ES2926713T3

ES2926713T3 - Coagonistas de glucagón y GLP-1 para el tratamiento de la obesidad

Info

Publication number: ES2926713T3
Application number: ES18182274T
Authority: ES
Inventors: Balaji Agoram; Madeleine Antonsson; Maria A Bednarek; Nicole Burmeister; Lambertus Benthem; David Fairman; Maria Fritsch-Fredin; Ronald Henry Jackson; Rasmus Jansson Lofmark; Jaqueline Metcalfe
Original assignee: MedImmune Ltd
Current assignee: MedImmune Ltd
Priority date: 2012-12-11
Filing date: 2013-12-10
Publication date: 2022-10-27
Anticipated expiration: 2033-12-10
Also published as: US20220098265A1; EP3495380B1; CA2893445C; DK3495380T3; US9765130B2; EP2931745A2; SI2931745T1; KR102080366B1; AU2013356934A1; US11230584B2; PL3495380T3; US20200115431A1; PT3495380T; DK2931745T3; SI3495380T1; CN104822699B; LT3495380T; CA2893445A1; JP2016501256A; CN109776670A

Abstract

La presente invención proporciona péptidos resistentes a proteasas, métodos para producir tales péptidos, así como composiciones que comprenden péptidos resistentes a proteasas y métodos de tratamiento que utilizan dichos péptidos. Se ha determinado que la incorporación de aminoácidos funcionalizados con alfa-metilo directamente en la cadena principal durante la síntesis de péptidos estándar a través de las metodologías descritas en el presente documento produce péptidos resistentes a la proteasa. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Coagonistas de glucagón y GLP-1 para el tratamiento de la obesidad

ANTECEDENTES

La obesidad es un problema de salud importante y creciente en todo el mundo y se asocia a muchas enfermedades que ponen en peligro la vida, tales como las enfermedades cardiovasculares, las enfermedades renales, la hipertensión, el ictus, la infertilidad, la disfunción respiratoria y la diabetes de tipo 2.

El glucagón y el péptido-1 similar al glucagón (GLP-1) derivan del preproglucagón, un polipéptido precursor de 158 aminoácidos que se procesa en diferentes tejidos para formar una serie de diferentes péptidos derivados del proglucagón, incluyendo el glucagón, el péptido-1 similar al glucagón (GLP-1), el péptido-2 similar al glucagón (GLP-2) y la oxintomodulina (OXM), que están implicados en una amplia diversidad de funciones fisiológicas, incluyendo la homeostasis de la glucosa, la secreción de insulina, el vaciado gástrico y el crecimiento intestinal, así como la regulación de la ingesta de alimentos. El glucagón es un péptido de 29 aminoácidos que corresponde a los aminoácidos 33 a 61 del proglucagón (53 a 81 del preproglucagón), mientras que el GLP-1 se produce como un péptido de 37 aminoácidos que corresponde a los aminoácidos 72 a 108 del proglucagón (92 a 128 del preproglucagón). La amida de GLP-1(7-36) o el ácido GLP-1(7-37) son formas biológicamente activas del GLP-1, que demuestran una actividad esencialmente equivalente en el receptor de GLP-1.

El glucagón es producido por el páncreas e interactúa con el receptor del glucagón ("glucR"). El glucagón actúa en el hígado para aumentar la glucosa en sangre a través de la gluconeogénesis y la glucogenólisis. Cuando la glucosa en sangre comienza a descender, el glucagón envía una señal al hígado para que descomponga el glucógeno y libere glucosa, lo que hace que los niveles de glucosa en sangre aumenten a un nivel normal.

El GLP-1 tiene actividades biológicas diferentes en comparación con el glucagón. Es secretado por las células L del intestino y se une al receptor de GLP-1. Sus actividades incluyen la estimulación de la síntesis y la secreción de insulina, la inhibición de la secreción de glucagón y la inhibición de la ingesta de alimentos.

Tanto el glucagón como el GLP-1, actuando como agonistas en sus respectivos receptores, han demostrado ser eficaces para la pérdida de peso. Determinados análogos del GLP-1 se comercializan o están en desarrollo para el tratamiento de la obesidad, incluyendo, por ejemplo, Liraglutida (VICTOZA® de Novo Nordisk) y Exenatida (Byetta® de Eli Lilly/Amylin). Hjorth et al (Glucagon and glucagon-like peptide 1: selective receptor recognition via distinct peptide epitopes, Journal of Biological Chemistry, Vol. 269, Número 48, 1994, págs. 30121-30124) describen cómo las sustituciones de aminoácidos en los extremos N y C del glucagón y del GLP-1 afectan a la afinidad por los receptores del glucagón y del GLP-1. Sigue existiendo la necesidad de más agentes para el tratamiento eficaz de la obesidad, por ejemplo, péptidos agonistas de GLP-1/Glucagón con mejor solubilidad, formulabilidad, estabilidad y eficacia.

SUMARIO BREVE

La invención se define en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.

La presente divulgación proporciona un péptido aislado que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos: HX2QGTFTSDX10SX12X13LX15X16X17X18AX20X21FX23X

24WLX27X28GX30;

donde X2 es G o S, X10 es Y o K, X12 es K, E, R o S, X13 es K o Y, X15 es D o E, X16 es S o G, X17 es E, R, Q o K, X18 es R, S o A, X20 es R, K o Q, X21 es D o E, X23 es V o I, X24 es A o Q, X27 es E o V, X28 es A o K y X30 es G o R (SEQ ID NO: 4). En el presente documento también se desvela que X2 es S, X15 es D, X16 es S, X20 es R, X21 es D, X23 es V, X24 es A, X28 es A y X30 es G (SEQ ID NO: 5). En el presente documento también se desvela que si X17 es E, entonces X18 es R y si X17 es R, entonces X18 es S (s Eq ID NO: 6 y 7). En el presente documento también se desvela que X10 es Y, X12 es K, X13 es K y X27 es V (SEQ iD NO: 8 y 9). En el presente documento también se desvela que X 10 es K, X13 es Y y X27 es E (Se Q ID NO: 10 y 11). En el presente documento también se desvela que X12 es E (s Eq ID NO: 12 y 13), como alternativa, X12 es R (SEQ ID NO: 14 y 15). En el presente documento también se desvela que el péptido aislado comprende o consiste en la SEQ ID NO: 16. En el presente documento también se desvela que el péptido aislado comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 17 o la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19. En el presente documento también se desvela que el péptido aislado comprende o consiste en la SEQ ID NO: 18.

En el presente documento también se desvela que, de los péptidos descritos anteriormente, el grupo carboxilo de X30 está amidado. En el presente documento también se desvela que el grupo carboxilo es el ácido sin modificar.

Cualquiera de los péptidos proporcionados en el presente documento puede comprender además uno o más aminoácidos modificados, por ejemplo, la adición de un resto acilo, por ejemplo, la modificación puede ser la adición de un resto palmitoílo en el grupo N(épsilon) de un residuo lisina. En el presente documento también se desvela que el grupo palmitoílo se une al residuo lisina a través de un enlazador de gamma glutamato. Se han utilizado enlazadores alternativos incluyendo la beta alanina y el ácido aminohexanoico. Son posibles enlazadores alternativos adicionales, incluyendo enlazadores que contengan restos cortos de PEG, por ejemplo, que contengan 2 o 4 unidades de PEG.

En el presente documento también se desvela que los péptidos aislados proporcionados en el presente documento pueden unirse a un receptor de glucagón, a un receptor de GLP-1 o tanto a un receptor de glucagón como de GLP-1. En el presente documento también se desvela que el receptor de glucagón es un receptor de glucagón humano y o el receptor de GLP-1 es un receptor de GLP-1 humano. En el presente documento también se desvela que un péptido aislado como se proporciona en el presente documento se une a un receptor de glucagón humano con una CE50 en el ensayo de AMPc 1 (como se describe en el presente documento) de menos de 10.000 pM, menos de 5000 pM, menos de 2500 pM, menos de 1000 pM, menos de 900 pM, menos de 800 pM, menos de 700 pM, menos de 600 pM, menos de 500 pM, menos de 400 pM, menos de 300 pM, menos de 200 pM, menos de 100 pM, menos de 50 pM, menos de 25 pM, menos de 20 pM, menos de 15 pM, menos de 10 pM, menos de 5 pM, menos de 4 pM, menos de 3 pM o menos de 2 pM. En el presente documento también se desvela que un péptido aislado como se proporciona en el presente documento se une a un receptor de GLP-1 humano con una CE50 en el ensayo de AMPc 1 de menos de 10.000 pM, menos de 5000 pM, menos de 2500 pM, menos de 1000 pM, menos de 900 pM, menos de 800 pM, menos de 700 pM, menos de 600 pM, menos de 500 pM, menos de 400 pM, menos de 300 pM, menos de 200 pM, menos de 100 pM, menos de 50 pM, menos de 25 pM, menos de 20 pM, menos de 15 pM, menos de 10 pM, menos de 5 pM, menos de 4 pM, menos de 3 pM o menos de 2 pM.

En el presente documento también se desvela que un péptido aislado como se proporciona en el presente documento es un agonista de la actividad del GLP-1, un agonista de la actividad del glucagón o un agonista de la actividad tanto del GLP-1 como del glucagón. En el presente documento también se desvela que un péptido aislado como se proporciona en el presente documento se une tanto a un receptor de glucagón como a un receptor de GLP-1 y presenta una actividad al menos aproximadamente 2 veces mayor con respecto al ligando natural en el receptor de GLP-1 que en el receptor de glucagón. En el presente documento también se desvela que el péptido tiene una potencia relativa de 5 a 10 veces mayor en el GLP1R, en comparación con el GLP1, que en el receptor del glucagón, con respecto al glucagón.

En el presente documento también se desvela que un péptido aislado, como se proporciona en el presente documento, puede comprender además un resto heterólogo asociado al péptido. En el presente documento también se desvela que el resto heterólogo es una proteína, un péptido, un dominio proteico, un enlazador, un polímero orgánico, un polímero inorgánico, un polietilenglicol (PEG), biotina, una albúmina, una albúmina sérica humana (HSA), una porción de unión a FcRn de HSA, un anticuerpo, un dominio de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo de dominio, un dominio de unión a albúmina, una enzima, un ligando, un receptor, un péptido de unión, un armazón no FnIII, un marcador epitópico, un polímero polipéptido recombinante, una citocina o cualquier combinación de dos o más de dichos restos.

