CN113189074A - 一种超高灵敏度的蛋白酶数字检测方法 - Google Patents

一种超高灵敏度的蛋白酶数字检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种超高灵敏度的蛋白酶数字检测方法。所述方法包括以下步骤：(1)将蛋白酶标准品与磁珠抗体复合物混合，进行反应，收集反应物并与多肽混合，得到混合液；(2)将所述混合液注入微阵列微流控芯片，进行孵育，并检测荧光点占总颗粒的百分比；(3)构建所述百分比和蛋白酶浓度的数学关系；(4)按步骤(1)和步骤(2)所述检测样本的荧光点占总颗粒的百分比，并利用步骤(3)所述的数学关系计算样本中蛋白酶浓度。所述方法可实现蛋白酶高灵敏度检测，且操作简单，标准曲线拟合度高，可准确计算样品中蛋白酶的浓度。

Description

一种超高灵敏度的蛋白酶数字检测方法
技术领域
本发明属于酶检测技术领域，涉及一种超高灵敏度的蛋白酶数字检测方法。
背景技术
蛋白酶(Protease)是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类，内肽酶切割蛋白质或多肽底物分子内部肽键，外肽酶从蛋白质分子游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解；按其活性中心，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶；按其反应的最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。
蛋白酶广泛存在于动植物、微生物和病毒中。蛋白酶对所作用的反应底物具有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中特异的肽键，如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。蛋白酶在许多生命活动中起到重要作用，例如病毒编码的蛋白酶在许多病毒的复制过程中发挥重要功能，如逆转录病毒HIV-1的逆转录酶、整合酶，黄病毒HCV的NS3/4a蛋白酶，冠状病毒SARS-CoV2的3CL蛋白酶等，这些蛋白酶在病毒结构和非结构蛋白的分离、RNA聚合酶的产生、病毒粒子的组装和成熟中发挥重要作用，且人体内没有同源蛋白，因此是病毒检测和抗病毒药物筛选的理想靶点；再如天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族，是一组在细胞凋亡过程中起关键作用的蛋白酶。caspase蛋白酶原的激活是凋亡进程中的一个必要的决定性事件，激活的caspase裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡，细胞凋亡对于及时清除体内多余和受损伤的细胞，维持组织器官的稳定性具有重要作用，在生命科学领域中，通过检测caspase蛋白酶的活性来检测凋亡的细胞。
目前检测蛋白酶活性的原理相似，通常是基于荧光法进行检测。
CN112326620A公开了一种快速荧光蛋白酶活性检测方法，所述方法包括(1)预先设定一份蛋白酶含量值参考表；(2)配置荧光用探针的荧光溶液；(3)根据预先设定的蛋白酶含量值参考表对应不同颜色的荧光溶液；(4)创建蛋白酶荧光色参考表；(5)测定样品中是否有蛋白酶；(6)将含有蛋白酶的样品放入到荧光溶液中，进行培养；(7)进行荧光光谱跟踪检测，获得显示不同的荧光颜色，然后在蛋白酶荧光色参考表中查找对应的蛋白酶含量值。操作工艺简单，能够快速的发现检测样品中是否有蛋白酶，但检测蛋白酶灵敏度有限，且当样本中蛋白酶浓度较低时，易出现假阴性的结果。
综上所述，提供一种高灵敏度的蛋白酶检测方法，对于蛋白酶检测领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种超高灵敏度的蛋白酶数字检测方法，所述方法利用微阵列微流控芯片，使得荧光反应在微孔中进行，能够显著提高蛋白酶检测的灵敏度，并缩小反应体积。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种超高灵敏度的蛋白酶数字蛋白酶检测方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将蛋白酶标准品与磁珠抗体复合物混合，进行反应，收集反应产物并与多肽混合，得到混合液；
(2)将所述混合液注入微阵列微流控芯片，进行孵育，并检测荧光点占总颗粒的百分比；
(3)构建所述百分比和蛋白酶浓度的数学关系；
(4)按步骤(1)和步骤(2)所述检测样本的荧光点占总颗粒的百分比，并利用步骤(3)所述的数学关系计算样本中蛋白酶浓度。
本发明的蛋白酶检测方法中，利用磁珠抗体复合物捕获蛋白酶，随后将其分散于微阵列微流控芯片的反应微孔中，每个反应微孔含有1个或0个磁珠，使得荧光反应在飞升(fL)体积的微孔中进行，比传统荧光法等检测蛋白酶的反应体积缩小了109倍，可实现蛋白酶高灵敏度检测。
本发明的蛋白酶检测可用于病毒检测、肿瘤转移检测、病理生理蛋白酶活性检测或者水果、水产品等各类含高危微生物产品的检测等多种领域。
