal amino acid of the peptide from the resin, it was labeled with piotin via 1,2-diaminoethane using 5- (N-succinimidyloxycarbol) pentyl D-piotinamide.
  • a 1% suspension of streptavidin-labeled magnetic particles (Dynal Biotech, particle size 2.8 ⁇ m) and the labeled substrate (0.5 mgZmL) prepared in the previous section (1) are mixed with 50 mmol ZL MES buffer (pH 6). ), And after washing with the buffer, blocking with 0.3% bovine albumin Z0.lmolZL Tris buffer (pH 8) was performed to prepare labeled substrate-bound magnetic particles.
  • the measurement was performed using a small automatic immunoassay device (PATHFAST; manufactured by Mitsubishi Chemical Co., Ltd.). Specifically, 60 L of a dilution series of plasma with a known thrombin content (0. llUZmL) and 100 L of a suspension of labeled substrate-bound magnetic particles were reacted at 37 ° C for 5 minutes, and 0. ImolZL Tris buffer Solution (pH8) /0.15 mol / L NaCL / 0.1% Triton X—100 After washing magnetic particles with CDP—Star (Tropics) solution 100 / z L as chemiluminescence substrate solution Were mixed, reacted at 37 ° C for 4 minutes, and the amount of luminescence was counted. As blank The same operation was performed using physiological saline instead of plasma. The results are shown in Figure 1.
  • thrombin concentration in a sample can be quantified by preparing a calibration curve using plasma or standard reagent of thrombin known concentration (or activity).
  • ADAMTS 13 also known as von Willebrand Factor cleaving protease
  • vWF73 a partial fragment of vWF (fragment consisting of amino acids 1596 to 1668; hereinafter referred to as vWF73)
  • the monoclonal antibody that specifically recognizes the cleavage site of vWF73 by ADAMTS 13 is Cruz
  • the measurement was performed using a small automatic immunoassay device (PATHFAST; manufactured by Mitsubishi Igakuyatron). Specifically, 60 L of a dilution series of healthy human plasma was reacted with 100 L of the substrate-bound magnetic particle suspension prepared in (2) at 37 ° C for 5 minutes, and the alkaline phosphata prepared in (3) was further reacted. ImAbs. was added to the casease-labeled anti-vWF monoclonal antibody and reacted at 37 ° C for 4 minutes. After washing magnetic particles with 0.
  • PATHFAST small automatic immunoassay device
  • the enzyme analysis method of the present invention can be applied to, for example, clinical diagnostic tests.
  • the present invention has been described according to specific embodiments. However, modifications and improvements obvious to those skilled in the art are possible. Included in the range. ⁇ self ⁇ ij table free text
