WO2006095775A1 - 水溶性ヒアルロン酸修飾物とｇｌｐ－１アナログの結合体 - Google Patents

水溶性ヒアルロン酸修飾物とｇｌｐ－１アナログの結合体 Download PDF

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WO2006095775A1
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glp
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hyaluronic acid
amino acid
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PCT/JP2006/304480
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Teruo Nakamura
Tatsuya Kato
Hideyuki Togawa
Kenji Yasugi
Hiroko Konishi
Yasuo Sekimori
Tsuyoshi Shimoboji
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates

Definitions

  • the present invention relates to a conjugate of a water-soluble hyaluronic acid modified product and a GLP-1 analog (conjugate) useful as a preventive or therapeutic agent for diabetic complications and obesity caused by diabetes and hyperglycemia. ), And a preventive or therapeutic agent for diabetic complications and obesity caused by persistent diabetes and hyperglycemia, including the conjugates thereof.
  • Glucagon-like peptide 1 is a peptide that also has a 31 amino acid power that is secreted from small intestinal L cells in response to food intake. It is known to act on spleen beta cells, promote insulin secretion, and reduce serum glucose level (see Non-Patent Document 1). This effect is low, sometimes not seen, which means that the risk of hypoglycemia is low.
  • GLP-1 has the effect of proliferating beta cells that produce insulin, inducing differentiation from progenitor cells, It is known to have a strong S such as glucagon secretion inhibitory effect, gastric emptying delay effect or feeding inhibitory effect (see Non-Patent Document 1), and it is also useful for diabetic complications and obesity caused by diabetes and hyperglycemia. Expectation for use as a preventive or therapeutic agent is high. However, due to degradation by dipeptidyl peptidase IV (DPPIV) and excretion from the kidney, GLP 1 has a short blood half-life of only a few minutes. Diabetes complications and obesity caused by diabetes and hyperglycemia In order to use it as a preventive or therapeutic agent, frequent administration is required. Various GLP-1 analogs and derivatives (analogues) that maintain biological activity and confer DPPIV resistance have been reported (see Patent Documents 1 to 8), but since renal excretion cannot be avoided, blood stagnation Extension of residence time is not enough.
  • DPPIV dipeptidyl
  • drugs and water-soluble polymers are used for the purpose of improving retention in blood, improving stability, improving solubility, reducing antigenicity, etc. of low molecular weight drugs, peptide drugs, protein drugs and the like.
  • PEG polyethylene glycol
  • Neo Quartz has already been put to practical use as a medicine.
  • PEG is not a biodegradable polymer, there are no clear problems such as safety when it accumulates in the body after long-term administration.
  • Hyaluronic acid (hereinafter also referred to as "HA") is a polysaccharide isolated from the vitreous of bovine eyes by K. Meyer in 1934 and has long been known as the main component of the extracellular matrix. ing. HA is a type of darcosamide darican that also has a disaccharide unit force in which D-glucuronic acid and N-acetylyldarcosamine are linked by a j8 (1 ⁇ 3) glycosidic bond.
  • Hyaluronic acid is a metabolite of hyaluronic acid even in humans where there are no species differences in its chemical and physical structure. Furthermore, it can be said that it is a very safe biomaterial in terms of immunity or toxicity.
  • hyaluronic acid As a carrier for drug conjugates are that it has biodegradability, can be enormously sized, and has many Since it has a reaction point, it means that multiple drugs (multiple drugs or two or more drugs) can be carried in one molecule.
  • the use of hyaluronic acid having such advantages as a drug conjugate carrier provides a means for designing and developing conjugates having higher pharmacokinetic control functions such as targeting and sustained release.
  • hyaluronic acid is biodegradable and has no species difference in its chemical structure. Therefore, it can be said that it is a carrier superior to PEG in terms of safety.
  • hyaluronic acid itself has a short residence time in the blood and has a half-life of 2 minutes by intravenous administration (hereinafter also referred to as "iv") (see Non-Patent Document 4). Even in the study by the present inventors, it was not confirmed that the retention time of the drug in blood or the improvement in the sustained efficacy of the drug was increased simply by conjugating hyaluronic acid to the drug.
  • the main metabolic sites of hyaluronic acid are the liver and lymph gland, and its metabolism is mainly taken up into cells via cell membrane localized receptors that specifically bind to hyaluronic acid such as CD44, RHAMM, HAR E and the like.
  • the modified hyaluronic acid is considered to be superior in terms of residence time in blood.
  • a hyaluronic acid modified product obtained by amidating a carboxy group of hyaluronic acid by converting hyaluronic acid into a tetrabutylammonium salt and reacting with a substituent in dimethyl sulfoxide (see Patent Document 7)
  • the present invention is intended to prepare a crosslinked product, and is not intended to improve retention in blood.
  • 1,1-carbodiimidazole (hereinafter also referred to as “CDI”) is used as a condensing agent.
  • water-soluble hyaluronic acid modified products that are practical as drug carriers, and in particular, water-soluble hyaluronic acid modified products that extend the residence time in blood to a practical level are known.
  • Patent document 1 International publication W091Z11457 pamphlet,
  • Patent Document 2 JP-A-11Z310597,
  • Patent Document 3 International Publication WO99Z43705 Pamphlet
  • Patent Document 4 International Publication WOOOZ069911 Pamphlet
  • Patent Document 5 International Publication W095Z31214 Pamphlet
  • Patent Document 6 International Publication WO00Z07617 Pamphlet
  • Patent Document 7 International Publication WO03Z103572 pamphlet
  • Patent Document 8 International Publication WO97Z29180 Pamphlet
  • Patent Document 9 International Publication WO92Z06714 Pamphlet
  • Patent Document 10 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-81103
  • Patent Document 11 JP-A-2-273176
  • Patent Document 12 Japanese Patent Laid-Open No. 5-85942
  • Patent Document 13 International Publication WO01Z05434 Pamphlet
  • Patent Document 14 International Publication WO01Z60412 Pamphlet
  • Patent Document 15 Special Table 2002-519481
  • Patent Document 16 International Publication W094Z19376 Pamphlet
  • Patent Document 17 International Publication WO04Z022004 Pamphlet
  • Patent Document 18 International Publication WO03Z040309 Pamphlet
  • Non-patent literature l Trends Pharacol. Sci. 24th, 377-383, 2003
  • Non-Patent Document 2 Int. J. Pharm. 255, 167-174, 2003
  • Non-Patent Document 3 Control. Rel. 88-35, 42-2003, 2003
  • Non-Patent Document 4 J. Inter. Med. 242, 27-33, 1997
  • Non-Patent Document 5 Exp. Cell Res. 228, 216-228, 1996
  • the problem to be solved by the invention is a GLP-1 analog conjugate useful for the prevention or treatment of chronic diseases such as diabetes, hyperglycemia, diabetic complications, or obesity. It is to provide a GLP-1 analog conjugate that has a stable blood residence time and is biodegradable and safe. Furthermore, another object of the present invention is to provide a method for producing the GLP-1 analog conjugate, a GLP-1 analogue that can be used for producing the conjugate, a pharmaceutical composition containing the conjugate, and a therapeutic method.
  • the present inventor has intensively studied to solve the problem to be solved.
  • a specific condensing agent is used in an aprotic polar solvent, and the glucuronic acid carboxy of hyaluronic acid or its derivative is used.
  • the binding strength of water-soluble hyaluronic acid modification product and GLP-1 analog obtained by introducing a substituent to the group with an amide bond was found to have a practical level of residence time in blood. It has been found that it has a continuous hypoglycemic action and has completed the present invention.
  • GLP-1 analog binds to the hyaluronic acid modification product via a polyvalent, preferably divalent linking group.
  • the salt of the above hyaluronic acid peptide conjugate is not particularly limited, but for example, a pharmaceutically acceptable salt (eg, acid addition salt (eg, hydrochloride, sulfate, hydrobromide, acetate, phosphate, etc.) And base addition salts (for example, sodium, potassium, magnesium, calcium, aluminum, ammonium-, tetraptylammo-, etc.) salts.
  • a pharmaceutically acceptable salt eg, acid addition salt (eg, hydrochloride, sulfate, hydrobromide, acetate, phosphate, etc.)
  • base addition salts for example, sodium, potassium, magnesium, calcium, aluminum, ammonium-, tetraptylammo-, etc.
  • the water-soluble modified hyaluronic acid is not particularly limited. A compound in which a carboxyl group contained in a molecule is converted to a substituted amide group is used.
  • the water-soluble hyaluronic acid modified product used in the present invention is preferably such that 70% or more of the carboxy group contained in the glucuronic acid moiety of hyaluronic acid has been converted to an N-substituted amide group, wherein the hyaluronic acid
  • the substituents of each N-substituted amide group in the acid-modified product may be the same or different, and at least one of the substituents may be a divalent linking group that links to the GLP-1 analog.
  • the GLP-1 analog is, for example, at the C-terminus of GLP-1 (1-36) or GLP-1 (7-36) -Xa-Cys Is a peptide consisting of a sequence obtained by substituting a natural or unnatural amino acid for the 8th-position alanine (Ala 8 ) in the amino acid sequence to which the amino acid sequence represented by May be converted to an amide group.
  • the natural or non-natural amino acid to be substituted with the alanine includes, for example, glycine, serine, parin, leucine, isoorthoicine, threonine, methionine, phenylalanine, aspartic acid, glutamine, arginine, and aminoamino acid.
  • the alanine is substituted with an amino acid from which glycine, serine, norin, leucine, isoleucine and threonker are also selected, more preferably glycine and serine.
  • the GLP-1 analog used in the present invention comprises:
  • Xa is as defined above, and includes, for example, direct bond or Gly—Pro—Pro Pro.
  • the GLP-1 analog may be GLP-1 (l-36), GLP-1 (1-37), GLP-1 (7-36), or GLP-1 (7- 37), an amino acid sequence attached with a mercapto compound represented by Qa-SH, or an amino acid in which 1 to 5 amino acids are deleted, substituted and Z or added in the amino acid sequence.
  • a peptide that also has sequence power the amino acid sequence may be replaced by natural amino acids and Z or non-natural amino acids
  • Qa is selected from 1 NH—X 5 , 1 CO—X 5 or 1 CONH—X 5 and linked to the carboxy group, amino group or hydroxyl group contained in the C-terminal amino acid residue of the peptide to form an amide bond Form urea bonds or ester bonds,
  • X 5 is a C alkylene group, wherein the alkylene group is substituted at one or more points of the alkylene group.
  • An oxygen atom may be inserted between two carbon atoms contained in the alkylene group.
  • the carbon atom of the alkylene group is selected from a hydroxyl group and a C alkyl group.
  • hyaluronic acid-peptide conjugate as described above, or a salt thereof, which may be independently substituted with the above substituents.
  • the divalent linking group has the formula (I):
  • Q is a C alkylene group (for example, including a C alkylene group).
  • An oxygen atom may be inserted between two carbon atoms contained in the alkylene group at one or more positions of the alkylene group, and carbon atoms contained in the alkylene group at one or more positions of the alkylene group.
  • CO—, —N HCO or CONH may be inserted between atoms or at the end !, and the carbon atom of the alkylene group may be independently substituted with one or more substituents selected from hydroxyl group and C alkyl group power.
  • X is -CH -CH- **, -CH -CH -CH **, or-CH (-CH)-CH
  • R is a hydrogen atom or a C alkyl group
  • the above-mentioned divalent linking group includes, for example, formula (la):
  • the carbon atom of the alkylene group, in which an oxygen atom is inserted between two carbon atoms contained in the alkylene group, is selected from a hydroxyl group and a C alkyl group.
  • X 1 is CH -CH— **, -CH -CH -CH **, or — CH (—CH) — CH
  • R 1 is a hydrogen atom or a C alkyl group
  • X 1 is the formula (lb):
  • Q is a C alkylene group, wherein at one or more points of the alkylene group,
  • an oxygen atom may be inserted between the two carbon atoms contained in the alkylene group, and the carbon atom of the alkylene group is selected from a hydroxyl group and a C alkyl group.
  • X 2 is CH -CH— **, -CH -CH -CH **, or — CH (— CH) — CH
  • R 2 is a hydrogen atom or a C alkyl group; or X 2 and R 2 together with the carbon and nitrogen atoms to which they are attached, the formula (lib)
  • X 2 is the formula (Ic):
  • an oxygen atom may be inserted between the two carbon atoms contained in the alkylene group, and the carbon atom of the alkylene group is selected from a hydroxyl group and a C alkyl group.
  • X 3 is —CH—CH — **, —CH—CH—CH — **, —CH (—CH) —CH — **
  • R 3 is a hydrogen atom or a C alkyl group
  • the bivalent coupling group represented by these is also included.
  • Q 1 represents, for example, the formula: — (CH 2) — or — (CH 2) — (O— C
  • n is an integer independently selected from, for example, 1-20, preferably 1-15, more preferably 2-10, and n is, for example, 1-200, preferably 1-25, More preferably, it is an integer selected from 1 to 4]
  • X 1 represents, for example, the formula: 1 (CH 2) —CH— (O—CH—CH 2) 1
  • m is an integer selected from, for example, 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably 2 to 10, and ⁇ is, for example, 1 to 200, preferably 1 to 25, more preferably 1 ⁇ 4 forces are integers selected, q and r are integers selected from, for example, 1-20, preferably 1-15, more preferably 1-10 , Y 1 is the formula (lie):
  • ** may represent a group represented by GLP-1 represents the bonding position of the mercapto group of the analog to the sulfur atom].
  • Ra ⁇ Ra ⁇ Ra "" and Ra 4 are each independently a hydrogen atom, or C alkyl group
  • x ° represents X or X 1 as defined above
  • n is an integer selected from, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10,
  • n is, for example, an integer selected from 1 to 200, preferably 1 to 25]
  • the substitution introduced on the nitrogen atom of the amide group One or more of the groups are of the formula (IV)
  • hyaluronic acid peptide conjugate as described above, or a salt thereof, which is a group represented by the formula:
  • the modification ratio of the N substitution amide group of the carboxy group contained in the hyaluronic acid is 70 mole 0/0 above, already hyaluronic acid peptide conjugate according, Or a salt thereof is also provided.
  • the introduction ratio of the amide group substituted by the linking group bonded to the GLP-1 analog to the carboxy group contained in one molecule of hyaluronic acid is, for example, an average of 0.1 mol% or more by and is 15 mol% or less, preferably 0.1 mol% to 10 mol 0/0, more preferably from 0.1 mol% to 5 mol 0/0.
  • the average molecular weight of the hyaluronic acid GLP-1 analog conjugate according to the present invention is, for example, 5,000 daltons to 1,000,000 daltons, preferably 10,000 daltons to 300,000 daltons, more preferably 8 when measured as a viscosity average molecular weight. 10,000 Dalton to 300,000 Dalton.
  • a pharmaceutical composition comprising a hyaluronic acid peptide conjugate as described above, or a salt thereof.
  • the administration method of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and can be administered by methods well known to those skilled in the art. For example, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, intranasal administration It can also be administered by means selected from administration and pulmonary administration.
  • a disease selected from diabetes, hyperglycemia, diabetic complications, and obesity comprising the hyaluronic acid peptide conjugate described above or a salt thereof.
  • a medicament for use in the prevention or treatment of is provided.
  • diabetes, hyperglycemia, diabetic complications, comprising administering a therapeutically effective amount of the hyaluronic acid peptide conjugate described above or a salt thereof Also provided are methods for preventing or treating selected diseases.
  • R 1Q , R U , R 12 , R 13 , R 14 and R 15 are each independently selected from C alkyl groups.
  • R 10 and R U , R 12 and R 13 , and R “and R 15 may each independently form a nitrogen-containing heterocycle with the nitrogen atom to which they are attached.
  • Ring B is a substituted or monocyclic or condensed nitrogen-containing heterocyclic group, and X— represents a cation]
  • a step of converting a carboxyl group contained in the glucuronic acid moiety of hyaluronic acid into an N-substituted amide group to obtain a water-soluble hyaluronic acid modified product using a condensing agent represented by A method for producing an acid peptide conjugate or a salt thereof is provided.
  • the aprotic polar solvent for example, dimethylformamide, dimethylacetamide, dimethyl sulfoxide, 1,3 dimethyl-2-imidazolidinone, sulfolane, N-methylpyrrolidone, or a mixed solvent of two or more of these is used. Can be done.
  • dimethyl sulfoxide can be used as the aprotic polar solvent.
  • ring B is preferably benzotriazole-1-yl, and examples of the condensing agent represented by the above formula (V) include benzotriazole-1-yloxy.
  • Monotris (dimethylamino) phospho-hexafluorophosphate, benzotriazole-1-ylxoxoliths (pyrrolidino) phospho-hexafluorophosphate, and these A BOP condensing agent selected from the mixture is included.
  • Xa is a direct bond or a sequence of 1 to 9 amino acids that are independently selected for proline, glycine, serine, and glutamate, and the carboxy group of the C-terminal cysteine of the peptide.
  • the GLP-1 analog is represented by one Xa-Cys at the C-terminus of GLP-1 (1-36) or GLP-1 (7-36).
  • Alanine (Ala 8 ) at position 8 of the amino acid sequence is substituted with a natural or non-natural amino acid !, and the C-terminal cysteine carboxy group of the peptide is Xa which may be converted to an amide group is as defined above.
  • the natural or non-natural amino acid substituted for the alanine includes, for example, glycine, serine, parin, leucine, isoleucine, threonine, methionine, ferrolanine, aspartic acid, glutamine, arginine, and aminobutyric acid.
  • the alanine is substituted with an amino acid selected from glycine, serine, norrin, leucine, isoleucine and threonine, more preferably an amino acid selected from glycine and serine.
  • the GLP-1 analog includes, for example, a peptide represented by SEQ ID NO: 1, or a peptide in which the C-terminal cysteine carboxy group of the peptide is converted to an amide group.
  • Xa is a direct bond or Gly—Pro—Pro—Pro.
  • the water-soluble hyaluronic acid-modified product is not particularly limited, and is capable of degrading force hyaluronic acid into disaccharides of its constituent units and the non-reducing end of the degradation product.
  • the water-soluble hyaluronic acid modification product is decomposed with a hyaluronanidase that produces an unsaturated disaccharide degradation product having ⁇ 4, 5 glucuronic acid residues, and 232 ⁇ of the resulting degradation product is obtained.
  • the fraction of absorption derived from disaccharides relative to the total absorption derived from degradation products is 30% or less.
  • FIG. 1 is an example of GPC data after treatment with a hyaluronidase of a water-soluble hyaluronic acid modification product that can be used in the present invention.
  • FIG. 2 is an example of NMR data of a water-soluble hyaluronic acid modification product that can be used in the present invention.
  • FIG. 3 is an example of NMR data of a water-soluble hyaluronic acid modification product obtained by converting an amino group of a water-soluble hyaluronic acid modification product that can be used in the present invention into a carboxylic acid (Example 2-2).
  • FIG. 4 is an example of GPC data after treatment with hyaluronan-dase of a water-soluble hyaluronic acid modification product obtained by converting an amino group of a water-soluble hyaluronic acid modification product that can be used in the present invention into a carboxylic acid.
  • FIG. 5 shows an example of NMR data of a water-soluble hyaluronic acid modification product that can be used in the present invention (Example 3-1).
  • FIG. 6 is a graph showing changes in blood concentration of fluorescently labeled HA modified products having different molecular weights.
  • FIG. 7 shows an example of NMR data of a water-soluble hyaluronic acid modification product that can be used in the present invention (Example 4-1).
  • FIG. 8 is a graph showing changes in blood concentration of fluorescently labeled HA modified products having a different amino group modification rate synthesized from molecular weight 200 kDa HA.
  • FIG. 10 is a graph showing changes in plasma concentration when HA-GLP-1 analog 1 conjugate is intravenously administered to rats.
  • FIG. 11 An example of GPC data for HA-GLP-1 analog 2 conjugate and control compound.
  • FIG. 12 is a graph showing changes in plasma concentration when HA-GLP-1 analog 2 conjugate is intravenously administered to rats.
  • FIG. 13 is a graph showing changes in plasma concentration when HA-GLP-1 analog 1 conjugate is intravenously administered to rats.
  • the water solubility of the modified hyaluronic acid used in the present invention is not particularly limited as long as the resulting hyaluronic acid-peptide conjugate exerts the desired effect.
  • a modified hyaluronic acid having a solubility of LOOOmgZmL, preferably 1 to 100mgZmL can be used in the present invention.
  • the water-soluble hyaluronic acid modification product used in the present invention uses a condensing agent in a solvent such as an aprotic polar solvent, and the carboxyl group of glucuronic acid of hyaluronic acid or its derivative is N -It can be obtained by converting to a substituted amide group.
  • the modification rate in the water-soluble HA modified product is the ratio of the modified carboxy group, that is, the ratio of the carboxy group converted to the N-substituted amide group.
  • the lower limit of the N-substituted amide group introduction rate of the water-soluble HA modified product used in the present invention is preferably 70% or more, more preferably 85 mol% or more.
  • the upper limit of the introduction rate should be 100 mol% or less.
  • the conversion reaction to the N-substituted amide group can be carried out by using hyaluronic acid or its derivatives and various amines using an appropriate condensing agent.
  • the amines used here are not particularly limited, but for example, the following formula:
  • n present is each independently an integer from which, for example, 1 to 20, preferably 1 to: L0 force is also selected,
  • n present is independently an integer selected from, for example, 1 to 200, preferably 1 to 25 And
  • Each p present is independently an integer selected from, for example, 0-20, preferably 0-10,
  • Each R 5 present is independently selected from a hydrogen atom, a C alkyl group and a hydroxyl group;
  • R 6 each independently represents a protecting group for a hydrogen atom, a C alkyl group and a mercapto group (for example,
  • a pyridylsulfide group for example, a pyridylsulfide group, a acetyl group, a trityl group and an ethoxycarbonylethyl group
  • Each R 7 is independently selected from a hydrogen atom and a C alkyl group
  • Y 2 is represented by formula (VII):
  • the modified hyaluronic acid can also produce the corresponding amines.
  • Preferred amines for the synthesis of the hyaluronic acid-peptide conjugate of the present invention include diamines (H N- (CHR 5 ) and H N-CH-CH- (O- CH- CH)
  • the above diamines are commercially available from, for example, Sigma-Aldrich.
  • a polar organic solvent is preferable, and an aprotic polar solvent is particularly preferable.
  • any condensing agent is used to introduce the necessary retention to give practically sufficient blood retention. It is difficult to get a rate of entry.
  • aprotic polar solvents are dimethylformamide (hereinafter also referred to as “DMF”), dimethylacetamide (hereinafter also referred to as “DMAc”), dimethyl sulfoxide (hereinafter also referred to as “DMSO”), 1, 3 Dimethyl-2-imidazolidinone (hereinafter also referred to as “DMI”), sulfolane (hereinafter also referred to as “SF”), N-methylpyrrolidone (hereinafter also referred to as “NMP”) or two or more of them A mixed solvent etc. are mentioned.
  • DMF dimethylformamide
  • DMAc dimethylacetamide
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • SF 1, 3 Dimethyl-2-imidazolidinone
  • SF sulfolane
  • NMP N-methylpyrrolidone
  • a mixed solvent etc. Preferred is dimethylformamide, dimethylacetamide, dimethyl sulfoxide, N-methylpyrrolidone or
  • the concentration of the reaction substrate in the reaction solvent is not particularly limited.
  • the molar concentration of the repeating unit of N-acetylyldarcosamine-glucuronic acid in the hyaluronic acid serving as the reaction substrate is, for example, A range force of 0.25 to 250 mmol ZL, preferably 0.25 to 50 mmol ZL may be selected.
  • the reaction temperature is not particularly limited.
  • a range force of 4 to 80 ° C, preferably 4 to 40 ° C, more preferably 20 to 40 ° C can be selected.
  • ring B is not particularly limited as long as it is a nitrogen-containing hetero ring group that does not have an acidic proton, such as a C alkyl group or a halogen atom.
  • Ring B includes, for example, pyrrolidine-1,2,5-dione1-1-yl, 3,4 dihydro-1,3-hydroxy-1,4-oxo1,2,3 benzotriazine, Such as Nzotriazole 1-yl.
  • X- includes, for example, fluoride ions, chloride ions, bromide ions, halide ions such as iodide ions, CF SO-, BF-, P
  • the nitrogen-containing heterocycle formed by R 1Q and R U , R 12 and R 13 , and R 14 and R 15 together with the nitrogen atom to which they are bonded includes a 5- to 7-membered saturated ring.
  • Specific examples of preferred nitrogen heterocycles include pyrrolidine, piperidine, and homopiperidine.
  • the condensing agent is a BOP condensing agent in which ring B is benzotriazole 1-yl.
  • BOP condensing agents include benzotriazole 1-yloxytris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (hereinafter also referred to as “: BOP”), benzotriazole 1-yloxytris. (Pyrrolidino) phospho-hexafluorophosphate (hereinafter also referred to as “PyBOP”), and mixtures thereof.
  • BOP condensing agents can be used alone or in appropriate combination.
  • the carboxyl group contained in hyaluronic acid that is, an amount equal to or more than the repeating unit (1 unit) of N-acetylylcosamine-glucuronic acid in hyaluronic acid. It is preferable to react with diamines (diamins)
  • the molar ratio of Z (HA unit) is, for example, 1 to: L000, preferably 20 to 750, more preferably 50 to 500. sell.
  • the molar ratio of the condensing agent used when introducing diamines (condensing agent ZHA unit) is a force that is appropriately adjusted depending on the reactivity of the amino group of the diamines. For example, 1 to: L0, preferably 1 to 5 More preferably, it can be selected from the range of 1 to 3.
  • Hyaluronic acid (HA) that can be used in the above production process is not particularly limited as long as it has an HA skeleton.
  • HA, HA and HA derivative salts are also included.
  • the HA used in the present invention is derived from the HA obtained by animal tissue strength, the HA obtained by fermentation, the HA obtained by chemical synthesis, etc. It is not limited.
  • Hyaluronic acid that can be used in the above manufacturing process
  • Derivatives include, for example, those partially alkylated, alkyl esterified or deacetylated.
  • the introduction rate of the N-substituted amide group can be quantified by proton NMR. Specifically, it can be determined by comparing the amount of the amino compound in the aminated HA-modified product obtained by proton NMR and the peak derived from HA. For example, a peak derived from an amine compound (2.9-3) obtained from proton NMR of a hyaluronic acid modified product (hereinafter also referred to as “HA-AM”) having an amino group introduced with ethylenediamine (hereinafter also referred to as “EDA”).
  • lppm Measurement solvent DO
  • HA-derived peak 1.8 to 1.9ppm: Measurement solvent DO
  • a modified hyaluronic acid (hereinafter also referred to as "HA-AM”) into which an amino group has been introduced is a precursor of the hyaluronic acid peptide conjugate of the present invention by introducing an appropriate substituent into the amino group.
  • the method for preparing a hyaluronic acid peptide conjugate according to the present invention is a known polymer drug.
  • the method used in the combination with the object can be used.
  • dehydration condensation reaction between amino group of water-soluble HA modified product and carboxy group of GLP-1 analog dehydration condensation reaction of amino group of GLP-1 analog and carboxy group of water-soluble HA modified product
  • GLP with modified groups introduced as carbohydrates such as alde
  • these modifying groups include groups derived from avidin and piotin
  • carboxy groups this carboxy group is an active ester such as NHS ester
  • a compound having two or more, preferably two groups in the molecule, whose force is also arbitrarily selected is used, and in this compound, the structure in the molecule other than these groups is a conjugate.
  • the compound may be synthesized by referring to the power available as a reagent or a method known in the literature!
  • N-substituted amide group substituent strength Water-soluble HA modified product containing amino group (HA —AM), where a part of the amino group is reacted with N-succinimidyl 3- [2-pyridyldithio] propionate (SP—) to produce a mercapto group.
  • HA—SH N-succinimidyl 3- [2-pyridyldithio] propionate
  • HA—SH N-succinimidyl 3- [2-pyridyldithio] propionate
  • the surplus amino group is treated with, for example, succinic anhydride and returned to the carboxy group to make the total charge aion.
  • maleimide, vinyl sulfone, attalyloyl, methacryloyl, aryl, etc. are introduced into GLP-1 analogs as modifying groups that react specifically with mercapto groups. This may be reacted with HA-SH to prepare a conjugate.
  • a group containing a double bond is introduced by modifying the amino group of the water-soluble HA modified product in which the substituent of the N-substituted amide group contains an amino group, and further,
  • the conjugate of the present invention may be prepared by reacting with a mercapto group-containing GLP-1 analog.
  • a water-soluble HA modified product into which a group containing a double bond is introduced is, for example, represented by the formula (VId):
  • the excess amino group may be treated with, for example, succinic anhydride.
  • a GLP-1 analog may be reacted with a linker having a cysteine introduction force or a mercapto group and reacted with ⁇ ⁇ -maleimide to prepare a conjugate.
  • the reaction between maleimide group and mercapto group is particularly preferable.
  • cysteine S- (EO) —MI is part of HA-AM and cysteine mercapto group introduced into GLP-1 analog. Those obtained by conjugation by reaction with the maleimide group introduced in (1) are preferred.
  • the introduction rate of LP-1 analog is 0.1 mol% or more on average per HA molecule, and 15 mol% The following is preferred.
  • the introduction rate is low, the amount of HA relative to the dose increases relatively, and when trying to administer a high dose of GLP-1 analog, the concentration of HA increases at a realistic dose, resulting in a high viscosity. Administration becomes difficult.
  • the introduction rate is too high, insoluble wrinkles of the conjugate are likely to occur.
  • the HA-AM remaining amino group after the introduction of the functional group for conjugates such as the maleimide group used in the present invention is, for example, succinic anhydride, maleic anhydride before the GLP-1 analog is bound.
  • succinic anhydride maleic anhydride before the GLP-1 analog is bound.
  • a dicarboxylic acid anhydride such as glutaric anhydride and adipic anhydride
  • dicarboxylic acid such as maleic acid, dartaric acid and adipic acid
  • succinic anhydride is preferred.
  • the condensing agent used here is not particularly limited, and examples thereof include benzotriazole 1-yloxy sheet lis (dimethylamino) phospho-hexafluorophosphate, benzotriazole 1-iloxy sheet lis (pyrrolidino) phospho- Um hexafluorophosphate, N, ⁇ '-carbodidiimidazole, ⁇ , ⁇ '-dicyclohexylcarbodiimide, 1-ethyl-3- (3 dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, EDCZ3, 4 -dihydro 1 3 Hydroxy 1 4-oxo 1, 2, 3 Benzotriazine, ⁇ -Ethoxycarbonyl 2-Ethoxy 1,2 Dihydroquinoline, 4-— (4, 6 Dimethoxy Dimethoxy —1, 3, 5 Triazine— 2-yl) — 4-Methylmorpholium chloride n-hydrate, 2-— (1H benzotriazole 1-yl
  • the molecular weight of the water-soluble HA modified product used in the present invention also affect its pharmacokinetics.
  • the molecular weight of the raw material HA used in the present invention is not particularly limited, but if the molecular weight is too low, the retention time in the blood of the obtained water-soluble HA modified product is shortened. On the other hand, if the molecular weight is too high, the resulting water-soluble HA-modified product will have a very high viscosity, making it difficult to administer at high concentrations.
  • the molecular weight of the raw material HA is usually 5000 dalton to 1 million dalton in terms of viscosity average molecular weight. But More preferably, it is 10,000 daltons to 300,000 daltons, more preferably 80,000 daltons to 300,000 daltons.
  • the method for measuring the HA weight average molecular weight is, for example, the light scattering method described in Seiichi Nakahama et al. "Essential Polymer Science” (published by Kodansha, ISBN4-06-06153310-X).
