WO2006054500A1 - メチル化カテキン生合成酵素をコードする遺伝子 - Google Patents

メチル化カテキン生合成酵素をコードする遺伝子 Download PDF

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methyl group
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Mari Yamamoto
Masanobu Kirita
Manabu Sami
Mitsuo Ikeda
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Incorporated Administrative Agency National Agriculture And Food Research Organization
Asahi Breweries, Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein

Definitions

  • the present invention relates to a methyli-catechin biosynthetic enzyme gene that biosynthesizes methyl-pure catechin using epigallocatechin-3-0-gallate, epicatechin-3-0-gallate or an isomer thereof as a substrate.
  • the present invention relates to a method for producing tekin.
  • R to R represent a hydrogen atom or a methyl group, and at least one of R to R is a cate group.
  • Epoxylocatechin 3-O-gallate derivative represented by the general formula ( ⁇ )
  • Epigalocatechin 1-O-gallate (hereinafter sometimes abbreviated as “EGCG”) represented by the formula [1] is known to have an antiallergic action (Non-patent Document 2).
  • epi gallocatechin 3—O— (3—O-methyl) galate epicatechin 1—O— (3-0-methyl) gallate is known to be a catechin with higher antiallergic activity.
  • Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • Patent Document 2 As methods for methylating EGCG, there are methods described in Non-patent Document 3, Patent Document 2, and Patent Document 3, all of which are based on chemical synthesis / modification methods and are represented by the following formula: It was very difficult to specifically methylate the hydroxyl groups at the 3-, 4-, and 5-positions
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2000-159670
  • Patent Document 2 JP-A-61-145177
  • Patent Document 3 JP 2002-255810 A Patent Document 1: Sano M, Suzuki M, Miyase T, Yoshino K, Maeda— Yamamoto M: J. Agric. FoodChem., 47 (5), 1906-1910 (1999)
  • Non-patent document 2 Matsuo, N. et al., Allergy 1997, 52, p58-64)
  • Non-Patent Document 3 J. Biochem. 55, p205 (1964)
  • the problem to be solved by the present invention is that a methylated catechin biosynthetic enzyme gene capable of efficiently biosynthesizing methyli-repulsive protein having high antiallergic activity, a plasmid containing the gene, and a trait with the plasmid
  • An object of the present invention is to provide a converted organism, a method for producing methyli ⁇ catechin biosynthesis enzyme using the organism, and a method for producing methyli ⁇ catechin using the methylated catechin biosynthesis enzyme obtained by the production method.
  • the present inventors firstly isolated a methyl potato catechin synthase gene from "Benifuuki” which is a tea leaf containing methyl potato catechin, and transforms this gene into Escherichia coli. As a result, methyli catechin synthase was obtained. That is, the present invention relates to the following.
  • R to R represent a hydrogen atom or a methyl group, and at least one of R to R is a methyl group
  • Epoxylocatechin 3-O-gallate derivative represented by the general formula ( ⁇ )
  • R to R are the same as defined above, and at least one of R to R represents a methyl group
  • R to R represent a hydrogen atom or a methyl group, and at least one of R to R is a cate group.
  • Epoxylocatechin 3-O-gallate derivative represented by the general formula ( ⁇ )
  • R to R are the same as defined above, and at least one of R to R represents a methyl group
  • R to R represent a hydrogen atom or a methyl group, and at least one of R to R is a methyl group
  • Epoxylocatechin 3-O-gallate derivative represented by the general formula ( ⁇ )
  • Epicatechin-3-0-gallate derivatives represented by the following and their isomerism: A gene encoding a biosynthetic enzyme capable of exerting the biosynthetic activity of at least one selected methyl catechin.
  • the transformed organism according to (5) is a plant cell, plant tissue or plant. Transformant.
  • R to R represent a hydrogen atom or a methyl group, and at least one of R to R represents a methyl group.
  • Epoxylocatechin 3-O-gallate derivative represented by the general formula ( ⁇ )
  • Epicatechin-3-0-gallate represented by the general formula (I), wherein the methyli-catechin biosynthetic enzyme is reacted with at least one selected from the group consisting of gallate and isomers thereof as a substrate
  • R to R represent a hydrogen atom or a methyl group, and at least one of R to R represents a methyl group.
  • Epoxylocatechin 3-O-gallate derivative represented by the general formula ( ⁇ )
  • At least one of 1 to R represents a methyl group
  • the methyl-i-catechin biosynthetic enzyme produced by the methyl-i-catechin biosynthetic enzyme gene of the present invention uses anti-allergy, anti-cancer, anti-obesity, arteriosclerosis prevention, blood pressure using force techins such as EGCG as a substrate It is possible to efficiently produce methylated catechins that are highly resistant to elevation and antibacterial.
  • FIG. 1 is a diagram showing an electrophoretic image (SDS-PAGE) of an induced enzyme.
  • Lane a first molecular weight
  • lane b before expression induction
  • lane c after expression induction
  • the methylated catechin in the present invention means a compound represented by the general formula (I)
  • Epoxylocatechin 3-O-gallate derivative represented by the general formula ( ⁇ ) [0058] [Chemical 20]
  • Epicatechin-3-0-gallate derivatives represented by and their isomer power means at least one selected.
  • methylated catechin in the present invention include, for example, epicarocatechin.
  • methylicatechin biosynthetic enzymes are epigallocatechin 3-O-gallate, epicatechin 3-O-gallate and isomers thereof.