  • the numerical heading ⁇ 223> in the sequence listing below describes the “Artificial Sequence”.
  • the amino acid sequence represented by the sequence of SEQ ID NO: 1 is a synthetic substrate.

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Abstract

　（１）分析対象酵素を含有する可能性のある被検試料と、前記分析対象酵素により切断可能な酵素基質を不溶性担体に結合させた固定化基質とを液中で接触させる工程、（２）前記液と不溶性担体とを分離する工程、並びに（３）不溶性担体に残存する基質又基質断片、及び／又は、不溶性担体から遊離した液中の基質断片を分析する工程を含む、酵素分析方法、並びに、分析対象酵素により切断可能な酵素基質を不溶性担体に結合させた固定化基質を少なくとも含む、酵素分析用キットを開示する。

Description

明 細 書
酵素分析方法
技術分野
[0001] 本発明は、試料中に含まれる酵素の分析方法に関する。更に詳しくは、例えば、酵 素活性を測定する酵素測定法にぉ 、て、不溶性担体に測定対象酵素の基質を結合 した固相化基質を試料と反応させ、酵素によって切断された基質断片の量を検出す る酵素の分析方法に関する。
背景技術
[0002] 現在、臨床診断検査の現場では、多数の検体について疾病診断の指標となる生体 成分を短時間且つ高精度に測定し、その結果を迅速，正確に治療現場にフィードバ ックすることが求められており、それにより適切な薬剤'治療法の選択、治療経過の観 察、再発症の予見等が効果的に行なうことができる。
[0003] 疾病を診断するための指標となる生体成分 (いわゆる診断マーカー）はタンパク質、 核酸、酵素、多糖類、脂質等と多岐に渡っており、また、疾病を早期に把握するため に、極めて微量濃度の生体成分を測定可能な手段が重要になっている。
[0004] 生体成分の大部分は化学反応における触媒とその阻害活性であり、その代表が酵 素とその阻害剤である。生体内における酵素反応は、その活性化物質やその反応を 阻害する阻害物質により制御'調整され、機能の調節が図られている。例えば、生体 内における血液の凝固、線溶系には数多くの酵素とその阻害剤が関係しており、こ れらの因子を測定することは臨床上重要になってきている。
[0005] 特に酵素については、目的の酵素によって合成基質を用いる測定法や免疫測定 法が行われている。このうち合成基質法では、目的の酵素が作用することによって遊 離してくる色素や蛍光物質を検出することで、活性型因子を検出、定量することがで きる。
[0006] 例えば、トロンビンは血液凝固に関係するエンドプロテアーゼの一種で、フイブリノ 一ゲンに働いてフイブリンを生成する重要な酵素で、その合成基質として Bz— Phe Val— Arg— pNA (非特許文献 1)、 Tos— Gly— Pro— Arg— pNA (特許文献 1) 、 H— D— Phe— Pip— Arg— pNA (特許文献 2)等が知られている。酵素反応を受 けてパラ-トロア-リン (pNA)を遊離して黄色の発色が得られるので、これを 405nm で比色することによりトロンビンの因子活性を測定することができ、凝固線溶能力を酵 素活性で表すことができる。
[0007] また、組織因子 (Tissue Factor:以下、 TFと称する)も発色性合成基質 [非特許 文献 2及び非特許文献 3]で活性測定することができる。
[0008] トロンビンや TF以外にも、凝固線溶系においてはプラスミン、アンチトロンビン III (A ΤΠΙ)、フォン'ヴィルブラント因子切断酵素（別称: ADAMTS13)、第 X因子、第 XI 因子、第 ΧΠ因子、プロテインお血漿カリクレイン、組織力リクレイン、組織プラスミノゲ ンァクチベータ、ゥロキナーゼ等の活性因子が合成基質を用いて活性測定されてい る。
[0009] このように、生体成分の微量測定法として、酵素測定法は複雑な組成の混合物の 中から酵素基質反応で特異的に選別することができることから、通常の定量法に必 要な対象物を試料力 分離する前処理が不要であり、し力も高感度 ·高精度に定量 することができる特徴を持つ。また、酵素測定法のうち、蛍光又は酵素標識を特徴と する酵素測定法は、放射性同位元素を用いる放射酵素測定法に比べて廉価で危険 な廃棄物を伴わず、測定の感度と精度の面で遜色な 、ことから汎用されて 、る。
[0010] このようにして、多くの活性因子 (酵素）は、その基質特異性を利用して種々の分析 系が開発されてきた。一方では、より特異性の高い基質物質を得るための検討も行 われており、中でも合成基質の開発によって、より正確な (基質特異性の向上)測定 が可能となってきた。しかし、これらの合成基質は、そこに結合された色素や蛍光色 素が遊離して初めて発色したり蛍光を生じることを基本として 、るが、どのような条件 下でもシグナルを発現するものではなぐ特定の物質を色素や蛍光色素の特定部位 に結合することが必要であり、新規な合成基質の開発はけつして容易ではない。
[0011] また液相中で酵素反応を行い、そのまま発色を検出する場合には、試料液の濁り や着色の影響を受けやすぐまた、蛍光を検出する場合も、試料液に蛍光を発する 共雑物質があるとその影響を受け不正確になる。
[0012] 特許文献 1 :特開昭 52— 3492号公報 特許文献 2：特開昭 52— 24590号公報
非特許文献 1 :「トロンボーシス'リサーチ（Thrombosis Research)」（アイルランド）， 197 2年, 1卷, p. 267-278