También se proporciona una composición farmacéutica que comprende un péptido aislado como se describe en el presente documento y un portador. Además se proporciona un kit que incluye una composición farmacéutica de este tipo.

También se proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección provocada o caracterizada por el exceso de peso corporal, donde el método incluye administrar a un sujeto que necesita tratamiento una cantidad eficaz de un péptido aislado como se proporciona en el presente documento o una composición que incluye un péptido de este tipo. En el presente documento también se desvela que la enfermedad o afección puede ser la obesidad, la resistencia a la insulina, la intolerancia a la glucosa, la prediabetes, el aumento de la glucosa en ayunas, la diabetes de tipo 2, la hipertensión, la dislipidemia (o una combinación de estos factores de riesgo metabólico), los glucagonomas, las enfermedades cardiovasculares, por ejemplo, la insuficiencia cardíaca congestiva, la ateroesclerosis, la arteriesclerosis, la cardiopatía coronaria o la arteriopatía periférica; el ictus, la disfunción respiratoria, la enfermedad renal y cualquier combinación de los mismos. De acuerdo con el método, un péptido aislado como se describe en el presente documento puede administrarse mediante inyección, por ejemplo, inyección subcutánea. De acuerdo con el método, el péptido puede administrarse una vez al día. En el presente documento también se desvela que el sujeto es un ser humano.

También se proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección provocada o caracterizada por el exceso de peso corporal, donde el método incluye administrar a un sujeto que necesita tratamiento una cantidad eficaz de un péptido aislado como se proporciona en el presente documento o una composición que incluye un péptido de este tipo. De acuerdo con el método, un péptido aislado como se describe en el presente documento puede administrarse mediante inyección, por ejemplo, inyección subcutánea. De acuerdo con el método, el péptido puede administrarse una vez al día. En el presente documento también se desvela que el sujeto es un ser humano.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS/FIGURAS

La FIGURA 1 muestra el porcentaje medio de cambio en el peso corporal desde el día cero en ratones DIO después de la administración del péptido G730 coagonista de glucagón/GLP-1 a tres dosis diferentes, en comparación con el tratamiento con vehículo y el tratamiento con Liraglutida. El peso corporal de partida en los diferentes grupos fue el vehículo: 47,4±3,7 g, G730 10 nmol/kg: 44,5±2,2 g, G73020 nmol/kg: 45,9±3,6 g y G730 50 nmol/kg: 46,1 ±2,4 g, respectivamente.

La FIGURA 2 muestra el porcentaje medio de cambio en el peso corporal desde el día cero en ratones DIO después de la administración del péptido G797 coagonista de glucagón/GLP-1 a tres dosis diferentes, en comparación con el tratamiento con vehículo y el tratamiento con Liraglutida. El peso corporal de partida en los diferentes grupos fue el vehículo: 47,4±3,7 g, G7975 nmol/kg: 47,5±1,2 g, G79720 nmol/kg: 47,4±2,2 g y G797 50 nmol/kg: 47,2±1,8 g, respectivamente.

La FIGURA 3 muestra el porcentaje medio de cambio en el peso corporal desde el día cero en ratones DIO después de la administración del péptido G812 coagonista de glucagón/GLP-1 a una dosis de 20 nmol/kg, en comparación con el tratamiento con vehículo y el tratamiento con Liraglutida. El peso corporal de partida en los diferentes grupos fue el vehículo: 47,4±3,7 g y G81220 nmol/kg: 49,2±3,4 g, respectivamente.

La FIGURA 4 es un gráfico que compara el cambio en los resultados de peso corporal para los tres péptidos coagonistas de glucagón/GLP-1 presentados en las FIG. 1,2 y 3.

La FIGURA 5 muestra el porcentaje medio de cambio en el peso corporal desde el día cero en ratones DIO después de la administración del péptido G796 coagonista de glucagón/GLP-1 a dos dosis diferentes, en comparación con el tratamiento con vehículo y el tratamiento con Liraglutida.

La FIGURA 6 muestra el porcentaje medio de cambio en el peso corporal desde el día cero en ratones DIO después de la administración del péptido G865 coagonista de glucagón/GLP-1 a dos dosis diferentes, en comparación con el tratamiento con vehículo y el tratamiento con Liraglutida.

La FIGURA 7 muestra el porcentaje medio de cambio en el peso corporal desde el día cero en ratones DIO después de la administración del péptido G933 coagonista de glucagón/GLP-1 a dos dosis diferentes, en comparación con el tratamiento con vehículo y el tratamiento con Liraglutida.

La FIGURA 8 es un gráfico que compara el cambio en los resultados de peso corporal para los tres péptidos coagonistas de glucagón/GLP-1 presentados en las FIG. 5, 6 y 7.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Definiciones

A lo largo de esta divulgación, el término "un" o "una" entidad se refiere a una o más de esa entidad; por ejemplo, se entiende que "un polinucleótido" representa uno o más polinucleótidos. Por ello, las expresiones "un" (o "una"), "uno o más" y "al menos uno" pueden usarse indistintamente en el presente documento.

Además, cuando en el presente documento se usa "y/o" debe interpretarse como la divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por tanto, el término "y/o" como se usa en una expresión como "A y/o B" en el presente documento pretende incluir "A y B", "A o B", "A" (solo) y "B "(solo). Igualmente, el término "y/o", como se usa en una expresión tal como "A, B y/o C" pretende abarcar cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

Se entiende que siempre que en el presente documento se describan aspectos con la expresión "que comprende", también se proporcionan aspectos análogos descritos en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto habitual en la materia a la que se refiere la presente divulgación. Por ejemplo, el Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2.a ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3.a ed., 1999, Academic Press; y el Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan a un experto un diccionario general de muchos de los términos utilizados en la presente divulgación.

Las unidades, prefijos y símbolos se indican en su forma aceptada en el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxilo. Los títulos proporcionados en el presente documento no son limitaciones de los diversos aspectos de la divulgación, que se pueden obtener haciendo referencia a la memoria descriptiva como un conjunto. Por consiguiente, los términos definidos a continuación se definen más completamente por referencia a la memoria descriptiva en su totalidad.

Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" pretende abarcar un "polipéptido" singular así como "polipéptidos" plurales y comprende cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos. Por tanto, como se usa en el presente documento, un "péptido", un "fragmento peptídico", una "proteína", una "cadena de aminoácidos", una "secuencia de aminoácidos" o cualquier otro término utilizado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, se incluyen genéricamente en la definición de "polipéptido", aunque cada uno de estos términos puede tener un significado más específico. El término "polipéptido" puede usarse en lugar de, o indistintamente con cualquiera de estos términos. El término incluye además polipéptidos que han sufrido modificaciones postraduccionales o de síntesis posterior, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivación por grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos que no se producen de forma natural.

Más específicamente, el término "péptido", como se usa en el presente documento, abarca un péptido de longitud completa y fragmentos, variantes o derivados del mismo, por ejemplo, un péptido agonista de GLP-1/glucagón (por ejemplo, de 29, 30 o 31 aminoácidos de longitud). Un "péptido", como se desvela en el presente documento, por ejemplo, un péptido agonista de GLP-1/glucagón, puede ser parte de un polipéptido de fusión que comprende componentes adicionales tales como, por ejemplo, un dominio de Fc o un dominio de albúmina, para aumentar la semivida. Como se describe en el presente documento, un péptido también puede derivatizarse de varias maneras diferentes.

Los términos "fragmento", "análogo", "derivado" o "variante" cuando se refieren a un péptido agonista de GLP-1/glucagón incluyen cualquier péptido que conserve al menos cierta actividad deseable, por ejemplo, la unión a receptores del glucagón y/o del GLP-1. Los fragmentos de péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento incluyen fragmentos proteolíticos, fragmentos de supresión que presentan propiedades deseables durante la expresión, purificación y/o administración a un sujeto.

El término "variante", como se usa en el presente documento, se refiere a un péptido que difiere del péptido citado debido a sustituciones, supresiones, inserciones y/o modificaciones de aminoácidos. Se pueden producir variantes usando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Las variantes también, o como alternativa, pueden contener otras modificaciones, por ejemplo, un péptido puede conjugarse o acoplarse, por ejemplo, fusionarse a una secuencia de aminoácidos heteróloga u otro resto, por ejemplo, para aumentar la semivida, la solubilidad o la estabilidad. Los ejemplos de restos que han de conjugarse o acoplarse a un péptido proporcionado en el presente documento incluyen, pero sin limitación, albúmina, una región Fc de inmunoglobulina, polietilenglicol (PEG) y similares. El péptido también se puede conjugar o producir acoplado a un enlazador u otra secuencia para facilitar síntesis, purificación o identificación del péptido (por ejemplo, 6-His), o para potenciar la unión del polipéptido a un soporte sólido.

La expresión "identidad de secuencia", como se usa en el presente documento, se refiere a una relación entre dos o más secuencias de polinucleótidos o entre dos o más secuencias de polipéptidos. Cuando una posición en una secuencia está ocupada por la misma base de ácido nucleico o aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia de comparación, se dice que las secuencias son "idénticas" en esa posición. El porcentaje de "identidad de secuencia" se calcula determinando el número de posiciones en donde se produce la base de ácido nucleico o aminoácido idéntico en ambas secuencias para producir el número de posiciones "idénticas". El número de posiciones "idénticas" se divide entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y se multiplica por 100 para obtener el porcentaje de "identidad de secuencia". El porcentaje de "identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias alineadas óptimamente sobre una ventana de comparación. Para alinear de manera óptima las secuencias para comparación, la parte de una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones denominadas huecos mientras la secuencia de referencia se mantiene constante. Una alineación óptima es aquella que, incluso con espacios, produce el mayor número posible de posiciones "idénticas" entre las secuencias de referencia y de comparación. El porcentaje de "identidad de secuencia" entre dos secuencias puede determinarse utilizando la versión del programa "Secuencias BLAST 2" que estaba disponible en el National Center for Biotechnology Information a partir del 1 de septiembre, 2004, programa que incorpora los programas BLASTN (para comparación de secuencias de nucleótidos) ) y BLASTP (para comparación de secuencias de polipéptidos), cuyos programas se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5873-5877, 1993). Cuando se utilizan "Secuencias BLAST 2", los parámetros que eran parámetros predeterminados a partir del 1 de septiembre, 2004, se pueden usar para el tamaño de palabra (3), penalización por hueco abierto (11), penalización por hueco de extensión (1), disminución de hueco (50), valor esperado (10) y cualquier otro parámetro requerido, incluyendo, entre otras, la opción de matriz.