  • Various known methods such as the osmotic pressure method and the viscosity method can be used, and the viscosity average molecular weight shown in the present specification is also a method usually used in the technical field to which the present invention belongs, such as using an Ubbelohde viscometer. Can be measured.
  • the blood residence time of the water-soluble HA-modified product used in the present invention is preferably a rat having an average blood residence time of 18 hours or more, more preferably 25 hours or more.
  • the water-soluble HA-modified product used in the present invention is more resistant to degradation by hyaluronan-dase than the raw material HA.
  • “has resistance to degradation by hyaluronan-dase” means that the raw material HA and the water-soluble HA modified product of the present invention are enzymatically degraded by hyaluronan-dase, respectively, compared to raw material HA. It means that the decomposition rate is slow or the decomposition does not proceed.
  • an unsaturated disaccharide degradation product capable of degrading hyaluronic acid to its structural unit disaccharide and having a ⁇ -4,5-glucuronic acid residue at the non-reducing end of the degradation product. (For example, including a compound of formula IV):
  • the water-soluble hyaluronic acid-modified product is decomposed with hyaluronidase that produces, and the determination can be made by measuring the absorption peak at 232 nm of the resulting degradation product.
  • the measurement can be performed by a method commonly used in the art using ordinary high performance liquid chromatography, such as a gel permeation chromatography (GPC) column (for example, Superdex200 10/300 GL, Superdex75HR 10/30 and Superdex Peptide HR 10/30 (V, which is connected to Amersham Bioscience Co., Ltd.) can be used.
  • GPC gel permeation chromatography
  • the eluent to be used is not particularly limited.
  • PBS for example, obtained by taking 2 tablets of Phosphate Buffered Saline Tablets manufactured by SIGMA and dissolving in 400 mL of purified water
  • PBS for example, obtained by taking 2 tablets of Phosphate Buffered Saline Tablets manufactured by SIGMA and dis
  • the upper limit of the fraction of the peak area derived from disaccharides relative to the total peak area derived from the degradation product is 30% or less. Preferably there is. More preferably, it is 20% or less, more preferably 13% or less. The lower limit may be 0% or more.
  • hyaluronan-dase SD manufactured by Seikagaku Corporation
  • the water-soluble HA modified product used in the present invention is not particularly limited.
  • the water-soluble HA modified product used in the present invention has a solubility of 10 mgZmL to 100 mgZmL in physiological saline at room temperature.
  • the concentration of the modified HA when administered for therapeutic purposes is preferably 5 Omg / mL or less! /.
  • C alkyl group means a linear or branched alkyl having 1 to 6 carbon atoms.
  • Means a kill group and includes, for example, “C-C alkyl groups” such as methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, s-butyl, i-butyl, t-butyl, and n—
  • Examples include pentyl, 3-methylbutyl, 2-methylbutyl, 1-methylbutyl, 1-ethylpropyl, n-hexyl, 4-methylpentyl, 3-methylpentyl, 2-methylpentyl, 1-methylpentyl, 3-ethylbutyl, and 2-ethylbutyl.
  • C-C alkyl carbonyl group means a straight chain having 1 to 6 carbon atoms
  • alkyl carbo yl group having a branched alkyl group includes, for example, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, pivalol, valeryl, isovaleryl, hexanol and the like.
  • C alkylene group means a linear alkylene having 1 to 400 carbon atoms.
  • Group for example, C alkylene group, C alkylene group, C alkylene group, C alkylene group, C alkylene group, C
  • alkylene group 1-200 1-100 1-50 1-alkylene group, etc. are included. Where the alkylene group is 1 or more
  • the definition includes, for example, -CH CH (OCH CH)
  • n is an integer selected from 0 to 199
  • natural amino acids include glycine, alanine, serine, proline, parin, threonine, cysteine, leucine, isoleucine, asparagine, aspartic acid, lysine, glutamine, glutamic acid, methionine, histidine, and fe-
  • ⁇ -amino acids such as lualanin, arginine, thiocin and tryptophan
  • ⁇ -amino acids such as ⁇ -alanine
  • ⁇ -amino acids such as y-aminobutyric acid
  • aminosulfonic acids such as taurine, etc. It is.
  • Non-natural ⁇ -amino acids include a-amino acids having an alkyl side chain (eg, norpaline, norleucine, t-mouth ysine, etc.), alanine and glycine substituted with a cycloalkyl group (eg, cyclopentylalanine, cyclohexylalanine). , Cyclohexyl glycine, etc.), or alanine and glycine substituted with aryl groups (eg, pyridylalanine, chelualanin, naphthylalanine, substituted phelaranine, phenyldaricin, etc.).
  • alkyl side chain eg, norpaline, norleucine, t-mouth ysine, etc.
  • alanine and glycine substituted with a cycloalkyl group eg, cyclopentylalanine, cyclohexylalanine.
  • the amount of substituents introduced in the present invention is the amount of condensation agent added to HA, etc. Can be adjusted.
  • the charge of the water-soluble HA-modified product used in the present invention is cationic after conjugation with the GLP-1 analog, it remains in the blood due to nonspecific interaction with a biological membrane or the like. In order to shorten the time, it is preferable to convert it to a nonionic strength or a ionicity by reacting with a compound containing an acid anhydride, rataton, lactide or an active ester.
  • tetraptyl ammonium (TBA) salified HA is dissolved in DMSO, and one amino group is added to both ends of the molecule.
  • TSA tetraptyl ammonium
  • Each HA-containing diamine group compound is added, condensed to the carboxy group of HA with a BOP condensing agent, and an amino group-introduced HA (hereinafter also referred to as “HA-AM”) can be synthesized.
  • the GLP-1 analog of the present invention includes, for example, one Xa- at the C-terminal side of a natural GLP-1 fragment such as 01 ⁇ —1 (1 36) or 01 ⁇ —1 (7—3 6).
  • a natural GLP-1 fragment such as 01 ⁇ —1 (1 36) or 01 ⁇ —1 (7—3 6).
  • An amino acid sequence to which an amino acid sequence represented by Cys is added, or one or more (for example, 1 to: LO, preferably 1 to 5) amino acids are deleted, substituted and Z or added in the amino acid sequence Peptides consisting of the amino acid sequence thus prepared are included.
  • amino acid sequence may be substituted and Z or added by a natural amino acid and Z or a non-natural amino acid.
  • Xa is directly bonded or independently selected 1 or more (for example, 1 to 9, preferably 1 to 4) amino acids (selected from natural amino acids and non-natural amino acids), and the carboxy group of the C-terminal cysteine of the peptide may be converted to an amide group. .
  • GLP-1 analogs include GLP-l (l-36), GLP-l (l-37), GLP-1 (7-36) or GLP-1 (7-37), Qa- An amino acid sequence with a mercaptoy compound represented by SH, or one or more (eg 1 to: LO, preferably 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence deleted, substituted and Z or added Also included are peptides consisting of the amino acid sequences described above. The amino acid sequence substitutions may be substituted with natural amino acids and Z or non-natural amino acids.
  • Qa one NH- X 5, one CO- X 5 or a CONH- X 5 is force al selection, Bae Linked to the carboxy group, amino group or hydroxyl group contained in the c-terminal amino acid residue of the peptide to form an amide bond, urea bond or ester bond.
  • X 5 is a C alkylene group, and is substituted at one or more points of the alkylene group.
  • An oxygen atom may be inserted between two carbon atoms contained in the alkylene group.
  • the carbon atom of the alkylene group is selected from a hydroxyl group and a C alkyl group.
  • the GLP-1 analog is GLP-1 (1-37), GLP-1
  • Analogue substituted with the amino acid sequence of the LO residue or a at the C-terminal side a is represented by X 5 — SH via an amide bond, urea bond or ester bond to the amino group, carboxyl group or hydroxyl group excluding the amino group, or hydroxyl group GLP-1 analog attached with a mercaptoic compound.
  • the amino acid residue to be replaced or added here may be a natural type or a non-natural type.
  • the GLP-1 analog is preferably an analog that provides a mercapto group as a site that is expected to exhibit DPPIV resistance and a site-specific conjugate site.
  • C The terminal amino acid residue was replaced with an amino acid sequence represented by —Xa—Cys (where Xa represents a sequence consisting of 1 to 9 amino acid strengths which are directly selected or independently selected from proline, glycine, serine and glutamic acid strength).
  • GLP-1 analog C-terminal cysteine may be amidated), or amide bond, urea bond or ester bond to the amino group, carboxy group or hydroxyl group excluding the a amino group of the C-terminal amino acid
  • X 5 — SH Via GLP-1 analog with X 5 — SH, represented by X 5 — SH, is preferred.
  • Preferred GLP-1 analogs include natural GLP-1 (Human, 7-37;
  • GLP-1 (7-36) -Xb-Cys For example, GLP-1 (7-36) -Xb-Cys, GLP-1 (7-36) -Xb-CysNH, [Gly 8 ] -GLP-1 (7-36). ) —Xb—Cys, [Gly
  • GLP— 1 (7—37) NH—X 5 — SH, G LP— 1 (7—36) — Lys— ⁇ — NHCO— X 5 — SH, Gly—Pro—Pro—) GLP— 1 (7— 36) —LysNH-
  • n and m are integers selected from 1 to 20
  • CysNH is a cysteine in which the carboxy group is amidated.
  • LysNH represents lysine in which the carboxy group is amidated.
  • the second Galanin GLP-1 (8th) alanine is changed to glycine
  • the 31st (37th) glycine is changed to cysteine
  • the second natural GLP-1 is changed to glycine.
  • An analog in which the 31st (37th) glycine is changed to glycine-proline-proline-proline-cysteine is preferred.
  • the C-terminus of the GLP-1 analog may be amidated by a well-known method.
  • the synthesis of the GLP-1 analog of the present invention can be carried out by any of the commonly used solid-phase and liquid-phase chemical synthesis methods, recombinant culture methods produced using E. coli and animal cells as hosts, and cell-free protein. The synthesis method is also good.
  • the conjugate of the present invention includes one or more pharmaceutically acceptable diluents, wetting agents, emulsifying agents, dispersing agents, adjuvants, preservatives, buffering agents, binders, stabilizers and the like.
  • the pharmaceutical composition can be administered in any appropriate form depending on the intended route of administration.
  • the pharmaceutical composition containing the conjugate of the present invention can be administered parenterally systemically or locally.
  • intravenous administration such as infusion, intramuscular administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration, intranasal administration, transpulmonary administration, etc.
  • the effective dose varies depending on the administration route and administration frequency. 2pM as the blood concentration to suppress the occurrence of side effects (nausea, vomiting, etc.) Since the force is assumed to be 20000 pM, it is preferable to adjust the dose so as to obtain the blood concentration.
  • the diabetic complication to which the present invention can be applied is not particularly limited.
  • diabetic retinopathy, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic arteriosclerosis, diabetic myocardial infarction examples include cerebral infarction and diabetic foot lesions.
  • NMR measurement was performed using a nuclear magnetic resonance apparatus JNM-ECA500 (manufactured by JEOL Ltd.). The NMR measurement conditions are shown below:
  • the HA unit in the following description means a repeating unit (1 unit) of N-acetylylcosamine-glucuronic acid in hyaluronic acid.
  • Example 1 Using DOWEX 50WX8-400 (manufactured by Sigma-Aldrich Co.), which is chlorinated with tetrabutyrene ammonia-Tum (TBA) with tetraptylammonium hydroxide (manufactured by Sigma Aldrich Co., Ltd.), sodium hyaluronate (HA; electrochemical industry stock) (Made by company).
  • TAA tetrabutyrene ammonia-Tum
  • HA sodium hyaluronate
  • the resulting tetraptyl ammonium salt hyaluronic acid hereinafter also referred to as “HA — TBA” 29.
  • lmg was dissolved in DMSO (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to a concentration of 2. OmgZmL.
  • HA-AM hyaluronic acid
  • Example 1-2 The same procedure as in Example 1-2 was carried out except that hexamethylenediamine (HMDA; Sigma Aldrich) was used instead of EDOBEA, and HA-TBA 62. Omg was used, and the amino group was introduced. Hyaluronic acid (HA-AM) 41. lmg was obtained.
  • HMDA hexamethylenediamine
  • EDOBEA EDOBEA
  • HA-TBA 62 Omg was used, and the amino group was introduced.
  • Hyaluronic acid (HA-AM) 41. lmg was obtained.
  • Hyaluronic acid (HA-AM) into which an amino group was introduced was prepared in the same manner as in Example 1-2, except that PyBOP (manufactured by Kokusan Chemical Co., Ltd.) was used instead of BOP, and HA-TBA 51.8 mg was used. 39. Omg was obtained.
  • Example 1 Enzymatic degradation evaluation Example 1 HA-AM obtained in 1 to 14 was dissolved in distilled water (Milli Q water) at a concentration of 2 mg / mL. Add 0.2 M phosphate buffer (pH 6.2) 132 L and water 77 L to 55 / z L of this solution, and add hyaluro-dase SD (Seikagaku Corporation) lU / mL solution (0.01% 44 L of 0.05M phosphate buffer (pH 6.2) containing BSA was added and incubated at 37 ° C for 24 hours. 100 L of each sample was collected, and 720 L of 50 mM acetic acid solution was added to stop the reaction.
  • distilled water Milli Q water
  • HA 200 kDa
  • Prepare 6 TBA DMSO solutions (4. OmgZmL), and add 2, 2'— (ethylenedioxy) bis (ethylamine) (EDOBEA) to each HA unit ZEDOBE A 1Z50 (molZmol) equivalent ratio
  • BOP is equivalent to HA unit 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.5, 1.85 or 2.5
  • 1M NaCl aqueous solution which is half the volume of the reaction mixture, was added, the pH was lowered to 3 with 5N HC1, and then neutralized with 2N NaOH.
  • Example 2-1 Make the sample obtained in the above (Example 2-1) in distilled water (Milli-Q water) to a 20.OmgZmL solution, and add 0.2M carbonate buffer (pH 9.0) to it. Omg / mL. To this solution, 20 mol times succinic anhydride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with respect to the HA unit was added as 1/10 volume of DMSO solution of HA-AM solution and stirred at room temperature for 30 minutes.
  • succinic anhydride manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • HA-AM-SUC obtained in Example 2-2 was dissolved in distilled water (Milli Q water) at a concentration of 4 mg / mL.
  • the fraction of disaccharides in the degradation product is 100 X (disaccharide peak area) Z (total peak area—non-enzyme-added column) excluding the solvent-derived peak (Retention Time: 90 minutes) Calculated as hourly total peak area) (%). It became clear that enzyme resistance increased with the rate of amide group introduction, that is, the rate of modification of carboxylic acid in HA.
  • HA-AM—SUC hyaluronic acid modified products
  • HA (23 kDa) —TBA in DMSO (2 mgZmL), HA (lOOkDa) —TBA and HA (200 kDa) —TBA in DMSO (4 mgZmL) were prepared.
  • HA unit ZBOPZ2, 2 '— (Ethylenedioxy) bis (ethylamine) (EDOBEA) 1Z2.5. Equivalent to each solution in the order of EDOBEA and BOP in the order of 5/50 (mol / mol / mol) at room temperature And reacted overnight.
  • HA-AM Dissolve HA-AM obtained in the above (Example 3-1) with distilled water (Milli-Q water) to make a 20. Omg / mL solution, and add 0.2M carbonate buffer (pH 9.0) to it. The concentration was 10. OmgZmL.
  • Fluorescein isothiocyanate hereinafter also referred to as “FITC”; manufactured by Pierce Co., Ltd.
  • FITC Fluorescein isothiocyanate
  • Each fluorescently-labeled HA-AM-SUC obtained here was dissolved in 50 mM carbonate buffer (PH9.0) at a concentration of 0.25 mgZmL, and the absorbance at 494 nm of the solution was reduced to N from FITC.
  • the molar concentration of the fluorescein-ruthio group was determined, and the concentration of each unit was calculated according to the following formula. Furthermore, conversion to mole fraction and calculation of HA-derived weight fraction in the modified HA were performed.
  • Equation 2 x / (y + (Remaining AM cone.) + (FTC cone.))-((100-AM (%))) / AM (%)
  • the remaining AM cone Means the molar concentration of the unit having an unreacted amino group, and FTC cone. Means the molar concentration of the unit having an FTC group.
  • HA-HZ hyaluronic acid
  • This HA-HZ was dissolved in distilled water (milli-Q water), and then an equal volume of lOOmM carbonate buffer (pH 9.0) was added to adjust the final concentration to lmgZmL.
  • the reaction mixture was purified by dialysis against a large excess of distilled water (milli-Q water) and lyophilized to obtain HA-HZ-SUC with HA-HZ FITC-labeled.
  • Each fluorescently labeled HA-HZ obtained was dissolved in 50 mM carbonate buffer (pH 9.0) at a concentration of 0.25 mgZmL, and the absorbance power at 494 nm of the solution was also quantified in FITC concentration. The concentration of was calculated. Furthermore, conversion to molar fractions and calculation of HA-derived weight fractions in the modified HA were performed.
  • HA—HZ—SUC unit defined as y molZmL (HZ treated with succinic anhydride), and calculated from the following formula.
  • FITC cone Means the molar concentration of a unit having a FITC group. The results obtained are summarized in Table 3. [0154] [Table 3] FITC labeling for pharmacokinetic studies HA_H Z _ SUC Residual HA-FITC HA-SUC Mizuru HA
  • the fluorescently-labeled HA-modified product of Example 3-2 and Comparative Example 3-1 was administered as a single dose intravenously (iv) and subcutaneously (sc) at a dose of lOmgZkg before and after administration.
  • Blood was collected (heparinized) at 5, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, and 168 hours, and plasma was obtained by centrifugation. This plasma sample was stored frozen at -20 ° C or lower until measurement.
  • the calibration curve standard sample and the measurement sample were analyzed by GPC. The conditions are shown below.
  • GPC Column TSKgel G6000PW (manufactured by TOSOH)
  • a sample for measurement was prepared by adding an equal volume of PBS (pH 7.4) to a plasma sample of a rat modified with HA.
  • the peak area was calculated using analysis software Milleniu, --m Ver 3.21 (manufactured by Waters). Peak area force of each standard sample The concentration of modified HA in plasma was calculated from the obtained calibration curve.
  • Fluorescence label of Example 3—2 and Comparative Example 3—1 Fluorescence label of HA modification product Pharmacological parameters were calculated using WinNonlin Ver 4.0.1 (Pharsight) for blood concentration data of HA modification product. did. A model-independent analysis was performed using the data of 3 final measurement points for each individual, and the half-life (tlZ2) and mean residence time in blood (MRT) were calculated. The changes in blood concentration of fluorescently labeled HA-modified products are shown in Fig. 6, and the calculated pharmacokinetic parameters are shown in Table 4.
  • HA modified product of the present invention (Example 3-2) synthesized in an aprotic polar organic solvent by a pharmacokinetic test using a fluorescently labeled HA modified product is HA and the HA derivative (HA—HZ) reported so far.
  • SUC see Patent Documents 12, 13, and 14
  • MRT mean blood residence time
  • HA-AM-SUC hyaluronic acid modified products
  • HA 200kDa
  • Prepare 5 TBA solutions in DMSO (4. OmgZmL), add EDOBEA to each solution at an equivalent ratio of HA unit ZEDOBEA 1/50 (molZmol), and add BOP reagent to HA unit.
  • each solution was added at an equivalent ratio of 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, or 1.5 and allowed to react overnight. Then, 1M NaCl aqueous solution, half the volume of the reaction mixture, was added, the pH was lowered to 3 with 5N HC1, and then neutralized with 2N NaOH.
  • Example 4 Each HA-AM obtained in 1 was dissolved in distilled water (Milli-Q water) to a concentration of 20. Omg / mL, and this was diluted with 0.2M carbonate buffer (pH 9.0). The concentration was 10. Omg / mL.
  • these solutions there are 0.07 mol times (69% and 90.5% amide introduction rate of HA solution) and 0.175 mol times (54.5% amide introduction rate of HA solution) with respect to the HA unit. ), 0.28 mole times (36.5% amide introduction HA solution) and 0.63 mole times (20.0% amide introduction HA solution) fluorescein isothiocyanate.
  • the HA-AM solution was prepared as a 1Z10 volume DMSO solution and stirred at room temperature for 1 hour. After that, 40 moles of succinic anhydride was added as a 1Z10 volume DMSO solution of HA-AM solution to the HA unit, and the mixture was further stirred at room temperature for 30 minutes. After dialyzing 20% amine modification into a large excess of DMSO and other samples directly against a large excess of 25% EtOH aqueous solution (Spectrapore 4, molecular weight cut-off (MWCO): 12k-14 kDa), and then purified by dialysis against 0.5M NaCl aqueous solution. The dialyzed external solution was replaced with distilled water (milli-Q water) and purified by dialysis. The resulting aqueous solution was lyophilized to obtain fluorescently labeled HA-AM-SUC.
  • MWCO molecular weight cut-off
  • Each fluorescence-labeled HA-AM-SUC obtained here was dissolved in 50 mM carbonate buffer (PH9.0) at a concentration of 0.25 mgZmL, and the FITC concentration was quantified based on the absorbance at 494 nm of the solution.
  • the concentration of each unit was calculated according to the following formula. Furthermore, conversion to molar fractions and calculation of HA-derived weight fractions in the modified HA were performed.
  • Example 4-2 Fluorescently-labeled HA-modified product is administered to rat intravenously at a dose of lOmgZkg, before administration and after administration 0.5, 24, 8, 24, 48, 72, 96, 168 hours Blood was collected (heparinized) and plasma was obtained by centrifugation. This plasma sample was stored frozen at -20 ° C or lower until measurement.
  • a standard sample for calibration curve and a measurement sample were dispensed into a 96-well plate and analyzed using a microplate reader. The conditions are shown below.
  • Microplate reader SPECTRA MAX GEMINI (Molecular Devices)
  • a sample for measurement was prepared by adding an equal volume of PBS (pH 7.4) to a plasma sample of a rat modified with HA.
  • Pharmacokinetic parameters were calculated using WinNonl in Ver 4.0.1 (manufactured by Pharsight) for the blood concentration transition data of the fluorescently labeled HA modified product of Example 42.
  • a model-independent analysis of the plasma concentration transition of each individual was performed, and the mean blood residence time (MRT) was calculated.
  • the half-life (tlZ2) was calculated using the last three data that can be measured for each individual.
  • Fig. 8 shows the change in blood concentration of fluorescently labeled HA-modified products
  • Fig. 9 shows the relationship between AM introduction rate and MRT.
  • the calculated pharmacokinetic parameters are shown in Table 6.
  • HA—EDOBEA 200 kDa HA—TBA, EDOBEA introduction rate: 95.5%
  • aqueous solution (10 mg) obtained in the same manner as in Example 3-1, except that the BOP reagent was used in an equivalent ratio of 2.5 to the HA unit. (0.2 mL / mL, 17.66 mL) was charged with 0.2 M diacid buffer (pH 7.0, 22.075 mL).
  • a DMSO solution 0.053 mg / mL, 4.4 15 mL
  • Sulfo-KMUS N— [ ⁇ -maleimidoundecanoxy] sulfosuccinimide ester (hereinafter also referred to as “Sulfo-KMUS”) (Pierce).
  • GLP-1 Analog 1 The natural type GLP-l (Human, 7-37; described in JP 7-504679A), the second (8th) alanine is changed to glycine, and the 31st (37th) glycine is changed to cysteine. Mouth (hereinafter also referred to as “GLP-1 Analog 1”) was obtained by a solid phase peptide synthesis method (manufactured by Peptide Laboratories).
  • Tris [2-carboxyethyl] phosphine hydrochloride (hereinafter also referred to as “TCEP”) in a solution (2.0 mg / mL) of 0.2 M phosphate buffer (pH 7.0) of GLP-1 Analog 1
  • TCEP Tris [2-carboxyethyl] phosphine hydrochloride
  • An aqueous solution (20 mM) manufactured by Pierce Co., Ltd. was obtained.
  • GLP-1 Analog 1 solution (1.3263 mL) containing TCEP is added to the HA-EDOBEA-MlZSUC aqueous solution (20 mgZmL, 1.2 mL) obtained in Example 5-1, and left at 37 ° C for 2 hours. did.
  • GLP-1 analog 1 solution (1.3263 mL) containing the same TCEP was added again and allowed to stand in the same manner.
  • a solution of cysteine hydrochloride monohydrate in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) (3.6 mg ZmL, 0.3853 mL) was added, and the mixture was further allowed to stand at 37 ° C for 1 hour.
  • the reaction mixture was divided into three portions and subjected to GPC under the following conditions to separate the conjugate fraction.
  • the collected fraction is concentrated to approximately 4.85 mL by centrifugal ultrafiltration (Vivaspin20, MWCO: 50000, manufactured by Funakoshi Co., Ltd.), and the title HA-G An LP-1 analog 1 conjugate solution was obtained.
  • the sample obtained by performing the same operation as in the present example without using GLP-1 Analog 1 was used as a control as a control, and the absorbance and strength rubazole at 280 nm of the obtained HA-GLP-1 Analog 1 solution were used.
  • GLP-1 analog 1 concentration, HA-EDOBEA-MIZSU concentration and GLP-analog 1 introduction rate were calculated by sulfuric acid method.
  • GLP-1 Analog 1 was 42.6 nmolZmL, HA-EDOBEA-MI / SU was 3.54 mgZmL, and GLP-1 Analog 1 was 3.7 ZHA (molZmol).
  • Force rubazole solution ethanol solution of force rubazole (1.25mg / mL: 0.12
  • the HA-GLP-Lanalog 1 conjugate solution obtained in Example 5-2 was diluted with PBS containing 0.05% Tween 80 (pH 7.4; hereinafter also referred to as “solvent Z”).
  • PBS containing 0.05% Tween 80 pH 7.4; hereinafter also referred to as “solvent Z”.
  • a single dose was administered intravenously at a dose of g / kg, blood was collected (heparinized) at 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96, and 168 hours after administration, and plasma was obtained by centrifugation. . This plasma sample was stored frozen at 20 ° C or lower until measurement.
  • GLP-1 (Active) ELISA KIT manufactured by Linco Research, Inc .; hereinafter referred to as “Kit W” is dispensed with a standard sample for calibration curve and a sample for measurement into a 96-well plate, and a microplate reader is used. Analysis. The conditions are shown below.
  • Microplate reader SPECTRA MAX GEMINI (Molecular Devices)
  • Samples for measurement were prepared by adding Assay Buffer enclosed in kit W to rat plasma samples administered with HA-GLP-1 analog 1 conjugate.
  • Pharmacokinetic parameters were calculated using WinNonlin Ver 4.0. 1 (manufactured by Pharsight) for blood concentration transition data of the administered HA-GLP-1 analog 1 conjugate. A model-independent analysis of plasma concentrations in each individual was performed, and the mean blood residence time (MRT) was calculated. The half-life (tl / 2) was calculated using the last three data that can be measured for each individual.
  • Figure 10 shows changes in blood concentration of HA-GLP-1 analog 1 conjugate. The calculated pharmacokinetic parameters are shown in Table 7.
  • GLP-1 Ha an, 7-37; manufactured by Peptide Institute Co., Ltd.
  • solvent Z 150 ⁇ gZkg or 1 500 gZkg
  • 50% glucose solution was orally administered to 3 gZkg.
  • Six animals were used in the test as one group.
  • the blood glucose lowering rate was calculated from the following formula.
  • the AUC of the blood glucose increase value is obtained by plotting the time after glucose administration on the horizontal axis and the blood glucose level of each individual on the vertical axis, The area under the curve of the graph is subtracted when the blood glucose level before administration of glucose for each individual is constant without change until 4 hours after glucose administration.
  • blood glucose level before dolcose administration blood glucose level 30 minutes after glucose administration
  • blood glucose level 1 hour after glucose administration blood glucose level 2 hours after glucose administration, 4 hours after glucose administration
  • the AUC of the blood glucose elevation value is expressed by the following formula:
  • AUC 0.5 X + 0.5 X plus I X + 2 X 4 X A '
  • GLP—1 Hypoglycemic rate at administration (%) Dose mean Average error
  • HA-EDOBEA 100 kDa HA-TBA, EDOBEA introduction rate: 97.0%) aqueous solution (10 mgZmL, 4.0 mL) obtained in the same manner as in Example 3-1, except that the BOP reagent was used in an equivalent ratio of 2.5 to the HA unit. To each of them, 0.2 M phosphate buffer (pH 7.0, 5. OmL) and 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0, 30 mL) were added, respectively.
  • N Hydroxysuccinimid 15- (3 Maleimidopropionyl) Amido 4, 7, 10, 13-Tetraoxapenta Decanoate hereinafter also referred to as “NHS— (EO) —MI”) (Quanta BioDesign Ltd.
  • DMSO solutions (2.283 mgZmL, 1. OmL) were prepared and shaken at room temperature for 30 minutes.
  • Succinic anhydride in DMSO (287 mgZmL, 1. OmL) was added, and the mixture was further shaken at room temperature for 1.5 hours.
  • Purify by dialysis against a large excess of distilled water (Milli Q water) at 4 ° C (Spectrapore 4, MWCO: 12k-14kDa) and freeze-dry the resulting solution to obtain maleimide groups and succinic acid.
  • HA—EDOBEA— (EO) MIZSUCJ, 46.93, 48.01, 22.57 mg
  • MlZHA maleimide
  • EDOBEA- (EO) MlZSUC average molecular weight and average molecular weight per unit
  • 0.2 M phosphate containing cysteine 20 mM ethylenediamine tetraacetic acid buffer (pH 7.0, 55 ⁇ L) or the same buffer without cysteine was added. After standing at 37 ° C for 30 minutes, the remaining cysteine was quantified with an Elman reagent. For control, distilled water (55 ⁇ L) containing 2 ⁇ cysteine, 0.2. Phosphate, 20 mM ethylenediamine tetraacetic acid buffer ( ⁇ 7.0, 55 ⁇ L), NHS- (EO) Ml in DMSO solution Replaced with DMSO
  • HA-EDOBEA-SUC The hyaluronic acid modification product in which only succinic acid was introduced into HA-EDOBEA obtained in the same manner as in Example 6-1 was performed in the same manner.
  • MI / HA (mol / mol) was calculated from the ratio to the HA concentration, with the nonspecific consumption corrected for the control and the cysteine consumption as the maleimide amount.
  • the absorbance at 412 nm was measured, a calibration curve was prepared from the absorbance of the blank and the standard sample, and the residual amount of cysteine contained in the sample solution was quantified.
  • the absorbance of the hyaluronic acid derivative at 412 nm was corrected with the measured value of the sample solution with no cysteine.
  • Natural GLP—l Human, 7-37; described in JP 7-504679
  • the second (8th) alanine is used as glycine
  • the 31st (37th) glycine is used as a proline on the C-terminal side— Proline-proline-cysteine was added and the C-terminal amidated mutant (hereinafter also referred to as “GLP-1 Analog 2”) was obtained by solid-phase peptide synthesis (Peptide Institute, Inc.) .
  • molZmol aqueous solution (20mgZmL, 2.0, 2, 0, 0.83mL) are mixed, respectively.
  • HA—EDOBEA- (EO) MlZSUC (average MlZHA 7.4 (molZmol) aqueous solution (20m
  • the concentrated solution was diluted about 20 times with PBS, and again concentrated and diluted in the same manner.
  • the concentrated solution obtained by reconcentration is adjusted to about 16 mL with PBS and filtered (MILLEX-GV, 0.22 m, manufactured by Millipore).
  • the title HA-GLP-1 analog 2 conjugate solution was obtained.
  • Figure 11 shows the GPC chromatogram.
  • GLP— 1 analog 2 is 161.8 nmol / mL
  • HA— EDOB EA- (EO) MlZSUC is 3.22 mgZmL
  • GLP— 1 analog 2 is 7.9 / HA (mol
  • Force rubazole solution ethanol solution of force rubazole (1.25mgZmL)
  • Example 6 except that DMSO was replaced with NHS-(EO) Ml in DMSO.
