WO2006100095A1

WO2006100095A1 - Substituierte carbonsäureamide, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als tnf-alpha-freisetzungsinhibitoren

Info

Publication number: WO2006100095A1
Application number: PCT/EP2006/002732
Authority: WO
Inventors: Mohammed Daghish; Alexander Schulze; Claudia Reichelt; Alexander Ludwig; Siegfried Leistner; Jochen Heinicke; Andreas KRÖDEL
Original assignee: Curacyte Discovery Gmbh
Priority date: 2005-03-24
Filing date: 2006-03-24
Publication date: 2006-09-28
Also published as: DE102005013621A1

Abstract

Die Erfindung betrifft neue Wirkstoffe gemäß Formel (1 ) wobei R1 = Aryl, ggf. mit Alkyl (C1 bis C5), Alkenyl (C2 bis C5), O-Alkyl (C1 bis C5), Aryloxy (O-Aryl), Alkoxycarbonyl (C1 bis C5), Amino, Alkylamino-, Alkylsulfonyl (C1 bis C5), Halogen, C1 bis C5-Alkylhalogenid, Nitro, Hydroxyl- oder CN substituiert; Hetaryl (C5 bis C7) aufweisend ein oder zwei S und/oder O und/oder N als Heteroatome, ggf. mit Alkyl (C1 bis C5), Alkenyl (C2 bis C5), O-Alkyl (C1 bis C5), Amino-, Alkylamino-, Halogen, C1 bis C5-Alkyihalogenid, Nitro, Hydroxyl- oder CN substituiert; Morpholino ; 3-Pyridyl, 4- Pyridyl, Cycloalkyl (C3 bis C7), Alkyl (C1 bis C5), Alkenyl (C2 bis C5), Alkylthio (C1 bis C5), O-Alkyl (C1 bis C5), jeweils ggf. mit Halogen, Hydroxyl, Amino-, Nitro oder CN substituiert; R2 = H Alkyl (C1 bis C5), Cycloalkyl (C3 bis C7), Alkylthio (C1 bis C5), Alkenyl (C2 bis C5), O-Alkyl , ggf. jeweils mit Halogen, Hydroxyl, CN oder Nitro substituiert, X= N, C-H, Y = N-R3 , S, mit der Maßgabe, dass X = N, wenn Y = S ist R3 = H Alkyl (C1 bis C3), Cycloalkyl (C3 bis C7), Alkenyl (C2 bis C5) und Hetaryl, ggf. jeweils mit Halogen, CN oder Nitro substituiert.

Description

Substituierte Carbonsäureamide, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als TNF-alpha-Freisetzungsinhibitoren

Die Erfindung betrifft Verbindungen der allgemeinen Formel (1)

(1 )

Es handelt sich um R¹- und R²- substituierte Carbonsäureamide, Verfahren zu deren Herstellung, pharmazeutische Zubereitungen, die diese Verbindungen und/oder deren Tautomere und daraus herstellbare physiologisch verträgliche Salze und/oder deren Solvate enthalten, sowie die Verwendung dieser Verbindungen, deren Tautomere, Salze oder Solvate, einschließlich pharmakologisch bekannter und geeigneter Prodrug-Formulierungen, als Inhibitoren der TNFα-Freisetzung,

Insbesondere handelt es sich um Verbindungen der allgemeinen Formeln (2) und (3).

(3)

Stand der Technik

Verbindungen der allgemeinen Formel (2) sind bereits bekannt, so z.B. mit den Substi- tuenten R¹ = Ph und R² = Me (Wagner, G., Vieweg, H. und Leistner, S., Pharmazie 48, 588 (1993)). Weitere bekannte Verbindungen zeigt die Tabelle 1.

Über biologische Aktivitäten von 5-Amino-thieno[2,3-d]pyrimidin-Derivaten ist bisher nur wenig berichtet worden. So wurden von R. G. J. M. Hanssen et al. (WO 2003020727, WO 2003020726), von N. C. R. van Straten et al. (ChemBioChem (2002), 3, 1023-1026), von C. M. Timmers (WO 2002024703)unά von G. G. Gerritsma et al. (WO2000061586) über LH- bzw. FSH-rezeptoraktvierende Eigenschaften diese Stoffklasse berichtet.

Antimikrobielle Eigenschaften von 5-Amino-thieno[2,3-d]pyrimidinen wurden von Z. H. Khalil (Phosphorits, SuIf ur and Silicon and Related Elements (1991), 60, 223-231) beschrieben.

Von T. Tahara et al. (JP 50140487) wurden bakterizide, analgetische, diuretische und antiiflammatorische Wirkungen von 5-Amino-thieno[2,3-d]pyrimidinen patentiert.

Die Firma Boehringer Ingelheim beschrieb in zwei Patenten (US 2004/0180922 A1 und US 2005/0038104 A1) primäre Carbonsäureaminoamide bicyclischer Thiophene, die sehr effektiv die Aktivität der Proteinkinasen IKK-1 und IKK-2 hemmten und z.T. dadurch u.a. einen antientzündlichen Effekt erzielten. Ausgewählte Vertreter der Formel I hemmten jedoch nicht signifikant die 1KK-1 bzw. IKK-2. Es kann deshalb zu Grunde gelegt werden, dass die in diesem Patent beschriebenen Substanzen über einen gänzlich anderen Regulationsweg, die Freisetzung von TNFα hemmen.

Bezüglich der Formel (3) sind folgende 5-Amino-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamide literaturbekannt:

Ri=SMe, R₂=NH₂, R₃=H, X=N Ri=Phenyl, R₂=NHEt, R₃=H, X=N R-ι=Phenyl, R₂=NHMe, R₃=H, X=N Ri=Phenyl, R₂=H, R₃=H, X=N

Diese Verbindungen werden beschrieben in:

Kim, Dong H.; Santilli, Arthur A. 4,5-Diamino-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine derivatives. U.S. (1975), 11 pp. CODEN: USXXAM US 3910913 19751007 CAN 84:31116 AN 1976:31116 Kim, Dong H.; Santilli, Arthur A. 5-Amino-2,6-substituted-7H-pyrrolo(2,3-d)pyrimidines and related Compounds. U.S. (1975), 12 pp. CODEN: USXXAM US 3867386 19750218 CAN 82:171036 AN 1975:171036

Kim, Dong H.; Santilli, Arthur A. 4,5-Diamino-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine derivatives. U.S. (1971), 9 pp. CODEN: USXXAM US 3631045 19711228 CAN 76:99705 AN 1972:99705

Kim, Dong H.; Santilli, Arthur A. 5-Amino-2,6-disubstituted-7H-pyrrolo[2,3- d]pyrimidines and related Compounds. U.S. (1971), 10 pp. CODEN: USXXAM US 3631036 19711228 CAN 76:99696 AN 1972:99696

Kim, Dong Han; Santilli, Arthur A. 7-Deazapurines. II. Syntheses and reactions of 5- aminopyrrolo[2,3-d]pyrimidine-6-carbonitrile and related Compounds. Journal of Het- erocyclic Chemistry (1971), 8(5), 715-19. CODEN: JHTCAD ISSN:0022-152X. CAN 76:14468 AN 1972:14468

Andererseits ist bekannt, daß weltweit große Anstrengungen unternommen werden, chronisch entzündliche Krankheiten wie Rheumatoide Arthritis, Morbus Crohn, Bowel Diseases, Asthma, COPD, Osteoporose und dergleichen zu lindem oder zu heilen. Ein Ansatz dazu ist die Freisetzungshemmung des TNFα.

Das Zytokin Tumour necrosis factor (TNFα) ist eines von heute 17 bekannten Mitgliedern einer strukturell sehr ähnlichen Proteinfamilie. Seinen Namen verdankt es der Fähigkeit, eine Nekrose von transplantierten Tumorzellen im Mausmodell zu triggern. Neben seiner Apoptose-induzierenden Wirkung wurde sehr schnell erkannt, dass TNFα auch ganz maßgeblich in die Regulation der Entzündungsantwort und der Immunantwort eingebunden ist. Eine Überproduktion von TNFα oder die Aktivierung der TNFα-vermittelten Signalkaskaden spielen in der Pathogenese einer Vielzahl von Erkrankungen, wie z.B. Sepsis, Rheumatoide Arthritis (RA), cerebrale Form der Malaria, neurodegenerativen Erkrankungen wie z.B. Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, bei Diabetes mellitus, COPD/Asthma, Tumorerkrankungen und hier insbesondere Tumoren des Blutbildenden Systems wie z.B. Leukämien und Lymphome, virale Erkrankun- gen und hier insbesondere retrovirale Erkrankungen wie z.B. das erworbene Immun- defizienz Syndrom (AIDS), Guillain-Barre Syndrom, Rhinitis allergica, allergische Konjunktivitis, systemische Sklerodermie, Graft versus host disease (GvHD), Systemischer Lupus Erythematodes (SLE), Osteoporosis, Toxisches Schocksyndrom, Akute Glomerulonephritis, akute und chronische Schmerzen, Arteriosklerose, Herzinfarkt, Schlaganfall, Sarkoidose, Multiple Sklerose, Osteoarthritis, Colitis ulcerosa, Vasculitis, Uveitis, Morbus Crohn, Morbus Behcet, Myastenia Gravis und chronisch entzündlichen Hauterkrankungen wie Psoriasis, atopische Dermatitis, Ekzeme und Alopecie, eine zentrale Rolle (Chen G, Goeddel DV (2002 TNF-R1 signaling: a beautiful pathway. Science 296 1634-1635; Ware CF (2003) The TNF superfamily. Cytokine & Growth Factor reviews 14 181-184; Dempsey PW (2003) The signaling adaptors and path- ways activated by TNF superfamily. Cytokine & Growth Factor reviews 14 193-209).