非特許文献 2 :「タリ-カル 'ケミストリー（Clinical Chemistry)」（米国）， 1989年， 35卷， P.1897
非特許文献 3 :「臨床病理」， 1995年， 43卷， p. 137
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0013] 従って、本発明の課題は、基質を用いる酵素分析法において、操作性及び感度に 優れた酵素分析法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0014] 前記課題は、本発明による、（1)分析対象酵素を含有する可能性のある被検試料 と、前記分析対象酵素により切断可能な酵素基質を不溶性担体に結合させた固定 化基質とを液中で接触させる工程 (以下、接触工程と称する）、
(2)前記液と不溶性担体とを分離する工程 (以下、分離工程と称する）、並びに
(3)不溶性担体に残存する基質又は基質断片、及び Z又は、不溶性担体から遊離 した液中の基質断片を分析する工程 (以下、分析工程と称する）
を含むことを特徴とする、酵素の分析方法により解決することができる。
[0015] 本発明の分析方法の好ましい態様によれば、不溶性担体に結合する前記酵素基 質が、分析対象酵素の切断により不溶性担体から遊離する基質断片側において、標 識物質で標識されている。
また、本発明の分析方法の別の好ましい態様によれば、前記酵素基質が前記分析 対象酵素で切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に結合し、且つ、標識物質で 標識されている標識ィ匕パートナーを用いて、前記工程 (3)の分析を実施する。本発 明の分析方法の更に好ましい態様によれば、標識ィ匕パートナーが標識ィ匕抗体である 。ここで「ネオアンチゲン」とは、酵素基質が対象酵素で切断された後に生じる、不溶 性担体に結合した基質断片、あるいは、遊離した基質断片の酵素基質切断部位を 意味する。酵素基質切断部位としては、ペプチド配列や切断されることで変化した酵 素基質の立体構造が含まれる。
[0016] 本発明の分析方法の更に別の好ましい態様によれば、標識物質が、蛍光物質、発 光物質、発色物質、又は酵素である。
本発明の分析方法の更に別の好ま 、態様によれば、不溶性担体が粒子である。 本発明の分析方法の更に好まし 、態様によれば、粒子がラテックス粒子又は磁性粒 子である。
[0017] また、本発明は、分析対象酵素により切断可能な酵素基質を不溶性担体に結合さ せた固定化基質であって、且つ、前記酵素基質が、前記分析対象酵素の切断により 前記不溶性担体力 遊離する基質断片側において、標識物質で標識されている標 識化固定化基質
を含むことを特徴とする、酵素分析用キットに関する。
更に、本発明は、分析対象酵素により切断可能な酵素基質を不溶性担体に結合さ せた固定化基質と、
前記酵素基質が前記分析対象酵素で切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に 結合し、且つ、標識物質で標識されている標識化パートナーと
を含むことを特徴とする、酵素分析用キットに関する。
[0018] なお、本明細書における用語「分析」には、分析対象物質の存在の有無を判定す る「検出」と、分析対象物質の量又は活性を定量的又は半定量的に決定する「測定」 とが含まれる。
発明の効果
[0019] 本発明によれば、酵素量を測定する酵素測定法にお!、て、簡便で迅速に高感度 に、測定対象酵素を検出する方法を提供することができる。
図面の簡単な説明
[0020] [図 1]本発明の酵素分析方法による血漿中トロンビン活性の測定結果を示すグラフで ある。横軸は、血漿希釈列の希釈率であり、縦軸は発光量 (単位 =カウント)である。
[図 2]本発明の酵素分析方法による血漿中 ADAMTS13活性の測定結果を示すグ ラフである。横軸は、血漿希釈列の希釈率であり、縦軸は発光量 (単位 =カウント)で ある。 発明を実施するための最良の形態
[0021] 本発明の酵素分析方法は、分析対象酵素により切断可能な酵素基質を不溶性担 体に結合させた固定ィ匕基質を少なくとも用いる。本発明の酵素分析方法には、用い る標識物質の標識ィ匕の態様に基づいて、例えば、
(1)不溶性担体に結合させた酵素基質が、標識物質で標識化されて!、る態様 (以下
、非免疫分析法と称することがある）、あるいは、
(2)酵素基質が分析対象酵素で切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に結合し
、且つ、標識物質で標識されている標識化パートナーを用いる態様 (以下、免疫分析 法と称することがある）
が含まれる。
[0022] 本発明の酵素分析方法によって分析可能な分析対象酵素は、基質を特異的部位 で切断可能な酵素である限り、特に限定されるものではなぐ例えば、臨床診断にお いて酵素検査の対象となる各種酵素、すなわち、ヒトに対する各種の疾患において 上昇又は減少する酵素、あるいは、ヒトにおける疾病に関連しない各種酵素、又はヒ ト以外の各種動物の酵素を挙げることができる。
[0023] 被検試料としては、分析対象酵素を含む可能性のある試料であれば特に限定され ないが、例えば、生物学的液体試料、特には、血液、血清、血漿、尿、又は髄液等を 挙げることができる。
[0024] 本発明で用いる酵素基質は、分析対象酵素で特異的に切断可能な物質である限 り、特に限定されるものではなぐ分析対象酵素に応じて適宜選択することができる。 前記酵素基質は、周知方法により調製することができ、例えば、寄生生物の粗抽出 品又は精製品をヒトゃ動物の体液より採集する方法、生物由来の粗抽出品又は精製 品を人工的に養殖した生物力 取得する方法、核酸又はタンパク質を遺伝子組換え 技術や細胞培養技術により生産する方法、あるいは、ポリペプチドゃハプテンをィ匕学 合成技術で合成する方法などが挙げられる。
