WO2006051660A1 - Ｌ－アミノ酸の製造法 - Google Patents

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WO2006051660A1
WO2006051660A1 PCT/JP2005/018479 JP2005018479W WO2006051660A1 WO 2006051660 A1 WO2006051660 A1 WO 2006051660A1 JP 2005018479 W JP2005018479 W JP 2005018479W WO 2006051660 A1 WO2006051660 A1 WO 2006051660A1
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WO
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gene
amino acid
strain
prpc
microorganism
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/018479
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroshi Izui
Yoshihiko Hara
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co., Inc. filed Critical Ajinomoto Co., Inc.
Publication of WO2006051660A1 publication Critical patent/WO2006051660A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids

Definitions

  • the present invention relates to L-amino acids, particularly amino acids (L-arginine, L-glutamine, L-proline, L-ornithine, L-citrulline) produced through biosynthetic pathways with L-glutamic acid and L-glutamic acid as intermediates. ) Manufacturing method.
  • amino acids L-arginine, L-glutamine, L-proline, L-ornithine, L-citrulline
  • L-amino acids mainly L-glutamic acid
  • coryneform L-glutamic acid-producing bacteria belonging to the genus Brevibacterium, Corynebacterium, and Micropacteria, or mutants thereof.
  • Bacillus, Streptomyces, Penicillium, Syudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida, Serratia, Aeropacter aerogenes (current Enterobacter aerogenes), and Escherichia coli A method using a mutant strain is known.
  • the present inventors also disclosed a method for producing L-amino acids using microorganisms of the family Enterobacteriaceae belonging to the genus Klebsiella, Ervinia or Pantoea (US Pat. No. 6,197,555) ), And a method for producing L-glutamic acid using Enteropacter bacteria (US Pat. No. 6,3 3 1, 4 19).
  • L monoglutamate using cells containing recombinant DA containing a glutamic acid dehydrogenase genease gene derived from a bacterium belonging to the genus Corynepacteria Japanese Patent Laid-Open No. Sho 6 1-266 8 85
  • Production technology technology for increasing L-glutamic acid production ability by amplifying glutamic acid dehydrogenase gene, isocitrate dehydrogenase gene, aconitic hydrase gene, and citrate synthase gene Sho 6 3-2 1 4 1 8 9).
  • An object of the present invention is to provide a microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae that can efficiently produce L 1 amino acid, and to provide a method for efficiently producing L 1 amino acid using the strain. It is in.
  • the present inventors have improved the fermentation yield of L-amino acid by introducing the prpC gene into a microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae. And the present invention has been completed.
  • the present invention provides the following inventions.
  • microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae is a microorganism derived from Pantoea ananatis FERM BP-6614 strain or FERM BP-7207 strain .
  • amino acid according to any one of claims 1 to 4, wherein the amino acid is selected from the group consisting of L monoglutamic acid, L monoarginine, L monoglutamine, L-proline, L-ornithine, and L-citrulline. Manufacturing method.
  • the microorganism of the present invention is a microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae, which has an L-amino acid acid-producing ability and has been modified so that expression of the prpC gene is enhanced.
  • L-amino acid-producing ability means that a microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae (Entrobacteriaciae) is cultured in a medium. Sometimes it refers to the ability to produce and accumulate L-amino acids in cells or media to the extent that they can be recovered from the cells or media.
  • Microorganisms having L-amino acid-producing ability may be inherently L-amino acid-producing microorganisms, but microorganisms such as those shown below can be obtained using mutation methods or recombinant DNA technology. It may be a microorganism that belongs to the family Enterobacteriaceae that has been modified so as to have an amino acid-producing ability, or that has been given the ability to produce an L-amino acid by introducing the gene of the present invention.
  • L-amino acid refers to L-lysine, L-glutamic acid, L-threonine, L-valine, L-sip Icine, L-isoleucine, L-serine, L-aspartic acid, L-asparagine, L-glutamine, L —Arginine, L-cystine (L-cystine), L-methionine, L-phenylalanine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-glycine, L-alanine, L-one proline, L-one ornitine, L-citrulline , L-homoserine, especially L-glutamic acid, L-arginine, L-glutamine, L-proline, L-ornithine L-citrulline is desirable.
  • the microorganism used in the present invention is a microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae such as Escherichia, Enteropactor, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Ervinia, Salmonella, Morganella, etc. If it has the capability to do, it will not be specifically limited. Specifically, those belonging to the family Enterobacteriaceae can be used according to the classification described in the NCBI (Nat ional Center for Biotechnology Information) database.
  • the parent strain of the genus Escherichia used for obtaining the bacterium belonging to the genus Escherichia of the present invention is not particularly limited, but specifically, it is a book by Neidhardt et al. (Neidhardt, FC et al., Escherichia coli and Salmone lla Typhi murium). , American Society for Microbiology, Washington DC, 1029 table 1) can be used. Among them, for example, Escherichia coli. Specific examples of Escherichia coli include Escherichia coli W3110 (ATCC '27325) and Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076) derived from the wild type K12 strain of the prototype.