  • methylicatechin biosynthetic enzymes are epigallocatechin 3-O-gallate, epicatechin 3-O-gallate and isomers thereof.
  • As a substrate it is an enzyme that biosynthesizes at least one selected from the general formula (1), the general formula (II) and isomers thereof.
  • the gene for the methyl ⁇ catechin biosynthetic enzyme is a plant containing a flavonoid substance, preferably tea, and more preferably "Blue Heart Large Ban", “Benihonare”, “Benifuji” Tea varieties containing methyl potato catechins such as “Benifuuki” also extract total RNA and degenerate A gene fragment that is a candidate for the target gene may be obtained by RT-PCR using primers.
  • the gene encoding the methylated catechin biosynthetic enzyme in the present invention includes at least one base sequence selected from the base sequence group represented by SEQ ID NOs: 1, 3, and 5.
  • the gene of the present invention has at least 70% homology with at least one base sequence selected from the base sequence group represented by SEQ ID NOs: 1, 3, and 5 and is capable of producing methyl catechin catechins. It may be a gene encoding a biosynthetic enzyme capable of exerting synthetic activity. It should be noted that even if it has a homology of 70% or less, it may be a gene that can exert the biosynthesis activity of methyl catechin.
  • the candidate gene fragment only needs to be a vector capable of determining the base sequence for cloning into a vector.
  • a pUC vector, a pGEM vector, or the like can be used.
  • the form of the force vector is characterized in that it contains either the DNA of this gene or the RNA molecule encoding it!
  • the full-length gene can be obtained by determining the nucleotide sequence of the obtained gene fragment and performing the RACE-PCR method based on the sequence.
  • this gene is incorporated into an expression vector, and the vector may be a vector capable of protein expression.
  • a pET vector or a pQE vector can be used, which is characterized in that it contains either the DNA of this gene or the RNA molecule that encodes it!
  • a protein expression vector can express a protein by introducing it into an expressible host.
  • a plant cell, plant tissue, plant or microorganism can be transformed as a host into which a vector containing this gene is introduced.
  • the microorganism into which E. coli (Escherichia coli), yeast, Bacillus subtilis (genus Bacillus), or mold can be considered is characterized in that the enzyme-introducing host is capable of obtaining an enzyme activity for biosynthesizing methyl-tungsten.
  • the methylated catechin biosynthetic enzyme of the present invention encoded by at least one base sequence selected from the base sequence group represented by SEQ ID NOs: 1, 3, and 5 is represented by SEQ ID NOs: 2, 4, and 6.
  • the amino acid sequence group strength also has at least one selected amino acid sequence.
  • the transformant thus obtained is cultured under the optimum conditions for each organism.
  • the expression vector introduced into the transformant is of the type induced by IPTG
  • the target enzyme protein can be produced by adding IPTG to the medium during culture.
  • amino acid sequence group power represented by SEQ ID NOs: 2, 4, and 6 is an amino acid in which one or more amino acid residues are inserted, added, deleted or substituted in at least one selected amino acid sequence.
  • it may be a gene encoding an enzyme capable of exhibiting an enzyme activity for biosynthesizing methyl-repulsive force.
  • the organism used for the transformant either a type that produces the target enzyme in the microbial cell or a type that releases it outside the microbial cell can be used, but a type that releases the enzyme outside the microbial cell is preferably used.
  • the target crude enzyme can be obtained by removing the cells by centrifugation or the like.
  • the target crude enzyme can be obtained by treating the microbial cell with an ultrasonic lysing enzyme or the like and crushing the microbial cell. The obtained crude enzyme can be used as it is in the methyl cocoon reaction, but it is desirable to purify it as necessary, such as molecular weight fractionation.
  • the purified enzyme protein is suspended in a buffer solution having a pH of 4.5 to 8.5, preferably 6.5 to 8, and then added to EtjCtj ECtj 3 ⁇ 4- adenosyl- L-
  • Methyl catechin can be obtained in the reaction liquid by adding methionine (SAM) and reacting at 5 to 60 ° C, preferably 20 to 40 ° C.
  • SAM methionine
  • RNA was extracted after grinding “Benifuuki” tea lg in liquid nitrogen. Next, the following degenerate primers were designed and RT-PCR was performed using 2 ⁇ g of total RNA: o
  • the confirmed amplified band was recovered from the agarose gel, cloned into the pGEM-T vector (Promega), and then transformed into Escherichia coli JM-109 (Takara). did.
  • the obtained JM-109 strain was cultured with shaking in LB medium at 37 ° C overnight, the plasmid was extracted, and the base sequence of the insert was confirmed.
  • the pGEM-T vector having the enzyme protein gene as an insert was treated with restriction enzymes Ndel and BamHI attached to the primer during RT-PCR, and the insert was recovered by agarose electrophoresis.
  • the pET28a (+) vector (Novagen) was similarly treated with Ndel and BamHI, and after gel electrophoresis, the gel force vector was recovered.
  • the insert was cloned into the Ndel and BamHI sites of the pET28a (+) vector, and then transformed into E. coli BL21 (DE3) strain (STRATA GENE)
  • the obtained BL2KDE3) strain was cultured with shaking in LB medium at 37 ° C overnight, and part of it was transferred again to fresh LB medium. After incubation, IPTG was added to a final concentration of ImM, and 28 ° C. so The enzyme protein expression was induced by shaking culture. Centrifuge the expression-induced E. coli (7,000rpm X 10min, 4 ° C), and remove the precipitate in ImM
  • SAM S-adenosvl-L-methionine
  • the reaction was carried out at 30 ° C for 1 hour, 200 ⁇ 1 IN HC1 was added to stop the reaction, 8 ml of ethyl acetate was added, the mixture was shaken, and the organic layer was recovered by centrifugation (3000 g, 5 min).