[0025] 例えば、合成基質を用いる場合、トロンビン用として、例えば、 Gly— Pro— Argを 含むペプチドを用いることができる。第 XII因子用としては、例えば、 Gin- Gly- Arg を、プラスミン用としては、例えば、 Glu— Lys— Lysを、第 X因子用としては、例えば 、 Ile— Glu—Gly—Argを、糸且織プラスミノゲンァクチべ一タインヒビター用としては、 例えば、 Pyr— Gly— Argを含むペプチドを、 ADAMTS13としては、例えば、フォン •ヴィルブラント因子（von
Willebrand Factor ;vWF)の第 1596番〜第 1668番のアミノ酸力らなる断片 (Koichi Kokame, Masanon
Matsumoto, Yoshihiro Fujimura, and Toshiyuki Miyata, VWF73, a region from D159 6
to R1668 of von Willebrand factor, provides a minimal substrate for ADAMTS— 13. Blood, Jan 2004; 103: 607 - 612)を用いることができる。
[0026] 本発明にお 、て使用する固定ィ匕担体としては、酵素基質を固定ィ匕することができる ものであればいかなる形態の不溶性担体でも利用可能であり、例えば、基質を物理 的に吸着可能な材質 (例えば、ポリスチレン製)からなるプレート、チューブ、ビーズ、 チップ、あるいは、基質固定ィ匕用の適当な官能基を有するガラス、磁性担体、ラテツ タス粒子、又は膜などを利用することができる。固定化基質を反応系から分離する際 の操作が簡便な点で、粒子を用いることが好ましぐ前記分離操作を機械を用いて行 なうことができるため、不溶性磁性粒子を用いることが好ま 、。
[0027] 不溶性磁性粒子の粒径は、通常 0. 05 μ m〜5 μ mのものが用いられ、 0. 3 m〜 3 mの範囲の粒径を有する不溶性磁性粒子が好ましい。物理的に吸着させる方法 としては、不溶性磁性粒子に、基質を直接固定ィ匕する方法が挙げられる。化学的に 担持させる方法としては、例えば、磁性粒子の表面に存在するァミノ基、カルボキシ ル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、エポキシ基などをィ匕学的に修飾 することにより基質と結合させることができる官能基を利用して、直接粒子上に固定化 する方法や粒子と基質分子の間にスぺーサ一分子を化学結合で導入して固定化す る方法が挙げられる。ここでスぺーサ一分子として、アビジン又はストレプトアビジンを 不溶性磁性粒子上に化学的に固定ィ匕し、これにピオチンィ匕基質を結合させて固定 化基質を調製することが可能である。更には、アルブミンなどの他のタンパク質に抗 体又は抗原を化学結合させた後、そのタンパク質を粒子に化学結合させる方法が挙 げられる。一般的に担持される基質の量は、用いる不溶性担体粒子の表面積、官能 基量等により適宜決定することができる力 通常担体粒子 lg当たり lmg〜500mg、 好ましくは lOmg〜： LOOmgである。
[0028] 本発明方法における免疫分析法で使用するパートナー物質は、酵素基質が分析 対象酵素で切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に結合可能な物質である限り 、特に限定されるものではなぐ例えば、抗体や、あるいは、基質に糖鎖が付加され ている場合には特定の糖鎖を認識するコンカナノリン A又はレクチンを挙げることが できる。前記ネオアンチゲンは、遊離した基質断片側に生じるネオアンチゲンであつ ても、不溶性担体に残存する基質断片側に生じるネオアンチゲンであっても構わな いが、不溶性担体に残存する基質断片側に生じるネオアンチゲンが好ましい。パート ナー物質として抗体を使用する場合、前記抗体は、分析対象酵素により適宜選択す ることができ、予めヒト、マウス、ゥサギ、ラット、ャギ、ヒッジなどに基質又はその断片 を免疫して得られた抗血清、ァフィユティー精製されたポリクローナル抗体、又はモノ クローナル抗体などを利用することができる。非特異的結合を避けるため、モノクロ一 ナル抗体を用いることが好まし 、。
[0029] 本発明で用いる標識物質としては、公知の各種標識物質を用いることができ、例え ば、蛍光物質 (例えば、ユーロピウム）、発光物質 (例えば、ルシフ リン）、発色物質 [ 例えば、ノラ-トロア-リン (pNA) ]、又は酵素（例えば、ペルォキシダーゼ）を挙げ ることができ、試薬の安定性、感度の点で酵素が好ましい。酵素としては、例えば、ぺ ルォキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースォキシダーゼ、 13 ガラクトシダ ーゼ、ゥレアーゼ、又はルシフェラーゼ等が挙げられる。特に、 1, 2—ジォキセタンを 基質とするアルカリホスファターゼによる活性測定法は、非常に強 、シグナルを示す ことから、高い検出感度が得られるため、微量成分の測定には好適である。
[0030] 本発明においては、非免疫分析法では、不溶性担体に固定ィ匕した酵素基質（固定 化基質)を標識物質で標識し、免疫分析法では、パートナー物質 (特には抗体)を標 識物質で標識する。固定化基質への標識の場合、酵素による切断部位とは異なる部 位で、且つ、分析対象酵素により切断されることで不溶性担体から遊離する部位 (例 えば、固定化末端と逆の末端）に、標識物質を結合させる。標識化基質 (好ましくは 酵素標識基質)又は標識化パートナー (好ましくは酵素標識パートナー物質、特には 酵素標識抗体)の調製方法は周知であり、任意の方法を選択することができる。例え ば、酵素にマレイミド基を導入して、基質又は抗体にチオール基を導入して、両者を 反応させれば酵素標識を行うことができる。マレイミド基導入用試薬としては、 N—ヒド ロキシスルフォスクシ-ミドエステル等が好適に用いられる。またチオール基の導入 用試薬としては、例えば、 S—ァセチルメル力プトコハク酸無水物等が好適に用いら れる。次に、導入したマレイミド基とチオール基とを pH7以下で 4°Cにて一夜反応させ ることにより、酵素標識基質又は酵素標識抗体を作成することができる。