  • Hyaluronic acid-modified product in which only succinic acid was introduced into HA-EDOBEA obtained in the same manner as in 1 was dissolved in PBS to make 0.5 mgZmL.
  • a 2-fold dilution series was prepared from this 0.5 mgZmL HA—EDOBEA— SUC solution (concentration 5 points: 0.03).
  • PBS control
  • standard 0.2 mL each
  • HA-GLP-1 analog 2 conjugate solution 15 L
  • GLP-1 Analog 2 The difference was taken as the absorption of GLP-1 Analog 2, and the molar extinction coefficient was also calculated as GLP-1 Analog 2 concentration.
  • the ratio of GLP-1 analog 2 concentration to the concentration of modified HA was also calculated as GLP-1 analog 2 introduction rate (molZmol).
  • Human GLP-1 receptor-expressing cells were cultured in a 96-well plate for 3 days and subjected to assembly. The culture solution was replaced with the reaction solution (DMEM containing 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine and 3.7 gZL NaHCO) and diluted with DMEM containing 0.05% Tween 80.
  • reaction solution DMEM containing 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine and 3.7 gZL NaHCO
  • Cyclic AMP produced in cells by the reaction of HA—GLP—1 analog 2 conjugate and GLP—1 receptor is chemiluminescent by cAMP-Screen TM (Applied Biosystems) ELIS A (Enzyme— This was measured by an ARVO HTS 1420 Multilabel Counter (manufactured by PerkinElmer (Wallac)) by a linked immunosorbent assay) method. From the calibration curve obtained from the emission intensity of the standard cyclic AMP sample, the cyclic AMP in the cell lysate was calculated using the analysis software Graphp ad Prism Version 4.02 (GraphPad Software, Inc.) The amount was converted to the amount of cyclic AMP per cell well.
  • the EC50 value of the conjugate was calculated from the concentration-response curve of HA-GLP-1 analog 2 conjugate and cyclic AMP amount per cell well using Graphpad Prism Version 4.02. The EC50 value of the conjugate was calculated based on the concentration of GLP-1 analog 2 in the HA-GLP-1 analog 2 conjugate. Table 10 shows the cyclic AMP production ability of the HA-GLP-1 analog 2 conjugate as a relative value when the EC50 value of natural GLP-1 (Human, 7-37) is 1.
  • the EC50 value of the HA-GLP-1 analog 2 conjugate is higher than that of the natural GLP-1 due to steric hindrance caused by the macromolecule HA. It was confirmed that it can retain cAMP production ability.
  • GLP-1 (Active) ELISA KIT manufactured by Linco Research, Inc.
  • Kit W Linco Research, Inc.
  • Microplate reader SPECTRA MAX GEMINI (Molecular Devices)
  • a sample for measurement was prepared by adding Assay Buffer enclosed in Kit W to a rat plasma sample administered with HA-GLP-1 analog 2 conjugate.
  • Pharmacokinetic parameters were calculated using WinNonlin Ver 4.0.1 (Pharsight) for blood concentration data of HA-GLP-1 analog 2 conjugate administered. . A model-independent analysis of plasma concentrations in each individual was performed, and the mean blood residence time (MRT) was calculated. The half-life (tl / 2) was calculated using the last three data that can be measured for each individual. Figure 12 shows the change in blood concentration of HA-GLP-1 analog 2 conjugate. The calculated pharmacokinetic parameters are shown in Table 11.
  • GLP-1 analog 0 alanine as a glycine mutant (hereinafter also referred to as “GLP-1 analog 0”) (Peptide Research Co., Ltd.) 50) after dilution with solvent Z (3000 ⁇ g / kg) or solvent Z subcutaneously, 2 minutes or 4 hours 2 minutes after subcutaneous administration (solvent Z is 1 or 5 hours after subcutaneous administration)
  • solvent Z 3000 ⁇ g / kg
  • solvent Z is 1 or 5 hours after subcutaneous administration
  • the blood glucose lowering rate was calculated from the formula described in Example 5-4.
  • the AUC of the blood glucose increase value is obtained by plotting the time after glucose administration on the horizontal axis and the blood glucose level of each individual on the vertical axis, and connecting the points with a straight line, from the area under the curve of the graph.
  • the area under the curve of the graph is subtracted when the blood glucose level before administration of glucose for each individual is constant without change until 2 hours after administration of glucose.
  • AUC has the following formula:
  • HA—EDOBEA 200 kDa HA—TBA, EDOBEA introduction rate: 98.5%) aqueous solution (10 mg) obtained in the same manner as in Example 3-1, except that the BOP reagent was used in an equivalent ratio of 2.5 to the HA unit. / mL, 9. OmL) was charged with 0.2 M diacid buffer (pH 7.0, 11.25 mL).
  • MlZHA was evaluated by the method described in Example 6-1 and found to be 5.0 (mol / mol).
  • HA-EDOBEA 100 kDa HA-TBA, EDOBEA introduction rate: 95.5%
  • aqueous solution (10 mgZmL) obtained in the same manner as in Example 3-1, except that the BOP reagent was used in an equivalent ratio of 2.5 to the HA unit. , 3.5, 4. OmL) 0.2M phosphate buffer (pH 7.0, 4. 375, 5. Om U and O. 1M phosphate buffer (pH 7.0, 8. 75, 10. OmL) Sulf o- KMUS (Pierce) DMSO solution (0.858 mgZmL, 0.875 mL) or N HS-(EO) -MI (Quanta BioDesign Ltd.) DMSO solution (1.528 mg) /
  • MI / HA 4.7 (molZmol)) in aqueous solution (20mgZmL, 0.15mL)
  • a solution (2. Omg / mL, 0.1539 mL) of 0.2 M phosphate buffer (pH 7.0) was added. Each was allowed to stand at 37 ° C for 1 hour.
  • Solution of cysteine hydrochloride monohydrate in 0.1M phosphate buffer ( PH 7.0) 11.22 (Example of using HA modification described in Example 7-1)), 21.28 (Example 7-2) Description Example of use of modified HA) mgZmL (0.015 mL each) was added, and the mixture was further allowed to stand at 37 ° C for 30 minutes.
  • the reaction mixture was subjected to GPC under the following conditions to separate the conjugate fraction.
  • the collected fraction was concentrated by centrifugal ultrafiltration (Centricon Plus 20, fractional molecular weight: 30000, manufactured by Millipore) until the volume became about 1Z20.
  • the concentrated solution was diluted about 20 times with PBS and again concentrated and diluted in the same manner.
  • the concentrated solution obtained by reconcentration was adjusted to about 1.2 (Example of using HA-modified product described in Example 7-1) and 0.6 (Example of using HA-modified product described in Example 7-1) with PBS.
  • a solution of the title HA-GLP-1 analog 2 conjugate and HA-GLP-1 analog 1 conjugate was obtained (Sample Nos. 7-3-1 to 7-3-4).
  • Table 14 summarizes the results of quantification in the same manner as described in Example 6-2, except that the dilution rate of the sample solution was changed as appropriate.
  • Example 7-3 The cAMP producing ability of various HA-GLP-lanalog conjugates obtained in Example 7-3 was measured in the same manner as in Example 6-3.
  • Table 15 shows the cyclic AMP production ability of various HA-GLP-1 analog conjugates as relative values when the EC50 value of natural GLP-1 is 1.
  • the HA-GLP-1 analog conjugate can be obtained when HA with a molecular weight of 200 kDa is used, and when hydrophobic (CH 3) is used as a linking group between the water-soluble HA modified product and the maleimide group.
  • the HA-GLP-1 analog conjugate solution obtained in Example 7-3 was diluted with solvent Z and administered once to the rat intravenously at a dose of 50 gZkg, and 1, 4, 8, 24, 48 after administration. 72, 120, and 168 hours, blood was collected (heparinized), and plasma was obtained by centrifugation. This plasma sample was stored frozen at -20 ° C or lower until measurement.
  • GLP-1 (Active) ELISA KIT manufactured by Linco Research, Inc.
  • Kit W Linco Research, Inc.
  • Microplate reader SPECTRA MAX GEMINI (Molecular Devices)
  • a sample for measurement was prepared by adding the assay buffer enclosed in the kit W to the rat plasma sample administered with the HA-GLP-1 analog conjugate.
  • Pharmacokinetic parameters were calculated using Win Nonlin Ver 4.0. 1 (manufactured by Pharsight) for blood concentration transition data of the administered HA-GLP-1 analog conjugate. A model-independent analysis of plasma concentrations in each individual was performed, and the mean blood residence time (MRT) was calculated. The half-life (tl / 2) was calculated using the last three data that can be measured for each individual. Fig. 13 shows the change in blood concentration of HA-GLP-1 analog conjugate. The calculated pharmacokinetic parameters are shown in Table 16.
  • Test sample 7 _3 1 Average value Standard deviation
  • HA-GLP-1 analog conjugates can be used for purposely selecting the molecular weight and linking group structure of HA.
  • HA-EDOBEA 100 kDa HA-TBA, EDOBEA introduction rate: 100% aqueous solution (10 mg / mL) obtained in the same manner as in Example 3-1, except that the BOP reagent was used in an equivalent ratio of 2.5 to the HA unit. , 5.0, 9. OmL) were each filled with 0.2 M diacid buffer (pH 7.0, 6.25, 11.25 mL). NHS— (EO) -MI (manufactured by Quanta BioDesign Ltd.) DM SO solution (0. 377, 1. 510 mg / mL, 1. 25, 2. 25 mU was added.
  • HA—EDOBEA 100 kDa HA—TBA—EDOBEA introduction rate: 100%
  • aqueous solution 10 mg /
  • 0.2M zinc buffer pH 7.0, 6.25mL
  • 0.1MU acid buffer ⁇ 7.0, 37.5mL
  • DMSO solutions (2.114, 2.717, 3.321 mg / mL, 1.25 mL) of BioDesign Ltd .; were added respectively. Shake for 30 minutes at room temperature. Add succinic anhydride DMSO solution (293 mg / mL, NHS- (EO) — MI in DMSO solution) to room temperature.
  • Example 8-2 The cAMP producing ability of various HA-GLP-lanalog conjugates obtained in Example 8-2 was measured in the same manner as in Example 6-3.
  • Table 18 shows the cyclic AMP-producing ability of various HA-GLP-1 analog conjugates. It is shown as a relative value when the EC50 value of type GLP-1 is 1. The EC50 value of the conjugate was calculated based on the GLP-1 analog 2 concentration in the HA-GLP-1 analog 2 conjugate.
  • HA-GLP-1 analog 2 conjugates can be converted to GLP-1 analog even if the rate of analog introduction is changed.
  • HALP-GLP-1 Analog Conjugate GLP-1 for use in the prevention or treatment of diabetic complications and obesity due to GLP-1 analog persistent diabetes and hyperglycemia Amount and method of administration
  • the GLP-1 analog introduction rate can be selected within a range that allows the increase in viscosity due to HA at the prescribed dose volume.
  • GLP-1 Analog 1 A solution of GLP-1 Analog 1 or 2 in 0.2M phosphate buffer (pH 7.0) in aqueous solution (20mgZmL, 0.15mL) with GLP-1 Analog / HA of 1.0, 2.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.5 (mol / mol)
  • GLP-1 Analog 1 2. Omg / mL, 0.01 62, 0. 0325, 0. 0649, 0. 0812, 0. 0974, 0. 1217 mL
  • GLP— 1 analog 2 2. Omg / mL, 0. 0179, 0. 0358, 0. 0716, 0. 0895, 0. 1074 and 0.1343 mL, respectively) were added and allowed to stand at 37 ° C for 1 hour.
  • a solution of cysteine hydrochloride monohydrate in 0.1 M phosphate buffer (PH 7.0) (11.22 mg / mL, 0.0150 mL) was added, and the mixture was further allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes.
  • the reaction mixture was subjected to GPC under the conditions described in Example 7-3 to separate the conjugate fraction.
  • the concentrated solution was diluted about 20 times with PBS and again concentrated and diluted in the same manner.
  • Example 9 The cAMP producing ability of various HA-GLP-1 analog conjugates obtained in 1 was Measurement was performed in the same manner as in Example 6-3.
  • Table 20 shows the cyclic AMP production ability of various HA-GLP-1 analog conjugates as relative values when the EC50 value of natural GLP-1 is 1.
  • HA-GLP-1 analog conjugate retains the cAMP-producing ability of GLP-1 even when the GLP-1 analog introduction ratio to maleimide is changed.
  • Example 10 Preparation of HA-EDOBEA- (EO) —MlZSUC HA-EDOBEA (100 kDa HA-TBA, EDOBEA introduction rate: 97.0%) aqueous solution (10 mg) obtained in the same manner as in Example 3-1, except that the BOP reagent was used in an equivalent ratio of 2.5 to the HA unit. 0.2 M diphosphate buffer (pH 7.0, 6.25 mL) and 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0, 37.5 mL) were respectively added to / mL and 5. OmL). NHS— (EO) -MI (Qua
  • DMSO solution (1.826 mg / mL, 1.25 mL) from nta BioDesign Ltd. was added and shaken at room temperature for 30 minutes.
  • a DMSO solution of succinic anhydride (287 mgZmL, 1.25 mL) was prepared and shaken at room temperature for 1.5 hours. It is purified by dialysis against a large excess of distilled water (milli-Q water) at 4 ° C (Spectrapore 4, MWCO: 12k-14kDa), and the resulting solution is freeze-dried to produce HA—EDOBEA— (EO ) -Ml / SUC (54. Omg) was obtained.
  • GLP-1 analog 3 A C-terminal amidated mutant (hereinafter also referred to as “GLP-1 analog 3”) was obtained by solid phase peptide synthesis (manufactured by Peptide Institute, Inc.).
  • GLP-1 analog 3 A C-terminal amidated mutant (hereinafter also referred to as “GLP-1 analog 3”) was obtained by solid phase peptide synthesis (manufactured by Peptide Institute, Inc.).
  • Example 10 HA obtained in Example 1— EDOBEA— (EO)
  • the concentrated solution was diluted about 20 times with PBS, and again concentrated and diluted in the same manner.
  • the concentrated solution obtained by concentration again was adjusted to about 0.6 mL with PBS, and this was filtered (MILLEX—GV, 0.22 / ⁇ ⁇ , manufactured by Millipore) to give the title HA-GLP-1 analog.
  • 1 and analog 3 conjugate solutions were obtained (sample numbers 10—2—1 to 10—2-2—2). Change the dilution rate of the sample solution as appropriate Table 21 summarizes the results of quantification in the same manner as described in Example 6-2 except that.

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Abstract

　本発明は、水溶性のヒアルロン酸修飾物に１以上のグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）アナログが結合したヒアルロン酸－ペプチド結合体またはその塩、特に、水溶性のヒアルロン酸修飾物において、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分に含まれるカルボキシ基の７０％以上がＮ－置換アミド基に変換されており、ここで当該ヒアルロン酸修飾物中の各Ｎ－置換アミド基の置換基は同一であっても異なってもよく、当該置換基の少なくとも１つが前記ＧＬＰ－１アナログと連結する２価の連結基である、前記ヒアルロン酸－ペプチド結合体またはその塩に関する。

Description

明 細 書
水溶性ヒアルロン酸修飾物と GLP_ 1アナログの結合体
技術分野
[0001] 本発明は、糖尿病および高血糖症に起因する糖尿病性合併症、肥満症の予防ま たは治療薬として有用な、水溶性ヒアルロン酸修飾物と GLP— 1アナログの結合体（ コンジュゲート）、並びにその結合体を含む持続性糖尿病および高血糖症に起因す る糖尿病性合併症、肥満症の予防または治療薬に関する。
背景技術
[0002] グルカゴン様ペプチド 1 (GLP— 1)は、食物摂取に応答して小腸 L 細胞から分 泌される 31アミノ酸力もなるペプチドである。脾臓ベータ細胞に作用し、インスリン分 泌を促進し、血清中グルコース量を減少させることが知られている（非特許文献 1を参 照)。この作用は血糖値が低 、時には見られな 、ことから低血糖のリスクが低 、こと、 さらに、 GLP— 1にはインスリンを産生するベータ細胞の増殖、前駆細胞からの分ィ匕 誘導作用、グルカゴン分泌抑制作用、胃排出遅延作用あるいは摂食抑制作用など 力 Sあることが知られており（非特許文献 1を参照）、糖尿病および高血糖症に起因す る糖尿病性合併症、肥満症の予防または治療薬としての利用への期待が高い。しか し、ジぺプチジルぺプチダーゼ IV(DPPIV)による分解と腎からの排泄により、 GLP 1の血中半減期は数分間と短ぐ糖尿病および高血糖症に起因する糖尿病性合 併症、肥満症の予防または治療薬として使用するためには頻回投与が必要になる。 生物活性を維持し、 DPPIV耐性を付与した様々な GLP— 1類縁体、誘導体 (アナ口 グ)が報告されている（特許文献 1〜8を参照）が、腎排泄は回避できないため血中滞 留時間の延長は十分ではな 、。
[0003] また、一般に、低分子薬物、ペプチド薬物、タンパク質薬物等の血中滞留性の向上 、安定性の向上、溶解性の向上、抗原性の低減等を目的として、薬物と水溶性ポリマ 一との結合体の形成 (コンジユゲーシヨン）が試みられている。特に、ポリエチレンダリ コール (以下、「PEG」とも称す）は、その不活性な性質と生体内でのタンパク質によ る薬物の吸着を防ぐ効果を有することから広く用いられており、 PEG結合体ィ匕タンパ ク質は医薬品として既に実用化されている。しかし、 PEGは生分解性ポリマーではな い為、長期投与により体内に蓄積した場合の安全性等の問題は明らかでない。更に は、最近、 PEG結合体化リボソームにおいて投与 2回目のクリアランスが異常に早い 現象（Accerelated Blood Clearance現象）が報告されており（非特許文献 2およ び 3を参照）、 PEG結合体ィ匕医薬品の安全性、有効性は充分に確立されたとは言い 難い。
[0004] ヒアルロン酸（以下、「HA」とも称す）は、 1934年、 K. Meyerによって牛の眼の硝 子体から単離された多糖であり、細胞外マトリックスの主成分として古くから知られて いる。 HAは、 D—グルクロン酸と N—ァセチルダルコサミンとが j8 (1→3)グリコシド結 合により連結された二糖単位力も成るダルコサミドダリカンの一種である。ヒアルロン 酸は、その化学的および物理的構造に種差が無ぐヒトにおいてもヒアルロン酸の代 謝系が存在する。さらに免疫性または毒性の点に関しても非常に安全な生体材料（ Biomaterial)ということができる。近年、細胞の接着、増殖、移動の誘導に関するヒ アルロン酸の生理活性物質としての側面が注目されている。また、微生物による高分 子量のヒアルロン酸の大量生産が可能となり、関節疾患治療薬などの医薬として実 用化されており、化粧品等の分野においても実用化が進んでいる。さらに、薬物をヒ アルロン酸と結合体ィ匕することで、薬物の癌組織へのターゲテイング (特許文献 9を 参照）、肝臓へのターゲティング (特許文献 10を参照）、抗原性の低減 (特許文献 11 を参照）、血中滞留時間の延長 (特許文献 12、 13および 14を参照)等が達成できる という報告がなされている。
[0005] 汎用されている PEGと比べて、薬物の結合体担体としてヒアルロン酸を用いる際の 利点は、生分解性を有する点、巨大サイズィ匕が可能な点、さらに、 1分子中に多くの 反応点を持っため、複数の薬物（同一薬物を複数、或いは 2種類以上の薬物)を 1分 子中に担持できるということである。このような利点を有するヒアルロン酸を薬物結合 体担体として用いることは、ターゲティング、徐放等、より高度な薬物動態制御機能を 持つ結合体を設計開発する手段となる。また、ヒアルロン酸は生分解性である上に、 その化学的構造に種差が無 、ことから、安全性と 、う点にぉ 、ても PEGよりも優れた 担体であるといえる。 [0006] しかし、ヒアルロン酸自体の血中滞留時間は短ぐ静脈内投与（以下、「iv」とも称す )で半減期が 2分であると報告されている (非特許文献 4を参照)。本発明者の検討に おいても、ただ単にヒアルロン酸を薬物に結合体ィ匕しただけでは、薬物の血中滞留 時間の大きな延長や、薬効の持続性の向上は確認されなかった。ヒアルロン酸の主 代謝部位は肝臓およびリンパ腺であり、その代謝は、主に CD44、 RHAMM、 HAR E等のヒアルロン酸に特異的に結合する細胞膜局在レセプターを介した細胞内への 取り込みとそれに引き続くヒアル口-ダーゼによる分解によるものである。これらのレ セプター分子は共に、ヒアルロン酸の連続した遊離のカルボキシ基 (6糖)を主な認識 部位にして 、ることが報告されて 、る（非特許文献 5を参照)。