  • epicarocatechin- 3-0-(3-O-methyl) gallate After adding 1% ascorbic acid of 200 1 and concentrating with suction, epicarocatechin- 3-0-(3-O-methyl) gallate, epicarocatechin 1- O- (4- O-methyl) ) Galate, Epigalocatechin-3—0— (3,5—O Dimethinole) Galate, Epigalocatechin-3—O— (3,4-O-dimethyl) gallate, Epicatechin 1—O— (3— O-methyl) gallate, epicatechin 3-O- (4 O-methinole) gallate, epicatechin 3-O- (3, 5-O dimethinole) gallate, epicatechin 3-O- (3, 4 O dimethyl) gallate, Epoxy (3-0-methyl) gallocatechin-3-0-gallate production was measured.
  • the methyl catechin biosynthetic enzyme produced by the methylated catechin biosynthetic enzyme gene of the present invention can efficiently produce a methylating power tekin excellent in antiallergy using a power techin such as EGCG as a substrate. Therefore, the present invention is extremely useful.

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Abstract

　【課題】　抗アレルギー活性の高いメチル化カテキンを効率的に生合成できるメチル化カテキン生合成酵素遺伝子を提供する。 　【解決手段】　配列番号１、３及び５で示される塩基配列群より選ばれた少なくとも一つの塩基配列を含んでなる、メチル化カテキンを生合成する酵素をコードする遺伝子。

Description

メチル化カテキン生合成酵素をコードする遺伝子
技術分野
[0001] 本発明は、ェピガロカテキンー3— 0—ガレート、ェピカテキンー3— 0—ガレートま たはそれらの異性体を基質として、メチルイ匕力テキンを生合成するメチルイ匕カテキン 生合成酵素遺伝子、メチル化カテキン生合成酵素遺伝子を含有するプラスミド、該プ ラスミドで形質転換された生物、該生物を用いるメチル化カテキン生合成酵素の製造 方法、及び該製造方法で得られたメチル化カテキン生合成酵素を用いるメチル化力 テキンの製造方法に関するものである。
背景技術
[0002] 化学式 (III)
[0003] [化 1]
Figure imgf000002_0001
[0004] で示されるェピガロカテキンー 3— 0—ガレート、化学式 (IV)
[0005] [化 2]
Figure imgf000002_0002
で示されるェピカテキンー3— 0—ガレートまたはそれらの異性体をメチルイ匕して得ら れる一般式 (I) [0007] [化 3]
Figure imgf000003_0001
[0008] (式中、 R〜Rは水素原子又はメチル基を表し、 R〜Rの少なくとも 1つカ^チル基
1 6 1 6
を表す)で示されるェピガロカテキンー 3— O—ガレート誘導体、一般式 (Π)
[0009] [化 4]
Figure imgf000003_0002
[0010] (式中、 R〜Rは前記定義に同じであり、 R〜Rの少なくとも 1つがメチル基を表す) で示されるェピカテキン 3— O—ガレート誘導体またはそれらの異性体は、抗ァレ ルギー剤として有用な天然由来の化合物である (特許文献 1、非特許文献 1)。
[0011] 近年、生活環境の変化によりアレルギー患者は急増している力 アレルギー疾患の 治療は長期に渡ることから、副作用がなく日常摂取しても問題がない食品によるァレ ルギー軽減ィ匕が強く望まれて 、る。茶の主要成分の一つである化学式 (V)
[0012] [化 5]
(V)
Figure imgf000003_0003
[0013] で示されるェピガロカテキン一 3— O—ガレート (以下、「EGCG」と略称することがある) は、抗アレルギー作用を有することが知られている（非特許文献 2)。最近になり、ェピ ガロカテキンー 3— O— (3— O—メチル）ガレートゃェピカテキン一 3— O— (3 - 0 - メチル)ガレート等は、さらに抗アレルギー活性が高いカテキン類であることが知られ ている
(特許文献 1、非特許文献 1)。
[0014] 一般の茶品種、 "やぶきた"は EGCGを多く含んでいる力 ェピガロカテキンー3— 0 一（3— 0—メチル）ガレートゃェピカテキンー3— 0—（3— O—メチル）ガレート等の V、わゆるメチルイ匕カテキンは全く含んで 、な 、。メチルイ匕カテキンを多く含む品種とし ては、 "青心大ばん"、 "べにほまれ"、 "べにふじ"、 "べにふうき"等が知られているが 、多くは普及しておらず入手が困難である。そこで、容易に入手できる EGCGをより付 加価値の高 、メチルイ匕カテキンに変換する方法が強く望まれて 、た。