[0031] 標識物質由来のシグナル強度の変化を検出する手段としては、標識物質の種類及 び測定機器の特性によって適宜選択され、周知の方法、例えば、比色法、蛍光法、 又は発光法などを利用することができる。例えば、標識物質としてペルォキシダーゼ を用いた場合、ルミノールを基質として化学発光法で検出することも可能で、特に微 量測定に好適である（例えば、田中弘一郎、石川榮治：西洋ヮサビペルォキシダー ゼを標識とする酵素免疫測定法における蛍光法と発光法の比較、臨床検査機器 '試 薬、 11 : 567— 569, 1988)。また、標識物質としてァノレカジホスファタ一ゼを用 ヽた 場合、 AMPPD LJ- (2 - spiroadamantane)- 4- methoxy- 4-、 phosphoroxy)phenyl-l ,2 - dioxetane]、 1, 2—ジォキセタン [1,2- dioxetane (CDP— Star ;トロピックス社）]等の 公知基質を用いると、より好感度に検出することができるため、好ましい。
[0032] 以下、本発明の酵素分析方法について、実施態様毎に、具体的な測定手順を示 すことにより、更に詳細に説明する。
本発明の酵素分析方法の一態様である非免疫分析法では、以下の工程に限定さ れるものではないが、例えば、目的とする酵素に対する特異的な基質の一端を標識 化し、別の一端で不溶性担体 (例えば、不溶性磁性粒子）と固相化した固定ィ匕基質 と、酵素を含む検体とを一定時間反応させた後、固定ィ匕基質を洗浄して、固定化基 質上の切断された標識化基質断片及び検体と、固定化基質とを分離する。次に、不 溶性磁性粒子上に残存している切断されな力つた基質の標識物質量を測定すること で、検体に含まれて 、る酵素活性を分析することができる。
[0033] 本発明における非免疫分析法は、例えば、
(Al) (a)分析対象酵素を含有する可能性のある被検試料と、 (b)分析対象酵素により切断可能な酵素基質を不溶性担体に結合させた固定化基 質であって、且つ、前記酵素基質が、前記分析対象酵素の切断により前記不溶性担 体力 遊離する基質断片側において、標識物質で標識されている標識ィ匕固定ィ匕基 質と
を液中で接触させる工程、
(A2)前記液と不溶性担体とを分離する工程、並びに
(A3)切断されずに不溶性担体に残存する基質、及び Z又は、不溶性担体から遊離 した液中の基質断片を分析する工程
を含む。
[0034] 前記工程 (A1)で用いる標識ィ匕固定ィ匕基質は、不溶性担体に結合され、更に、標 識物質で標識された酵素基質である。前記標識化固定化基質における酵素基質部 分は、分析対象酵素の特異的切断部位を有しており、前記切断部位とは異なる部位 であって、且つ、分析対象酵素により切断されることで不溶性担体から遊離する部位 (例えば、固定ィ匕末端と逆の末端)が標識物質で標識されている。従って、工程 (A1 )において、分析対象酵素を含有する被検試料と、標識化固定化基質とを接触させ ると、分析対象酵素が標識ィ匕固定ィ匕基質の特異的切断部位で基質を切断するため 、基質断片の内、標識化基質断片は不溶性担体から遊離する一方、分析対象酵素 によって切断されなかった固定化基質は不溶性担体に残存する。本工程における前 記接触時間は、被検試料に含有される可能性のある分析対象酵素と、固定化基質と の反応が実施可能である限り、特に限定されるものではなぐ反応条件 (例えば、試 薬及び試料の使用量、温度、 pH等）に応じて適宜決定することができるが、通常、 3 分〜 24時間であり、好ましくは 15分〜 1時間である。
[0035] 前記工程 (A2)では、前記工程 (A1)を実施した後の不溶性担体を、それ以外の画 分 (すなわち、遊離基質断片及び被検試料を含む液画分)と分離する。前記分離操 作は、常法により実施することができ、例えば、不溶性担体として磁性粒子を用いる 場合には、例えば、磁石を使用することにより、あるいは、遠心操作により分離するこ とができ、不溶性担体としてラテックス粒子を用いる場合には、例えば、遠心操作又 は濾過により分離することができる。次の工程 (A3)で不溶性担体に含まれる標識物 質を分析する場合には、前記分離後に不溶性担体を洗浄することにより、遊離基質 断片を充分に除去することが好まし 、。
[0036] 前記工程 (A3)では、不溶性担体に残存する基質断片、若しくは、不溶性担体から 遊離した液中の基質断片のいずれか一方を、又はその両方を分析することができる 不溶性担体から遊離した液中の基質断片を分析する場合には、遊離基質断片に 含まれる標識物質の量を測定することにより、遊離基質断片の量を決定することがで き、更に、例えば、検量線を作成することにより、被検試料中に含有される分析対象 酵素の量又は活性を決定することができる。被検試料中に分析対象酵素が含まれる 場合、その酵素量又は活性に応じて、遊離基質断片の量が増加する。
一方、不溶性担体に切断されずに残存する固定化基質を分析する場合、残存する 標識物質の量を測定することにより、残存標識基質 (すなわち、固定化標識基質)の 量を決定することができ、更に、例えば、検量線を作成することにより、被検試料中に 含有される分析対象酵素の量又は活性を決定することができる。被検試料中に分析 対象酵素が含まれる場合、その酵素量又は活性に応じて、固定化標識基質の量が 減少する。
[0037] 本発明の酵素分析方法の別の一態様である免疫分析法では、以下の工程に限定 されるものではないが、例えば、固定化基質と検体とを一定時間反応させた後、切断 された断片と特異的に結合する標識ィ匕抗体を添加し、一定時間反応させて、洗浄の 後、固定化基質に結合する標識化抗体量を測定することで、検体に含まれている酵 素活性を分析することができる。