Bei TNFα handelt es sich um eines der wichtigsten pro-inflammatorischen Zytokine, der in die Pathogenese fast aller chronisch entzündlichen Erkrankungen maßgeblich eingebunden ist. TNFα, welches auch als Chachektin, Makrophagen-Cytotoxin (MCT), E tumor necrosis factor-a und als macrophage cytotoxic factor (MCF) beschrieben wurde, wird von verschiedensten Zellen nach Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS), Interferronen (IFN's), IL-2, Bradykinin, GM-CSF, Antigen-Antikörper-Komplexen, Substanz P und zahlreichen weiteren biologisch aktiven Verbindungen synthetisiert und sezerniert. TNFα wird unter physiologischen Bedingungen hauptsächlich von aktivierten Makrophagen, T-Lymphozyten, Mikrogliazellen und NL-Zellen gebildet. Stimulierte und somit aktivierte Fibroblasten, glatte Muskelzellen, Astrozyten, Keratinozyten, En- dothelzellen und Lungen-Epithelzellen sezemieren gleichfalls TNFα.

Humanes TNFα ist ein 17 kDa großes Protein, welches aus 157 Aminosäuren besteht und zu Dimeren und Trimeren assoziiert. Es existiert eine weitere höhermolekulare Variante dieses Moleküls mit einer Molmasse von 26 kDa, das als Transmembranprotein in der Zellmembran verankert ist. Man weiß heute, dass zunächst die höhermolekulare Transmembranform synthetisiert in die Zellmembran eingelagert wird und bei Bedarf deren extrazelluläre Domäne durch das TNFα Converting enzyme (TAGE) abgespalten wird. Das lösliche TNFα zirkuliert als ein Homotrimer und bindet sich an seine spezifischen Rezeptoren an Zelloberflächen. Die Bindung von TNFα an seine Rezeptoren (TNFR1 , TNFR2) bewirkt bei diesen eine konformative Änderung und Dirne- risierung bzw. Clusterung, welche über eine Signalkaskade den biologischen Effekt von TNFα vermitteln. In zahlreichen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass über die Bindung von TNFα an den TNFR1 die meisten biologischen Effekte realisiert werden. Dies beinhaltet die Induktion der Apoptose über eine Aktivierung der Caspase 8 und nachfolgender Aktivierung der Caspasen 3, 6 und 7, die dann zur Apoptose der Zelle führen.

Ein weiterer wichtiger Signalweg durch TNFα ist die Aktivierung von zwei wichtigen Transkriptionsfaktoren, dem nuclear factor-kappaB (NF-_KB) und c-Jun. Diese beiden Transkriptionsfaktoren spielen eine außerordentlich wichtige Rolle in der Regulation der Genexpression bei der Zelldifferenzierung, dem Zellwachstum, bei der Immun- und Entzündungsantwort:, bei Zellstressregulationsvorgängen und bei der Tumorgenese. NF-_KB reguliert unter anderem die Gene für IL-1α, IL-1 ß, IL-2, IL-3, IL-6, IL-8, IL-12, TNFα, LT-α, IFN-α/ß, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, für den Zytokinrezeptor IL-2Rα, für die Adhäsionsmoleküle ICAM-1 , VCAM-1 , MAdCAM, E-Selektin, für die immunregulatori- schen Moleküle leichte Kette des lgγ, MHC Class I und II, TCRα und ß, ß₂ Mikroglobu- lin, TAP1 , iNOS und für die Akute Phase Proteine SAA, α_rsaures Glycoprotein und TSG-14/PTX3.

Über die tatsächliche physiologische Bedeutung der Bindung von TNFα an den TNFR2 existieren heute noch erhebliche Widersprüche. Deshalb ist die Aufdeckung der genauen molekularen Signaltransduktionsabläufe noch Gegenstand der Grundlagenforschung. Mehrheitlich geht man heute davon aus, dass die Bindung von TNFα an den TNFR2 auch die Mitogen-aktivierten Proteinkinase Kinasen (MAPKK) aktiviert, im speziellen die MEKK1 und die ASK1 , die über eine Aktivierungskaskade zur Aktivierung der c-Jun Kinase (JNK) und damit zu einer Aktivierung des Transkriptionsfaktors c-Jun führt. In diesen Regulationsweg ist auch die Aktivierung der p38 Kinase eingebunden, die zur Aktivierung von p38 führt. Die Aktivierung von p38 ist essentiell für die Produktion der pro-inflammatorischen Zytokine IL-1ß, TNFα und IL-6 und ist darüber hinaus auch verantwortlich für die Induktion und Expression der mit chronischen Entzündung vergesellschafteten Enzyme COX-2 und iNOS (Ono K, Han J (2000) The p38 Signal transduction pathway: activation and function. Cell Signal 12. 1-13). Über weitere Aktivierungswege werden auch die wichtigen Transkriptionsfaktoren activating-transcrip- tion factor 2 (ATF2) und das Aktivatorprotein-1 (AP-1 ) induziert, welche unmittelbar stimulierenden Einfluss auf die Expression pro-inflammatorischer Moleküle wie E- Selectin, RANTES, IL-12, IL-6 und IL-8 ausüben (Guicciardi ME, Gores GJ (2003) J Clin InvestUl 1813-1815 ).

Die erste biologische Bedeutung von TNF erkannten 1969 GRANGER et al. (Granger GA, Shacks SJ, Williams TW, KoIb WP (1969) Lymphocyte in vitro cytotoxicity: specific release of lymphotoxin-like materials from tυberculin-sensitive lymphoid cells. Nature 221 1155-1157) die zeigen konnten, dass ein von Lymphozyten und Makrophagen sezemiertes Protein (Lymphotoxin) zur Lyse von Zellen, insbesondere von Tumorzellen, führt. 1984 konnten GRAY et al. (Gray PW, Aggarwal BB, Benton CV, Briingman TS, Henzel WJ, Jarrett JA, Leung DW, Maffatt B, Ng P, Svedersky LP et al. (1984) Cloning and expression of cDNA for human lymphotoxin, a lymphokine with tumor ne- crosis activity. Nature 3f2 721-724) und PENNICA et al. (Pennica D₁ Nedwin GE, Hay- flick JS, Seeburg PH, Deyrynck R, Palladino MA, Kohr WJ, Aggarwal BB, Goeddel DV (1984) Human tumor necrosis factor: precursor structure, expression and homology to lymphotoxin. Natur 312 724-729) die cDNA für TNFα klonieren und das Protein expri- mieren.

Die biologische Aktivität von TNFα wird hauptsächlich über zwei spezifische Rezeptortypen (TNFR1 , TNFR2) vermittelt, die sich transmembran mit einem extra- und intrazellulären Anteil auf einer Vielzahl Zellen des menschlichen Körpers befinden.

TNFα besitzt ein sehr breites Spektrum an biologischen Aktivitäten und reguliert fast alle Zellen. Er ist aus heutiger Sicht ein wesentlicher Mediator bei Entzündungs- und Immunreaktionen, aber auch bei der Apoptose, der Zelldifferenzierung, bei der Induktion von Fieber und zahlreichen weiteren pathophysiologischen Regulationsprozessen.

Eine zentrale Stellung nimmt TNFα bei der Endothelzellaktivierung während des Entzündungsprozesses ein. Hierbei stellt die Aktivierung der vaskulären Endothelzellen einen wesentlichen Schritt in der Initiationsphase der entzündlichen Reaktionen im Gewebe dar. So führen pro-inflammatorische Zytokine, mit TNFα an der Spitze, zur Expression endothelialer Adhäsionsmoleküle und chemotaktisch wirksamer Chemoki- rie, die ihrerseits Makrophagen und T-Lymphozyten die Möglichkeit geben, am Endothel anzudocken und über eine aktive Wanderung ins entzündliche Gewebe (Extrava- sion) zu kommen. Man unterscheidet heute in diesem Zusammenhang eine lokale Wirkung von TNFα von einer systemischen. Die lokalen Effekte sind wie oben angeführt eine verstärkte Diapetese von Immun- und Entzündungszellen ins entzündliche Gewebe und eine starke Adhäsion von Thrombozyten an den Blutgefäßwänden. Der systemische Effekt von TNFα führt zu Ödemen, einer Verringerung des Blutvolumens, Hypoproteinämie, verbreitete intravaskuläre Blutgerinnung und in ihrer Maximalvariante zu multiplem Organversagen (septischer Schock).

TNFα bewirkt also eine lokale Aktivierung des vaskulären Endothels, eine Freisetzung von Stickoxid (NO) mit nachfolgender Steigerung der vaskulären Permeabilität, eine erhöhte Expression von Adhäsionsmolekülen und eine erhöhte Expression von „class Il major histocompatibility molecules" (MHC II). Das Ergebnis ist ein Einwandern von Entzündungs- und Immunzellen, Antikörpern und Komplementfaktoren in das entzündliche Gewebe. TNFα verursacht gleichfalls in den lokalen Lymphknoten eine antigen- spezifische Aktivierung der B- und T-Lymphozyten. Des Weiteren aktiviert TNFα Thrombozyten und verstärkt deren Adhäsion an den Gefäßwänden.

TNFα selbst induziert die Synthese anderer pro-inflammatorischer Zytokine wie IL-1 , IL-6, IL-8 und GM-CSF und führt dadurch zu einem Circulus vitiosus des entzündlichen Prozesses. Zusätzlich ist TNFα noch maßgeblich in weitere pathophysiologische Prozesse, wie die Gelenkknorpelzerstörung bei rheumatischen Erkrankungen, Knochenresorptionsprozesse, Hemmung der Knochenbildung, Hemmung der Proteoglycan- synthese und Induktion von Matrix Metalloproteinasen (MMP's) und Prostaglandin E₂ (Mease P (2002) Psoriatic arthritis: The role of TNF inhibition and the effect of its Inhibition with etanercept. Clin Exp Rheumatol 20 (Suppl. 28) S116-S121) involviert.

Übersicht der gesicherten biologischen Wirkung von TNFα auf humane Zellen/- Organe

Tabelle 2

Entwicklung von TNFα Inhibitoren

In der Vergangenheit gab es zahlreiche therapeutische Strategien, um die biologische Aktivität von TNFα zu hemmen und damit den chronischen Entzündungsprozess zu unterbrechen.

• An erster Stelle standen Bemühungen, die Synthese von TNFα zu hemmen. Hierzu kamen anti-inflammatorische Zytokine, wie z.B. das IL-10, Pentoxifylline, Thalidomid bzw.-Analoga, Corticosteroide, Cyclosporin A, PDE-4 Inhibitoren und Antisense Oligonukleotide zum Einsatz.