[0015] EGCGをメチルイヒする方法としては、非特許文献 3、特許文献 2、特許文献 3に記載 の方法があるが、いずれも化学合成 ·修飾法によるものであり、次式で表されるガロイ ル基の 3位、 4位、 5位のヒドロキシ基を特異的にメチルイ匕することが非常に困難であ つた o
[0016] [化 6]
Figure imgf000004_0001
また、化学合成で製造した化学物質を食品として用いるのも困難なのが現状である 。そのため、部位特異的かつ高効率にメチルイ匕力テキンを生合成できる酵素の発見 が望まれていた。
特許文献 1：特開 2000-159670公報
特許文献 2：特開昭 61-145177号公報
特許文献 3：特開 2002-255810号公報 特許文献 1 : Sano M, Suzuki M, Miyase T, Yoshino K, Maeda— Yamamoto M: J. Ag ric. FoodChem., 47(5), 1906-1910 (1999)
非特許文献 2 : Matsuo, N. et al.， Allergy 1997, 52, p58- 64)
非特許文献 3 : J.Biochem.55,p205(1964)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0018] 本発明が解決しょうとする課題は、抗アレルギー活性の高いメチルイ匕力テキンを効 率的に生合成できるメチル化カテキン生合成酵素遺伝子、該遺伝子を含有するブラ スミド、該プラスミドで形質転換された生物、該生物を用いるメチルイ匕カテキン生合成 酵素の製造方法及び該製造方法で得られたメチル化カテキン生合成酵素を用いる メチルイ匕カテキンの製造方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0019] 本発明者らは上記課題を解決するために、まず、メチルイ匕カテキンを含む茶葉であ る"べにふうき"よりメチルイ匕カテキン合成酵素遺伝子を単離し、この遺伝子を大腸菌 に形質転換することにより、メチルイ匕カテキン合成酵素を得るに至った。すなわち、本 発明は以下に関するものである。
[0020] (1) 配列番号 1、 3及び 5で示される塩基配列群より選ばれた少なくとも一つの塩基 配列を含んでなる、一般式 (I)
[0021] [化 7]
Figure imgf000005_0001
[0022] (式中、 R〜Rは水素原子又はメチル基を表し、 R〜Rの少なくとも 1つがメチル基
1 6 1 6
を表す)で示されるェピガロカテキンー 3— O—ガレート誘導体、一般式 (Π)
[0023] [化 8]
Figure imgf000006_0001
[0024] (式中、 R〜Rは前記定義に同じであり、 R〜Rの少なくとも 1つがメチル基を表す）
1 5 1 5
で示されるェピカテキンー3— 0—ガレート誘導体及びそれらの異性体力 選ばれた 少なくとも 1種のメチルイ匕力テキンを生合成する酵素をコードする遺伝子。
[0025] (2) 配列番号 2、 4及び 6で示されるアミノ酸配列群力 選ばれた少なくとも 1つのァ ミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失若しくは置換さ れたアミノ酸を有し、一般式 (I)
[0026] [化 9]
Figure imgf000006_0002
[0027] (式中、 R〜Rは水素原子又はメチル基を表し、 R〜Rの少なくとも 1つカ^チル基
1 6 1 6
を表す)で示されるェピガロカテキンー 3— O—ガレート誘導体、一般式 (Π)
[0028] [化 10]
Figure imgf000006_0003
[0029] (式中、 R〜Rは前記定義に同じであり、 R〜Rの少なくとも 1つがメチル基を表す) で示されるェピカテキン—3— 0—ガレート誘導体及びそれらの異性体力 選ばれた 少なくとも 1種のメチルイ匕力テキンを生合成する酵素活性を発揮しうる酵素をコードす る遺伝子。
[0030] (3) 配列番号 1、 3及び 5で示される塩基配列群より選ばれた少なくとも一つの塩基 配列と 70%以上の相同性を有し、かつ、一般式 (I)
[0031] [化 11]
Figure imgf000007_0001
[0032] (式中、 R〜Rは水素原子又はメチル基を表し、 R〜Rの少なくとも 1つがメチル基
1 6 1 6
を表す)で示されるェピガロカテキンー 3— O—ガレート誘導体、一般式 (Π)
[0033] [化 12]
Figure imgf000007_0002
[0034] (式中、 R〜Rは前記定義に同じであり、 R〜Rの少なくとも 1つがメチル基を表す）
1 5 1 5
で示されるェピカテキンー3— 0—ガレート誘導体及びそれらの異性体力 選ばれた 少なくとも 1種のメチルイ匕カテキンの生合成活性を発揮し得る生合成酵素をコードす る遺 子。
[0035] (4) (1)〜（3)のいずれか 1項に記載の遺伝子を含有する組換え発現ベクター。
[0036] (5) (4)に記載の組換え発現ベクターで形質転換された生物体。
[0037] (6) (5)に記載の形質転換された生物体が微生物である形質転換体。
[0038] (7) (5)に記載の形質転換された生物体が植物細胞、植物組織または植物体であ る形質転換体。
[0039] (8) (6)〜（7)のいずれか 1項に記載の形質転換体を培養し、培養物中に産生され た酵素を単離し、精製することからなる、一般式 (I)