优选地，所述蛋白酶包括胰蛋白酶、3CL蛋白酶、Caspase家族蛋白酶、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、胶原酶、基质金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨基肽酶或羧肽酶中的任意一种。
优选地，步骤(1)所述磁珠抗体复合物包括磁珠和修饰于所述磁珠表面的抗蛋白酶抗体。
优选地，步骤(1)所述多肽包括所述蛋白酶的特异性酶切位点。
优选地，步骤(1)所述多肽修饰有荧光基团和淬灭基团。
本发明中，所述多肽一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团，当多肽保持完整时，荧光基团被淬灭，多肽不发光；当多肽被蛋白酶切割后，荧光基团发出荧光。若反应微孔中磁珠抗体复合物捕获到了蛋白酶，酶连续切割微孔中的多肽而发出荧光；若微孔中磁珠抗体复合物未捕获到蛋白酶，则多肽保持完整且不发荧光，在荧光显微镜下观察，获取各个反应微孔中的明场图片和荧光图片，从两幅照片中获得荧光点占磁珠总颗粒数的百分比，再根据利用蛋白酶标准品构建的标准曲线，可确定样品中蛋白酶的浓度。
优选地，步骤(1)所述反应的温度为4～37℃，包括但不限于5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃或36℃。
优选地，步骤(1)所述反应的时间为5～60min，包括但不限于6min、7min、8min、9min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、51min、52min、53min、54min、55min、58min或59min。
优选地，步骤(2)所述微阵列微流控芯片包括微阵列层和盖片层。
优选地，所述微阵列层包括20～150万个反应微孔，包括但不限于21万个、22万个、23万个、24万个、25万个、30万个、40万个、50万个、60万个、70万个、80万个、85万个、90万个、95万个、100万个、120万个、130万个、140万个、141万个、142万个、145万个、148万个或149万个。
优选地，步骤(2)所述孵育的温度为4～37℃，包括但不限于5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、15℃、20℃、25℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃或36℃。
优选地，步骤(2)所述孵育的时间为0.5～2h，包括但不限于0.6h、0.7h、0.8h、0.9h、1h、1.2h、1.4h、1.6h、1.8h或1.9h。
优选地，步骤(2)还包括向微阵列微流控芯片注入氟油的步骤。
优选地，步骤(3)包括构建所述百分比和蛋白酶浓度的标准曲线并拟合标准曲线方程。
优选地，所述方法还包括制备磁珠抗体复合物的步骤。
优选地，所述磁珠抗体复合物的制备方法包括以下步骤：
(1’)使用磷酸盐缓冲液清洗磁珠，并将清洗后的磁珠与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合，进行反应，收集磁珠，并使用2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液清洗；
(2’)将步骤(1’)得到的磁珠与抗蛋白酶抗体混合，进行反应，得到所述磁珠抗体复合物。
优选地，步骤(1’)所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为10～30mg/mL，包括但不限于11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、22mg/mL、25mg/mL、26mg/mL、27mg/mL、28mg/mL或29mg/mL。
优选地，步骤(1’)所述N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为10～30mg/mL，包括但不限于11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、22mg/mL、25mg/mL、26mg/mL、27mg/mL、28mg/mL或29mg/mL。
优选地，所述EDC和NHC使用MES缓冲液溶解。
优选地，步骤(1’)所述反应的时间为20～40min，包括但不限于21min、22min、23min、24min、25min、26min、30min、32min、34min、35min、36min、37min、38min或39min。
优选地，步骤(2’)所述反应的时间为30～60min，包括但不限于31min、32min、33min、34min、35min、40min、45min、50min、52min、53min、55min、56min或58min。
优选地，所述方法还包括制备微阵列微流控芯片的步骤。
优选地，所述微阵列微流控芯片的制备方法包括以下步骤：