Las expresiones "composición" o "composición farmacéutica" se refieren a composiciones que contienen un péptido agonista de GLP-1/glucagón proporcionado en el presente documento, junto con, por ejemplo, portadores, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables para la administración a un sujeto que necesita tratamiento, por ejemplo, un sujeto humano que recibe tratamiento para la obesidad.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a composiciones que son, dentro del alcance del buen criterio médico, adecuadas para el contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva u otras complicaciones proporcionales con una relación beneficio/riesgo razonable.

Una "cantidad eficaz" es aquella cantidad de un péptido agonista de GLP-1/glucagón proporcionado en el presente documento, cuya administración a un sujeto, ya sea en una dosis única o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento, por ejemplo, de la obesidad. Una cantidad es eficaz, por ejemplo, cuando su administración da como resultado una o más de la pérdida o el mantenimiento del peso (por ejemplo, la prevención del aumento de peso), la pérdida de grasa corporal, la prevención o la modulación de la hipoglucemia, la prevención o la modulación de la hiperglucemia, la promoción de la síntesis de insulina o la reducción de la ingesta de alimentos. Esta cantidad puede ser una dosis fija para todos los sujetos que se están tratando, o puede variar dependiendo del peso, la salud y la condición física del sujeto que ha de tratarse, el grado de pérdida de peso o el mantenimiento del peso deseado, la formulación del péptido, una evaluación profesional de la situación médica y otros factores relevantes.

El término "sujeto" se refiere a cualquier sujeto, en particular un sujeto mamífero, que necesite tratamiento con un péptido agonista de GLP-1/glucagón proporcionado en el presente documento. Los sujetos mamíferos incluyen, pero sin limitación, seres humanos, perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, osos, vacas, simios, monos, orangutanes y chimpancés, etc. En el presente documento también se desvela que el sujeto es un sujeto humano.

Como se usa en el presente documento, un "sujeto que lo necesita" se refiere a un individuo al que se desea tratar, por ejemplo, a un sujeto obeso o con tendencia a la obesidad al que se desea facilitar la pérdida de peso o de grasa corporal, el mantenimiento del peso o la grasa corporal, o evitar o minimizar el aumento de peso durante un período de tiempo determinado.

Como se usa en el presente documento, un "péptido agonista de GLP-1/glucagón" es un péptido quimérico que presenta una actividad en el receptor del glucagón de al menos aproximadamente el 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más con respecto al glucagón nativo y también presenta actividad en el receptor de GLP-1 de aproximadamente al menos aproximadamente el 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más con respecto al GLP-1 nativo, en las condiciones del ensayo 1.

Como se usa en el presente documento, la expresión "glucagón nativo" se refiere al glucagón natural, por ejemplo, el glucagón humano, que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1. La expresión "GLP-1 nativo" se refiere a GLP-1 de origen natural, por ejemplo, GLP-1 humano y es una expresión genérica que abarca, por ejemplo, amida de GLP-1(7-36) (SEQ ID NO: 2), ácido de GLP-1(7-37) (s Eq ID NO: 3) o una mezcla de estos dos compuestos. Como se usa en el presente documento, una referencia general a "glucagón" o "GLP-1" en ausencia de cualquier otra designación pretende significar glucagón humano nativo o GLP-1 humano nativo, respectivamente. A menos que se indique lo contrario, "glucagón" se refiere a glucagón humano y "GLP-1" se refiere a ^gLP-1 humano.

Péptidos agonistas de GLP-1/glucagón

En el presente documento se proporcionan péptidos que se unen tanto a un receptor de glucagón como a un receptor de GLP-1. En el presente documento también se desvela que los péptidos son coagonistas de la actividad del glucagón y del GLP-1. Dichos péptidos se denominan en el presente documento péptidos agonistas de GLP-1/glucagón. Los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón como se proporcionan en el presente documento poseen actividades de GLP-1 y glucagón con relaciones favorables para promover la pérdida de peso, prevenir el aumento de peso o mantener un peso corporal deseable y poseen una solubilidad, una formulabilidad y una estabilidad optimizadas. En el presente documento también se desvela que los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón como se proporcionan en el presente documento son activos en los receptores de GLP1 humano y glucagón humano. En el presente documento también se desvela que la actividad relativa en comparación con el ligando natural en el receptor de GLP-1 es al menos aproximadamente 1 vez, 2 veces, 5 veces, 8 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces o 25 veces mayor que en el receptor de glucagón.

En el presente documento también se desvela que los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón como se desvelan en el presente documento tienen potencias deseables en los receptores de glucagón y GLP-1, y tienen potencias relativas deseables para promover la pérdida de peso. En el presente documento también se desvela que los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón como se desvelan presentan potencias in vitro en el receptor de GLP-1 como se muestra por una CE50 en el ensayo de AMPc 1 (véase el Ejemplo 2) de menos de 10.000 pM, menos de 5000 pM, menos de 2500 pM, menos de 1000 pM, menos de 900 pM, menos de 800 pM, menos de 700 pM, menos de 600 pM, menos de 500 pM, menos de 400 pM, menos de 300 pM, menos de 200 pM, menos de 100 pM, menos de 50 pM, menos de 25 pM, menos de 20 pM, menos de 15 pM, menos de 10 pM, menos de 5 pM, menos de 4 pM, menos de 3 pM o menos de 2 pM. En el presente documento también se desvela que los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón como se desvelan presentan potencias in vitro en el receptor de GLP-1 como se muestra por la CE50 en el ensayo de AMPc en albúmina sérica humana al 4,4 % (ensayo 2, véase el Ejemplo 2) de menos de 10.000 pM, menos de 5000 pM, menos de 2500 pM, menos de 1000 pM, menos de 900 pM, menos de 800 pM, menos de 700 pM, menos de 600 pM, menos de 500 pM, menos de 400 pM, menos de 300 pM, menos de 200 pM, menos de 100 pM, menos de 50 pM, menos de 25 pM, menos de 20 pM, menos de 15 pM, menos de 10 pM, menos de 5 pM, menos de 4 pM, menos de 3 pM o menos de 2 pM. En el presente documento también se desvela que los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón como se desvelan presentan potencias in vitro en el receptor de glucagón como se muestra por una CE50 en el ensayo de AMPc 1 (véase el Ejemplo 2) de menos de 10.000 pM, menos de 5000 pM, menos de 2500 pM, menos de 1000 pM, menos de 900 pM, menos de 800 pM, menos de 700 pM, menos de 600 pM, menos de 500 pM, menos de 400 pM, menos de 300 pM, menos de 200 pM, menos de 100 pM, menos de 50 pM, menos de 25 pM, menos de 20 pM, menos de 15 pM, menos de 10 pM, menos de 5 pM, menos de 4 pM, menos de 3 pM o menos de 2 pM. En el presente documento también se desvela que los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón como se desvelan presentan potencias in vitro en el receptor de glucagón como se muestra por una CE50 en el ensayo de AMPc en albúmina sérica humana al 4,4 % (ensayo 2, véase el Ejemplo 2) de menos de 10.000 pM, menos de 5000 pM, menos de 2500 pM, menos de 1000 pM, menos de 900 pM, menos de 800 pM, menos de 700 pM, menos de 600 pM, menos de 500 pM, menos de 400 pM, menos de 300 pM, menos de 200 pM, menos de 100 pM, menos de 50 pM, menos de 25 pM, menos de 20 pM, menos de 15 pM, menos de 10 pM, menos de 5 pM, menos de 4 pM, menos de 3 pM o menos de 2 pM. En el presente documento también se desvela que los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón como se desvelan tienen relaciones de potencia de GLP1-R/glucR relativas, en comparación con los ligandos nativos, en el intervalo de aproximadamente 0,01 a 0,50, por ejemplo, de aproximadamente 0,02 a 0,30, por ejemplo, aproximadamente 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,11. 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,20, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24, 0,25, 0,26, 0,27, 0,28 o 0,30 cuando se usa el ensayo 2.

En el presente documento también se desvela que los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón como se desvelan presentan potencias in vitro en el péptido insulinotrópico dependiente de glucosa (péptido inhibidor gástrico) (GIPR) como se muestra por una CE50 en el ensayo de AMPc 1 (véase el Ejemplo 2) de menos de 10.000 pM, menos de 5000 pM, menos de 2500 pM, menos de 1000 pM, menos de 900 pM, menos de 800 pM, menos de 700 pM, menos de 600 pM, menos de 500 pM, menos de 400 pM, menos de 300 pM, menos de 200 pM, menos de 100 pM, menos de 50 pM, menos de 25 pM, menos de 20 pM, menos de 15 pM, menos de 10 pM, menos de 5 pM, menos de 4 pM, menos de 3 pM o menos de 2 pM. En el presente documento también se desvela que los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón como se desvelan presentan potencias in vitro en el GIPR como se muestra por la CE50 en el ensayo de AMPc en albúmina sérica humana al 4,4 % (ensayo 2, véase el Ejemplo 2) de menos de 10.000 pM, menos de 5000 pM, menos de 2500 pM, menos de 1000 pM, menos de 900 pM, menos de 800 pM, menos de 700 pM, menos de 600 pM, menos de 500 pM, menos de 400 pM, menos de 300 pM, menos de 200 pM, menos de 100 pM, menos de 50 pM, menos de 25 pM, menos de 20 pM, menos de 15 pM, menos de 10 pM, menos de 5 pM, menos de 4 pM, menos de 3 pM o menos de 2 pM.

En el presente documento también se desvela que los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento poseen uno o más criterios de solubilidad aceptable, facilidad de formulación, estabilidad en plasma y propiedades farmacocinéticas mejoradas. En el presente documento también se desvela que los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón como se desvelan son solubles en tampones convencionales en un amplio intervalo de pH.

