WO2006093097A1 - アシストプローブ及びその利用方法 - Google Patents

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WO2006093097A1
WO2006093097A1 PCT/JP2006/303629 JP2006303629W WO2006093097A1 WO 2006093097 A1 WO2006093097 A1 WO 2006093097A1 JP 2006303629 W JP2006303629 W JP 2006303629W WO 2006093097 A1 WO2006093097 A1 WO 2006093097A1
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acid region
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Toshihiko Fujikawa
Mitsugu Usui
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Eisai R&D Management Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to an assist probe used in a signal amplification method using a pair of oligonucleotides forming a self-assembly and a method of using the assist probe. More specifically, D using a support such as a microplate type, a slide glass type, a fine particle type, or an electrically conductive substrate.
  • Assist probe that enables increased sensitivity and simultaneous detection of multiple genes on NA chips (hereinafter collectively referred to as DNA chips), and target gene detection method using the assist probe And a method for forming a signal probe polymer using the assist probe.
  • a signal amplification method a pair of oligonucleotides represented by the following chemical formula (1) and the following chemical formula (2) (hereinafter referred to as HCP) are used.
  • a signal amplification method hereinafter referred to as the PALSAR method
  • a gene detection method using this method have been reported (Patent Documents 1 and 2, etc.).
  • region X and region X ′, region ⁇ and region Y ′, and region ⁇ and region Z ′ are complementary nucleic acid regions that can hybridize, and a plurality of pairs of HCPs
  • a self-assembly represented by the following chemical formula (3) is formed.
  • the signal probe polymer refers to the self-assembly formed by HCP.
  • An assist probe is a sequence complementary to the target gene to be detected and a sequence complementary to HCP. It has a function to connect the target gene and the signal probe polymer.
  • Patent Document 3 discloses a method for detecting a target gene on a DNA chip using a pulsar method.
  • Patent Documents 1 to 3 disclose a method for detecting a target gene with high sensitivity by forming a complex of a target gene and a self-assembly and detecting the self-assembly.
  • a method of forming a signal probe polymer on a target gene there are a method of designing HCP so that HCP itself contains a sequence complementary to the target gene, and a method of using an assist probe.
  • the method of forming an assist probe has an advantage that a plurality of genes can be detected simultaneously by a pair of HCPs by preparing a plurality of assist probes in which complementary portions of the target gene are changed.
  • Patent Documents 1 to 3 do not examine what kind of assist probe can detect a target gene with high sensitivity, as the assist probe having a sequence complementary to one region of HCP is illustrated.
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 3267576
  • Patent Document 2 Japanese Patent No. 3310662
  • Patent Document 3 International Publication No. 2003Z029441
  • Patent Document 4 International Publication No. 2004Z074480
  • Patent Document 5 International Publication No. 2004Z072302 Disclosure of the invention
  • the present invention provides a target gene detection method capable of improving sensitivity and simultaneously detecting multiple genes in a pulser method, an assist probe used in the method, and a method for forming a signal probe polymer using the assist probe The purpose is to do.
  • the present inventors have intensively studied the design of the assist probe. As a result, the inventors have found a method for designing an assist probe that is optimal for the pulsar method, and have completed the present invention. That is, the target gene detection method of the present invention comprises a nucleic acid region X, a nucleic acid region Y, and a nucleic acid region Z in order from the 5 ′ end, and comprises three nucleic acid regions having the structure of the following chemical formula (1).
  • First probe also called HCP-1
  • the second probe (HCP-2) is provided with nucleic acid region ⁇ ', nucleic acid region Y' and nucleic acid region Z 'in order from the 5' end, and has the structure of the following chemical formula (2) and also has three nucleic acid region forces Also called)
  • nucleic acid region X and the nucleic acid region X ′, the nucleic acid region ⁇ and the nucleic acid region Y ′, and the nucleic acid region ⁇ and the nucleic acid region Z ′ are complementary regions capable of hybridizing, respectively.
  • a pair of first and second probes (also referred to as HCPs) that also have a force, and a plurality of the first probes Using a assist probe having the same nucleic acid region as the probe and a target region capable of hybridizing to the target gene, forming a signal probe polymer, and detecting the target gene, in order from the end of the assist probe force 5 ′.
  • the nucleic acid region X, the nucleic acid region Y, the structure provided with the nucleic acid region X and the target region, or the 5 ′ end force in order of the target region, the nucleic acid region ⁇ , the nucleic acid region ⁇ ⁇ and the nucleic acid region ⁇ It has the structure provided with.
  • the assist probe between the target region and the nucleic acid region X or the nucleic acid region ⁇ ⁇ , further hybridize to the target gene and the first and second probes! /, The spacer region. You may use what has.
  • the assist probe in order from the 5 'end, the nucleic acid region X, the nucleic acid region ⁇ ⁇ and the nucleic acid region X ⁇ ⁇ region, and the nucleic acid region ⁇ and the nucleic acid region X ⁇ region And an assist probe including the target region may be used. It is preferable that a spacer region that does not hybridize to the target gene and the first and second probes is further included between the cocoon region and the cocoon region.
  • the target region also has a 5 'end force in order, a cocoon region composed of the nucleic acid region ⁇ and the nucleic acid region ⁇ , the nucleic acid region ⁇ , the nucleic acid region ⁇ ⁇ , and the nucleic acid region. It is also possible to use an assist probe that includes a specific region. It is preferable that a spacer region that does not hybridize to the target gene and the first and second probes is further included between the cocoon region and the cocoon region.
  • the method for detecting a target gene of the present invention includes a reaction step in which the assist probe is subjected to a ligation reaction using the target gene as a saddle type, and the target gene can be detected using the hybridization reaction. is there.
  • the method for detecting a target gene of the present invention is a reaction step in which the assist probe has poly dT or a primer sequence in the 3 ′ target region, and reverse transcription is performed using the assist probe as a primer and the target RNA as a saddle.
  • the target gene can be detected using the reverse transcription reaction.
  • a plurality of target genes are detected simultaneously by using a plurality of assist probes that differ only in the target region. be able to.
  • the method for forming a signal probe polymer of the present invention comprises three nucleic acid regions each having a nucleic acid region X, a nucleic acid region Y, and a nucleic acid region Z in order from the 5 'end, and having the structure of the following chemical formula (1)
  • nucleic acid region X and the nucleic acid region X ′, the nucleic acid region Y and the nucleic acid region Y ′, and the nucleic acid region Z and the nucleic acid region Z ′ are complementary regions that can be hybridized
  • X and the target region are provided, or the target region, the nucleic acid region ⁇ , the nucleic acid region ⁇ , and the nucleic acid region ⁇ are provided in this order from the 5 ′ end.
  • a first aspect of the assist probe of the present invention is an assist probe used in the method of the present invention, and includes the nucleic acid region X, the nucleic acid region ⁇ , and the nucleic acid region X in this order from the 5 ′ end. It has a structure in which a ridge region and the target region are provided.
  • an assist probe in which the target region has poly dT or a primer sequence may be used.
  • a YX region comprising the nucleic acid region Y and the nucleic acid region X, and / or a target gene and the first and second probes.
  • An assist probe that does not hybridize and includes a spacer region may be used.
  • a second aspect of the assist probe of the present invention is an assist probe used in the method of the present invention, wherein the target region, the nucleic acid region Z, the nucleic acid region Y, and the 5 'end force are ordered. It has a structure provided with a ZYZ region having the nucleic acid region Z.
  • an assist probe having a phosphate group at the 5 ′ end on the target region side is used.
  • assist probe between the ZYZ region and the target gene, further hybridize to the YZ region consisting of the nucleic acid region Y and the nucleic acid region Z, Z or the target gene, and the first and second probes.
  • the signal probe polymer of the present invention is characterized by being formed by the method of the present invention.
  • the detection sensitivity of a target gene using the pulsar method can be remarkably improved.