(1”)将聚二甲基硅氧烷与固化剂混合，并进行除气脱泡处理，得到混合物；
(2”)将所述混合物注入微阵列层模具上，进行固化处理后裁片得到微阵列层；
(3”)将所述混合物注入盖片层模具上，进行固化处理后裁片，得到盖片层；
(4”)对所述微阵列层和盖片层进行等离子处理，将等离子处理后的微阵列层和盖片层叠合，得到所述微阵列微流控芯片。
优选地，步骤(1”)所述聚二甲基硅氧烷与固化剂的质量比为(8～12):1，包括但不限于9:1、10:1或11:1。
优选地，步骤(1”)所述固化剂包括正硅酸四乙酯和/或钛酸丁酯。
优选地，步骤(2”)所述固化处理的温度为60～90℃，包括但不限于61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、70℃、75℃、80℃、82℃、84℃、86℃、88℃或89℃。
优选地，步骤(2”)所述固化处理的时间为20～40min，包括但不限于21min、22min、23min、24min、25min、30min、31min、32min、34min、36min、38min或39min。
优选地，步骤(4”)所述等离子处理的功率为20％～80％，包括但不限于21％、22％、23％、24％、25％、26％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、72％、74％、76％、78％或79％。
优选地，步骤(4”)所述等离子处理的时间为20～100sec，包括但不限于21sec、22sec、23sec、24sec、25sec、26sec、30sec、35sec、40sec、50sec、60sec、70sec、80sec、90sec、91sec、92sec、93sec、94sec、95sec、98sec或99sec。
作为优选的技术方案，所述超高灵敏度的蛋白酶数字检测方法包括以下步骤：
(1)使用磷酸盐缓冲液清洗磁珠，并将清洗后的磁珠与10～30mg/mL EDC和10～30mg/mLNHS混合，进行反应20～40min，收集磁珠，并使用MES缓冲液清洗；
(2)将步骤(1)得到的磁珠与抗蛋白酶抗体混合，进行反应30～60min，得到磁珠抗体复合物；
(3)将蛋白酶标准品与所述磁珠抗体复合物混合，于4～37℃进行反应5～60min，收集反应物并与多肽混合，得到混合液；
(4)将所述混合液注入微阵列微流控芯片，静置5～15min后注入氟油，于4～37℃孵育0.5～2h，检测荧光点占总颗粒的百分比；
(5)构建所述百分比和蛋白酶浓度的标准曲线并拟合标准曲线方程；
(6)按步骤(3)和步骤(4)所述检测样本的荧光点占总颗粒的百分比，并利用步骤(5)所述的标准曲线方程计算样本中蛋白酶浓度。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明的蛋白酶检测方法中，利用磁珠抗体复合物捕获蛋白酶，随后将其分散于微阵列微流控芯片的反应微孔中，使得荧光反应在飞升(fL)体积的微孔中进行，可实现蛋白酶高灵敏度检测；
(2)本发明的蛋白酶检测方法，检测3CL蛋白酶的灵敏度可达90.97fg/mL，且操作简单，标准曲线拟合度高，可准确计算样品中蛋白酶的浓度。
附图说明
图1为微阵列微流控芯片放大100倍和200倍的明场图；
图2为本发明检测原理图；
图3为加入氟油后微阵列微流控芯片明场图，将磁珠固定在反应微孔内，并将未进入反应微孔的磁珠从出样口冲出；
图4为磁珠进入微阵列微流控芯片反应微孔内的100倍和200倍放大的明场图；
图5a和为3CL蛋白酶浓度为0时，荧光显微镜观察到的明场图；
图5b和为3CL蛋白酶浓度为0时，荧光显微镜观察到的荧光图；
图5c和为3CL蛋白酶浓度为100ng/mL时，荧光显微镜观察到的明场图；
图5d和为3CL蛋白酶浓度为100ng/mL时，荧光显微镜观察到的荧光图；
图6为微阵列微流控芯片检测3CL蛋白酶的标准曲线图；
图7为荧光法检测3CL蛋白酶的标准曲线图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例制备微阵列微流控芯片，所述芯片由
Figure BDA0003061123250000081
20143D CAD软件设计，由微阵列层和盖片层组成，微阵列层含有100万个圆形反应微孔，每个微孔只能容纳一个磁珠，微孔体积为fL级别，所述微阵列层和盖片层的材料为混合硅胶(聚二甲基硅氧烷(PDMS)与正硅酸四乙酯，质量比为10:1)，通过注射成型工艺生产。
具体生产过程包括：
(1)按质量比为10:1称取PDMS与正硅酸四乙酯，充分搅拌混匀后，在真空装置中进行除气脱泡处理；
(2)将除气脱泡后的混合物注射入微阵列层模具上，于80℃固化30min；
(3)将成形后的硅胶芯片从模具中剥离下来，得到微阵列层；
(4)将除气脱泡后的混合物注射入盖片层模具上，并按照微阵列层的尺寸裁片，打孔，2个孔分别用作进样口与出样口，得到盖片层；
(5)将所述微阵列层和盖片层等离子plasma处理30sec(功率60％)，并将微阵列层和盖片层对准叠合好按压密实，确保没有气泡，得到所述微阵列微流控芯片。
