WO2006075429A1 - 酵素活性検出用粒子及びそれを用いた酵素活性の検出方法並びに酵素活性検出具 - Google Patents

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enzyme
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particle
sample solution
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Norikazu Nishino
Tamaki Kato
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Kyushu Institute Of Technology
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Definitions

  • Enzyme activity detection particles Enzyme activity detection particles, enzyme activity detection method using the same, and enzyme activity detection tool
  • the present invention relates to an enzyme activity detection particle for detecting enzyme activity, an enzyme activity detection method using the same, and an enzyme activity detector.
  • Patent Document 1 describes “a fluorescent probe in which both ends of a substrate peptide that is specifically cleaved by a caspase that is a type of proteolytic enzyme are modified with a fluorescent group that causes fluorescence resonance energy transfer”.
  • Patent Document 1 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-316598
  • Patent Document 1 The technology disclosed in (Patent Document 1) is based on the fact that the substrate peptide of the fluorescent probe placed in the solution is cleaved by the enzyme, so that the fluorescence resonance energy transfer of the fluorescent group of the substrate peptide is released and the fluorescence wavelength and fluorescence intensity The enzyme activity is detected by measuring this.
  • the fluorescent probe is supplied in the form of a lyophilized powder or a solution.
  • a predetermined amount of powder is weighed and dissolved in a solvent to prepare a solution at the time of use.
  • enzyme activity detection is not possible. Due to the lack of quantitativeness, it is necessary to weigh the powder with high accuracy and to check whether the fluorescent probe is completely dissolved in the prepared solution. Lack.
  • the freeze-dried powder often has a hygroscopic property.
  • the powder is agglomerated or swollen due to the adsorbed water adsorbed on the powder, so the weighing accuracy is reduced.
  • the concentration of the solution becomes inaccurate and lacks quantitativeness.
  • the present invention solves the above-mentioned conventional problems, and by measuring the intensity of the fluorescence wavelength of the sample solution, not only the presence of the enzyme but also the quantitative analysis of the enzyme in the sample solution can be performed with high accuracy. In addition, it is not easily affected by adsorbed water, and weighing errors are unlikely to occur, so it is easy to handle and can improve measurement accuracy and quantitativeness.
  • An object of the present invention is to provide particles for detecting enzyme activity, which do not require complicated processes such as processes, and are extremely excellent in productivity.
  • the present invention can detect the enzyme activity by simply contacting the sample solution containing the enzyme with the particles and then measuring the fluorescence intensity of the sample solution, thereby shortening the measurement time.
  • a microplate for fluorescence measurement such as a 96 well plate to perform a wide range of image analysis with an image sensor, multiple enzymes can be analyzed. Enzyme activity of a sample solution containing can be comprehensively measured and analyzed in a short time, the measurement efficiency can be dramatically improved, and the search and screening of useful substances that lead to pharmaceuticals can be performed with high efficiency. It is an object of the present invention to provide a method for detecting a possible enzyme activity.
  • the present invention can easily detect whether or not an active enzyme is contained in the sample solution by measuring the fluorescence intensity or the like of the sample solution that has passed, and has an excellent handling property.
  • the purpose is to provide.
  • the enzyme activity detection particles, the enzyme activity detection method and the enzyme activity detection tool using the same according to the present invention have the following configurations.
  • the particle for detecting enzyme activity according to claim 1 of the present invention comprises a particle and a first compound having one end of the particle and a first compound having a first fluorescent group bonded to the other end and a cleavage site by the enzyme. have.
  • the particle includes a particle at one end and the first compound having a first fluorescent group bonded to the other end and a cleavage site by an enzyme, the particle is in contact with a sample solution containing the enzyme. As a result, the first fluorescent group is cleaved at the cleavage site by the enzyme and released into the sample solution.
  • the enzyme activity can be detected using changes in the fluorescence intensity of the sample solution as an index.
  • the first fluorescent group If the first fluorescent group is not liberated in the sample solution and remains bound to the particle, it will be easily affected by the particle, such as irregular reflection on the surface of the particle when measuring the fluorescence wavelength, and the quantification will be reduced. However, there is a problem that the measurement accuracy is lowered. However, since the first fluorescent group is liberated in the sample solution, it is difficult to be affected by particles when measuring the fluorescence wavelength, and the quantitativeness is increased and the measurement accuracy can be improved.
  • the intensity of the fluorescence wavelength of the sample solution is proportional to the enzyme concentration in the sample solution. Therefore, by measuring the intensity of the fluorescence wavelength of the sample solution, quantitative analysis of the enzyme in the sample solution can be performed with high accuracy only by detecting the presence or absence of the enzyme.
  • the first compound bound to the particle surface adsorbs water, the first compound is larger than the particle size. Since the size of the compound is extremely small and the surface of the particles has fine irregularities, the particles do not adhere to each other due to adsorbed water. It can be used and has excellent handling.
  • the surface area of the particle is constant, the amount of the first compound bonded to the surface of one particle is almost constant, and the weight of the first compound bonded to the surface of the particle is the weight of the particle. Therefore, if the weight of the particles is uniform, the amount of the first compound, that is, the first fluorescent group is between the sample solutions. Variations can be minimized and the weighing accuracy can be improved, thereby improving the quantitativeness of fluorescence intensity and the like, and improving the quantitative analysis accuracy.
  • the particle force can be adjusted to the distance to the cutting site of the first compound and the enzyme can be operated without being affected by the particle.
  • the activity can be detected accurately and the detection accuracy can be improved.
  • the particles used here are made of synthetic resin such as polystyrene, inorganic material such as silica gel, glass, etc., and are formed in a substantially spherical, polyhedral or crushed shape. Of these, those formed in a substantially spherical or polyhedral shape are preferably used. Since the shape of the particles can be made uniform, the surface area of the particles per unit weight can be made constant, and the weight and surface area of the particles can be directly proportional to each other. If the amount of the fluorescent group bound to the particle is known, the amount of the fluorescent group bound to all the particles can be estimated by weighing the particles if the weight of the particles is uniform, and the measured fluorescence intensity force is also measured. It is also the ability to perform quantitative analysis of the enzymes in it.
  • Synthetic resin materials include chloroform, halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, and esters such as ethyl acetate, which are used in condensation reactions to form peptide bonds.
  • Solvents such as polar organic solvents such as N, N dimethylformamide and dimethyl sulfoxide, ethers such as dioxane and tetrahydrofuran, alcohols such as methanol and ethanol, and solvents such as pyridine are used.
  • Commercially available carriers for solid-phase organic synthesis such as lanthanum series (registered trademark) manufactured by Mimotobus can also be used.
  • the particle diameter of 0.05 to 0.5 mm is preferably used. This is because a peptide or the like can be bound to the particle surface using a commercially available automatic peptide synthesizer.
  • Particles whose surface is coated with polyethylene glycol are preferably used. This is because hydrophilicity and swelling property with respect to a solvent can be enhanced.
  • an amino acid or a substrate peptide in which two or more amino acids are peptide-bonded and contain a specific cleavage site of the enzyme is used.
  • a substrate peptide having a molecular chain in which a peptide or other compound or molecule is bound can also be used.
  • the first compound can be synthesized using a normal peptide synthesis method such as a solid phase method in which the C-terminal amino acid is immobilized on the particle and the peptide is also extended in C-terminal force.
  • a sequential extension method in which the desired amino acid sequence is sequentially extended from the C-terminal side to the N-terminal side
  • a fragment condensation method in which a plurality of short peptide fragments are synthesized and extended by coupling between peptide fragments, etc.
  • It can also be synthesized by introducing 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) amino acid, t-butyloxycarboxyl (Boc) amino acid, etc. using a peptide synthesizer.
  • a peptide bond can be generated using a protease, or it can be synthesized using genetic engineering.
  • a condensation method for forming a peptide bond in the first compound a known method can be used. For example, an azide method, an acid chloride method, an acid anhydride method, a mixed acid anhydride Method, DCC method, DCC additive method, active ester method, carbodiimidazole method, oxidation-reduction method, method using Woodward reagent K, etc. are used.
  • the first fluorescent group the first compound is cleaved at the peptide bond cleavage site by an enzyme.
  • a fluorescent group whose properties change and changes in fluorescence wavelength or fluorescence intensity is used.
  • fluorescent groups that cause changes in fluorescence wavelength or fluorescence intensity due to concentration quenching are also used. Concentration quenching is a phenomenon in which the fluorescence wavelength and intensity change when the fluorescent groups are close to each other on the particle and when they are released into the sample solution and the distance between the fluorescent groups is increased.
  • Examples of such a first fluorescent group include 4-methylcoumaryl-7amide (MCA), 7-amino-4-carboxymethylcoumarin (ACC), p-troa-lide, a-naphthylamide, a naphthyl ester, and fluorescein. Alternatively, derivatives thereof are used.
  • the fluorescence wavelength and fluorescence intensity of the first fluorescent group released from the particles are different from those of the first fluorescent group before release, so the amount of cleavage by the enzyme using the fluorescence intensity in a specific wavelength region as an index. Can be measured.
  • detectable enzymes include thrombin, plasmin, urokinase, elastase, collagenase and all other enzymes that cleave peptides.
  • the enzyme activity detection particle according to claim 2 of the present invention has a configuration in which the first fluorescent group is fluorescein or a derivative thereof.
  • the following operation can be obtained.
  • various fluorescent substances contained in the medicines appear in the urine of the subject. Since many of these fluorescent substances have a fluorescence wavelength of around 400 nm, when urine is used as it is as a sample solution, the first fluorescent group having a fluorescence wavelength of around 400 nm cannot be used. This is because the fluorescence of a fluorescent substance contained in a medicine or the like cannot be distinguished from the fluorescence of the first fluorescent group released into the sample solution by enzyme activity. Since fluorescein emits fluorescence at around 525 nm, it can be distinguished from the fluorescence wavelength of fluorescent substances contained in medicines, and the urine of a subject who takes medicines or vitamins can be used directly as a sample solution. Excellent versatility.
  • fluorescein derivative fluorescein isothiocyanate (FITC) or the like is used.
  • the enzyme activity detecting particle according to claim 3 of the present invention the second compound having a second fluorescent group at one end and a quencher bonded to an atomic group at the other end and having a cleavage site by the enzyme, Second compound
  • the structure includes the atomic group at the other end of the particle or the particle bonded to the quencher.
  • the fluorescence spectrum of the second fluorescent group changes as the distance between the quencher and the second fluorescent group increases. It can be used as an index for measuring enzyme activity, whereby enzyme activity can be detected using changes in fluorescence intensity as an index.
  • the quencher includes a substance that absorbs light corresponding to the fluorescence excitation wavelength of the second fluorescent group, a substance that forms a non-light-emitting complex by loose bonding with the second fluorescent group, A substance that causes fluorescence resonance energy transfer with a fluorescent group is used.
  • Fluorescence resonance energy transfer refers to the relationship between the excitation spectrum of the quencher (acceptor) and the fluorescence spectrum of the second fluorescent group (donor) when the second fluorescent group and the quencher are located at close distances.
  • the quencher deprives the excitation energy, and the phenomenon that the fluorescence of the second fluorescent group that should be observed attenuates.
  • the second fluorescent group or quencher a combination of a donor and an acceptor in which fluorescence resonance energy transfer occurs can be used.
  • a quencher that is an atomic group having an absorption band in the wavelength region overlapping the fluorescence wavelength of the second fluorescent group is used.
  • a quencher that is an atomic group having an absorption band in the wavelength region overlapping the fluorescence wavelength of the second fluorescent group.
  • MOAc (7-methoxycoumarin 1-yl) acetyl
  • ABz anthro-royl penzyl
  • Nma N-methylanthroleic acid
  • Dabsyl and EDANS (2'-aminoenotinole) aminonaphthalene 1-snorephonic acid), tryptophan (Trp) and 5-dimethylamino-1-naphthalenesulfonic acid (Dns)
  • Dns 5-dimethylamino-1-naphthalenesulfonic acid
  • an amino acid or a substrate peptide in which two or more amino acids are peptide-bonded and contain a specific cleavage site of the enzyme is used.
  • a substrate peptide having a molecular chain in which a peptide or other compound or molecule is bound can also be used.
  • the atomic group or quencher of the second compound may be directly bonded to the particle, or may be bonded to the particle via a molecular chain to which a peptide or other compound or molecule is bonded.
  • the bond between the quencher and the particle, the bond between the second compound's atomic group and the quencher, and the bond between the second compound's atomic group and the particle are amide bonds, ester bonds, ether bonds, and thioethers that are not cleaved by the enzyme. Bonds, urethane bonds, etc. are used. Even when the quencher is cleaved by the enzyme and the particle force is released, the fluorescence spectrum of the second fluorescent group changes, but the enzyme activity depending on the amino acid sequence of the second compound cannot be detected. .
  • the length between the second fluorescent group bonded to the second compound and the bonding portion of the quencher is preferably 100 A or less. Changes in the fluorescence intensity tend to decrease as the distance between the binding sites of the second fluorescent group and the quencher increases, and this tendency becomes significant when the distance exceeds 100 A, and the change in fluorescence intensity becomes significantly smaller. This is because of a decrease.
  • Examples of the enzyme capable of detecting the activity include serine proteases such as trypsin, chymotrypsin, thrombin, brassin, kallikrein, urokinase, and elastase, aspartic proteases such as pepsin, cathebcin D, renin, and chymosin, and carboxypeptidase. Endopeptidases that cleave internal peptide bonds such as A, B, collagenase, meta-oral proteases such as thermolysin, cysteine proteases such as cathebucin B, H, L, calpain, blood coagulation proteases, trapping proteases, hormones Examples include processing enzymes.
  • serine proteases such as trypsin, chymotrypsin, thrombin, brassin, kallikrein, urokinase, and elastase
  • aspartic proteases such as pepsin, cathebc
  • the invention according to claim 4 of the present invention is the enzyme activity detection particle according to any one of claims 1 to 3, wherein the first compound or the second compound is acetylated. It has a structure with a defined amino acid residue!
  • the substrate peptide is not cleaved or cleaved when the substrate peptide is acetylated. Changes in fluorescence intensity etc. are not detected even when contacted with a specific enzyme that significantly decreases. However, this specific enzyme and acetylated peptide force release the acetyl group.