  • various genes can be detected simultaneously by changing the target region of the assist probe of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic explanatory view showing a first example of an assist probe of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram in which HCP-2 and a target gene are bound to the assist probe in FIG.
  • FIG. 3 is a schematic explanatory view showing an example of a method for forming a signal probe polymer using the assist probe of FIG. 1.
  • FIG. 4 is a schematic explanatory view showing an example of an assist probe.
  • FIG. 5 is a schematic diagram in which HCP-2 and a target gene are bound to the assist probe in FIG.
  • FIG. 6 is a schematic explanatory view showing another example of an assist probe.
  • FIG. 7 is a schematic explanatory view showing a second example of the assist probe of the present invention.
  • FIG. 8 is a schematic explanatory view showing a third example of the assist probe of the present invention.
  • FIG. 9 is a schematic diagram in which HCP-2 and a target gene are bound to the assist probe in FIG.
  • FIG. 10 is a schematic explanatory view showing a fourth example of the assist probe of the present invention.
  • FIG. 11 is a schematic explanatory view showing a fifth example of the assist probe of the present invention.
  • FIG. 12 is a schematic diagram in which HCP-2 and a target gene are bound to the assist probe of FIG.
  • FIG. 13 is a schematic explanatory view showing a sixth example of the assist probe of the present invention.
  • FIG. 14 is a schematic explanatory view showing a seventh example of the assist probe of the present invention.
  • FIG. 15 is a schematic explanatory view showing an example of the process sequence of the target gene detection method using the assist probe and ligation reaction of FIG. 14, wherein (a) is a target gene and (b) is bound to a support. A capture probe is shown.
  • FIG. 16 is a schematic explanatory diagram showing step 100 in an example of the process sequence of the target gene detection method using the assist probe and ligation reaction of FIG.
  • FIG. 17 is a schematic explanatory diagram showing step 104 in an example of the process sequence of the target gene detection method using the assist probe and the ligation reaction of FIG.
  • FIG. 18 is a schematic explanatory diagram showing step 106 in an example of the process order of the target gene detection method using the assist probe and ligation reaction of FIG.
  • FIG. 19 is a schematic explanatory view showing an eighth example of the assist probe of the present invention.
  • FIG. 20 is a schematic explanatory diagram showing step 200 in an example of the process sequence of the target gene detection method using the assist probe and reverse transcription reaction of FIG.
  • FIG. 21 is a schematic explanatory diagram showing step 202 in an example of the process sequence of the target gene detection method using the assist probe and reverse transcription reaction of FIG. 19.
  • FIG. 22 is a schematic explanatory diagram showing step 204 in an example of the process sequence of the target gene detection method using the assist probe and reverse transcription reaction of FIG.
  • FIG. 23 is a schematic explanatory diagram showing step 206 in an example of the process sequence of the target gene detection method using the assist probe and reverse transcription reaction of FIG. 19.
  • 10a ⁇ LOh: assist probe of the present invention
  • 11a, l ib assist probe
  • 12a, 12b target gene
  • 14 HCP-2
  • 16 HCP-1
  • 1, 18 signal probe polymer
  • 20 Capture probe
  • 22 Support
  • 24 Assist probe 10g and adjacent part of capture probe
  • 26 Probe.
  • FIG. 1 is a schematic explanatory view showing a first example of the assist probe of the present invention
  • FIGS. 2 and 3 are schematic views showing an example of a method for forming a signal probe polymer using the assist probe of FIG. It is explanatory drawing.
  • FIG. 4 is a schematic explanatory diagram showing an example of a conventional assist probe
  • FIG. 5 is a schematic diagram in which one of a target gene and HCP is bound to the assist probe of FIG.
  • FIG. 6 is a schematic explanatory view showing another example of the assist probe.
  • HCP-1 As an assist probe used in the pulsar method, one of HCPs (HCP-1) is used as an assist probe as it is, or one of HCPs (HCP-1) as shown in Fig. 4 is used as a target.
  • the assist probe 11a shown in FIG. 4 has an HCP region consisting of the same nucleic acid region X, nucleic acid region Y, and nucleic acid region Z as HCP-1 in turn, and a target region T complementary to the target gene in order of 5 ′ end force.
  • the HCP region as shown in FIG. 5 binds to HCP-2 (reference numeral 14) for each region.
  • the group consisting of a plurality of nucleic acid regions selected from the nucleic acid regions X, Y and Z is referred to as an HCP region.
  • the assist probe of the present invention is designed to be able to bind to at least one HCP-2 in two regions and to bind to another HCP-2 in the remaining region.
  • FIG. 1 shows an example of the assist probe of the present invention.
  • 10a is a first example of the assist probe of the present invention, which consists of a target region T and an HCP region, and has 3 regions as an HCP region, but 3 regions of XYX that are not connected by XYZ from the 5 'end. Has a region (ie, 5'-XYX-T-3 '). Therefore, when HCP-2 (symbol 14) reacts with the assist probe 10a, the assist probe as shown in Fig.
  • HCP-2 binds to one HCP-2 and three regions in two regions, and the rest. One region binds to another HCP-2 for polymer formation. Therefore, by reacting multiple pairs of HCP (symbols 14 and 16), assist probe 10a and target gene 12, a pair of HCP force-formed polymer, assist probe and target gene as shown in FIG. A signal probe polymer 18 consisting of the complex is formed.
  • FIG. 7 is a schematic explanatory view showing a second example of the assist probe of the present invention.
  • FIG. 1 there is no particular limitation on the position of the force target region and the HCP region, which shows an assist probe with a target region on the 3 ′ side.
  • An assist probe with a target region on the 5 ′ side is also included in the present invention. It is included.
  • an assist probe with a target area on the 5 'side as shown in Fig. 7, an assist probe with a target area T on the 5' side and an HCP area consisting of three ZYZ areas on the 3 'side is provided.
  • Probe 10b (5'-T-ZYZ-3 ') force is mentioned.
  • FIG. 8 is a schematic explanatory view showing a third example of the assist probe of the present invention
  • FIG. 9 is a schematic diagram in which one of HCP (HCP-2) and a target gene are bound to the assist probe of FIG. is there.
  • FIG. 10 is a schematic explanatory view showing a fourth example of the assist probe of the present invention.
  • the assist probe of the present invention it is possible to use two or more HCP-2s and one assist probe that can be coupled to each other continuously in two regions!
  • the first HCP region (XYX) at the 5 ′ end and the target at the 3 ′ end Between the region T and the second region that has two regions of CP that can be combined with two regions of HCP-2 continuously? Assist probe 10 with the region inserted. (5 '— ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ -3').
  • the assist probe 10c reacts with HCP-2, one assist probe 10c as shown in FIG. 9 binds to the two HCP-2s in two continuous regions.
  • HCP-2 and two regions can be bound continuously between the target region T at the 5 'end and the first HCP region (Z YZ) at the 3' end. It is also possible to use assist probe 10d (5, -T-ZY-ZYZ-3,) inserted with the second HCP region having two regions. 8 and 10 show an example in which one second HCP region is inserted, an assist probe having a plurality of the second HCP regions can be used.
  • FIG. 11 is a schematic explanatory view showing a fifth example of the assist probe of the present invention
  • FIG. 12 is a schematic diagram in which one of HCP (HCP-2) and a target gene are bound to the assist probe of FIG. It is.
  • FIG. 13 is a schematic explanatory view showing a sixth example of the assist probe of the present invention.
  • a spacer region S having a target sequence or a sequence not related to HCP Spacer sequence
  • the sensitivity of signal detection may be increased by using an assist probe inserted between the target region and the HCP region or between the first HCP region and the second HCP region.
  • the number of bases in the spacer region is not particularly limited, but is preferably 0 to 5 bases.
  • assist probe having the spacer region for example, an assist probe having a spacer region inserted between a target region and an HCP region [5′-XYX-ST-3, (assist probe of FIG. 11] — See 10e), or 5, — T—S—ZYZ—3,], assist probe with a spacer region inserted between the first HCP region and the second HCP region [5, 1 XYX- S -YX-T- 3 '(assist probe in Fig.