[0038] 本発明における免疫分析法は、前記酵素基質が前記分析対象酵素で切断されて 生じるネオアンチゲンと特異的に結合し、且つ、標識物質で標識されている標識ィ匕 パートナーを用いて、分析工程を実施する。以下、ネオアンチゲンが、不溶性担体に 残存する基質断片側に生じるネオアンチゲンである場合を主として、本発明の免疫 分析法を説明するが、当業者であれば、ネオアンチゲンが、遊離した基質断片側に 生じるネオアンチゲンである場合も、適宜実施することが可能である。反応系に標識 化パートナーを添加する時期は、例えば、接触工程、分離工程、又は分析工程のい ずれであることちできる。
[0039] 例えば、接触工程において標識ィ匕パートナーを添加する場合には、被検試料と固 定ィ匕基質との接触の前 (すなわち、被検試料又は固定ィ匕基質のいずれか一方と標 識化パートナーとを接触させた後、被検試料又は固定化基質の残る一方を更に接触 させる）、接触と同時 (すなわち、被検試料、固定化基質、及び標識化パートナーの 三者を同時に接触させる）、あるいは、接触後 (すなわち、被検試料及び固定化基質 を接触させた後、標識化パートナーを更に接触させる）に添加することができる。標識 化パートナーは、酵素基質が分析対象酵素で切断されて生じるネオアンチゲンと特 異的に結合するため、酵素切断前の固定化基質とは結合せず、接触工程における 酵素反応は、標識化パートナーの存在の有無と無関係に進行する。接触工程にお いて標識化パートナーを添加する場合、被検試料に分析対象酵素が含有され、且 つ、前記酵素により固定化基質が切断されて、初めて、基質断片（固定化基質断片 又は遊離基質断片)と標識化パートナー (好ましくは標識化抗体)との複合体 (好まし くは免疫複合体)を形成する。
[0040] 分離工程において標識ィ匕パートナーを添加する場合には、分離操作の前に、ある いは、分離操作の後に、添加することができる。例えば、分離操作の後に標識化パ 一トナーを添加する場合であって、標識化パートナーが、不溶性担体に残存する基 質断片側に生じるネオアンチゲンを認識するパートナーである場合には、分離操作 で得られた不溶性担体に添加した後、不溶性担体を洗浄することにより、未反応の 標識ィ匕パートナーを除去することができる。
[0041] 分析工程において標識ィ匕パートナーを添加する場合には、例えば、前記分離工程 で得られた不溶性担体に標識化パートナーを添加した後、不溶性担体を洗浄して未 反応の標識ィ匕パートナーを除去し、標識物質の分析を実施することができる。
[0042] 反応した標識化パートナーと未反応の標識化パートナーとの分離操作を省略する ことができる点で、接触工程において、あるいは、分離工程における分離操作の前に 、標識ィ匕パートナーを添加することが好ましい。
[0043] 免疫分析法における分析工程では、例えば、標識化パートナーが、不溶性担体に 残存する基質断片側に生じるネオアンチゲンを認識するパートナーである場合、不 溶性担体に残存する基質断片に特異的に結合した標識化パートナーを分析するこ とにより、被検試料中に含有される分析対象酵素の量又は活性を決定することができ る。すなわち、不溶性担体に残存する基質断片に特異的に結合した標識化パートナ 一の標識物質の量を測定することにより、固定ィ匕基質断片の量を決定することができ 、更に、例えば、検量線を作成することにより、被検試料中に含有される分析対象酵 素の量又は活性を決定することができる。被検試料中に分析対象酵素が含まれる場 合、その酵素量又は活性に応じて、固定化基質断片の量が増加するため、基質断 片に特異的に結する標識ィ匕パートナーの量も増加する。
[0044] 本発明の酵素分析用キットは、少なくとも、分析対象酵素により切断可能な酵素基 質を不溶性担体に結合させた固定化基質を含む。本発明の酵素分析用キットには、 本発明の非免疫分析法に用いることのできるキット (以下、非免疫分析用キットと称す る）と、本発明の免疫分析法に用いることのできるキット（以下、免疫分析用キットと称 する）とが含まれる。
[0045] 本発明における非免疫分析用キットは、少なくとも、分析対象酵素により切断可能 な酵素基質を不溶性担体に結合させた固定化基質であって、且つ、前記酵素基質 力 前記分析対象酵素の切断により前記不溶性担体力 遊離する基質断片側にお Vヽて、標識物質で標識されて!ヽる標識ィ匕固定ィ匕基質を含む。
また、本発明における免疫分析用キットは、少なくとも、分析対象酵素により切断可 能な酵素基質を不溶性担体に結合させた固定化基質と、前記酵素基質が前記分析 対象酵素で切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に結合し、且つ、標識物質で 標識されて ヽる標識ィ匕パートナーとを含む。
[0046] 本発明の酵素分析用キットは、標識物質及び検出系などに応じて、例えば、酵素 基質、洗浄液、検体希釈液、及び Z又は反応増幅剤を更に含むことができる。例え ば、第一試薬に固定化基質、第二試薬に基質に標識した物質の信号を発現させる 物質を含ませることができる。具体的には、非免疫分析用キットとしては、例えば、 第一試薬:固定ィ匕基質溶液 (標識をアルカリホスファターゼ）
第二試薬：化学発光用基質 (例えば AMPPD)
からなる試薬構成、あるいは、免疫分析用キットとしては、例えば、 第一試薬:固定化基質溶液
第二試薬:切断断片を特異的に認識する標識ィ匕抗体 (標識をアルカリホスファターゼ )
第三試薬：化学発光用基質 (例えば AMPPD)
力もなる試薬構成を挙げることができ、標識物質、検出系により、適宜組成を変更し、 種々の構成とすることが可能である。