En el presente documento también se desvela que los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón son solubles en soluciones tampón comunes a una concentración de hasta 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, o más, en sistemas tampón y un intervalo de fuerzas iónicas, por ejemplo, de 0,25 a 150 mM, incluyendo, pero sin limitación, tampón de fosfato, tampón de T ris, tampón de glutamato, tampón de acetato, tampón de succinato o tampón de histidina. Los tampones de ejemplo incluyen el tampón de glutamato pH 4,5100 mM, el tampón de acetato pH 5100 mM, el tampón de succinato pH 5100 mM, el tampón de fosfato pH 6100 mM, el tampón de fosfato pH 6,5100 mM, el tampón de fosfato pH 7,0100 mM, el tampón de histidina pH 7,0 100 mM, el tampón de fosfato pH 7,5 100 mM y el tampón de Tris pH 8,0 100 mM. En el presente documento también se desvela que los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón como se desvelan son solubles en tampones convencionales a 0,8 mg/ml en un intervalo de pH, por ejemplo, de pH 4,0 a pH 8,0, por ejemplo, a pH 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0 u 8,5. En el presente documento también se desvela que los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón como se desvelan son solubles en tampones convencionales de pH 4,5 a 8,0, 5,0 a 8,0, 5,5 a 8,0, 6,0 a 8,0, 6,5 a 8,0, 7,0 a 8,0, 4,5 a 8,5, 5,5 a 8,5, 5,5 a 8,5, 6,0 a 8,5, 6,5 a 8,5 o 7,0 a 8,5.

En el presente documento también se desvela que los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón como se desvelan pueden formularse en formulaciones farmacéuticas convencionales. Las formulaciones de ejemplo incluyen, pero sin limitación: Tris 0,1 M pH 7,5, Manitol 150 mM, formulación final pH= 7,2; Tris 0,05 M, Arginina 50 mM/Prolina, formulación final pH= 8,0; o tampón fosfato de sodio (pH8)/ propilenglicol al 1,85 % P/V, formulación final pH= 7,0. En el presente documento también se desvela que los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón como se desvelan son solubles en estas u otras formulaciones a una concentración de hasta 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml o más.

En el presente documento también se desvela que los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón como se desvelan son aceptablemente estables frente a las proteasas en suero o plasma. Los productos de degradación comunes del glucagón o del GLP-1 incluyen los productos 1 (ácido) y los productos de escisión de DPP IV. Los productos con masa 1 pueden surgir de la desamidación en los grupos amida de la glutamina o en el extremo C. Los productos de escisión surgen de la acción de la proteasa DPP IV en plasma. En el presente documento también se desvela que los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón como se desvelan permanecen estables en el plasma a niveles de hasta el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % después de 24 horas en plasma a 37 °C.

En el presente documento se proporciona un péptido agonista de GLP-1/glucagón que comprende la secuencia de aminoácidos:

HX2QGTFTSDX10SX12X13LX15X16X17X18AX20X21FX23X24WLX27X28GX30;

en donde X2 es G o S, X10 es Y o K, X12 es K, E, R o S, X13 es K o Y, X15 es D o E, X16 es S o G, X17 es E, R, Q o K, X18 es R, S o A, X20 es R, K o Q, X21 es D o E, X23 es V o I, X24 es A o Q, X27 es E o V, X28 es A o K y X30 es G o R. (SEQ ID NO: 4). En el presente documento también se desvela que se proporciona el péptido aislado mostrado anteriormente, donde X2 es S, X10 es Y o K, X12 es K, E, R o S, X13 es K o Y, X15 es D, X16 es S, X17 es E, R, Q o K, X18 es R, S o A, X20 es R, X21 es D, X23 es V, X24 es A, X27 es E o V, X28 es A y X30 es G (SEQ ID NO: 5). En el presente documento también se desvela que se proporciona el péptido aislado mostrado anteriormente, donde X2 es S, X10 es Y o K, X12 es K, E, R o S, X13 es K o Y, X15 es D, X16 es S, si X17 es E y X18 es R, o si X17 es R y X18 es S, X20 es R, X21 es D, X23 es V, X24 es A, X27 es E o V, X28 es A y X30 es G (SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO. 7, respectivamente). En el presente documento también se desvela que se proporciona el péptido aislado mostrado anteriormente, donde X2 es S, X10 es Y, X12 es K, X13 es K, X15 es D, X16 es S, si X17 es E y X18 es R, o si X17 es R y X18 es S, X20 es R, X21 es D, X23 es V, X24 es A, X27 es V, X28 es A y X30 es G (SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9, respectivamente). En el presente documento también se desvela que se proporciona el péptido aislado mostrado anteriormente, donde X2 es S, X10 es K, X12 es K, E, R, o S, X13 es Y, X15 es D, X16 es S, si X17 es E y X18 es R, y si X17 es R y X18 es S, X20 es R, X21 es D, X23 es V, X24 es A, X27 es E, X28 es A y X30 es G (SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11, respectivamente). En el presente documento también se desvela que se proporciona el péptido aislado mostrado anteriormente, donde X2 es S, X10 es K, X12 es E, X13 es Y, X15 es D, X16 es S, si X17 es E y X18 es R, o si X17 es R y X18 es S, X20 es R, X21 es D, X23 es V, X24 es A, X27 es E, X28 es A y X30 es G (SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13, respectivamente). En el presente documento también se desvela que se proporciona el péptido aislado mostrado anteriormente, donde X2 es S, X10 es K, X12 es R, X13 es Y, X15 es D, X16 es S, si X17 es E y X18 es R, o si X17 es R y X18 es S, X20 es R, X21 es D, X23 es V, X24 es A, X27 es E, X28 es A y X30 es G (SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15, respectivamente).

Los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento incluyen, pero sin limitación, G730 (SEQ ID NO: 16), G797 (SEQ ID NO: 17), G849 (SEQ ID NO: 18), G933 (SEQ ID NO: 19), G865 (SEQ ID NO: 20), G796 (SEQ ID NO: 21), G812 (SEQ ID NO: 22) y G380 (SEQ ID NO: 23). Estos péptidos agonistas de GLP-1/glucagón se enumeran en la Tabla 1:

Tabla 1: Secuencias de péptidos de GLP-1/Glucagón

Los péptidos G797 y G933 tienen ambos un residuo glutamato en la posición 12 y mantienen una actividad robusta en los receptores tanto de glucagón como de GLP-1, como se muestra en el Ejemplo 2. El residuo correspondiente es lisina en la exendina-4 y el glucagón y es serina en el GLP-1. Aunque se cree que este residuo no entra en contacto con el receptor, los cambios de carga de positiva a negativa pueden modificar el entorno adyacente. Además, G797, G849 y G933 tienen un residuo glutamato en la posición 27. El residuo 27 es Lisina en la exendina 4 y es un residuo hidrófobo sin carga en el GLP1 (valina) y en el glucagón (metionina). La lisina de la exenatida hace interacciones electrostáticas con el receptor de GLP1 en los residuos Glu127 y Glu24 (C. R. Underwood et al J Biol Chem 285723-730 (2010); S. Runge et al J Biol Chem 283 11340-11347 (2008)). Aunque cabría esperar una pérdida de potencia del GLP1R cuando la carga en la posición 27 cambia a negativa, el cambio es compatible con la actividad del g LP1 R en G797, G849 y G933.

Métodos de fabricación. La presente divulgación proporciona un método de fabricación de un péptido agonista de GLP-1/glucagón. Los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento pueden fabricarse mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento pueden sintetizarse químicamente mediante métodos bien conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, por síntesis en fase sólida como la descrita por Merrifield (1963, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154). La síntesis de péptidos en fase sólida puede realizarse, por ejemplo, mediante el uso de sintetizadores automatizados, usando reactivos convencionales, por ejemplo, como se explica en el Ejemplo 1.

Como alternativa, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento pueden producirse de forma recombinante usando una combinación conveniente de vector/célula hospedadora como sería bien conocido por el experto habitual en la materia. Existe una diversidad de métodos para producir de forma recombinante péptidos agonistas de GLP-1/glucagón. Generalmente, una secuencia polinucleotídica que codifica el péptido agonista de GLP-1/glucagón se inserta en un vehículo de expresión apropiado, por ejemplo, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. El ácido nucleico que codifica el péptido agonista de GLP-1/glucagón se inserta en el vector en el marco de lectura adecuado. El vector de expresión se transfecta entonces en una célula hospedadora adecuada que expresará el péptido agonista de GLP-1/glucagón. Las células hospedadoras adecuadas incluyen, sin limitación, células de bacterias, levaduras o mamíferos. Para expresar los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón descritos en el presente documento puede utilizarse una diversidad de sistemas de vectores de expresión de huéspedes disponibles en el mercado.

Modificaciones, conjugados, fusiones y derivaciones. En el presente documento también se desvela que los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento se estabilizan a través de modificaciones de aminoácidos. En el presente documento también se desvela que el grupo carboxilo del aminoácido C-terminal está amidado. En el presente documento también se desvela que el aminoácido C-terminal es glicina amidada, por ejemplo, G730, G797, g 849, G865, G796, G812 y G380. En el presente documento también se desvela que, por ejemplo, G933, la glicina C-terminal es el ácido sin modificar. En el presente documento también se desvela que se proporcionan péptidos agonistas de GLP-1/glucagón en los que uno o más residuos de aminoácidos están acilados. Por ejemplo, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento pueden contener uno o más residuos lisina, en los que un resto palmitoílo se une al grupo N (épsilon). En el presente documento también se desvela que se incorpora un enlazador entre la lisina y el grupo palmitoílo. Este enlazador puede ser un grupo ácido gamma glutámico, o un enlazador alternativo tal como, pero sin limitación, beta alanina y ácido aminohexanoico. Pueden usarse diferentes métodos de acilación, tales como la adición de grupos colesterol o miristoílo. En el presente documento también se desvela que el resto palmitoílo se añade en la posición 13 (por ejemplo, G730). En el presente documento también se desvela que el resto palmitoílo se añade en la posición 10 (por ejemplo, G797, G849, G933, G865, G796 y G812). En el presente documento también se desvela que el resto palmitoílo se añade en la posición 17 (por ejemplo, G380).