  • FIG. 14 is a schematic explanatory diagram showing an example of an assist probe used in a target gene detection method using a ligation reaction
  • 10 g is a seventh example of the assist probe of the present invention.
  • an assist probe as shown in FIG. 14 an assist probe in which the 5 ′ end of the target region is phosphorylated is used to detect a target gene using a ligation reaction (see, for example, Patent Document 4). Can also be used suitably.
  • 15 to 18 are schematic explanatory diagrams showing an example of the process sequence of the target gene detection method of the present invention using the assist probe and the ligation reaction shown in FIG.
  • FIG. 15 shows a target gene (symbol 12a), and (b) shows a capture probe (capture probe: symbol) having a region T complementary to the target gene at the 3 ′ end side.
  • FIG. 16 is a schematic explanatory diagram in which the assist probe 10g, the capture probe 20 and the target gene 12a are bound.
  • FIG. 17 shows a state where the capture probe 20 to which the target gene 12a is dissociated and the assist probe 10g is linked binds to the support 24.
  • the assist probe 10g and the capture probe 20 as shown in FIGS. 14 to 16 are connected to the end of the capture probe 20 when the assist probe 10g and the capture probe 20 are bound to the target gene 12a.
  • the assist probe is configured to anneal with the target gene 12a with the ends of 10 g adjacent to each other! RU
  • the assist probe 10g and the capture probe 20 are hybridized to the target gene 12a (step 100). Thereafter, a ligation reaction using ligase is performed (step 102). Only when the sequence of the adjacent portion 24 of the assist probe 10g and the capture probe 20 is complementary to the sequence of the target gene 12a, the assist probe 10g and the capture probe 20 are linked by the ligation reaction.
  • the target gene 12a is removed (step 104).
  • the sequence of the assist probe lOg and the adjacent portion 24 of the capture probe 20 is complementary to the sequence of the target gene 12a, the capture probe 20 to which the assist probe 10g is linked as shown in FIG. 17 is supported. Combined with body 24.
  • a pair of HCPs (14, 16) are placed on the support as shown in FIG.
  • a signal probe polymer 18 that is a complex force of the polymer, assist probe, and target gene formed from HCP is formed.
  • the assist probe 10g and the capture probe 20 are linked after the step 102. Instead, after the target gene is removed, only the capture probe 20 is bound to the support 24. Therefore, after that, a plurality of pairs of HCP are added, and the formed polymer is not captured on the support but is removed by washing or the like.
  • the target gene can be detected by detecting the signal probe polymer captured on the support.
  • the mutant gene can be detected by configuring the assist probe 10g and the adjacent portion 24 of the capture probe 20 to be located at the mutation site of the target gene.
  • FIG. 19 is a schematic explanatory diagram showing an example of an assist probe used in the target gene detection method using reverse transcription reaction
  • 10h is an eighth example of the assist probe of the present invention.
  • 20 to 23 are schematic cross-sectional explanatory views showing an example of the process sequence of the target gene detection method of the present invention using an assist probe and a reverse transcription reaction.
  • the target gene is mRNA
  • an HCP region having poly dT in the 3 ′ end target region and 3 regions of XYX on the 5 ′ side is provided as an assist probe.
  • Assist An example using the probe lOh is shown.
  • An assist probe 10h containing poly dT at the 3 'end is bound to the poly A tail portion of the target gene mRNA (symbol 12b) (step 200, Fig. 20), and the assist probe 1 Oh is used as a primer. Then, a reverse transcription reaction of mRNA is performed by a reverse transcription reaction to form a probe 26 comprising the assist probe and the cDNA region of the mRNA (step 202, FIG. 21).
  • mRNA as shown in FIG. 22 is dissociated from the probe 26 to obtain a single-stranded oligonucleotide having a cDNA region and an XYX HCP region (step 204).
  • the dissociated probe 26 is hybridized to a capture probe 28 having a region complementary to the cDN region of mRNA to capture the probe 26 (step 206, FIG. 23).
  • the capture probe is preferably bonded to the support 22 in advance.
  • a plurality of pairs of HCPs are added to cause a hybridization reaction (step 208), whereby a signal probe polymer captured by the capture probe 28 is formed.
  • a signal probe polymer captured by the capture probe 28 is formed.
  • the target gene can be detected.
  • oligonucleotide probes As a pair of HCPs used in the Noresa method, oligonucleotide probes (HCP-1A and HCP-2A) having the following base sequence with the 5 ′ end Cy3 labeled were used.
  • HCP-1A base sequence (SEQ ID NO: 1)
  • HCP-2A base sequence (SEQ ID NO: 2)
  • target DNA synthetic DN A (target DNA-1) having a base sequence derived from Apolipoprotein E (ApoE) was used.
  • the following assist probe 1 includes 2 of the 3 regions of HCP-1A in the order of XYX, and 3 has a region (T region) of a sequence complementary to the target DNA-1 at the end. Was used.
  • the following probe probe 1 having a base sequence complementary to the target DNA-1 was used as a capillary probe.
  • Fine particles polystyrene particles having the above-mentioned Capture Probe 1 fixed on the surface: 500 pieces
  • Assist probe 1 lpmol
  • Target DNA — 1 0, 100 or 500 amol
  • LuminexlOO manufactured by Luminex
  • the numerical value is the value obtained by subtracting the blank value.
  • Example 1 Same as Example 1 except that the following assist probe 2 was used, in which the spacer region S and YX region consisting of five poly dTs were inserted between the XYX region and T region of the assist probe 1 as an assist probe.
  • the experiment was conducted. The results are shown in Table 1.
  • Assist probe 2 base sequence SEQ ID NO: 6
  • Example 1 An experiment was performed in the same manner as in Example 1 except that the following assist probe 3 as a conventional assist probe was used as the assist probe. The results are shown in Table 1.