  • the sample solution containing deacetylase is brought into contact with the enzyme activity detection particles, the deacetylase releases the acetyl group from the peptide, and the peptide from which the acetyl group is released is cleaved by the specific enzyme and identified.
  • Histone deacetylase one of the deacetylases, is involved in cell cycle progression and differentiation, and plays an important role in regulating the expression of various genes by altering the nucleosome structure. It has been reported that this regulation is associated with certain types of cancer, and that histone deacetylase inhibitors are effective for antitumor effects and leukemia treatments. It is known!
  • the ⁇ amino group and the side chain amino group are blocked with a protecting group.
  • a method for acetylating a certain amino acid with acetic anhydride, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ -hydroxysuccinimide acetate, or the like.
  • the method for detecting an enzyme activity according to claim 5 of the present invention comprises: (a) contacting a sample solution containing an enzyme with the enzyme activity detection particle according to any one of claims 1 to 3; A contact reaction step for reacting; and (b) a fluorescence measurement step for measuring fluorescence of the sample solution reacted with the enzyme activity detection particles.
  • the enzyme activity can be detected simply by measuring the fluorescence intensity of the sample solution after the sample solution containing the enzyme is brought into contact with the enzyme activity detection particles, the measurement time is shortened. It is possible to improve workability and increase measurement efficiency.
  • Enzyme activity detection particles with fluorescent groups bound to each of different types of peptides, etc. are placed in the wells of a 96-well microplate for fluorescence measurement, and the sample solution is placed in each well.
  • the sample solution containing the enzyme a body fluid or culture solution containing blood or urine to be subjected to pathological diagnosis or the like can be used.
  • a biological sample blood, etc.
  • a sample obtained by removing blood cell components etc. by a filter or centrifugation it is also possible to use those in which conditions are set (pH adjustment, introduction of an activator, etc.) such that the enzyme exhibits activity based on a biological sample.
  • a buffer such as Tris-HC1, Hepes-KOH can be added as a reaction buffer.
  • salts and active protective agents necessary for the expression of enzyme activity can be added.
  • the fluorescence measurement of the sample solution is performed by irradiating the sample solution with light from a light emitting element such as a light emitting diode through a filter that passes the excitation wavelength of the fluorescent group. It is also possible to use a method of measuring the fluorescence intensity or the like with a light receiving element such as a CCD arranged at a position where it can be detected.
  • the method for detecting an enzyme activity according to claim 6 of the present invention comprises: (a) the first compound or the first compound having an acetylated amino acid residue on the enzyme activity detection particle according to claim 4; A specimen solution containing a deacetylase that liberates a acetyl group from the second compound and a specific enzyme that selectively cleaves a peptide bond of the amino acid residue from which the acetyl group has been released is contacted.
  • a structure comprising: a contact reaction step for reacting; and (b) a fluorescence measurement step for measuring fluorescence of the sample solution reacted with the enzyme activity detection particles! / Speak.
  • the substrate peptide of the first compound or the second compound is acetylated, the substrate peptide is not cleaved, or the acetylase
  • a sample solution containing deacetylated enzyme that liberates a acetyl group from a conjugated peptide is brought into contact with the enzyme activity detection particle, the acetyl group is liberated from the peptide by the deacetylase and the acetyl group is liberated.
  • the activity of the histone deacetylase enzyme which is a candidate compound such as an anticancer drug, can be obtained. It is possible to detect how much inhibitory substances are present in the sample solution, and to detect candidate substances such as anticancer agents. Screening can be done easily and quickly.
  • the existing methods for measuring histone deacetylase enzyme activity include the method of using metabolically radiolabeled histone by adding radiolabeled acetic acid to the culture medium of cultured cells, and the use of acetylated lysine labeled with a fluorescent substance. A very complicated method such as a method for separating and measuring a reaction product by reverse phase HPLC using a solution was used.
  • examples of deacetylase enzymes include histone deacetylase enzymes.
  • Specific enzymes include lysyl endopeptidase, plasmin, carbaine, trypsin, meta-oral protease, armillaria mellea protease, and the like. These peptidases are preferably used because they do not cleave peptides in which the amino group of a lysine residue in the peptide does not cleave the acetylyl, or the cleavage activity decreases significantly.
  • the concentration of the specific enzyme in the sample solution is set to a concentration that can sufficiently cleave the substrate peptide of the first compound or the second compound under the given conditions. For example, even when all of the substrate peptides can be cleaved by deacetylase, it is desirable that the concentration be such that sufficient cleaving activity is present under the given measurement conditions. This is to prevent the activity of the deacetylase enzyme activity inhibitor from being estimated to be low due to insufficient cleavage activity of the specific enzyme.
  • the enzyme activity detector according to claim 7 of the present invention includes a liquid inlet formed upstream of the liquid passage, and a liquid outlet formed downstream of the liquid inlet. It has a configuration comprising a container and the enzyme activity detection particles according to any one of claims 1 to 4, which are stored in the liquid passage and held in the container.
  • a container provided with a liquid inlet formed upstream of the liquid inlet, and a liquid outlet formed downstream of the liquid inlet, and an enzyme filled in the liquid passage and held in the container Since the sample solution such as urine is put into the container from the inlet and contacted with the enzyme activity detection particle, the fluorescence intensity etc. As a result of the measurement, if an active enzyme is contained in the sample solution, the fluorescent group is released in the sample solution. Therefore, it is possible to easily detect whether the sample solution contains an active enzyme using the fluorescence intensity of the sample solution as an index.
  • the sample solution can be measured without being affected by the fluorescence of the enzyme activity detection particles because the fluorescence intensity of the sample solution that has come out after contact with the enzyme activity detection particles is measured.
  • the fluorescent group can be selected without considering the magnitude of the fluorescence change caused by the separation of the particle force for enzyme activity detection. When a fluorescent group with small fluorescence change before and after separation is used, when measuring the fluorescence wavelength of a small amount of sample solution using a microplate for fluorescence measurement, etc., it is easily affected by the fluorescence wavelength of the particle.
  • the fluorescent group must be selected in consideration of the magnitude of the fluorescence change because the problem arises that the quantitative accuracy is lowered and the measurement accuracy is lowered.
  • the enzyme activity detection particles of the present invention As described above, according to the enzyme activity detection particles of the present invention, the enzyme activity detection method using the same, and the enzyme activity detector, the following advantageous effects can be obtained.
  • the fluorescence wavelength intensity of the sample solution in contact with the same amount of particles is proportional to the concentration of the enzyme in the sample solution
  • the presence or absence of the enzyme can be determined by measuring the fluorescence wavelength intensity of the sample solution. It is possible to provide particles for detecting enzyme activity, which can accurately perform quantitative analysis of an enzyme in a sample solution only by detection. In addition, it is possible to provide particles for detecting enzyme activity that are not easily affected by particles when measuring the fluorescence wavelength, and have high quantitativeness and high measurement accuracy.
  • the enzyme By optimizing the distance between the particle and the cleavage site, the enzyme can act without being affected by the particle, and the enzyme activity detection particle having high enzyme activity detection accuracy can be provided.
  • the fluorescence wavelength of fluorescein can be distinguished from the fluorescence wavelength of fluorescent substances contained in drugs, etc., and the urine of a subject who is taking drugs or vitamins can be used as a sample solution as it is. It is possible to provide an enzyme activity detection particle having excellent properties.
  • the interaction between the second fluorescent group and the quencher disappears due to the distance between the second fluorescent group and the quencher.
  • the change can be used as a measurement index of enzyme activity, and thereby, an enzyme activity detection particle capable of detecting enzyme activity using a change in fluorescence intensity or the like as an index can be provided.
  • the enzyme activity can be detected simply by measuring the fluorescence intensity of the sample solution after the sample solution containing the enzyme is brought into contact with the enzyme activity detection particles, the measurement time should be shortened. Therefore, it is possible to provide a method for detecting enzyme activity with improved workability and excellent measurement efficiency.
  • Enzyme activity detection particles with fluorescent groups bound to each of different types of peptides, etc. are placed in the wells of a 96-well microplate for fluorescence measurement, and the sample solution is placed in each well.
  • image analysis By injecting and performing image analysis over a wide range with an image sensor, etc., it is possible to comprehensively measure and analyze the enzyme activity of a sample solution containing multiple enzymes in a short time, which can dramatically improve the measurement efficiency.
  • the acetyl group is released from the peptide by the deacetylase, and the peptide from which the acetyl group is released is cleaved by the specific enzyme and exhibits fluorescence at a specific wavelength, so if the fluorescence intensity of the sample solution is used as a reference, It is possible to detect how much an inhibitor of activity, such as histone deacetylase, which is a candidate compound such as an anticancer agent, is present in a sample solution, and easily and quickly screen a candidate substance such as an anticancer agent. Therefore, it is possible to provide a method for detecting enzyme activity, which enables highly efficient search and screening of useful substances that lead to the development of new drugs.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the principle of enzyme activity detection of enzyme activity detection particles in Embodiment 1.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the principle of enzyme activity detection of the enzyme activity detection particles in Embodiment 2.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a modification of the enzyme activity detection particle in the second embodiment.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing the principle of enzyme activity detection of the enzyme activity detection particles in Embodiment 3.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing the principle of enzyme activity detection of the enzyme activity detection particles in Embodiment 4.
  • FIG. 6 Schematic diagram of an enzyme activity detector in embodiment 5.
  • Second fluorescent group 20 Particles for detecting enzyme activity
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the enzyme activity detection principle of the enzyme activity detection particle according to Embodiment 1 of the present invention.
  • 1 is a particle for detecting enzyme activity in Embodiment 1
  • 2 is a substantially spherical or polyhedral shape made of synthetic resin (polystyrene or the like) insoluble in solvents such as halogenated hydrocarbons and esters, or glass.
  • 3 is a first compound such as an amino acid or a peptide having particle 2 bound to one end.
  • X in the first compound 3 represents any amino acid residue.
  • 4 is the second 1 Binds to the other end of compound 3 and changes its fluorescence wavelength and intensity before and after peptide bond with compound 1 and the cleavage site of compound 1 are cleaved by enzyme 5 described later.
  • the first fluorescent group such as 4 methylcoumaryl 7 amide (MCA), fluorescein sothiocyanate (FITC), etc., which is one of the fluorescent groups that generate benzene
  • 5 is the peptide bond between the first fluorescent group 4 and the first compound 3
  • the first An enzyme having a substrate specificity such as a meta-protease in a sample solution that selectively cleaves the substrate peptide of compound 3 at a specific cleavage site; 6 was cleaved at the cleavage site of compound 1 by enzyme 5 This is the first fluorescent group that has been released due to the change in fluorescence wavelength.
  • the enzyme activity detection particle 1 configured as described above is used for a normal peptide synthesis method such as a solid phase method in which the C-terminal force of the first compound 3 such as a peptide is extended.
  • a sequential extension method in which the amino acid sequence is sequentially extended from the C-terminal side to the N-terminal side
  • a fragment condensation method in which a plurality of short peptide fragments are synthesized and extended by coupling between peptide fragments, and a peptide synthesizer It can be synthesized using methods such as Fmoc method, Boc method and the like.
  • 1st fluorescent group 4 such as 4-methylcoumaryl 7-amide (MCA) and fluorescein isothiocyanate (FITC) in particle 1 for enzyme activity detection shown in Fig. 1 (a) is non-fluorescent in a specific wavelength region. When it is a substance and exists on the surface of particle 2 at a high density, the fluorescence intensity is weak due to concentration quenching.
  • enzyme 5 such as a meta-oral protease having substrate specificity is bound between the first fluorescent group 4 and the first compound 3. Peptide bond and 1st compound 3 substrate peptide are selectively cleaved at specific cleavage sites.
  • the first fluorescent group 6 released from the first compound 3 becomes a fluorescent substance such as 7-amino-methyltamarin (AMC), or the concentration quenching effect decreases by moving away from the particle 2, and the first fluorescent group 6 Since the fluorescence wavelength or the fluorescence intensity in the specific wavelength region is different from the first compound 3 and the first fluorescent group 4 that is peptide-bonded, the enzyme activity can be detected using changes in the fluorescence intensity of the sample solution as an index ( (See Figure 1 (b)). [0043] As described above, since the enzyme activity detection particles according to Embodiment 1 are configured, the following actions are obtained.
  • AMC 7-amino-methyltamarin
  • the particle 2 and the particle 2 have the first fluorescent compound 4 at the one end and the first fluorescent compound 4 bound at the other end and the first compound 3 having a cleavage site by the enzyme 5 in the sample solution. Therefore, when the particles 2 are brought into contact with the sample solution containing the enzyme 5, the enzyme activity can be detected using changes in the fluorescence intensity of the sample solution as an index.
  • the particle 2 and the cleavage site (in this embodiment, the peptide bond between the first fluorescent group 4 and the first compound 3)
  • the enzyme 5 can be allowed to act without being affected by the particle 2 by optimizing the distance to the target, and the enzyme activity can be accurately detected, and the detection accuracy can be improved.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the principle of enzyme activity detection of the enzyme activity detection particles in Embodiment 2 of the present invention. Components similar to those in the first embodiment are denoted by the same reference numerals and description thereof is omitted.
  • 10 is a particle for detecting enzyme activity in Embodiment 2
  • 11 is a substrate peptide containing a specific cleavage site of enzyme 14 in the sample solution described later, and a molecule in which a peptide or other compound or molecule is bound to the substrate peptide.
  • This is a second compound such as a chain.
  • X and Y in the second compound 11 represent an atomic group such as an arbitrary amino acid residue, and the atomic group Y at the end is bonded to the particle 2.
  • the quencher 12 is a quencher such as dinitrophenol (Dnp), 5 dimethylamino 1 naphthalenesulfonic acid (Dns), etc., which binds to the atomic group Y of the second compound 11, and 13 is a quencher introduced at the other end of the second compound 11
  • Dnp dinitrophenol
  • Dns 5 dimethylamino 1 naphthalenesulfonic acid
  • Trp tributophan
  • 14 is an enzyme such as serine protease, aspartate protease, metamouth protease, cysteine protease, etc. present in the sample solution
  • 15 is the second compound 11 is cleaved at a specific cleavage site due to the substrate specificity of enzyme 14 and released This is the second fluorescent group whose fluorescence wavelength and the like have changed.
  • the quencher 12 and the second fluorescent group 13 of the enzyme activity detection particle 10 shown in FIG. 2 (a) are bonded to each other at a distance at which an interaction affecting fluorescence is observed, the absorption spectrum of the quencher 12 is reduced.