Los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento, por ejemplo, G730, G797, G849 y G933, pueden palmitoilarse para prolongar su semivida por asociación con la albúmina sérica, reduciendo de este modo su propensión al aclaramiento renal, como se describe en el Ejemplo 1.

Como alternativa o además, un péptido agonista de GLP-1/glucagón, como se desvela en el presente documento, puede asociarse a un resto heterólogo, por ejemplo, para prolongar la semivida. El resto heterólogo puede ser una proteína, un péptido, un dominio proteico, un enlazador, un polímero orgánico, un polímero inorgánico, un polietilenglicol (PEG), biotina, una albúmina, una albúmina sérica humana (HSA), una porción de unión a FcRn de HSA, un anticuerpo, un dominio de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo de dominio, un dominio de unión a albúmina, una enzima, un ligando, un receptor, un péptido de unión, un armazón no FnIII, un marcador epitópico, un polímero polipéptido recombinante, una citocina y una combinación de dos o más de dichos restos.

Por ejemplo, los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón pueden fusionarse con un polipéptido heterólogo. Los péptidos pueden fusionarse con proteínas, ya sea a través de la fusión y la expresión de genes recombinantes o mediante conjugación química. Las proteínas que son adecuadas como compañeros para la fusión incluyen, sin limitación, la albúmina sérica humana, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que incluyen la fusión a la porción Fc de los anticuerpos. El GLP-1 se ha fusionado a estas proteínas conservando su potencia (L. Baggio et al, Diabetes 532492-2500 (2004); P. Barrington et al Diabetes, Obesity and Metabolism 13426-433 (2011); P. Paulik et al American Diabetes Association 2012, Póster 1946). También se han descrito secuencias de péptidos recombinantes extendidas para proporcionar al péptido una masa molecular elevada (V.Schellenberger et al Nature Biotechnol 27 1186-1190 (2009); PASylation (documento EP2173890)). En el presente documento también se desvela que los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón se incorporan como la parte N-terminal de una proteína de fusión, con el compañero de fusión, por ejemplo, la albúmina o la porción Fc, en el extremo C-terminal. Los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón como se describen en el presente documento también pueden fusionarse a péptidos o dominios proteicos, tales como los "Albudabs" que tienen afinidad por la albúmina sérica humana (M.S. Dennis et al J Biol Chem 27735035-35043 (2002); A. Walker et al Protein Eng Design Selection 23 271-278 (2010)). Los métodos para fusionar péptidos agonistas de GLP-1/glucagón, como se desvelan en el presente documento, con un polipéptido heterólogo, por ejemplo, albúmina o una región Fc, son bien conocidos por los expertos habituales en la materia.

Otros restos heterólogos pueden conjugarse a péptidos agonistas de GLP-1/glucagón para estabilizar o aumentar adicionalmente su semivida. Para la fusión química, determinados péptidos se caracterizan por mantener un extremo N libre, pero pueden hacerse puntos alternativos para la derivatización. Un método alternativo adicional es derivatizar el péptido con un resto químico grande, tal como polietilenglicol (PEG) de alto peso molecular. Un "péptido agonista de GLP-1/glucagón pegilado" tiene una cadena de PEG unida covalentemente al mismo. La derivatización de péptidos agonistas de GLP-1/glucagón, por ejemplo, la pegilación, puede realizarse en la lisina que está palmitoilada, o como alternativa en un residuo tal como la cisteína, que se sustituye o incorpora por extensión para permitir la derivatización. Los formatos de péptidos agonistas de GLP-1/glucagón mencionados anteriormente pueden caracterizarse in vitro y/o in vivo para determinar la potencia relativa y el equilibrio entre la activación de los receptores de GLP-1 y de glucagón.

La expresión general "cadena de polietilenglicol" o "cadena de PEG", se refiere a mezclas de polímeros de condensación de óxido de etileno y agua, en una cadena ramificada o lineal, representadas por la fórmula general H(OCH2CH2)nOH, donde n es un número entero de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más. Las cadenas de PEG incluyen polímeros de etilenglicol con un peso molecular total promedio seleccionado del intervalo de aproximadamente 500 a aproximadamente 40.000 Dalton. El peso molecular promedio de una cadena de PEG se indica con un número, por ejemplo, PEG-5.000 se refiere a la cadena de polietilenglicol que tiene un peso molecular promedio total de aproximadamente 5.000.

La PEGilación puede realizarse mediante cualquiera de las reacciones de PEGilación conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Focus on Growth Factors, 3: 4-10, 1992 y las solicitudes de patente europeas EP 0154316 y EP 0401 384. La PEGilación puede realizarse usando una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de polietilenglicol reactiva (o un polímero hidrosoluble reactivo análogo).

Los métodos para preparar un péptido agonista de GLP-1/glucagón PEGilado generalmente incluyen las etapas de (a) hacer reaccionar un péptido agonista de GLP-1/glucagón o con polietilenglicol (tal como un derivado reactivo de éster o aldehído de PEG) en condiciones en las que la molécula se une a uno o más grupos PEG y (b) obtener el producto o productos de reacción.

Composiciones farmacéuticas

Se proporcionan además composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, que contienen una cantidad eficaz de un péptido agonista de GLP-1/glucagón como se proporciona en el presente documento, formuladas para el tratamiento de enfermedades metabólicas, por ejemplo, la obesidad.

Las composiciones de la divulgación pueden formularse de acuerdo con métodos conocidos. Se describen métodos de preparación adecuados, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a edición, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995). La composición puede estar en una diversidad de formas que incluyen, pero sin limitación, una solución acuosa, una emulsión, un gel, una suspensión, una forma liofilizada o cualquier otra forma conocida en la técnica. Además, la composición puede contener aditivos farmacéuticamente aceptables que incluyen, por ejemplo, diluyentes, aglutinantes, estabilizadores y conservantes. Una vez formuladas, las composiciones de la divulgación pueden administrarse directamente al sujeto.

Se conocen bien en la técnica portadores que pueden usarse con composiciones de la divulgación e incluyen, sin limitación, por ejemplo, tiroglobulina, albúminas tales como la albúmina sérica humana, toxoide tetánico y poliaminoácidos tales como poli L-lisina, poli ácido L-glutámico, gripe, proteína del núcleo del virus de la hepatitis B y similares. Puede usarse una diversidad de portadores acuosos, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina al 0,8 %, glicina al 0,3 %, ácido hialurónico y similares. Las composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales y bien conocidas, o pueden esterilizarse por filtración. Una composición resultante puede envasarse para su uso tal cual, o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con una solución estéril antes de administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste y tamponamiento del pH, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, etc.

Método de tratamiento de la obesidad, sistemas modelo.

Los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón pueden combinar el efecto del glucagón, por ejemplo, la inhibición de la ingesta de alimentos o la regulación de los niveles de glucosa, con el efecto del GLP-1, por ejemplo, la inhibición de la motilidad gástrica o la promoción de la liberación de insulina. Por tanto, pueden actuar para acelerar la eliminación del tejido adiposo excesivo, inducir una pérdida de peso sostenible y mejorar el control glucémico. Los péptidos agonistas de GLP1/glucagón también pueden actuar para reducir los factores de riesgo cardiovascular, tales como el colesterol alto y el colesterol LDL alto o las relaciones HDL/LDL anormales.

La presente divulgación proporciona un método de tratamiento de la obesidad o de una enfermedad o un trastorno relacionados con la obesidad, que comprende administrar a un sujeto que necesita tratamiento, un péptido agonista de GLP-1/glucagón, como se desvela en el presente documento. Se proporciona además un péptido agonista de GLP-1/glucagón para el tratamiento de la obesidad o de una enfermedad o un trastorno relacionados con la obesidad. Se proporciona además el uso de un péptido agonista de GLP-1/glucagón como se proporciona en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la obesidad o una enfermedad o un trastorno relacionados con la obesidad.

Pueden administrarse péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento para prevenir el aumento de peso, promover la pérdida de peso, reducir el exceso de peso corporal o tratar la obesidad (por ejemplo, mediante el control del apetito, la alimentación, la ingesta de alimentos, la ingesta de calorías y/o el gasto energético), incluyendo la obesidad mórbida. Además, pueden usarse péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento para el tratamiento de otros trastornos metabólicos relacionados con la obesidad. Los ejemplos de otros trastornos relacionados con la obesidad incluyen, sin limitación: la resistencia a la insulina, la intolerancia a la glucosa, la prediabetes, el aumento de la glucosa en ayunas, la diabetes de tipo 2, la hipertensión, la dislipidemia (o una combinación de estos factores de riesgo metabólico), los glucagonomas, las enfermedades cardiovasculares, tales como la insuficiencia cardíaca congestiva, la ateroesclerosis, la arterioesclerosis, la cardiopatía coronaria o la arteriopatía periférica, el ictus, la disfunción respiratoria o la enfermedad renal.

"Tratamiento" es un enfoque para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Como se proporciona en el presente documento, los resultados clínicos beneficiosos o deseados de los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón desvelados incluyen, sin limitación, la reducción del peso corporal, la disminución del aumento de peso, la reducción del apetito, la reducción o la estabilización de los niveles de glucosa e insulina en suero, la mejoría, la paliación, la estabilización, la disminución de la extensión de las enfermedades relacionadas con la obesidad, o el retardo o la ralentización de la progresión de la enfermedad relacionada con la obesidad. "Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Las personas que necesitan tratamiento incluyen tanto las que ya padecen el trastorno como aquellas en las que se ha de prevenir el trastorno. Por tratamiento se entiende la inhibición o la reducción de un aumento de los síntomas relacionados con la obesidad (por ejemplo, el aumento de peso) en comparación con la ausencia de tratamiento y no implica necesariamente el cese completo de la afección pertinente.

La vía de administración de los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento puede ser, por ejemplo, oral, parenteral, por inhalación o tópica. El término parenteral, como se usa en el presente documento, incluye, por ejemplo, la administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal. Otro ejemplo de una forma de administración es una solución inyectable, en particular para inyección o goteo intravenoso o intraarterial. Los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento pueden administrarse en una dosis única o en dosis múltiples. En el presente documento también se desvela que un péptido agonista de GLP-1/glucagón se administra por inyección subcutánea.