  • Assist probe 3 base sequence SEQ ID NO: 7

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Abstract

 パルサー法における感度の向上と多遺伝子同時検出が可能なターゲット遺伝子の検出方法、該方法に用いられるアシストプローブ、並びに該アシストプローブを用いたシグナルプローブポリマーの形成方法を提供する。  5’端部から順に核酸領域X、核酸領域Y及び核酸領域Zが設けられた第1プローブ、及び5’端部から順に核酸領域X’、核酸領域Y’及び核酸領域Z’が設けられた第2プローブ、並びに複数の前記第1プローブと同じ核酸領域及びターゲット遺伝子にハイブリダイズ可能なターゲット領域を有するアシストプローブを用い、シグナルプローブポリマーを形成させて、ターゲット遺伝子を検出する方法であって、前記アシストプローブが、5’端部から順に前記核酸領域X、Y、X及び前記ターゲット領域が設けられた構造、又は5’端部から順に前記ターゲット領域及び前記核酸領域Z、Y、Zが設けられた構造を有するようにした。                                                                                 

Description

明 細 書
アシストプローブ及びその利用方法
技術分野
[0001] 本発明は、自己集合体を形成する一対のオリゴヌクレオチドを用いたシグナル増幅 方法に用いられるアシストプローブ及びその利用方法に関する。より詳細には、マイ クロプレート型、スライドガラス型、微粒子型、電気伝導性基板等の支持体を用いた D
NAチップ(以下総称して DNAチップと称する)上で、上記シグナル増幅方法を用い る際の感度上昇、及び複数遺伝子同時検出を可能とするアシストプローブ、該アシス トプローブを用いたターゲット遺伝子の検出方法、及び該アシストプローブを用いた シグナルプローブポリマーの形成方法に関する。
背景技術
[0002] 酵素を使用しな!、シグナル増幅方法として、下記化学式(1)及び下記化学式(2) で示される一対のオリゴヌクレオチド (以下、 HCPと称する)を用い、 HCPの自己集 合体 (ポリマー)を形成させるシグナル増幅方法 (以下、パルサー法 (PALSAR法)と 称す)及び該方法を利用した遺伝子の検出方法が報告されている (特許文献 1及び 2等)。
[化 1]
X Y Z
5,養 : :† 3, ■ ■ ■ ( 1 )
[化
3, 扁: , 5, - - ■ ( 2 )
Z, Y, X,
[0003] 前記式(1)及び (2)において、領域 Xと領域 X'、領域 Υと領域 Y'、領域 Ζと領域 Z' はそれぞれハイブリダィズ可能な相補的核酸領域であり、複数対の HCPの結合によ り下記化学式(3)で示される自己集合体が形成される。本明細書中でシグナルプロ ーブポリマーとは、 HCPにより形成される前記自己集合体を言う。またアシストプロ一 ブとは、検出するターゲット遺伝子と相補的な配列、及び HCPと相補的な配列の両 方を有するプローブを言 ヽ、ターゲット遺伝子とシグナルプローブポリマーをつなぐ 働きをする。
[化 3]
Figure imgf000004_0001
また、特許文献 3はパルサー法を利用した DNAチップ上のターゲット遺伝子の検 出方法を開示している。特許文献 1〜3は、ターゲット遺伝子と自己集合体の複合体 を形成させ、自己集合体を検出することによりターゲット遺伝子を高感度に検出する 方法を開示して 、る。ターゲット遺伝子上にシグナルプローブポリマーを形成させる 方法としては、 HCP自体にターゲット遺伝子と相補的な配列が含まれるように HCP をデザインする方法、及びアシストプローブを使用する方法がある。このうちアシスト プローブを形成する方法は、ターゲット遺伝子と相補的な部分を変えた複数のアシス トプローブを準備することにより、一対の HCPにより複数の遺伝子を同時に検出でき るという利点を有している。
特許文献 1〜3には、 HCPの 1領域と相補的な配列を有するアシストプローブが図 示されている力 どの様なアシストプローブが感度良くターゲット遺伝子を検出できる かに関しては、検討されていない。
特許文献 1:特許第 3267576号
特許文献 2:特許第 3310662号
特許文献 3:国際公開 2003Z029441号
特許文献 4:国際公開 2004Z074480号
特許文献 5:国際公開 2004Z072302号 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 上記した従来技術の現状に鑑み、本発明者らは、多種遺伝子同時検出にも対応し たパルサー法による検出感度の向上を可能にすべく鋭意研究を重ねてきた。その結 果、ノルサ一法に適したアシストプローブのデザイン方法を見出した。本発明は、パ ルサ一法における感度の向上と多遺伝子同時検出が可能なターゲット遺伝子の検 出方法、該方法に用いられるアシストプローブ、並びに該アシストプローブを用いた シグナルプローブポリマーの形成方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 上記課題を解決するため、本発明者らはアシストプローブのデザインについて鋭意 研究を重ねた結果、パルサー法に最適なアシストプローブの設計方法を見出し、本 発明を完成させるに至った。即ち、本発明のターゲット遺伝子の検出方法は、 5'端 部から順に核酸領域 X、核酸領域 Y及び核酸領域 Zが設けられ、下記化学式(1)の 構造を有する、 3箇所の核酸領域からなる第 1プローブ (HCP— 1とも称する)と、 [化 4]
Figure imgf000005_0001
5'端部から順に核酸領域 Χ'、核酸領域 Y'及び核酸領域 Z'が設けられ、下記化 学式 (2)の構造を有する、 3箇所の核酸領域力もなる第 2プローブ (HCP - 2とも称 する)と、
[化 5]
3, 扁 , 5, - - ■ ( 2 )
Ζ' Υ' X,
(前記化学式(1)及び (2)において、核酸領域 Xと核酸領域 X'、核酸領域 Υと核酸 領域 Y'、核酸領域 Ζと核酸領域 Z'はそれぞれハイブリダィズ可能な相補的領域であ る)
力もなる一対の第 1及び第 2プローブ (HCPとも称する)、並びに複数の前記第 1プロ ーブと同じ核酸領域及びターゲット遺伝子にハイブリダィズ可能なターゲット領域を 有するアシストプローブを用い、シグナルプローブポリマーを形成させて、ターゲット 遺伝子を検出する方法であって、前記アシストプローブ力 5'端部から順に前記核 酸領域 X、前記核酸領域 Y、前記核酸領域 X及び前記ターゲット領域が設けられた 構造、又は 5'端部力 順に前記ターゲット領域、前記核酸領域 Ζ、前記核酸領域 Υ 及び前記核酸領域 Ζが設けられた構造を有することを特徴とする。
[0007] 前記アシストプローブとして、前記ターゲット領域と前記核酸領域 X又は前記核酸 領域 Ζとの間に、更にターゲット遺伝子並びに前記第 1及び第 2プローブにハイブリダ ィズしな!/、スぺーサー領域を有するものを用いても良 、。
[0008] また、前記アシストプローブとして、 5 '端部から順に前記核酸領域 X、前記核酸領 域 Υ及び前記核酸領域 Xからなる ΧΥΧ領域と、前記核酸領域 Υ及び前記核酸領域 Xからなる ΥΧ領域と、前記ターゲット領域とを含むアシストプローブを用いても良 、。 前記 ΧΥΧ領域と前記 ΥΧ領域との間に、更にターゲット遺伝子並びに前記第 1及び 第 2プローブにハイブリダィズしな 、スぺーサー領域を含むことが好まし 、。
[0009] また、前記アシストプローブとして、 5'端部力も順に前記ターゲット領域と、前記核 酸領域 Ζ及び前記核酸領域 Υからなる ΖΥ領域と、前記核酸領域 Ζ、前記核酸領域 Υ 及び前記核酸領域 Ζカゝらなる ΖΥΖ領域とを含むアシストプローブを用いても良 ヽ。 前記 ΖΥ領域と前記 ΖΥΖ領域との間に、更にターゲット遺伝子並びに前記第 1及び 第 2プローブにハイブリダィズしな 、スぺーサー領域を含むことが好まし 、。
[0010] 本発明のターゲット遺伝子の検出方法力 前記アシストプローブを前記ターゲット 遺伝子を铸型としてライゲーシヨン反応させる反応工程を含み、該ノ、イブリダィゼー シヨン反応を利用してターゲット遺伝子を検出することが可能である。