[0040] [化 13]
Figure imgf000008_0001
[0041] (式中、 R〜Rは水素原子又はメチル基を表し、 R〜Rの少なくとも 1つがメチル基
1 6 1 6
を表す)で示されるェピガロカテキンー 3— O—ガレート誘導体、一般式 (Π)
[0042] [化 14]
Figure imgf000008_0002
[0043] (式中、 R〜Rは前記定義に同じであり、 R〜Rの少なくとも 1つがメチル基を表す） で示されるェピカテキンー3— 0—ガレート誘導体及びそれらの異性体力 選ばれた 少なくとも 1種のメチルイ匕力テキンを生合成する酵素の製造方法。
[0044] (9) (6)〜（7)のいずれか 1項に記載の形質転換体を培養し、培養物中の産生物 からメチル化カテキン生合成酵素を単離し、化学式 (III)
[0045] [化 15]
Figure imgf000009_0001
[0046] で示されるェピガロカテキンー 3— 0—ガレート、化学式 (IV)
[0047] [化 16]
Figure imgf000009_0002
[0048] で示されるェピカテキンー3— 0—ガレート及びそれらの異性体力 なる群より選ば れる少なくとも 1種を基質として該メチルイ匕カテキン生合成酵素を反応させることを特 徴とする一般式 (I)
[0049] [化 17]
Figure imgf000009_0003
[0050] (式中、 R〜Rは水素原子又はメチル基を表し、 R〜Rの少なくとも 1つがメチル基
1 6 1 6
を表す)で示されるェピガロカテキンー 3— O—ガレート誘導体、一般式 (Π)
[0051] [化 18]
Figure imgf000010_0001
[0052] (式中、 R〜Rは前記定義に同じであり、 R
1〜Rの少なくとも 1つがメチル基を表す）
1 5 5
で示されるェピカテキンー3— 0—ガレート誘導体及びそれらの異性体力 選ばれた 少なくとも 1種のメチルイ匕カテキンの製造方法。
発明の効果
[0053] 本発明のメチルイ匕カテキン生合成酵素遺伝子により産生されるメチルイ匕カテキン生 合成酵素は、 EGCG等の力テキン類を基質として、抗アレルギー、抗がん、抗肥満、 動脈硬化予防、血圧上昇抑制、抗菌に優れたメチル化カテキンを効率的に製造でき る。
図面の簡単な説明
[0054] [図 1]誘導された酵素の電気泳動像 (SDS— PAGE)を示す図。レーン a：分子量マ 一力一、レーン b :発現誘導前、レーン c :発現誘導後
発明を実施するための最良の形態
[0055] 本発明におけるメチル化カテキンとは、一般式 (I)
[0056] [化 19]
Figure imgf000010_0002
(式中、 R R
1〜Rは水素原子又はメチル基を表し、
6 1〜Rの少なくとも 1つカ^チル基
6
を表す)で示されるェピガロカテキンー 3— O—ガレート誘導体、一般式 (Π) [0058] [化 20]
Figure imgf000011_0001
[0059] (式中、 R〜Rは前記定義に同じであり、 R〜Rの少なくとも 1つがメチル基を表す）
1 5 1 5
で示されるェピカテキンー3— 0—ガレート誘導体及びそれらの異性体力 選ばれた 少なくとも 1種を意味する。
[0060] 本発明におけるメチル化カテキンを具体的に例示すると、例えばェピガロカテキン
3— O—（3— O—メチル）ガレート、ェピガロカテキンー 3— O—（4 O—メチノレ） ガレート、ェピガロカテキンー3— 0— (3, 5— O ジメチノレ）ガレート、ェピガロカテキ ン一 3— O— (3, 4— O ジメチル）ガレート、ェピカテキン一 3— O— (3— O—メチル )ガレート、ェピカテキンー3— 0—（4 O—メチノレ）ガレート、ェピカテキンー3— 0 (3, 5— O ジメチノレ）ガレート、ェピカテキンー3— 0— (3, 4— 0 ジメチノレ）ガ レート、ェピ（3— 0—メチル)ガロカテキンー3— 0 ガレート等を挙げることができる
[0061] メチルイ匕力テキンを生合成する酵素（以下、「メチルイ匕カテキン生合成酵素」と呼ぶ ことがある）は、ェピガロカテキン 3— O—ガレート、ェピカテキン 3— O—ガレート 及びそれらの異性体を基質として、前記一般式 (1)、一般式 (II)及びそれらの異性体 力 選ばれた少なくとも 1種のメチルイ匕力テキンを生合成する酵素である。
[0062] 本発明の遺伝子組み換え技術は、既に一般化されて ヽるが、例えば Molecular Clo ning:Cold Spring Haroor Laboratory
Pressに記載されている方法で行うことができる。
[0063] メチルイ匕カテキン生合成酵素の遺伝子は、フラボノイド系の物質を含んでいる植物 体、好ましくは茶、さらに好ましくは"青心大ばん"、 "べにほまれ"、 "べにふじ"、 "ベ にふうき"等のメチルイ匕カテキンを含む茶品種力も総 RNAを抽出し、ディジェネレート プライマーを用いた RT-PCRにより、目的の遺伝子の候補となる遺伝子断片を取得す ればよい。
[0064] 本発明におけるメチル化カテキン生合成酵素をコードする遺伝子は、配列番号 1、 3及び 5で示される塩基配列群より選ばれた少なくとも一つの塩基配列を含むもので ある。
[0065] なお、本発明の遺伝子は、配列番号 1、 3及び 5で示される塩基配列群より選ばれ た少なくとも一つの塩基配列と 70%以上の相同性を有し、かつメチルイ匕カテキンの 生合成活性を発揮し得る生合成酵素をコードする遺伝子であってもよ ヽ。なお 70% 以下の相同性であっても、メチルイ匕カテキンの生合成活性を発揮し得る遺伝子であ ればよい。