Las formulaciones parenterales pueden ser una dosis única en embolada, una infusión o una dosis en embolada de carga seguida de una dosis de mantenimiento. Estas composiciones pueden administrarse a intervalos específicos, fijos o variables, por ejemplo, una vez al día o "según necesidad". Las pautas de dosificación también pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica).

Un experto en la materia puede determinar fácilmente la cantidad de un péptido agonista de GLP-1/glucagón que ha de administrarse sin necesidad de experimentación indebida, dada la divulgación del presente documento. Los factores que influyen en el modo de administración y en la cantidad respectiva de un péptido agonista de GLP-1/glucagón incluyen, pero sin limitación, la gravedad de la enfermedad (por ejemplo, el grado de obesidad), los antecedentes del sujeto y la edad, la altura, el peso, la salud y el estado físico del sujeto sometido a la terapia. Del mismo modo, la cantidad de un péptido agonista de GLP-1/glucagón que ha de administrarse dependerá del modo de administración y de si el sujeto se someterá a una dosis única o a múltiples dosis de este agente. En el presente documento también se desvela que los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón proporcionados en el presente documento pueden administrarse una vez al día a través de inyección.

KITS

La presente divulgación proporciona adicionalmente kits que comprenden péptidos agonistas de GLP-1/glucagón, que pueden usarse para realizar los métodos descritos en el presente documento. En el presente documento también se desvela que un kit comprende un péptido agonista de GLP-1/glucagón desvelado en el presente documento en uno o más recipientes. Un experto en la materia reconocerá fácilmente que los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón desvelados pueden incorporarse fácilmente a uno de los formatos de kit establecidos que son bien conocidos en la técnica.

Ejemplos

Ejemplo 1: Síntesis, modificaciones y caracterización de péptidos agonistas de GLP-1/glucagón

Lista de abreviaturas:

Boc:

terc-butiloxicarbonilo

terc-Bu;

terc-butilo

DCM:

diclorometano

DIC:

diisopropilcarbodiimida

Fmoc:

9-fluorenilmetoxicarbonilo

HOBt:

1-hidroxibenzotriazol

HPLC:

Cromatografía de líquidos de alto rendimiento

Mtt:

4-metiltritilo

NMP:

N-metilpirrolidona

Pbf:

2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofurano-5-sulfonilo

TFA:

ácido trifluoroacético

TIS:

triisopropilsilano

Trt:

trifenilmetilo, tritilo

Se sintetizaron péptidos agonistas de GLP-1/glucagón de la siguiente manera. La elongación de las cadenas peptídicas en NovaSyn TGR o en resina Fmoc-Wang precargada (NovaBiochem) se realizó con un sintetizador de péptidos en fase sólida PRELUDE™ (Protein Technologies, Tucson, AZ, EE.UU.). Se aplicaron los protocolos suministrados por el fabricante para el acoplamiento de los ésteres hidroxibenzotriazólicos de aminoácidos en N-metilpirolidona (NMP). El grupo fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) se usó para la protección semipermanente de los grupos alfa-amino de los aminoácidos, mientras que las cadenas laterales se protegieron con terc-butilo (terc-Bu) para la serina, la treonina, el ácido aspártico, el ácido glutámico y la tirosina y con 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofurano-5-sulfonilo (Pbf) para la arginina y con tritilo (Trt) para la histidina. El grupo amino N-terminal de la histidina en posición 1 se protegió con el grupo terc-butiloxicarbonilo (Boc). La Lys(Mtt) se incorporó a la cadena peptídica cuando se requería una modificación química posterior de la cadena lateral.

Una vez completada la elongación de la cadena peptídica, se retiró el grupo Mtt lavando la resina peptídica con DCM que contenía TFA al 2 % y TIS al 5 % (10 * 7 ml, cada 0,5 min). El acoplamiento de un resto lipídico a la cadena lateral de Lys se realizó en el sintetizador de péptidos PRELUDE™ usando DIC como reactivo de acoplamiento en presencia de HOBt.

Los péptidos se escindieron de la resina usando una mezcla de TFA:TIS:agua (95:2,5:2,5). Después de 2 h a temperatura ambiente, la resina peptidílica se filtró, se lavó con TFA y los filtrados combinados se evaporaron a sequedad al vacío. El residuo se trituró con éter y el precipitado formado se filtró, se lavó con éter y se secó. Los péptidos en bruto se disolvieron en ácido acético al 5 % en agua y se analizaron mediante cromatografía de líquidos de alta presión en fase inversa en una columna Polaris 3 C8-A acoplada al sistema Varian 920-LC. Para el análisis se usó un sistema de gradiente convencional del 10 al 90 % de tampón B en el transcurso de 15 min. El tampón A era TFA al 0,1 % en agua y el tampón B era TFA al 0,1 % en acetonitrilo. Los perfiles de HPLC se registraron a 210 nm. Se realizaron separaciones preparativas en el sistema Varian ProStar con una columna semipreparativa C18 RP XBridge Waters. Para la separación se usó el sistema de disolventes descrito anteriormente de agua y acetonitrilo, en un gradiente del 30 al 70 % de tampón B en el transcurso de 30 min. Los productos cromatográficamente homogéneos (pureza > 97 %) se analizaron mediante espectrometría de masas por electronebulización (MassLynx, Waters).

Ejemplo 2: Estudios in vitro

Producción de AMPc mediada por receptores de glucagón y de GLP-1

Actividad biológica de los péptidos en el ensayo de actividad del AMPc basado en células (ensayo 1):

La actividad biológica de los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón sintetizados mediante el método del Ejemplo 1 se sometió a ensayo para determinar la actividad biológica, por ejemplo, la estimulación de una o más respuestas de receptores celulares, mediante los siguientes métodos. Se generaron estirpes celulares estables que expresaban el receptor de GLP-1 (GLP-1R), el receptor de glucagón (GCGR) o el receptor del péptido insulinotrópico dependiente de glucosa (polipéptido inhibidor gástrico) (GIPR) humanos, de ratón, de rata o de perro en células HEK293s o CHO mediante métodos convencionales. La activación peptídica de estos diversos receptores da como resultado la producción corriente abajo del segundo mensajero AMPc, que puede medirse en un ensayo de actividad funcional.

Los ensayos de AMPc se realizaron usando "medio de ensayo":

Medio de ensayo: FBS al 10 % en DMEM (Gibco n.° 41966), que contenía

IBMX 0,5 mM (Sigma n.° 17018).

Se usaron placas de 384 pocillos de baja unión a proteínas (Greiner n.° 781280) para realizar once diluciones en serie de 1 en 5 de las muestras de ensayo que se hicieron en medio de ensayo. Todas las diluciones de muestras se hicieron por duplicado.

Un crio-vial congelado de células que expresaban el receptor de interés se descongeló rápidamente en un baño de agua, se transfirió al medio de ensayo precalentado y se centrifugó a 240xg durante 5 minutos. Las células se volvieron a suspender en medios de ensayo a una concentración optimizada (por ejemplo, células hGCGR a 1*105 células /ml, células hGLP-1R y hGIPR a 0,5*105 células /ml).

A partir de la placa de dilución, se estampó una réplica de 5 |jl en una placa de color negro de fondo en U de 384 pocillos (Corning n.° 3676). A esto se añadieron 5 j l de suspensión celular y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Se midieron los niveles de AMPc usando un kit de AMPc dinámico 2 HTRF disponible en el mercado (Cisbio, n.° de Cat 62AM4PEJ), siguiendo el protocolo de dos etapas según las recomendaciones del fabricante. En resumen, se prepararon criptato anti-AMPc (fluoróforo donante) y AMPc-d2 (fluoróforo aceptor) por separado diluyendo cada uno 1/20 en tampón de conjugado y lisis proporcionado en el kit. Se añadieron 5 j l de criptato anti-AMPc a todos los pocillos de la placa de ensayo y 5 j l de AMPc-d2 a todos los pocillos excepto a los de unión no específica (NSB, por sus siglas en inglés), a los que se les añadió tampón de conjugado y lisis. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante una hora y después se leyeron en un Envision (Perkin Elmer) usando una longitud de onda de excitación de 320 nm y longitudes de onda de emisión de 620 nm y 665 nm.

Las secuencias de los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón sintetizados y sus valores de CE50 determinados en ensayos de AMPc, realizados en "medio de ensayo", se muestran en la Tabla 2. Todos los péptidos de la Tabla 2 se sintetizaron con una amida C-terminal. Se sintetizaron péptidos agonistas de GLP-1/glucagón adicionales con un ácido C-terminal y los valores de CE50 determinados en los ensayos de AMPc, realizados en "medio de ensayo", se muestran en la Tabla 3. La CE50 para péptidos agonistas de GLP-1/glucagón adicionales, realizada en "medio de ensayo", se muestra en la Tabla 4. Todos los péptidos de la Tabla 4 tienen una amida C-terminal, a menos que se indiquen como "ácido", en cuyo caso tienen un ácido C-terminal.

Tabla 2: Actividad del AMPc de los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón con amida C-terminal (ensayo 1)

Tabla 3: Actividad del AMPc de los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón con ácido C-terminal (ensayo 1)

Tabla 4: Actividad del AMPc de péptidos agonistas de GLP-l/glucagón adicionales (ensayo 1)

Abreviaturas: K(gE-palm) = Lisina con un grupo palmitoílo conjugado con el nitrógeno épsilon, a través de un enlazador de ácido gamma glutámico; K (Ahx-palm) = Lisina con un grupo palmitoílo conjugado con el nitrógeno épsilon, a través de un enlazador de ácido aminohexanoico; K(bA-palm) = Lisina con un grupo palmitoílo conjugado con el nitrógeno épsilon, a través de un enlazador de ácido beta alanina; Aib, ácido aminoisobutírico. K(palm) — Lisina con un grupo palmitoílo conjugado directamente con el nitrógeno épsilon.

Ensayos de producción de AMPc mediada por el receptor de glucagón y de GLP-1 en presencia de concentraciones plasmáticas de albúmina sérica (ensayo 2). Las determinaciones de la potencia agonista para péptidos que inducen la producción de AMPc se midieron en células CHO que expresaban receptores de glucagón humanos, de rata o de ratón (abreviados como GlucR o GCGR) o receptores de GLP-1 en presencia de albúmina sérica humana, de rata o de ratón al 4,4, 3,2 y 3,2 % respectivamente, de la siguiente manera.