また、本発明のターゲット遺伝子の検出方法力 前記アシストプローブが 3'側ター ゲット領域にポリ dT又はプライマー配列を有し、前記アシストプローブをプライマーと し、ターゲット RNAを铸型として逆転写させる反応工程を含み、該逆転写反応を利 用してターゲット遺伝子を検出することができる。
本発明のターゲット遺伝子の検出方法において、前記ターゲット領域のみ異なる複 数のアシストプローブを用いることにより、複数のターゲット遺伝子を同時に検出する ことができる。
[0011] 本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法は、 5'端部から順に核酸領域 X、 核酸領域 Y及び核酸領域 Zが設けられ、下記化学式(1)の構造を有する、 3箇所の 核酸領域力 なる第 1プローブと、
[化 6]
X Y Z
5, #'†^! , H,a!aili'i'illirii'i'T',rn"rv i \ ηψ 3, ■ ■ ■ ( 1 )
5'端部から順に核酸領域 χ'、核酸領域 Y'及び核酸領域 ζ'が設けられ、下記化 学式 (2)の構造を有する、 3箇所の核酸領域からなる第 2プローブと、
[化 7]
Figure imgf000007_0001
Z, Y, X,
(前記化学式(1)及び (2)において、核酸領域 Xと核酸領域 X'、核酸領域 Yと核酸 領域 Y'、核酸領域 Zと核酸領域 Z'はそれぞれハイブリダィズ可能な相補的領域であ る)
からなる一対の第 1及び第 2プローブと、複数の前記第 1プローブと同じ核酸領域及 びターゲット遺伝子にハイブリダィズ可能なターゲット領域を有するアシストプローブ とを用い、前記一対の第 1及び第 2プローブの複数対と前記アシストプローブと前記 ターゲット遺伝子とを反応させ、シグナルプローブポリマーを形成させる方法であって 、前記アシストプローブが、 5'端部から順に前記核酸領域 X、前記核酸領域 Y、前記 核酸領域 X及び前記ターゲット領域が設けられた構造を有する、又は 5'端部から順 に前記ターゲット領域、前記核酸領域 Ζ、前記核酸領域 Υ及び前記核酸領域 Ζが設 けられた構造を有することを特徴とする。
[0012] 本発明のアシストプローブの第 1の態様は、前記本発明方法に用いられるアシスト プローブであって、 5'端部から順に前記核酸領域 X、前記核酸領域 Υ及び前記核酸 領域 Xを有する ΧΥΧ領域と、前記ターゲット領域とが設けられた構造を有することを 特徴とする。 前記アシストプローブとして、前記ターゲット領域がポリ dT又はプライマー配列を有 するアシストプローブを用いても良い。
[0013] 前記アシストプローブとして、前記 XYX領域と前記ターゲット遺伝子との間に、更に 前記核酸領域 Y及び前記核酸領域 Xからなる YX領域、及び,又はターゲット遺伝 子並びに前記第 1及び第 2プローブにハイブリダィズしな 、スぺーサー領域、を含む アシストプローブを用いても良 、。
[0014] 本発明のアシストプローブの第 2の態様は、前記本発明方法に用いられるアシスト プローブであって、 5'端部力 順に前記ターゲット領域と、前記核酸領域 Z、前記核 酸領域 Y及び前記核酸領域 Zを有する ZYZ領域とが設けられた構造を有することを 特徴とする。
前記アシストプローブとして、前記ターゲット領域側の 5'末端にリン酸基を有するァ シストプローブが用いられる。
[0015] 前記アシストプローブとして、前記 ZYZ領域と前記ターゲット遺伝子との間に、更に 前記核酸領域 Y及び前記核酸領域 Zからなる YZ領域、及び Z又はターゲット遺伝子 並びに前記第 1及び第 2プローブにハイブリダィズしな 、スぺーサー領域、を含むァ シストプローブを用いてもよ!、。
[0016] 本発明のシグナルプローブポリマーは、前記本発明方法により形成されることを特 徴とする。
発明の効果
[0017] 本発明によれば、パルサー法を利用したターゲット遺伝子の検出感度を著しく向上 させることができる。また、本発明のアシストプローブのターゲット領域を変化させる事 により多種遺伝子も同時に検出する事が可能である。
図面の簡単な説明
[0018] [図 1]本発明のアシストプローブの第 1の例を示す概略説明図である。
[図 2]図 1のアシストプローブに HCP— 2及びターゲット遺伝子が結合した模式図で ある。
[図 3]図 1のアシストプローブを用いたシグナルプローブポリマーの形成方法の一例を 示す概略説明図である。 [図 4]アシストプローブの一例を示す概略説明図である。
[図 5]図 4のアシストプローブに HCP— 2及びターゲット遺伝子が結合した模式図で ある。
[図 6]アシストプローブの他の例を示す概略説明図である。
[図 7]本発明のアシストプローブの第 2の例を示す概略説明図である。
[図 8]本発明のアシストプローブの第 3の例を示す概略説明図である。
[図 9]図 8のアシストプローブに HCP— 2及びターゲット遺伝子が結合した模式図で ある。
[図 10]本発明のアシストプローブの第 4の例を示す概略説明図である。
[図 11]本発明のアシストプローブの第 5の例を示す概略説明図である。
[図 12]図 11のアシストプローブに HCP— 2及びターゲット遺伝子が結合した模式図 である。
[図 13]本発明のアシストプローブの第 6の例を示す概略説明図である。
[図 14]本発明のアシストプローブの第 7の例を示す概略説明図である。
[図 15]図 14のアシストプローブ及びライゲーシヨン反応を利用したターゲット遺伝子 の検出方法の工程順の一例を示す概略説明図であり、(a)はターゲット遺伝子、(b) は支持体に結合された捕捉用プローブを示す。
[図 16]図 14のアシストプローブ及びライゲーシヨン反応を利用したターゲット遺伝子 の検出方法の工程順の一例におけるステップ 100を示す概略説明図である。
[図 17]図 14のアシストプローブ及びライゲーシヨン反応を利用したターゲット遺伝子 の検出方法の工程順の一例におけるステップ 104を示す概略説明図である。
[図 18]図 14のアシストプローブ及びライゲーシヨン反応を利用したターゲット遺伝子 の検出方法の工程順の一例におけるステップ 106を示す概略説明図である。
[図 19]本発明のアシストプローブの第 8の例を示す概略説明図である。
[図 20]図 19のアシストプローブ及び逆転写反応を利用したターゲット遺伝子の検出 方法の工程順の一例におけるステップ 200を示す概略説明図である。
[図 21]図 19のアシストプローブ及び逆転写反応を利用したターゲット遺伝子の検出 方法の工程順の一例におけるステップ 202を示す概略説明図である。 [図 22]図 19のアシストプローブ及び逆転写反応を利用したターゲット遺伝子の検出 方法の工程順の一例におけるステップ 204を示す概略説明図である。
[図 23]図 19のアシストプローブ及び逆転写反応を利用したターゲット遺伝子の検出 方法の工程順の一例におけるステップ 206を示す概略説明図である。
符号の説明
[0019] 10a〜: LOh:本発明のアシストプローブ、 11a, l ib :アシストプローブ、 12、 12a、 1 2b :ターゲット遺伝子、 14 :HCP— 2、 16 :HCP—1、 18 :シグナルプローブポリマー 、 20 :捕捉用プローブ、 22 :支持体、 24 :アシストプローブ 10gと捕捉用プローブ 20 の隣接部分、 26 :プローブ。
発明を実施するための最良の形態
[0020] 以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的 に示されるもので、本発明の技術思想力 逸脱しない限り種々の変形が可能なことは いうまでもない。
[0021] 図 1は本発明のアシストプローブの第 1の例を示す概略説明図であり、図 2及び図 3 は図 1のアシストプローブを用いたシグナルプローブポリマーの形成方法の一例を示 す概略説明図である。図 4は従来のアシストプローブの一例を示す概略説明図であり 、図 5は図 4のアシストプローブにターゲット遺伝子及び HCPの一方が結合した模式 図である。図 6はアシストプローブの他の例を示す概略説明図である。