  • the vector and the fluorescence spectrum of the second fluorescent group 13 overlap, and when the energy of the excitation wavelength of the second fluorescent group 13 is applied, attenuation of the fluorescence of the second fluorescent group 13 that should be observed is observed. .
  • the enzyme 14 having substrate specificity cleaves the peptide bond of the second compound 11.
  • the excitation wavelength of the second fluorescent group 13 in the analyte solution When this energy is applied, the fluorescence wavelength of the second fluorescent group 15 that was not observed before contact with the sample solution will be observed, which is different from the fluorescence wavelength before the reaction of enzyme 14, so the fluorescence intensity Enzyme activity can be detected using such changes as an index (see Fig. 2 (b)).
  • the fluorescent wavelength of the second fluorescent group 13 can be set in the visible region, so that visible light detection using a commercially available CCD camera or the like is possible. Measurements can be made using a device, making it highly versatile.
  • the second compound 11 can freely select an amino acid sequence, as the enzyme 14, an enzyme that selectively cleaves the peptide bond at the N-terminal side and the C-terminal side, a substrate for each amino acid Low specificity and relatively long peptide chain required for cleavage Enzymes such as elastase can be detected, and the number of types of enzymes that can be detected can be increased.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a modification of the enzyme activity detection particles in the second exemplary embodiment.
  • Embodiment 2 attaches the same code
  • 10a is a modified enzyme activity detection particle
  • 12a is a quencher bonded to an atomic group Y such as an amino acid residue at the end of the second compound 11
  • the quencher 12a is a particle 2
  • the quencher 12a is used. Since the fluorescence spectrum of the second fluorescent group 13 changes as the distance between the second fluorescent group 13 and the second fluorescent group 13 increases, this spectral change can be used as a measurement index for enzyme activity, and changes in the fluorescence intensity of the sample solution can be detected. Enzyme activity can be detected as an indicator.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing the principle of enzyme activity detection of the enzyme activity detection particles in Embodiment 3 of the present invention. Components similar to those in the first embodiment are denoted by the same reference numerals and description thereof is omitted.
  • 20 is a particle for detecting enzyme activity in Embodiment 3
  • 21 is a first compound such as a peptide having one end bound to the surface of particle 2.
  • X in the first compound 21 is an arbitrary amino acid residue
  • Z is an amino acid residue such as acetylated lysine.
  • 22 is the first fluorescent group such as fluorescein isothiocyanate (FITC) peptide-bonded to amino acid residue X of compound 1; 23 is the acetylated amino acid residue Z force or acetyl group (
  • 24 is a deacetylase enzyme such as histone deacetylase enzyme in the sample solution that catalyzes the reaction that releases (Ac). It is a specific enzyme such as meta-mouth protease.
  • the first fluorescent group 22 such as fluorescein isothiocyanate (FITC) in the enzyme activity detection particle 20 shown in FIG. 4 (a) has a weak fluorescence intensity due to concentration quenching.
  • This enzyme activity detection particle 20 When the sample solution containing the deacetylase 23 and the specific enzyme 24 is brought into contact with and reacted, the deacetylase 23 also releases the acetyl group (Ac) in the amino acid residue Z force of the first compound 21.
  • the specific enzyme 24 such as the meta-oral protease does not cleave the peptide bond or the cleavage activity significantly decreases while the amino acid residue Z of the first compound 21 is acetylated, and shows almost no activity. Absent.
  • the specific enzyme 24 such as metaprotease releases the acetyl group (Ac) as shown in FIG.
  • the amino acid residue Z is selectively cleaved at the C-terminal side.
  • the fluorescence wavelength of the first fluorescent group 22 released from the particle 2 or the fluorescence intensity in the specific wavelength region is different from that of the first fluorescent group 22 bonded to the particle 2, the change in the fluorescence intensity or the like of the sample solution is used as an indicator. As shown in Fig. 4 (c), the enzyme activity can be detected.
  • the deacetylase activity inhibitory substance can determine the potency or potency.
  • the fluorescence intensity of the sample solution as a reference, it is possible to detect how much an inhibitor of the activity of the deacetylase enzyme, which is a candidate compound such as an anticancer drug, is present in the sample solution.
  • Candidate substances such as anticancer drugs, antitumor drugs, and leukemia drugs can be screened.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing the enzyme activity detection principle of the enzyme activity detection particle according to Embodiment 4 of the present invention. Components similar to those in the first embodiment are denoted by the same reference numerals and description thereof is omitted.
  • 30 is a particle for detecting enzyme activity in Embodiment 4, and 31 is a second compound such as an amino acid or a peptide having one end bonded to the surface of particle 2.
  • X in the second compound 31 is an atomic group having an arbitrary amino acid residue force, and Z is an amino acid residue such as acetylated lysine.
  • 32 is a quencher such as dinitrophenol (Dnp), 5 dimethylamine 1 naphthalene sulfonic acid (Dns), etc. introduced at one end of the second compound 31;
  • 33 is the other end of the second compound 31 (7-methoxycoumarin-4-yl) acetyl (MOAc), tryptophan (Trp), etc.
  • the second fluorescent group, 34 is a deacetylating enzyme such as histone deacetylase in the sample solution that catalyzes the reaction to release the acetylated amino acid residue Z force and the acetyl group (Ac), 35 is the second In the sample solution, which selectively cleaves the peptide bond on the C-terminal side of amino acid residue Z of compound 31, such as lysyl endopeptidase, plasmin, carbaine, trypsin, meta-protease, armillaria mellea protease, etc.
  • Specific enzyme, 36 is the second This is a second fluorescent group whose fluorescence wavelength and the like have been changed by cleaving and releasing the compound 31 from the specific enzyme 35.
  • the quencher 32 and the second fluorescent group 33 of the enzyme activity detection particle 30 shown in FIG. 5 (a) are bonded to each other at a distance at which an interaction affecting the fluorescence is observed, the absorption spectrum of the quencher 32 is reduced.
  • the vector and the fluorescence spectrum of the second fluorescent group 33 overlap, and when the excitation wavelength energy of the second fluorescent group 33 is applied, attenuation of the fluorescence of the second fluorescent group 33 that should be observed is observed. .
  • deacetylase 34 reacts with the amino acid residue Z force of secondary compound 31 as well.
  • the group (Ac) is liberated.
  • the specific enzyme 35 does not cleave the peptide bond or cleaves it while the amino acid residue Z of the second compound 31 is acetylated. Sex is significantly reduced and shows little activity.
  • the specific enzyme 35 When the acetyl group is liberated from the amino acid residue Z of the second compound 31, the specific enzyme 35, as shown in FIG. 5 (b), becomes the amino acid residue of the second compound 31 from which the acetyl group (Ac) has been released. Breaks the peptide bond of Z.
  • the sample solution contains a deacetylase-enzyme activity inhibitor that inhibits the activity of deacetylase-34, the fluorescence intensity, etc. of each sample containing the deacetylase-enzyme activity inhibitor is not measured.
  • the deacetylase activity inhibitory substance can determine the potency or potency.
  • the second compound 31 can freely select the amino acid sequence and the specific enzyme 35 can also be freely selected, it is a highly stable ligand that selectively cleaves the peptide bond on the C-terminal side.
  • Zylendopeptidase or the like can be used as the specific enzyme 35, and the enzyme detection accuracy can be improved.
  • FIG. 6 is a schematic diagram of an enzyme activity detector according to Embodiment 5 of the present invention.
  • 40 is an enzyme activity detector
  • 41 is a container formed in a cylindrical shape
  • 42 is a liquid passage formed in the container 41
  • 43 is a liquid inlet formed upstream of the liquid passage 42
  • 44 is a liquid outlet formed downstream of the liquid passage 42
  • 45 is a porous filter formed in the liquid inlet 43
  • 46 is porous, etc., and is arranged in the liquid outlet 44.
  • the provided filter 47 is an enzyme activity detection particle contained in the liquid passage 42 inside the filters 45, 46 and held in the container 41.
  • the enzyme activity detection particles those described in Embodiments 1 to 5 may be used. Togashi.
  • a sample solution such as urine is caused to flow into the container 41 from the liquid inlet 43, passes through the liquid passage 42 of the container 41, and flows out from the liquid outlet 44. Since the sample solution flows out from the liquid outlet 44 after reacting with the enzyme activity detection particles 47 filled in the liquid passage 42, the fluorescence intensity of the sample solution flowing out of the liquid outlet 44 is measured. taking measurement.
  • the sample solution contains an enzyme with cleavage activity by measuring the fluorescence intensity of the sample solution that has flowed out of the outlet 44 after contact with the enzyme activity detection particle 47. Can be detected.
  • the fluorescent group can be measured without considering the magnitude of the fluorescence change due to separation from the enzyme activity detection particle 47. It is possible to select and has excellent flexibility.
  • Example 1 peptidyl fluorescent group-bound spherical particles were synthesized as enzyme activity detection particles, and the activity was measured with the enzyme Subtilisin. The method is described below
  • spherical NH-PEGA-resin made by Watanabe Chemical Industry, particle size of about 0.1 mm is used.
  • a second fluorescent group consisting of ⁇ Ala-Xxx-Yyy-Zzz-Lys with a second fluorescent group that binds to / 3-alanine at one end and a quencher that dinitrophenyl (Dnp) binds to lysine at the other end 8 particles (samples 1 to 8 having the amino acid sequence shown in Table 1) having PEGA resin bound to lysine of the second compound were obtained.
  • Example 2 peptidyl fluorescent group-bound spherical particles were synthesized as enzyme activity detection particles, and the activity was measured with the enzyme Trypsin. The method will be described below. ⁇ Synthesis of peptidyl fluorescent group-bound spherical particles>
  • a second fluorescent group consisting of FITC is bound to ⁇ -alanine at one end, and a dinitrophenyl (Dnp) force quencher is bound to lysine at the other end.
  • ⁇ Ala-X xx- PEGA resin bound to the second compound of Yyy-Zzz-Lys and lysine of the second compound 13 particles (samples 9 to 21 having the amino acid sequences shown in Table 2) having enzyme activity were synthesized.
  • Trypsin aqueous solution 16 1 (100 unit) as a sample take 10 1 from the sample every measurement time, add 190 ⁇ l of buffer, transfer it to a 96 well plate, and transfer the fluorescence value to Wallac 1420 manufactured by Perkin Elmer. Measured with an ARVO sx plate reader (measurement time 0.1 seconds). Change in fluorescence value 60 minutes after adding sample solution (difference between fluorescence value before adding sample solution and fluorescence value 60 minutes after adding sample solution) (excitation wavelength 485 nm, fluorescence wavelength 535 nm) is shown in the right column of Table 2.
  • Example 3 the activity of the enzyme was measured by synthesizing peptidyl fluorescent group-bound spherical particles as the enzyme activity detection particles, and comparison between the enzymes was performed. The method is described below.
  • a second fluorescent group consisting of FITC is bound to ⁇ -alanine at one end, and a dinitrophenyl (Dnp) force quencher is bound to lysine at the other end.
  • Dnp dinitrophenyl
  • ⁇ Ala-X xx- For detecting enzyme activity of 4 types (samples 22-25 of the amino acid sequence shown in Table 3) having a second compound consisting of Yyy-Zzz-Lys and particles consisting of PEGA resin bound to lysine of the second compound Particles were synthesized.
  • the activity by Trypsin is about 240 times the fluorescence change by Subtilisin.
  • Elastase activity was found to be approximately twice the change in fluorescence caused by Subtilisin. From this, the enzyme having a different amino acid sequence in this example It was confirmed that the activity detection particles showed different fluorescence changes depending on the substrate specificity of the enzyme.
  • a plurality of types of enzyme activity detection particles having different amino acid sequences are synthesized, and a plurality of enzyme activity detection devices are prepared in separate containers for each amino acid sequence. Measure the fluorescence intensity of each sample solution that has passed through and record it. By measuring this continuously every day or once a week, etc., and comparing it with the previous measurement results, it is possible to determine whether the amount or type of enzyme contained in the urine has changed. It can be detected, and it can be diagnosed whether or not there is a change in the physical condition using the fluorescence intensity of the sample solution in contact with the enzyme activity detection particles as an index.
  • a second fluorescent group having a fluorescein isothiocyanate (FITC) force is bonded to one end, and a quencher having a dinitrophenol (Dnp) force is added to a lysine at the other end.
  • Fluorescence change of the sample solution that was synthesized and contacted with the enzyme activity detection particle having the second compound bound to lysine and the PEGA resin-binding particle bound to the lysine of the second compound was confirmed that the same results were obtained when (7-methoxycoumarin-4-yl) acetyl (MOAc) was used as the second fluorescent group. did.
  • a particle for detecting the enzyme activity comprising a first compound such as a substrate peptide having a first fluorescent group such as FITC bound to the other end and a cleavage site by the enzyme having a first fluorescent group such as FITC bound to the other end
  • a first compound such as a substrate peptide having a first fluorescent group such as FITC bound to the other end
  • a cleavage site by the enzyme having a first fluorescent group such as FITC bound to the other end Even when used, the fluorescence change of the sample solution brought into contact with this was measured, and it was confirmed that a difference in enzyme activity could be detected.
  • enzyme activity detection particles in which lysine (Yyy) of the second compound of sample 15 described in Example 2 was acetylated were synthesized, and histone deacetylase and metaprotease were combined with this. After a sample solution containing a specific enzyme such as benzene is brought into contact and reacted, a fluorescence measurement of the sample solution is performed, and the measured values are compared, and a sample containing a large amount of inhibitors of histone deacetylase activity It was confirmed that there was little change in fluorescence in the solution.
  • the present invention relates to an enzyme activity detection particle for detecting enzyme activity, an enzyme activity detection method using the same, and an enzyme activity detector, and only the presence / absence of an enzyme is detected by measuring the intensity of the fluorescence wavelength of a sample solution.
  • the quantitative analysis of the enzyme in the sample solution can be performed with high accuracy, and it is difficult to be affected by adsorbed water and does not cause weighing errors.
  • the measurement time can be shortened, the workability is improved and the measurement efficiency is excellent.
  • By performing image analysis over a wide range with a mage sensor, etc. it is possible to comprehensively measure and analyze the enzyme activity of a sample solution containing multiple enzymes in a short period of time, which can dramatically increase the measurement efficiency.