[0066] 候補遺伝子断片はベクターにクローユングする力 塩基配列決定が可能なベクタ 一であればよい。例えば pUC系ベクターや pGEM系ベクター等を用いることができる 力 ベクターの形態は本遺伝子の DNAまたはそれをコードする RNA分子の!/、ずれか を含むことを特徴とする。得られた遺伝子断片については塩基配列を決定し、その配 列を基に RACE-PCR法を行うことにより、全長遺伝子を取得することができる。
[0067] 次に、この遺伝子を発現ベクターに組み込むが、ベクターはタンパク質発現が可能 なベクターであればよい。例えば、 pET系ベクターや pQE系ベクター等を用いることが できるが、本遺伝子の DNAまたはそれをコードする RNA分子の!/、ずれかを含むことを 特徴とする。タンパク質発現ベクターは、発現可能な宿主に導入することによってタン ノ ク質を発現させることが可能となる。
[0068] また、この遺伝子を含むベクターを導入する宿主として、植物細胞、植物組織、植 物体または微生物に形質転換することができる。微生物としては大腸菌 (Escherichi a coli)、酵母、枯草菌（Bacillus属）またはカビ等が考えられる力 導入宿主はメチ ルイ匕力テキンを生合成する酵素活性が得られることを特徴とする。
[0069] 配列番号 1、 3及び 5で示される塩基配列群より選ばれた少なくとも一つの塩基配列 からコードされる本発明のメチル化カテキン生合成酵素は、配列番号 2、 4及び 6で示 されるアミノ酸配列群力も選ばれた少なくとも 1つのアミノ酸配列を有するものである。
[0070] このようにして得られた形質転換体をそれぞれの生物体の最適な条件で培養する。 例えば、形質転換体に導入された発現ベクターが IPTGにより誘導されるタイプのもの であれば、培養時に培地中に IPTGを添加することにより、目的酵素タンパク質を生成 させることがでさる。
[0071] なお、配列番号 2、 4及び 6で示されるアミノ酸配列群力 選ばれた少なくとも 1つの アミノ酸配列おいて 1若しくは複数のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失若しくは置換さ れたアミノ酸であっても、メチルイ匕力テキンを生合成する酵素活性を発揮しうる酵素を コードする遺伝子であってもよい。
[0072] 形質転換体に用いる生物については、目的酵素を菌体内に産生するタイプあるい は菌体外に放出するタイプ何れを用いることができるが、菌対外に放出するタイプを 用いることが好ましい。菌体外に放出するタイプであれば、菌体を遠心分離等により 除去することにより目的の粗酵素を得ることができる。菌体内に産生するタイプであれ ば、菌体を超音波ゃ溶菌酵素等で処理し菌体を破砕することにより目的粗酵素を得 ることができる。得られた粗酵素はそのままでもメチルイ匕反応に用いることができるが 、分子量分画等必要に応じて精製することが望ましい。
[0073] 精製された当該酵素タンパク質を pH4.5〜8.5好ましくは pH6.5〜8の緩衝液に懸濁 し、 EtjCtjある ヽ ίま ECtjに ¾— adenosyl— L—
methionine (SAM)をカ卩え、 5〜60°C好ましくは、 20〜40°Cで反応させることにより、反 応液中にメチルイ匕カテキンを得ることができる。
[0074] 実施例
以下実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限 定されるものではない。
実施例 1
[0075] ("べにふうき"からの tota卜 RNAの抽出）
「べにふうき」茶葉 lgを液体窒素中で摩砕した後 total RNAを抽出した。次いで以下 に示す、ディジェネレートプライマーを設計し、 total RNA 2 μ gを用いて RT- PCRを行 つた o
[0076] 5 '側ディジェネレートプライマー： CAGTAYATWYTNGARACHAGTGT
3，側ディジェネレートプライマー： TGTGRGCAACDCCRGCTTTYTBAAT 配列記号： Y=C,T、 W=A,T、 R=A,G、 H=A,T,C、
D=G,A,T B=G,T,C、 N=A,C,G,T
RT-PCR産物をァガロースゲル電気泳動にかけた結果、確認された増幅バンドをァ ガロースゲルから回収し、 pGEM-Tベクター (プロメガ社)へクローユングした後、大腸 菌 JM-109株 (タカラ社)へ形質転換した。得られた JM- 109株を LB培地にて 37°Cで終 夜振とう培養し、プラスミドを抽出した後、インサートの塩基配列を確認した。
実施例 2
[0077] (遺伝子の全長の単離）
単離した遺伝子の塩基配列をもとに特異的プライマーを設計し、 5 '側と 3 '側の全長 を取得するために RACE-PCR法を行った。得られた PCR産物をァガロースゲル電気 泳動し、増幅バンドを回収した後、 pGEM-Tベクターへクローユングし、塩基配列を確 認した。その結果、本酵素タンパク質遺伝子の全長を単離した。
[0078] 次に、確認した塩基配列をもとに 5'および 3'末端配列のプライマーを設計し、本酵 素タンパク質遺伝子の全長を単離するために total RNA 3 gを用いて RT- PCRを行 つた。 PCR産物をァガロースゲル電気泳動し、増幅バンドを回収した。回収した PCR 産物を pGEM-Tベクターへクローユングし、大腸菌 JM109株へ形質転換後、再度塩 基配列を確認した。決定した塩基配列およびアミノ酸配列は配列表に示した。