制备好的微阵列微流控芯片在显微镜下观察其微阵列的微孔结构，分别放大100倍和200倍的明场图片，如图1所示。
实施例2
本实施例制备磁珠抗体复合物，所述磁珠抗体复合物的制备方法包括以下步骤：
(1)取50μL羧基修饰的磁珠(5mg/mL)，使用PBS清洗2遍，分别加入预冷的20μL EDC(20mg/mL)和20μL NHS(20mg/mL)，EDC和NHS使用MES缓冲液溶解(20mM，pH 6)，室温震荡反应30min活化羧基基团，并使用磁架富集磁珠；
(2)使用预冷的MES缓冲液将步骤(1)富集的磁珠清洗磁珠3遍，加入20μg抗3CL蛋白酶抗体，室温震荡反应2h，使用磁架富集磁珠，弃去上清，使用预冷的MES缓冲液清洗磁珠3遍，加入Tris-BSA缓冲液(25mM Tris-HCl，0.1％Tween-20，0.5％BSA，pH 7.4)，室温震荡反应30min，封闭过量活化的羧基，使用磁架富集磁珠，得到所述磁珠抗体复合物，并将其重悬在Tris-甘氨酸缓冲液中，4℃保存备用。
实施例3
本实施例以冠状病毒的3CL蛋白酶为例进行检测。
检测的原理图如图2所示，具体包括以下步骤：(1)将实施例2制备的磁珠抗体复合物与3CL蛋白酶在PBS缓冲液中4℃反应60min，形成磁珠/抗体/3CL蛋白酶复合物，磁架富集磁珠，弃去上清，加入预冷的PBS清洗3遍，使用Tris-HCl缓冲液(20mM，pH7.0)重悬；
(2)向步骤(1)重悬液中加入荧光多肽底物(序列为Dabcyl-TSAVLQSGFRVM-FITC，其中Dabcyl为荧光淬灭基团琥珀酰亚胺酯；FITC为异硫氰酸荧光素)至终体积为50μL，然后从实施例1制备的微阵列微流控芯片的进样口将液体注入，室温静置5min后，再从进样口加入氟油，将未进入反应微孔的磁珠从出样口冲出，并将磁珠固定在反应微孔内，如图3所示和图4所示，37℃孵育1h，使用倒置荧光显微镜(OLYMPUS，IX73)观察图像，获取各个反应孔中的明场和荧光照片，使用Image J处理图像，从两幅照片中获得荧光点占总颗粒的百分比，图5a和图5b分别为3CL蛋白酶含量为0时的明场和荧光图像，荧光显微镜观察不到背景荧光信号；图5c和图5d分别为3CL蛋白酶含量为100ng/mL时的明场和荧光图像，荧光显微镜可观察到磁珠孔的荧光信号显著增强。
实施例4
本实施例对3CL蛋白酶的检测灵敏度进行分析，包括以下步骤：
(1)将实施例2所述磁珠抗体复合物与不同浓度的商业化3CL蛋白酶标准品(10ng/ml，1ng/mL，100pg/mL，10pg/mL，1pg/mL，100fg/mL，0)在PBS缓冲液中于37℃反应5min，磁架富集磁珠，并使用预冷的PBS清洗3遍，重悬在Tris-HCl缓冲液中(20mM，pH 7.0)；
(2)分别取100万个步骤(1)中处理得到的磁珠与100μg多肽底物(序列为Dabcyl-TSAVLQSGFRVM-FITC)混合于Tris-HCl缓冲液中，至终体积为50μL，随后使用微量注射泵分别将混合液注入微阵列微流控芯片的进样口，室温静置5min后，从进样口加入氟油，将未进入反应微孔的磁珠从出样口冲出，并将磁珠固定在反应孔内，37℃反应1h，使用倒置荧光显微镜(OLYMPUS，IX73)观察，获取微阵列微流控芯片各个反应微孔的明场和荧光照片，使用Image J处理图像，从两幅照片中获得荧光点占磁珠总颗粒的百分比；
(3)制作标准曲线，如图6所示，随着3CL蛋白酶浓度的增加，发荧光磁珠的比例也随之增加，检测的灵敏度计算方法为空白样品(3CL蛋白酶浓度为0)平均值+3SD(标准误差)，最终得出的灵敏度为90.97fg/mL，并且根据荧光点占总颗粒的百分比(x)和3CL蛋白酶浓度(y)拟合的标准曲线方程为y＝-34.119+17.866x。
实施例5
本实施例对健康人鼻拭子裂解液中3CL蛋白酶的回收率进行分析，包括以下步骤：
(1)样本的采集
采集健康志愿者的鼻拭子标本，将采样后的鼻拭子放入含有病毒裂解液的管内，旋紧管盖，标记好采样相关信息，完成样品取样，-80℃保存备用；
(2)进行检测
在鼻拭子样本液中加入已知浓度的3CL蛋白酶，至终浓度分别为1ng/mL，100pg/mL和10pg/mL，然后分别与实施例2所述磁珠抗体复合物反应30min，磁架富集磁珠，使用预冷的PBS清洗3遍，重悬在Tris-HCl缓冲液中(20mM，pH7.0)，取100万个磁珠与100μg多肽底物(序列为Dabcyl-TSAVLQSGFRVM-FITC)混合于Tris-HCl缓冲液中，至终体积为50μL，使用移液器将混合液注入微阵列微流控芯片的进样口，室温静置5min后，从进样口加入硅油，将未进入反应小孔的磁珠从出样口冲出，并将磁珠固定在反应孔内，37℃反应1h，使用倒置荧光显微镜(OLYMPUS，IX73)观察图像，获取各个反应孔中的明场和荧光照片，使用Image J处理图像，从两幅照片中获得荧光点占总颗粒的百分比；
(3)鼻拭子裂解液中3CL蛋白酶的回收率分析
根据荧光点占总颗粒的百分比，代入标准曲线方程y＝-34.119+17.866x，得出3CL蛋白酶的实际检测浓度，并计算回收率，3CL蛋白酶回收率(R％)的计算方式为：R％＝检出浓度/添加浓度。