[0047] これらの分析用キットを用いた具体的な測定方法の例を以下に説明する。まず測 定しょうとする酵素を含むと考えられる試料溶液を、前記酵素により切断される部位を 含有し、酵素標識を行った基質を担持させた不溶性磁性粒子カゝらなる第 1試薬と共 に、反応容器の液体媒体中で反応させる。あるいは、測定しょうとする酵素を含むと 考えられる試料溶液と、前記第 1試薬と、測定しょうとする不溶性磁性粒子上の基質 の切断部位に対する酵素標識抗体からなる第 2試薬とを反応容器の液体媒体中で 反応させる。第 1試薬、第 2試薬を反応容器の液体媒体中に加える際、同時に加え ても構わないし、別々にカ卩えても構わない。また、加える順番についてはどの試薬か らカ卩えても構わない。
[0048] 各試薬添加後の混合は充分に行う必要があるが、均一に混合された後は混合を止 め放置して反応させてもよい。反応は一般の免疫化学反応と同様に通常 pH5〜10 、好ましくは pH6〜7にて行う。温度については、通常 2〜50°Cの範囲で実施可能で あるが、望ましくは室温乃至は 37〜45°Cで反応させる。反応時間は、反応直後から 1昼夜まで任意であるが、感度、操作性を考慮して、通常 3〜60分の範囲で設定さ れる。
[0049] 目的の pHを維持するために、通常緩衝液が用いられる。緩衝液としては、例えば、 MES (2-Morpholinoethansulphonic Acid)、リン酸等が用いられるが、弱酸性から中 性で常用される殆どの緩衝液が使用可能である。多くの場合、非特異反応を避ける ために、塩ィ匕ナトリウム等の塩類及び牛血清アルブミン等のタンパク質が添加される
[0050] 不溶性磁性粒子は、反応液に対して通常 0. 0001〜1重量％、好ましくは 0. 001 〜0. 1重量％、酵素標識抗体は反応液に対して通常 0. 00001-0. lmAbs、好ま しくは 0. 0001〜0. OlmAbsとなるように使用される。
実施例
[0051] 以下、実施例によって本発明を具体的に説明する力 これらは本発明の範囲を限 定するものではない。
[0052] 《実施例 1：トロンビン活性の測定》
( 1)基質の標識ィ匕
C末端ピオチン標識ペプチド基質の合成ペプチド基質 (N— Gly Pro -Arg ビ ォチン）は、 1 , 2—ジアミノエタントリチル榭脂と、ペプチドの N 末端アミノ酸残基と して N— a—tert ブトキシカルボ-ルグリシンとを用いる Fmocケミストリーに従い、 自動ペプチド合成機を用いて合成した。ペプチドの C末端アミノ酸を榭脂から除去し た後、 5—（N—スクシンイミジロキシカルボ-ル）ペンチル D ピオチンアミドを用い て、 1 , 2—ジアミノエタンを介しピオチン標識した。ピオチン標識ペプチドの側鎖の全 ての保護基をトルフルォロ酢酸と反応させることによって除去した。得られた N— Gly Pro -Arg ピオチンを、市販のアルカリホスファターゼ標識キット（同仁品コード： LK12)を用いて、 N末のアミノ基をアルカリホスファターゼ標識した。
[0053] (2)磁性粒子への基質の結合
ストレプトアビジン標識磁性粒子 (ダイナルバイオテック社、粒径 2. 8 μ m)の 1 %懸 濁液と、前項（1)で調製した標識基質 (0. 5mgZmL)とを 50mmolZL MES緩衝 液 (pH6)中で 1時間反応させ、前記緩衝液で洗浄後、 0. 3%牛アルブミン Z0. lm olZLトリス緩衝液 (pH8)によるブロッキングを行い、標識基質結合磁性粒子を調製 した。
[0054] (3)血漿中のトロンビン測定
小型自動免疫測定装置 (PATHFAST ;三菱ィ匕学ャトロン社製)を用いて測定を行 つた。詳細には、トロンビン含有量既知（0. llUZmL)の血漿の希釈列 60 Lと標 識基質結合磁性粒子の懸濁液 100 Lとを 37°Cで 5分間反応させ、 0. ImolZLトリ ス緩衝液（pH8) /0. 15mol/L NaCL/0. 1 %トリトン (Triton) X— 100で磁性 粒子を洗浄した後、ケミルミネッセンス基質溶液として CDP— Star (トロピックス社)溶 液 100 /z Lを混合し、 37°Cで 4分間反応させ、発光量をカウントした。ブランクとして、 血漿に変えて生理食塩水を用いて同様の操作を行った。結果を図 1に示す。
[0055] グラフのように、トロンビンの濃度が高 、ほど、固定化基質が分解されて、酵素を標 識した部位 (基質断片）が遊離し、粒子上に残存する基質量が減少するため、発光力 ゥントが濃度依存的に減少することがわかる。トロンビン既知濃度 (又は活性)の血漿 又は標準試薬を用いて検量線を作成することにより、試料中のトロンビン濃度 (又は 活性)を定量することができる。
[0056] 《実施例 2： ADAMTS 13活性の測定》
(1)基質の調製
ADAMTS 13 [別称：フォン'ヴィルブラント因子（vWF)切断プロテアーゼ（von Willebrand Factor cleaving protease) ]の基質として、 vWFの部分断片（第 1596番 〜第 1668番のアミノ酸からなる断片。以下、 vWF73と称する）を、 Koichi
Kokame, Masanon Matsumoto, Yoshihiro Fujimura, and Toshiyu i iyata, VWF73, a
region from D1596 to R1668 of von Willebrand factor, provides a minimal substrate for ADAMTS- 13. Blood, Jan 2004; 103: 607 - 612に記載の方法に従って
、調製した。
[0057] (2)磁性粒子への基質の結合
2. 4 μ mの粒径の磁性ラテックス (JSR製)の 1 %溶液と（1)で調製した vWF73 (50
0 g)とを、 50mmol/L MES緩衝液 (pH6)中で室温にて 1時間反応させ、前記 緩衝液で洗浄後、 0. 3%牛アルブミン Z0. lmol,Lトリス緩衝液 (pH8)によるブロ ッキングを行い、基質結合磁性粒子を調製した。