Se cultivaron células CHO con expresión recombinante estable del GlucR o el receptor de GLP-1 humanos, de ratón o de rata en DMEM, FBS al 10 % y geneticina (100 |jg/ml). Se prepararon soluciones madre de células criopreservadas en medio de congelación celular 1x-DMSO sin suero (Sigma Aldrich) a 2*107 /vial y se almacenaron a -80 °C. Las células se descongelaron rápidamente a 37 °C y se diluyeron en el tampón de ensayo (DMEM) que contenía albúmina sérica al 4,4, 3,2 y 3,2 % para la albúmina sérica humana, de rata y de ratón, respectivamente. Los péptidos se diluyeron en serie en DMSO y después se diluyeron 100 veces en DMEM que contenía albúmina sérica, a la concentración final indicada. Después, los péptidos diluidos se transfirieron a placas de ensayo de microtitulación de 384 pocillos de color negro poco profundos. Las células se añadieron a las placas de ensayo y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Después de la incubación el ensayo se detuvo y se midieron los niveles de AMPc usando el kit de ensayo de AMPc HTRF® dynamic d2 disponible en CisBio Bioassays, según las directrices del fabricante. Las placas se leyeron en lectores de placas de fluorescencia Perkin Elmer ENVISION®. La albúmina sérica humana y de rata se adquirió en Sigma Aldrich y la albúmina sérica de ratón en Equitech Bio Ltd.

Los datos se transformaron en % de Delta F como se describe en las directrices del fabricante y se analizaron mediante un ajuste logístico de 4 parámetros para determinar los valores de CE50. Los valores de CE50 del ensayo 2 para péptidos seleccionados se muestran en la Tabla 5. Los valores de CE50 del ensayo 2 determinados dependen tanto de la potencia intrínseca de los péptidos sometidos a ensayo en los receptores de GLP1 y de glucagón en las estirpes celulares recombinantes como de la afinidad del péptido por la albúmina sérica, que determina la cantidad de péptido libre. La asociación con la albúmina sérica aumenta el valor de CE50 obtenido. La fracción de péptido libre a concentraciones plasmáticas de albúmina y la CE50 a HSA al 0 % pueden calcularse basándose en la variación en la generación de AMPc con la concentración de HSA. Por ejemplo, G730 y G933 proporcionaron valores del 0,85 % y el 0,29 % para el péptido libre a HSA al 4,4 % y de 7 pM y 6 pM para la CE50 en el GLP1R a HSA al 0 %, respectivamente. G797 y G849 proporcionan valores del 0,82 % y el 0,48 % para el péptido libre a HSA al 4,4 % y de 7 pM y 2 pM para la CE50 en el GLP1R a HSA al 0 %, respectivamente. Para comparar el equilibrio de las actividades en el GLP1R y el GlucR entre diferentes péptidos y en diferentes condiciones, éstos pueden correlacionarse usando el cálculo a continuación, en el que las CE50 se relacionan con las de los ligandos naturales.

Tabla 5: Potencias de CE50 para péptidos agonistas de GLP-1/Glucagón en presencia de concentraciones plasmáticas de albúmina sérica (ensayo 2)

Ensayos de estabilidad de péptidos en plasma. La estabilidad en el plasma de los péptidos G730, G797, G849 y G933 se determinó de la siguiente manera.

Se prepararon soluciones madre de los péptidos de aproximadamente 200 |jmol/l pesando el péptido sólido en un tubo Eppendorf de Baja Unión y disolviéndolo en DMSO. Se añadieron 10 j l de soluciones madre a 990 j l de plasma en un tubo Eppendorf de Baja Unión, dando como resultado concentraciones iniciales de los péptidos en plasma de aproximadamente 2 jmol/l. El plasma en blanco congelado de ser humano, rata y ratón se había descongelado y calentado a una temperatura de 37 °C antes de añadir la solución madre. Las muestras de plasma enriquecidas se mezclaron suavemente y se dejaron equilibrar durante aproximadamente 5 minutos antes de comenzar el experimento. Las muestras de plasma se incubaron durante 48 horas en una incubadora GalaxyR de CO2 a 37 °C. Se tomaron muestras (30 j l) a las 0, 1, 2, 6,5, 17, 24 y 48 horas. Las muestras se almacenaron a -70 °C hasta su análisis.

Las muestras de plasma se analizaron de la siguiente manera. Las muestras de plasma de 30 j l precipitaron con 180 ml de etanol frío en una placa de 96 pocillos de baja unión (Eppendorf Protein LoBind). Después de mezclar y centrifugar, se transfirieron 100 j l del sobrenadante a una nueva placa y se inyectó 1 j l en una columna analítica.

El análisis se realizó usando un sistema ^LC (LC Exigent ^LC) acoplado a un espectrómetro de masas de resolución media-alta (Perkin Elmer PenTOF) con ionización por electronebulización positiva. La columna analítica era una columna C18 Agilent Poroshell (hecha a medida) de 5 cm y 1 mm con un tamaño de partícula de 2,7 ^m. Flujo: 0,1 ml/min usando un gradiente de fase inversa lento. Las fases móviles utilizadas fueron acetonitrilo y agua que contenían ácido fórmico al 0,1 %.

Los datos resultantes se evaluaron manualmente para los siguientes productos de degradación: 1 producto (ácido) y el producto de escisión de DPP IV. Los productos con masa 1 pueden surgir de la desamidación en los grupos amida de la glutamina o en el extremo C. Los productos de escisión surgen de la acción de la proteasa DPP IV en plasma. Tanto la degradación de los péptidos como la formación de productos peptídicos se publicaron en porcentaje de la concentración de péptido inicial. Se integraron los picos y se calculó el % de péptido restante: (área del pico/área del pico 0H)*100. Los datos para el punto temporal de 24 h se muestran en la Tabla 6. Los niveles de desamidación y escisión de DPP IV fueron bajos para ^g797 y G933.

Tabla 6: Estabilidad del péptido en plasma

Solubilidad La solubilidad del péptido se evaluó en una diversidad de especies de tampón dentro de un intervalo de pH de 4,5 a 8,0, de la siguiente manera. Las formas de polvo seco de los péptidos agonistas de GLP-1/Glucagón se reconstituyeron en diversos tampones a temperatura ambiente. La absorbancia se midió a 280 nm usando el espectrofotómetro NanoDrop 2000 y la concentración de péptidos se calculó usando la siguiente ecuación:

C=(A ²⁸⁰ *M^w)/S

donde: c- concentración £- coeficiente de extinción Mw- peso molecular A280- Absorbancia a 280 nm

s — (1 x Trp — 5560) (1 x Tyr = 1200)

Los Resultados se muestran en la Tabla 7. Cada uno de los péptidos era soluble a 0,8 mg/ml en un intervalo de pH (6,5 a 8,5). G730 era soluble en un intervalo de pH de 4,5 a 8,0, G797 era soluble en un intervalo de pH de 6. a 8,0 y ^g933 era soluble en un intervalo de pH de 6 a 8,0. La solubilidad de G933 se sometió a ensayo en varios sistemas tampón diferentes, que también se muestran en la Tabla 7. G933 era soluble a 1 mg/ml en al menos los siguientes sistemas tampón: histidina (pH 6 y 7; fuerza iónica: 0,25 a 100 mM), fosfato de sodio (pH 6-7,5; fuerza iónica: 0,25 a 100 mM) y tris/hidroximetil aminometano (pH 7-9; fuerza iónica: 0,25 a 100 mM).

TABLA 7: Perfil de solubilidad del péptido (Fuerza iónica de todos los tampones: 100 mM)

Formulaciones. Se evaluó la solubilidad del péptido en tres formulaciones isotónicas diferentes:

1. Formulación por defecto (DF, por sus siglas en inglés)= Tris 0,1 M pH 7,5, Manitol 150 mM. Formulación final pH=7,2

2. Formulación de respaldo 1 (BF1, por sus siglas en inglés)= Tris 0,05 M, Arginina 50 mM/Prolina. Formulación final pH= 8,0

3. Formulación de respaldo 2 (BF2, por sus siglas en inglés)= Tampón de fosfato de sodio (pH8)/ propilenglicol al 1,85 % P/V. Formulación final pH= 7,0

La solubilidad se midió como se ha detallado anteriormente y los resultados se muestran en la Tabla 8. G730, G797 y G933 fueron solubles hasta al menos 5 mg/ml en la DF, la solubilidad máxima de G849 en la DF fue de 3,7 mg/ml, G797 fue soluble hasta al menos 10 mg/ml en la BF1 y G933 fue soluble hasta al menos 10 mg/ml en la BF2.

Tabla 8: Solubilidad del péptido en la formulación

La estabilidad de la DF se evaluó midiendo la pureza por cromatografía de líquidos de fase inversa (RP UPLC), en un mes. Las condiciones de almacenamiento fueron 5 °C, 25 °C, 40 °C y -80 °C. Los resultados se muestran en las Tablas 9 y 10.

Tabla 9 Pureza de la formulación del péptido después de 1 mes en condiciones de estabilidad

Tabla 10: Pérdida de pureza de la formulación del péptido (% en comparación con T0) después de 1 mes en condiciones de estabilidad

Todos los péptidos mostraron propiedades aceptables en cuanto a solubilidad, formulabilidad y estabilidad Ejemplo 3: Estudios in vivo

G730, G797 y G812 (estudio A). Los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón seleccionados desvelados en el presente documento se sometieron a ensayo en un modelo en ratón de obesidad inducida por dieta (DIO, por sus siglas en inglés), de la siguiente manera. A las 9-11 semanas de vida, las hembras C57/Bl6JHsdOla (obtenidas en Harlan Laboratories, Reino Unido) empezaron a recibir una dieta rica en grasas de D12492 (Research Diets, NJ, EE.UU.) y una golosina de chocolate, Delicatoball (Delicata Bakverk, Suecia) y se mantuvieron con la dieta durante 16 semanas antes de llegar al animalario, en la Tabla 11 se muestra el contenido calórico de los dos componentes de la dieta durante un período de aclimatación de tres semanas y durante el tratamiento farmacológico. Los ratones se dividieron en 9 grupos (n=5-6) y el tratamiento se inició a las 29 semanas de vida. Los grupos de tratamiento y las dosis se muestran en la Tabla 12.