Am erfolgreichsten werden seit Jahren Corticosteroide in der akuten Phase eines schweren entzündlichen Prozesses eingesetzt. Ihre breitere und besonders längere Anwendung ist auf Grund der schweren unerwünschten Arzneimittelwirkungen stark limitiert. Diese Gründe treffen auch für das gleichfalls seit Jahren zugelassene Immunsuppresivum Cyclosporin A zu. Pentoxifylline und Thalido- midanaloga zeigten in den klinischen Studien nur eine unzureichende therapeutische Wirksamkeit. • Der Einsatz von PDE-4 Inhibitoren zeigt über die intrazelluläre Steigerung der cAMP Konzentration einen inhibierenden Einfluss auf die TNFα Freisetzung. Momentan sind mit Cilomilast, AWD 12-81 (GSK) und Roflumilast (Altana) drei Entwicklungskandidaten in der fortgeschrittenen klinischen Prüfung bzw. stehen kurz vor der Zulassung. Die klinische Anwendung dieser Substanzen geht jedoch auch mit unerwünschten Arzneimittelwirkungen, hauptsächlich emetischer Natur, einher.

• Die Antisense-Therapie befindet sich noch in einer sehr frühen Entwicklungsphase und hat zumindest in den ersten Tieruntersuchungen die erhoffte Wirksamkeit nachweisen können, aber auch hier sind noch umfängliche grundlagenorientierte Arbeiten notwendig.

• Ein weiterer Ansatz bestand in der Inhibierung des TNFα Prozessings durch Inhibitoren der Metalloproteinase TNF Converting enzyme (TACE).

Die Entwicklung von niedermolekularen TAGE Inhibitoren befindet sich noch in der Phase der angewandten Grundlagenforschung. So beschrieben TSUKIDA et al. 2004 Hydroxamsäurederivate, die TAGE in vitro hemmen (Tsukida T₁ Mo- riyama H, lnoue Y, Kondo H₁ Yoshino K, Nishimura S (2004) Synthesis and bio- logical activity of selective azasugar-based TACE Inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 22 1569-1572). Einige Matrix Metalloproteinase Inhibitoren hemmen auch unspezifisch TACE, sind aber auf Grund ihrer MMP-inhibitorischen Aktivität für eine pharmazeutische Entwicklung nicht geeignet. WILLIAMS et al. konnten überraschend zeigen, dass der MMP Inhibitor BB-2275 paradoxerweise sowohl TACE, als auch das Shedding der TNFα Rezeptoren (TNFR1 , TNFR2) hemmt und dadurch keinen TNFα inhibierenden Effekt hatte (Williams LM, Gibbons DL, Gearing A, et al. (1996) Paradoxical effects of a synthetic metalloproteinase in- hibitor that blocks both p55 and p75 TNF receptor shedding and TNF alpha processing in RA synovial membrane cell cultures. J Clin Invest 972833-2841). Alle heute bekannten TAGE Inhibitoren sind in ihrer hemmenden Wirkung unspezifisch, d.h. auch andere wichtige Metalloenzyme werden durch sie gehemmt, mit der Wahrscheinlichkeit unerwünschter (Neben)Wirkungen. • Momentan sind zahlreiche nichtproteinogene (small molecules) TNFα Inhibitoren in der präklinischen und klinischen Entwicklung. Haupttarget dieser Wirkstoffe sind intrazelluläre Proteinkinasen, die über eine Phosphorylierung Transkriptionsfaktoren aktivieren und dadurch unmittelbar in die Genexpression eingreifen. Am besten untersucht ist in diesem Zusammenhang die Regulation des Transkriptionsfaktors NFKB. NFKB befindet sich komplexiert mit IKB₁ der als Inhibitor für NFKB wirkt. Wird dieser Inhibitor durch die Proteinkinasen IKK-1 und IKK-2 phosphoryliert, kommt es zu einer partiellen Degradation von IKB, die die Freisetzung des NFKB aus dem Komplex verursacht. Jetzt kann der Transkriptionsfaktor NFKB vom Zytosol in den Zellkern wandern und dort direkt die Expression von z.B. TNFα erhöhen. Es ist hierbei offensichtlich, dass es bei einer Hemmung der Proteinkinase IKK zu keiner Phosphorylierung der IKB und damit zu keiner Aktivierung des NFKB kommt, mit dem Resultat, dass die Expression von z.B. TNFα, aber auch anderer NFκB-abhängiger Mediatoren, nicht stimuliert wird.

So befinden sich zahlreiche p38 Kinase Inhibitoren (BIRB796 [Boehringer Ingel- heim], 681232 [GlaxoSmithKline], SCIO-469 und SCIO-323 [Scios], VX-745 [Vertex], AR 00112190 [Array Biopharma], SC-80036 [Pfizer], AMG-548 [Am- gen], Ro-320-1195 [Roche], L-167307 [Merck]), die auch indirekt die Synthese von TNFα senken, in der klinischen Entwicklung.

• In neuerer Zeit haben sich Strategien zur Blockierung des TNFα durch Antikörper gegen TNFα und lösliche TNF-Rezeptoren durchgesetzt.

Zum jetzigen Zeitpunkt sind mit Remicade^® und Humira™ zwei monoklonale anti-TNF-Antikörper von der FDA und auch von der EMEA als anti-inflammatorische Therapeutika zugelassen worden.

Remicade (Essex/Centrocor) wurde durch die FDA 1998 für die Indikation Morbus Crohn und in 2000 für die Indikation Rheumatoide Arthritis zugelassen. Momentan laufen klinische Studien für die Anwendung bei Psoriasis vulgaris und Psoriasis arthropatica. Bei Remicade handelt es sich um einen chimaeren monoklonalen Antikörper gegen das humane TNFα. In den klinischen Studien zeigte das Präparat gute bis sehr gute Wirkeigenschaften beim Morbus Crohn. Jedoch wurde über teilweise erhebliche Nebenwirkungen, wie erhöhte Infektionsgefahr, Magen-Darm Beschwerden, Kopfschmerz und allergische Reaktionen berichtet. Ein Teil der Nebenwirkungen wird auf den Maus-Anteil des monoklonalen Antikörpers zurückgeführt, der vom menschlichen Organismus als „fremd" erkannt wird, wodurch Antikörper dagegen gebildet werden. Remicade wird intravenös verabreicht und die jährlichen Medikamentenkosten belaufen sich auf über $ 12.000 pro Patient.

Humira (Abbott) ist für die Behandlung der Rheumatoiden Arthritis seit 2002 in USA und seit 2003 in Europa zugelassen. Klinische Studien zur Behandlung der Psoriasis vulgaris zeigten sehr gute Therapieerfolge. Als häufige Nebenwirkungen wurden Kopfschmerz, erhöhte Infektanfälligkeit, Magen-Darm Beschwerden und allergische Reaktionen beobachtet. Bei Humira handelt es sich um einen vollhumanisierten monoklonalen Antikörper gegen humanes TNFα. Das Präparat wird subcutan (s.c.) verabreicht. Die jährlichen Behandlungskosten belaufen sich auch bei diesem Präparat auf über $ 12.000 pro Patient.

Enbrel (Immunex/Wyeth) wurde erstmals durch die FDA 1998 für die Indikation Rheumatoide Arthritis zugelassen und seit 2000 ist das Präparat auch auf dem europäischen Markt. Die Zulassung für die Indikation Psoriasis vulgaris und Psoriasis arthropatica wird noch 2004 von der FDA erwartet. Bei Enbrel handelt es sich um ein rekombinantes (CHO-Zellen) dimeres Fusionsprotein, bei dem zwei extrazelluläre Bindungsdomänen des p75-Anteils des TNF Rezeptors an den Fc-Anteil des humanen IgGI -Moleküls angekoppelt sind und dadurch lösliches TNFα im Blut/Gewebe abbinden und somit neutralisieren kann. Laut Herstellerangaben besitzt dieses Fusionsprotein ein geringes immunogenes Potential, wohingegen aber auch Fälle beschrieben wurden, in denen eine Antikörperbildung gegen das Fusionsprotein beobachtet wurde. Als häufige Nebenwirkungen wurden allergische Reaktionen, Infektanfälligkeit und die Bildung von Auto-Antikörpern (ANA) beschrieben. Das Präparat wird subcutan verabreicht und die jährlichen Behandlungskosten belaufen sich gleichfalls auf über $ 10.000 pro Patient. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass sich das therapeutische Konzept der direkten Hemmung von TNFα als biologischer Endpunkt, als tragfähig in der Klinik erwiesen hat. Momentan stehen nur proteinogene Präparate (monoklonale Antikörper, Fusionsproteine) zur Verfügung, die eine Reihe von unerwünschten Arzneimittelnebenwirkungen aufweisen. Darüber hinaus ist deren intravenöse bzw. subkutane Applikationsform für Patienten sehr belastend und geht mit einer entsprechend schlechten Compliance einher. Die sehr hohen Herstellungs- und somit auch Behandlungskosten limitieren ebenfalls deren Einsatz.

Es besteht deshalb nach wie vor Bedarf an niedermolekularen, nichtproteinogenen Wirkstoffen, die oral verabreicht werden können und eine bessere Verträglichkeit aufweisen. Zurzeit existieren noch keine bekannten niedermolekularen Verbindungen, die selektiv die Synthese von TNFα hemmen, ohne mit anderen Stoffwechselwegen zu interagieren und keine unerwünschten Arzneimittelwirkungen aufweisen.

Es besteht die Aufgabe, neuartige, am besten niedermolekulare Wirkstoffe zu entwickeln, die zu einer signifikanten Inhibition der TNFα-Freisetzung aus relevanten humanen Zellpopulationen führen. Die Erfindung hat daher das Ziel, pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, die gut verträglich sind, beherrschbare oder keine Nebenwirkungen haben und die geeignet sind, Krankheiten wie Rheumatoid Arthritis, Asthma, COPD, Osteoporose und dergleichen erfolgreich zu behandeln. Mit den neuen Wirkstoffen sollen die Ursachen der Nachteile der bekannten Medikamente beseitigt werden. Es sollen deshalb Wirkstoffe hergestellt und verfügbar gemacht werden, welche eine TNFα-Freisetzung zuverlässig hemmen und dabei ohne oder mit nur geringen Nebenwirkungen einzusetzen sind.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass Verbindungen der Formel I zur Verfügung gestellt werden. Diese Verbindungen hemmen die TNFα-Freisetzung und sind damit zur Heilung der bezeichneten Krankheiten geeignet.