[0007] 従って、血中滞留時間が短いというヒアルロン酸の問題を克服すベぐヒアルロン酸 に置換基を導入したヒアルロン酸修飾物を薬物担体として利用する試みもある（特許 文献 4、 5および 6を参照)。一般に、ヒアルロン酸に置換基を導入すればその血中滞 留時間は延長され、その程度は置換基の導入率と相関すると考えられる。ヒアルロン 酸の様々な位置に置換基が導入されたヒアルロン酸修飾物が報告されて ヽる。その 中でも、ヒアルロン酸におけるグルクロン酸部分のカルボキシ基に加水分解されにく V、アミド結合を介して置換基を導入することが、得られるヒアルロン酸修飾物とヒアル ロン酸レセプターとの結合阻害において効果的であり、当該ヒアルロン酸修飾物は血 中滞留時間の面において優れていると考えられる。
[0008] 一方、ヒアルロン酸をテトラブチルアンモ -ゥム塩にし、ジメチルスルホキシド中で置 換基と反応させることによって、ヒアルロン酸のカルボキシ基をアミド化したヒアルロン 酸修飾物 (特許文献 7を参照)も報告されているが、この発明は架橋体調製を目的と したもので、血中滞留性向上を目指したものではない。さらに言えば、この発明にお いては縮合剤として 1, 1—カルボ-ルジイミダゾール (以下、「CDI」とも称す)を用い ている。我々の検討では、縮合剤として CDIを用いても血中滞留性が充分に向上さ れた (ヒアル口-ダーゼによる分解に対して充分な耐性を持つような)ヒアルロン酸誘 導体を得ることはできず、さらに、反応中にヒアルロン酸分子量が大きく低下すること が確認されている。
[0009] これら以外にも、水と極性有機溶媒の混合溶媒中で、ヒアルロン酸のカルボキシ基 に置換基を導入した例も報告されている (特許文献 8を参照)。しかしながら、得られ たヒアルロン酸修飾物につ 、て、血中滞留時間の延長が見られるかどうかにつ!/、て は一切触れられて 、な 、。
[0010] このように、薬物担体として実用的な水溶性ヒアルロン酸修飾物、特に血中滞留時 間を実用的なレベルまで延長した水溶性ヒアルロン酸修飾物は知られて ヽな 、。
[0011] GLP—1アナログのポリマー結合体としては、 C末端で PEGと結合体ィ匕したものが 報告されて 、るが（国際公開 WO04Z022004号パンフレット、国際公開 WO03Z0 40309号パンフレット）、血中滞留性を改善した水溶性ヒアルロン酸修飾物と GLP— 1アナログとの結合体の報告は無 、。
特許文献 1：国際公開 W091Z11457号パンフレット、
特許文献 2：特開平 11Z310597号公報、
特許文献 3：国際公開 WO99Z43705号パンフレット、
特許文献 4:国際公開 WOOOZ069911号パンフレット、
特許文献 5:国際公開 W095Z31214号パンフレット、
特許文献 6 :国際公開 WO00Z07617号パンフレット、
特許文献 7：国際公開 WO03Z103572号パンフレット、
特許文献 8 :国際公開 WO97Z29180号パンフレット
特許文献 9：国際公開 WO92Z06714号パンフレット
特許文献 10：特開 2001— 81103号公報
特許文献 11 :特開平 2— 273176号公報
特許文献 12：特開平 5— 85942号公報
特許文献 13：国際公開 WO01Z05434号パンフレット
特許文献 14:国際公開 WO01Z60412号パンフレット
特許文献 15：特表 2002— 519481号公報
特許文献 16:国際公開 W094Z19376号パンフレット
特許文献 17：国際公開 WO04Z022004号パンフレット、
特許文献 18：国際公開 WO03Z040309号パンフレット
非特許文献 l :Trends Pharacol. Sci.第 24卷、第 377— 383頁、 2003年 非特許文献 2 :Int. J. Pharm.第 255卷、第 167— 174頁、 2003年 非特許文献 3 : Control. Rel.第 88卷、第 35— 42頁、 2003年
非特許文献 4 :J. Inter. Med.第 242卷、第 27— 33頁、 1997年
非特許文献 5 :Exp. Cell Res.第 228卷、第 216— 228頁、 1996年
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0012] 発明が解決しょうとする課題は、糖尿病、高血糖症、糖尿病性合併症、または肥満 症などの慢性疾患の予防または治療に有用な GLP— 1アナログ結合体であって、実 用的な血中滞留時間を有し、かつ生分解性で安全な GLP— 1アナログ結合体を提 供することにある。さらに、前記 GLP— 1アナログ結合体の製造方法、当該結合体の 製造に使用することができる GLP— 1アナログ、および当該結合体を含む医薬組成 物および治療方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0013] 本発明者は、カゝかる課題を解決する為に鋭意研究を進めたところ、非プロトン性極 性溶媒中で、特定の縮合剤を用い、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸の カルボキシ基に置換基をアミド結合で導入することにより得られた水溶性ヒアルロン 酸修飾物と GLP— 1アナログの結合体力 実用的なレベルの血中滞留時間を有する ことを見出し、また、当該結合体が持続的な血糖降下作用を有することを見出し、本 発明を完成させた。
[0014] 本発明の 1つの側面によれば、水溶性のヒアルロン酸修飾物に 1以上のグルカゴン 様ペプチド 1 (GLP— 1)アナログが結合した、ヒアルロン酸 ペプチド結合体、ま たはその塩が提供される。当該 GLP—1アナログは、多価、好ましくは 2価の連結基 を介して前記ヒアルロン酸修飾物に結合する。上記ヒアルロン酸 ペプチド結合体の 塩は、特に限定されないが、例えば医薬として許容な塩 (例えば、酸付加塩 (例えば 、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、リン酸塩など）、および塩基付加塩 (例え ば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩、アンモ -ゥム塩、テトラプチルアンモ -ゥム塩など））が含まれる。
[0015] 水溶性のヒアルロン酸修飾物は、特に限定はされないが、例えば、ヒアルロン酸の 分子中に含まれるカルボキシル基が置換アミド基に変換されたィ匕合物が用いられる。 本発明に使用される水溶性のヒアルロン酸修飾物は、好ましくは、ヒアルロン酸のグ ルクロン酸部分に含まれるカルボキシ基の 70%以上が N—置換アミド基に変換され ており、ここで当該ヒアルロン酸修飾物中の各 N—置換アミド基の置換基は同一であ つても異なってもよく、当該置換基の少なくとも 1つが前記 GLP— 1アナログと連結す る 2価の連結基でありうる。
[0016] 本発明の別の側面によれば、 GLP—1アナログ力 GLP—1 (1— 36)または GLP
- 1 (7- 36)の C末端側に— Xa— Cysで表されるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配 列、または当該アミノ酸配列において 1〜5個のアミノ酸が欠失、置換および Zまたは 付加されたアミノ酸配列力もなるペプチドであり（前記アミノ酸配列の置換は、天然ァ ミノ酸および Zまたは非天然アミノ酸により置換されてもよい）、ここで Xaは直接結合 またはプロリン、グリシン、セリンおよびグルタミン酸力も独立に選択される 1〜9のアミ ノ酸力 なる配列であり、当該ペプチドの C末端のシスティンのカルボキシ基はアミド 基に変換されていてもよい、既に記載のヒアルロン酸—ペプチド結合体、またはその 塩が提供される。
[0017] 本発明の当該側面における 1つの態様によれば、 GLP— 1アナログは、例えば、 G LP— 1 (1— 36)または GLP— 1 (7— 36)の C末端に—Xa— Cysで表されるアミノ酸 配列を付加したアミノ酸配列の 8位のァラニン (Ala8)が天然または非天然アミノ酸に 置換されて ヽる配列からなるペプチドであり、当該ペプチドの C末端のシスティンの力 ルポキシ基はアミド基に変換されていてもよい。ここで、前記ァラニンと置換する天然 または非天然アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、パリン、ロイシン、イソ口イシ ン、トレオニン、メチォニン、フエ二ルァラニン、ァスパラギン酸、グルタミン、アルギニ ンおよびァミノ酪酸などが挙げられる。好ましくは、前記ァラニンは、グリシン、セリン、 ノ リン、ロイシン、イソロイシンおよびスレオ-ンカも選択されるアミノ酸、さらに好ましく はグリシンおよびセリンカ 選択されるアミノ酸と置換される。
[0018] 本発明の当該側面における別の態様によれば、本発明に使用される GLP— 1アナ ログは、
His— Gly— Glu— Gly— Thr— Phe— Thr— Ser— Asp— Val— Ser— Ser— Tyr -Leu- Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe lie— Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg— Xa— Cys (配列番号 1 )
で表されるペプチド、または当該ペプチドの C末端のシスティンのカルボキシ基がアミ ド基に変換されたペプチドあってもよい。ここで、 Xaは既に定義した通りであり、例え ば直接結合または Gly— Pro— Pro Pro が含まれる。
[0019] 本発明の別の側面において、 GLP—1アナログが、 GLP—l (l— 36)、 GLP—1 ( 1 - 37) , GLP - 1 (7- 36)または GLP— 1 (7— 37)に、 一 Qa— SHで表されるメル カプトィ匕合物を付カ卩したアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において 1〜5個のァ ミノ酸が欠失、置換および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなるペプチドであり（ 前記アミノ酸配列は、天然アミノ酸および Zまたは非天然アミノ酸により置換されても よい）、
ここで Qaは一 NH— X5 、 一 CO— X5 または一 CONH— X5 力ら選択され、ぺ プチドの C末端アミノ酸残基に含まれるカルボキシ基、アミノ基または水酸基と連結し てアミド結合、ゥレア結合またはエステル結合を形成し、
X5は C アルキレン基であり、ここで当該アルキレン基の 1以上の個所において当
1-50
該アルキレン基に含まれる 2つの炭素原子の間に酸素原子が挿入されていてもよぐ 当該アルキレン基の炭素原子は、水酸基および C アルキル基から選択される 1以
1-6
上の置換基により独立に置換されていてもよい、既に記載のヒアルロン酸—ペプチド 結合体、またはその塩が提供される。
[0020] 本発明のさらなる側面において、 2価の連結基の一端が GLP— 1アナログに導入さ れたメルカプト基において結合する、既に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体、ま たはその塩が提供される。
[0021] 本発明のこの側面の 1つの態様において、 2価の連結基は、式 (I)：
[0022] [化 1]
Figure imgf000009_0001
[0023] [式中、 Qは C アルキレン基（例えば、 C アルキレン基を含む）であり、ここで当
1-400 1-10
該アルキレン基の 1以上の個所において当該アルキレン基に含まれる 2つの炭素原 子の間に酸素原子が挿入されていてもよぐさらに当該アルキレン基の 1以上の個所 において当該アルキレン基に含まれる炭素原子の間あるいは末端に CO—、 -N HCO または CONH が挿入されて!、てもよく、当該アルキレン基の炭素原子 は、水酸基および C アルキル基力 選択される 1以上の置換基により独立に置換さ
1-6
れていてもよく；
Xは、 -CH -CH— **、 -CH -CH -CH **、もしくは— CH (— CH )— CH
2 2 2 2 2 3 2 **であり、 Rは水素原子または C アルキル基であり；または
1-6
Xおよび Rは結合する炭素原子および窒素原子と一緒になつて、式 (Π)： [0024] [化 2]
Figure imgf000010_0001
[0025] で表される基を形成し；
*はヒアルロン酸修飾物中のアミド基の窒素原子への結合位置を表し、 **は GLP— 1 アナログのメルカプト基の硫黄原子への結合位置を表す]
で表されうる。
[0026] 上述の 2価の連結基には、例えば、式 (la)：
[0027] [化 3]
Figure imgf000010_0002
a ) [0028] [式中、 Q1は C アルキレン基であり、ここで当該アルキレン基の 1以上の個所にお
1-10
いて当該アルキレン基に含まれる 2つの炭素原子の間に酸素原子が挿入されていて もよぐ当該アルキレン基の炭素原子は、水酸基および C アルキル基から選択され
1-6
る 1以上の置換基により独立に置換されていてもよく；
X1は、 CH -CH— **、 -CH -CH -CH **、もしくは— CH (— CH )— CH
2 2 2 2 2 3 ί **であり、 R1は水素原子または C アルキル基であり；または
1-6
X1および R1は結合する炭素原子および窒素原子と一緒になつて、式 (Ila)： [0029] [化 4]
Figure imgf000011_0001
( I l a )
[0030] で示される基を形成し;または
X1は、式 (lb)：
[0031] [化 5]
Figure imgf000011_0002
[0032] (式中、 Qは C アルキレン基であり、ここで当該アルキレン基の 1以上の個所にお
1-10
いて当該アルキレン基に含まれる 2つの炭素原子の間には酸素原子が挿入されてい てもよく、当該アルキレン基の炭素原子は、水酸基および C アルキル基力 選択さ
1-6
れる 1以上の置換基により独立に置換されていてもよく；
X2は、 CH -CH— **、 -CH -CH -CH **、もしくは— CH (— CH )— CH
2 2 2 2 2 3 2 **であり、 R2は水素原子または C アルキル基であり；または X2および R2は結合する炭素原子および窒素原子と一緒になつて、式 (lib)
[0033] [化 6]
Figure imgf000012_0001
[0034] で示される基を形成し；または
X2は、式 (Ic)：
[0035] [化 7]
Figure imgf000012_0002
[0036] (式中、 Q3は C アルキレン基であり、ここで当該アルキレン基の 1以上の個所にお
1-10
いて当該アルキレン基に含まれる 2つの炭素原子の間には酸素原子が挿入されてい てもよく、当該アルキレン基の炭素原子は、水酸基および C アルキル基力 選択さ
1-6
れる 1以上の置換基により独立に置換されていてもよく；
X3は、— CH -CH— **、 -CH -CH -CH— **、— CH (— CH )— CH — **で
2 2 2 2 2 3 2 あり、 R3は水素原子または C アルキル基であり；または
1-6
X3および R3は結合する炭素原子および窒素原子と一緒になつて、式 (lie)：
[0037] [化 8] q [0038] で表される基を形成する）
で表される基であり）
で表される基であり；
*はヒアルロン酸修飾物中のアミド基の窒素原子への結合位置を表し、 **は GLP— 1 アナログのメルカプト基の硫黄原子への結合位置を表す]
で表される 2価の連結基も含まれる。
[0039] 上記式（la)において、 Q1は、例えば、式：—（CH ) —、または—（CH ) — (O— C
2 m 2 m
H CH )
2 2 n
[式中、 mは、例えば 1〜20、好ましくは 1〜15、より好ましくは 2〜10からそれぞれ独 立に選択される整数であり、 nは、例えば 1〜200、好ましくは 1〜25、より好ましくは 1 〜4から選択される整数である]
で表される基であってもよ 、。
[0040] 上記式（la)において、 X1は、例えば、式：一 （CH ) —CH—（O— CH—CH ) 一
2 m 2 2 2 p
NHCO- (CH ) — Y1— **、または—（CH )— Y1— **
2 q 2 r
[式中、 mは、例えば 1〜20、好ましくは 1〜15、より好ましくは 2〜10から選択される 整数であり、 ρは、例えば 1〜200、好ましくは 1〜25、より好ましくは 1〜4力 選択さ れる整数であり、 qおよび rは、例えば 1〜20、好ましくは 1〜15、より好ましくは 1〜1 0から選択される整数であり、 Y1は式 (lie)：
[0041] [化 9]
Figure imgf000013_0001
[0042] で表される基であり、
**は GLP— 1アナログのメルカプト基の硫黄原子への結合位置を表す] で表される基であってもよ 、。 [0043] 本発明のさらに別の側面によれば、式 (Via)：
[0044] [化 10]
Figure imgf000014_0001
[0045] [式中、 Ra^ Ra^ Ra""および Ra4は、それぞれ独立に、水素原子、 C アルキル基ま
1-6
たは C アルキルカルボニル基から選択され、
1-6
x°は、既に定義した Xまたは X1を表し、
Q。は、既に定義した Qまたは Q1を表し、
Rおよび **は、既に定義されたとおりである]
で表される繰り返し単位、および式 (VIb)：
[0046] [化 11]
Figure imgf000014_0002
[式中、
Figure imgf000015_0001
X°、 Q°、 Rおよび **は、既に定義されたとおりであり、 X6 は一 CH = CH 、 -CH 一 CH = CH 、 一 C (CH ) =CH 、 一 （CH ) 一 Y2または一
2 2 2 3 2 2 m
(CH ) 一（O CH— CH ) — Y2であり、 Υ2は式 (VII)：
[0048] [化 12]
Figure imgf000015_0002
[0049] で表される基であり、
mは、例えば 1〜20、好ましくは 1〜10から選択される整数であり、
nは、例えば 1〜200、好ましくは 1〜25から選択される整数である]
で表される繰り返し単位、および式 (Vic)：
[0050] [化 13]
Figure imgf000015_0003
[0051] [式中、 Ra1
Figure imgf000015_0004
Q。および Rは、既に定義されたとおりである]
で表される繰り返し単位を含む、既に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体、または その塩が提供される。
[0052] 本発明のさらに別の側面によれば、前記アミド基の窒素原子上に導入された置換 基の 1以上が、式 (IV)
[0053] [化 14]
Figure imgf000016_0001
( I V)
[0054] [Qおよび Rは既に定義したとおりであり、 Q4は C アルキレン基である]
1-6
で表される基である、既に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体、またはその塩が提 供される。
[0055] 本発明のさらに別の側面によれば、ヒアルロン酸に含まれるカルボキシ基の N 置 換アミド基への修飾率が 70モル0 /0以上である、既に記載のヒアルロン酸 ペプチド 結合体、またはその塩もまた提供される。
[0056] 本発明の 1つの態様において、 GLP—1アナログに結合した連結基により置換され たアミド基のヒアルロン酸 1分子に含まれるカルボキシ基に対する導入率は、例えば、 平均 0. 1モル％以上であり 15モル％以下であり、好ましくは 0. 1モル％〜10モル0 /0 であり、さらに好ましくは 0. 1モル％〜5モル0 /0である。また、本発明に係るヒアルロン 酸 GLP— 1アナログ結合体の平均分子量は、粘度平均分子量として測定した場合 、例えば、 5000ダルトン〜 100万ダルトン、好ましくは 1万ダルトン〜 30万ダルトン、 さらに好ましくは 8万ダルトン〜 30万ダルトンである。
[0057] 本発明のさらに別の側面によれば、既に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体、ま たはその塩を含む医薬組成物もまた提供される。当該医薬組成物の投与方法は、特 に限定されず、当該技術分野において当業者に周知の方法により投与されうるが、 例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与および経 肺投与から選択される手段によっても投与されうる。
[0058] 本発明のさらに別の側面によれば、既に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体、ま たはその塩を含む、糖尿病、高血糖症、糖尿病性合併症、および肥満症から選択さ れる疾患の予防または治療に使用される医薬が提供される。 [0059] 本発明のさらに別の側面によれば、既に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体、ま たはその塩の治療有効量を投与することを含む、糖尿病、高血糖症、糖尿病性合併 症、および肥満症力 選択される疾患の予防または治療方法もまた提供される。
[0060] 本発明のさらに別の側面によれば、非プロトン性極性溶媒中で、式 (V)：
[0061] [化 15]
Figure imgf000017_0001
[0062] [式中、 R1Q、 RU、 R12、 R13、 R14および R15は、それぞれ独立に C アルキル基から選
1-6
択され、または R10および RU、 R12および R13、ならびに R"および R15は、それぞれ独立 にそれらが結合する窒素原子と一緒になつて含窒素へテロ環を形成してもよぐ環 B は置換されて 、てもよ 、単環式または縮環式の含窒素へテロ環基であり、 X—はァ- オンを表す]
で表される縮合剤を使用して、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分に含まれるカルボキ シ基を、 N—置換アミド基に変換して水溶性ヒアルロン酸修飾物を得る工程を含む、 既に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体、またはその塩の製造方法が提供される 。ここで、前記非プロトン性極性溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチ ルァセトアミド、ジメチルスルホキシド、 1, 3 ジメチルー 2 イミダゾリジノン、スルホ ラン、 N—メチルピロリドンまたはこれらの 2種以上の混合溶媒が使用されうる。好まし くは、前記非プロトン性極性溶媒として、ジメチルスルホキシドが使用されうる。
[0063] 上記式 (V)において、環 Bは、好ましくはべンゾトリァゾールー 1ーィルであり、上記 式 (V)で表される縮合剤の例には、ベンゾトリァゾール一 1—ィルォキシ一トリス (ジメ チルァミノ）ホスホ-ゥム へキサフルォロホスフェート、ベンゾトリァゾールー 1ーィル ォキシートリス（ピロリジノ）ホスホ-ゥム へキサフルォロホスフェート、およびこれらの 混合物から選択される BOP系縮合剤が含まれる。
[0064] 本発明のさらに別の側面によれば、上記の製造方法により製造することができる、 既に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体、またはその塩が提供される。
[0065] 本発明のさらに別の側面によれば、 GLP— 1 (1 36)または GLP— 1 (7— 36)の C末端側に Xa— Cysで表されるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列、または当該 アミノ酸配列において 1〜5個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミ ノ酸配列からなるペプチドであり（前記アミノ酸配列の置換は、天然アミノ酸および Z または非天然アミノ酸により置換および/または付加されてもよい）、ここで Xaは直接 結合またはプロリン、グリシン、セリンおよびグルタミン酸力も独立に選択される 1〜9 のアミノ酸力もなる配列であり、当該ペプチドの C末端のシスティンのカルボキシ基は アミド基に変換されていてもよいペプチドである GLP—1アナログが提供される。
[0066] 本発明の当該側面の 1つの態様によれば、 GLP—1アナログは、 GLP—1 (1— 36 )または GLP - 1 (7- 36)の C末端に一 Xa - Cysで表されるアミノ酸配列を付カ卩した アミノ酸配列の 8位のァラニン (Ala8)が天然または非天然アミノ酸に置換されて!、る 配列からなるペプチドであり、当該ペプチドの C末端のシスティンのカルボキシ基が アミド基に変換されていてもよぐ Xaは既に定義されたとおりである。ここで、前記ァラ ニンと置換する天然または非天然アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、パリン、 ロイシン、イソロイシン、トレオニン、メチォニン、フエ-ルァラニン、ァスパラギン酸、グ ルタミン、アルギニンおよびアミノ酪酸などが挙げられる。好ましくは、前記ァラニンは 、グリシン、セリン、ノ リン、ロイシン、イソロイシンおよびスレオニンから選択されるアミ ノ酸、さらに好ましくはグリシンおよびセリンカ 選択されるアミノ酸と置換される。
[0067] 前記 GLP— 1アナログには、例えば、配列番号 1で表されるペプチド、または当該 ペプチドの C末端のシスティンのカルボキシ基がアミド基に変換されたペプチドが含 まれる。好ましくは、 Xaは、直接結合または Gly— Pro— Pro— Pro である。
[0068] 本発明の別の側面によれば、当該水溶性ヒアルロン酸修飾物は特に限定されな 、 力 ヒアルロン酸をその構成ユニットの 2糖にまで分解することができ且つ分解産物の 非還元末端に Δ 4, 5 グルクロン酸残基をもつ不飽和 2糖分解物を生成させるヒ アル口ニダ一ゼで該水溶性ヒアルロン酸修飾物を分解し、得られる分解産物の 232η mにおける吸収を測定した場合に、分解産物に由来する全吸収に対する 2糖に由来 する吸収の分率が 30%以下となるものが好ましい。
発明の効果
[0069] 本発明のヒアルロン酸修飾物 GLP— 1アナログ結合体を用いることで、その血中 滞留時間も延長が実現され、従来の技術では達成できなかった実用的でかつ安全 な GLP— 1アナログの持続性製剤、および当該アナログを含む糖尿病、高血糖症、 糖尿病性合併症、または肥満症の予防または治療薬を提供することが可能である。 図面の簡単な説明
[0070] [図 1]本発明に使用することができる水溶性ヒアルロン酸修飾物のヒアルロニダーゼ 処理後の GPCデータの一例である。
[図 2]本発明に使用することができる水溶性ヒアルロン酸修飾物 NMRデータの一例 である。
[図 3]本発明に使用することができる水溶性ヒアルロン酸修飾物のアミノ基をカルボン 酸へ変換した水溶性ヒアルロン酸修飾物 NMRデータの一例である（実施例 2— 2)。
[図 4]本発明に使用することができる水溶性ヒアルロン酸修飾物のアミノ基をカルボン 酸へ変換した水溶性ヒアルロン酸修飾物のヒアル口-ダーゼ処理後の GPCデータの 一例である。
[図 5]本発明に使用することができる水溶性ヒアルロン酸修飾物 NMRデータの一例 である（実施例 3— 1)。
[図 6]分子量の異なる蛍光標識 HA修飾物の血中濃度推移を示した図である。
[図 7]本発明に使用することができる水溶性ヒアルロン酸修飾物 NMRデータの一例 である（実施例 4—1)。
[図 8]分子量 200kDa HAから合成したアミノ基修飾率の違う蛍光標識 HA修飾物 の血中濃度推移を示した図である。
[図 9]HA修飾物のアミノ基修飾率と平均血中滞留時間（MRT)との相関およびアミノ 基修飾率とヒアル口-ダーゼにより分解される 2糖の分率との相関を示した図である。
[図 10]HA—GLP—1アナログ 1結合体をラットに静脈内投与したときの血漿中濃度 推移を示した図である。 [図 11]HA— GLP— 1アナログ 2結合体および対照化合物の GPCデータの一例であ る。
[図 12]HA—GLP—1アナログ 2結合体をラットに静脈内投与したときの血漿中濃度 推移を示した図である。
[図 13]HA—GLP—1アナログ 1結合体をラットに静脈内投与したときの血漿中濃度 推移を示した図である。
発明の実施の形態
[0071] 以下、本発明を更に具体的に説明する。
[0072] 本発明にお 、て使用されるヒアルロン酸修飾物の水溶性は、得られるヒアルロン酸 —ペプチド結合体が所望の効果をそうする限りにおいて特に限定されないが、水に 対して、例えば 0. 1〜： LOOOmgZmL、好ましくは l〜100mgZmLの溶解度を有す るヒアルロン酸修飾物を本発明に用いることができる。
[0073] 本発明にお ヽて使用される水溶性ヒアルロン酸修飾物は、非プロトン性極性溶媒な どの溶媒中で、縮合剤を用い、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸のカル ボキシ基を N—置換アミド基に変換することにより得ることができる。当該水溶性 HA 修飾物における修飾率は、修飾されたカルボキシ基の割合、すなわち N—置換アミド 基に変換されているカルボキシ基の割合である、アミド基導入率として以下の式：
[0074] [化 16]
〔各分子中の導入されたアミ ド基の合計数）
(ァミド基導入率) = X 1 0 0
(各分子中のダルク口ン酸の合計数）
[0075] により算出される。本発明に使用される水溶性 HA修飾物の N—置換アミド基導入率 の下限は 70%以上であることが好ましぐ 85モル％以上であることがさらに好ましい。 また、導入率の上限は 100モル％以下であればょ 、。
[0076] 上記の N—置換アミド基への変換反応は、ヒアルロン酸またはその誘導体と種々の アミン類を適当な縮合剤を用いることにより行うことができる。ここで使用されるァミン 類は、特に限定されないが、例えば、以下の式：
H N- (CHR5) 一而； HN- CH CH (OCH CH ) NH；
2 2 2 2 2 n 2
HN- - (CHR5) -OH;
2
HN- CH CH - (OCH CH ) -OH;
2 2 2 2 2 n
HN- - (CHR5) SR6;
2 m
HN- CH CH - (OCH CH ) -SR6;
2 2 2 2 2 n
HN- - (CHR5) O— CO— C(R7)=CH；
2 m 2
HN- - (CHR5) CO -O- (CHR5) -C(R7) ： CH；
2 m P
HN- - (CHR5) -NHCO— C(R7)=CH；
2 m 2
HN- - (CHR5) -NHCO-CH C(R7) =CH；
2 m 2 2
HN- - (CHR5) -CONH—（CHR5) — C(R7):
2 m P
HN- CH CH - (OCH CH ) NHCO— C(R7)
2 2 2 2 2
HN- CH CH - (OCH CH ) NHCO- CH C(R7)=CH
2 2 2 2 2 2 2
HN- CH CH - (OCH CH ) CONH- - (CHR5) -C(R7)
2 2 2 2 2 P
HN- CH CH - (OCH CH ) O— CO -C(R7)=CH；
2 2 2 2 2 2
HN- CH CH - (OCH CH ) CO— O - (CHR5) -C(R7) CH
2 2 2 2 2 P
HN- CH CH - (OCH CH ) NHCO- (CH) Y2;
2 2 2 2 2 2 m
HN- CH CH - (OCH CH ) CONH- (CH) Y2;
2 2 2 2 2 2 m
HN- CH CH - (OCH CH ) NHCO- CH CH - (OCH CH) -Y2;
2 2 2 2 2
HN- CH CH - (OCH CH ) -CONH CH CH - (OCH CH) -Y2;
2 2 2 2 2 n
HN- - (CHR5) -NHCO—（CH) - -Y2;
2 m 2 m
HN- - (CHR5) -CONH—（CH) - -Y2;
2 m
HN- - (CHR5) NHCO-CH CH (OCH CH ) Y ;
2 m 2 2 2 2 n
HN- - (CHR5) CONH— CH CH (OCH CH ) Y2;
m
HN- - (CHR5) - Y；または
HN- CH CH— (O-CH CH ) Y2
2 2 2 2 n
[式中、存在する mは、各々独立に、例えば 1〜20、好ましくは 1〜： L0力も選択される 整数であり、
存在する nは、各々独立に、例えば 1〜200、好ましくは 1〜25から選択される整数 であり、
存在する pは、各々独立に、例えば 0〜20、好ましくは 0〜 10から選択される整数で あり、
存在する R5は、各々独立に、水素原子、 C アルキル基および水酸基から選択さ
1-6
れ、
R6は、各々独立に、水素原子、 C アルキル基およびメルカプト基の保護基 (例え
1-6
ば、ピリジルスルフイド基、ァセチル基、トリチル基およびエトキシカルボニルェチル基 など)から選択され、
R7は、各々独立に、水素原子および C アルキル基力 選択され、
1-6
Y2は、式 (VII)：
[0077] [化 17]
Figure imgf000022_0001
[0078] で表される基である]
で表されるァミン類が挙げられる。したがって、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分に含 まれるカルボキシ基が N 置換アミド基に変換されているヒアルロン酸修飾物のうち、 置換基が以下の基：
(CHR5) 一而；
m 2
-CH CH (OCH CH ) -NH；
2 2 2 2 n 2
— (CHR5) -OH ;
m
CH CH (OCH CH ) -OH ;
2 2 2 2 n
一（CHR5) — SR6;
m
CH CH (OCH CH ) -SR6;
2 2 2 2 n
- (CHR5) -0-CO-C (R7) =CH； - (CHR5) CO— O—（CHR5) — C(R7)=CH ;
m p 2
- (CHR5) NHCO— C(R7)=CH ;
m 2
- (CHR5) -NHCO-CH C(R7) =CH；
m 2 2
- (CHR5) -CONH-(CHR5) —C(R7)=CH ;
m p 2
CH CH (OCH CH ) NHCO— C(R7) =CH；
2 2 2 2 n 2
CH CH (OCH CH ) -NHCO-CH C(R7) =CH；
2 2 2 2 n 2 2
CH CH— (OCH CH ) CONH— (CHR5) C(R7) =CH；
2 2 2 2 n p 2
-CH CH - (OCH CH) -0-CO-C(R7)=CH；
2 2 2 2 n 2
-CH CH - (OCH CH) -CO-0-C(R7)=CH；
2 2 2 2 n 2
— CH CH - (OCH CH ) -NHCO- (CH ) — Y2;
2 2 2 2 n 2 m
— CH CH— (OCH CH ) -CONH- (CH ) — Y2;
2 2 2 2 n 2 m
CH CH (OCH CH ) -NHCO-CH CH (OCH CH ) Y2;
2 2 2 2 n 2 2 2 2 n
CH CH— (OCH CH ) CONH— CH CH (OCH CH ) Y2;
2 2 2 2 n 2 2 2 2 n
一（CHR5) — NHCO—（CH) — Y2;
m 2 m
一（CHR5) — CONH—（CH) — Y2;
m 2 m
(CHR5) -NHCO-CH CH (OCH CH ) —Y2;
m 2 2 2 2 n
(CHR5) CONH— CH CH (OCH CH ) —Y2;
m 2 2 2 2 n
- (CHR5) — Y2;または
m
CH— CH (O-CH CH ) Y2
2 2 2 2 n
であるヒアルロン酸修飾物は、それぞれ対応するアミン類カも製造することができる。
[0079] 本発明のヒアルロン酸—ペプチド結合体の合成のために好ましいアミン類は、ジァ ミン類（H N- (CHR5) 一而、および H N-CH—CH—（O— CH—CH )
2 m 2 2 2 2 2 2 η
ΝΗ )である。上記のジァミン類は例えばシグマ アルドリッチ社などから市販されて
2
おり、適宜購入して利用することができる。また、文献記載の方法に従い、もしくは文 献記載の方法を参考にして合成してもよ 、。