実施例 3
[0079] (酵素タンパク質の発現誘導）
本酵素タンパク質遺伝子をインサートに持つ pGEM- Tベクターを RT-PCRの際にプ ライマーに付カ卩した制限酵素 Ndel、 BamHIで処理した後、ァガロース電気泳動してィ ンサートを回収した。また pET28a(+)ベクター (ノバジェン社)を同様に Ndel、 BamHI処 理し、ァガロース電気泳動後、ゲル力 ベクターを回収した。インサートを pET28a(+) ベクターの Ndel、 BamHIサイトへクローユングした後、大腸菌 BL21(DE3)株（STRATA GENE社)へ形質転換
した。得られた BL2KDE3)株を LB培地にて 37°Cで終夜振とう培養した後、その一部を 再度新 ヽ LB培地へ移し培養後 IPTGを最終濃度 ImMになるように添加し、 28°Cで 振とう培養して酵素タンパク質の発現誘導を行った。発現誘導した大腸菌を遠心分 離し（7,000rpm X 10min、 4°C)、沈殿物を ImM
DTTを含む 20mMリン酸 buffer(pH7.4)に懸濁した。この大腸菌懸濁液を超音波摩砕 し、再度遠心分離（7,500rpm X 10min、 4°C)した。上清をポアサイズ 0.45 μ mのフィル ターでろ過し、得られたろ液を粗酵素液として用いた。粗酵素液を 12%SDS-PAGEに て電気泳動した結果、酵素タンパク質の発現誘導を行って!/ヽな ヽ大腸菌を電気泳動 した場合と比較して、約 27kDa付近に発現した酵素タンパク質のバンドを確認した。 先に決定したアミノ酸配列より本酵素タンパク質の分子量は 27.6kDaであった。誘導 された酵素の電気泳動像を図 1に示す。
実施例 4
(酵素反応）
粗酵素液を用いて、下記の反応系により変換反応を行った。
lOOmM Tris— HCl(pH6.8)
0.2mM MgCl
2
25 μ EGCGある!/ヽ ίま ECG
80 u M S-adenosvl-L- methionine (SAM)
総容量 5ml
反応は 30°Cにて 1時間行った後、 200 μ 1の IN HC1を添加し反応を停止させ、 8mlの 酢酸ェチルを加え振とう後、遠心分離 (3000g, 5min)により有機層を回収し、 200 1の 1%ァスコルビン酸を添カ卩、吸引濃縮を行つた上で HPLCにてェピガロカテキン— 3 - 0 - (3— O—メチル）ガレート、ェピガロカテキン一 3— O— (4— O—メチル）ガレート 、ェピガロカテキンー3— 0—（3、 5— O ジメチノレ）ガレート、ェピガロカテキンー3 — O— (3、 4— O ジメチル）ガレート、ェピカテキン一 3— O— (3— O—メチル）ガレ ート、ェピカテキン 3— O—（4 O—メチノレ）ガレート、ェピカテキン 3— O—（3、 5— O ジメチノレ）ガレート、ェピカテキン 3— O—（3、 4 O ジメチル）ガレート、 ェピ（3— 0—メチル)ガロカテキンー3— 0—ガレート生成量の測定を行った。その 結果、粗酵素量に対し容量依存的にェピガロカテキン— 3— O— (3— O—メチル)ガ レート、ェピガロカテキンー 3— O— (4 O—メチノレ）ガレート、ェピガロカテキンー 3 — O—（3、 5— O—ジメチル）ガレート、ェピガロカテキン— 3— O— (3、 4— O—ジメ チノレ）ガレート、ェピカテキン一 3— 0—（3— O—メチノレ）ガレート、ェピカテキン一 3 — O—（4— O—メチル)ガレート、ェピカテキン一 3— O—（3、 5— O—ジメチル）ガレ ート、ェピカテキン一 3— O—（3、 4— 0—ジメチノレ）ガレート、ェピ（3— O—メチノレ） ガロカテキン一 3— O—ガレートが生成されていることが明ら力となった。（表 1)。また 、反応系から、ェピガロカテキンー3— 0—ガレー KEGCG)ゃェピカテキンー3— 0— ガレート (ECG)あるいは S- adenosyト L- methionine(SAM)を除くとメチルイ匕カテキンの生成は認められな力 た。
[0081] これらの結果から、メチルイ匕カテキンを合成する酵素を取得できたことが明ら力とな つた o
[0082] [表 1]
1 酵素反応により生成されたメチル化カテキン量（yg/ml) 添加酵素量 (ml)
0 0. 05 0 .1 0. .5 1. , 0 2. 0 ェピ力'ロカテキン- 3-0- (3- (?- チル）力'レ-ト 0 0. .8 2. 8 9. 9 32. 9 45. 4 ェピ力' Iカテキン -3-0- (4 - (？ チル）力'レ-ト 0 0. .2 0. 3 0. 6 2. 6 5. 7 ェピ力' α力 Ϊキン— 3 - £»-(3， 5 -。-シ'ヌチル）力'レ-ト 0 0. , 3 1. 3 2. 2 14. 1 44. 9 ェ匕'力' αカテキン- 3- -(3， 4 -。-シ'； (チル）力'レ-ト 0 0. , 1 0. 4 0. 9 5. 1 21. 3 ェピカテキン- 3- (7- (3- チル）力'レ-ト 0 0. .7 2. 4 1. 2 30. 1 42. 2 ェピカテキン- 3- 6»- (4-C- ル）力'レ-ト 0 0. .2 0. 4 0. 9 2. 9 4. 8 ェピ力 Ϊキン- 3- -(3, b-0-v ； <チル）力'レ-ト 0 0. .2 1. 6 2. 8 12. 5 49. 6 ェピ力 Ϊキン - 3 - 6·- (3, 4-ひ-シ'； (チル）力'レ-ト 0 0. , 1 0. 2 0. 7 3. 8 16. 6 ェピ (3-。- チル）力'ロカテキン- 3- tf-力'レ-ト 0 0. .6 2. 2 8. 3 26. 3 38. 1 産業上の利用可能性