[0058] (3) vWFモノクローナル抗体のアルカリホスファターゼ標識
vWF73の ADAMTS 13による切断部位を特異的に認識するモノクローナル抗体 は、 Cruz
MA, Whitelock J, Dong JF. Evaluation of ADAMT¾— 13 activity in plasma using recombinant von Willebrand Factor A2 domain polypeptide as substrate. Thromb Haemost. 2003;90(6): 1204-9の記載に従って作成した。プロテイン Gカラムにより、抗 血清力 IgGを精製し、更に 0. lmol/L酢酸ナトリウム (pH3. 9)溶液中、 4%ぺプ シン消化を 37°C—夜行い、 F (ab，） の調製を行った。更に 2—メルカプトェチルアミ
2
ン溶液を添カ卩し、 37°Cで 90分間反応後、 UltrogelAcA44カラムにて、 Fab'の分離を 行った。アルカリホスファターゼを 50mmol/Lホウ酸ナトリウム緩衝液 (pH7. 6)、 1 mmolZL塩化マグネシム、及び 0. Immol/L塩化亜鉛緩衝液にて透析した。この 透析液に N— (6—マレイミドカプロイロキシ）サクシミドを添加して 30°Cにて 30分間ィ ンキュペートした。セフアデックス G— 25カラムにてゲルろ過して濃縮し、マレイミド導 入アルカリホスファターゼを調製した。マレイミド導入アルカリホスファターゼ lOnmol /0. lmol/Lトリス緩衝液（pH7) (lmmol/L塩化マグネシム、 0. ImmolZL塩 化亜鉛を含む）と Fab，50nmolZ0. ImolZLリン酸ナトリウム緩衝液（pH6) (5mm ol/L EDTAを含む）を混合し、 4°Cで 20時間インキュベートした。 lOmmolZL 2 —メルカプトェチルァミン溶液を添カ卩して、 UltrogelAcA44カラムにて、 0. lmol/Lト リス緩衝液（PH6. 8) (0. Immol/L塩化ナトリウム、 ImmolZL塩化マグネシム、 0 . ImmolZL塩ィ匕亜鉛を含む)でゲルろ過し、酵素標識 Fab，を得た。
[0059] (4)ADAMTS13活性の測定
小型自動免疫測定装置 (PATHFAST;三菱ィ匕学ャトロン社製)を用いて測定を行 つた。詳細には、健常ヒト血漿の希釈列 60 Lと（2)で調製した基質結合磁性粒子 の懸濁液 100 Lとを 37°Cで 5分間反応させ、更に（3)で調製したアルカリホスファタ ーゼ標識抗 vWFモノクローナル抗体を ImAbs.添加し、 37°Cで 4分間反応させた。 0. lmol/Lトリス緩衝液（pH8) /0. 15mol/L NaCL/0. 1%トリトン (Triton) X— 100で磁性粒子を洗浄した後、ケミルミネッセンス基質溶液として CDP— Star (ト 口ピックス社)溶液 100 /z Lを混合し、 37°Cで 2分間反応させ、発光量をカウントした。 ブランクとして、血漿に変えて生理食塩水を用いて同様の操作を行った。結果を図 2 に示す。
産業上の利用可能性
[0060] 本発明の酵素分析方法は、例えば、臨床診断検査の用途に適用することができる 以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。 酉己歹 ij表フリーテキスト
以下の配列表の数字見出し < 223 >には、「Artificial Sequence」の説明を記載す る。配列番号 1の配列で表されるアミノ酸配列は、合成基質である。

Claims

請求の範囲
[1] (1)分析対象酵素を含有する可能性のある被検試料と、前記分析対象酵素により 切断可能な酵素基質を不溶性担体に結合させた固定化基質とを液中で接触させる 工程、
(2)前記液と不溶性担体とを分離する工程、並びに
(3)不溶性担体に残存する基質又は基質断片、及び Z又は、不溶性担体から遊離 した液中の基質断片を分析する工程
を含むことを特徴とする、酵素の分析方法。
[2] 不溶性担体に結合する前記酵素基質が、分析対象酵素の切断により不溶性担体 力 遊離する基質断片側において、標識物質で標識されている、請求項 1に記載の 分析方法。
[3] 前記酵素基質が前記分析対象酵素で切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に 結合し、且つ、標識物質で標識されている標識ィ匕パートナーを用いて、前記工程 (3
)の分析を実施する、請求項 1に記載の分析方法。
[4] 標識ィ匕パートナーが標識ィ匕抗体である、請求項 3に記載の分析方法。
[5] 標識物質が、蛍光物質、発光物質、発色物質、又は酵素である、請求項 2〜4の ヽ ずれか一項に記載の分析方法。
[6] 不溶性担体が粒子である、請求項 1〜5のいずれか一項に記載の分析方法。
[7] 粒子がラテックス粒子又は磁性粒子である、請求項 6に記載の分析方法。
[8] 分析対象酵素により切断可能な酵素基質を不溶性担体に結合させた固定化基質 であって、且つ、前記酵素基質が、前記分析対象酵素の切断により前記不溶性担体 力 遊離する基質断片側において、標識物質で標識されている標識ィ匕固定ィ匕基質 を含むことを特徴とする、酵素分析用キット。
[9] 分析対象酵素により切断可能な酵素基質を不溶性担体に結合させた固定化基質 と、
前記酵素基質が前記分析対象酵素で切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に 結合し、且つ、標識物質で標識されている標識化パートナーと
を含むことを特徴とする、酵素分析用キット。
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