  • It is possible to provide a method for detecting enzyme activity that enables highly efficient search and screening of useful substances connected to the substance, and it has activity in the sample solution by measuring the fluorescence intensity of the sample solution. It is possible to provide an enzyme activity detection device that can easily detect whether or not an enzyme is contained and is excellent in handleability.

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Abstract

　検体溶液の蛍光波長の強度を測定することによって、酵素の有無の検出だけでなく検体溶液内の酵素の定量分析も精度良く行うことができ、また吸着水の影響を受け難く秤量誤差も生じ難いため取扱性に優れるとともに測定精度を高め定量性を高めることができ、さらに製造する際には合成したペプチドを切断し精製する工程や凍結乾燥工程等の煩雑な工程が必要なく生産性に著しく優れた酵素活性検出用粒子を提供することを目的とする。 　本発明の酵素活性検出用粒子１は、粒子２と、一端に粒子２が他端に第１蛍光基４が結合し検体溶液中の酵素５による切断部位を有する第１化合物３と、を備える。                                                                                 

Description

酵素活性検出用粒子及びそれを用いた酵素活性の検出方法並びに酵 素活性検出具
技術分野
[0001] 本発明は、酵素活性を検出する酵素活性検出用粒子及びそれを用いた酵素活性 の検出方法並びに酵素活性検出具に関するものである。
背景技術
[0002] 近年、病理学的診断などの医学的分野やプロテオーム解析等の研究的分野の発 展に伴って、複数の酵素の活性を検出する必要性が生じており、酵素の活性を吸収 光、蛍光等を用いて溶液中で測定する技術が種々研究されている。
例えば、（特許文献 1)には、「タンパク質分解酵素の 1種であるカスパーゼが特異的 に切断する基質ペプチドの両端を、蛍光共鳴エネルギー移動が起こる蛍光基で修 飾した蛍光プローブ」が記載されて 、る。
特許文献 1 :特開 2000— 316598号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] し力しながら上記従来の技術においては、以下のような課題を有していた。
(1) (特許文献 1)に開示の技術は、溶液中に入れた蛍光プローブの基質ペプチドが 酵素によって切断された結果、基質ペプチドの蛍光基の蛍光共鳴エネルギー移動 が解除され蛍光波長や蛍光強度が変化するので、これを測定することによって酵素 活性を検出するものである。蛍光プローブは、凍結乾燥された粉末の状態か溶液の 状態で供給される。粉末の状態で供給された蛍光プローブを使用する場合は、使用 時に所定量の粉末を秤量して溶媒に溶解し溶液に調製するのであるが、溶液の調 製が不正確だと酵素活性検出の定量性に欠けるため、粉末を高精度で秤量するとと もに、調製した溶液中に蛍光プローブが完全に溶解した力どうかを確認しなければな らず、測定前の準備が煩雑であり取扱性に欠ける。
(2)近年の医学的分野や研究的分野の発展に伴い測定が必要となる酵素の種類は 増加し続け、それに伴 、必要な蛍光プローブの種類とその組合せも飛躍的に増加し ているので、上述の問題によって、測定前の蛍光プローブ溶液の調製に要する時間 と労力も増加し、酵素活性検出作業に占める測定前の準備作業の割合が増大し、測 定者の負担が増大している。
(3)凍結乾燥された粉末は吸湿性を有することが多ぐこの場合は粉末に吸着した吸 着水のために粉末が塊状になったり水あめ状になったりするため、秤量の精度が低 下し溶液の濃度が不正確になり定量性に欠ける。
(4)溶液の蛍光プローブを使用する場合は、粉末で供給された場合と異なり上述の ような問題はなく定量性にも優れるが、一般に蛍光物質は溶液状態では不安定であ り長期間の保存に耐えないため保存性に欠ける。
(5)保存性を高めるため冷凍保存されることも多いが、測定時には解凍して用いなけ ればならない等、測定前の蛍光プローブ溶液の準備に手間が力かり作業が煩雑であ る。
(6)蛍光プローブを製造する際、ペプチド合成用榭脂等の表面に所定のペプチドを 合成した後、ペプチド合成用榭脂等カゝらペプチドを切断し精製する必要があり、工程 が煩雑で生産性に欠ける。また、粉末状態の蛍光プローブを製造する場合は、精製 されたペプチドを凍結乾燥するとともに吸湿しないように密封する必要があり煩雑で ある。
本発明は上記従来の課題を解決するもので、検体溶液の蛍光波長の強度を測定 することによって、酵素の有無の検出だけでなく検体溶液内の酵素の定量分析も精 度良く行うことができ、また吸着水の影響を受け難く秤量誤差も生じ難いため取扱性 に優れるとともに測定精度を高め定量性を高めることができ、さらに製造する際には 合成したペプチドを切断し精製する工程や凍結乾燥工程等の煩雑な工程が必要な く生産性に著しく優れた酵素活性検出用粒子を提供することを目的とする。
また、本発明は、粒子に酵素を含む検体溶液を接触させた後、検体溶液の蛍光強度 等を測定するだけで酵素活性を検出することができ、測定時間を短縮ィ匕することがで き作業性を高め測定効率に優れ、また 96ゥエルプレート等の蛍光測定用マイクロプ レートを利用してイメージセンサ等で広範囲の画像解析を行うことにより、複数の酵素 を含む検体溶液の酵素活性を短時間で網羅的に測定し解析することができ測定効 率を飛躍的に高めることができ、医薬品に繋がる有用な物質の検索やスクリーニング を高効率で行うことができる酵素活性の検出方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、通過した検体溶液の蛍光強度等を測定することによって、検体溶液 に活性を有する酵素が含まれているかどうかを簡単に検出することができるとともに 取扱性に優れる酵素活性検出具を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
上記従来の課題を解決するために本発明の酵素活性検出用粒子及びそれを用い た酵素活性の検出方法並びに酵素活性検出具は、以下の構成を有している。
本発明の請求項 1に記載の酵素活性検出用粒子は、粒子と、一端に前記粒子が 他端に第 1蛍光基が結合し酵素による切断部位を有する第 1化合物と、を備えた構 成を有している。
この構成により、以下のような作用が得られる。
(1)粒子と、一端に前記粒子が他端に第 1蛍光基が結合し酵素による切断部位を有 する第 1化合物と、を備えているので、粒子が酵素を含む検体溶液と接触すること〖こ よって、第 1蛍光基が酵素による切断部位で切断されて検体溶液内に遊離するため
、検体溶液の蛍光強度等の変化を指標として酵素活性を検出することができる。
(2)第 1蛍光基が検体溶液中に遊離せず粒子に結合したままであると、蛍光波長を 測定する際に、粒子の表面で乱反射する等、粒子の影響を受け易く定量性が低下し 測定精度が低下する問題が生ずるが、第 1蛍光基が検体溶液中に遊離するので、蛍 光波長を測定する際に粒子の影響を受け難く定量性が増し測定精度を高めることが できる。
(3) 1個当りの粒子の表面積が同一ならば、 1個の粒子が結合した第 1ィ匕合物即ち第 1蛍光基の量はほぼ同量であるため、同量の粒子と接触した検体溶液の蛍光波長の 強度は、検体溶液内の酵素の濃度に比例する。従って、検体溶液の蛍光波長の強 度を測定することによって、酵素の有無の検出だけでなぐ検体溶液内の酵素の定 量分析も精度良く行うことができる。
(4)粒子の表面に結合した第 1化合物が水を吸着しても、粒子の大きさに比べて第 1 化合物の大きさは著しく小さぐかつ、粒子の表面には微細な凹凸があるため、吸着 水によって粒子同士が付着することがないので、塊状や水あめ状になることがなく秤 量精度を高めることができるとともに取扱性に優れる。
(5)粒子の表面積が一定ならば 1個の粒子の表面に結合した第 1ィヒ合物の量はほぼ 一定であり、かつ、粒子の表面に結合した第 1化合物の重量は粒子の重量に比べて 著しく小さいので、粒子の秤量誤差が生じ難ぐ粒子の重量が均一な場合は使用時 に一定量の粒子を秤量すれば、第 1化合物即ち第 1蛍光基の量が検体溶液間でば らつくのを最小限に抑えることができ秤量精度を高め、これにより蛍光強度等の定量 性を高め、定量分析精度を高めることができる。
(6)自動ペプチド合成装置を用いて、粒子の表面に第 1化合物、第 1蛍光基を結合 させ合成すれば製造できるため、ペプチド合成用榭脂等を用いて蛍光プローブを製 造する場合のように、合成されたペプチド等をペプチド合成用榭脂等から切断し精 製する必要がなぐ製造工程が煩雑でなく生産性に著しく優れる。また、第 1蛍光基 が導入された第 1ィ匕合物を結合させた粒子は、溶媒で洗浄した後は、凍結乾燥を行 うことなく減圧下乾燥するだけで製品化でき、生産性を高めることができる。
(7)第 1ィ匕合物を有しているので、粒子力も第 1ィ匕合物の切断部位までの距離を適正 化して粒子の影響を受けずに酵素を作用させることができ、酵素活性を正確に検出 することができ検出精度を高めることができる。
ここで、粒子としては、ポリスチレン等の合成樹脂製、シリカゲル，ガラス製等の無機 材料製で、略球状，多面体状，破砕状に形成されたものが用いられる。なかでも、略 球状や多面体状に形成されたものが好適に用いられる。粒子の形状を画一化するこ とができるので、単位重量当たりの粒子の表面積を一定にすることができ、粒子の重 量と表面積とを正比例の関係にすることができ、 1個の粒子に結合した蛍光基の量が わかれば、粒子の重量を均一にしておけば粒子を秤量することによって、全粒子に 結合した蛍光基の量を見積ることができ、測定された蛍光強度力も検体溶液内の酵 素の定量分析を行うことができる力もである。
合成樹脂の材質としては、ペプチド結合を形成するための縮合反応に用いられるク ロロホルム，ジクロロメタン等のハロゲン化炭化水素類、酢酸ェチル等のエステル類、 N, N ジメチルホルムアミド，ジメチルスルホキシド等の極性有機溶媒、ジォキサン ,テトラヒドロフラン等のエーテル類、メタノール，エタノール等のアルコール類、ピリジ ン等の溶媒に不溶性のものが用いられる。ミモートブス社製ランタンシリーズ (登録商 標)等の市販の固相有機合成用担体も用いることができる。
[0007] 粒子の粒径としては、 0. 05〜0. 5mmのものが好適に用いられる。市販の自動べ プチド合成装置を用いて、粒子の表面にペプチド等を結合させることができるからで ある。
粒子は、表面をポリエチレングリコールで被覆したものが好適に用いられる。親水性 及び溶媒に対する膨潤性を高めることができるからである。
[0008] 第 1ィ匕合物としては、アミノ酸、 2個以上のアミノ酸がペプチド結合し酵素の特定の 切断部位を含む基質ペプチドが用いられる。また、基質ペプチドにペプチド又はそ の他の化合物や分子が結合した分子鎖を有するものも用いることができる。
第 1ィ匕合物は、 C末端のアミノ酸を粒子上に固定しペプチドを C末端力も伸長していく 固相法等の通常のペプチド合成法を用いて合成することができる。また、 目的とする アミノ酸配列の C末端側から N末端側へ逐次伸長して ヽく逐次伸長法や、複数の短 いペプチド断片を合成しペプチド断片間のカップリングにより伸長させる断片縮合法 等を用いることができる。また、ペプチド合成機を用いて 9—フルォレニルメチルォキ シカルボニル (Fmoc)アミノ酸や t ブチルォキシカルボ-ル（Boc)アミノ酸等を導 入して合成することもできる。さらに、プロテアーゼを用いてペプチド結合を生成した り、遺伝子工学を利用して合成することもできる。
[0009] 第 1ィ匕合物においてペプチド結合を形成するための縮合方法としては、公知の方 法を用いることができ、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水 物法、 DCC法、 DCC アディティブ法、活性エステル法、カルボ-ルジイミダゾール 法、酸化還元法、ウッドワード試薬 Kを用いる方法等が用いられる。
縮合反応を行う前に、公知の手段により、アミノ酸やペプチド中の反応に関与しな いカルボキシル基，アミノ基等を保護したり、また反応に関与するカルボキシル基，ァ ミノ基を活性ィ匕することもできる。
[0010] 第 1蛍光基としては、酵素によって第 1ィ匕合物がペプチド結合の切断部位で切断さ れる前後において蛍光基の性質が変わり、蛍光波長や蛍光強度に変化が生じるもの が用いられる。また、濃度消光現象に由来して蛍光波長や蛍光強度の変化が生じる 蛍光基も用いられる。濃度消光現象とは、蛍光基が粒子上で互いに近接していると きと検体溶液中に遊離して蛍光基間の距離が離れているときとで蛍光波長や蛍光強 度が変化する現象をいう。
このような第 1蛍光基としては、例えば、 4—メチルクマリル— 7 アミド (MCA)、 7— アミノー 4—カルボキシメチルクマリン (ACC)、 p -トロア-リド、 a—ナフチルアミド 、 a ナフチルエステル、フルォレセイン又はその誘導体等が用いられる。
これにより、粒子から遊離した第 1蛍光基の蛍光波長や蛍光強度は、遊離前の第 1蛍 光基のものとは異なるので、特定波長領域における蛍光強度を指標として、酵素によ る切断量を測定することができる。