[0022] パルサー法に用いられるアシストプローブとしては、 HCPの一方(HCP— 1)をその ままアシストプローブとして使用するものや、図 4に示した如ぐ HCPの一方(HCP— 1)にターゲットに相補的な配列(ターゲット領域)を追加したデザインのものがあった 。図 4に示したアシストプローブ 11aは、 5'端部力も順に、 HCP— 1と同じ核酸領域 X 、核酸領域 Y及び核酸領域 Zからなる HCP領域と、ターゲット遺伝子と相補的なター ゲット領域 Tを有し、図 5に示した如ぐ HCP領域は 1領域ごとに HCP— 2 (符号 14) に結合するものである。なお、本発明において、前記核酸領域 X、 Y及び Zカゝらなる 群力 選択される複数の核酸領域力 なる領域を HCP領域と称する。
[0023] 本発明のアシストプローブは、少なくとも 1本の HCP— 2と 2領域で結合できるように し、かつ残った領域で別の HCP— 2とも結合できるようにしたものである。 図 1に本発明のアシストプローブの一例を示す。図 1において、 10aは本発明のァ シストプローブの第 1の例であり、ターゲット領域 Tと HCP領域とからなり、 HCP領域 として 3領域を有するが、 5'端部から XYZではなぐ XYXの 3領域を有している(即ち 、 5'—XYX—T—3' )。従って、 HCP— 2 (符号 14)とアシストプローブ 10aを反応さ せると、図 2に示した如ぐアシストプローブは、 1本の HCP— 2と 3領域中、 2領域連 続で結合し、残り 1領域がポリマー形成のため別の HCP— 2と結合する。よって、一 対の HCP (符号 14, 16)の複数対、アシストプローブ 10a及びターゲット遺伝子 12を 反応させることにより、図 3に示した如ぐ一対の HCP力 形成されたポリマー、アシス トプローブ及びターゲット遺伝子の複合体からなるシグナルプローブポリマー 18が形 成される。
[0024] 但し、本発明において、図 6に示した如ぐ結合の際に、アシストプローブの HCP領 域側の末端と HCP— 2の末端が一致するようなデザインは逆にシグナルが低下する ため、アシストプローブの HCP領域側の末端力 HCP— 2と結合する時、 HCP— 2 の末端と重ならないように、アシストプローブをデザインする必要がある。図 6におい て、 l ibはアシストプローブの他の例である。
[0025] 図 7は、本発明のアシストプローブの第 2の例を示す概略説明図である。
図 1においては、 3'側にターゲット領域を設けたアシストプローブを示した力 ター ゲット領域と HCP領域の位置に特に限定はなぐ 5'側にターゲット領域を設けたァシ ストプローブも本発明に含まれるものである。 5'側にターゲット領域を設けた場合の アシストプローブの一例としては、図 7に示した如ぐ 5'側にターゲット領域 Tを、 3'側 に ZYZの 3領域からなる HCP領域を設けたアシストプローブ 10b (5' -T-ZYZ- 3 ' )力挙げられる。
[0026] 図 8は本発明のアシストプローブの第 3の例を示す概略説明図であり、図 9は図 8の アシストプローブに HCPの一方 (HCP— 2)及びターゲット遺伝子が結合した模式図 である。図 10は本発明のアシストプローブの第 4の例を示す概略説明図である。 本発明のアシストプローブとして、 2本以上の HCP— 2と 1本のアシストプローブとが それぞれ 2領域連続で結合できるようにしたものを用いても良!、。
[0027] 例えば、図 8に示した如ぐ 5'末端の第 1の HCP領域 (XYX)と 3'末端のターゲット 領域 Tとの間に、 HCP— 2と 2領域連続して結合できる ΧΥの 2領域を有する第 2の Η じ?領域を揷入したァシストプローブ10。(5'— ^ー^ー丁ー3' )が挙げられる。 該アシストプローブ 10cと HCP— 2を反応させると、図 9に示した如ぐ 1本のアシスト プローブ 10cは、 2本の HCP— 2とそれぞれ 2領域連続で結合する。
[0028] また、図 10に示した如ぐ 5'末端のターゲット領域 Tと 3'末端の第 1の HCP領域 (Z YZ)との間に、 HCP— 2と 2領域連続して結合できる ZYの 2領域を有する第 2の HC P領域を挿入したアシストプローブ 10d (5, -T-ZY-ZYZ- 3, )を用いても良!ヽ。 なお、図 8及び図 10では第 2の HCP領域を 1個挿入した場合の例を示したが、該 第 2の HCP領域を複数有するアシストプローブを用いることも可能である。
[0029] 図 11は本発明のアシストプローブの第 5の例を示す概略説明図であり、図 12は図 11のアシストプローブに HCPの一方(HCP— 2)及びターゲット遺伝子が結合した模 式図である。図 13は本発明のアシストプローブの第 6の例を示す概略説明図である 本発明のアシストプローブとして、ターゲット配列や HCPに全く関係のない配列(Sp acer配列)をもつスぺーサー領域 Sを、ターゲット領域と HCP領域の間や第 1の HCP 領域と第 2の HCP領域の間に挿入したアシストプローブを用いることにより、シグナル 検出の感度が上昇する場合もある。
本発明のアシストプローブにおいて、スぺーサー領域の塩基数は特に限定されな いが、 0〜5塩基が好ましい。
[0030] 前記スぺーサー領域を有するアシストプローブとしては、例えば、ターゲット領域と HCP領域の間にスぺーサー領域を挿入したアシストプローブ [5 ' -XYX-S-T- 3,(図 11のアシストプローブ— 10e参照)、又は 5,— T— S— ZYZ— 3,]、第 1の HC P領域と第 2の HCP領域との間にスぺーサー領域を挿入したアシストプローブ [5,一 XYX-S -YX-T- 3' (図 13のアシストプローブ— 10f参照)、又は 5,— T— ZY— S— ZYZ— 3,]、ターゲット領域と第 2の HCP領域との間にスぺーサー領域を挿入し たアシストプローブ [5,— XYX— YX— S— T— 3,、又は 5,— T— S— ZY— ZYZ— 3, ]、並びにターゲット領域と第 2の HCP領域の間及び第 2の HCPと第 1の HCP領 域の間の両方にスぺーサー領域を挿入したアシストプローブ [5'— XYX— S— YX — S— T— 3'、又は 5 '— T— S— ZY— S— ZYZ— 3' ]等が挙げられる。
[0031] 図 14は、ライゲーシヨン反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法に用いられる アシストプローブの一例を示す概略説明図であり、 10gは本発明のアシストプローブ の第 7の例である。図 14に示した如ぐアシストプローブとして、ターゲット領域の 5' 末端をリン酸化させたアシストプローブを用いることにより、ライゲーシヨン反応を利用 したターゲット遺伝子の検出方法 (例えば、特許文献 4等参照。)にも好適に使用す ることがでさる。
[0032] 前記ライゲーシヨン反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法の一例を以下に説 明する。図 15〜図 18は、図 14に示したアシストプローブ及びライゲーシヨン反応を 利用した本発明のターゲット遺伝子の検出方法の工程順の一例を示す概略説明図 である。
図 15において、(a)はターゲット遺伝子 (符号 12a)を示し、(b)は該ターゲット遺伝 子に相補的な領域 Tを 3 '端側に有する捕捉用プローブ (キヤプチヤープローブ:符
2
号 20)を結合させた支持体 22を示す。図 16は、アシストプローブ 10g、捕捉用プロ ーブ 20及びターゲット遺伝子 12aが結合した概略説明図である。図 17は、ターゲット 遺伝子 12aを解離させ、アシストプローブ 10gを連結させた捕捉用プローブ 20が支 持体 24に結合して ヽる状態を示す。
[0033] 図 14〜図 16に示した如ぐ前記アシストプローブ 10g及び前記捕捉用プローブ 20 は、アシストプローブ 10gと捕捉用プローブ 20をターゲット遺伝子 12aに結合させる 時に、該捕捉用プローブ 20の末端と該アシストプローブ 10gの末端が隣接する状態 でターゲット遺伝子 12aとアニーリングするように構成されて!、る。