Detailierte Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verbindungen der allgemeinen Formel (1 ),

(1 )

wobei

R¹ =

- Aryl, ggf. mit Alkyl (Ci bis C₅), Alkenyl (C₂ bis C₅), O-Alkyl (C₁ bis C₅), Aryloxy (O-Aryl), Alkoxycarbonyl (Ci bis C₅), Amino, Alkylamino-, Alkylsulfonyl (Ci bis C₅), Halogen, Ci bis C₅-A!kylhalogenid, Nitro, Hydroxyl- oder CN substituiert;

- Hetaryl (C₅ bis C₇) aufweisend ein oder zwei S und/oder O und/oder N als Hete- roatome, ggf. mit Aikyl (Ci bis C₅), Alkenyl (C₂ bis C₅), O-Alkyl (Ci bis C₅), Amino- , Alkylamino-, Halogen, Ci bis C₅-Alkylhalogenid, Nitro, Hydroxyl- oder CN substituiert;

- Morpholino ; 3-Pyridyl, 4- Pyridyl,

- Cycloalkyl (C₃ bis C₇), Alkyl (Ci bis C₅), Alkenyl (C₂ bis C₅), Alkylthio (C₁ bis C₅), O-Alkyl (C₁ bis C₅), jeweils ggf. mit Halogen, Hydroxyl, Amino-, Nitro oder CN substituiert;

R² =

-H

-Alkyl (C₁ bis C₅), Cycloalkyl (C₃ bis C₇), Alkylthio (C₁ bis C₅), Alkenyl (C₂ bis C₅),

O-Alkyl , jeweils ggf. mit Halogen, Hydroxyl, CN oder Nitro substituiert,

X =

N, C-H,

Y = N-R₃ , S, mit der Maßgabe, dass X = N, wenn Y = S ist

R₃ = -H

-Alkyl (C₁ bis C₃), Cycloalkyl (C₃ bis C₇), Alkenyl (C₂ bis C₅) und Hetaryl, ggf. jeweils mit Halogen, CN oder Nitro substituiert,

Vom Schutz ausgenommen sind die folgenden Verbindungen:

R¹: Thieno, R²: Methyl, X = N, Y = S R¹: Phenyl, R²: H, X = N, Y = NH

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Verbindungen der Formel (2)

Verbindungen der Formel (2) sind substituierte 2-Aryl(HetaryI)-5-aminothieno[2,3- d]pyrimidin-6-carbonsäureamide. Die Reste R¹ und R² sind wie vorstehend definiert.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Verbindungen der Formel (3):

Verbindungen der Formel (3) sind substituierte 3-Amino-1 H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-2- carbonsäureamide bzw. 5-Amino-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-6-carbonsäureamide. Die Reste R¹ , R² und R³ sind wie vorstehend definiert, wobei X = C-H oder N.

Die Begriffe "Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkoxy (O-Alkyl), usw.", bedeuten sowohl die unverzweigten wie auch die verzweigten möglichen Verbindungen. Das gleiche gilt auch für die entsprechenden cyclischen Verbindungen.

Falls die Begriffe "Alkyl, Alkoxy, usw." bezüglich ihrer Kettenlänge nicht näher erläutert sind, so kann diese Ci bis C₅ betragen.

Falls die Begriffe "Alkenyl, Alkinyl, usw." bezüglich ihrer Kettenlänge nicht näher erläutert sind, so kann diese C₂ bis C₅ betragen.

Beispiele für Aryl-Reste sind aromatische mono-, bi- oder tricyclische Ringverbindungen, wie Phenyl., Naphthyl, Biphenyl, Anthryl.

Beispiele für Hetaryl-Reste sind mono- oder bicyclische aromatische Heterocyclen mit 5 - 7 Ringatomen, darunter ein oder zwei N- und/oder O und/oder S als Heteroatome, z.B.: Pyridin, Pyrimidin, Piperazin, Piperidin, Morpholin, Thiomorpholin, Pyrazin, Thia- zol, Thiophen, Furan, Chinolin, Isochinolin, Imidazol, Benzo[d][1 ,3]dioxol.

Halogen sind Fluor, Chlor, Brom oder lod, davon vorzugsweise Fluor oder Chlor.

Im Sinne der Erfindung gelten alle Reste als miteinander kombinierbar, soweit bei der Definition der Reste nichts anderes angegeben ist. Es sollen alle denkbaren Untergruppierungen daraus als offenbart gelten.

Die Erfindung betrifft auch physiologisch verträgliche Salze der Verbindungen der allgemeinen Formeln (1), (2) oder (3).

Die physiologisch verträglichen Salze werden auf übliche Weise durch Umsetzung basischer Verbindungen der allgemeinen Formeln mit anorganischen oder organischen Säuren, ggf. auch bei Vorliegen von Verbindungen mit aciden Eigenschaften, durch Neutralisation mit anorganischen oder organischen Basen, erhalten. Als anorganische Säuren kommen vorzugsweise Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure oder Bromwasserstoffsäure, als organische Säuren zum Beispiel Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Mandelsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Malonsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Succinsäure, Alginsäu- re, Benzoesäure, 2-, 3- und 4-Alkyloxy- und Acyloxy-benzoesäuren, Ascorbinsäure, Ci-C₃-Alkylsulfonsäuren, Benzolsulfonsäure, Nicotinsäure, Isonicotinsäure und Aminosäuren zur Anwendung.

Als anorganische Basen kommen zum Beispiel Ammoniak, Natron- und Kalilauge sowie als organische Basen Alkylamine, C₁-C₃, Pyridin, Chinolin, Isochinolin, Piperazin und -Derivate, Picoline, Chinaldin oder Pyrimidin zur Anwendung.

Weiterhin können physiologisch verträgliche Salze der Verbindungen gemäß der allgemeinen Formeln dadurch gewonnen werden, dass jene Substanzen, die als Substi- tuenten eine tertiäre Amino-Gruppe besitzen, in prinzipiell bekannter Weise mit alkyiie- renden Agentien - wie zum Beispiel Alkyl- oder Aralkylhalogeniden - in die entsprechenden quartemären Ammoniumsalze übergeführt werden können.

Die Erfindung betrifft auch Solvate der Verbindungen, einschließlich der pharmazeutisch akzeptablen Salze, Säuren, Basen und Ester sowie deren aktive Metabolite und gegebenenfalls deren Tautomere gemäß der allgemeinen Formeln einschließlich Prodrug-Formulierungen. Prodrug-Formulierungen umfassen hierbei alle jene Substanzen, die durch einfache Transformation einschließlich Hydrolyse, Oxidation, oder Reduktion entweder enzymatisch, metabolisch oder auf andere Art und Weise entstehen. Ein geeignetes Prodrug enthält beispielsweise eine Substanz der allgemeinen Formeln, die über einen enzymatisch spaltbaren Linker (z.B. Carbamat, Phosphat, N- Glycosid oder eine Disulfidgruppe an eine lösungsverbessernde Substanz (z.B. Tetra- ethylenglykol, Saccharide, Aminosäuren) gebunden ist. Ein solches Prodrug einer erfindungsgemäßen Verbindung kann einem Patienten appliziert werden, und dieses Prodrug kann in eine Substanz der allgemeinen Formeln transformiert werden, wodurch der gewünschte pharmakologische Effekt erzielt wird. Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend mindestens eine der Verbindungen gemäß Formeln (1), (2) oder (3) sowie ggf. pharmazeutisch verträgliche Hiifsstoffe und/oder Träger. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zusätzlich einen oder mehrere der folgenden Wirkstoffe enthalten:

ß2-Adrenoceptor Agonisten Dinatriumcromoglycat Korticosteroide

Leukotrien-Antagonisten (entweder Enzym-Inhibitoren [wie 5- Lipoxygenaseinhibitoren oder Arachidonsäure-Enzyminhibitoren] oder Rezep- torantagonisten) ,

Antihistaminika (bevorzugt solche mit Mastzellen-stabilisierenden Eigenschaften oder Leukotrien-antagonisierenden Aspekten) Theophyllin

Muscarinrezeptor-Antagonisten

(monoklonale) Antikörper gegen TNF-alpha oder andere Wirkstoffe, die die Bildung bzw. Freisetzung von TNF-alpha oder die Aktivität von TNF-aipha hemmen

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auf verschieden Wegen verabreicht werden, z.B. oral, parenteral, kutan, subkutan, intravenös, intramuskulär, rektal oder inhalativ. Die Verbindung wird einem Patienten, der eine Therapie einer unter das Indikationsspektrum der erfindungsgemäßen Verbindungen fallenden Krankheit bedarf, über einen vom Arzt zu bestimmenden Zeitraum verabreicht. Die Verbindung kann sowohl Menschen als auch anderen Säugern verabreicht werden.

Die Dosierung der erfindungsgemäßen Verbindungen wird vom Arzt anhand der patientenspezifischen Parameter wie z.B. Alter, Gewicht, Geschlecht, Schwere der Erkrankung, etc. bestimmt. Bevorzugt beträgt die Dosierung zwischen 0,001 mg/kg bis 100 mg/kg Körpergewicht, bevorzugt 0,01 bis 10 mg/kg Körpergewicht .

Entsprechend der Art der Verabreichung wird das Medikament in geeigneter Weise formuliert, z.B. in Form von Lösungen bzw. Suspensionen, Tabletten oder Dragees, Hart- oder Weichgelatinekapseln, Pulver zur Rekonstitution vor Gebrauch, Aerosolen, Inhalationssprays, Wirkstoffpflastern, Granulaten, Suppositorien, Ovula, Injektionspräparaten, Cremes, Salben, Gels, Mikrospheren, Implantaten, die nach üblichen galeni- schen Verfahren hergestellt werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können gegebenenfalls zusammen mit weiteren Wirkstoffen und mit in pharmazeutischen Zusammensetzungen üblichen Exzipien- tien formuliert werden, z.B. je nach herzustellendem Präparat Talk, Gummi arabicum, Lactose, Phospholipide, Stärke, Magnesiumstearat, Kakaobutter, wäßrige und nicht- wäßrige Träger, Lipide tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, Paraffin-Derivate, GIy- kole (insbesondere Polytethylenglykol), verschiedene Weichmacher, Dispergiermittel oder Emulgatoren, pharmazeutisch verträgliche Gase (z.B. Luft, Sauerstoff, Kohlendioxid usw.) und Konservierungsstoffe.