[0083] 本発明のメチル化カテキン生合成酵素遺伝子により産生されるメチルイ匕カテキン生 合成酵素は、 EGCG等の力テキン類を基質として、抗アレルギーに優れたメチル化力 テキンを効率的に製造できるため、本発明は極めて有用である。

Claims

請求の範囲 [1] 配列番号 1、 3及び 5で示される塩基配列群より選ばれた少なくとも一つの塩基配列 を含んでなる、一般式 (I)
[化 1]
Figure imgf000017_0001
(式中、 R〜Rは水素原子又はメチル基を表し、 R〜Rの少なくとも 1つカ^チル基
1 6 1 6
を表す)で示されるェピガロカテキンー 3— O—ガレート誘導体、一般式 (Π)
[化 2]
Figure imgf000017_0002
(式中、 R〜Rは前記定義に同じであり、 R〜Rの少なくとも 1つがメチル基を表す)
1 5 1 5
で示されるェピカテキンー3— 0—ガレート誘導体及びそれらの異性体力 選ばれた 少なくとも 1種のメチルイ匕力テキンを生合成する酵素をコードする遺伝子。
[2] 配列番号 2、 4及び 6で示されるアミノ酸配列群から選ばれた少なくとも 1つのアミノ酸 配列において 1若しくは複数のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失若しくは置換された アミノ酸を有し、一般式 (I)
[化 3]
Figure imgf000018_0001
(式中、 R〜Rは水素原子又はメチル基を表し、 R〜Rの少なくとも 1つカ^チル基
1 6 1 6
を表す)で示されるェピガロカテキンー 3— O—ガレート誘導体、一般式 (Π)
[化 4]
Figure imgf000018_0002
(式中、 R〜Rは前記定義に同じであり、 R〜Rの少なくとも 1つがメチル基を表す)
1 5 1 5
で示されるェピカテキンー3— 0—ガレート誘導体及びそれらの異性体力 選ばれた 少なくとも 1種のメチルイ匕力テキンを生合成する酵素活性を発揮しうる酵素をコードす る遺 子。
[3] 配列番号 1、 3及び 5で示される塩基配列群より選ばれた少なくとも一つの塩基配列 と 70%以上の相同性を有し、かつ、一般式 (I)
[化 5]
Figure imgf000018_0003
(式中、 R〜Rは水素原子又はメチル基を表し、 R〜Rの少なくとも 1つカ^チル基 を表す)で示されるェピガロカテキンー 3— O—ガレート誘導体、一般式 (Π)
[化 6]
Figure imgf000019_0001
(式中、 R〜Rは前記定義に同じであり、 R〜Rの少なくとも 1つがメチル基を表す)
1 5 1 5
で示されるェピカテキンー3— 0—ガレート誘導体及びそれらの異性体力 選ばれた 少なくとも 1種のメチルイ匕カテキンの生合成活性を発揮し得る生合成酵素をコードす る遺 子。
[4] 請求項 1〜3の ヽずれか 1項に記載の遺伝子を含有する組換え発現ベクター。
[5] 請求項 4に記載の組換え発現ベクターで形質転換された生物体。
[6] 請求項 5に記載の形質転換された生物体が微生物である形質転換体。
[7] 請求項 5に記載の形質転換された生物体が植物細胞、植物組織または植物体であ る形質転換体。
[8] 請求項 6〜7のいずれか 1項に記載の形質転換体を培養し、培養物中に産生された 酵素を単離し、精製することからなる、一般式 (I)
[化 7]
Figure imgf000019_0002
(式中、 R〜Rは水素原子又はメチル基を表し、 R〜Rの少なくとも 1つカ^チル基
1 6 1 6
を表す)で示されるェピガロカテキンー 3— O—ガレート誘導体、一般式 (Π)
[化 8]
Figure imgf000020_0001
(式中、 R〜Rは前記定義に同じであり、 R〜Rの少なくとも 1つがメチル基を表す) で示されるェピカテキンー3— 0—ガレート誘導体及びそれらの異性体力 選ばれた 少なくとも 1種のメチルイ匕力テキンを生合成する酵素の製造方法。
請求項 6〜7のいずれか 1項に記載の形質転換体を培養し、培養物中の産生物から メチル化カテキン生合成酵素を単離し、化学式 (III)
[化 9]
Figure imgf000020_0002
で示されるェピガロカテキンー 3— 0—ガレート、化学式 (IV)
[化 10]
Figure imgf000020_0003
で示されるェピカテキンー3— 0—ガレート及びそれらの異性体力 なる群より選ば れる少なくとも 1種を基質として該メチルイ匕カテキン生合成酵素を反応させることを特 徴とする一般式 (I)
[化 11]
Figure imgf000021_0001
(式中、 R 〜Rは水素原子又はメチル基を表し、 R 〜Rの少なくとも 1つがメチル基
1 6 1 6
を表す）で示されるェピガロカテキンー 3— O—ガレート誘導体、一般式（II)
[化 12]
Figure imgf000021_0002
(式中、 R 〜Rは前記定義に同じであり、 R 〜Rの少なくとも 1つがメチル基を表す）
丄 ^ 1 5
で示されるェピカテキン一 3— O—ガレート誘導体及びそれらの異性体力 選ばれた 少なくとも 1種のメチルイ匕カテキンの製造方法。
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