[0011] 検出可能な酵素としては、トロンビン、プラスミン、ゥロキナーゼ、エラスターゼ、コラ ゲナーゼ等ペプチドを切断する酵素全てを挙げることができる。
[0012] 本発明の請求項 2に記載の酵素活性検出粒子は、前記第 1蛍光基が、フルォレセ イン又はその誘導体である構成を有して 、る。
この構成により、請求項 1で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。 ( 1 )薬やビタミン剤等を服用して 、る被験者の尿中には薬等に含まれる雑多な蛍光 物質が出る。これらの蛍光物質は蛍光波長が 400nm付近のものが多いため、尿を 検体溶液としてそのまま用いる場合、蛍光波長を 400nm付近にもつ第 1蛍光基は使 用できない。薬等に含まれる蛍光物質の蛍光と、酵素活性によって検体溶液内に遊 離した第 1蛍光基の蛍光とを区別できな 、からである。フルォレセインは 525nm前後 の蛍光を発するので、薬等に含まれる蛍光物質の蛍光波長と区別することができ、薬 やビタミン剤等を服用して 、る被験者の尿もそのまま検体溶液として用いることができ 汎用性に優れる。
[0013] ここで、フルォレセイン誘導体としては、フルォレセインイソチオシァネート（FITC) 等が用いられる。
[0014] 本発明の請求項 3に記載の酵素活性検出用粒子は、一端に第 2蛍光基が他端の原 子団に消光剤が結合し酵素による切断部位を有する第 2化合物と、前記第 2化合物 の他端の前記原子団又は前記消光剤と結合した粒子と、を備えた構成を有して ヽる この構成により、請求項 1に記載の作用に加え、以下のような作用が得られる。
(1)酵素によって第 2化合物の切断部位でペプチド結合が切断されると、消光剤と第 2蛍光基との距離が離れることによって第 2蛍光基の蛍光スペクトルが変化するので、 このスペクトル変化を酵素活性の測定指標にすることができ、これにより、蛍光強度等 の変化を指標として酵素活性を検出することができる。
[0015] ここで、消光剤としては、第 2蛍光基の蛍光励起波長に相当する光を吸収する物質 、第 2蛍光基との間のゆるい結合により無発光複合体を形成する物質、第 2蛍光基と 蛍光共鳴エネルギー移動が起こる物質等が用いられる。
蛍光共鳴エネルギー移動とは、第 2蛍光基と消光剤が距離的に近い位置に存在す るとき、消光剤 (ァクセプター）の励起スペクトルと第 2蛍光基 (ドナー）の蛍光スぺタト ルとが重なりをもつ場合、第 2蛍光基の励起波長のエネルギーを当てると消光剤が励 起工ネルギーを奪 ヽ、本来観察されるはずの第 2蛍光基の蛍光が減衰する現象を 、
[0016] 第 2蛍光基や消光剤としては、蛍光共鳴エネルギー移動が起こるドナーとァクセプタ 一の組合せを用いることができる。例えば、第 2蛍光基の蛍光波長と重なる波長域に 吸収帯をもつ原子団である消光剤等が用いられる。具体的には、（7—メトキシクマリ ン一 4—ィル）ァセチル（MOAc) ,アントラ-ロイルペンジル（ABz) , N—メチルアン トラ-ル酸（Nma)等とジ-トロフエ-ル（Dnp)の組合せ、 Dabsylと EDANS (5— (2'-ァ ミノェチノレ）ァミノナフタレン一 1—スノレホン酸）の組合せ、トリプトファン（Trp)と 5—ジ メチルアミノー 1—ナフタレンスルホン酸（Dns)の組合せ、カルボキシジクロ口フルォ レセイン（CDCF)とカルボキシメチルローダミン（CTMR)の組合せ、カルボキシジク ロロフルォレセイン（CDCF)とカルボキシ X—ローダミン（CXR)の組合せ、ルシファ 一イェロー（LY)とカルボキシメチルローダミン（CTMR)の組合せ等が用いられる。
[0017] 第 2化合物としては、アミノ酸、 2個以上のアミノ酸がペプチド結合し酵素の特定の 切断部位を含む基質ペプチドが用いられる。また、基質ペプチドにペプチド又はそ の他の化合物や分子が結合した分子鎖を有するものも用いることができる。 第 2化合物の原子団又は消光剤は、粒子と直接結合してもよいし、ペプチド又はそ の他の化合物や分子が結合した分子鎖を介して粒子と結合してもよい。
なお、消光剤と粒子との結合、第 2化合物の原子団と消光剤との結合、第 2化合物 の原子団と粒子との結合は、酵素によって切断されないアミド結合，エステル結合， エーテル結合，チォエーテル結合，ウレタン結合等が用いられる。消光剤が酵素によ つて切断されて粒子力 遊離することでも第 2蛍光基の蛍光スペクトルに変化が生じ るが、第 2ィ匕合物のアミノ酸配列に依存した酵素活性は検出できないからである。
[0018] 第 2化合物に結合した第 2蛍光基と消光剤の結合部間の長さは、 100A以下であ ることが望ましい。第 2蛍光基と消光剤との結合部間の距離が長くなるにつれ蛍光強 度等の変化が小さくなる傾向がみられ、 100Aより長くなるとこの傾向が著しく蛍光強 度の変化が著しく小さくなり感度が低下するからである。
[0019] 活性を検出できる酵素としては、例えば、トリプシン，キモトリブシン，トロンビン，ブラ スミン，カリクレイン，ゥロキナーゼ，エラスターゼ等のセリンプロテアーゼ、ペプシン， カテブシン D,レニン，キモシン等のァスパラギン酸プロテアーゼ、カルボキシぺプチ ダーゼ A, B,コラゲナーゼ，サーモリシン等のメタ口プロテアーゼ、カテブシン B, H, L,カルパイン等のシスティンプロテアーゼ等の内部のペプチド結合を切断するェン ドぺプチダーゼ、血液凝固系プロテアーゼ、捕体系プロテアーゼ、ホルモンプロセシ ング酵素等を挙げることができる。
[0020] なお、粒子としては、請求項 1で説明したものと同様なので、説明を省略する。
[0021] 本発明の請求項 4に記載の発明は、請求項 1乃至 3の内いずれか 1に記載の酵素 活性検出用粒子であって、前記第 1化合物又は前記第 2化合物が、ァセチル化され たアミノ酸残基を有する構成を有して!/ヽる。
この構成により、請求項 1乃至 3の内いずれか 1で得られる作用にカ卩え、以下のよう な作用が得られる。
(1)第 1化合物や第 2化合物がァセチル化されたアミノ酸残基を有しているので、基 質ペプチド等がァセチル化されている場合には基質ペプチドを切断しないか、若しく は切断活性が有意に低下する特定酵素と接触しても蛍光強度等の変化は検出され ない。しかし、この特定酵素と、ァセチルイ匕されたペプチド力 ァセチル基を遊離させ る脱ァセチル化酵素と、を含む検体溶液を酵素活性検出用粒子と接触させると、脱 ァセチルイ匕酵素によってペプチドからァセチル基が遊離され、ァセチル基が遊離さ れたペプチドは特定酵素によって切断され特定波長の蛍光を示すので、その検体溶 液の蛍光強度等を基準にすれば、抗癌剤等の候補化合物である脱ァセチル化酵素 の活性の阻害物質力 検体溶液内にどの程度存在しているかを検出することができ 、抗癌剤等の候補物質をスクリーニングすることができる。脱ァセチル化酵素のひと つであるヒストン脱ァセチルイ匕酵素は、細胞周期の進行'分化に関与しており、またヌ クレオソーム構造を変化させることにより様々な遺伝子の発現を調節する重要な働き をしており、この調節が崩れることがある種の癌と関連していることが報告されており、 さらにヒストン脱ァセチルイ匕酵素の阻害剤が、抗腫瘍効果、白血病の治療に効果的 であることが知られて!/ヽるカゝらである。
[0022] ここで、第 1ィ匕合物や第 2ィ匕合物の基質ペプチドのアミノ酸残基をァセチルイ匕する方 法としては、 αアミノ基と側鎖のアミノ基を保護基でブロックしてあるアミノ酸を、酢酸 無水物や Ν—ヒドロキシスクシンイミドアセテート等を用いてァセチル化する方法が挙 げられる。
[0023] 本発明の請求項 5に記載の酵素活性の検出方法は、（a)請求項 1乃至 3の内いずれ カゝ 1に記載の酵素活性検出用粒子に酵素を含む検体溶液を接触させ反応させる接 触反応工程と、 (b)前記酵素活性検出用粒子と反応させた前記検体溶液の蛍光測 定を行う蛍光測定工程と、を備えた構成を有している。
この構成により、以下のような作用が得られる。
(1)酵素活性検出用粒子に酵素を含む検体溶液を接触反応させた後、検体溶液の 蛍光強度等を測定するだけで酵素活性を検出することができるので、測定時間を短 縮ィ匕することができ作業性を高め測定効率を高めることができる。
(2)蛍光測定によって酵素活性を検出するので、検出感度と測定精度を高めること ができる。
(3)種類の異なるペプチド等の各々に蛍光基が結合した酵素活性検出用粒子を、 9 6ゥエルの蛍光測定用マイクロプレートのゥエル等に入れた後、各ゥエル等の中に検 体溶液を注入しイメージセンサ等で広範囲の画像解析を行うことにより、複数の酵素 を含む検体溶液の酵素活性を短時間で網羅的に測定し解析することができ測定効 率を飛躍的に高めることができる。
[0024] ここで、酵素を含む検体溶液としては、病理診断などの対象となる血液や尿を含む 体液や培養液等を用いることができる。検体溶液は生体試料 (血液等）をそのまま、 あるいはフィルタや遠心分離等で血球成分等を除去したものを用いることができる。 また、生体試料を基に酵素が活性を発現するような条件設定 (pH調整、活性剤導入 など）を行ったものを使用することもできる。 pH調整剤としては、 Tris— HC1, Hepes —KOH等の緩衝剤を反応バッファ一として添加することができる。また、酵素活性の 発現に必要な塩類や活性保護剤を添加することもできる。
[0025] 検体溶液の蛍光測定は、蛍光分光光度計を用いる方法の他、発光ダイオード等の 発光素子からの光を蛍光基の励起波長を通過するフィルタを通して検体溶液に照射 し、検体溶液の蛍光を検出することができる位置に配置した CCD等の受光素子で蛍 光強度等を測定する方法を用いることもできる。
[0026] 本発明の請求項 6に記載の酵素活性の検出方法は、 (a)請求項 4の酵素活性検出 用粒子に、ァセチル化されたアミノ酸残基を有する前記第 1ィ匕合物又は前記第 2ィ匕 合物からァセチル基を遊離させる脱ァセチルイヒ酵素と、前記ァセチル基が遊離され た前記アミノ酸残基のペプチド結合を選択的に切断する特定酵素と、を含む検体溶 液を接触させ反応させる接触反応工程と、 (b)前記酵素活性検出用粒子と反応させ た前記検体溶液の蛍光測定を行う蛍光測定工程と、を備えた構成を有して！/ヽる。 この構成により、請求項 5に記載の作用に加え、以下のような作用が得られる。 (1)第 1ィ匕合物や第 2ィ匕合物の基質ペプチド等がァセチル化されている場合には基 質ペプチドを切断しないか、若しくは切断活性が有意に低下する特定酵素と、ァセチ ルイ匕されたペプチドからァセチル基を遊離させる脱ァセチルイ匕酵素と、を含む検体 溶液を酵素活性検出用粒子と接触させると、脱ァセチル化酵素によってペプチドか らァセチル基が遊離され、ァセチル基が遊離されたペプチドは特定酵素によって切 断され特定波長の蛍光を示すので、その検体溶液の蛍光強度等を基準にすれば、 抗癌剤等の候補ィ匕合物であるヒストン脱ァセチルイ匕酵素等の活性の阻害物質が、検 体溶液内にどの程度存在しているかを検出することができ、抗癌剤等の候補物質を 容易かつ迅速にスクリーニングすることができる。なお、既存のヒストン脱ァセチルイ匕 酵素活性の測定方法は、培養細胞の培地中に放射能標識された酢酸を添加し代謝 的に放射能標識したヒストンを用いる方法、蛍光物質で標識したァセチル化リジンを 用い反応生成物を逆相 HPLCで分離して測定する方法等の非常に煩雑な方法が用 いられていた。
[0027] ここで、脱ァセチルイ匕酵素としては、ヒストン脱ァセチルイ匕酵素等を挙げることがで きる。
[0028] 特定酵素としては、リジルエンドべプチダーゼ、プラスミン、カルバイン、トリプシン、 メタ口プロテアーゼ、ナラタケ (Armillaria mellea)プロテア一ゼ等を挙げることがで きる。これらのぺプチダーゼは、ペプチド中のリジン残基のァミノ基がァセチルイ匕され たペプチドを切断しないか切断活性が有意に低下するので、好適に用いられる。
[0029] 検体溶液としては、請求項 5で説明したものと同様なので、説明を省略する。
検体溶液中の特定酵素の濃度は、与えられた条件下で第 1化合物や第 2化合物の 基質ペプチドを十分に切断することができる濃度に設定される。例えば、基質べプチ ドの全てが脱ァセチルイ匕によって切断可能となった場合にも、与えられた測定条件 のもとで十分に切断活性を存在させる濃度にすることが望ましい。特定酵素の切断 活性が不足して脱ァセチルイ匕酵素の活性阻害物質の効果が低く見積られるのを防 止するためである。
[0030] 本発明の請求項 7に記載の酵素活性検出具は、通液路の上流に形成された入液 口と、前記入液口の下流に形成された出液口と、を備えた容器と、前記通液路に収 容され前記容器内に保持された請求項 1乃至 4の内いずれか 1に記載の酵素活性検 出用粒子と、を備えた構成を有している。
この構成により、以下のような作用が得られる。
(1)通液路の上流に形成された入液口と、入液口の下流に形成された出液口と、を 備えた容器と、通液路に充填され容器内に保持された酵素活性検出用粒子と、を備 えているので、入液口から尿等の検体溶液を容器内へ入れ、酵素活性検出用粒子 と接触反応させた後に出液ロカ 出た検体溶液の蛍光強度等を測定することによつ て、検体溶液中に活性を有する酵素が含まれる場合は蛍光基が検体溶液中に遊離 するので、検体溶液の蛍光強度等を指標として、検体溶液に活性を有する酵素が含 まれて 、るかどうかを簡単に検出することができる。
(2)測定を終えた後は、新しいものと容器毎交換することによって、新たな測定ができ 取扱性に優れる。