  • Pantoea ananatis is an example of the genus Pantoea.
  • enterobacter-agromerans has been re-established as Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii agromerans, etc. by 16 S rRNA nucleotide sequence analysis. Some are classified. In the present invention, as long as it is classified as a microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae, it may belong to either Enterobacter or Pantoea.
  • Pantoea Ananatis AJ 13355 (FERM BP— 6614), AJ 13356 (F ERM BP—6615), AJ 13601 (FERM BP— 7207) ) And their derivatives. These strains were identified as Enteropactor agglomerans at the time of isolation and deposited as Enteropactor agromerans, but as described above, they were reclassified as Pantoea Ananatis by 16S rRNA sequence analysis, etc. .
  • auxotrophic mutants In order to confer L-amino acid production ability, acquisition of auxotrophic mutants, analog resistant strains or metabolic control mutants, creation of recombinant strains with enhanced expression of L-amino acid biosynthetic enzymes, etc.
  • methods that have been adopted for breeding coryneform bacteria or bacteria belonging to the genus Escherichia can be applied (Amino Acid Fermentation Co., Ltd., Academic Publishing Center, first published on May 30, 1986, pp. 77-100. reference).
  • the auxotrophy, analog resistance, metabolic control mutation and other properties imparted may be singly or in combination of two or more.
  • L-amino acid biosynthetic enzyme whose expression is enhanced may be used alone or in combination of two or more. Furthermore, imparting properties such as auxotrophy, analog resistance, and metabolic regulation mutation may be combined with enhancement of biosynthetic enzymes.
  • an auxotrophic mutant with L-amino acid-producing ability an L-amino acid analog-resistant strain, or a metabolically controlled mutant
  • the parent strain is subjected to normal mutation treatment, that is, irradiation with X-rays or ultraviolet rays.
  • normal mutation treatment that is, irradiation with X-rays or ultraviolet rays.
  • L-amino acid-producing bacteria can also be obtained by enhancing the enzyme activity of L-amino acid biosynthetic enzymes by gene recombination.
  • L-daryumin-producing bacteria For example, the breeding of L-daryumin-producing bacteria can be performed as follows.
  • Enzymes involved in L-glutamate biosynthesis include, for example, glutamate dehydrogenase (hereinafter also referred to as “GDH”), glutamine synthetase, glutamate synthase, isocitrate dehydrogenase, aconite hydratase, and kennate synthate.
  • GDH glutamate dehydrogenase
  • glutamine synthetase glutamate synthase
  • glutamate synthase glutamate synthase
  • isocitrate dehydrogenase isocitrate dehydrogenase
  • aconite hydratase aconite hydratase
  • CS phosphoenolpyruvate carboxylase
  • PEPCJ phosphoenolpyruvate carboxylase
  • pyruvate carboxylase pyruvate dehydrogenase
  • pyruvate quiner Phosphoenolpyruvate synthase enolase
  • phosphodaricelum eveningase phosphoglycerate kinase
  • dalyceraldehyde mono-3-phosphate dehydrogenase ⁇ riophosphate isomerase
  • fructose bisphosphate aldolase phosphofructokinase And glucose phosphate isomerase.
  • CS methyl cinnamate synthase
  • PRPC methyl cinnamate synthase
  • L-glutamic acid-producing ability can be imparted by introducing a gene encoding an enzyme of the L-glutamic acid biosynthesis system into the host as follows. That is, a gene fragment encoding the L-glutamic acid biosynthesis gene is linked to a vector that functions in the host microorganism used for the production of L-glutamic acid, preferably a multi-copy vector, and recombinant DNA is used. And then transform the host. Transformation increases the number of copies of L-glutamate-enzyme-encoding genes in host cells and increases the expression level. As a result, the activities of these enzymes are enhanced.
  • the gene encoding the L-glutamic acid biosynthetic enzyme is not particularly limited as long as it is a gene that can be expressed in the host microorganism. Examples thereof include genes derived from Escherichia coli and coli, and genes derived from the genus Pantoea. . Since the entire genomic sequence for Escherichia coli has been clarified (Science 277 (5331), 1453-1474 (1997)), primers were synthesized based on the nucleotide sequences of these genes, and Escherichia coli These genes can be obtained by PCR using chromosomal DNA from microorganisms such as K-12.
  • the plasmid used for gene cloning may be any plasmid that can replicate autonomously in the Enterobacteriaceae family. Specifically, pBR322, PTWV228 (Takara Bio), MW119 (Nippon Gene) PUC 19, pSTV29 (manufactured by Takara Bio Inc.), RSF 1010 (Gene vol. 75 (2), p271-288, 1989), and the like. In addition, phage DNA vectors can be used.