[0080] 上記の溶媒としては極性有機溶媒が好ましぐ特に非プロトン性極性溶媒が好まし い。非プロトン性極性溶媒と水との混合溶媒、あるいは、水を溶媒に使用した場合に は、何れの縮合剤を用いても実用上十分な血中滞留性を付与するために必要な導 入率を得ることが難しい。使用可能な非プロトン性極性溶媒は、ジメチルホルムアミド (以下、「DMF」とも称す）、ジメチルァセトアミド（以下、「DMAc」とも称す）、ジメチル スルホキシド（以下、「DMSO」とも称す）、 1, 3 ジメチル— 2—イミダゾリジノン（以 下、「DMI」とも称す）、スルホラン（以下、「SF」とも称す）、 N—メチルピロリドン（以下 、「NMP」とも称す)またはそれらの 2種以上の混合溶媒等が挙げられる。好ましくは 、ジメチルホルムアミド、ジメチルァセトアミド、ジメチルスルホキシド、 N メチルピロリ ドンまたはそれらの 2種以上の混合溶媒であり、特に好ましくは、ジメチルスルホキシ ドである。
[0081] 上記反応溶媒中の反応基質の濃度は、特には限定されないが、反応基質となるヒ アルロン酸中の N ァセチルダルコサミン—グルクロン酸の繰り返し単位（ユニット）の モル濃度として、例えば、 0. 025〜250mmolZL、好ましくは、 0. 25〜50mmolZ Lの範囲力 選択されうる。
[0082] 反応温度は特に限定されないが、例えば、 4〜80°C、好ましくは 4〜40°C、より好ま しくは 20〜40°Cの範囲力 選択されうる。
[0083] 上記の縮合剤としては、式 (V)：
[0084] [化 18]
Figure imgf000024_0001
[0085] [式中、 R1Q、 Ru、 R"、 R"、 R14、 R15、環 Bおよび X—は、既に定義したとおりである] で示される縮合剤を用いることができる。ここで、環 Bは、酸性プロトンを有さない含窒 素へテロ環基であれば特に限定されず、 C アルキル基またはハロゲン原子などの
1-6
置換基により置換されていてもよい。環 Bには、例えばピロリジン一 2, 5 ジオン一 1 —ィル、 3, 4 ジヒドロ一 3 ヒドロキシ一 4—ォキソ 1, 2, 3 ベンゾトリアジン、ベ ンゾトリァゾールー 1ーィルなどが含まれる。 X—には、例えばフッ化物イオン、塩化物 イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオンなどのハロゲン化物イオン、 CF SO―、 BF―、 P
3 3 4
F—などが含まれる。
6
[0086] R1Qおよび RU、 R12および R13、ならびに R14および R15が、それらが結合する窒素原子 と一緒になつて形成する含窒素へテロ環としては、 5〜7員飽和含窒素へテロ環など が好ましぐ具体的にはピロリジン、ピぺリジン、ホモピぺリジンなどが含まれる。
[0087] 好ましくは、当該縮合剤は環 Bがべンゾトリアゾール 1—ィルである BOP系縮合 剤である。好ましい BOP系縮合剤としては、ベンゾトリアゾール 1—ィルォキシ一ト リス（ジメチルァミノ）ホスホ-ゥム へキサフルォロホスフェート（以下、「： BOP」とも称 す）、ベンゾトリァゾール一 1—ィルォキシ一トリス（ピロリジノ）ホスホ-ゥム へキサフ ルォロホスフェート（以下、「PyBOP」とも称す）、およびこれらの混合物が挙げられる 。 BOP系縮合剤は単独でまたは適宜組み合わせて利用することができる。
[0088] ヒアルロン酸とジァミン類を反応させる場合、ヒアルロン酸中に含まれるカルボキシ ル基、すなわちヒアルロン酸中の N ァセチルダルコサミンーグルクロン酸の繰り返し 単位（1ユニット）に対して等量以上のジァミン類を用いて反応させることが好ましぐ ( ジァミン類） Z(HAユニット）のモル比は、例えば、 1〜： L000、好ましくは 20〜750、 より好ましくは 50〜500の範囲力も選択されうる。さらに、ジァミン類を導入する場合 に使用する縮合剤のモル比 (縮合剤 ZHAユニット）は、ジァミン類のアミノ基の反応 性により適宜調整される力 例えば、 1〜： L0、好ましくは 1〜5、より好ましくは 1〜3の 範囲から選択されうる。
[0089] 上記の製造工程において使用されうるヒアルロン酸 (HA)は HA骨格を有していれ ば特に限定されず、 HAの一部を誘導体化した HA誘導体や、酵素、熱分解等で低 分子化した HA、 HA及び HA誘導体の塩（ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩 、カルシウム塩、アルミニウム塩、等）なども含まれる。本発明に用いられる HAは、ど のようにして得られた HAでもよぐ動物組織力ゝら抽出された HA、発酵法で得られた HA、化学合成で得られた HAなど、その由来は限定されない。また、 HAを有機溶 媒に可溶化する為に、テトラプチルアンモ-ゥム塩等の疎水性の高い対イオンにィォ ン交換したものを用いてもょ 、。上記の製造工程にお 、て使用されうるヒアルロン酸 誘導体としては、例えば、一部をアルキル化、アルキルエステルイ匕あるいは脱ァセチ ルイ匕したものなどが挙げられる。
[0090] ここで、 N—置換アミド基の導入率は、プロトン NMRで定量することができる。具体 的には、プロトン NMRで得られるァミノ化された HA修飾物中のアミノ化合物の量と、 HA由来のピークとの比較から求めることができる。例えば、エチレンジァミン (以下、 「EDA」とも称す)でアミノ基を導入したヒアルロン酸修飾物（以下、「HA— AM」とも 称す）のプロトン NMRから得られるァミン化合物由来のピーク（2. 9〜3. lppm :測 定溶媒 D O)と、 HA由来のピーク（1. 8〜1. 9ppm :測定溶媒 D O)の比を実測する
2 2
[0091] アミノ基を導入したヒアルロン酸修飾物（以下、「HA— AM」とも称する）は、アミノ基 に適当な置換基を導入することにより、本発明のヒアルロン酸 ペプチド結合体の前 駆体として使用することができる。上記方法によりヒアルロン酸またはヒアルロン酸誘 導体とジァミン類とを反応させて得られるヒアルロン酸修飾物は、例えば以下の式 (V Id)
[0092] [化 19]
Figure imgf000026_0001
[0093] [式中、
Figure imgf000026_0002
Q。および Rは、既に定義されたとおりである]
で表される繰り返し単位を分子内に含む、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸修飾物 であり、本発明のヒアルロン酸 ペプチド結合体の前駆体として使用することができる
[0094] 本発明に係るヒアルロン酸 ペプチド結合体の調製方法は、既知のポリマーの薬 物との結合体ィ匕で使用されている方法を用いることができる。例えば、水溶性 HA修 飾物のアミノ基と、 GLP— 1アナログのカルボキシ基との脱水縮合反応； GLP— 1ァ ナログのァミノ基と、水溶性 HA修飾物のカルボキシ基との脱水縮合反応；水溶性 H A修飾物のアミノ基と、イソチオシァネート、イソシァネート、ァシルアジド、 N—ヒドロ キシコハク酸イミド (以下、「NHS」とも称す)エステルおよびエポキシドなどとして修飾 基が導入された GLP— 1アナログとの反応； GLP— 1アナログのァミノ基と、イソチォ シァネート、イソシァネート、ァシルアジド、 NHSエステルおよびエポキシドなどとして 修飾基が導入された水溶性 HA修飾物との反応；水溶性 HA修飾物のアミノ基と、ァ ルデヒドおよびケトンなどのカルボ-ル化物として修飾基が導入された GLP— 1アナ ログとのシッフ塩基形成ならびに還元アミノ化反応； GLP— 1アナログのァミノ基と、ァ ルデヒドおよびケトンなどのカルボニル化物として修飾基が導入された水溶性 HA修 飾物とのシッフ塩基形成ならびに還元アミノ化反応;水溶性 HA修飾物に導入したメ ルカプト基と、マレイミド、アクリルエステル、アクリルアミド、メタクリルエステル、メタタリ ルアミド、ァリル化物、ビニルスルホンおよびメルカプト化物などとして修飾基が導入さ れた GLP— 1アナログとの反応； GLP— 1アナログに導入したメルカプト基と、マレイミ ド、アクリルエステル、アクリルアミド、メタクリルエステル、メタクリルアミド、ァリル化物、 ビニルスルホンおよびメルカプト化物などとして修飾基が導入された水溶性 HA修飾 物との反応;水溶性 HA修飾物に導入したアビジンと、 GLP— 1アナログに導入した ピオチンとの結合; GLP— 1アナログに導入したアビジンと、水溶性 HA修飾物に導 入したピオチンとの結合；などを利用することができる。水溶性 HA修飾物あるいは G LP— 1アナログへこれらの修飾基 (アビジンおよびピオチン由来の基を含む）を導入 するには、これらの修飾基およびカルボキシ基（このカルボキシ基は NHSエステルな どの活性エステルとなっていてもよい）力も任意に選ばれる 2つ以上、好ましくは 2つ の基を分子内に有する化合物が用いられ、この化合物においては、これらの基以外 の分子内の構造は、結合体を調製するまでの間に不都合な反応が進行しないもの であれば、特に限定されない。該化合物は試薬として入手可能である力、または文献 公知の方法を参考にして合成してもよ!/ヽ。
具体的には、 N—置換アミド基の置換基力 アミノ基を含む水溶性 HA修飾物 (HA —AM)を合成し、ここで、ァミノ基の一部を N—スクシンィミジル 3 - [2—ピリジルジ チォ]プロピオネート（N— Succinimidyl 3 - [2-pyridyldithio]propinate ; SP DP)と反応させ、メルカプト基を導入した HA (以下、「HA— SH」とも称す)を調製す る。この際、余剰のアミノ基は、例えば無水コハク酸等で処理、カルボキシ基に戻して トータル電荷をァ-オン性にした方が好ましい。一方で、 GLP— 1アナログにメルカプ ト基と特異的に反応する修飾基として、マレイミド、ビニルスルホン、アタリロイル、メタ クリロイル、ァリルなどを導入する。これを HA—SHと反応させ結合体を調製してもよ い。
[0096] また逆に、 N—置換アミド基の置換基がアミノ基を含む水溶性 HA修飾物の当該ァ ミノ基を修飾することにより二重結合を含有する基を導入し、さら〖こ、メルカプト基含有 GLP—1アナログと反応させることにより、本発明の結合体を調製してもよい。二重結 合を含有する基を導入した水溶性 HA修飾物は、例えば、式 (VId)：
[0097] [化 20]
Figure imgf000028_0001
[0098] [式中、
Figure imgf000028_0002
Q。および Rは、既に定義されたとおりである]
で表される繰り返し単位を分子内に含むヒアルロン酸修飾物を、適切な試薬と反応さ せることにより、式 (VIb) :
[0099] [化 21]
Figure imgf000029_0001
[0100] [式中、
Figure imgf000029_0002
Q°、 Rおよび X6は、既に定義されたとおりである]
へ変換すること〖こより調製することができる。上記反応において使用されうる試薬とし ては、例えば、アクリル酸クロリド (X6が一 CH = CHの場合）、メタクリル酸クロリド（一
2
C (CH ) =CHの場合）、 Ν— ( γ—マレイミドブチリルォキシ)スルホサクシンイミドエ
3 2
ステル、 Ν— ( κ マレイミドウンデカノィルォキシ)スルホサクシンイミドエステル（以 上、 X6が—（CH ) — Υ2の場合）、および Ν ヒドロキシサクシンィミジル— 15— (3—
2 m
マレイミドプロピオ-ル) アミドー 4, 7, 10, 13—テトラォキサペンタデカノエート（以 下、「NHS— (EO) —MI」とも称する）、 N ヒドロキシサクシンィミジル一 75— (3—
4
マレイミドプロピオ-ル)—アミド— 4, 7, 10, 13, 16、 19、 22、 25、 28、 31、 34、 37 、 40、 43、 46、 49、 52、 55、 58、 61、 64、 67、 70、 73—テ卜ラコサォキサペンタへ プタコンタノエート（以上、 X6が— CH— CH— (O— CH— CH ) —Y2の場合）が挙
2 2 2 2 η
げられる。余剰のアミノ基は、例えば無水コハク酸等で処理してもよい。
[0101] 一方で GLP—1アナログにはシスティンを導入する力、またはメルカプト基を有する リンカ一を反応させておき、これを ΗΑ—マレイミドと反応させ結合体を調製してもよい 。これらの中で、特に好ましいのは、マレイミド基とメルカプト基の反応であり、例えば 、 GLP— 1アナログに導入されたシスティンのメルカプト基と HA— AMの一部に ΝΗ S - (EO) —MIで導入したマレイミド基との反応で結合体ィ匕したものが好ましい。 G
4
LP— 1アナログの導入率は、 HA1分子当たり平均 0. 1モル％以上であり 15モル％ 以下が好ましい。導入率が少ないと相対的に投与量に占める HA量が増大し、高用 量の GLP— 1アナログを投与しょうとしたときに現実的な投与用量では HAの濃度が 上がってしまい、高い粘度となり投与が困難になる。一方、導入率が高すぎると結合 体の不溶ィ匕が起こり易くなる。
[0102] また、本発明に用いられるマレイミド基等の結合体用官能基を導入した後の HA— AM残存したアミノ基は、 GLP— 1アナログの結合前に、例えば無水コハク酸、無水 マレイン酸、無水グルタル酸および無水アジピン酸などのジカルボン酸無水物などで 処理するか、マレイン酸、ダルタル酸およびアジピン酸などのジカルボン酸を縮合剤 共存下で反応させることで、末端の官能基をカルボキシ基に戻してトータル電荷をァ ユオン性にした方が血中滞留時間の延長には好ましい。特に無水コハク酸が好まし い。ここで用いられる縮合剤は、特に限定されず、例えば、ベンゾトリアゾール 1— ィルォキシートリス（ジメチルァミノ）ホスホ-ゥム へキサフルォロホスフェート、ベンゾ トリァゾールー 1—ィルォキシートリス（ピロリジノ）ホスホ-ゥム へキサフルォロホスフ エート、 N, Ν'—カルボ-ルジイミダゾール、 Ν, Ν'—ジシクロへキシルカルボジイミド 、 1ーェチルー 3—（3 ジメチルァミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、 EDCZ3, 4 —ジヒドロ一 3 ヒドロキシ一 4—ォキソ 1, 2, 3 ベンゾトリアジン、 Ν—エトキシカ ルボニルー 2 エトキシ一 1, 2 ジヒドロキノリン、 4— (4, 6 ジメトキシ Dimethoxy —1, 3, 5 トリァジン— 2—ィル）—4—メチルモルホリウムクロリド n—水和物、 2— (1H ベンゾトリアゾール 1—ィル） 1, 1, 3, 3—テトラメチルゥ口-ゥム テトラフ ルォロボレートならびにこれらの混合物などを使用することができる。
[0103] また、 GLP— 1アナログとの結合体とした時に実用的な血中滞留時間を得るための ヒアルロン酸修飾物としての観点では、本発明に用いられる水溶性 HA修飾物の分 子量も、その体内動態を左右する。本発明に用いられる原料 HAの分子量は特に制 限されな 、が、余りに低分子量では得られた水溶性 HA修飾物の血中滞留時間が短 くなる。逆に、余りに高分子量になると得られた水溶性 HA修飾物の粘度が非常に高 くなり、高濃度での投与が難しくなる。また、本発明に用いられる水溶性 HA修飾物の 血中滞留時間は分子量が一定以上大きくなるとほとんど変化しなくなるので、通常、 原料 HAの分子量は粘度平均分子量で 5000ダルトン〜 100万ダルトンであることが 好ましぐ 1万ダルトン〜 30万ダルトンであることがより好ましぐ 8万ダルトン〜 30万ダ ルトンであることがさらに好ましい。
[0104] なお、 HA重量平均分子量の測定方法については、例えば、中浜精一他著「エツセ ンシャル高分子科学」（講談社発行、 ISBN4— 06— 153310— X)に記載された、光 散乱法、浸透圧法、粘度法等、各種の公知の方法を利用することができ、本明細書 において示される粘度平均分子量もウベローデ粘度計を使用するなど、本発明が属 する技術分野において通常用いられる方法により測定することができる。
[0105] 本発明に用いられる水溶性 HA修飾物の血中滞留時間は、ラットで平均血中滞留 時間が 18時間以上のものであることが好ましぐ 25時間以上のものがより好ましい。
[0106] また、本発明の別の側面によれば、本発明に使用される水溶性 HA修飾物は、原 料 HAに比べてヒアル口-ダーゼによる分解に対して耐性を有するものである。ここで 、「ヒアル口-ダーゼによる分解に対して耐性を有する」とは、原料 HAと本発明の水 溶性 HA修飾物をそれぞれヒアル口-ダーゼにより酵素分解させた際に、原料 HAよ りも分解速度が遅いかまたは分解が進まない性質を有することを指す。例えば、 HA 修飾物 lmgに対してヒアル口-ダーゼを 0. 4ユニット添カ卩して 37°Cで 24時間ヒアル 口-ダーゼ処理した際に、原料 HAで観察される 2糖分解物より少な ヽか 2糖分解物 が観察されなければ「分解が進まない」性質を有する（即ち、ヒアル口-ダーゼによる 分解に対して耐性を有する）と判定することができる。具体的には、例えば、ヒアルロ ン酸をその構成ユニットの 2糖にまで分解することができ且つ分解産物の非還元末端 に Δ— 4, 5—グルクロン酸残基をもつ不飽和 2糖分解物（例えば、式 IVの化合物を 含む）：
[0107] [化 22]
Figure imgf000031_0001
[0108] を生成させるヒアルロニダ一ゼで該水溶性ヒアルロン酸修飾物を分解し、得られる分 解産物の 232nmにおける吸収ピークを測定して判定することができる。当該測定は 、通常の高速液体クロマトグラフィーを用いて当該技術分野において通常用いられる 方法により行うことができ、例えばゲル浸透クロマトグラフィー（GPC)カラム（例えば S uperdex200 10/300 GL、 Superdex75HR 10/30および Superdex Pept ideHR 10/30 (V、ずれもアマシャムバイオサイエンス株式会社製）を連結したもの など)を使用することができる。また使用する溶離液は特には限定されないが、例え ば PBS (例えば、 SIGMA製 Phosphate Buffered Saline Tablets 2錠をとり、 精製水 400mLに溶解させて得たもの)を使用することができる。
[0109] 本発明で用いる水溶性ヒアルロン酸修飾物としては、上記方法で測定した場合、分 解産物に由来する全ピークエリアに対する 2糖に由来するピークエリアの分率の上限 が 30%以下であることが好ましい。さらに好ましくは 20%以下、さらに好ましくは 13% 以下である。また、下限は 0%以上であればよい。
[0110] ここで、分解産物に由来する全ピークエリアに対する 2糖に由来するピークエリアの 分率は、以下の式：
[0111] [化 23]
2糖のピークエリア
2糖分率 （％) = X I 0 0
液の全ピークエリア） 一 （酵素非翻口時全ピークエリア）
[0112] で求めることができる。また、ヒアル口-ダーゼとしては、例えばヒアル口-ダーゼ SD ( 生化学工業株式会社製)等を使用することができる。
[0113] GLP— 1アナログと結合体とした時に実用的な血中滞留時間を得るためのヒアルロ ン酸修飾物としての観点では、本発明に用いられる水溶性 HA修飾物は、特に限定 はされないが、例えば室温において生理食塩水に対して 10mgZmL〜100mgZm Lの溶解度を有する。実際に治療を目的として投与される時の HA修飾物の濃度は 5 Omg/mL以下が好まし!/、。
[0114] 本明細書において「C アルキル基」とは、炭素数 1〜6の直鎖状、分岐鎖状のアル キル基を意味し、例えば、メチル、ェチル、 n—プロピル、 i—プロピル、 n—ブチル、 s ーブチル、 iーブチル、 t—ブチルなどの「C - Cアルキル基」が含まれ、さらに、 n—
1 4
ペンチル、 3—メチルブチル、 2—メチルブチル、 1ーメチルブチル、 1 ェチルプロピ ル、 n—へキシル、 4ーメチルペンチル、 3—メチルペンチル、 2—メチルペンチル、 1 ーメチルペンチル、 3 ェチルブチル、および 2 ェチルブチルなどが含まれる。
[0115] 本明細書において「C - Cアルキルカルボ-ル基」とは、炭素数 1〜6の直鎖状、
1 6
分岐鎖状のアルキル基を有するアルキルカルボ-ル基を意味し、例えば、ァセチル 、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ピバロィル、バレリル、イソバレリル、へキサノ ィルなどが含まれる。
[0116] 本明細書において「C アルキレン基」とは、炭素数 1〜400の直鎖状アルキレン
1-400
基を意味し、例えば、 C アルキレン基、 C アルキレン基、 C アルキレン基、 C
1-200 1-100 1-50 1- アルキレン基、 などが含まれる。ここで、当該アルキレン基が 1以
20 c アルキレン基
1-10
上の個所において当該アルキレン基に含まれる 2つの炭素原子の間に酸素原子が 挿入されていてもよい場合、当該定義には、例えば、 - CH CH (OCH CH )
2 2 2 2 n
(ここで nは 0〜 199から選択される整数)で表されるエチレンォキシド基などが含まれ る。
[0117] 本明細書において天然アミノ酸とは、グリシン、ァラニン、セリン、プロリン、パリン、ト レオ-ン、システィン、ロイシン、イソロイシン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、リジン、 グルタミン、グルタミン酸、メチォニン、ヒスチジン、フエ-ルァラニン、アルギニン、チ 口シン、トリプトファンなど力も選択される α—アミノ酸の他に、 β—ァラニンなどの β —アミノ酸、 y—ァミノ酪酸などの γ—アミノ酸、およびタウリンなどのアミノスルホン酸 などが含まれる。また、非天然 α アミノ酸には、アルキル側鎖を持つ a—アミノ酸（ 例えば、ノルパリン、ノルロイシン、 t一口イシンなど）、シクロアルキル基で置換された ァラニンやグリシン（例えば、シクロペンチルァラニン、シクロへキシルァラニン、シクロ へキシルグリシンなど）、またはァリール基で置換されたァラニンやグリシン (例えば、 ピリジルァラニン、チェ-ルァラニン、ナフチルァラニン、置換フエ-ルァラニン、フエ ニルダリシンなど）などが含まれる。
[0118] 本発明において導入される置換基の導入量は、縮合剤の HAに対する添加量など で調節することができる。
[0119] また、本発明に使用される水溶性 HA修飾物の電荷が、 GLP— 1アナログとの結合 体後にカチオン性であった場合、生体膜などとの非特異的相互作用により血中滞留 時間の短縮に繋がるため、酸無水物、ラタトン、ラクチドあるいは活性エステルを含む 化合物などと反応させることによりノ-オン性力、ァ-オン性に変換することが好まし い。
[0120] 本発明に使用される水溶性 HA修飾物の調製方法では、例えば、テトラプチルアン モ -ゥム (TBA)塩化した HAを DMSOに溶解し、分子の両末端にアミノ基を 1つずつ 有するジァミノ系化合物を添加、 HAのカルボキシ基に BOP系縮合剤で縮合させ、 アミノ基を導入した HA (以下、「HA— AM」とも称す)を合成できる。
[0121] GLP— 1アナログとの結合体合成は、活性低下を抑える上力も部位特異的な結合 体ィ匕が好ましい。
[0122] 本発明の GLP—1アナログには、例えば、 01^—1 (1 36)または01^—1 (7— 3 6)などの天然型 GLP - 1フラグメントの C末端側に一 Xa— Cysで表されるアミノ酸配 列を付加したアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列にお 、て 1以上 (例えば 1〜： LO 個、好ましくは 1〜5個）のアミノ酸が欠失、置換および Zまたは付加されたアミノ酸配 列からなるペプチドが含まれる。ここで、前記アミノ酸配列は、天然アミノ酸および Z または非天然アミノ酸により置換および Zまたは付加されてもよぐ Xaは直接結合ま たは独立に選択される 1以上 (例えば 1〜9個、好ましくは 1〜4個）のアミノ酸 (天然ァ ミノ酸および非天然アミノ酸から選択される）からなる配列であり、当該ペプチドの C末 端のシスティンのカルボキシ基はアミド基に変換されて 、てもよ 、。
[0123] さらに GLP—1アナログには、 GLP—l (l— 36)、 GLP—l (l— 37)、 GLP—1 (7 — 36)または GLP— 1 (7— 37)に、 Qa— SHで表されるメルカプトィ匕合物を付カロし たアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において 1以上 (例えば 1〜： LO個、好ましく は 1〜5個）のアミノ酸が欠失、置換および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなる ペプチドも含まれる。前記アミノ酸配列の置換は、天然アミノ酸および Zまたは非天 然アミノ酸により置換されてもょ 、。
[0124] ここで Qaは一 NH— X5 、 一 CO— X5 または一 CONH— X5 力ら選択され、ぺ プチドの c末端アミノ酸残基に含まれるカルボキシ基、アミノ基または水酸基と連結し てアミド結合、ゥレア結合またはエステル結合を形成する。
[0125] X5は C アルキレン基であり、ここで当該アルキレン基の 1以上の個所において当
1-50
該アルキレン基に含まれる 2つの炭素原子の間に酸素原子が挿入されていてもよぐ 当該アルキレン基の炭素原子は、水酸基および C アルキル基から選択される 1以
1-6
上の置換基により独立に置換されて 、てもよ 、。
[0126] 本発明の 1つの態様において、 GLP— 1アナログは、 GLP— 1 (1— 37)、 GLP— 1
(7- 37) , GLP - 1 (7- 36)等の天然型 GLP— 1構成アミノ酸の 1〜5残基を置換、 欠失、付加したアナログ、及び当該アナログの C末端のアミノ酸残基を 1〜： LO残基の アミノ酸配列で置換したアナログまたは C末端側に a アミノ基を除くアミノ基、カル ボキシ基あるいは水酸基にアミド結合、ゥレア結合あるいはエステル結合を介して X5— SHで表されるメルカプトィ匕合物が付カ卩した GLP— 1アナログを示す。ここで置 換、付加されるアミノ酸残基は天然型でも非天然型であってもよ ヽ。
[0127] GLP—1アナログとしては、 DPPIV耐性を示すことが期待される置換と部位特異的 な結合体ィ匕部位としてメルカプト基を与えるアナログが好ましい。具体的には、少なく とも天然型の GLP— 1の 2番目（8位）のァラニンを他の天然型或 、は非天然型のアミ ノ酸残基に置換したアナログにおいて、さらに当該アナログの C末端のアミノ酸残基 を—Xa— Cysで表されるアミノ酸配列 (Xaは直接結合またはプロリン、グリシン、セリ ンおよびグルタミン酸力 独立に選択される 1〜9のアミノ酸力 なる配列を示す)で 置換した GLP-1アナログ（ここで C末端のシスティンはアミド化されていてもよい）、あ るいは C末端側アミノ酸の a アミノ基を除くアミノ基、カルボキシ基あるいは水酸基 にアミド結合、ゥレア結合あるいはエステル結合を介して— X5— SHで表されるチォ 一ルイ匕合物が付カ卩した GLP— 1アナログが好まし 、。
[0128] 好ましい GLP— 1アナログとしては、天然型の GLP—l (Human、 7— 37 ;特表平 7
504679号公報記載）のアナログであり、例えば、 GLP— 1 (7— 36)—Xb— Cys、 GLP—1 (7— 36)—Xb— CysNH、 [Gly8]—GLP— 1 (7— 36)—Xb— Cys、 [Gly
2
8] -GLP- 1 (7- 36) -Xb- CysNH、 [Ser8] GLP— 1 (7— 36)— Xb— Cysゝ
2
[Ser8] -GLP- 1 (7— 36) -Xb- CysNH、 [Val8]— GLP—1 (7— 36)— Xb— C ys、 [Val8]— GLP— 1 (7— 36)— Xb— CysNH、 [Leu8]—GLP— 1 (7— 36)—X
2
b— Cys、 [Leu8]— GLP— 1 (7— 36)— Xb— CysNH、 [lie8]—GLP— 1 (7— 36)
2
— Xb— Cys、 [lie8]— GLP— 1 (7— 36)— Xb— CysNH、 [Thr8]— GLP— 1 (7—
2
36)— Xb— Cys、 [Thr8]—GLP— 1 (7— 36)—Xb— CysNH (式中、 Xbは、直接
2
結合または Gly— Pro— Pro— Pro—を表す）、 GLP— 1 (7— 37) NH—X5— SH、 G LP— 1 (7— 36)— Lys— ε — NHCO— X5— SH、 GLP— 1 (7— 36)—LysNH -
2 ε — NHCO— X5— SH、 [Gly8]—GLP— 1 (7— 37) NH—X5— SH、 [Gly8]— GL P - 1 (7 - 36) -LysNH - ε — NHCO— X5— SH (式中、 X5は、— (CH )―、直
2 2 n 接結合または—（CH CH O) —であり、 nおよび mは 1〜20から選択される整数で
2 2 m
ある）
などが含まれる。なお、上記の CysNHはカルボキシ基がアミド化されたシスティンを
2
、 LysNHはカルボキシ基がアミド化されたリシンを表す。
2
[0129] 特に、天然型の GLP—1の 2番目（8位）のァラニンをグリシンに、 31番目（37位）の グリシンをシスティンに変更したアナログ、天然型 GLP— 1の 2番目をグリシンに、 31 番目（37位）のグリシンをグリシン-プロリン一プロリン一プロリン一システィンに変更し たアナログが好ましい。また、 GLP— 1アナログの C末端は周知の方法でアミド化され ていてもよい。
[0130] 本発明の GLP—1アナログの合成は、通常用いられる、固相法、液相法による化学 合成法でも、大腸菌や動物細胞を宿主として製造される組み換え培養法でも、無細 胞タンパク質合成法でも良 、。
[0131] 本発明の結合体は、 1種もしくはそれ以上の薬学的に許容し得る希釈剤、湿潤剤、 乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤等を含む医薬組成物と して、 目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。
[0132] 本発明の結合体を含む医薬組成物は、非経口的に全身又は局所的に投与するこ とができる。例えば、点滴などの静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、 鼻腔内投与、経肺投与などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与 方法を選択することができる。有効投与量は、投与経路、投与頻度によって異なる。 副作用（悪心、嘔吐等）の発生を抑制しつつ薬効を得るための血中濃度として、 2pM 力も 20000pMが想定されるので、当該血中濃度となるように投与量を調整すること が好ましい。
[0133] 本発明を適用することができる糖尿病性合併症は特に限定されず、例えば、糖尿 病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性動脈硬化症、糖尿病性 心筋梗塞、脳梗塞、糖尿病性足病変などが挙げられる。
[0134] 本発明により、従来の方法では得られない、長期間の持続性糖尿病医薬を提供す ることが可能である。
[0135] 本発明により、血中滞留時間が延長された実用的でかつ安全な GLP— 1アナログ 結合体を製造することが可能となる。
実施例
[0136] 以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明する力 本発明はこれら の実施例に限定されるものではない。
[0137] NMR測定は、核磁気共鳴装置 JNM— ECA500 (日本電子株式会社製)を用い て測定した。 NMRの測定条件を以下に示す：
Data point : 16384
Spectral width (X sweep)： 15ppm
Acquisition time (X acq time)： 1. 749s
Pulse delay (Relaxation delay)： 30s
Transients (Scans)： 64
温度：室温
測定溶媒: D O
2
また、以下の記載中の HAユニットとは、ヒアルロン酸中の N ァセチルダルコサミン ーグルクロン酸の繰り返し単位（1ユニット）を意味する。
〔実施例 1〕非プロトン性極性溶媒中でのヒアルロン酸修飾物の合成 (縮合剤、溶媒 混合比率、酵素分解性）
非極性溶媒中における様々な合成条件を検討し、各条件で得られたヒアルロン酸 修飾物の酵素耐性の評価を行った。
(実施例 1 1) テトラプチルアンモ-ゥムヒドロキシド（シグマ アルドリッチ社製)でテトラブチノレア ンモ -ゥム（TBA)塩化した DOWEX 50WX8 - 400 (シグマ―アルドリッチ社製）を 用いて、分子量 200kDaのヒアルロン酸ナトリウム (HA;電気化学工業株式会社製） を TBA塩ィ匕した。得られたテトラプチルアンモ-ゥム塩ィ匕ヒアルロン酸（以下、「HA — TBA」とも称す） 29. lmgを 2. OmgZmL濃度となるよう DMSO (和光純薬株式 会社製）に溶解した。 HAユニット ZBOP (和光純薬株式会社製) Zエチレンジァミン (以下、「EDA」とも称す；シグマ—アルドリッチ社製） = 1Z2. 5/100 (mol/mol/ mol)の当量比で EDA、 BOPの順で添カ卩し、室温下でー晚反応させた。その後、 1 M NaCl水溶液を 10mL加えた後、 5N HC1をカ卩えて pHを 3まで低下させ、さらに 2N NaOHにて中和を行った。大過剰量の蒸留水（ミリ Q水）に対して透析精製し（ スぺクトラポア 4、分画分子量（以下、「MWCO」とも称す）： 12k— 14kDa)、限外ろ 過後 (YM— 10、 MILLIPORE社製）、凍結乾燥して標題のァミノ基が導入されたヒ アルロン酸（以下、「HA— AM」とも称す） 25. 8mgを得た。
(実施例 1 2)
エチレンジァミンの代わりに 2, 2 '—(エチレンジォキシ）ビス（ェチルァミン）（以下、 「EDOBEA」とも称す；シグマ一アルドリッチ社製）を用い、 HA— TBA 35. lmgを 用い、 HAユニット ZBOPZEDOBEA= lZ2. 5Z50 (molZmolZmol)の当量 比で反応させたこと以外は実施例 1 1と同様の方法で行 、、ァミノ基が導入されたヒ アルロン酸（HA— AM) 27. 2mgを得た。
(実施例 1 3)
EDOBEAの代わりにへキサメチレンジァミン（HMDA；シグマ アルドリッチ社製） を用い、 HA—TBA 62. Omgを用いたこと以外は実施例 1—2と同様の方法で行い 、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸（HA— AM) 41. lmgを得た。
(実施例 1 4)
BOPの代わりに PyBOP (国産化学株式会社製）を用い、 HA— TBA 51. 8mgを 用いたこと以外は実施例 1—2と同様の方法で、ァミノ基が導入されたヒアルロン酸（ HA-AM) 39. Omgを得た。
(試験例 1)酵素分解性評価 実施例 1 1〜1 4で得られた HA— AMを 2mg/mL濃度に蒸留水（ミリ Q水）に 溶解した。この溶液 55 /z Lに 0. 2Mリン酸緩衝液 (pH6. 2) 132 Lおよび水 77 L を加え、ヒアル口-ダーゼ SD (生化学工業株式会社製） lU/mL溶液 (0. 01%BSA を含む 0. 05Mリン酸緩衝液 (pH6. 2) )44 Lをカ卩えて 37°Cで 24時間インキュベー トした。各サンプル 100 Lを分取し、 50mM酢酸溶液を 720 L加え反応を停止さ せた。対照として酵素非添加群も同様に行った (データ省略)。それぞれゲル浸透ク 口マトグラフィー（以下、「GPC」とも称す）に供して HA— AMの分子量の変化、分解 産物の生成パターンを観察した（232nmの吸収)。 GPCの条件を以下に示す。
[0138] GPC Column： Superdex200 10/300 GL、 Superdex75HR 10/30, S uperdex PeptideHR 10Z30 (アマシャムバイオサイエンス株式会社製）（3本連 結）
Eluent: PBS (pH7. 4)
Flow Rate : 0. 4mL/ mm
Injection Volume : 50 ^ L
Detection： UV (232nm)
2糖分解ピーク（Retention Time : 130分）は観察されなかった。また、 GPCデー タを図 1に示す (実施例 1 1〜 1—4)。
[0139] また、実施例 1 1〜1 4のァミノ基導入率をプロトン NMR法で定量した (HA:N —ァセチル基のメチルプロトン、 1. 8〜1. 9ppm、 AM :遊離のァミノ基に隣接するメ チレンプロトン、 2. 9〜3. lppm)。プロトン NMRデータを図 2に示す。アミノ基導入 率はそれぞれ 97. 5、 75. 5、 88. 3、 84. 5%だった。
〔実施例 2〕カルボン酸変換した HA修飾物のヒアル口-ダーゼ耐性評価
より詳細に酵素耐性を評価するために、導入した一級アミンをコハク酸アミドに変換 した HA修飾物（HA— AM - SUC)の合成を行!ヽ、得られた HA修飾物の酵素耐性 の評価を行った。
(実施例 2— 1) EDOBEA導入 HA修飾物の合成