Zur Herstellung flüssiger Präparate können Additive wie Natriumchloridlösung, Etha- nol, Sorbit, Glycerin, Olivenöl, Mandelöl, Phospholipide, Propylenglycol oder Ethy- lenglycol verwendet werden.

Bei der Verwendung von Infusions- oder Injektionslösungen sind bevorzugt wässrige Lösungen oder Suspensionen, wobei es möglich ist, diese vor Gebrauch herzustellen, beispielsweise aus lyophilisierten Präparaten, die den Wirkstoff alleine oder zusammen mit einem Träger, wie Mannit, Lactose, Glucose, Albumin und dergleichen, enthalten. Die gebrauchsfertigen Lösungen werden sterilisiert und gegebenenfalls mit Hilfsmitteln vermischt, beispielsweise mit Konservierungsstoffen, Stabilisatoren, Emulgatoren, Lösungsvermittlern, Puffern und/oder Salzen zur Regulierung des osmotischen Drucks. Die Sterilisierung kann durch Sterilfiltration durch Filter geeigneter Porengröße erzielt werden, wonach die Zusammensetzung gegebenenfalls lyophilisiert werden kann. Geringe Mengen an Antibiotika können zugesetzt werden, um die Sterilität zu gewährleisten.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich auch im Rahmen von Kombinationstherapien mit schon bekannten Wirkstoffen zur Behandlung der oben genannten Erkrankungen. Dabei sollen überraschende Synergieeffekte zur Steigerung der therapeutischen Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Substanzen genutzt werden. Die Kombination kann zum einen darin bestehen, eine einzige pharmazeutische Zusammensetzung anzubieten, die mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem oder mehrere der nachfolgend genannten Wirkstoffen enthält oder dem Patienten werden gleichzeitig oder zeitlich versetzt mehrere Mittel, die einen oder mehreren der nachfolgenden Wirkstoffe enthalten, verabreicht.

Es ist bevorzugt eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Verbindungen mit einem oder mehreren der folgenden Wirkstoffe zu kombinieren:

• Corticosteroide

• (monoklonale) Antikörper gegen TNF-alpha oder andere Wirkstoffe, die die Bildung bzw. Freisetzung von TNF-alpha oder die Aktivität von TNF-alpha hemmen (z.B. rekombinante TNFα-Rezeptorkonstrukte)

• Zytokin-Antagonisten (z.B. IL-1 ß, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12)

• Chemokin-Antagonisten

• Zytokin-Agonisten (z.B. IL-10)

• immunmoduiatorische Wirkstoffe wie z.B. Cyclosporin A, Methodrexat, Leflu- nomid, D-Penicillamin, Auranofine

• Substanz P-Antagonisten

• Bradykinin-Antagonisten

• PAF-Antagonisten

• Adenosin-Rezeptor-Agonisten

• Antibiotika/Virostatika

• α-Mimetika

• Zytostatika

• ß₂-Adrenorezeptor-Agonisten (z.B. Terbutalin, Salbutanol, Salmetanol, Fenoterol, Formoterol)

• Leukotrien-Antagonisten (entweder Enzym-Inhibitoren [wie 5-Lipoxygenase- inhibitoren oder Arachidonsäure-Enzyminhibitoren] oder Rezeptorantagonisten) z.B. Pranlukast, Montelukast, Zafirlukast, Zileuton

• Antihistaminika (bevorzugt solche mit Mastzell-stabilisierenden oder Leukotrien- antagonisierenden Eigenschaften, wie z.B. Loratadin, Astemizol, Mizolastin, Olopatadin

• Theophyllin

• Muscarinrezeptor-Antagonisten, z.B. Spiriva Die Kombination mit oben aufgeführten Arzneimitteln bzw. Wirkprinzipien dient besonders dazu, den akut zu behandelnden Krankheitszustand in einem möglichst frühen Stadium in seiner Manifestation zu beeinflussen und nicht chronisch werden zu lassen, da die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit den anderen Wirkstoffen komplementäre/additive Aspekte ermöglichen. In der Kombination ergibt sich ein positiver Effekt u.a. daraus, dass eine geringere Substanzmenge pro Behandlung angewendet werden kann und damit zum einen eine Verbesserung des therapeutischen Effektes, geringere unerwünschte Arzneimittelwirkungen und zum anderen ein Spareffekt zu erreichen ist.

Abhängig von der Krankheitsausprägung und den zugrunde liegenden Symptomen können die erfindungsgemäßen Verbindungen zu den anderen Wirkstoffen in der Kombination im Verhältnis von 1 :10.000 bis 10.000:1 vorliegen.

Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen.

Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel (2) mit den zuvor aufgeführten Bedeutungen von R¹ und R² sind gekennzeichnet durch folgende Verfahrensweise (Schema 1 ):

IV

III

Schema 1

• Darstellung der 2-Aminonitrile der allgemeinen Formel IV durch Umsetzung von Acetonitril mit einem Carbonitril der allgemeinen Formel VI in Gegenwart eines Alkoxids, vorzugsweise Kalium-terf-butoxid in einem geeigneten Lösungsmittel, vorzugsweise Toluol.

• Umsetzung eines Säurehalogenids der allgemeinen Formel V mit einem Thio- cyanat, vorzugsweise Ammoniumthiocyanat, in einem geeignetem Lösungsmittel, vorzugsweise Dioxan, zum entsprechenden Acylisothiocyanat, welches mit einem 2-Aminonitril der allgemeinen Formel IV zum Pyrimidin-5-carbonitril der allgemeinen Formel III umgesetzt wird. Die Herstellung der 6-Thioxopyrimidin-5-carbonitrile der allgemeinen Formel in erfolgt analog einer Vorschrift von El-Bahaie und M.G.Assy ( Pharmazie 1990, 216) bzw. von H. Elnagdi, F.M. Abdelrazek, N.S.Ibrahim, A.Erian (Tetrahedron, 1989, 3597).

• Umsetzung der dargestellten Pyrimidin-5-carbonitrile der allgemeinen Formel πi in an sich bekannter Weise mit Chloracetamid, CICH₂CONH₂, in methanolischer oder ethanolischer Lösung in Gegenwart eines Natriumalkoxides, vorzugsweise Natriummethoxid oder Natriumethoxid, in die analogen 5-Aminothieno[2,3- d]pyrimidin-6-carbonsäureamide der allgemeinen Formel I.

• Die Verbindungen der allgemeinen Formel I sind aus den Verbindungen der allgemeinen Formel III (wobei R¹ und R² die oben genannten Bedeutungen aufweisen) auch dadurch darstellbar, dass diese Verbindungen mit Choracetamid zunächst in vorzugsweise ethanolischer Lösung in Gegenwart von vorzugsweise Triethylamin oder einem sekundären cycloaliphatischen Amin wie Morpholin, Piperidin oder Pyrrolidin zu den Verbindungen der allgemeinen Formel II (wobei R¹ und R² die oben genannten Bedeutungen aufweisen), umgesetzt werden und diese Verbindungen in einem weiteren Syntheseschritt in vorzugsweise wasserfreier ethanolischer Lösung mit einer katalytischen Menge Natriummethoxid oder Natriumethoxid durch Erhitzen unter Rückfluss gleichfalls in die oben genannten Verbindungen der allgemeinen Formel I übergeführt werden.

Verbindungen der Formel (3) sind wie folgt herstellbar:

Die Synthese der Pyridincarbonitrile (X=CH) erfolgt durch Umsetzung von 1 ,3- Diketonen mit Cyanoacetamid in einem geeigneten Lösungsmittel:

Die Synthese der Pyrimidincarbonitrile (X=N) erfolgt in drei Stufen: Die Darstellung der 2-Aminonitrile erfolgt durch Umsetzung von Acetonitril mit einem Nitril in Gegenwart eines Alkoxids, vorzugsweise Kalium-ferf-butoxid, in einem geeigneten Lösungsmittel, vorzugsweise Toluol:

Die Umsetzung eines Säurehalogenids mit Ammoniumthiocyanat wird in einem geeignetem Lösungsmittel, vorzugsweise Dioxan, durchgeführt. Das dabei entstandene Carbonsäure-isothiocyanat wird mit dem 2-Aminonitril zum Mercapto-pyrimidin- carbonitril umgesetzt:

Die Umsetzung zum Pyridincarbonitril erfolgt mit Wasserstoffperoxid in konz. Ammoniak-Lösung:

Die nachfolgenden Schritte sind für die Verbindungen mit X = N bzw. C-H identisch:

Die Chlorierung erfolgt mit Phosphoroxychlorid oder Dichlorphenylphosphinoxid.

Die Synthese des offenkettigen Amids wird mit Glycinamidhydrochlord in Gegenwart von Natriumhydrogencarbonat oder Kaliumcarbonat vorzugsweise in Ethanol, N₁N- Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid durchgeführt .

Die Cyclisierung zum Finalprodukt erfolgt vorzugsweise in Gegenwart von Natriu- methylat oder Natriumisopropylat in einem geeigneten Lösungsmittel.

Methodenbeschreibung der Hemmung der TNFα Freisetzung nach LPS Stimulation von humanem Vollblut

Die Stimulierung isolierter Leukozyten für die Freisetzung von Zytokinen kann auf verschiedenen Wegen erfolgen. Lipopolysaccharide (LPS) stellen einen Stimulus für die Untersuchung der Freisetzung von TNFα dar. LPS ist Bestandteil bakterieller Zellwände und wird beim Abtöten der Bakterien (durch Antibiotika oder das natürliche Immunsystem) freigesetzt. LPS stimuliert insbesondere die Aktivität phagozytierender Leukozyten (Gewebsmakrophagen, Granulozyten, Monozyten) und verursacht die Infiltration von Leukozyten vom peripheren Blut in das betroffene Gewebe. Ein Zytokin von besonderer Bedeutung für diese Mechanismen ist TNFα, das in großen Mengen durch die betroffenen Zellen sezemiert wird. Hauptquelle dabei sind Monozyten und Makrophagen. TNFα initiiert und prolongiert den Entzündungsprozess im Zusammenspiel mit anderen Mediatoren.