结果如表1所示，3CL蛋白酶的回收率为85.2％～96.55％，回收率在可接受的范围内，说明本发明方法可有效检测样本中的3CL蛋白酶。
表1
Figure BDA0003061123250000121
对比例1
本对比例使用常规荧光法进行3CL蛋白酶标准品的检测灵敏度分析。
使用商业化3CL蛋白酶标准品，梯度稀释至5μg/mL，500ng/mL，50ng/mL，5ng/mL，500pg/mL，100pg/mL，0，每个反应体系加入100ng荧光多肽底物(Dabcyl-TSAVLQSGFRVM-FITC)，终体积为20μL，使用荧光定量PCR仪检测3CL蛋白酶的活性，反应程序设置为37℃，1h，每30秒采集一次荧光数据，共120个循环，检测结果如图7所示，由图7可知，每个浓度梯度的荧光强度随着时间的增加而增加，标准曲线方程为y＝400946+0.25074x，其中x表示3CL蛋白酶的浓度，y表示荧光强度，荧光法检测3CL蛋白酶的灵敏度的计算方法为空白样品平均值+3SD，最终得出的灵敏度为83pg/mL。
实施例4中结果表明，本发明所述蛋白酶检测方法检测的3CL蛋白酶的灵敏度为90.97fg/mL，比常规荧光法检测3CL蛋白酶灵敏度提高了近1000倍。
综上所述，本发明的蛋白酶检测方法，利用磁珠抗体复合物捕获蛋白酶，随后将其分散于微阵列微流控芯片的反应微孔中，使得荧光反应在飞升(fL)体积的微孔中进行，可实现蛋白酶高灵敏度检测，检测的3CL蛋白酶的灵敏度为90.97fg/mL，比常规荧光法检测3CL蛋白酶灵敏度提高了近1000倍。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种超高灵敏度的蛋白酶数字检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将蛋白酶标准品与磁珠抗体复合物混合，进行反应，收集反应产物并与多肽混合，得到混合液；
(2)将所述混合液注入微阵列微流控芯片，进行孵育，并检测荧光点占总颗粒的百分比；
(3)构建所述百分比和蛋白酶浓度的数学关系；
(4)按步骤(1)和步骤(2)所述检测样本的荧光点占总颗粒的百分比，并利用步骤(3)所述的数学关系计算样本中蛋白酶浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶包括胰蛋白酶、3CL蛋白酶、Caspase家族蛋白酶、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、胶原酶、基质金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨基肽酶或羧肽酶中的任意一种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述磁珠抗体复合物包括磁珠和修饰于所述磁珠表面的抗蛋白酶抗体；
优选地，步骤(1)所述多肽包括所述蛋白酶的特异性酶切位点；
优选地，步骤(1)所述多肽修饰有荧光基团和淬灭基团；
优选地，步骤(1)所述反应的温度为4～37℃；
优选地，步骤(1)所述反应的时间为5～60min。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述微阵列微流控芯片包括微阵列层和盖片层；
优选地，所述微阵列层包括20～150万个反应微孔；
优选地，步骤(2)所述孵育的温度为4～37℃；
优选地，步骤(2)所述孵育的时间为0.5～2h；
优选地，步骤(2)还包括向微阵列微流控芯片注入氟油的步骤。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)包括构建所述百分比和蛋白酶浓度的标准曲线并拟合标准曲线方程。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括制备磁珠抗体复合物的步骤；
优选地，所述磁珠抗体复合物的制备方法包括以下步骤：
(1’)使用磷酸盐缓冲液清洗磁珠，并将清洗后的磁珠与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合，进行反应，收集磁珠，并使用2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液清洗；
(2’)将步骤(1’)得到的磁珠与抗蛋白酶抗体混合，进行反应，得到所述磁珠抗体复合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1’)所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为10～30mg/mL；
优选地，步骤(1’)所述N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为10～30mg/mL；
优选地，步骤(1’)所述反应的时间为20～40min；
优选地，步骤(2’)所述反应的时间为30～60min。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括制备微阵列微流控芯片的步骤；