[0034] 図 16に示した如ぐアシストプローブ 10g及び捕捉用プローブ 20をターゲット遺伝 子 12aにハイブリダィズさせる(ステップ 100)。その後、リガーゼを用いたライゲーショ ン反応を行う(ステップ 102)。前記アシストプローブ 10gと前記捕捉用プローブ 20の 隣接部分 24の配列がターゲット遺伝子 12aの配列と相補的な場合にのみ、該ラィゲ ーシヨン反応により前記アシストプローブ 10gと前記捕捉用プローブ 20は連結される
[0035] 前記ライゲーシヨン反応後、前記ターゲット遺伝子 12aを除去する (ステップ 104)。 前記アシストプローブ lOgと前記捕捉用プローブ 20の隣接部分 24の配列がターゲッ ト遺伝子 12aの配列と相補的な場合は、図 17に示した如ぐアシストプローブ 10gを 連結させた捕捉用プローブ 20が支持体 24に結合した状態となる。
その後、一対の HCP (14、 16)の複数対を添カ卩し、ノ、イブリダィゼーシヨン反応をさ せることにより(ステップ 106)、図 18に示した如ぐ支持体上に一対の HCPから形成 されたポリマー、アシストプローブ及びターゲット遺伝子の複合体力 なるシグナルプ ローブポリマー 18が形成される。
[0036] 一方、前記アシストプローブ 10gと前記捕捉用プローブ 20の隣接部分 24の配列が ターゲット遺伝子の配列と相補的でない場合は、前記ステップ 102後、前記アシスト プローブ 10gと前記捕捉用プローブ 20は連結されず、ターゲット遺伝子を除去後、 捕捉用プローブ 20のみ支持体 24に結合した状態となる。従って、その後、一対の H CPの複数対を添加し、形成させたポリマーは支持体上に捕捉されず、洗浄等により 除去される。
[0037] よって、支持体上に捕捉されたシグナルプローブポリマーを検出することによりター ゲット遺伝子を検出することができる。得に、前記アシストプローブ 10gと前記捕捉用 プローブ 20の隣接部分 24がターゲット遺伝子の変異部位に位置するように構成する ことにより、変異遺伝子を検出することができる。
[0038] 図 19は、逆転写反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法に用いられるアシスト プローブの一例を示す概略説明図であり、 10hは本発明のアシストプローブの第 8の 例である。図 15に示した如ぐアシストプローブとして 3'側ターゲット領域にポリ dT配 列など逆転写反応のプライマーとして利用できる配列を有するアシストプローブを用 いることにより、逆転写反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法 (例えば、特許文 献 5等参照。)にも好適に使用することができる。
[0039] 前記逆転写反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法の一例を以下に説明する 。図 20〜23は、アシストプローブ及び逆転写反応を利用した本発明のターゲット遺 伝子の検出方法の工程順の一例を示す断面概略説明図である。図 20〜図 23にお いては、ターゲット遺伝子が mRNAであり、アシストプローブとして、 3'末端のターゲ ット領域にポリ dTを有し、 5'側に XYXの 3領域を有する HCP領域を設けたアシスト プローブ lOhを用いた場合の例を示した。
[0040] ターゲット遺伝子である mRNA (符号 12b)のポリ Aテール部分に 3'末端にポリ dT を含むアシストプローブ 10hを結合させ (ステップ 200、図 20)、該アシストプローブ 1 Ohをプライマーとして用いて、逆転写反応により mRNAの逆転写反応を行い、該ァ シストプローブ及び該 mRNAの cDNA領域からなるプローブ 26を形成させる(ステツ プ 202、図 21)。
[0041] 次に、図 22に示した如ぐ mRNAを前記プローブ 26から解離させ、 cDNA領域と XYXの HCP領域を有する一本鎖のオリゴヌクレオチドとする(ステップ 204)。
解離後のプローブ 26を、 mRNAの cDN領域に相補的な領域を有する捕捉用プロ ーブ 28にハイブリダィズさせ、前記プローブ 26を捕捉する(ステップ 206、図 23)。な お、前記捕捉用プローブを予め支持体 22に結合させておくことが好ましい。
[0042] その後、一対の HCPの複数対を添加し、ハイブリダィゼーシヨン反応をさせることに より(ステップ 208)、捕捉用プローブ 28で捕捉されたシグナルプローブポリマーが形 成され、該シグナルプローブポリマーを検出することにより、ターゲット遺伝子を検出 することができる。
実施例
[0043] 以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明する力 これらの実施例は例 示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでな 、ことは 、うまでもな!/、。
[0044] (実施例 1)
1.材料
ノ レサ一法で用いられる一対の HCPとして、 5'末端を Cy3標識した下記塩基配列 を有するオリゴヌクレオチド ·プローブ(HCP— 1 A及び HCP— 2A)を用 、た。
HCP— 1Aの塩基配列(配列番号 1)
5'- Cy3- X領域(CGTATCAATGATAGCCGATC) · Y領域(CGCCTAAGTTCGATA TAGTC) · Z領域(CGCGTATACTAAGCGTAATG) -3'
HCP— 2Aの塩基配列(配列番号 2)
5'- Cy3- X,領域(GATCGGCTATCATTGATACG) · Y,領域(GACTATATCGAACT TAGGCG) · Z,領域 (CATTACGCTTAGTATACGCG) - 3' [0045] ターゲット DNAとして、 ApolipoproteinE (ApoE)由来の塩基配列を有する合成 DN A (ターゲット DNA— 1)を用いた。
ターゲット DNA— 1の塩基配列(配列番号 3)
5,
G
ACCGCGGCGAGGTGCAGGCCAT-3'
[0046] アシストプローブとして、前記 HCP— 1Aの 3領域中 2領域を XYXの順で含み、 3, 末端にターゲット DNA— 1と相補する配列の領域 (T領域)を有する下記アシストプロ 一ブー 1を用いた。
アシストプローブ 1の塩基配列(配列番号 4)
5し X領域 (CGTATCAATGATAGCCGATC) . Y領域(CGCCTAAGTTCGATATAG TC) ·Χ領域(CGTATCAATGATAGCCGATC) ·Τ領域(GTACTGCACCAGGCGGC CGC) -3'
[0047] キヤプチヤープローブとして、前記ターゲット DNA— 1に相補的な塩基配列を有す る下記キヤプチヤープローブ 1を用いた。
キヤプチヤープローブ 1の塩基配列(配列番号 5)
CCTTGGACAGCCG-NH - 3'
2
[0048] 2.方法
(2— 1)第 1ハイブリダィゼーシヨン
下記組成の第 1ハイブリダィゼーシヨン溶液 (全量 50 μ L)を調製し、該溶液を 95°C で 2分間反応させ、 68°Cで 120分間反応させた後、 15°Cに保持した。
〈第 1ハイブリダィゼーシヨン溶液の組成〉
微小粒子 (前記キヤプチヤープローブ 1を表面に固定したポリスチレン製粒子): 5 00個
アシストプローブ 1: lpmol
ターゲット DNA— 1 : 0, 100又は 500amol
3M TMAC 0. 1% N-Lauroylsarcosine
50mM Tris— HCl (pH8. 0)
4mM EDTA(pH8. 0)
[0049] (2- 2)第 2ハイブリダィゼーシヨン(パルサー法)
前記第 1ハイブリダィゼーシヨン後の溶液に下記組成になるように 50 μ Lの HCP溶 液を添加し (最終量 100 L)、 68°Cで 60分間反応させた後、 15°Cに保持した。な お、 HCP溶液は添加前に 95°C 2分間の熱処理を行つた。
〈第 2ハイブリダィゼーシヨン溶液の組成〉
HCP— lA: 50pmol
HCP— 2A: 50pmol
3M TMAC
0. 1% N-Lauroyisarcosine
50mM Tris— HCl (pH8. 0)
4mM EDTA(pH8. 0)
[0050] (2— 3)測定
前記第 2ハイブリダィゼーシヨン後、フローサイトメーターにて測定を行った。測定は 、フローサイトメーターとして LuminexlOO (Luminex社製)を使用し、各項目 100個前 後微小粒子の蛍光強度を測定後、中央値を求めた。結果を表 1に示す。なお、数値 はブランク値を引 、た値を示した。