HA(200kDa)— TBAの DMSO溶液（4. OmgZmL)を 6つ用意し、各溶液に 2, 2'— (エチレンジォキシ）ビス（ェチルァミン）（EDOBEA)を HAユニット ZEDOBE A= lZ50 (molZmol)の当量比でカ卩え、 BOPを HAユニットに対し、 0. 4、 0. 6、 0 . 8、 1. 0、 1. 5、 1. 85または 2. 5の当量比でカ卩え、ー晚反応させた。その後反応混 合物の容量の半分量の 1M NaCl水溶液をカ卩え、 5N HC1にて pHを 3まで低下さ せた後、 2N NaOHにて中和を行った。その後 0. 3M NaCl水溶液に対して透析 を行い、次に大過剰量の蒸留水 (ミリ Q水）に対して透析精製し (スぺクトラポア 4、分 画分子量（MWCO)： 12k- 14kDa)、凍結乾燥を行い、 EDOBEA導入 HA修飾物 を得た。
(実施例 2— 2)—級ァミンのコハク酸アミドへの変換
上記（実施例 2— 1)で得られたサンプルを蒸留水（ミリ Q水）で 20. OmgZmLの溶 液とし、これに 0. 2M炭酸緩衝液 (pH9. 0)をカ卩え、 10. Omg/mLとした。この溶液 に HAのユニットに対して 20モル倍の無水コハク酸（和光純薬株式会社製）を HA— AM溶液の 1/10容量の DMSO溶液として加えて室温で 30分間撹拌した。その後 0. 3M NaCl水溶液に対して透析を行い、次に大過剰量の蒸留水（ミリ Q水）に対し て透析精製し (スぺクトラポア 4、分画分子量 (MWCO) : 12k— 14kDa)、凍結乾燥 を行ない、 HA— AM— SUCを得た。 NMR ^ベクトルを図 3に示す。ァミノ基の隣の メチレンのピーク（2. 9〜3. 1)が完全に消失し、新たにコハク酸由来のピーク（2. 4 〜2. 6ppm)が観察され、ァミノ基がコノ、ク酸アミドに変換され新たにカルボキシ基が 導入されていることが明ら力となった。
(実施例 2— 3)酵素分解性評価
実施例 2— 2で得られた HA— AM— SUCを 4mg/mL濃度で蒸留水（ミリ Q水）に 溶解した。この溶液 25 /z Lに 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH6. 2) 200 Lおよび水 25 L を加え、ヒアル口-ダーゼ SD (生化学工業株式会社製） lU/mL溶液 (0. 2Mリン酸 緩衝液; PH6. 2)50 Lを加えて 37°Cで 24時間インキュベートした。各サンプル 10 0 Lを分取し、 50mM酢酸溶液を 700 Lカ卩ぇ反応を停止させた。対照として酵素 非添加群も同様に行った (データ省略)。それぞれゲル浸透クロマトグラフィー（以下 、「GPC」とも称す）に供して HA— AM— SUCの分子量の変化、分解産物の生成パ ターンを観察した（232nmの吸収)。結果を図 4および表 1に示す。
また、 GPCの条件を以下に示す。 [0140] GPC Column： Superdex200 10/300 GLゝ Superdex PeptideHR 10 Z30(アマシャムバイオサイエンス株式会社製）（2本連結）
Eluent:PBS(pH7.4)
Flow Rate:0.4mL/ mm
Injection Volume : 50^ L
Detection： UV(232nm)
[0141] [表 1] 表 1. アミ ド基導入率とヒアルロニダ一ゼ而村生の相関
全ピークエリアに対する
導入率
2糖のピークエリアの割合 (%)
18.0 88.9
30.0 52.5
45.5 22.5
56.5 11.9
66.5 12.9
94.5 0.0
96.0 0.0
[0142] ここで分解産物のうちの 2糖分率は溶媒由来のピーク（Retention Time :90分） を除いた範囲で 100 X (2糖のピークエリア) Z (全ピークエリア—酵素非添カ卩時全ピ ークエリア )(％)として算出した。酵素耐性はアミド基の導入率、すなわち HAのカルボ ン酸の修飾率に対応して酵素耐性が上がることが明ら力となった。
〔実施例 3〕ヒアルロン酸修飾物（HA— AM— SUC)の分子量と血中滞留時間との相 関 (分子量依存性）
ヒアルロン酸修飾物（HA— AM— SUC)の血中滞留性を分子量の観点カゝら解析 するために、 23k、 100kおよび 200kDaの HAから HA修飾物を合成し、蛍光色素で ある FITCを導入したサンプルを調製し、それぞれの血中滞留性を観察した。 (実施例 3— 1 ) HA— AMの合成
HA(23kDa)—TBAの DMSO溶液（2mgZmL)、 HA(lOOkDa)—TBAおよび HA (200kDa)—TBAのそれぞれの DMSO溶液（4mgZmL)を調製した。 HAュ ニット ZBOPZ2, 2'—（エチレンジォキシ）ビス（ェチルァミン）（EDOBEA) = 1Z2 . 5/50 (mol/mol/mol)の当量比で EDOBEA、 BOPの順で各溶液に添カロし、 室温下で一晩反応させた。その後、反応混合物の容量の半分量の 1M NaCl水溶 液をカ卩えた後、 5N HC1をカ卩えて pHを 3まで低下させ、さらに 2N NaOHにて中和 を行った。大過剰量の蒸留水 (ミリ Q水）に対して透析精製し (スぺクトラポア 4、分画 分子量（MWCO)： 12k- 14kDa)、限外ろ過後（YM— 10、 MILLIPORE社製）、 凍結乾燥して標題のァミノ基が導入された N—置換アミド化ヒアルロン酸 (HA— AM )を得た。アミド基導入率はプロトン NMR法で定量した。 NMRチャートを図 5に示す（ HA:N—ァセチル基のメチルプロトン、 1. 8〜1. 9ppm、 AM： EDOBEA部分のメ チレンプロ卜ン、 2. 9〜3. lppm)。それぞれ導入率は 23kDa : 87モル0 /0、 lOOkDa : 92. 5モル0 /0、 200kDa : 93. 5モル0 /。であった。
(実施例 3— 2)蛍光標識 HA修飾物の合成
上記（実施例 3— 1)で得られた HA— AMを蒸留水（ミリ Q水）で溶解し 20. Omg/ mLの溶液とし、これに 0. 2M炭酸緩衝液 (pH9. 0)をカ卩え、濃度を 10. OmgZmLと した。この溶液に HAのユニットに対して 0. 07モル倍のフルォレセインイソチォシァ ネート（以下、「FITC」とも称す；ピアス社製）を HA— AM溶液の 1Z10容量の DMS O溶液としてカ卩えて室温で 1時間撹拌した。その後、 HAのユニットに対して 40モル 倍の無水コハク酸（和光純薬株式会社製）を HA— AM溶液の 1Z10容量の DMSO 溶液として加えて室温で 30分間撹拌した。 PD— 10カラム（アムシャムバイオサイエ ンス株式会社製）によるゲル濾過で粗精製した後、大過剰量の 0. 5M NaCl水溶液 に対して透析精製した (スぺクトラポア 4、分画分子量 (MWCO) : 12k—14kDa)。 透析外液を蒸留水 (ミリ Q水）に置換してさらに透析精製し、得られた水溶液を凍結乾 燥して蛍光標識ィ匕 HA— AM— SUCを得た。
ここで得られた各蛍光標識 HA— AM— SUCを 0. 25mgZmL濃度で 50mM炭酸 緩衝液 (PH9. 0)に溶解し、その溶液の 494nmにおける吸光度カゝら FITC由来の N フルォロセィ-ルチオ力ルバモイル基のモル濃度を定量し、以下の式に従って各 ユニットの濃度を算出した。さらに、モル分率への変換、 HA修飾物中の HA由来の 重量分率算出を行った。
未修飾 H Aユニット： X nmol/mL
HA— AM— SUCユニット： y nmolZmL (AMが無水コハク酸処理されたユニット) [0144] [化 24] 式 1 ： (401.3 X x) + (631.58 X y) + (544.97 X (残存 AM cone. )) + (898.9 X (FTC じ on ))=250μ g
式 2 ： x/(y+ (残存 AM cone.) + (FTC cone. ) ) - ( (100-AM (%) ) ) /AM (%)
[0145] なお、式中の残存 AM cone.とは未反応のアミノ基を有するユニットのモル濃度を 意味し、 FTC cone.とは FTC基を有するユニットのモル濃度を意味する。
[0146] 得られた結果を表 2にまとめた。
[0147] [表 2] 表 2. 動態試験用 F I T C標識 H A -AM- SUC
残存 HA— AM- F I TC HA- AM- SUC 未修飾 ΤίΑ
分子量 AM (%) AM (%) ュニット ュニット ュニット ΗΑ
(k D a ) N R TNB s (モル (モル％) (モル％) (重最％)
23 87.0 1.0 86.0 13.0 63.7
100 92.5 0.9 91.6 7.5 62.3
200 93.5 1.5 0.7 91.3 6.5 62.9
¾量限界以下
(比較例 3— 1)蛍光標識 ΗΑ— ΗΖ— SUCの合成
580kDaのヒアルロン酸ナトリウム（電気化学工業株式会社製)を 0.25%濃度 (w Zv)で蒸留水に溶解し、 5N塩酸で pHを 4.7〜4.8に調整した。 1ーェチルー 3—（ 3 -ジメチルァミノプロピル)カルボジイミド (EDC)とアジピン酸ジヒドラジド（以下、「A DH」とも称す）を、 HAのユニット： EDC： ADH =1:5: 40のモル比になるよう添カロし 、 5N塩酸で pHを 4. 7〜4. 8に保ちながら室温で 2時間反応させた。大過剰量の 10 OmM塩化ナトリウム溶液、 25%エタノール水溶液、蒸留水（ミリ Q水）に対して順に透 析 (スぺクトラポア 7、分画分子量 (MWCO) : 12k—14kDa)し、凍結乾燥してヒドラ ジド基が導入されたヒアルロン酸（HA— HZ)を得た。 HA—HZ中の HZ導入率を A DH導入率としてプロトン NMR法で定量したところ、 HAのカルボキシ基の 73%であ つた o
[0149] この HA—HZを蒸留水（ミリ Q水）に溶解させた後、等量の lOOmM炭酸緩衝液 (p H9. 0)を加えて終濃度を lmgZmLに調整した。これに FITCZHAのユニット = 3. OmolZmolの仕込比で、 HA— HZ溶液の 1 Z 10容量の DMSOに溶解させた FIT Cを添加し、室温、遮光下に 1時間反応させた。反応溶液 25mLを予め 50mM炭酸 緩衝液 (PH9. 0)で平衡ィ匕した PD— 10カラム（10本）に投入し、未反応の FITCを 除去した。この粗精製した溶液に無水コハク酸 ZHZ = 250molZmolの仕込比で、 DMSOに溶解させた無水コハク酸を添加し（3. 5mL)、同様に反応させた。反応混 合物を大過剰量の蒸留水 (ミリ Q水）に対して透析精製し、凍結乾燥して HA— HZを FITC標識した蛍光標識 HA— HZ— SUCを得た。
[0150] 得られた各蛍光標識 HA— HZを 0. 25mgZmL濃度で 50mM炭酸緩衝液 (pH9 . 0)に溶解し、その溶液の 494nmにおける吸光度力も FITC濃度を定量し、以下の 式に従って各ユニットの濃度を算出した。さらに、モル分率への変換、 HA修飾物中 の HA由来の重量分率算出を行った。
[0151] 未修飾 HAユニット： X μ mol/mL
HA— HZ— SUCユニット： y molZmL (HZが無水コハク酸処理されたュ-ッ ト）と定義し、以下の式より算出した。
[0152] [化 25] 式 1 ： (379. 3 X x) + (635. 57 X y) + (924. 88 X (FITC cone. ) ) = 250 mg 式 2 : x / (y + (FITC cone. ) ) - (100- HZ (%) ) I HZ (%)
[0153] なお、式中 FITC cone.とは FITC基を有するユニットのモル濃度を意味する。得ら れた結果を表 3にまとめた。 [0154] [表 3] 薬物動態試験用 F I T C標識 HA_H Z _ S U C 残存 HA-FITC HA-SUC 未鶴 HA
HZ (%) HZ (%) ュニット ュニット ュュット HA
丽 TNBS (モル %) (モル %) (モル％) (劃
73 - 1. 1 71. 9 27. 0 67. 8
-：定量限界以下
[0155] (実施例 3— 3)血中滞留時間評価
HA投与ラット血漿サンプル
実施例 3— 2および比較例 3— 1の蛍光標識 HA修飾物を lOmgZkgの用量でラッ ト静脈内（iv)および皮下（sc)に単回投与し、投与前および投与後 0. 0833、 0. 5、 2、 4、 8、 24、 48、 72、 96、 168時間に採血（へパリン処理）し、遠心分離により血漿 を得た。この血漿サンプルは測定まで— 20°C以下で凍結保存した。
[0156] 沏 I 法
GPCにより検量線用標準試料および測定用試料の分析を行った。以下に条件を 示す。
[0157] GPC Column :TSKgel G6000PW (TOSOH社製）
XL
Mobile phase： PBS (pH7. 4)
Elution mode： Isocratic
Flow rate : 0. 5mL/ min
Inj ection volume :40 ^ L
Detection： Fluorescence (EX： 494nm, EM： 518nm)
測定試料の調製
•検量線用試料；
各蛍光標識 HA修飾物を PBS (pH7. 4)を用いて希釈し、 1、 5、 10、 50、 100、 50 0 μ gZmLおよび 0 μ g/mL (対照、 PBS (pH7. 4) )の標準液を調製した。この標 準液に等容量の正常ラット血漿を添加し検量線用試料を調製した。
•測定用試料の調製；
HA修飾物投与ラット血漿サンプルに等容量の PBS (pH7.4)を添加して測定用 試料を調製した。
ο
•血漿中の HA修飾物濃度の算出；
解析ソフト Milleniu 、 -—m Ver 3.21 (Waters社製）を用いてピーク面積を算出した 。各標準試料のピーク面積力 得られた検量線より血漿中の HA修飾物濃度を算出 した。
[0158] 薬物動餱データ
実施例 3— 2および比較例 3— 1の蛍光標識 HA修飾物の蛍光標識 HA修飾物の 血中濃度推移のデータについて、 WinNonlin Ver 4.0.1 (Pharsight社製）で 薬物動態学的パラメーターを算出した。各個体の最終測定点 3点のデータを用いて モデル非依存的解析を行い、半減期 (tlZ2)、平均血中滞留時間 (MRT)を算出し た。蛍光標識 HA修飾物の血中濃度推移を図 6に示し、算出した薬物動態学的パラ メーターを表 4に示す。
[0159] [表 4] 表 4. F I TC標識化 H A誘導体の薬物動態学的パラメータ一
分子最 導入率 C 1
MRT (h) t 1/2
(kDa) (%： NMR) (mL/h r/k g)
23 (iv) 87.0 2.44 86.0 47.3
92.5 0.76 91.6 49.3
200 (iv) 93.5 0.87 91.3 44.7
23 (sc) 87.0 5.40 83.9 50.8
92.5 2.18 101.4 56.5
200 (sc) 93.5 3.76 98. 7 57.6
580 Civ) 73.0 (HZ) 2.52 16.3 11.2 蛍光標識化 HA修飾物を用いた薬物動態試験により、非プロトン極性有機溶媒中 で合成した本発明 HA修飾物（実施例 3— 2)は HAおよびこれまで報告された HA誘 導体 (HA— HZ— SUC ;特許文献 12、 13および 14を参照）と比較して、ラット単回 静脈内投与後の血中滞留時間が大幅に改善されることが確認された。これまでに報 告された分子量 600kDaの HA修飾物（70モル％修飾）においてもラット単回静脈内 投与後の平均血中滞留時間（MRT)は 16時間程度であり、血中滞留性が 5. 5倍程 度延長されていることが明ら力となった。 23kDa HA修飾物に関しては、初期段階 で血中濃度が減少する傾向が観察され、一部低分子 HA修飾物が腎排泄されてい る可能性が示唆された。 lOOkDaおよび 200kDaの HA修飾物に関しては、血中滞 留性に関する特性 (CL、 MRT, tlZ2)はほぼ同様の値となった。
〔実施例 4〕ヒアルロン酸修飾物（HA— AM— SUC)のアミド基導入率と血中滞留時 間との相関
ヒアルロン酸修飾物（HA—AM— SUC)の血中滞留性を修飾率の観点から解析 するために、 200kDaの HA力 様々な修飾率の HA修飾物を合成し、蛍光色素で ある FITCを導入したサンプルを調製し、それぞれの血中滞留性を観察した。
(実施例 4 1 ) H A— AMの調製
HA(200kDa)— TBAの DMSO溶液（4. OmgZmL)を 5つ調製し、各溶液に H Aユニット ZEDOBEA= 1/50 (molZmol)の当量比で EDOBEAを添カ卩し、 BOP 試薬を HAユニットに対し、 0. 25、 0. 5、 0. 75、 1. 0、または 1. 5の当量比でそれ ぞれの溶液に加え、一晩反応させた。その後反応混合物の容量の半分量の 1M N aCl水溶液を加え、 5N HC1にて pHを 3まで低下させた後、 2N NaOHにて中和を 行った。その後大過剰量の蒸留水 (ミリ Q水）に対して透析精製し (スぺクトラポア 4、 分画分子量（MWCO)： 12k- 14kDa)、限外ろ過後（YM— 10、 MILLIPORE社 製)、凍結乾燥を行った。置換基の末端にアミノ基を有する N 置換アミド基導入率 はプロトン NMR法で定量した。 NMRチャートを図 7に示す。（HA:N ァセチル基 のメチルプロトン、 1. 8〜1. 9ppm、 AM : EDOBEA部分のメチレンプロトン、 2. 9〜 3. lppm)それぞれ導入率は BOP試薬比率 0. 25 : 20. 0モル％、 0. 5 : 36. 5モル %、 0. 75 : 54. 5モル0 /0、 1. 0 : 69. 0モル0 /0、 1. 5 : 90. 5モル0 /。であった。 (実施例 4 2)蛍光標識化 HA修飾物の合成
実施例 4 1で得られた HA— AMのそれぞれを、蒸留水（ミリ Q水）で 20. Omg/ mLの濃度に溶解し、これ〖こ 0. 2M炭酸緩衝液 (pH9. 0)をカ卩ぇ濃度を 10. Omg/m Lとした。これらの溶液に HAのユニットに対して 0. 07モル倍（69%および 90. 5%ァ ミド導入率の HAの溶液）、 0. 175モル倍（54. 5%アミド導入率の HAの溶液）、 0. 28モル倍（36. 5%アミド導入率の HAの溶液）および 0. 63モル倍（20. 0%アミド導 入率の HAの溶液）のフルォレセインイソチオシァネートを HA— AM溶液の 1Z10 容量の DMSO溶液としてカ卩え、室温で 1時間撹拌した。その後、 HAのユニットに対 して 40モル倍の無水コハク酸を HA— AM溶液の 1Z10容量の DMSO溶液として 加え、室温でさらに 30分間撹拌した。 20%ァミン修飾物は大過剰量 DMSOへ透析 を行った後、またその他のサンプルは直接、大過剰量の 25%EtOH水溶液に対して 透析し (スぺクトラポア 4、分画分子量（MWCO) : 12k— 14kDa)、その後、 0. 5M NaCl水溶液に対して透析精製した。透析外液を蒸留水 (ミリ Q水）に置換してさら〖こ 透析精製し、得られた水溶液を凍結乾燥して蛍光標識ィ匕 HA— AM— SUCを得た。
[0161] ここで得られた各蛍光標識化 HA— AM— SUCを 0. 25mgZmL濃度で 50mM炭 酸緩衝液 (PH9. 0)に溶解し、その溶液の 494nmにおける吸光度カゝら FITC濃度を 定量し、以下の式に従って各ユニットの濃度を算出した。さらに、モル分率への変換 、 HA修飾物中の HA由来の重量分率算出を行った。
未修飾 H Aユニット： X nmol/mL
HA— AM— SUCユニット： y nmolZmL (AMが無水コハク酸処理されたユニット) [0162] [化 26] 式 1 ： (401. 3 X X) + (631. 58 X y) + (544. 97 X (残存 AM cone. ) ) + (898. 9 X (FITC cone. ) =250 μ g
式 2 ： x/ (y+ (残存 AM cone. ) + (FITC cone. ) ) = ( ( 100-AM (%) ) ) /AM (%)
[0163] 得られた結果を表 5にまとめた。
[0164] [表 5] 表 5. 動態 ϊ¾¾用 F I TC標識化 HA— AM— SUC
BOP):匕率 残存 ΠΛ-ΛΜ-F I TC HA-A -SUC 未修飾 ΗΛ
(BOP AM (%) AM (%) 卜 HA
HAュニット NMR TNBS 隱％)
0.25 20.0 1.6 0.3 18.1 80.0 87.2
0.50 36.5 2.4 0.9 33.2 63.5 81.7
0.75 54.5 2.4 1.6 50.5 45.5 75.6
1.00 69.0 0.6 68.4 31.0 68.2
1.50 90.5 - 0.9 89.6 9.5 62.8
-：定量限界以ト'
[0165] (実施例 4 3)血中滞留時間評価
HA投与ラット血漿サンプル
実施例 4— 2の蛍光標識 HA修飾物を lOmgZkgの用量でラット静脈内に単回投 与し、投与前および投与後 0. 5、 2 4、 8、 24, 48, 72、 96, 168時間に採血（へパ リン処理)し、遠心分離により血漿を得た。この血漿サンプルは測定まで— 20°C以下 で凍結保存した。
[0166] 沏 I 法
96穴プレートに検量線用標準試料および測定用試料を分注しマイクロプレートリー ダーを用いて分析を行った。以下に条件を示す。
[0167] マイクロプレートリーダー： SPECTRA MAX GEMINI (Molecular Devices 社製）
Sample volume： 100 μ L/ well
Detection： Fluorescence (EX： 485nm， EM： 538nm)
測定試料の調製
•検量線用試料；
各蛍光標識 HA修飾物を PBS (pH7. 4)を用いて希釈し、 1、 5、 10、 50、 100、 50 0 μ gZmLおよび 0 μ g/mL (対照、 PBS (pH7.4) )の標準液を調製した。この標 準液に等容量の正常ラット血漿を添加し検量線用試料を調製した。 •測定用試料の調製；
HA修飾物投与ラット血漿サンプルに等容量の PBS (pH7.4)を添加して測定用 試料を調製した。
•血漿中の HA修飾物濃度の算出；
解析ソフト SOFTmax PRO (Molecular Devices社製）を用いて各標準試料の 蛍光強度から得られた検量線より血漿中の HA修飾物濃度を算出した。
[0168] 薬物動餱データ
実施例 4 2の蛍光標識 HA修飾物の血中濃度推移のデータにつ 、て、 WinNonl in Ver 4.0.1 (Pharsight社製)で薬物動態学的パラメーターを算出した。各個 体の血漿中濃度推移についてモデル非依存的解析を行い、平均血中滞留時間（M RT)を算出した。半減期 (tlZ2)は各個体の測定可能な最終 3点のデータを用いて 算出した。蛍光標識 HA修飾物の血中濃度推移を図 8に示し、 AM導入率と MRTの 関係を図 9に示す。また、算出した薬物動態学的パラメーターを表 6に示す。
[0169] [表 6] 表 6. N 置換ァミドィヒ H A誘導体の薬物動態学的パラメーター
導入率 （°/。： NMR) C 1 (mL/h r/k g) MRT (h) t 1/2
20.0 16.37 2.81 1.95
36.5 12.96 2.90 1.62
54.5 10.47 4.26 2.76
69.0 1.20 49.6 36.7
90.5 0.97 60.6 44.5
[0170] 図 9に示されるアミド基導入率と MRTとの関係から、修飾率が 50%の後半力 急 激に MRTの増加すなわち血中滞留性の向上が起こることが示唆された。すなわち 導入率が 55モル％以上、好ましくは 65モル％以上、さらに好ましくは 69モル％以上 の場合、 18時間以上の MRTを有する血中滞留時間の面において好ましい HA修飾 物が得られる可能性が高 、結果となった。 酵素耐性を獲得した HA誘導体は、 CD44など HAレセプターへの結合能も大きく 低下しているため長期間の血中滞留性が得られるものと考えられる。
〔実施例 5〕水溶性 HA修飾物 GLP— 1アナログ 1結合体の調製と評価
(実施例5— l) HA—EDOBEA— (CH ) —MlZSUCの調製
2 10
BOP試薬を HAユニットに対し 2. 5の当量比とした以外は実施例 3— 1と同様にし て得た HA— EDOBEA (200kDa HA— TBA、 EDOBEA導入率： 95. 5%)水溶 液（10mg/mL、 17. 66mL)に 0. 2Mジン酸緩衝液（pH7. 0、 22. 075mL)をカロ えた。 N— [ κ—マレイミドウンデカノィルォキシ]スルホスクシンイミド エステル（以下 、 「Sulfo—KMUS」とも称す）（ピアス社製）の DMSO溶液（0. 573mg/mL, 4. 4 15mL)をカ卩え、室温で 30分間振とうした。無水コハク酸 DMSO溶液（283. 95mg ZmL、 4. 415mL)をカ卩えて、更に室温で 1. 5時間振とうした。 4°Cで大過剰量の蒸 留水（ミリ Q水）に対して透析精製し (スぺクトラポア 4、 MWCO : 12k— 14kDa)、得ら れた溶液を凍結乾燥して、マレイミド基およびコノ、ク酸が導入されたヒアルロン酸修 飾物（以下、「HA— EDOBEA— MIZSUCJとも称す、 177. 80mg)を得た。
(実施例 5— 2)ヒアルロン酸—GLP—1アナログ 1結合体溶液の調製
天然型の GLP— l (Human、 7— 37 ;特表平 7— 504679号公報記載）の 2番目（8 位）のァラニンをグリシンに、 31番目（37位）のグリシンをシスティンに変更したアナ口 グ（以下、「GLP— 1アナログ 1」とも称す)を固相法ペプチド合成法で得た ((株)ぺプ チド研究所製)。 GLP— 1アナログ 1の 0. 2Mリン酸緩衝液 (pH7. 0)の溶液（2. 0m g/mL)にトリス [2—カルボキシェチル]ホスフィン塩酸塩（以下、「TCEP」とも称す） (ピアス社製）水溶液（20mM)を 1Z20容量カ卩えた。この TCEPを含む GLP— 1アナ ログ 1溶液（ 1. 3263mL)を実施例 5—1で得た H A— EDOBEA—MlZSUC水溶 液（20mgZmL、 1. 2mL)に加え、 37°Cで 2時間静置した。同じ TCEPを含む GLP — 1アナログ 1溶液（1. 3263mL)を再度添カ卩し、同様に静置した。システィン塩酸塩 一水和物の 0. 1Mリン酸緩衝液（pH7. 0)の溶液（3. 6mgZmL、0. 3853mL)を 加え、更に 37°Cで 1時間静置した。反応混合液を 3回に分けて下記の条件で GPC に供して結合体画分を分取した。分取した画分を遠心式限外濾過 (Vivaspin20、 M WCO : 50000、フナコシ株式会社製）で約 4. 85mLまで濃縮して、標題の HA— G LP— 1アナログ 1結合体溶液を得た。 GLP— 1アナログ 1を使用せずに本実施例と 同様の操作を行なって得られた試料を対照として補正に用い、得られた HA—GLP - 1アナログ 1溶液の 280nmにおける吸光度と力ルバゾール—硫酸法で、 GLP— 1 アナログ 1濃度、 HA—EDOBEA— MIZSU濃度ぉょびGLP—lァナログl導入率 を算出した。 GLP— 1アナログ 1が 42. 6nmolZmL、 HA - EDOBEA - MI/SU が 3. 54mgZmL、 GLP— 1アナログ 1が 3. 7ZHA(molZmol)であった。
GPC条件
System： FPLC (アマシャムバイオサイエンス株式会社製）
GPC Column :HiLoad 16/60 Superdex 200prep grede (；アマシャムノ ィォサイエンス株式会社製）
Mobile phase： PBS (pH7. 4)
Flow rate： 1. OmL/ mm
Detection :UV (280nm)
カルバゾールー 法による HA修飾物 畺 法 C試薬]
硫酸溶液: Na B O - 10H Oの硫酸溶液（25mM)
2 4 7 2
力ルバゾール溶液：力ルバゾールのエタノール溶液（1. 25mg/mL : 0. 12
5%)
[標準物質]
Ν- [ κ—マレイミドウンデカノィルォキシ]スルホスクシンイミド エステルの DMSO 溶液をカ卩えないこと以外は実施例 5— 1と同様にして、 ΗΑ— EDOBEAに無水コハ ク酸のみが導入されたヒアルロン酸修飾物（HA— EDOBEA— SUC)を調製し、 PB Sに溶解して 0. 5mgZmLとした。この 0. 5mgZmLの HA— EDOBEA— SUC溶 液から 2倍希釈列を調製した (濃度 5点： 0. 03125〜0. 5mg/mL) 0
[定量]
氷冷した硫酸溶液（lmL)に、 PBS (対照）および標準物質 (各 0. 2mL)、ならびに 実施例 5— 2で得られた HA— GLP— 1アナログ 1結合体溶液を PBSで 19. 8倍希釈 して得た溶液 (0. 2mL)を加え、混合した。熱水浴中で約 25分間加熱した後、流水 で室温まで冷却した。それぞれに力ルバゾール溶液 (40 L)を加えて混合した。再 度熱水浴中で約 30分間加熱した後、流水で室温まで冷却した。 530nmにおける吸 光度を測定し、対照および標準物質の吸光度から検量線を作成し，試料溶液に含ま れる HA修飾物の濃度を定量した。
(実施例 5— 3) HA— GLP— 1アナログ 1結合体の血中滞留時間評価
HA— GLP— 1アナログ 1結合体投与ラット血漿サンプル
実施例 5— 2で得られたHA—GLP—lァナログl結合体溶液をTween 80を 0. 0 5%含有する PBS (pH7. 4 ;以下、「溶媒 Z」とも称す)で希釈し、 50 g/kgの用量 でラット静脈内に単回投与し、投与後 1、 4、 8、 24、 48、 72、 96、および 168時間で 採血 (へパリン処理)し、遠心分離により血漿を得た。この血漿サンプルは測定まで 20°C以下で凍結保存した。
[0173] 沏 I 法
GLP—1 (Active) ELISA KIT (Linco Research, Inc.製；以下、「キット W」と も称す)の 96穴プレートに検量線用標準試料および測定用試料を分注し、マイクロ プレートリーダーを用いて分析を行った。以下に条件を示す。
[0174] マイクロプレートリーダー： SPECTRA MAX GEMINI (Molecular Devices 社製）
Detection： Fluorescence (EX： 355nm, EM： 460nm)
測定試料の調製
•検量線用試料；
実施例 5— 2で得られた HA— GLP— 1アナログ 1結合体溶液を溶媒 Zおよびキット W【こ同封された Assay Bufferを用!ヽて希釈し、 12. 8、 6. 4、 3. 2 1. 6、 0. 8、 0 . 4、 0. 2、 0. 1 μ gZmLおよび 0 μ gZmLの標準液を調製した。この標準液に 5 μ Lの正常ラット血漿を添加し、検量線用試料を調製した。
•測定用試料の調製；
HA—GLP— 1アナログ 1結合体投与ラット血漿サンプルに、キット Wに同封された Assay Bufferを添カ卩して測定用試料を調製した。
•血漿中の HA修飾物濃度の算出； 解析ソフト SOFTmax PRO (Molecular Devices社製）を用いて各標準試料の 蛍光強度力 得られた検量線より血漿中の HA—GLP—1アナログ 1結合体濃度を 算出した。
[0175] 薬物動餱データ
投与した HA— GLP— 1アナログ 1結合体の血中濃度推移のデータにつ 、て、 Wi nNonlin Ver 4. 0. 1 (Pharsight社製)で薬物動態学的パラメーターを算出した 。各個体の血漿中濃度推移についてモデル非依存的解析を行い、平均血中滞留時 間（MRT)を算出した。半減期 (tl/2)は各個体の測定可能な最終 3点のデータを 用いて算出した。 HA— GLP— 1アナログ 1結合体の血中濃度推移を図 10に示す。 また、算出した薬物動態学的パラメーターを表 7に示す。
[0176] [表 7] 表 7 HA— G L P— 1アナログ丄結合体をラットに静脈内投与したときの薬物動態学 的ノ ラメーター
平均値 標準偏差
半翻 23. 6 3. 1 (hr)
トータルクリアランス 1. 8 0. 1 (mL/hr/kg)
率均血中滞留時間 30. 2 4. 3 (hr)
分布容積 53. 4 4. 9 (mL/kg) 天然型の GLP— 1および天然型の GLP— 1の 2番目のァラニンをグリシンに変更し た変異体を、ヒトおよびブタに静脈内投与したときの半減期力^〜 5分間であることが 報告されている（Current Medicinal Chemistry、第 10卷、第 2471— 2483頁、 2003年および Diabetologia、第 41卷、第 271— 278頁、 1998年）。図 10および表 7から、 HA— GLP— 1アナログ 1結合体をラットに静脈内投与したときの半減期は、 2 3. 6時間、 MRTは 30. 2時間となり、天然型の GLP— 1などと比較して大幅に血中 滞留性が向上したことが示唆された。
(実施例 5—4)経口糖負荷試験
8週齢の雄性 BKS . Cg— + LeprdV + LeprdbZjclマウス（日本クレア株式会 社)を一晩絶食した後、実施例5— 2で得られた11八ー01^—1ァナログ1結合体溶 液を溶媒 Zで希釈したもの（ペプチド量として、 1. 5 gZkg、 15 g/kgまたは 150 μ gZkg)または溶媒 Ζを静脈内投与し、静脈内投与 1分後に 50%グルコース溶液（ (株)大塚製薬工場製)を 3gZkgになるように経口投与した。同様に GLP - 1 (Hum an、 7- 37 ; (株)ペプチド研究所製)を溶媒 Zで希釈したもの（150 μ gZkgまたは 1 500 gZkg)または溶媒 Zを静脈内投与し、静脈内投与 1分後に 50%グルコース 溶液を 3gZkgになるように経口投与した。 6匹を 1群として試験に用いた。
[0178] グルコース投与前（0時間の値とする）、グルコース投与 0. 5、 1、 2、および 4時間後 に尾部より血液を採取し、血糖値を酵素法 (へキソキナーゼ法、試薬名：オートセラ S GLU (第一化学薬品（株)製）；機器名： BioMajesty JCA—BM1250 (日本電子 (株)製)）にて測定した。
以下の式より血糖降下率を算出した。
[0179] [化 27] 溶媒投与群の血糖上昇値の AU Cの 均値一各個体の血搪上昇値の A U C
溶媒投 群の血糖上昇値の AU Cの'ド.均値
[0180] ここで、血糖上昇値の AUCとは、横軸にグルコース投与後の時間、縦軸に各個体 の血糖値をプロットし、各点を直線で結んで得られるグラフの曲線下面積から、各個 体のグルコース投与前の血糖値がグルコース投与 4時間後まで変化無く一定であつ たとした場合のグラフの曲線下面積を減算したものである。具体的には、 =ダルコ ース投与前の血糖値、 グルコース投与 30分後の血糖値、 =グルコース投与 1 時間後の血糖値、 グルコース投与 2時間後の血糖値、 グルコース投与 4時 間後の血糖値としたとき、血糖上昇値の AUCは、以下の式：
[0181] [化 28]
A1 + B1 B1 + C1 C1 + D1 D1 + E1
AUC = 0. 5 X + 0. 5 X 十 I X + 2 X 4 X A'
1 2 2 2 [0182] 力も求めることができる。
[0183] 算出された血糖降下率から、各群ごとに平均値及び標準誤差を算出し、表 8および 表 9に示した。 HA- GLP— 1アナログ 1結合体では、 GLP— l(Human、 7— 37)と 比較して、血糖降下作用が大幅に増大し、糖尿病治療剤としての有用性が示唆され た。
[0184] [表 8]
GLP— 1 (Huma n、 7-37) 投与時の血糖降下率 (%) 投与量 平均値 標準誤差
150 μ g/k g 15 15
1500 g/k g 60 17
HA— GLP—lアナログ 1結合体投与時の血糖降下率 （％)
投与量 平均値 標準誤差
1.5// g/k g 3 11
15 μ g/k g 60 21
150μ g k g 120 15
[0186] 〔実施例 6〕水溶性 HA修飾物 GLP— 1アナログ 2結合体の調製と評価
(実施例 6— 1)HA— EDOBEA—（EO) — MlZSUCの調製
4
BOP試薬を HAユニットに対し 2.5の当量比とした以外は実施例 3— 1と同様にし て得た HA— EDOBEA(100kDa HA— TBA、 EDOBEA導入率： 97.0%)水溶 液（10mgZmL、4.0mL)3本に 0.2Mリン酸緩衝液（pH7.0、 5. OmL)および 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH7.0、 30mL)をそれぞれ加えた。 N ヒドロキシサクシンイミジ ル 15— (3 マレイミドプロピオニル) アミドー 4, 7, 10, 13—テトラォキサペンタ デカノエート（以下、「NHS— (EO) —MI」とも称す）（Quanta BioDesign Ltd.