Tabla 11: Contenido de la dieta DIO

Tabla 12: Grupos de tratamiento para el Estudio A

Los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón G730, G797 y G812, así como la Liraglutida, se formularon en el vehículo, Tris 100 mM/manitol 150 mM, pH 7,4. Los tratamientos se administraron por vía subcutánea dos veces al día durante 14 días, mientras los animales se mantenían con una dieta rica en grasas. El peso corporal de los animales se controló a diario durante todo el período de dosificación. El día 14, se obtuvieron muestras de sangre para la medición de la glucosa y la insulina en plasma de ratones conscientes después de un período de ayuno de 4 horas. Después, los ratones se anestesiaron con isoflourano y se recogió sangre terminal del lecho capilar detrás del ojo. Se midieron los siguientes parámetros: mediciones de química sanguínea de triglicéridos, colesterol total, ácidos grasos no esterificados (NEFA), beta-hidroxibutirato y factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21) (Tablas 14 y 15 a continuación).

El efecto del tratamiento con liraglutida y los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón G730, G797 y G812 sobre el peso corporal, en comparación con la liraglutida y el vehículo, se muestra en las FIG. 1-4. Los animales tratados con G730 o G797 mostraron una pérdida de peso continua y dependiente de la dosis durante el período de dosificación de 14 días. A 50 nmol/kg, los animales tratados con G730 y G797 experimentaron un cambio de peso de aproximadamente el 24 % el día 14 en comparación con los animales tratados con vehículo.

Los ratones tratados con G730 o G797 mostraron una reducción, dependiente de la dosis, de los niveles de glucosa el día 14 (Tabla 13). También se observó una reducción de los niveles de insulina con estos dos tratamientos, especialmente con las dosis más altas (Tabla 13). El índice de sensibilidad a la insulina Evaluación en Modelo Homeostático (HOMA, por sus siglas en inglés) mejoró significativamente a 20 nmol/kg de G730 y 20 y 50 nmol/kg de G797. HOMA es un método de modelización que usa la suma de los niveles plasmáticos de insulina y glucosa para evaluar la función de las células p y la resistencia a la insulina (Tabla 14). El colesterol plasmático total se redujo con liraglutida, G730 y G797 en todas las dosis, con cambios menos pronunciados en los niveles de ácidos grasos no esterificados (AGNE) en plasma y en los triglicéridos (TG) plasmáticos y hepáticos. El beta-hidroxibutirato (BeHy) tenía tendencia a aumentar sus niveles, en consonancia con la pérdida de peso corporal. El factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21) aumentó en general con el tratamiento con el péptido agonista dual de GLP-1/glucagón.

Tabla 13: Efecto del tratamiento con péptidos agonistas de GLP-l/glucagón sobre la glucosa, la

insulina y la HOMA

Resultados evaluados mediante un ensayo t de varianza desigual de dos muestras, de

distribución de dos colas; * indica p<0,05 en comparación con el vehículo.

Tabla 14: Efecto del tratamiento con péptidos agonistas de GLP-l /glucagón sobre

mediciones de química sanguínea adicionales

distribución de dos colas; * indica p<0,05 en comparación con el vehículo.

G865, G933 y G796 (estudio B). Se sometió a ensayo un conjunto adicional de péptidos de GLP-1/glucagón en un modelo de obesidad inducida por dieta usando el mismo protocolo anterior, pero con los grupos de tratamiento y las dosis que se muestran en la Tabla 15:

Tabla 15: Grupos de tratamiento para el Estudio B

Los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón G865, G933 y G796, así como la liraglutida, se formularon en el vehículo, Tris 100 mM/manitol 150 mM, pH 7,4. Los tratamientos se administraron por vía subcutánea dos veces al día durante 14 días, mientras los animales se mantenían con una dieta rica en grasas. El peso corporal de los animales se controló a diario durante todo el período de dosificación. El día 14, se obtuvieron muestras de sangre para la medición de la glucosa y la insulina en plasma de ratones conscientes después de un período de ayuno de 4 horas. Después, los ratones se anestesiaron con isoflourano y se recogió sangre terminal del lecho capilar detrás del ojo. Se midieron los siguientes parámetros: mediciones de química sanguínea de triglicéridos, colesterol total, ácidos grasos no esterificados (NEFA), beta-hidroxibutirato y factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21) (Tabla 16 y Tabla 17 a continuación).

El efecto del tratamiento con liraglutida y los péptidos agonistas de GLP-1/glucagón G933, G865, G796 sobre el peso corporal, en comparación con la liraglutida y el vehículo, se muestra en las FIG. 5-8. Los animales tratados con G933, G865 o G796 mostraron una pérdida de peso continua y dependiente de la dosis durante el período de dosificación de 14 días.

Los niveles de glucosa, los niveles de insulina y la HOMA el día 14 después del tratamiento se muestran en la Tabla 16. Los niveles totales de colesterol en plasma, los niveles de ácidos grasos no esterificados (NEFA) en plasma, los niveles de triglicéridos (TG) en plasma y hepáticos, los niveles de beta-hidroxibutirato (BeHy) y los niveles del factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21) el día 14 después del tratamiento se muestran en la Tabla 17.

Tabla 16: Efecto del tratamiento con péptidos agonistas de GLP-l/glucagón sobre la glucosa, la

insulina y la HOMA

distribución de dos colas; * indica p<0,05 en comparación con el vehículo.

Tabla 17: Efecto del tratamiento con péptidos agonistas de GLP-l /glucagón sobre

mediciones de química sanguínea adicionales

distribución de dos colas; * indica p<0,05 en comparación con el vehículo.

El alcance de la divulgación no debe limitarse a las realizaciones específicas descritas, que pretenden ser ilustraciones únicas de aspectos individuales de la divulgación y cualquier composición o método que sea funcionalmente equivalente está dentro del alcance de la presente divulgación. De hecho, diversas modificaciones de la divulgación, además de las que se muestran y se describen en el presente documento, resultarán evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripción anterior y los dibujos adjuntos. Dichas modificaciones están previstas en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un péptido aislado para su uso en un método de tratamiento de la obesidad, en donde el péptido comprende la secuencia de aminoácidos:

HX2QGTFTSDX10SX12X13LX15X16X17X18AX20X21FX23X24WLX27

X28GX30;

en donde X2 es G o S, X10 es K, X12 es K, E, R o S, X13 es K o Y, X15 es D o E, X16 es S o G, X17 es E, R, Q o K, X18 es R, S o A, X20 es R, K o Q, X21 es D o E, X23 es V o I, X24 es A o Q, X27 es E o V, X28 es A o K y X30 es G o R (SEQ ID NO: 4), en donde el residuo lisina en X10 se modifica mediante la adición de un resto palmitoílo en el grupo (N)épsilon del residuo lisina.

2. El péptido aislado para el uso de la reivindicación 1, en donde el grupo palmitoílo está unido a la lisina a través de un enlazador.

3. El péptido aislado para el uso de la reivindicación 2, en donde el enlazador es gamma glutamato.

4. El péptido aislado para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el péptido se une a un receptor de glucagón, se une a un receptor de GLP-1 o se une tanto a un receptor de glucagón como a un receptor de GLP-1.

5. El péptido aislado para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se une a un receptor de glucagón.

6. El péptido aislado para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el grupo carboxilo de X30 está amidado o es el ácido sin modificar.

7. El péptido aislado para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el péptido aislado se une a un receptor de glucagón humano con una CE50 en el ensayo de AMPc 1 de menos de 10.000 pM, menos de 5000 pM, menos de 2500 pM, menos de 1000 pM, menos de 900 pM, menos de 800 pM, menos de 700 pM, menos de 600 pM, menos de 500 pM, menos de 400 pM, menos de 300 pM, menos de 200 pM, menos de 100 pM, menos de 50 pM, menos de 25 pM, menos de 20 pM, menos de 15 pM, menos de 10 pM, menos de 5 pM, menos de 4 pM, menos de 3 pM o menos de 2 pM.

8. El péptido aislado para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el péptido aislado se une a un receptor de GLP-1.

9. El péptido aislado para el uso de la reivindicación 8, en donde el receptor de GLP-1 es un receptor de GLP-1 de ratón o un receptor de GLP-1 humano.

10. El péptido aislado para el uso de la reivindicación 8 o 9, que se une a un receptor de GLP-1 humano con una CE50 en el ensayo de AMPc 1 de menos de 10.000 pM, menos de 5000 pM, menos de 2500 pM, menos de 1000 pM, menos de 900 pM, menos de 800 pM, menos de 700 pM, menos de 600 pM, menos de 500 pM, menos de 400 pM, menos de 300 pM, menos de 200 pM, menos de 100 pM, menos de 50 pM, menos de 25 pM, menos de 20 pM, menos de 15 pM, menos de 10 pM, menos de 5 pM, menos de 4 pM, menos de 3 pM o menos de 2 pM.

11. El péptido aislado para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el péptido aislado es un agonista de la actividad del GLP-1, un agonista de la actividad del glucagón o un agonista de la actividad tanto del GLP-1 como del glucagón.

12. El péptido aislado para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el péptido aislado se une tanto a un receptor de glucagón como a un receptor de GLP-1, en donde el péptido presenta una actividad al menos aproximadamente 2 veces, 5 veces o 10 veces mayor con respecto al ligando natural en el receptor de GLP-1 que en el receptor de glucagón.

13. El péptido aislado para el uso de cualquier reivindicación anterior, que comprende además un resto heterólogo asociado al péptido, opcionalmente en donde el resto heterólogo es una proteína, un péptido, un dominio proteico, un enlazador, un polímero orgánico, un polímero inorgánico, un polietilenglicol (PEG), biotina, una albúmina, una albúmina sérica humana (HSA), una porción de unión a FcRn de HSA, un anticuerpo, un dominio de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo de dominio, un dominio de unión a albúmina, una enzima, un ligando, un receptor, un péptido de unión, un armazón no FnIII, un marcador epitópico, un polímero polipéptido recombinante, una citocina o una combinación de dos o más de los restos citados.