Für die Untersuchung des Effektes auf die LPS-induzierte TNFα-Freisetzung wurde eine Methode verwendet, die von MARX et al. (Marx D, Tassabehji M, Heer S, Hüt- tenbrink KB, Szelenyi I (2002) Pulmonary Pharmacology & Therapeutics 15 7-15) beschrieben wurde. Die Methodenbeschreibung in verkürzter Darstellung: Humanes Blut verschiedener Spender wird durch Zusatz von 10 mM Na-Citrat ungerinnbar gemacht und 1 :5 mit RPMI 1640 Zellkulturmedium verdünnt. Die Verbindungen der allgemeinen Formel I sowie die Kontrollsubstanzen (z.B. Dexamethason) wurden den Blutproben in verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt. 15 min später wurden die Leukozyten durch Zusatz von Lipopolysacchariden (LPS) (aus Salmonella abortus equi) in einer Endkonzentration von 1 μg/ml stimuliert. Nach Inkubation der Testansätze für 24 h bei 37 ⁰C. und unter 5% CO₂ in wassergesättigter Luft, wurde das Blut zentrifugiert und die Konzentration an TNFα im zellfreien Überstand unter Verwendung eines käuflichen ELISA (BD Biosciences) exakt nach Angaben des Herstellers vermessen.

Die nachfolgende Auflistung beinhaltet erfindungsgemäße Substanzen der allgemeinen Formeln (2) bzw. (3), die im TNFα-Hemmassay einen IC₅o-Wert von <100 nM, aber >10 nM, aufweisen und somit bevorzugt sind (Tabelle 3).

Tabelle 3

Die nachfolgende Tabelle 4 beinhaltet erfindungsgemäße Substanzen der allgemeinen Formel (2), die im TNFα-Hemmassay einen ICso-Wert von <10 nM aufweisen und somit besonders bevorzugt sind:

Tabelle 4

20 δ-Amino^-methyl^-p-tolyl-thienop.S-dJpyrimiclin-δ-carbonsäureamid

Weitere bevorzugte Verbindungen sind:

5-Amino-2,4-dimethyl-thieno[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamid

5-Amino-2-cyclopropyl-4-methyl-thieno[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamid

5-Amino-2-benzhydryl-4-methyl-thieno[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamid δ-Amino^-cyclohexyM-methyl-thienop.S-dfcyrimidin-θ-carbon- säureamid

5-amino-2-(4-bromophenyl)-4-methyl-thieno[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamid

5-Amino-4-methyl-2-(pyridin-4-yl)-thieno[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamid

5-Amino-4-methyl-2-(4-(trifluormethoxy)phenyl)-thieno[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamid

5-Amino-4-methyl-2-styryl-thieno[2,3-d]pyrimidin-6-carbonsäureamid

5-amino-2-(2,6-difluorphenyl)-4-methyl-thieno[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamid

5-Amino-2-(2-fluorphenyl)-4-methyl-thieno[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamid

5-Amino-2-(4-cyanophenyl)-4-methyl-thieno[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamid

5-Amino-4-methyl-2-o-tolyl-thieno[2,3-d]pyrimidin-6-carbonsäureamid

Methodenbeschreibunq der Hemmung der humanen Serin/Threonin Kinasen (IKK-1 und IKK-2) (MDS Pharma Services^

Rekombinante humane IKK-1 und IKK-2 wurden in Sf21 Insektenzellen exprimiert. Die rekombinanten Enzyme wurden an einer Sephadex G200 Säule aufgereinigt und konzentriert und für den enzymatischen Test eingesetzt. Das Enzym wurde für 15 min. mit der Testsubstanz (10 μM) präinkubiert und danach 30 min. mit 20 μM synthetischem Substrat-Peptid IKK-tide und [γ-³²P] ATP in 20 mM MOPS Puffer, 5 mM EGTA, 20 mM MgCI₂, 1 mM DTT, 25 mM ß-Glycerophosphat und 1 mM Na₃VO₄ bei pH 7.2 in Anwesenheit und Abwesenheit der Testsubstanz inkubiert. Die enzymatische Aktivität wurde durch Quantifizierung des synthetischen Peptides [³²P]IKK-tide bestimmt. Als signifikant positiv wurde eine Hemmung der enzymatischen Aktivität > 50 % bei 10 μM Testsubstanz angesehen.

Exemplarisch wurde für die Verbindung der allgemeinen Formel (2) (R¹=Ph, R²=Me) die mögliche hemmende Eigenschaft der IKK-1 und IKK-2 überprüft. Bei einer Konzentration von 10 μM der Testsubstanz wurden folgende Hemmwerte erhalten: IKK-1 -2% und lKK-2 21 %

Diese, sich im Grundrauschen befindliche Beeinflussung der enzymatischen Aktivität der beiden Proteinkinasen sind nicht signifikant.

Methodenbeschreibung Adenosin-Rezeptor-Bindunqsassavs (MDS Pharma Services)

Für die notwendigen Selektivitätsuntersuchungen und da bekannt ist, dass Adenosin A₃ Agonisten indirekt die Freisetzung von TNFα hemmen, wurde mit ausgewählten Substanzen des vorliegenden Patentes Bindungsstudien an den Adenosin-Rezeptoren Ai, A_2A , A₃, und den Purinnergen P₂χ und P₂γ durchgeführt. Auch hier sind bei einer Testsubstanzkonzentration von 10 μM nur Bindungen >50 % als statistisch signifikant anzusehen.

1. Adenosin-Ai-Rezeptorassay

Der humane rekombinante Adenosin-Ai-Rezeptor wurde auf CHO Zellen exprimiert. Die Testsubstanzen wurden in einer Konzentration von 10 μM für 90 min mit den CHO Zellen inkubiert. Die Zellen wurden mit 1 nM eines radioaktiv markierten Ar Adenosinrezeptor-Agonisten [³H]1 ,3-Dipropyl-8-cyclopentylxanthin vorinkubiert. Die Bindungsaktivität der Testsubstanz wurde durch Verdrängung des radiaktiv markierten Agonisten im Zellkulturüberstand bestimmt. Die detaillierte Methodenbeschreibung ist in: Liberi F et al. Cloning and functional characterization of a human A₁ adenosine re- ceptor. Biochem Biophys Res Commun (1992) 187919-926 dargelegt.

2. Adenosin-A_2A-Rezeptorassay Der humane rekombinante A_2A-Rezeptor wurde auf HEK-293 Zellen exprimiert. Die Testsubstanzen wurden in einer Konzentration von 10 μM für 90 min mit den HEK-293 Zellen inkubiert. Die Zellen wurden mit 50 nM eines radioaktiv markierten A-i-Adenosin- analogs [³H]2-p-(2-Carboxyethyl)phenethylamino-5'-N-ethylcarboxoamido-adenosin vorinkubiert. Die Bindungsaktivität der Testsubstanz wurde durch Verdrängung des radiaktiv markierten Adenosinanalogs im Zellkulturüberstand bestimmt. Die detaillierte Methodenbeschreibung ist in: Varani K et al. Pharmacological and biochemical charac- terization of purified A_2A adenosine rezeptors in human platelet membranes by [³H]CGS21680 binding. BrJ Pharmacol (1996) 117 1693-1701 dargelegt.

3. Adenosin-A₃-Rezeptorassay

Der humane rekombinante A₃-Rezeptor wurde auf CHO-K1 Zellen exprimiert. Die Testsubstanzen wurden in einer Konzentration von 10 μM für 60 min mit den CHO-K1 Zellen inkubiert. Die Zellen wurden mit 0.5 nM eines radioaktiv markierten A₃- Adenosinrezeptor-Agonisten [¹²⁵l]-6-N-(Amino-3-iodbenzyl)adenosin-5'-N-methyluron- amid vorinkubiert. Die Bindungsaktivität der Testsubstanz wurde durch Verdrängung des radiaktiv markierten Adenosinanalogs im Zellkulturüberstand bestimmt. Die detaillierte Methodenbeschreibung ist in: Olah M et al. ¹²⁵J-4-aminobenzyl-5'~N- methylcarboxyamidosdenosine, a high-affinity A₃ adenosine receptor agonist. Proc NatlAcad Sei (USA) (1994) 90 10365-10369 dargelegt.

4. Purinergic-P₂χ-Rezeptorassay

Der Purinerge-P₂χ-Rezeptor wurde auf Zellen der Harnblase von New Zealand Albino- Kaninchen genutzt. Die Testsubstanzen wurden in einer Konzentration von 10 μM für 30 min mit den Hamblasenzellen inkubiert. Die Zellen wurden mit 8.0 nM eines radioaktiv markierten ATP-Analogs [³H]α,ß-Methylen-adenosin-triphosphat vorinkubiert. Die Bindungsaktivität der Testsubstanz wurde durch Verdrängung des radiaktiv markierten ATP-Analogs im Zellkulturüberstand bestimmt. Die detaillierte Methodenbeschreibung ist in: Bo X et al. High- and low-affinity binding sites for [³H]α,ß-methylene ATP in rat urinary bladder membranes. BrJ Pharmacol (1990) 101_ 291-296 dargelegt.

5. Purinergic-P_2Y-Rezeptorassay Der Purinerge-P2_Y-Rezθptor wurde aus Zellen des Hirns von Wistar Ratten genutzt. Die Testsubstanzen wurden in einer Konzentration von 10 μM für 60 min mit den Hirnzellen inkubiert. Die Zellen wurden mit 0.1 nM eines radioaktiv markierten ATP- Analogs [³⁵S]-Adenosin-5'-O-1-thiotriphosphat vorinkubiert. Die Bindungsaktivität der Testsubstanz wurde durch Verdrängung des radiaktiv markierten ATP-Analogs im Zellkulturüberstand bestimmt. Die detaillierte Methodenbeschreibung ist in: Boyer J et al. [³²P]3'-O-(4-benzoyl)benzoyl ATP as a photoaffin ity lable for a phospholipase C- coupled P∑y-purinergic receptor. J Biol Chem (1990) 265 13515-13520 dargelegt.