4
製）の DMSO溶液（2. 283mgZmL、 1. OmL)をそれぞれカ卩え、室温で 30分間振 とうした。無水コハク酸 DMSO溶液（287mgZmL、 1. OmL)をそれぞれ加えて、更 に室温で 1. 5時間振とうした。 4°Cで大過剰量の蒸留水 (ミリ Q水）に対して透析精製 し (スぺクトラポア 4、 MWCO： 12k- 14kDa)、得られた溶液を凍結乾燥して、マレイ ミド基およびコハク酸が導入されたヒアルロン酸修飾物（以下、「HA—EDOBEA— ( EO) — MIZSUCJとも称す、 46. 93, 48. 01, 22. 57mg)を得た。
4
[0187] それぞれの HA1分子あたりのマレイミド（Ml)導入量（以下、「MlZHA」とも称す） を評価したところ 7. 0、 7. 8、 7. 4 (molZmol)であった。
[0188] HA-EDOBEA- (EOj -MI SUC^H≤MI HA^¾
4
[分子量の算出]
HA-EDOBEA- (EO) —MlZSUCのコハク酸導入率をプロトン NMR法で定
4
量した（HA:N ァセチル基のメチルプロトン、 1. 8〜1. 9ppm、コハク酸：エチレン プロトン、 2. 4〜2. 55ppm) 0 (EO) — MI導入率は低率であるため考慮せず HA—
4
EDOBEA- (EO) MlZSUCの平均分子量およびユニット当たりの平均分子量
4
を算出した。
[Mlの定量]
HA-EDOBEA- (EO) — MlZSUC水溶液（20. OmgZmL、 55 L)に 2M
4
システィンを含む 0. 2Mリン酸、 20mMエチレンジァミン四酢酸緩衝液（pH7. 0、 55 μ L)あるいはシスティンを含まない同じ緩衝液を加えた。 37°Cで 30分間静置した後 、残存するシスティンをエルマン試薬で定量した。対照として蒸留水（55 μ L)に 2Μ システィンを含む 0. 2Μリン酸、 20mMエチレンジァミン四酢酸緩衝液（ρΗ7. 0、 55 μ L)を加えたもの、 NHS- (EO) Mlの DMSO溶液に替えて DMSOをカ卩えたこ
4
と以外は実施例 6—1と同様にして得た HA— EDOBEAにコハク酸のみが導入され たヒアルロン酸修飾物（HA— EDOBEA— SUC)についても同様に行った。対照で 非特異的消費を補正してシスティンの消費量をマレイミド量として、 HA濃度との比か ら MI/HA (mol/mol)を算出した。
[エルマン試薬を用いたシスティン定量法] 反応溶媒として ImMエチレンジァミン四酢酸を含む 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH8. 0 )を調製した。標準試料溶液としてシスティンを反応溶媒に溶解させ、 1. 2、 0. 6、 0 . 3、 0. 15、 0. 075mM【こ調整した。ェノレマン試薬を DMSO【こ溶解し（40mg/m )、これを反応溶媒で 10倍稀釈してエルマン試薬溶液を調製した。反応溶媒（1. Om L)にエルマン試薬溶液（20 μ L)を加え、これにブランクとして反応溶媒、標準試料 溶液および試料溶液をそれぞれ加え（100 L)加えて混合した後、室温、遮光下に 15分間静置した。 412nmにおける吸光度を測定し、ブランクおよび標準試料の吸光 度から検量線を作成し，試料溶液に含まれるシスティン残存量を定量した。ヒアルロ ン酸誘導体の 412nmにおける吸光度はシスティンをカ卩えなカゝつた試料溶液の測定 値で補正した。
(実施例 6— 2) HA—GLP— 1アナログ 2結合体溶液の調製
天然型の GLP— l (Human、 7— 37 ;特表平 7— 504679号公報記載）の 2番目（8 位）のァラニンをグリシンに、 31番目（37位）のグリシン C末端側にプロリン—プロリン —プロリン—システィンを付加し、 C末端をアミド化した変異体 (以下、「GLP— 1アナ ログ 2」とも称す)を固相法ペプチド合成法で得た（ (株)ペプチド研究所製)。実施例 6— 1で得た HA— EDOBEA— (EO) -MI/SUC (MI/HA= 7. 0、 7. 8、 7. 4 (
4
molZmol)水溶液（20mgZmL、 2. 0、 2, 0、 0. 83mL)をそれぞれ混合し、 HA— EDOBEA- (EO) MlZSUC (平均 MlZHA= 7. 4 (molZmol)水溶液（20m
4
gZmL)とした。この HA— EDOBEA— (EO) —MlZSUC水溶液（20mgZmL、
4
4. 02mL)に GLP—lアナログ 2の 0. 2Mリン酸緩衝液（pH7. 0)の溶液（2. Omg/ mL、 7. 052mL)に加え、 37°Cで 1時間静置した。システィン塩酸塩一水和物の 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH7. 0)の溶液（11. 98mg/mL、 1. 107mL)をカ卩え、更に 37 °Cで 30分間静置した。反応混合液を 3回に分けて下記の条件で GPCに供して結合 体画分を分取した。分取した結合体画分を濾過（MILLEX— GV、 =0. 22 m、 ミリポア社製）した後、遠心式限外濾過（Centricon Plus - 20、分画分子量： 3000 0、ミリポア社製)で容量が約 1Z20程度になるまで濃縮した。濃縮液を PBSで約 20 倍程度に稀釈、再度同様に濃縮、稀釈した。再び濃縮して得られた濃縮液を PBSで 約 16mLに調整し、これを濾過（MILLEX— GV、 =0. 22 m、ミリポア社製）して 標題の HA— GLP— 1アナログ 2結合体溶液を得た。図 11に GPCのクロマトグラムを 示す。 GLP— 1アナログ 2を添加した試料について高分子量画分でペプチドに由来 すると考えられる 280nmにおける吸収が強く観察され、 GLP— 1アナログ 2がヒアル ロン酸修飾物に結合したことが支持された。 GLP— 1アナログを使用せずに本実施 例と同様の操作を行なって得られた試料を対照として補正に用い、得られた HA—G LP— 1アナログ 2溶液の 280nmにおける吸光度とカルバゾールー硫酸法で、 GLP 1アナログ 2濃度、 HA— EDOBEA—（EO) —MlZSUC濃度および GLP— 1ァ
4
ナログ 2導入率を算出した。 GLP— 1アナログ 2が 161. 8nmol/mL、 HA— EDOB EA- (EO) — MlZSUCが 3. 22mgZmLゝ GLP— 1アナログ 2が 7. 9/HA (mol
4
Z mol)で teつた。
GPC条件
System： FPLCまたは AKTAexplorer (アマシャムバイオサイエンス株式会社製） GPC Column :HiLoad 26/60 Superdex 200prep grede (；アマシャムノ ィォサイエンス株式会社製）
Mobile phase : 30%ァセトニトリル、 0. 1%トリフルォロ酢酸水溶液
Flow rate : 2. 5mL/ mm
Detection :UV (280nm)
カルバゾールー 法による HA修飾物 畺 法 C試薬]
硫酸溶液: Na B O - 10H Oの硫酸溶液（25mM)
2 4 7 2
力ルバゾール溶液：力ルバゾールのエタノール溶液（ 1. 25mgZmL)
[標準物質]
NHS - (EO) Mlの DMSO溶液に替えて DMSOをカ卩えたこと以外は実施例 6
4
1と同様にして得た HA— EDOBEAにコハク酸のみが導入されたヒアルロン酸修 飾物（HA— EDOBEA— SUC)を PBSに溶解して 0. 5mgZmLとした。この 0. 5m gZmLの HA—EDOBEA— SUC溶液から 2倍稀釈列を調製した (濃度 5点： 0. 03 氷冷した硫酸溶液（lmL)に、 PBS (対照）および標準物質 (各 0. 2mL)、ならびに 実施例 6— 2で得られた HA— GLP— 1アナログ 2結合体溶液（15 L)を PBSで 20 倍希釈して得た溶液 (0. 2mL)を加え、混合した。熱水浴中で約 25分間加熱した後 、流水で室温まで冷却した。それぞれに力ルバゾール溶液 (40 L)をカ卩えて混合し た。再度熱水浴中で約 30分間加熱した後、流水で室温まで冷却した。 530nmにお ける吸光度を測定し、対照および標準物質の吸光度から検量線を作成し，試料溶液 に含まれる HA修飾物の濃度を定量した。
[0190] HA—GLP— 1アナログ 2結合体における GLP— 1アナログ 2濃度および GLP— 1 アナログ 2導人率決定方法
GLP—1アナログを使用せずに本実施例と同様の操作を行なって得られた試料およ び得られた HA— GLP— 1アナログ 2溶液（50 μ L)を PBSで 2倍稀釈した溶液の 28 Onmにおける吸光度を測定した。カルバゾールー硫酸法で定量した GLP— 1アナ口 グを使用せずに本実施例と同様の操作を行なって得られた試料の HA修飾物濃度と 280nmにおける吸光度力も比例定数を算出し、 HA— GLP— 1アナログ 2結合体溶 液の HA修飾物濃度力も結合体溶液の 280nmにおける吸収の HA寄与分を算出し た。差分を GLP— 1アナログ 2の吸収としてモル吸光係数力も GLP— 1アナログ 2濃 度を算出した。 GLP— 1アナログ 2濃度と HA修飾物濃度の比力も GLP— 1アナログ 2導入率 (molZmol)を算出した。
(実施例 6— 3) HA— GLP— 1アナログ 2結合体の cAMP産生能評価
ヒト GLP— 1受容体の公開されている DNA配列情報「Grazianoら、 Biochem. Bi ophys. Res. Commun. 1993. 196 : 141— 146 (1993) ]に基づき、発現べクタ 一を構築した。ヒト胎児腎臓 HEK293細胞を該ベクターで形質転換し、ヒト GLP— 1 受容体を発現する組換え HEK293細胞を得た。
[0191] ヒト GLP— 1受容体発現細胞は、 96wellプレートで 3日間培養し、アツセィに供した 。培養液を反応液（0. 5mM 3—イソブチルー 1ーメチルキサンチン、 3. 7gZL N aHCOを含む DMEM)に置換し、 0. 05% Tween 80を含む DMEMで希釈した
3
GLP— 1または実施例 6— 2で得られた HA— GLP— 1アナログ 2結合体を添カ卩して 、 37°C、 COインキュベータ中で 30分間インキュベーションした後、細胞溶解用緩衝 液を添加して反応を停止した。
[0192] HA— GLP— 1アナログ 2結合体と GLP— 1受容体との反応により細胞内に生成さ れるサイクリック AMPは、 cAMP - Screen™ (Applied Biosystems製）による化学 発光 ELIS A (Enzyme— linked immunosorbent assay)法により、 ARVO HT S 1420 Multilabel Counter(PerkinElmer(Wallac)社製）を用いて測定した 。標準サイクリック AMP試料の発光強度カゝら得られた検量線より、解析ソフト Graphp ad Prism Version 4. 02 (GraphPad Software, Inc.製）を用いて細胞溶解 液中のサイクリック AMPを算出し、細胞 wellあたりのサイクリック AMP量に換算した。 HA— GLP— 1アナログ 2結合体と細胞 wellあたりのサイクリック AMP量の濃度一反 応曲線から、 Graphpad Prism Version 4. 02を用いて結合体の EC50値を算 出した。なお、結合体の EC50値は HA—GLP—1アナログ 2結合体における GLP— 1アナログ 2濃度に基づいて算出した。表 10に、 HA—GLP—1アナログ 2結合体の サイクリック AMP産生能を、天然型 GLP— l (Human、 7— 37)の EC50値を 1とした 時の相対値で示した。
[0193] [表 10] 表 1 0 HA—G L P— 1アナログ 2結合体 c AMP産生能 被検試料 E C 5 0値 （相対値）
G L P 1 1 HA G L P— 1
1 1 2
アナログ 2結合体
[0194] HA—GLP—1ァナログ2結合体のEC50値は、巨大分子である HAによる立体障 害などのために天然型 GLP— 1に比して高い値であった力 GLP—1のもつ cAMP 産生能を保持して ヽることが確認された。
(実施例 6— 4) HA— GLP— 1アナログ 2結合体の血中滞留時間評価
HA— GLP— 1アナログ 2結合体投与ラット血漿サンプル 実施例 6— 2で得られた HA— GLP— 1アナログ 2結合体溶液を Tween 80 0. 0 5%含有 PBS (pH7. 4) (以下、「溶媒 Z」とも称す)で希釈し、 50 g/kgの用量でラ ット静脈内に単回投与し、投与後 1、 4、 8、 24、 48、 72、 96、 120、 168時間に採血 (へパリン処理)し、遠心分離により血漿を得た。この血漿サンプルは測定まで 20 °C以下で凍結保存した。
[0195] 沏 I 法
GLP—1 (Active) ELISA KIT (Linco Research, Inc.製）（以下、「キット W」と も称す)の 96穴プレートに検量線用標準試料および測定用試料を分注しマイクロプ レートリーダーを用いて分析を行った。以下に条件を示す。
[0196] マイクロプレートリーダー： SPECTRA MAX GEMINI (Molecular Devices 社製）
Detection： Fluorescence (EX： 355nm, EM： 460nm)
測定試料の調製
•検量線用試料；
実施例 6 - 2で得られた HA— GLP - 1アナログ 2結合体溶液を溶媒 Zおよびキット W【こ同封された Assay Bufferを用!ヽて希釈し、 3. 2 1. 6、 0. 8、 0. 4、 0. 2 0. 1、 0. 05 gZmLおよび 0 μ gZmLの標準液を調製した。この標準液に 5 μ Lの正 常ラット血漿を添加し、検量線用試料を調製した。
•測定用試料の調製；
HA—GLP— 1アナログ 2結合体投与ラット血漿サンプルに、キット Wに同封された Assay Bufferを添カ卩して測定用試料を調製した。
•血漿中の HA修飾物濃度の算出；
解析ソフト SOFTmax PRO (Molecular Devices社製）を用いて各標準試料の 蛍光強度力 得られた検量線より血漿中の HA—GLP—1アナログ 2結合体濃度を 算出した。
[0197] 薬物動餱データ
投与した HA— GLP— 1アナログ 2結合体の血中濃度推移のデータにつ 、て、 Wi nNonlin Ver 4. 0. 1 (Pharsight社製)で薬物動態学的パラメーターを算出した 。各個体の血漿中濃度推移についてモデル非依存的解析を行い、平均血中滞留時 間（MRT)を算出した。半減期 (tl/2)は各個体の測定可能な最終 3点のデータを 用 、て算出した。 HA-GLP - 1アナログ 2結合体の血中濃度推移を図 12に示す。 また、算出した薬物動態学的パラメーターを表 11に示す。
[表 11] 表 1 1_ H A— G L P— 1アナログ 2結合体をラットに静脈内投与したときの薬物動態 学的パラメーター 平均値 標準偏差
半翻 21. 3 7. 1 (hr)
トータノレクリアランス 1. 4 0. 1 (mL/hr/kg) 平均血中滞留時間 32. 6 3. 3 (hr)
分布容積 44. 4 4. 4 (mL/kg)
天然型の GLP— 1および天然型の GLP— 1の 2番目のァラニンをグリシンに変更し た変異体を、ヒトおよびブタに静脈内投与したときの半減期力^〜 5分間であることが 報告されている（Current Medicinal Chemistry、第 10卷、第 2471— 2483頁、 2003年および Diabetologia、第 41卷、第 271— 278頁、 1998年）。図 12および表 11から、 HA—GLP—1アナログ 2結合体をラットに静脈内投与したときの半減期は、 21. 3時間、 MRTは 32. 6時間となり、天然型の GLP— 1などと比較して大幅に血中 滞留性が向上したことが示唆された。
(実施例 6— 5)経口糖負荷試験
8週齢の雄性 BKS . Cg— + Lepr'V + LeprdbZjclマウス（日本クレア株式会 社)を一晩から 24時間絶食した後、実施例6— 2で得られた11八ー01^—1ァナログ 2結合体溶液を溶媒 Zで希釈したもの（ペプチド量として、 300 μ g/kg)または溶媒 Zを皮下投与し、皮下投与 6、 24または 48時間後に 50%グルコース溶液（(株）大塚 製薬工場製)を 3gZkgになるように経口投与した。同様に天然型の GLP— 1 (Hum an、 7— 37 ;特表平 7— 504679号公報記載）の 2番目（8位）のァラニンをグリシンに した変異体 (以下、「GLP— 1アナログ 0」とも称す）（(株)ペプチド研究所製)を溶媒 Z で希釈したもの（3000 μ g/kg)または溶媒 Zを皮下投与し、皮下投与 2分後または 4時間 2分後 (溶媒 Zは皮下投与 1または 5時間後）に 50%グルコース溶液を 3gZkg になるように経口投与した。 6匹を 1群として試験に用いた。
[0200] グルコース投与前（0時間の値とする）、グルコース投与 0. 5、 1、および 2時間後に 尾部より血液を採取し、血糖値を酵素法 (へキソキナーゼ法、試薬名：オートセラ S GLU (第一化学薬品（株)製）；機器名： BioMajesty JCA— BM1250 (日本電子（ 株)製)）にて測定した。
[0201] 実施例 5— 4に記載の式より血糖降下率を算出した。
[0202] ここで、血糖上昇値の AUCとは、横軸にグルコース投与後の時間、縦軸に各個体 の血糖値をプロットし、各点を直線で結んで得られるグラフの曲線下面積から、各個 体のグルコース投与前の血糖値がグルコース投与 2時間後まで変化無く一定であつ たとした場合のグラフの曲線下面積を減算したものである。具体的には、 =ダルコ ース投与前の血糖値、 グルコース投与 30分後の血糖値、 =グルコース投与 1 時間後の血糖値、 グルコース投与 2時間後の血糖値としたとき、血糖上昇値の AUCは、以下の式：
[0203] [化 29]
A1 + B1 B1 + C1 C1 + D1
AUC 二 0. 5 X + 0. 5 X + I X 2 X A1
2 2 2
[0204] 力も求めることができる。
[0205] 算出された血糖降下率から、各群ごとに平均値及び標準誤差を算出し、表 12およ び表 13に示した。 HA- GLP— 1アナログ 2結合体では、 GLP— 1アナログ 0と比較し て、血糖降下作用が大幅に持続し、糖尿病治療剤としての有用性が示唆された。
[0206] [表 12] 表 1 2 G L P— 1アナログ 0投与時の血糖降 F率 （％) 投与後の時間 平均値 標準誤差 2分 102 3
4時間 2分 18 10
[0207] [表 13] 表 1 3 HA— G L P—1アナログ 2結合体投与時の血糖降下率 （％) 投与後の時間 平均値 標準誤差
6時間 53 6
2 4時間 23 8
4 8時間 18 5
[0208] 〔実施例 7〕水溶性 HA修飾物— GLP— 1アナログ 1および GLP— 1アナログ 2結合体 の調製と評価
異なる HA分子量、異なる水溶性 HA修飾物とマレイミド間のリンカ一および異なる GLP— 1アナログ力もなる水溶性 HA修飾物— GLP— 1アナログ結合体を調製した。 (実施例 7—1) HA-EDOBEA- (CH ) — MlZSUCの調製
2 10
BOP試薬を HAユニットに対し 2. 5の当量比とした以外は実施例 3— 1と同様にし て得た HA— EDOBEA (200kDa HA— TBA、 EDOBEA導入率： 98. 5%)水溶 液（10mg/mL、 9. OmL)に 0. 2Mジン酸緩衝液（pH7. 0、 11. 25mL)をカロえた。
N— [ κ —マレイミドウンデカノィルォキシ]スルホスクシンイミドエステル（以下、「Sulf o—KMUS」とも称す）（ピアス社製）の DMSO溶液（0. 567mg/mL, 2. 25mL)を 加え、室温で 30分間振とうした。無水コハク酸 DMSO溶液（290mgZmL、 2. 25m L)をそれぞれ加えて、更に室温で 1. 5時間振とうした。 4°Cで大過剰量の蒸留水（ミ リ Q水）に対して透析精製し (スぺクトラポア 4、 MWCO : 12k- 14kDa)、得られた溶 液を凍結乾燥して、 HA-EDOBEA- (CH ) -MI/SUC (94. 81mg)を得た。
2 10
[0209] MlZHAを実施例 6— 1記載の方法で評価したところ 5. 0 (mol/mol)であった。
(実施例 7— 2) HA-EDOBEA- (CH ) — MlZSUCおよび HA— EDOBEA
2 10
一（EO) — MlZSUCの調製
4
BOP試薬を HAユニットに対し 2. 5の当量比とした以外は実施例 3— 1と同様にし て得た HA— EDOBEA(100kDa HA— TBA、 EDOBEA導入率： 95. 5%)水溶 液（10mgZmL、 3. 5、 4. OmL)に 0. 2Mリン酸緩衝液（pH7. 0、 4. 375、 5. Om Uおよび O. 1Mリン酸緩衝液 (pH7. 0、 8. 75、 10. OmL)をそれぞれ加えた。 Sulf o— KMUS (ピアス社製）の DMSO溶液（0. 858mgZmL、0. 875mL)あるいは N HS - (EO) -MI (Quanta BioDesign Ltd.製）の DMSO溶液（1. 528mg/
4
mL、 1. OmL)をそれぞれ加え、室温で 30分間振とうした。無水コハク酸 DMSO溶 液（283mg/mL、 0. 875, 1. OmL)をそれぞれカロえて、更に室温で 1. 5時間振と うした。 4°Cで大過剰量の蒸留水（ミリ Q水）に対して透析精製し (スぺクトラポア 4、 M WCO : 12k- 14kDa)、得られた溶液を凍結乾燥して、 HA— EDOBEA— (CH )
2 10
— MI/SUCゝ HA— EDOBEA— (EO) — Ml/SUC (37. 87、 42. 42mg)を得
4
た。
[0210] それぞれの MlZHAを実施例 6—1記載の方法で評価したところ 4. 7、 4. 7 (mol Z mol)で teつた。
(実施例 7— 3) HA- GLP 1アナログ 2および GLP— 1アナログ 1結合体溶液の 調製
実施例 7—1で得た HA— EDOBEA— (CH ) -MI/SUC (MI/HA= 5. 0 (
2 10
molZmol) )水溶液（20mgZmL、 0. 15mL)に GLP— 1アナログ 2の 0. 2Mリン酸 緩衝液 (ρΗ7. 0)の溶液（2. Omg/mL、 0. 895mL)を加えた。実施例 7— 2で得た HA-EDOBEA- (CH ) - MI/SUC (MI/HA = 4. 7 (molZmol) )水溶液（2
2 10
Omg/mL, 0. 15、 0. 15mL)に GLP— 1アナログ 2あるいは GLP— 1アナログ 1の 0. 2Mリン酸緩衝液（pH7. 0)の溶液（2. Omg/mL, 0. 1527、 0. 1684mL)をそ れぞれ加えた。また、実施例 7— 2で得た HA— EDOBEA—（EO) - MI/SUC (
4
MI/HA =4. 7 (molZmol) )水溶液（20mgZmL、 0. 15mL)に GLP 1アナ口 グ 1の 0. 2Mリン酸緩衝液（pH7. 0)の溶液（2. Omg/mL, 0. 1539mL)をカ卩えた 。それぞれ 37°Cで 1時間静置した。システィン塩酸塩一水和物の 0. 1Mリン酸緩衝 液 (PH7. 0)の溶液（11. 22 (実施例 7—1記載 HA修飾物使用例）、 21. 28 (実施 例 7— 2記載 HA修飾物使用例） mgZmL、それぞれ 0. 015mL)を加え、更に 37°C で 30分間静置した。反応混合液を下記の条件で GPCに供して結合体画分を分取し た。分取した画分を遠心式限外濾過（Centricon Plus 20、分画分子量： 30000 、ミリポア社製)で容量が約 1Z20程度になるまで濃縮した。濃縮液を PBSで約 20倍 程度に稀釈、再度同様に濃縮、稀釈した。再び濃縮して得られた濃縮液を PBSで約 1. 2 (実施例 7— 1記載 HA修飾物使用例）、 0. 6 (実施例 7— 1記載 HA修飾物使用 例） mLに調整し、標題の HA—GLP— 1アナログ 2結合体および HA—GLP— 1ァ ナログ 1結合体の溶液を得た (試料番号 7— 3— 1〜7— 3—4)。試料溶液の稀釈率 を適宜変更した以外は実施例 6— 2記載の方法と同様に定量した結果を表 14にまと めた。
[0211] GPC条件
System： FPLCまたは AKTAexplorer (アマシャムバイオサイエンス株式会社製） GPC Column： Superdex200 10/300 GL (アマシャムバイオサイエンス株 式会社製）
Mobile phase : 30%ァセトニトリル、 0. 1%トリフルォロ酢酸水溶液
Flow rate : 0. 6mL/ mm
Detection :UV (280nm)
[0212] [表 14]
表 14 HA— GLP—lアナログ 2および GLP—lアナログ 1結合灘液の調製
GLP-l
HA分子 GLP-l GLP-l
(. H2) ,o or HA-ED0BEA-(CH2)10 or アナログ 試料 アナログ アナログ
(E0) I/SUC (mg/mL) /HA
(k D a) 2 or 1 (nmol/mL)
(raol/mol)
7-3-1 200 (CH2ノ l0 5.0 2 27.1 1.87 4.5
O
CO
7-3-2 100 1
(CH2) 10 1 s 4.7 1 118.7 4.02 4.6 ド
7-3-3 100 (CH2) 10 4.7 2 112.2 3.88 4.5
7~3-4 100 (E0)4 4.7 1 128.2 3.80 5.2
[0213] (実施例 7— 4)HA— GLP— 1アナログ結合体の cAMP産生能評価
実施例 7— 3で得られた各種HA—GLP—lァナログ結合体のcAMP産生能は、 実施例 6— 3と同様に測定した。
[0214] 表 15に、各種 HA—GLP— 1アナログ結合体のサイクリック AMP産生能を、天然 型 GLP— 1の EC50値を 1とした時の相対値で示した。
[0215] [表 15] 表 1 !5 HA— GLP— 1アナログ 1および GLP— 1アナログ 2結合体の c AMP 産生能
被検試料 EC 50値 （相対値）
GLP- 1 1
77
206
Figure imgf000068_0001
80
[0216] HA— GLP— 1アナログ結合体は、分子量 200kDaの HAを用いた場合、および水 溶性 HA修飾物とマレイミド基の間の連結基に疎水性の（CH ) を用いた場合にも、
2 10
GLP— 1のもつ cAMP産生能は維持されることが確認された。 (実施例 7— 5) HA— GLP— 1アナログ結合体の血中滞留時間評価
実施例 7— 3で得られた HA— GLP - 1アナログ結合体溶液を溶媒 Zで希釈し、 50 gZkgの用量でラット静脈内に単回投与し、投与後 1、 4、 8、 24、 48、 72、 120、 1 68時間に採血 (へパリン処理)し、遠心分離により血漿を得た。この血漿サンプルは 測定まで— 20°C以下で凍結保存した。
[0217] 沏 I 法
GLP—1 (Active) ELISA KIT(Linco Research, Inc.製）（以下、「キット W」と も称す)の 96穴プレートに検量線用標準試料および測定用試料を分注しマイクロプ レートリーダーを用いて分析を行った。以下に条件を示す。
[0218] マイクロプレートリーダー： SPECTRA MAX GEMINI (Molecular Devices 社製）
Detection： Fluorescence (EX： 355nm, EM： 460nm)
測定試料の調製
•検量線用試料；
実施例 7— 3で得られた HA— GLP - 1アナログ結合体溶液を溶媒 Zおよびキット W 【こ同封された Assay Bufferを用!ヽて希釈し、 3. 2、 1. 6、 0. 8、 0. 4、 0. 2、 0. 1、 0. 05 μ gZmLおよび 0 μ gZmLの標準液を調製した。この標準液に 5 μ Lの正常 ラット血漿を添加し、検量線用試料を調製した。
•測定用試料の調製；
HA—GLP— 1アナログ結合体投与ラット血漿サンプルに、キット Wに同封された A ssay Bufferを添カ卩して測定用試料を調製した。
•血漿中の HA修飾物濃度の算出；
解析ソフト SOFTmax PRO (Molecular Devices社製）を用いて各標準試料の 蛍光強度力 得られた検量線より血漿中の HA—GLP—1アナログ結合体濃度を算 出した。
[0219] 薬物動餱データ
投与した HA— GLP— 1アナログ結合体の血中濃度推移のデータにつ 、て、 Win Nonlin Ver 4. 0. 1 (Pharsight社製)で薬物動態学的パラメーターを算出した。 各個体の血漿中濃度推移についてモデル非依存的解析を行い、平均血中滞留時 間（MRT)を算出した。半減期 (tl/2)は各個体の測定可能な最終 3点のデータを 用いて算出した。 HA— GLP— 1アナログ結合体の血中濃度推移を図 13に示す。ま た、算出した薬物動態学的パラメーターを表 16に示す。
[0220] [表 16- 1] 表 1 6 HA— G L P— 1アナ口グ結合体をラットに静脈内投与したときの薬物動態学 的パラメーター
被検試料 7 _3— 1 平均値 標準偏差
半減期 18,2 2.3 (hr)
クリアランス 1.43 0.15 (raL/hr/kg)
平均血中滞留時問 25.3 1.9 (hr)
分布容積 36.1 3.1 (mL/kg) 被検試料 7— 3 _2 平均値 標準偏差
23.6 8.3 (hr)
クリアランス 0.86 0.09 (raL/hr/kg)
平均血中滞留時間 37.3 4.5 (hr)
分布容積 31.9 2.6 (mL/kg)
[0221] [表 16- 2]
被検試料 7 - 3 - 3 平均値 標準偏差
18.8 1.4 (hr)
クリアランス 1.50 0.10 (mL/hr/kg) 平均血中滞留時間 29.1 0.6 (hr) 分布容積 43.7 2.8 (mL/kg) 被織料 7 - 3— 4 平均値 標準偏差
26.3 0.8 (hr)
クリアランス 1.23 0.06 (mL/hr/kg) 平均血中滞留時間 41.2 1.1 (hr) 分布容積 50.6 3.4 (mL/kg)
[0222] いずれのペプチドおよびリンカ一を用いても HA— GLP— 1アナログ結合体とする ことによって、半減期が 18〜26時間、平均血中滞留時間が 25. 3〜41. 2時間と滞 留性が非常に向上することが明ら力となった。
[0223] HA— GLP— 1アナログ結合体は合目的的に HAの分子量や連結基構造を選択 すること可能であることが示された。
〔実施例 8〕水溶性 HA修飾物 GLP— 1アナログ結合体の調製と評価
GLP— 1アナログ導入率の異なる水溶性 HA修飾物 GLP— 1アナログ結合体を 調製した。
(実施例 8— 1) HA-EDOBEA- (EO) —MlZSUCの調製
4
BOP試薬を HAユニットに対し 2. 5の当量比とした以外は実施例 3— 1と同様にし て得たHA—EDOBEA(100kDa HA—TBA、 EDOBEA導入率： 100%)水溶 液（10mg/mL、 5. 0、 9. OmL)に 0. 2Mジン酸緩衝液（pH7. 0、 6. 25、 11. 25m L)をそれぞれカ卩えた。 NHS—（EO) -MI (Quanta BioDesign Ltd.製）の DM SO溶液（0. 377, 1. 510mg/mL, 1. 25, 2. 25mUをそれぞれ加えた。また、同 じHA— EDOBEA (100kDa HA—TBAゝ EDOBEA導入率： 100%)水溶液（10 mg/mL、 5. 0mL) 3本に 0. 2Mジン酸緩衝液（pH7. 0、 6. 25mL)および 0. 1MU ン酸緩衝液（ρΗ7. 0、 37. 5mL)をそれぞれ加えた。 NHS— (EO) -MI (Quanta
4
BioDesign Ltd.製;)の DMSO溶液（2. 114、 2. 717、 3. 321mg/mL, 1. 25 mL)をそれぞれ加えた。室温で 30分間振とうした。無水コハク酸 DMSO溶液（293 mg/mL, NHS—（EO) — MIの DMSO溶液と等量）をそれぞれ加えて、更に室温
4
で 1. 5時間振とうした。 4°Cで大過剰量の蒸留水 (ミリ Q水）に対して透析精製し (スぺ クトラポア 4、 MWCO： 12k- 14kDa)、得られた溶液を凍結乾燥して、マレイミド基 およびコハク酸が導入された HA—EDOBEA— (EO) -Ml/SUC (57. 78、 99.