(3)酵素活性検出用粒子と接触した後に出液ロカ 出た検体溶液の蛍光強度等を 測定するため、酵素活性検出用粒子の蛍光に影響されずに検体溶液の測定を行う ことができるので、酵素活性検出用粒子力 切り離されることによる蛍光変化の大きさ を考慮せずに蛍光基を選択することができ自在性に優れる。粒子力 切り離される前 後の蛍光変化が小さい蛍光基を用いると、蛍光測定用マイクロプレート等を用いて微 量の検体溶液の蛍光波長等を測定する場合に粒子の蛍光波長等の影響を受け易く
、定量性が低下し測定精度が低下する問題が生ずるため、蛍光変化の大きさを考慮 して蛍光基を選択しなければならないからである。
発明の効果
以上のように、本発明の酵素活性検出用粒子及びそれを用いた酵素活性の検出 方法並びに酵素活性検出具によれば、以下のような有利な効果が得られる。
請求項 1に記載の発明によれば、
(1)同量の粒子と接触した検体溶液の蛍光波長の強度は、検体溶液内の酵素の濃 度に比例するため、検体溶液の蛍光波長の強度を測定することによって、酵素の有 無の検出だけでなぐ検体溶液内の酵素の定量分析も精度良く行うことができる酵素 活性検出用粒子を提供することができる。また、蛍光波長を測定する際に粒子の影 響を受け難く定量性が増し高い測定精度が得られる酵素活性検出用粒子を提供す ることがでさる。
(2)吸着水によって粒子同士が付着することがないので、塊状や水あめ状になること 力 Sなく秤量精度を高めることができるとともに取扱性に優れた酵素活性検出用粒子を 提供することができる。
(3)粒子の秤量誤差が生じ難ぐ使用時に一定量の粒子を秤量すれば、第 1化合物 及び第 1蛍光基の量が検体溶液間でばらつくのを最小限に抑えることができ秤量精 度を高め定量性を高めることができる酵素活性検出用粒子を提供することができる。 (4)自動ペプチド合成装置を用いて、粒子の表面に第 1化合物と第 1蛍光基とを結 合させ合成すれば製造できるため、ペプチドを切断する工程、精製する工程、凍結 乾燥工程等の煩雑な工程が必要なく生産性に著しく優れた酵素活性検出用粒子を 提供することができる。
(5)粒子と切断部位との距離を適正化して粒子の影響を受けずに酵素を作用させる ことができ、酵素活性の検出精度の高い酵素活性検出用粒子を提供することができ る。
[0032] 請求項 2に記載の発明によれば、請求項 1の効果に加え、
(1)フルォレセインの蛍光波長は薬等に含まれる蛍光物質の蛍光波長と区別するこ とができ、薬やビタミン剤等を服用している被験者の尿もそのまま検体溶液として用 いることができ汎用性に優れた酵素活性検出用粒子を提供することができる。
[0033] 請求項 3に記載の発明によれば、請求項 1又は 2の効果に加え、
(1)酵素によって基質ペプチドのペプチド結合が切断されると、第 2蛍光基と消光剤 との距離が離れることにより相互作用が起こらなくなり、第 2蛍光基力 の蛍光スぺタト ルへのスペクトル変化を酵素活性の測定指標にすることができ、これにより、蛍光強 度等の変化を指標として酵素活性を検出することができる酵素活性検出用粒子を提 供することができる。
[0034] 請求項 4の発明によれば、請求項 1乃至 3の内いずれか 1の効果にカロえ、
(1)特定酵素と、ァセチルイ匕されたペプチドからァセチル基を遊離させる脱ァセチル 化酵素と、を含む検体溶液を酵素活性検出用粒子と接触させると、脱ァセチル化酵 素によってペプチドからァセチル基が遊離され、ァセチル基が遊離されたペプチドは 特定酵素によって切断され特定波長の蛍光を示すので、その検体溶液の蛍光強度 等を基準にすれば、脱ァセチル化酵素の活性の阻害物質が、検体溶液内にどの程 度存在しているかを検出することができ、脱ァセチル化酵素の活性阻害物質を迅速 にスクリーニングすることができ、抗癌剤、白血病治療剤等の新薬の開発に繋がる有 用な物質の検索やスクリーニングを高効率で行うことができる酵素活性検出用粒子を 提供することができる。
[0035] 請求項 5に記載の発明によれば、 (1)酵素活性検出用粒子に酵素を含む検体溶液を接触反応させた後、検体溶液の 蛍光強度等を測定するだけで酵素活性を検出することができるので、測定時間を短 縮化することができ作業性を高め測定効率に優れた酵素活性の検出方法を提供す ることがでさる。
(2)蛍光測定によって酵素活性を検出するので、検出感度と測定精度を高めること ができる酵素活性の検出方法を提供することができる。
(3)種類の異なるペプチド等の各々に蛍光基が結合した酵素活性検出用粒子を、 9 6ゥエルの蛍光測定用マイクロプレートのゥエル等に入れた後、各ゥエル等の中に検 体溶液を注入しイメージセンサ等で広範囲の画像解析を行うことにより、複数の酵素 を含む検体溶液の酵素活性を短時間で網羅的に測定し解析することができ測定効 率を飛躍的に高めることができ、医薬品に繋がる有用な物質の検索やスクリーニング を高効率で行うことができる酵素活性の検出方法を提供することができる。
[0036] 請求項 6に記載の発明によれば、請求項 5の効果に加え、
(1)脱ァセチルイ匕酵素によってペプチドからァセチル基が遊離され、ァセチル基が 遊離されたペプチドは特定酵素によって切断され特定波長の蛍光を示すので、その 検体溶液の蛍光強度等を基準にすれば、抗癌剤等の候補化合物であるヒストン脱ァ セチルイ匕酵素等の活性の阻害物質が、検体溶液内にどの程度存在しているかを検 出することができ、抗癌剤等の候補物質を容易かつ迅速にスクリーニングすることが でき、新薬の開発に繋がる有用な物質の検索やスクリーニングを高効率で行うことが できる酵素活性の検出方法を提供することができる。
[0037] 請求項 7に記載の発明によれば、
(1)入液口から尿等の検体溶液を容器内へ入れ、酵素活性検出用粒子と接触反応 させた後に出液ロカ 出た検体溶液の蛍光強度等を測定することによって、検体溶 液中に活性を有する酵素が含まれる場合は蛍光基が検体溶液中に遊離し蛍光強度 等に変化が生じるので、検体溶液に活性を有する酵素が含まれているかどうかを簡 単に検出することができる酵素活性検出具を提供することができる。
(2)測定を終えた後は、新しいものと容器毎交換することによって、新たな測定ができ 取扱性に優れた酵素活性検出具を提供することができる。 (3)酵素活性検出用粒子の蛍光に影響されずに検体溶液の測定を行うことができる ので、酵素活性検出用粒子力 切り離されることによる蛍光変化の大きさを考慮せず に蛍光基を選択することができ自在性に優れた酵素活性検出具を提供することがで きる。
図面の簡単な説明
[図 1]実施の形態 1における酵素活性検出用粒子の酵素活性検出原理を示す模式 図
[図 2]実施の形態 2における酵素活性検出用粒子の酵素活性検出原理を示す模式 図
[図 3]実施の形態 2における酵素活性検出用粒子の変形例の模式図
[図 4]実施の形態 3における酵素活性検出用粒子の酵素活性検出原理を示す模式 図
[図 5]実施の形態 4における酵素活性検出用粒子の酵素活性検出原理を示す模式 図
[図 6]実施の形態 5における酵素活性検出具の模式図
符号の説明
1 酵素活性検出用粒子
2 粒子
3 第 1化合物
4 第 1蛍光基
5 酵素
6 第 1蛍光基
10 酵素活性検出用粒子
11 第 2化合物
12 消光剤
13 第 2蛍光基
14 酵素
15 第 2蛍光基 20 酵素活性検出用粒子
21 第 1化合物
22 第 1蛍光基
23 脱ァセチル化酵素
24 特定酵素
30 酵素活性検出用粒子
31 第 2化合物
32 消光剤
33 第 2蛍光基
34 脱ァセチル化酵素
35 特定酵素
36 第 2蛍光基
40 酵素活性検出具
41 容器
42 通液路
43 入液口
44 出液口
45, 46 フィルタ
47 酵素活性検出用粒子
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施するための最良の形態を、図面を参照しながら説明する。
(実施の形態 1)
図 1は本発明の実施の形態 1における酵素活性検出用粒子の酵素活性検出原理 を示す模式図である。
図中、 1は実施の形態 1における酵素活性検出用粒子、 2はハロゲンィ匕炭化水素類 ,エステル類等の溶媒に不溶性の合成樹脂 (ポリスチレン等)製やガラス製等で略球 状や多面体状等に形成された粒子、 3は一端に粒子 2が結合したアミノ酸，ペプチド 等の第 1ィ匕合物である。第 1ィ匕合物 3の Xは任意のアミノ酸残基を示している。 4は第 1化合物 3の他端に結合し第 1ィ匕合物 3とのペプチド結合や第 1ィ匕合物 3の切断部位 が後述する酵素 5によって切断される前後において、蛍光波長や蛍光強度に変化が 生じる蛍光基の 1種である 4 メチルクマリル 7 アミド（MCA) ,フルォレセインィ ソチオシァネート (FITC)等の第 1蛍光基、 5は第 1蛍光基 4と第 1化合物 3とのぺプ チド結合や第 1化合物 3の基質ペプチドを特定の切断部位で選択的に切断する検 体溶液中のメタ口プロテアーゼ等の基質特異性を有する酵素、 6は酵素 5によって第 1化合物 3の切断部位で切断されたことにより遊離し蛍光波長等が変化した第 1蛍光 基である。
[0041] 以上のように構成された酵素活性検出用粒子 1は、ペプチド等の第 1ィ匕合物 3を C 末端力 伸長していく固相法等の通常のペプチド合成法、 目的とするアミノ酸配列の C末端側から N末端側へ逐次伸長して ヽく逐次伸長法、複数の短!ヽペプチド断片を 合成しペプチド断片間のカップリングにより伸長させる断片縮合法、ペプチド合成機 を用いて Fmoc法、 Boc法等を導入して合成する方法等を用いて合成することができ る。
[0042] 以上のように構成された実施の形態 1における酵素活性検出用粒子について、以 下その酵素活性の検出原理を説明する。
図 1 (a)に示す酵素活性検出用粒子 1の 4 メチルクマリル 7 アミド (MCA) ,フ ルォレセインイソチオシァネート (FITC)等の第 1蛍光基 4は特定波長領域にぉ 、て 非蛍光物質であり、また粒子 2の表面に高密度に存在しているときは濃度消光により 蛍光強度が弱い。この酵素活性検出用粒子 1に酵素 5を含む検体溶液を接触させ反 応させると、基質特異性を有するメタ口プロテアーゼ等の酵素 5は、第 1蛍光基 4と第 1化合物 3との間のペプチド結合や第 1ィ匕合物 3の基質ペプチドを特定の切断部位 で選択的に切断する。
第 1化合物 3と遊離した第 1蛍光基 6は 7 アミノーメチルタマリン ( AMC)等の蛍光物 質となったり、粒子 2から離れることで濃度消光の効果が減少し、第 1蛍光基 6の蛍光 波長又は該特定波長領域における蛍光強度は、第 1化合物 3とペプチド結合した第 1蛍光基 4とは異なるので、検体溶液の蛍光強度等の変化を指標として酵素活性を 検出することができる（図 1 (b)参照)。 [0043] 以上のように、実施の形態 1における酵素活性検出用粒子は構成されているので、 以下のような作用が得られる。
(1)粒子 2と、粒子 2がー端に第 1蛍光基 4が他端に結合し検体溶液中の酵素 5によ る切断部位を有する第 1ィ匕合物 3と、を備えているので、粒子 2が酵素 5を含む検体 溶液と接触反応することによって、検体溶液の蛍光強度等の変化を指標として酵素 活性を検出することができる。
(2)粒子 2の表面に結合した第 1ィ匕合物 3に水が吸着しても、粒子 2の大きさに比べ て第 1ィ匕合物 3の大きさは著しく小さぐかつ、粒子 2の表面には微細な凹凸があるた め、吸着水によって粒子 2同士が付着することがないので、塊状や水あめ状になるこ とがなく秤量精度を高めることができるとともに取扱性に優れる。
(3)自動ペプチド合成装置を用いて、粒子 2の表面に第 1ィ匕合物 3,第 1蛍光基 4を 結合させ合成すれば製造できるため、合成されたペプチド等を切断し精製する工程 が不要で生産性を高めることができる。
(4)第 1ィ匕合物 3を有しているので、粒子 2と切断部位 (本実施の形態の場合は第 1 蛍光基 4と第 1ィ匕合物 3との間のペプチド結合)との距離を適正化して粒子 2の影響を 受けずに酵素 5を作用させることができ、酵素活性を正確に検出することができ検出 精度を高めることができる。
[0044] (実施の形態 2)
図 2は本発明の実施の形態 2における酵素活性検出用粒子の酵素活性検出原理 を示す模式図である。なお、実施の形態 1と同様のものは、同じ符号を付して説明を 省略する。
図中、 10は実施の形態 2における酵素活性検出用粒子、 11は後述する検体溶液 中の酵素 14の特定の切断部位を含む基質ペプチド，基質ペプチドにペプチド又は その他の化合物や分子が結合した分子鎖等の第 2ィヒ合物である。第 2ィヒ合物 11の X , Yは任意のアミノ酸残基等の原子団を示しており、端部の原子団 Yが粒子 2と結合 している。 12は第 2化合物 11の原子団 Yと結合するジニトロフエ-ル (Dnp) , 5 ジ メチルァミノ 1 ナフタレンスルホン酸 (Dns)等の消光剤、 13は第 2化合物 11の他 端に導入され消光剤 12と蛍光共鳴エネルギー移動がみられる（7—メトキシクマリン — 4—ィル)ァセチル (MOAc) ,トリブトファン (Trp)等の第 2蛍光基である。消光剤 1 2と第 2蛍光基 13は互いに蛍光に影響を及ぼす相互作用がみられる距離（100A以 下)で結合している。 14は検体溶液中に存在するセリンプロテアーゼ，ァスパラギン 酸プロテアーゼ，メタ口プロテアーゼ，システィンプロテアーゼ等の酵素、 15は第 2ィ匕 合物 11が酵素 14の基質特異性によって特定の切断部位で切断され遊離されたこと により蛍光波長等が変化した第 2蛍光基である。
[0045] 以上のように構成された実施の形態 2における酵素活性検出用粒子について、以 下その酵素活性の検出原理を説明する。
図 2 (a)に示す酵素活性検出用粒子 10の消光剤 12と第 2蛍光基 13は、互いに蛍光 に影響を及ぼす相互作用がみられる距離で結合しているので、消光剤 12の吸収ス ベクトルと第 2蛍光基 13の蛍光スペクトルとが重なりをもち、第 2蛍光基 13の励起波 長のエネルギーを当てると本来観察されるはずの第 2蛍光基 13の蛍光の減衰が観 察される。