[0051] [表 1]
Figure imgf000017_0001
(実施例 2)
アシストプローブとして、前記アシストプローブ 1の XYX領域と T領域との間に 5つ のポリ dTからなるスぺーサー領域 Sと YX領域を挿入した下記アシストプローブ 2を 用いた以外は実施例 1と同様に実験を行った。結果を表 1に示す。 アシストプローブ 2の塩基配列(配列番号 6)
5し X領域 (CGTATCAATGATAGCCGATC) . Y領域(CGCCTAAGTTCGATATAG TC) ·Χ領域(CGTATCAATGATAGCCGATC) ' S領域(ΤΤΤΤΤ) ·Υ領域(CGCCTA AGTTCGATATAGTC) ·Χ領域(CGTATCAATGATAGCCGATC) ·Τ領域(GTACT GCACCAGGCGGCCGC) - 3'
[0053] (比較例 1)
アシストプローブとして、従来のアシストプローブである下記アシストプローブ 3を 用いた以外は実施例 1と同様に実験を行った。結果を表 1に示す。
アシストプローブ 3の塩基配列(配列番号 7)
5し X領域 (CGTATCAATGATAGCCGATC) . Y領域(CGCCTAAGTTCGATATAG TC) ·Ζ領域(CGCGTATACTAAGCGTAATG) ·Τ領域(GTACTGCACCAGGCGGC CGC) -3'
[0054] 表 1に示した如ぐ本発明のアシストプローブを用いた実施例 1及び 2は、従来のァ シストプローブを用いた比較例 1に比べてシグナルが著しく上昇した。

Claims

請求の範囲
[1] 5 '端部から順に核酸領域 X、核酸領域 Y及び核酸領域 Zが設けられ、下記化学式
(1)の構造を有する、 3箇所の核酸領域からなる第 1プローブと、
[化 1]
X Y Z
5 m f ■'" ΤΤΠΤ'Ί'Ι' Ι'ΤΤΓ 3' · · ■ ( "! )
5 '端部から順に核酸領域 Χ'、核酸領域 Υ'及び核酸領域 Ζ'が設けられ、下記化 学式 (2)の構造を有する、 3箇所の核酸領域からなる第 2プローブと、
[化 2]
->» ij !l ΙιιιΊ ' 1 ΊιΙ 1 Lnil I I it1 1 1 1 1 J J 1 . . . r 2 ^
Z Y X'
(前記化学式(1)及び (2)において、核酸領域 Xと核酸領域 X'、核酸領域 Yと核酸 領域 Y'、核酸領域 Zと核酸領域 Z'はそれぞれハイブリダィズ可能な相補的領域であ る)
力 なる一対の第 1及び第 2プローブ、並びに複数の前記第 1プローブと同じ核酸領 域及びターゲット遺伝子にハイブリダィズ可能なターゲット領域を有するアシストプロ ーブを用い、シグナルプローブポリマーを形成させて、ターゲット遺伝子を検出する 方法であって、前記アシストプローブが、 5 '端部から順に前記核酸領域 X、前記核酸 領域 Y、前記核酸領域 X及び前記ターゲット領域が設けられた構造、又は 5 '端部か ら順に前記ターゲット領域、前記核酸領域 Ζ、前記核酸領域 Υ及び前記核酸領域 Ζ が設けられた構造を有することを特徴とするターゲット遺伝子の検出方法。
[2] 前記アシストプローブが、前記ターゲット領域と前記核酸領域 X又は前記核酸領域 Ζとの間に、更にターゲット遺伝子並びに前記第 1及び第 2プローブにハイブリダィズ しないスぺーサー領域を有することを特徴とする請求項 1記載のターゲット遺伝子の 検出方法。
[3] 前記アシストプローブが、 5 '端部から順に前記核酸領域 X、前記核酸領域 Υ及び 前記核酸領域 Xからなる ΧΥΧ領域と、前記核酸領域 Υ及び前記核酸領域 Xからなる YX領域と、前記ターゲット領域とを含む、又は 5'端部力 順に前記ターゲット領域と 、前記核酸領域 Ζ及び前記核酸領域 Υからなる ΖΥ領域と、前記核酸領域 Ζ、前記核 酸領域 Υ及び前記核酸領域 Ζからなる ΖΥΖ領域とを含むことを特徴とする請求項 1又 は 2記載のターゲット遺伝子の検出方法。
[4] 前記 ΧΥΧ領域と前記 ΥΧ領域との間、又は前記 ΖΥ領域と前記 ΖΥΖ領域との間に、 更にターゲット遺伝子並びに前記第 1及び第 2プローブにハイブリダィズしないスぺ ーサー領域を含むことを特徴とする請求項 3記載のターゲット遺伝子の検出方法。
[5] 前記アシストプローブを前記ターゲット遺伝子を铸型としてライゲーシヨンさせる反 応工程を含むことを特徴とする請求項 1〜4のいずれか 1項記載のターゲット遺伝子 の検出方法。
[6] 前記アシストプローブが 3 '末端のターゲット領域にポリ dT又はプライマー配列を有 し、前記アシストプローブをプライマーとし、ターゲット RNAを铸型として逆転写させる 反応工程を含むことを特徴とする請求項 1〜4のいずれか 1項記載のターゲット遺伝 子の検出方法。
[7] 前記ターゲット領域のみ異なる複数のアシストプローブを用いることにより、複数の ターゲット遺伝子を同時に検出することを特徴とする請求項 1〜6のいずれか 1項記 載のターゲット遺伝子の検出方法。
[8] 5 '端部から順に核酸領域 X、核酸領域 Y及び核酸領域 Zが設けられ、下記化学式
(1)の構造を有する、 3箇所の核酸領域からなる第 1プローブと、
[化 3]
5,
Figure imgf000020_0001
3' ■ ■ ■ ( "! )
5'端部から順に核酸領域 X'、核酸領域 Y'及び核酸領域 Z'が設けられ、下記化 学式 (2)の構造を有する、 3箇所の核酸領域からなる第 2プローブと、
[化 4] , ytfliiiilniiliiiilii iliil iiiii 11 1 I I il il 1 H J J H J , ■ ■ ■ ^ ^
Z, Y, X' (前記化学式(1)及び (2)において、核酸領域 Xと核酸領域 X'、核酸領域 Yと核酸 領域 Y'、核酸領域 Zと核酸領域 Z'はそれぞれハイブリダィズ可能な相補的領域であ る)
からなる一対の第 1及び第 2プローブと、複数の前記第 1プローブと同じ核酸領域及 びターゲット遺伝子にハイブリダィズ可能なターゲット領域を有するアシストプローブ とを用い、前記一対の第 1及び第 2プローブの複数対と前記アシストプローブと前記 ターゲット遺伝子とを反応させ、シグナルプローブポリマーを形成させる方法であって 、前記アシストプローブが、 5'端部から順に前記核酸領域 X、前記核酸領域 Y、前記 核酸領域 X及び前記ターゲット領域が設けられた構造を有する、又は 5'端部から順 に前記ターゲット領域、前記核酸領域 Ζ、前記核酸領域 Υ及び前記核酸領域 Ζが設 けられた構造を有することを特徴とするシグナルプローブポリマーの形成方法。
請求項 1〜8のいずれか 1項記載の方法に用いられ、 5'端部から順に前記核酸領 域 X、前記核酸領域 Υ及び前記核酸領域 Xを有する ΧΥΧ領域と、前記ターゲット領 域とが設けられた構造を有することを特徴とするアシストプローブ。
前記 ΧΥΧ領域と前記ターゲット遺伝子との間に、更に前記核酸領域 Υ及び前記核 酸領域 Xからなる ΥΧ領域、及び Ζ又はターゲット遺伝子並びに前記第 1及び第 2プ ローブにハイブリダィズしな ヽスぺーサー領域、を含むことを特徴とする請求項 9記載 のアシストプローブ。
請求項 1〜8のいずれか 1項記載の方法に用いられ、 5'端部力 順に前記ターゲッ ト領域と、前記核酸領域 Ζ、前記核酸領域 Υ及び前記核酸領域 Ζを有する ΖΥΖ領域 とが設けられた構造を有することを特徴とするアシストプローブ。
前記 ΖΥΖ領域と前記ターゲット遺伝子との間に、更に前記核酸領域 Υ及び前記核 酸領域 Ζカゝらなる ΥΖ領域、及び Ζ又はターゲット遺伝子並びに前記第 1及び第 2プ ローブにハイブリダィズしな ヽスぺーサー領域、を含むことを特徴とする請求項 11記 載のアシストプローブ。
前記ターゲット領域がポリ dT又はプライマー配列を有することを特徴とする請求項 9 又は 10記載のアシストプローブ。
前記ターゲット領域側の 5 '末端にリン酸基を有することを特徴とする請求項 11又は 12記載のアシストプローブ。
[15] 請求項 1〜8のいずれか 1項記載の方法により形成されるシグナルプローブポリマ
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