Exemplarisch wurde für die Verbindungen 14, 19, 20 und 71 die mögliche Bindung an die Rezeptoren Ai, A_2A, A₃, P₂χ und P₂γ überprüft. Bei einer Konzentration von 10 μM der Testsubstanz ergaben sich folgende Bindungswerte (Tabelle 5):

Tabelle 5

Auch in diesem Bindungsassay sind bei einer Testsubstanzkonzentration von 10 μM nur Bindungen >50 % als statistisch signifikant anzusehen. Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, binden alle dargestellten Substanzen signifikant an den Adenosin Rezeptor A₃ und in unterschiedlichem Maße an die Adenosin Rezeptoren Ai und A_2A.

Auf der Grundlage der dargestellten Befunde ist nicht zwangsläufig ableitbar, ob die TNFα Freisetzungshemmung das Ergebnis einer agonistischen Wirkung am Adenosin A_2A und A₃ Rezeptor ist. Dickenson et al. konnten zeigen, dass selektive Agonisten dieser zwei Rezeptortypen die Konzentration des intrazelluläre cAMP steigern und somit zu einer Hemmung der TNFα Freisetzung führen (Dickenson JM, Reeder S, Rees B₁ Alexander S, Kendali D: Functional expression of adenosine A2A and A3 re- ceptors in the mouse dendritic cell line XS-106. Eur J Pharmacol. (2003) 474; 43-51). Baharav et al. konnten gleichfalls zeigen, dass ein niedermolekularer Adenosin A₃ Re- zeptor Agonist in der Kollagen-induzierten Arthritis der Maus zu einer Verminderung von TNFα in der Synovialflüssigkeit führt und dadurch ein signifikanter antirheumatischer Effekt erzielt wird (Baharav E, Bar-Yehuda S, Madi L, Silberman D, Rath-Wolfson L, Halpren M, Ochaion A, Weinberger A₁ Fishman P: Antiinflammatory Effect of A3 Adenosine Receptor Agonists in Murine Autoimmune Arthritis Models. J Rheumatol (2005) 32469-476).

Auch heute noch sind die zahlreichen Stoffwechselwege, die die Expression und Freisetzung von TNFα regulieren, nur in Ansätzen bekannt. Sicher erscheint jedoch, dass die TNFα-Freisetzungshemmung der erfindungsgemäßen Verbindungen nicht das Ergebnis einer Hemmung der Phosphodiesterase-4 und auch nicht der Proteinkinasen IKK-1 bzw. IKK-2 ist. Gleichfalls unwahrscheinlich erscheint die TNFα-hemmende Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen auf die Bindung der Substanzen an den Adenosin-A₃-Rezeptor zurückzuführen zu sein, da auch die Verbindungen aus der gleichen Strukturfamilie, die TNFα nicht signifikant hemmen, sich in vergleichbar signifikanter Stärke jedoch an den Adenosin-A_ß-Rezeptor binden.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1 :

Synthese von 5-Amino-4-cyclopropyl-2-phenyl-thieno[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamid

10.0 g (149 mmol) Cyclopropylcyanid und 12.2 g (298 mmol) Acetonitril werden in 700 ml Toluol gelöst und mit 33.0 g (265 mmol) Kalium-terf-butoxid (298 mmol) suspendiert. Das Reaktionsgemisch wird 24 h bei Raumtemperatur (RT) gerührt, anschließend werden 500 ml Wasser zugegeben, mit Essigester extrahiert, über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Man erhält 12.2 g (74 %) (E/Z)- 3-Amino-3-cyclopropylacrylonitril.

14.5 g (103 mmol) Benzoylchlorid und 8.6 g (113 mmol) Ammoniumthiocyanat werden in 300 ml Dioxan suspendiert und 15 min unter Rückfluss erhitzt. Anschließend werden 12.2 g (113 mmol) (E/Z)-3-Amino-3-cyclopropylacrylonitril zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 4 h unter Rückfluss erhitzt. Danach wird das Gemisch mit 500 ml Eiswasser gemischt und über Nacht stehen gelassen, anschließend filtriert und der Niederschlag getrocknet. Man erhält 13.4 g (51 %) 4-Cyclopropyl-6-mercapto-2-phenyl- pyrimidin-5-carbonitril.

12.7 g (50 mmol) 4-Cyclopropyl-6-mercapto-2-phenyl-pyrimidin-5-carbonitril und 5.6 g (60 mmol) 2-Chloracetamid werden in 300 ml Ethanol suspendiert und mit 6,8 g (265 mmol) Natriumethylat versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 3 h unter Rückfluss erhitzt. Es wird filtriert, der Niederschlag mit Ethanol und Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält 8.0 g (52 %) 5-Amino-4-cyclopropyl-2-phenyl-thieno[2,3-d] pyrimidin-6-carbonsäure-amid.

Beispiel 2:

Synthese von 5-Amino-4-methyI-2-phenyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamid

3.81 g (17 mmol) 4-Methyl-6-mercapto-2-phenyl-pyrimidin-5-carbonitril werden in einer Mischung aus 10 ml Wasser, 10 ml Ammoniak-Lösung (25%) und 4 ml Wasserstoffperoxid (30%) 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 5 ml Ammoniak- Lösung (25%) und 2 ml Wasserstoffperoxid-Lösung (30%) wird weitere 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird mit Eisessig vorsichtig angesäuert (pH 5-6), 5 ml Ethanol zugegeben, der Niederschlag abgesaugt, mit ca. 20 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält 3.2 g (89%) 4-Methyl-6-oxo-2-phenyl-pyrimidin-5- carbonitril.

2.17 g (10 mmol) 4-Methyl-6-oxo-2-phenyl-pyrimidin-5-carbonitril werden in 10 ml Phosphoroxychlorid 3 h unter Rückfluss erhitzt. Der Ansatz wird vorsichtig auf 150 g Eis gegossen und mit Natriumhydrogencarbonat neutralisiert. Der Niederschlag wird abgesaugt, mit ca. 100 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält 2.07 g (90%) 4-Chlor-6-methyl-2-phenyl-pyrimidin-5-carbonitril.

3.54 g (32 mmol) Glycinamid-hydrochlorid und 2.29 g (32 mmol) Natriumhydrogencarbonat werden in 40 ml Ethanol 45 min unter Rückfluss erhitzt. Es werden 1 ,48 g (6 mmol) 4-Chlor-6-methyl-2-phenyl-pyrimidin-5-carbonitril zugesetzt und 3 h unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen wird der Ansatz auf 30 g Eis gegossen. Der Niederschlag wird abgesaugt, mit 20 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält 1 ,40 g (82%) 2-(5-Cyano-6-methyl-2-phenyl-pyrimidin-4-yl-amino)-acetamid.

1.4 g (5 mmol) 2-(5-Cyano-6-methyl-2-phenyl-pyrimidin-4-yl-amino)-acetamid und 0.55 g (8 mmol) Natriumethylat werden in 20 ml abs. Ethanol 4 h unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen wird der Ansatz auf 50 g Eis gegossen und mit Eisessig angesäuert (pH 6). Der Niederschlag wird abgesaugt, mit 20 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält 1.18 g (84%) 5-Amino-4-methyl-2-phenyl-7H-pyrrolo[2,3- d]pyrimidin-6-carbonsäureamid.

Beispiel 3:

Synthese von 3-Amino-4-trifluormethyl-6-pyridin-4-yl-1 H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-2- carbonsäureamid

10.O g (39 mmol) 4,4,4-Trifluor-1-(pyridin-4-yl)-butan-1 ,3-dion-hydrochlorid, 4,0 g (47 mmol) 2-Cyanoacetamid und 7 ml Triethylamin werden in 100 ml Ethanol 3 h unter Rückfluss erhitzt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt. Zu dem öligen Rückstand werden 20 ml Wasser zugesetzt und es wird mit Eisessig angesäuert (pH 6). Der Niederschlag wird abgesaugt, mit 20 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält 6.8 g (65%) 4-Trifluormethyl-2-oxo-6-pyridin-4-yl-pyridin-3-carbonitril.

6,74 g (25 mmol) 2-Oxo-6-pyridin-4-yl-4-trifluormethyl-pyridin-3-carbonitril werden in 32 ml Phosphoroxychlorid 2 h unter Rückfluss erhitzt. Der Ansatz wird vorsichtig auf 150 g Eis gegossen und mit Natriumhydrogencarbonat neutralisiert. Der Niederschlag wird abgesaugt, mit ca. 50 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält 6,0 g (85%) 2-Chlor-4-trifluoromethyl-6-pyridin-4-yl-pyridin-3-carbonitril.

Unter Stickstoff-Atmosphäre werden 0.47 g (4 mmol) Glycinamid-hydrochlorid und 1.2 g (9 mmol) Kaliumcarbonat in 7 ml N,N-Dimethylformamid (wasserfrei) 15 min bei 50 ⁰C gerührt. Es werden 0,3 g (1 mmol) 2-Chlor-4-trifluoromethyl-6-pyridin-4-yl- pyridin-3-carbonitril zugesetzt und 2 h bei 90 ⁰C gerührt. Nach Abkühlen wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Zu dem Rückstand werden 20 ml Wasser gegeben und es wird mit Eisessig angesäuert (pH 5). Der Niederschlag wird abgesaugt, mit 50 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält 0.15 g (47%) 2-(3-Cyano-4- trifluormethyl-6-pyridin-4-yl-pyridin-2-yl-amino)-acetamid.

0.13 g (0.4 mmol) 2-(3-Cyano-4-trifluormethyl-6-pyridin-4-yl-pyridin-2-yl-amino)- acetamid und 0.06 g (0.8 mmol) Natriumethylat werden in 10 ml abs. Ethanol 4 h unter Rückfluss erhitzt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt. Zu dem öligen Rückstand werden 10 ml Wasser gegeben und es wird mit Eisessig angesäuert (pH 6). Der Niederschlag wird abgesaugt, mit 5 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Das Rohprodukt wird mittels präparativer RP-HPLC gereinigt. Man erhält 0.02 g (15%) 3- Amino-4-trifluormethyl-6-pyridin-4-yl-1 H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-2-carbonsäureamid.