优选地，所述微阵列微流控芯片的制备方法包括以下步骤：
(1”)将聚二甲基硅氧烷与固化剂混合，并进行除气脱泡处理，得到混合物；
(2”)将所述混合物注入微阵列层模具上，进行固化处理后裁片得到微阵列层；
(3”)将所述混合物注入盖片层模具上，进行固化处理后裁片，得到盖片层；
(4”)对所述微阵列层和盖片层进行等离子处理，将等离子处理后的微阵列层和盖片层叠合，得到所述微阵列微流控芯片。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1”)所述聚二甲基硅氧烷与固化剂的质量比为(8～12):1；
优选地，步骤(1”)所述固化剂包括正硅酸四乙酯和/或钛酸丁酯；
优选地，步骤(2”)所述固化处理的温度为60～90℃；
优选地，步骤(2”)所述固化处理的时间为20～40min；
优选地，步骤(4”)所述等离子处理的功率为20％～80％；
优选地，步骤(4”)所述等离子处理的时间为20～100sec。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)使用磷酸盐缓冲液清洗磁珠，并将清洗后的磁珠与10～30mg/mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和10～30mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺混合，进行反应20～40min，收集磁珠，并使用2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液清洗；
(2)将步骤(1)得到的磁珠与抗蛋白酶抗体混合，进行反应30～60min，得到磁珠抗体复合物；
(3)将蛋白酶标准品与所述磁珠抗体复合物混合，于4～37℃进行反应5～60min，收集反应产物并与多肽混合，得到混合液；
(4)将所述混合液注入微阵列微流控芯片，静置5～15min后注入氟油，于4～37℃孵育0.5～2h，检测荧光点占总颗粒的百分比；
(5)构建所述百分比和蛋白酶浓度的标准曲线并拟合标准曲线方程；
(6)按步骤(3)和步骤(4)所述检测样本的荧光点占总颗粒的百分比，并利用步骤(5)所述的标准曲线方程计算样本中蛋白酶浓度。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117388227A (zh) * 2023-10-18 2024-01-12 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 使用检测微球测定样品中目标分子浓度的方法、计算机可读介质和分析设备

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020142351A1 (en) * 2001-02-02 2002-10-03 University Of Pennsylvania Peptide or protein microassay method and apparatus
CN1472339A (zh) * 2002-08-02 2004-02-04 � 赵 高通量细胞生物芯片检测技术及试剂盒
US20060134774A1 (en) * 2002-11-22 2006-06-22 Marligen Biosciences, Inc. Detection of protease enzymes
US20090023200A1 (en) * 2005-01-13 2009-01-22 Kyushu Institute Of Technology Particle for detecting enzyme activity, method for detecting the enzyme activity and enzyme activity detection device by the use thereof
US20090258382A1 (en) * 2007-12-15 2009-10-15 Schultz Gregory S Novel devices for the detection of the presence and/or activity of proteases in biological samples
CN103149185A (zh) * 2013-02-05 2013-06-12 苏州大学 一种新型高效的蛋白酶活性检测方法
US20160238612A1 (en) * 2013-09-23 2016-08-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York High-throughput single molecule protein identification
US20170219601A1 (en) * 2013-04-25 2017-08-03 Vladislav B. Bergo Eluting analytes from bead arrays