4
24、 61. 33、 60. 92、 59. 02mg)を得た。
[0224] それぞれの MlZHAを実施例 6— 1に記載の方法で評価したところ 1. 2、 4. 7、 6.
0、 7. 3、 9. 3 (molZmol)であった。
[0225] マレイミド導入量（マレイミド ZHA (mol/mol) )は添カ卩する NHS—（EO) — Ml添
4 加量で制御することが可能であった。
(実施例 8— 2) HA—GLP— 1アナログ 2結合体溶液の調製
実施例 8— 1で得たそれぞれの HA— EDOBEA—（EO) — MlZSUC水溶液（2
4
Omg/mL, 0. 15mL)に GLP— 1アナログ 2の 0. 2Mリン酸緩衝液（pH7. 0)の溶 液を Mlと GLP—1アナログ 2が等モルとなるように（2. Omg/mL, 0. 0432、 0. 16 77、 0. 2128、 0. 2588、 0. 3319mL)それぞれ加え、 37。Cで 1時間静置した。シス ティン塩酸塩一水和物の 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH7. 0)の溶液 (4. 21、 9. 93、 11. 03、 11. 90、 12. 95mg/mL, 0. 0193、 0. 0318、 0. 0363、 0. 0409、 0. 048 2mL)をそれぞれ加え、更に 37°Cで 30分間静置した。反応混合液を実施例 7— 3記 載の条件で GPCに供して結合体画分を分取した。分取した画分を濾過（MILLEX — GV、 =0. 22 m、ミリポア社製）した後、遠心式限外濾過（Centricon Plus — 20、分画分子量： 30000、ミリポア社製)で容量が約 1Z20程度になるまで濃縮し た。濃縮液を PBSで約 20倍程度に稀釈、再度同様に濃縮、稀釈した。再び濃縮して 得られた濃縮液を PBSで約 0. 48, 0. 45、 0. 48、 0. 60、 0. 60mUこ調整し、これ を濾過（MILLEX— GV、 =0.22 m、ミリポア社製）して標題の HA— GLP— 1 アナログ 2結合体溶液を得た (試料番号 8— 2—1〜8— 2— 5)。試料溶液の稀釈率 を適宜変更した以外は実施例 6— 2記載の方法と同様に定量した。結果を表 17にま とめた。
[0226] [表 17] 表 17 HA— GLP— 1アナログ 2の調製
GUM
GLP-1 HA-ED0BEA-
MI/HA アナ口グ
アナログ (E0)4- MI/SUC
unol/mol) /HA
Figure imgf000073_0001
8-2-1 1.2 27.1 1.87 1.2
8-2-2 4.7 118.7 4.02 5.9
8-2-3 6.0 112.2 3.88 7.0
8-2-4 7.3 112.2 3.88 7.5
8-2-5 9.3 112.2 3.88 10.7
[0227] GLP—1アナログはマレイミドと等量添加することで、その導入量はマレイミド量に 近い値として定量され、ほぼ定量的に結合体ィ匕されるものと考えられた。
[0228] マレイミド導入量、 GLP— 1アナログ導入量が制御可能であることは、再現性高く結 合体を調製し得ることを示すものである。
(実施例 8— 3)HA— GLP— 1アナログ 2結合体の cAMP産生能評価
実施例 8— 2で得られた各種HA—GLP—lァナログ結合体のcAMP産生能は、 実施例 6— 3と同様に測定した。
[0229] 表 18に、各種 HA—GLP— 1アナログ結合体のサイクリック AMP産生能を、天然 型 GLP—lの EC50値を 1とした時の相対値で示した。なお、結合体の EC50値は H A—GLP— 1アナログ 2結合体における GLP— 1アナログ 2濃度に基づいて算出した
[表 18] 表 1 8 ^1八ー0乙13—1ァナログ1ぉょび01^ —1ァナログ2結合体の。八]^ ?産 生能
χ'
被検試料 E C 5 0値 （相対値）
Figure imgf000074_0001
8 - 2 - 4 9 5
1 5 1
[0231] HA— GLP— 1アナログ 2結合体は、 GLP— 1アナログ導入率を変化させても GLP
1のもつ cAMP産生能を保持することが確認された。
[0232] HA—GLP— 1アナログ結合体を GLP— 1アナログ持続性糖尿病および高血糖症 に起因する糖尿病性合併症、肥満症の予防または治療薬として使用する上では、投 与する GLP— 1量と投与方法力 規定される投与容量において、 HAに起因する粘 度の上昇が許容される範囲で GLP— 1アナログ導入率を選択することができる。 〔実施例 9〕水溶性 HA修飾物 GLP— 1アナログ結合体の調製と評価
異なる GLP— 1アナログで GLP— 1アナログ導入率の異なる水溶性 HA修飾物 GLP— 1アナログ結合体を調製した。
(実施例 9 1) HA—GLP— 1アナログ結合体溶液の調製
実施例 7— 1で得た HA— EDOBEA— (CH ) -MI/SUC (MI/HA= 5. 0 (
2 10
molZmol) )水溶液（20mgZmL、 0. 15mL)に GLP— 1アナログ 1あるいは 2の 0. 2Mリン酸緩衝液（pH7. 0)の溶液を GLP— 1アナログ/ HAが 1. 0、 2. 0、 4. 0、 5 . 0、 6. 0、 7. 5 (mol/mol)となるように（GLP— 1アナログ 1 : 2. Omg/mL, 0. 01 62、 0. 0325、 0. 0649、 0. 0812、 0. 0974、 0. 1217mL、 GLP— 1アナログ 2 : 2. Omg/mL, 0. 0179、 0. 0358、 0. 0716、 0. 0895、 0. 1074、 0. 1343mL、 )それぞれ加え、 37°Cで 1時間静置した。システィン塩酸塩一水和物の 0. 1Mリン酸 緩衝液 (PH7. 0)の溶液（11. 22mg/mL、 0. 0150mL)をそれぞれ加え、更に 37 °Cで 30分間静置した。反応混合液を実施例 7— 3記載の条件で GPCに供して結合 体画分を分取した。分取した画分を濾過（MILLEX—GV、 φ =0. 22 ^ m,ミリポア 社製）した後、遠心式限外濾過（Centricon Plus— 20、分画分子量： 30000、ミリ ポア社製)で容量が約 1Z20程度になるまで濃縮した。濃縮液を PBSで約 20倍程度 に稀釈、再度同様に濃縮、稀釈した。再び濃縮して得られた濃縮液を PBSで約 0. 4 8, 0. 45、 0. 48、 0. 60、 0. 60mLに調整し、これを濾過（MILLEX— GV、 φ =0 . 22 m、ミリポア社製）して標題の HA— GLP— 1アナログ 1および HA— GLP— 1 アナログ 2結合体溶液を得た。試料溶液の稀釈率を適宜変更した以外は実施例 6 - 2記載の方法と同様に定量した。
[0233] 結果を表 19にまとめた。
[0234] [表 19]
HA— GLP— 1アナログ 1および HA GLP— 1アナログ 2の調製
仕込み
HA-ED0BEA- GLP-l
GLP-1 GLP - 1 GLP- 1
MI/HA (CH2) ,ο
料 アナログ/ アナログ アナ口グ
(mol/mol) -MI/SUC ΗΛ
Ml 1 or 2 (nmol/rau
(mg mL) (mol/mol)
(m。丄 /raoO
9-1-1 5.0 1. 5 13.6 4.39 1.0
9-1-2 5.0 2.0 5 28.6 4.76 1.9
9-1-3 5.0 4.0 5 57.2 3.65 4.9
9-1-4 5.0 5.0 5 65.7 4.32 4.8
9-1-5 5.0 6.0 5 67.3 3.65 4.9
9 1 6 5.0 7.5 5 78.2 4.32 5.1
9-1-7 5.0 1.0 6 15.8 4.26 1.1
9-1-8 5.0 2.0 6 31.2 4.81 2.0
-1-9 5.0 4.0 6 59.9 4.25 4.4
9-1-10 5.0 5.0 6 75.0 4.60 5.1
9-1-11 5.0 6.0 6 61.6 3.59 5.4
9-1-12 5.0 7.5 6 69.5 4.64 4.7 マレイミド導入量（MlZHA (mol/mol) )を一定とした時、 GLP— 1アナログ導入 率は GLP— 1アナログ添カ卩量で制御できることが示された。一方、 GLP—1アナログ 添力卩量をマレイミドの 1から 1.5等量に増大しても GLP—1導入率はほぼ不変であつ たことから、結合体ィ匕はマレイミドと GLP— 1アナログのチオールとの特異的な反応で 形成されて 、ることが支持された。
(実施例 9 2) HA— GLP 1アナログ結合体の cAMP産生能評価
実施例 9 1で得られた各種 HA—GLP— 1アナログ結合体の cAMP産生能は、 実施例 6— 3と同様に測定した。
[0236] 表 20に、各種 HA—GLP— 1アナログ結合体のサイクリック AMP産生能を、天然 型 GLP— 1の EC50値を 1とした時の相対値で示した。
[0237] [表 20] 表 20 ΗΛ— GLP— 1アナログ 1および G LP— 1アナログ 2結合体の c AMP産 生能
被検試料 EC 50値 （相対値）
GLP- 1 1
9-1-1 350
9-1-2 379
9-1-3 691
9-1-4 439
9-1 -5 57 R
9-1-6 4 1
9-1-7 153
9-1-8 115
9-1-9 112
9一 1 10 109
9-1-11 162
9-1-12 1 77
HA—GLP— 1アナログ結合体は、マレイミドに対する GLP— 1アナログ導入率を 変化させても GLP—1のもつ cAMP産生能を保持することが確認された。
〔実施例 10〕水溶性 HA修飾物— GLP— 1アナログ 1および GLP— 1アナログ 3結合 体の調製と評価
GLP— 1アナログの C末端が異なる水溶性 HA修飾物— GLP— 1アナログ結合体 を調製した。
(実施例 10— 1) HA-EDOBEA- (EO) —MlZSUCの調製 BOP試薬を HAユニットに対し 2. 5の当量比とした以外は実施例 3— 1と同様にし て得た HA— EDOBEA(100kDa HA— TBA、 EDOBEA導入率： 97. 0%)水溶 液（10mg/mL、 5. OmL)に 0. 2Mジン酸緩衝液（pH7. 0、 6. 25mL)および 0. 1 Mリン酸緩衝液（pH7. 0、 37. 5mL)をそれぞれカ卩えた。 NHS— (EO) -MI (Qua
4
nta BioDesign Ltd.製）の DMSO溶液（1. 826mg/mL, 1. 25mL)を加え、 室温で 30分間振とうした。無水コハク酸 DMSO溶液（287mgZmL、 1. 25mL)を カロえて、更に室温で 1. 5時間振とうした。 4°Cで大過剰量の蒸留水（ミリ Q水）に対し て透析精製し (スぺクトラポア 4、 MWCO： 12k- 14kDa)、得られた溶液を凍結乾燥 して、 HA— EDOBEA— (EO) -Ml/SUC (54. Omg)を得た。
4
MlZHAを実施例 6— 1記載の方法で評価したところ 7. 7 (mol/mol)であった。 (実施例 10— 2) HA-GLP- 1アナログ 3および GLP— 1アナログ 1結合体溶液の 調製
天然型の GLP— l (Human、 7— 37 ;特表平 7— 504679号公報記載）の 2番目（8 位)のァラニンをグリシンに、 31番目（37位)のグリシンをシスティンに変更し、 C末端 をアミド化した変異体 (以下、「GLP— 1アナログ 3」とも称す)を固相法ペプチド合成 法で得た（(株)ペプチド研究所製)。実施例 10— 1で得た HA— EDOBEA— (EO)
4
-MI/SUC (MI/HA=7. 7(molZmol) )水溶液（20mgZmL、 0. 15mL)に G LP— 1アナログ 3あるいは GLP— 1アナログ 3の 0. 2Mリン酸緩衝液（pH7. 0)の溶 液（2. Omg/mL, 0. 250mL)を加えた。それぞれ 37°Cで 1時間静置した。システ イン塩酸塩一水和物の 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH7. 0)の溶液（12. 96mg/mL、そ れぞれ 0. 040mL)を加え、更に 37°Cで 30分間静置した。反応混合液を下記の条 件で GPCに供して結合体画分を分取した。分取した結合体画分を濾過（MILLEX — GV、 =0. 22 m、ミリポア社製）した後、遠心式限外濾過（Centricon Plus — 20、分画分子量： 30000、ミリポア社製)で容量が約 1Z20程度になるまで濃縮し た。濃縮液を PBSで約 20倍程度に稀釈、再度同様に濃縮、稀釈した。再び濃縮して 得られた濃縮液を PBSで約 0. 6mLに調整し、これを濾過（MILLEX—GV、 =0 . 22 /ζ πι、ミリポア社製）して標題の HA— GLP— 1アナログ 1およびアナログ 3結合 体溶液を得た (試料番号 10— 2— 1〜 10— 2— 2)。試料溶液の稀釈率を適宜変更 した以外は実施例 6— 2記載の方法と同様に定量した結果を表 21にまとめた。
[0240] GPC条件
System： FPLC (アマシャムバイオサイエンス株式会社製）
GPC Column： Superdex200 10/300 GL (アマシャムバイオサイエンス株 式会社製）
Mobile phase: 30%ァセトニトリル、 0.1%トリフルォロ酢酸水溶液
Flow rate:0.6mL/ mm
Detection :UV(280nm)
[0241] [表 21]
* 1 HA— GLP— 1アナログ 3および GLP—lアナログ 1結合^液の調製
GLP-1 HA-ED0BEA- GLP-1 ΗΛ分子量 MI/HA アナログ
アナログ （E0) 4-MI/SUC アナ口グ /HA
(kD a) (mol/mol) (nmol/mL)
3 or 1 (mg/mL) (molZmol)
0-2-1 100 7. 7 3 166. 3 2. 94 8. 9
0-2-2 100 7. 7 1 191. 1 3. 04 9. 9
[0242] (実施例 10— 3)HA—GLP—lァナログ結合体のcAMP産生能
実施例 10— 2で得られた HA— GLP— 1アナログ 3および GLP— 1アナログ 1結合 体の cAMP産生能は、実施例 6— 3と同様に測定した。
[0243] 表 22に、 HA—GLP— 1アナログ 3および GLP— 1アナログ 1結合体の cAMP産生 能を、天然型 GLP— 1の EC50値を 1とした時の相対値で示した。
[0244] [表 22] 表 22 ΠΑ Gi.P - 1アナログ 3および G Li1— 1アナログ 1結合体の c AMP産 生能
被検試料 EC50値 （相対値）
GLP- 1 1
1 0- 2- 1 1 6
1 0-2-2 575
HA—GLP— 1アナログ結合体は、 GLP— 1アナログの C末端カルボキシ基がアミ ド化されていても GLP— 1のもつ cAMP産生能を保持することが確認された。

Claims

請求の範囲
[1] 水溶性のヒアルロン酸修飾物に 1以上のグルカゴン様ペプチド 1 (GLP— 1)アナ ログが結合した、ヒアルロン酸 ペプチド結合体、またはその塩。
[2] 前記 GLP— 1アナログが 2価の連結基を介して前記ヒアルロン酸修飾物に結合する 、請求項 1に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体、またはその塩。
[3] 水溶性のヒアルロン酸修飾物において、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分に含まれ るカルボキシ基の 70%以上が N—置換アミド基に変換されており、ここで当該ヒアル ロン酸修飾物中の各 N 置換アミド基の置換基は同一であっても異なってもよぐ当 該置換基の少なくとも 1つが前記 GLP— 1アナログと連結する 2価の連結基である、 請求項 1または 2に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体、またはその塩。
[4] 糖尿病、高血糖症、糖尿病性合併症、および肥満症から選択される疾患の予防ま たは治療に使用される、請求項 1〜3のいずれか 1項に記載のヒアルロン酸ーぺプチ ド結合体、またはその塩。
[5] GLP— 1アナログ力 GLP— 1 (1— 36)または GLP— 1 (7— 36)の C末端側に— X a— Cysで表されるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列に お 、て 1〜5個のアミノ酸が欠失、置換および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もな るペプチドであり（前記アミノ酸配列は、天然アミノ酸および Zまたは非天然アミノ酸 により置換および/または付加されてもよい）、ここで Xaは直接結合またはプロリン、 グリシン、セリンおよびグルタミン酸力 独立に選択される 1〜9のアミノ酸力 なる配 列であり、当該ペプチドの C末端のシスティンのカルボキシ基はアミド基に変換されて いてもよい、請求項 1〜4のいずれ力 1項に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体、ま たはその塩。
[6] GLP— 1アナログが、 GLP— 1 (1— 36)または GLP— 1 (7— 36)の C末端に— Xa
Cysで表されるアミノ酸配列を付カ卩したアミノ酸配列の 8位のァラニン (Ala8)が天 然または非天然アミノ酸に置換されて!、る配列からなるペプチドであり、当該べプチ ドの C末端のシスティンのカルボキシ基がアミド基に変換されて 、てもよ 、、請求項 5 に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体、またはその塩。
[7] GLP— 1アナログが、 GLP— 1 (1— 36)または GLP— 1 (7— 36)の C末端に— Xa — Cysで表されるアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列の 8位のァラニン (Ala8)が、 グリシン、セリン、ノ リン、ロイシン、イソロイシンおよびスレオ-ンカも選択されるァミノ 酸に置換されて ヽる配列からなるペプチドであり、当該ペプチドの C末端のシスティ ンのカルボキシ基がアミド基に変換されていてもよい、請求項 5に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体、またはその塩。
[8] GLP— 1アナログが、
His— Gly— Glu— Gly— Thr— Phe— Thr— Ser— Asp— Val— Ser— Ser— Tyr -Leu- Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe lie— Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg— Xa— Cys (配列番号 1 )
で表されるペプチド、または当該ペプチドの C末端のシスティンのカルボキシ基がアミ ド基に変換されたペプチドである、請求項 5に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体 、またはその塩
[9] Xaが、直接結合または Gly— Pro— Pro— Pro である請求項 5〜8のいずれか
1項に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体、またはその塩。
[10] GLP—1アナログが、 GLP—l (l— 36)、 GLP—l (l— 37)、 GLP—l (7— 36)ま たは GLP— 1 (7— 37)に、 Qa—SHで表されるチオールィ匕合物を付カ卩したアミノ酸 配列、または当該アミノ酸配列において 1〜5個のアミノ酸が欠失、置換および Zまた は付加されたアミノ酸配列力もなるペプチドであり（前記アミノ酸配列は、天然アミノ酸 および Zまたは非天然アミノ酸により置換および Zまたは付加されてもょ 、）、 ここで Qaは一 NH— X5 、 一 CO— X5 または一 CONH— X5 力ら選択され、ぺ プチドの C末端アミノ酸に含まれるカルボキシ基、アミノ基または水酸基と連結してァ ミド結合、ゥレア結合またはエステル結合を形成し、
X5は C アルキレン基であり、ここで当該アルキレン基の 1以上の個所において当
1-50
該アルキレン基に含まれる 2つの炭素原子の間に酸素原子が挿入されていてもよぐ 当該アルキレン基の炭素原子は、水酸基および C アルキル基から選択される 1以
1-6
上の置換基により独立に置換されていてもよい、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載 のヒアルロン酸 ペプチド結合体、またはその塩。
[11] 2価の連結基の一端力 GLP— 1アナログに導入されたメルカプト基において結合す る請求項 5〜10のいずれ力 1項に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体、またはそ の塩。
2価の連結基が式 (I) :
[化 1]
Figure imgf000083_0001
[式中、 Qは C アルキレン基であり、ここで当該アルキレン基の 1以上の個所にお
1-400
いて当該アルキレン基に含まれる 2つの炭素原子の間に酸素原子が挿入されていて もよぐさらに当該アルキレン基の 1以上の個所において当該アルキレン基に含まれ る炭素原子の間ある ヽは末端に CO 、 一 NHCO -または CONH -が挿入さ れていてもよぐ当該アルキレン基の炭素原子は、水酸基および C アルキル基から
1-6
選択される 1以上の置換基により独立に置換されていてもよく；
Xは、 -CH -CH— **、 -CH -CH -CH **、もしくは— CH (— CH )— CH
2 2 2 2 2 3 2 **であり、 Rは水素原子または C アルキル基であり；または
1-6
Xおよび Rは結合する炭素原子および窒素原子と一緒になつて、式 (Π)：
[化 2]
Figure imgf000083_0002
で表される基を形成し；
*はヒアルロン酸修飾物中のアミド基の窒素原子への結合位置を表し、 **は GLP— アナログのメルカプト基の硫黄原子への結合位置を表す] で表される、請求項 11に記載のヒアルロン酸—ペプチド結合体、またはその塩。
2価の連結基が式 (la) :
[化 3]
Figure imgf000084_0001
[式中、 Q1は C アルキレン基であり、ここで当該アルキレン基の 1以上の個所にお
1-10
いて当該アルキレン基に含まれる 2つの炭素原子の間に酸素原子が挿入されていて もよぐ当該アルキレン基の炭素原子は、水酸基および C アルキル基から選択され
1-6
る 1以上の置換基により独立に置換されていてもよく；
X1は、 CH -CH— **、 -CH -CH -CH **、もしくは— CH (— CH )— CH
2 2 2 2 2 3 ί **であり、 R1は水素原子または C アルキル基であり；または
1-6
X1および R1は結合する炭素原子および窒素原子と一緒になつて、式 (Ila)：
[化 4]
Figure imgf000084_0002
で示される基を形成し；または
X1は、式 (lb)：
[化 5]
Figure imgf000085_0001
(式中、 Qは C アルキレン基であり、ここで当該アルキレン基の 1以上の個所にお
1-10
いて当該アルキレン基に含まれる 2つの炭素原子の間には酸素原子が挿入されてい てもよぐ当該アルキレン基の炭素原子は、水酸基および C アルキル基力 選択さ
1-6
れる 1以上の置換基により独立に置換されていてもよく；
X2は、 CH -CH— **、 -CH -CH -CH **、もしくは一 CH (— CH )— CH
2 2 2 2 2 3 2 **であり、 R2は水素原子または C アルキル基であり；または
1-6
X2および R2は結合する炭素原子および窒素原子と一緒になつて、式 (lib)：
[化 6]
Figure imgf000085_0002
で示される基を形成し；または
X2は、式 (Ic)：
[化 7]
Figure imgf000085_0003
(式中、 Qは C アルキレン基であり、ここで当該アルキレン基の 1以上の個所にお いて当該アルキレン基に含まれる 2つの炭素原子の間には酸素原子が挿入されてい てもよく、当該アルキレン基の炭素原子は、水酸基および C アルキル基力 選択さ
1-6
れる 1以上の置換基により独立に置換されていてもよく；
X3は、 C -CH— **、 -CH -CH -CH— **、— CH (— CH )— CH **で
2 2 2 2 2 3 2 あり、 R3は水素原子または C アルキル基であり；または
1-6
X3および R3は結合する炭素原子および窒素原子と一緒になつて、式 (lie)：
[化 8]
Figure imgf000086_0001
で表される基を形成する）
で表される基であり）
で表される基であり；
*はヒアルロン酸修飾物中のアミド基の窒素原子への結合位置を表し、 **は GLP— 1 アナログのメルカプト基の硫黄原子への結合位置を表す]
で表される、請求項 9または 10に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体、またはその 塩。
前記アミド基の窒素原子上に導入された置換基の 1つが、式 (IV)：
Figure imgf000086_0002
[Qおよび Rは請求項 12で定義したとおりであり、 Qは C アルキレン基である] で表される、請求項 1〜13のいずれか 1項に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体、 またはその塩。
[15] Q1が、式：—（CH ) —、または—（CH ) - (O-CH -CH )―
2 m 2 m 2 2 n
[式中、 mは 1〜10からそれぞれ独立に選択される整数であり、 nは 1〜200から選択 される整数である]
で表される、請求項 13または 14に記載のヒアルロン酸—ペプチド結合体、またはそ の塩。
[16] X1が、式：—（CH ) - (O-CH -CH ) — NHCO— (CH ) — Y1— **、または—
2 m 2 2 p 2 q
(CH ) Y1—**
2 r
[式中、 mは 1〜10から選択される整数であり、 pは 1〜200から選択される整数であ り、 qおよび rは 1〜： LOから独立に選択される整数であり、 Y1は式 (lie)：
[化 10]
Figure imgf000087_0001
で表される基であり、
**は GLP— 1アナログのメルカプト基の硫黄原子への結合位置を表す] で表される、請求項 13〜15のいずれか 1項に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体 、またはその塩。
[17] ヒアルロン酸に含まれるカルボキシ基の N 置換アミド基への修飾率が 85モル％ 以上である、請求項 1〜16のいずれか 1項に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体、 またはその塩。
[18] GLP— 1アナログに結合した連結基により置換されたアミド基のヒアルロン酸に含ま れるカルボキシ基に対する導入率力 平均 0. 1モル％以上であり 15モル％以下で ある、請求項 1〜17のいずれか 1項に記載のヒアルロン酸—ペプチド結合体、または その塩。 [19] 粘度平均分子量が 5000ダルトン〜 100万ダルトンである、請求項 1〜18のいずれ 力 1項に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体、またはその塩。
[20] 請求項 1〜19のいずれか 1項に記載のヒアルロン酸—ペプチド結合体、またはその 塩を含む医薬組成物。
[21] 請求項 1〜19のいずれか 1項に記載のヒアルロン酸—ペプチド結合体、またはその 塩を含む、糖尿病、高血糖症、糖尿病性合併症、および肥満症から選択される疾患 の予防または治療に使用される医薬。
[22] 静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与および経肺投与 力も選択される手段により投与される、請求項 20に記載の医薬組成物。
[23] 請求項 1〜19いずれ力 1項に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体、またはその塩 の治療有効量を投与することを含む、糖尿病、高血糖症、糖尿病性合併症、および 肥満症から選択される疾患の予防または治療方法。
[24] 非プロトン性極性溶媒中で、式 (V) ：
[化 11]
( V )
Figure imgf000088_0001
[式中、 R1Q、 Ru、 R12、 R13、 R14および R15は、それぞれ独立に C アルキル基から選
1-6
択され、または R10および RU、 R12および R13、ならびに R"および R15は、それぞれ独立 にそれらが結合する窒素原子と一緒になつて含窒素へテロ環を形成してもよぐ環 B は置換されて 、てもよ 、単環式または縮環式の含窒素へテロ環基であり、 ΧΊまァ- オンを表す]
で表される縮合剤を使用して、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分に含まれるカルボキ シ基を、 N—置換アミド基に変換して水溶性ヒアルロン酸修飾物を得る工程を含む、 請求項 1〜19のいずれか 1項に記載のヒアルロン酸 ペプチド結合体、またはその 塩の製造方法。
[25] 上記非プロトン性極性溶媒力 ジメチルホルムアミド、ジメチルァセトアミド、ジメチル スルホキシド、 1, 3 ジメチル一 2—イミダゾリジノン、スルホラン、 N—メチルピロリド ンまたはこれらの 2種以上の混合溶媒力 選択される請求項 24に記載の製造方法。
[26] 上記非プロトン性極性溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項 25に記載の製造 方法。
[27] 式 (V)において、環 Bがべンゾトリアゾール—1—ィルである、請求項 24〜26のい ずれか 1項に記載の製造方法。
[28] 上記縮合剤が、ベンゾトリァゾール一 1—ィルォキシ一トリス（ジメチルァミノ）ホスホ -ゥム へキサフルォロホスフェート、ベンゾトリアゾール 1—ィルォキシ一トリス（ピ ロリジノ）ホスホ-ゥム へキサフルォロホスフェート、およびこれらの混合物から選択 される BOP系縮合剤である、請求項 27に記載の製造方法。
[29] 請求項 24〜28のいずれか 1項に記載の製造方法により製造することができる、請 求項 1〜19のいずれ力 1項に記載のヒアルロン酸—ペプチド結合体、またはその塩。
[30] GLP - 1 (1 - 36)または GLP—1 (7— 36)の C末端側に一 Xa— Cysで表されるァ ミノ酸配列を付カ卩したアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列にぉ 、て 1〜5個のァミノ 酸が欠失、置換および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなるペプチドであり（前記 アミノ酸配列は、天然アミノ酸および Zまたは非天然アミノ酸により置換および Zまた は付加されてもよい）、ここで Xaは直接結合またはプロリン、グリシン、セリンおよびグ ルタミン酸力も独立に選択される 1〜9のアミノ酸力もなる配列であり、当該ペプチドの C末端のシスティンのカルボキシ基はアミド基に変換されて 、てもよ 、ペプチドである 、 GLP—1アナログ。
[31] GLP— 1アナログが、 GLP— 1 (1— 36)または GLP— 1 (7— 36)の C末端に— Xa
Cysで表されるアミノ酸配列を付カ卩したアミノ酸配列の 8位のァラニン (Ala8)が天 然または非天然アミノ酸に置換されて!、る配列からなるペプチドであり、当該べプチ ドの C末端のシスティンのカルボキシ基がアミド基に変換されて 、てもよく、 Xaは請求 項 30に定義されたとおりである、 GLP— 1アナログ。 [32] GLP— 1アナログが、 GLP— 1 (1— 36)または GLP— 1 (7— 36)の C末端に— Xa — Cysで表されるアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列の 8位のァラニン (Ala8)が、 グリシン、セリン、ノ リン、ロイシン、イソロイシンおよびスレオ-ンカも選択されるァミノ 酸に置換されて ヽる配列からなるペプチドであり、当該ペプチドの C末端のシスティ ンのカルボキシ基がアミド基に変換されて 、てもよ 、、請求項 31に記載の GLP— 1ァ ナログ。
[33] 配列番号 1で表されるペプチド、または当該ペプチドの C末端のシスティンのカル ボキシ基がアミド基に変換されたペプチドである、請求項 30に記載の GLP— 1アナ口 グ。
[34] Xaが、直接結合または Gly— Pro— Pro— Pro である請求項 33に記載の GLP
1アナログ。
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