Beispiel 4:

Synthese von 1 -Allyl-3-amino-4-trifluormethyl-6-pyridin-4-yl-1 H-pyrrolo[2,3- b]pyridin-2-carbonsäureamid

Unter Stickstoff-Atmosphäre werden 1 ml (14 mmol) Allylamin, 1.9 g (20 mmol) ChIo- racetamid und 1 ,9 g (14 mmol) Kaliumcarbonat in 20 ml N,N-Dimethylformamid (wasserfrei) 24 h bei 50 ⁰C gerührt. Nach Zugabe von 2.4 g (8 mmol) 2-Chlor-4- trifluoromethyl-6-pyridin-4-yl-pyridin-3-carbonitril und 1.1 g (8 mmol) Kaliumcarbonat wird 7 h bei 90 ⁰C gerührt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt. Zu dem Rückstand werden 20 ml Wasser gegeben und es wird mit Eisessig angesäuert (pH 6). Der Niederschlag wird abgesaugt, mit 5 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Das Rohprodukt wird mittels Flash-Chromatographie (Kieselgel, Gradient: Metha- nol/Dichlormethan 0/100 auf 5/100) gereinigt. Man erhält 0.25 g (9%) 2-(N-Allyl-N-(3- cyano-4-trifluoromethyl-6-pyridin-4-yl-pyridin-2-yl)-amino)-acetamid.

0.22 g (0.6 mmol) 2-(N-Allyl-N-(3-cyano-4-trifluoromethyl-6-pyridin-4-yl-pyridin-2-yl)- amino)-acetamid und 0.04 g (0.6 mmol) Natriumethylat werden in 10 ml abs. Ethanol 2 h unter Rückfluss erhitzt. Es werden 20 ml Eiswasser zugegeben. Der Niederschlag wird abgesaugt, mit 30 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält 0.18 g (83%) 1-Allyl-3-amino-4-trifluormethyI-6-pyridin-4-yl-1 H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-2- carbonsäureamid.

Die nachfolgenden Verbindungen (Tabelle 6 und Tabelle 7) wurden analog Beispiel 1 dargestellt.

Tabelle 6

Tabelle 7

Säule: CROM Resolution Star Cie, 100 A₁ 5 μm, 4.6x50 mm

Eluent A: 0.1 % TFA / Wasser, B: 0.09 % TFA Acetonitril; Flussrate: 1 ml/min; Temp.: 25 ⁰C; λ: 254 nm;

Gradient (linear) B: 0-0.5 min: 20 %, 0.5-5 min: 20-100 %, 5-7 min: 100 %, 7-7.3 min: 100-20 %, 7.3- 9 min 20 %

" Säule: CROM Resolution Star Ci₈, 100 A, 5 μm, 4.6x50 mm

Eluent A: 0.1 % TFA / Wasser, B: 0.09 % TFA Acetonitril; Flussrate: 1 ml/min; Temp.: 25 ⁰C; λ: 254 nm; Gradient (linear) B: 0-0.5 min: 50 %, 0.5-4 min: 50-100 %, 4-6 min: 100 %, 6-6.3 min: 100-50 %, 6-8 min: 50 % n.d. nicht detektiert

Die nachfolgenden Verbindungen (Tabellen 8, 9, 10 und 11 ) entsprechen den Verbindungen in den Beispielen 2, 3 und 4.

Tabelle 8:

Tabelle 9:

Tabelle 10:

Tabelle n :

Retentionszeit (t_R) und Reinheit durch HPLC bestimmt:

Säule: CROM Resolution Star Ci₈, 100 A, 5 μm, 4.6x50 mm

Eluent A: 0.1 % TFA /Wasser, B: 0.09 % TFA Acetonitril; Flussrate: 1 ml/min; Temp.: 25 ⁰C; λ: 254 nm;

Claims

Patentansprüche

1. Verbindung der allgemeinen Formel (1),

(1 )

wobei

R¹ =

- Aryl, ggf. mit Alkyl (Ci bis C₅), Alkenyl (C₂ bis C₅), O-Alkyl (C₁ bis C₅), Aryloxy (O-Aryl), Alkoxycarbonyl (Ci bis C₅), Amino, Alkylamino-, Alkylsulfonyl (Ci bis C₅), Halogen, Ci bis C₅-Alkylhalogenid, Nitro, Hydroxyl- oder CN substituiert;

- Hetaryl (C₅ bis C₇) aufweisend ein oder zwei S und/oder O und/oder N als Hete- roatome, ggf. mit Alkyl (C₁ bis C₅), Alkenyl (C₂ bis C₅), O-Alkyl (Ci bis C₅), Amino- , Alkylamino-, Halogen, C₁ bis C₅-Alkylhalogenid, Nitro, Hydroxyl- oder CN substituiert;

- Morpholino ; 3-Pyridyl, 4- Pyridyl,

- Cycloalkyl (C₃ bis C₇), Alkyl (C₁ bis C₅), Alkenyl (C₂ bis C₅), Alkylthio (C₁ bis C₅), O-Alkyl (C₁ bis C₅), jeweils ggf. mit Halogen, Hydroxyl, Amino-, Nitro oder CN substituiert;

R² =

-H -Alkyl (C₁ bis C₅), Cycloalkyl (C₃ bis C₇), Alkylthio (C₁ bis C₅), Alkenyl (C₂ bis C₅), O-Alkyl , ggf. jeweils mit Halogen, Hydroxyl, CN oder Nitro substituiert,

X =

N, C-H,

Y =

N-R₃ , S, mit der Maßgabe, dass X = N, wenn Y = S ist

R₃ = -H

wobei die folgenden Verbindungen vom Schutz ausgenommen sind:

R¹: Thieno, R²: Methyl, X = N, Y = S R¹: Phenyl, R²: H, X = N, Y = NH

2. Verbindung nach Anspruch 1 , wobei diese die Formel (2) aufweist

(2) wobei die Substituenten R¹ und R² die oben angegebene Bedeutung haben und die Verbindung mit R¹: Thieno, R²: Methyl vom Schutz ausgenommen ist.

3. Verbindung nach Anspruch 1 , wobei diese die Formel (3) aufweist:

wobei die Substituenten R¹ und R² die oben angegebene Bedeutung haben und die Verbindung mit R¹: Phenyl , R²: H vom Schutz ausgenommen ist.

4. Verbindung nach Anspruch 3, wobei die Reste R¹-R³ und X die folgenden Bedeutungen haben:

Ri^Phenyl.F^Mθthyl, Ra=H, X=N R₁₌4-p_yridy|, R₂=CF_3; R₃=AiIyI, X=N R₁₌4.pyridy|, R₂=CF_3; R₃=H, X=N

5. Verbindung nach Anspruch 1 , 2 oder 3 , dadurch gekennzeichnet, daß sie aus der folgenden Liste ausgewählt ist:

5-Amino-4-methyl-2-phenyl-thieno[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamid

5-Amino-2-(4-brom-2-fluorphenyl)-4-methyl-thieno[2,3- d]pyrimidin-6-carbonsäureamid

5-Amino-2-(4-terf-butyl-phenyl)-4-methyl-thieno[2,3- d]pyrimidin-6-carbonsäureamid

5-Amino-4-methyl-2-styryl-thieno[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamid

5-Amino-4-methyl-2-(2-hydroxyphenyl)-thieno[2,3- d]pyrimidin-6-carbonsäureamid

5-Amino-4-methyl-2-(4-nitrophenyl)-thieno[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamid

5-Amino-4-methyl-2-(thiophen-2-yl)-thieno[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamid

5-Amino-4-methyl-2-(4-n-propoxyphenyl)-thieno[2,3- d]pyrimidin-6-carboxamid

5-Amino-2-(3-fluoφhenyl)-4-methyl-thieno[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamid

5-Amino-4-methyl-2-/77-tolyl-thieno[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamid

5-Amino-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-4-methyl-thieno[2,3- d]pyrimidin-6-carboxamid

5-Amino-4-methyl-2-phenyl-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamid

5-Amino-2-(2-naphthyl)-4-methyI-thieno[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamid

5-Amino-2-(4-chlorphenyl)-4-methyl-thieno[2,3-d]pyrinnidin- 6-carbonsäureamid

5-Amino-4-methylthio-2-phenyl-thieno[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamid

5-Amino-4-methyl-2-(4-/so-propoxyphenyI)-thieno[2,3- d]pyrimidin-6-carboxamid

5-Amino-2-(4-ethylphenyl)-4-methyl-thieno[2,3-d]pyrimidin- 6-carbonsäureamid

5-amino-2-(4-biphenyl)-4-methyl-thieno[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamid

5-amino-2-(4-bromphenyl)-4-methyl-thieno[2,3-d]pyrimidin- 6-carbonsäureamid

5-Amino-2-(4-methoxyphenyl)-4-methyl-thieno[2,3- d]pyrimidin-6-carboxamide

5-Amino-4-methyl-2-p-tolyl-thiθno[2,3-d]pyrimidin-6- carbonsäureamid

3-Amino-4-trifluormethyl-6-pyridin-4-yl-1 H-pyrroIo[2,3- b]pyridin-2-carbonsäureamid

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1-5 sowie übliche Hilfs- und Trägerstoffe.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 6 zur oralen Gabe oder zur Injektion oder zur Verabreichung als Spray oder als medizinisches Pflaster.

8. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 2, wobei Pyrimidin-5- carbonitrile der allgemeinen Formel III mit Chloracetamid in Ethanol unter Zusatz von Natriumethylat in der Wärme umgesetzt werden.

9. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 3 mit den Schritten:

I

10. Verwendung mindestens einer der Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1-5 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibition der TNFα- Freisetzung.

11. Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei die TNFα-Freisetzung zur Behandlung von Entzündungen, Rheumatoider Arthritis, Asthma, COPD und Osteoporose gehemmt werden soll.