酵素活性検出用粒子 10に酵素 14を含む検体溶液を接触させ反応させると、基質特 異性を有する酵素 14は、第 2化合物 11のペプチド結合を切断する。
第 2蛍光基 13が粒子 2から遊離すると、第 2蛍光基 13と消光剤 12との間で蛍光に影 響を及ぼす相互作用がみられなくなるので、検体溶液に第 2蛍光基 13の励起波長 のエネルギーを当てると、検体溶液との接触前には観察されな力つた第 2蛍光基 15 の蛍光波長が観察されるようになり、酵素 14の反応前の蛍光波長とは異なるため、 蛍光強度等の変化を指標として酵素活性を検出することができる（図 2 (b)参照)。
[0046] 以上のように実施の形態 2における酵素活性検出用粒子は構成されているので、 実施の形態 1に記載の作用に加え、以下のような作用が得られる。
(1)消光剤 12と第 2蛍光基 13を選択することにより、第 2蛍光基 13の蛍光波長を可 視部領域に設定することが可能になるので、市販の CCDカメラ等の可視光検出装置 を用いて測定することが可能になり汎用性に優れる。
(2)第 2ィ匕合物 11はアミノ酸配列を自由に選択することができるため、酵素 14として 、 N末端側及び C末端側のペプチド結合を選択的に切断する酵素、個々のアミノ酸 に対する基質特異性が高くなく切断作用の発現に比較的長いペプチド鎖を必要とす るエラスターゼ等の酵素の検出もできるようにすることができ、検出できる酵素の種類 を増やすことができ応用性に優れる。
[0047] 図 3は実施の形態 2における酵素活性検出用粒子の変形例を示す模式図である。
なお、実施の形態 2と同様のものは、同じ符号を付して説明を省略する。
図中、 10aは変形例の酵素活性検出用粒子、 12aは第 2ィ匕合物 11の端部のアミノ 酸残基等の原子団 Yと結合した消光剤であり、消光剤 12aは粒子 2とも結合している 変形例の酵素活性検出用粒子 10aの場合も、実施の形態 2で説明したように、酵 素によって第 2化合物 11の切断部位でペプチド結合が切断されると、消光剤 12aと 第 2蛍光基 13との距離が離れることによって第 2蛍光基 13の蛍光スペクトルが変化 するので、このスペクトル変化を酵素活性の測定指標にすることができ、検体溶液の 蛍光強度等の変化を指標として酵素活性を検出することができる。
[0048] (実施の形態 3)
図 4は本発明の実施の形態 3における酵素活性検出用粒子の酵素活性検出原理 を示す模式図である。なお、実施の形態 1と同様のものは、同じ符号を付して説明を 省略する。
図中、 20は実施の形態 3における酵素活性検出用粒子、 21は一端が粒子 2の表 面と結合するペプチド等の第 1ィ匕合物である。第 1ィ匕合物 21の Xは任意のアミノ酸残 基であり、 Zはァセチルイ匕されたリジン等のアミノ酸残基である。 22は第 1ィ匕合物 21 のアミノ酸残基 Xとペプチド結合したフルォレセインイソチオシァネート (FITC)等の 第 1蛍光基、 23はァセチル化されたアミノ酸残基 Z力もァセチル基 (Ac)を遊離させ る反応を触媒する検体溶液中のヒストン脱ァセチルイ匕酵素等の脱ァセチルイ匕酵素、 24は第 1化合物 21のアミノ酸残基 Zのペプチド結合を選択的に切断する検体溶液 中のメタ口プロテアーゼ等の特定酵素である。
[0049] 以上のように構成された実施の形態 3における酵素活性検出用粒子について、以 下その酵素活性の検出原理を説明する。
図 4 (a)に示す酵素活性検出用粒子 20のフルォレセインイソチオシァネート (FITC) 等の第 1蛍光基 22は濃度消光により蛍光強度が弱い。この酵素活性検出用粒子 20 に脱ァセチル化酵素 23と特定酵素 24とを含む検体溶液を接触させ反応させると、 脱ァセチルイ匕酵素 23が第 1ィ匕合物 21のアミノ酸残基 Z力もァセチル基 (Ac)を遊離 させる。なお、メタ口プロテアーゼ等の特定酵素 24は、第 1化合物 21のアミノ酸残基 Zがァセチルイ匕されている間は、ペプチド結合を切断しないか、若しくは切断活性が 有意に低下し、活性をほとんど示さない。
第 1ィ匕合物 21のアミノ酸残基 Zカもァセチル基が遊離されると、メタ口プロテアーゼ等 の特定酵素 24は、図 4 (b)に示すように、ァセチル基 (Ac)が遊離されたアミノ酸残基 Zの C末端側を選択的に切断する。
粒子 2から遊離した第 1蛍光基 22の蛍光波長又は該特定波長領域における蛍光強 度は、粒子 2と結合した第 1蛍光基 22とは異なるので、検体溶液の蛍光強度等の変 化を指標として酵素活性を検出することができる（図 4 (c)参照)。
従って、脱ァセチルイ匕酵素 23の活性を阻害する脱ァセチルイ匕酵素活性阻害物質 を検体溶液が含む場合、脱ァセチルイ匕酵素活性阻害物質を検体溶液が含まな ヽ場 合の各々の蛍光強度等を測定し比較することによって、その脱ァセチル化酵素活性 阻害物質が有効力否力の判定をすることができる。
[0050] 以上のように実施の形態 3における酵素活性検出用粒子は構成されているので、 以下のような作用が得られる。
(1)第 1ィ匕合物 21のアミノ酸残基 Zがァセチルイ匕されている場合にはペプチド結合を 切断しないか、若しくは切断活性が有意に低下する特定酵素 24と接触しても蛍光強 度等の変化は検出されない。しかし、特定酵素 24と、ァセチル化された第 1ィ匕合物 2 1からァセチル基を遊離させる脱ァセチルイ匕酵素 23と、を含む検体溶液を酵素活性 検出用粒子 20と接触させると、脱ァセチルイ匕酵素 23によって第 1ィ匕合物 21からァセ チル基が遊離され、第 1化合物 21は特定酵素によって切断され、遊離された第 1蛍 光基 22が特定波長の蛍光を示すので、その検体溶液の蛍光強度等を基準にすれ ば、抗癌剤等の候補ィ匕合物である脱ァセチルイ匕酵素の活性の阻害物質が、検体溶 液内にどの程度存在しているかを検出することができ、抗癌剤，抗腫瘍薬， 白血病治 療薬等の候補物質をスクリーニングすることができる。
[0051] (実施の形態 4) 図 5は本発明の実施の形態 4における酵素活性検出用粒子の酵素活性検出原理 を示す模式図である。なお、実施の形態 1と同様のものは、同じ符号を付して説明を 省略する。
図中、 30は実施の形態 4における酵素活性検出用粒子、 31は一端が粒子 2の表 面と結合したアミノ酸，ペプチド等の第 2ィ匕合物である。第 2ィ匕合物 31の Xは任意の アミノ酸残基力 なる原子団であり、 Zはァセチルイ匕されたリジン等のアミノ酸残基で ある。 32は第 2ィ匕合物 31の一端側に導入されたジニトロフエ-ル (Dnp) , 5 ジメチ ルァミノー 1 ナフタレンスルホン酸 (Dns)等の消光剤、 33は第 2ィ匕合物 31の他端 に導入され消光剤 32と互いに蛍光に影響を及ぼす相互作用がみられる距離（100 A以下）で結合した（7—メトキシクマリン一 4—ィル)ァセチル (MOAc) ,トリプトファ ン (Trp)等の第 2蛍光基、 34はァセチル化されたアミノ酸残基 Z力ゝらァセチル基 (Ac )を遊離させる反応を触媒する検体溶液中のヒストン脱ァセチルイヒ酵素等の脱ァセチ ル化酵素、 35は第 2ィ匕合物 31のアミノ酸残基 Zの C末端側のペプチド結合を選択的 に切断する検体溶液中のリジルエンドべプチダーゼ、プラスミン、カルバイン、トリプ シン、メタ口プロテアーゼ、ナラタケ (Armillaria mellea)プロテアーゼ等の特定酵 素、 36は第 2ィ匕合物 31が特定酵素 35によって切断され遊離されたことにより蛍光波 長等が変化した第 2蛍光基である。
以上のように構成された実施の形態 4における酵素活性検出用粒子について、以 下その酵素活性の検出原理を説明する。
図 5 (a)に示す酵素活性検出用粒子 30の消光剤 32と第 2蛍光基 33は、互いに蛍光 に影響を及ぼす相互作用がみられる距離で結合しているので、消光剤 32の吸収ス ベクトルと第 2蛍光基 33の蛍光スペクトルとが重なりをもち、第 2蛍光基 33の励起波 長のエネルギーを当てると本来観察されるはずの第 2蛍光基 33の蛍光の減衰が観 察される。
この酵素活性検出用粒子 30に脱ァセチル化酵素 34と特定酵素 35とを含む検体溶 液を接触させ反応させると、脱ァセチルイ匕酵素 34が第 2ィ匕合物 31のアミノ酸残基 Z 力もァセチル基 (Ac)を遊離させる。なお、特定酵素 35は、第 2化合物 31のアミノ酸 残基 Zがァセチルイ匕されている間は、ペプチド結合を切断しないか、若しくは切断活 性が有意に低下し、活性をほとんど示さない。
第 2化合物 31のアミノ酸残基 Zからァセチル基が遊離されると、特定酵素 35は、図 5 (b)に示すように、ァセチル基 (Ac)が遊離された第 2化合物 31のアミノ酸残基 Zのぺ プチド結合を切断する。
第 2蛍光基 33が粒子 2から検体溶液内に遊離すると、第 2蛍光基 33と消光剤 32との 間で蛍光に影響を及ぼす相互作用がみられなくなるので、検体溶液に第 2蛍光基 3 3の励起波長のエネルギーを当てると、検体溶液との接触前には観察されな力つた 第 2蛍光基 36の蛍光波長が観察されるようになり、検体溶液との反応前の蛍光波長 とは異なるため、蛍光強度等の変化を指標として酵素活性を検出することができる（ 図 5 (c)参照)。
従って、脱ァセチルイ匕酵素 34の活性を阻害する脱ァセチルイ匕酵素活性阻害物質 を検体溶液が含む場合、脱ァセチルイ匕酵素活性阻害物質を検体溶液が含まな ヽ場 合の各々の蛍光強度等を測定し比較することによって、その脱ァセチル化酵素活性 阻害物質が有効力否力の判定をすることができる。
[0053] 以上のように実施の形態 4における酵素活性検出用粒子は構成されているので、 実施の形態 3に記載の作用に加え、以下のような作用が得られる。
(1)第 2ィ匕合物 31はアミノ酸配列を自由に選択することができ、特定酵素 35も自由 に選択できるので、 C末端側のペプチド結合を選択的に切断する安定性に優れたリ ジルエンドべプチダーゼ等を特定酵素 35として用いることができ、酵素検出精度を 高めることができる。
[0054] (実施の形態 5)
図 6は本発明の実施の形態 5における酵素活性検出具の模式図である。 図中、 40は酵素活性検出具、 41は筒状等に形成された容器、 42は容器 41内に 形成された通液路、 43は通液路 42の上流に形成された入液口、 44は通液路 42の 下流に形成された出液口、 45は多孔状等に形成され入液口 43に配設されたフィル タ、 46は多孔状等に形成され出液口 44に配設されたフィルタ、 47はフィルタ 45, 46 の内側の通液路 42に収容され容器 41内に保持された酵素活性検出用粒子である。 なお、酵素活性検出用粒子としては、実施の形態 1乃至 5で説明したものを用いるこ とがでさる。
[0055] 以上のように構成された酵素活性検出具 40の使用方法について、以下説明する。
尿等の検体溶液を、入液口 43から容器 41内へ流入させ、容器 41の通液路 42を 通過させて出液口 44から流出させる。検体溶液は、通液路 42内に充填された酵素 活性検出用粒子 47と接触反応した後に出液口 44から流出されるので、出液口 44か ら流出された検体溶液の蛍光強度等を測定する。
[0056] 以上のように実施の形態 5における酵素活性検出具は構成されているので、以下 のような作用が得られる。
(1)酵素活性検出用粒子 47と接触反応した後に出液口 44から流出した検体溶液の 蛍光強度等を測定することによって、検体溶液中に切断活性を有する酵素が含まれ ているかどうかを簡単に検出することができる。また、酵素活性検出用粒子 47の蛍光 に影響されずに検体溶液の測定を行うことができるので、酵素活性検出用粒子 47か ら切り離されることによる蛍光変化の大きさを考慮せずに蛍光基を選択することがで き自在性に優れる。
(2)酵素活性検出用粒子 47が容器 41内に充填され保持されているので、測定を終 えた後は、新しいものと容器 41毎交換することによって、新たな測定ができ取扱性に 優れる。
実施例
[0057] 以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に 限定されるものではない。
本実施例で説明するアミノ酸、ペプチド、保護基、溶媒等は、当該技術分野で慣用さ れて 、る略号又は IUPAC-IUBの命名委員会で採用された略号を使用して 、る。例 えば、以下の略号を使用している。 Ala :ァラニン、 Lys :リジン、 13 Ala : βァラニン、 Glu ：グルタミン酸、 Gly :グリシン、 Arg :アルギニン、 FITC： Fluorescein- 4- isothiocyanate i somer- 1 (フルォレセインイソチオシァネート） 、 DMF : N,N—ジメチルホルムアミド、 DI EA : N,N—ジイソプロピルェチルァミン、 DCM :ジクロロメタン、卜 PrOH : 2-プロパノー ノレ、 MeOH：メタノ ~~ノレ、 Lys(Dnp)： (2S)— 2— amino— 6— (2,4— dinitrophenylamino)hexanoic acid, Pro :プロリン、 Arg :アルギニン、 Phe :フエ二ルァラニン、 Leu :ロイシン、 Val :ノ リ ン、 Asn :ァスパラギン、 Asp :ァスパラギン酸、 Tyr :チロシン、 Gin :グルタミン、 His :ヒス チジン、 Ser :セリン、 Thr :スレオニン。
[0058] (実施例 1)
実施例 1では、酵素活性検出用粒子としてのぺプチジル蛍光基結合球状粒子を合 成して酵素 Subtilisinによって活性測定を行った。以下、その方法について説明する
<ぺプチジル蛍光基結合球状粒子の合成 >