CN108085364A (zh) * 2017-12-25 2018-05-29 安阳师范学院 用于蛋白酶检测的多肽功能化磁球及比色检测法
CN112461802A (zh) * 2020-09-27 2021-03-09 苏州新格诺康生物技术有限公司 一种基于荧光共振能量转移的冠状病毒蛋白酶测活法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020142351A1 (en) * 2001-02-02 2002-10-03 University Of Pennsylvania Peptide or protein microassay method and apparatus
CN1472339A (zh) * 2002-08-02 2004-02-04 � 赵 高通量细胞生物芯片检测技术及试剂盒
US20060134774A1 (en) * 2002-11-22 2006-06-22 Marligen Biosciences, Inc. Detection of protease enzymes
US20090023200A1 (en) * 2005-01-13 2009-01-22 Kyushu Institute Of Technology Particle for detecting enzyme activity, method for detecting the enzyme activity and enzyme activity detection device by the use thereof
US20090258382A1 (en) * 2007-12-15 2009-10-15 Schultz Gregory S Novel devices for the detection of the presence and/or activity of proteases in biological samples
CN103149185A (zh) * 2013-02-05 2013-06-12 苏州大学 一种新型高效的蛋白酶活性检测方法
US20170219601A1 (en) * 2013-04-25 2017-08-03 Vladislav B. Bergo Eluting analytes from bead arrays
US20160238612A1 (en) * 2013-09-23 2016-08-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York High-throughput single molecule protein identification
CN108085364A (zh) * 2017-12-25 2018-05-29 安阳师范学院 用于蛋白酶检测的多肽功能化磁球及比色检测法
CN112461802A (zh) * 2020-09-27 2021-03-09 苏州新格诺康生物技术有限公司 一种基于荧光共振能量转移的冠状病毒蛋白酶测活法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEUK W. KAN ET AL.: "Isolation and detection of single molecules on paramagnetic beads using sequential fluid flows in microfabricated polymer array assemblies", 《LAB CHIP》 *
DAVID M RISSIN ET AL.: "Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations", 《NATURE BIOTECHNOLOGY》 *
SEUNG YONG LEE ET AL.: "Development of microbiochip for detection of metalloproteinase 7 using fluorescence resonance energy transfer", 《BIOCHIP J》 *
黄志平 等: "多肽荧光探针在蛋白质检测中的应用", 《中国科学：化学》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117388227A (zh) * 2023-10-18 2024-01-12 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 使用检测微球测定样品中目标分子浓度的方法、计算机可读介质和分析设备
CN117388227B (zh) * 2023-10-18 2024-05-31 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 使用检测微球测定样品中目标分子浓度的方法、计算机可读介质和分析设备

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