粒子としては球状の市販の NH - PEGA-resin (渡辺化学工業製、粒径約 0. 1mm)を
2
用いた。 Peptide synthesizer (Model 433A, Applied Biosystems)を用いて NH— PEGA
2
Resin (0.5 g, 25 μ mol)に、 Lys(Dnp)、 Zzz、 Yyy、 Xxx、 j8 Alaの 5つのアミノ酸を順に 導入した。なお、 Xxx、 Yyy、 Zzzは表 1に示すアミノ酸である。その後、プラスチックべ ッセルに粒子を入れ、 DMFをカ卩えて粒子を膨潤させた。 DMFを吸引除去した後、少 量の DMFに溶解させた FITC (30 μ mol, 12 mg), DMF (2 ml)及び DIEA (25 μ mol, 4 Λ μ \)を加え、室温で 3時間振とうした。反応液を吸引除去した後、 DMF (2 ml, 2回)、
DCM (2 ml, 2回)、 i-PrOH (2 ml, 2回)、 DMF (2 ml, 2回)、 MeOH (2 ml, 2回)、エー テル（2 ml, 2回）の順で粒子を洗浄した。その後、フエノール (75 mg)、 1 ,2-エタンジ チオール (25 μ 1)、チオア-ノール (50 μ 1)、蒸留水 (50 μ 1)及び TFA (2 ml)の混合溶 液と 3時間反応させた。反応液を吸引除去後、 DCM (2 ml, 2回)、 DMF (2 ml, 2回)、 20%ピぺリジン I DMF (2 ml, 2回)、 DMF (2 ml, 2回)、 i-PrOH (2 ml, 2回)、 DMF (2 ml , 2回)、蒸留水（2 ml, 2回)、エーテル (2 ml, 10)の順で粒子を洗浄し減圧乾燥する ことによって、 FITC力もなる第 2蛍光基が一端の /3ァラニンに結合し、ジニトロフエ- ル（Dnp)力 なる消光剤が他端のリジンに結合した β Ala-Xxx-Yyy-Zzz-Lysからなる 第 2化合物と、第 2ィ匕合物のリジンに結合した PEGA resinからなる粒子と、を有する 8 種類 (表 1に示すアミノ酸配列の試料 1〜8)の酵素活性検出用粒子を得た。
[0059] [表 1]
Figure imgf000028_0001
[0060] <酵素活性の測定 >
試料 1〜8の酵素活性検出用粒子の各々 1 mgに 0.01% Tween 20を含有する 20 mM Tris-HCl buffer(pH 8.0, NaCl lOOmM, CaCl 50 mM) 190 μ 1を加え、検体溶液とし
2
ての Subtilisin水溶液 10 1 (10 unit)をカ卩え、測定時間ごとにサンプルから 10 1とり、 bufferを 190 1力卩えて 96ゥエルプレートに移し、蛍光値を Perkin Elmer社製 Wallac 14 20 ARVO sxプレートリーダーにより測定した (測定時間 0.1秒)。検体溶液を加えて から 20分後の蛍光値の変化量 (検体溶液を加える前の蛍光値と検体溶液を加えて から 20分後の蛍光値との差) (励起波長 485 nm、蛍光波長 535 nm)を表 1の右列に示 す。
表 1に示すように、最も活性の高い試料 1と活性の低い試料 8とでは、蛍光値の変化 量に 10倍以上の違いが認められる。このことから、第 2化合物のアミノ酸配列の異な る酵素活性検出用粒子を用いて、各基質による Subtilisinの酵素活性の違 、を検出 することが可能なことが確認された。
[0061] (実施例 2)
実施例 2では、酵素活性検出用粒子としてのぺプチジル蛍光基結合球状粒子を合 成して酵素 Trypsinによって活性測定を行った。以下、その方法について説明する。 <ぺプチジル蛍光基結合球状粒子の合成 >
実施例 1で説明した方法と同様にして、 FITCからなる第 2蛍光基が一端の βァラニン に結合し、ジニトロフエニル (Dnp)力 なる消光剤が他端のリジンに結合した β Ala-X xx-Yyy-Zzz-Lysからなる第 2化合物と、第 2化合物のリジンに結合した PEGA resinか らなる粒子と、を有する 13種類 (表 2に示すアミノ酸配列の試料 9〜21)の酵素活性 検出用粒子を合成した。
[0062] [表 2]
Figure imgf000029_0001
[0063] <酵素活性の測定 >
試料 9〜21の酵素活性検出用粒子の各々 1 mgに 0.01% Tween 20を含有する 20 m M Tris-HCl buffer(pH 8.0, NaCl lOOmM, CaCl 50 mM) 190 μ 1を加え、検体溶液
2
としての Trypsin水溶液 16 1 (100 unit)をカ卩え、測定時間ごとにサンプルから 10 1と り、 bufferを 190 μ 1カ卩えて 96ゥエルプレートに移し、蛍光値を Perkin Elmer社製 Wallac 1420 ARVO sxプレートリーダーにより測定した (測定時間 0.1秒)。検体溶液を加え てから 60分後の蛍光値の変化量 (検体溶液を加える前の蛍光値と検体溶液を加え て力 60分後の蛍光値との差) (励起波長 485 nm、蛍光波長 535 nm)を表 2の右列に 示す。
表 2に示すように、最も活性の高い試料 9と活性の低い試料 21とでは、蛍光値の変化 量に 60倍以上の違いが認められる。このことから、第 2化合物のアミノ酸配列の異な る酵素活性検出用粒子を用いて、各基質による Trypsinの酵素活性の違いを検出す ることが可能なことが確認された。 [0064] (実施例 3)
実施例 3では、酵素活性検出用粒子としてのぺプチジル蛍光基結合球状粒子を合 成して酵素の活性測定を行い、酵素間の比較を行った。以下、その方法について説 明する。
<ぺプチジル蛍光基結合球状粒子の合成 >
実施例 1で説明した方法と同様にして、 FITCからなる第 2蛍光基が一端の βァラニン に結合し、ジニトロフエニル (Dnp)力 なる消光剤が他端のリジンに結合した β Ala-X xx-Yyy-Zzz-Lysからなる第 2化合物と、第 2化合物のリジンに結合した PEGA resinか らなる粒子と、を有する 4種類 (表 3に示すアミノ酸配列の試料 22〜25)の酵素活性 検出用粒子を合成した。
[0065] [表 3]
Figure imgf000030_0001
[0066] <酵素活性の測定 >
試料 22〜25の酵素活性検出用粒子の各々 1 mgに 0.01%Tween 20を含有する 20 m M Tris-HCl buffer(pH 8.0, NaCl lOOmM, CaCl 50 mM) 190 μ 1をカロえ、検体溶液と
2
しての Elastase水溶液 10 μ 1 (10 unit)、 Trypsin水溶液 10 μ 1 (10 unit)及び Subtilisin 水溶液 10 μ 1 (10 unit)をカ卩え、測定時間ごとにサンプルから 10 μ 1とり、 bufferを 190 μ 1を加えて 96ゥエルプレートに移し、蛍光値を Perkin Elmer社製 Wallac 1420 ARVO sxプレートリーダーにより測定した (測定時間 0.1秒)。検体溶液を加えて力も 60分 後の蛍光値の変化量 (検体溶液を加える前の蛍光値と検体溶液を加えてから 60分 後の蛍光値との差) (励起波長 485 nm、蛍光波長 535 nm)を表 3の右列に示す。
表 3に示すように、試料 22では Trypsinによる活性は Subtilisinによる蛍光変化の約 24 0分の 1である。また、試料 23では Elastaseによる活性は Subtilisinによる蛍光変化の 約 2倍であることが認められる。このことから、本実施例のアミノ酸配列の異なる酵素 活性検出用粒子は、酵素の基質特異性の違いによって、異なる蛍光変化を示すこと が確認された。
このことから、アミノ酸配列の異なる酵素活性検出用粒子を、 96ゥエルの蛍光測定用 マイクロプレートのゥエル等に入れた後、各ゥエル等の中に検体溶液を注入しィメー ジセンサ等で広範囲の蛍光の画像解析を行うことにより、複数の酵素を含む検体溶 液の酵素活性を短時間で網羅的に測定し解析することができ測定効率を飛躍的に 高めることができることが明らかになった。
また、アミノ酸配列の異なる複数種の酵素活性検出用粒子を合成し、アミノ酸配列毎 に別々の容器に収容した複数の酵素活性検出具を用意しておき、例えば、被験者 の尿を検体溶液として複数の酵素活性検出具に通過させ、通過した各々の検体溶 液の蛍光強度等を測定し記録しておく。これを毎日若しくは 1週間に 1回等のように 定期的に継続して測定し、以前の測定結果と比較することによって、尿中に含まれる 酵素の量や種類に変化が生じた力どうかを検知することができ、酵素活性検出用粒 子と接触した検体溶液の蛍光強度等を指標として体調に変化が生じているか否かを 診断することができる。
なお、本実施例にお!、ては、フルォレセインイソチオシァネート（FITC)力もなる第 2 蛍光基が一端に結合し、ジニトロフエ-ル (Dnp)力 なる消光剤が他端のリジンに結 合した第 2化合物と、第 2ィ匕合物のリジンに結合した PEGA resin力もなる粒子と、を有 する酵素活性検出用粒子を合成して、これと接触させた検体溶液の蛍光変化を測定 し、酵素活性の違いを検出できることを説明したが、第 2蛍光基として（7—メトキシク マリンー4 ィル)ァセチル (MOAc)等を用いた場合も、同様の結果が得られること を確認した。
また、 PEGA resin等の粒子が一端に FITC等の第 1蛍光基が他端に結合し酵素によ る切断部位を有する基質ペプチド等の第 1ィ匕合物を備えた酵素活性検出用粒子を 用いた場合も、これと接触させた検体溶液の蛍光変化を測定し、酵素活性の違いを 検出できることを確認した。
また、実施例 2で説明した試料 15の第 2ィ匕合物のリジン (Yyy)がァセチルイ匕された 酵素活性検出用粒子を合成し、これにヒストン脱ァセチル化酵素と、メタ口プロテア一 ゼ等の特定酵素と、を含む検体溶液を接触させ反応させた後、検体溶液の蛍光測 定を行 、測定値を比較すると、ヒストン脱ァセチルイヒ酵素の活性の阻害物質が多く 含まれている検体溶液では蛍光変化が少ないことが確認された。このことから、本実 施例の酵素活性検出用粒子を用いると、抗癌剤等の候補ィ匕合物であるヒストン脱ァ セチル化酵素の活性の阻害物質が検体溶液内にどの程度存在しているかを検出す ることができ、抗癌剤等の候補物質を容易かつ迅速にスクリーニングできることが明ら カゝになった。
産業上の利用可能性
本発明は、酵素活性を検出する酵素活性検出用粒子及びそれを用いた酵素活性 の検出方法並びに酵素活性検出具に関し、検体溶液の蛍光波長の強度を測定する ことによって、酵素の有無の検出だけでなく検体溶液内の酵素の定量分析も精度良 く行うことができ、また吸着水の影響を受け難く秤量誤差も生じ難いため取扱性に優 れるとともに測定精度を高め定量性を高めることができ、さらに合成したペプチドを切 断し精製する工程や凍結乾燥工程等の煩雑な工程が必要なく生産性に著しく優れ た酵素活性検出用粒子を提供することができ、また、粒子に酵素を含む検体溶液を 接触させた後、検体溶液の蛍光強度等を測定するだけで酵素活性を検出することが でき、測定時間を短縮ィ匕することができ作業性を高め測定効率に優れ、またイメージ センサ等で広範囲の画像解析を行うことにより、複数の酵素を含む検体溶液の酵素 活性を短時間で網羅的に測定し解析することができ測定効率を飛躍的に高めること ができ、医薬品に繋がる有用な物質の検索やスクリーニングを高効率で行うことがで きる酵素活性の検出方法を提供することができ、また、検体溶液の蛍光強度等を測 定することによって、検体溶液に活性を有する酵素が含まれているかどうかを簡単に 検出することができるとともに取扱性に優れる酵素活性検出具を提供することができ る。

Claims

請求の範囲
[1] 粒子と、一端に前記粒子が他端に第 1蛍光基が結合し酵素による切断部位を有す る第 1ィ匕合物と、を備えていることを特徴とする酵素活性検出用粒子。
[2] 前記第 1蛍光基が、フルォレセイン又はその誘導体であることを特徴とする請求項 1 に記載の酵素活性検出用粒子。
[3] 一端に第 2蛍光基が他端の原子団に消光剤が結合し酵素による切断部位を有す る第 2化合物と、前記第 2化合物の他端の前記原子団又は前記消光剤と結合した粒 子と、を備えていることを特徴とする酵素活性検出用粒子。
[4] 前記第 1ィ匕合物又は前記第 2ィ匕合物が、ァセチル化されたアミノ酸残基を有してい ることを特徴とする請求項 1乃至 3の内いずれか 1に記載の酵素活性検出用粒子。
[5] (a)請求項 1乃至 3の内いずれ力 1に記載の酵素活性検出用粒子に酵素を含む検 体溶液を接触させ反応させる接触反応工程と、 (b)前記酵素活性検出用粒子と反応 させた前記検体溶液の蛍光測定を行う蛍光測定工程と、を備えて!/ヽることを特徴とす る酵素活性の検出方法。
[6] (a)請求項 4の酵素活性検出用粒子に、ァセチル化されたアミノ酸残基を有する前 記第 1ィヒ合物又は前記第 2ィヒ合物力 ァセチル基を遊離させる脱ァセチルイヒ酵素と 、前記ァセチル基が遊離された前記アミノ酸残基のペプチド結合を選択的に切断す る特定酵素と、を含む検体溶液を接触させ反応させる接触反応工程と、（b)前記酵 素活性検出用粒子と反応させた前記検体溶液の蛍光測定を行う蛍光測定工程と、 を備えていることを特徴とする酵素活性の検出方法。
[7] 通液路の上流に形成された入液口と、前記入液口の下流に形成された出液口と、 を備えた容器と、前記通液路に収容され前記容器内に保持された請求項 1乃至 4の 内いずれか 1に記載の酵素活性検出用粒子と、を備えていることを特徴とする酵素 活性検出具。
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