  • a restriction enzyme that matches the end of the DNA fragment containing the target gene.
  • Ligation is usually performed using a ligase such as T 4 DNA NA ligase.
  • the target genes may be loaded on separate vectors or on the same vector. Methods such as DNA cleavage, ligation, chromosomal DNA preparation, PCR, plasmid DNA preparation, transformation, and setting of oligonucleotides used as primers are usually well known to those skilled in the art. This method can be adopted.
  • homologous recombination is performed using a sequence in which multiple copies exist on the chromosomal DNA as a target.
  • site-directed mutagenesis by gene replacement using homologous recombination has already been established, including a method using linear DNA and a method using a plasmid containing a temperature-sensitive replication origin (US Patent No. 1). No. 6303383, or JP 05-007491 A).
  • a sequence having multiple copies on a chromosome DNA a repetitive DNA and an inverted repeat existing at the end of a transposable element can be used.
  • a target gene can be mounted on a transposon, transferred, and introduced in multiple copies onto chromosomal DNA. Either method results in an increase in the number of copies of the gene of interest in the transformant, and as a result, the enzymatic activity of the L-monovalent amino acid biosynthesis system is enhanced.
  • the activity enhancement of the L-glutamic acid biosynthetic enzyme can also be achieved by substituting a strong expression regulatory sequence such as a promoter of the target gene (Japanese Patent Laid-Open No. 1). -215280).
  • a strong expression regulatory sequence such as a promoter of the target gene (Japanese Patent Laid-Open No. 1). -215280).
  • a promoter of the target gene Japanese Patent Laid-Open No. 1 a c promoter, trp promoter, trc promoter one, ta.
  • Promoters, lambda phage PR promoters, PL promoters, tet promoters, and the like are known as powerful promoters. By substituting these promoters, the enzyme activity is increased by enhancing the expression of the target gene.
  • the expression regulatory region such as the promoter of the target gene can be determined using a promoter search vector or gene analysis software such as GENETYX.
  • the replacement of the expression regulatory sequence can be performed, for example, in the same manner as the gene replacement using the above-described temperature sensitive plasmid.
  • microorganisms that have enhanced the activity of L-glutamic acid biosynthetic enzyme by the methods described above include those described in European Patent Application Publication No. 1078989, European Patent No. 0952221, and US Patent No. 6,682,912. it can.
  • the modification to confer L-dalumanic acid production ability is to reduce or eliminate the activity of the enzyme that catalyzes the reaction that diverts from the biosynthetic pathway of L-dalumanic acid to produce other compounds. You may go more.
  • Enzymes that catalyze reactions that branch off from the biosynthetic pathway of L_glutamate to produce compounds other than L-glutamate include 2-oxoglutarate dehydrogenase (hydrogenase with ⁇ -ketoglutarate), iso-enzyme lyase, phosphate Examples include acetyl transferase phrase, acetate kinase, acetohydroxy acid synthase, aceto lactate synthase, formate acetyl transferase, lactate dehydrogenase, glutamate decarboxylase, 1-pyrroline dehydrogenase and the like. Among these, it is particularly preferable to reduce or eliminate 2-oxoglutarate dehydr
  • a mutation that reduces or eliminates the activity of the enzyme in the cell may be introduced into the gene of the enzyme on the chromosome by a usual mutation treatment method.
  • a usual mutation treatment method for example, it can be achieved by deleting a gene encoding an enzyme on a chromosome by genetic recombination, or by modifying an expression regulatory sequence such as a promoter or Shine-Dalgarno (SD) sequence.
  • amino acid substitution is introduced into the region encoding the enzyme on the chromosome, termination codon is introduced (nonsense mutation), and frameshift mutation that adds or deletes one or two bases.
  • JP-A-2000-106869 and 2000-189169 describe methods for reducing or reducing 2-oxodaltalic acid dehydrogenase activity of microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae.
  • 2-Oxodal A microbe belonging to the family Enterobacteriaceae whose tartrate dehydrogenase activity is deficient or reduced is specifically,
  • L-arginine-producing bacteria examples include ⁇ -methylmethionine, ⁇ -fluorophenylalanine, D-arginine, arginine hydroxamic acid, S- (2-aminoethyl) monocystine, ⁇ -methylserine,) 3-2-chet
  • Examples include Escherichia coli mutant strains having resistance to dilauranin or sulfaguanidine (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 56-1060 598).
  • Escherichia coli 2 3 7 strain which is an L-arginine-producing bacterium that has a highly active N-acetylglutamate synthase and L-arginine-producing bacterium that has a mutation resistant to feedback inhibition by L-arginine.
  • Russian patent application 2 0 0 0 1 1 7 6 7 7) is also a suitable L-arginine producing strain. The stock became a Russian 'National' collection on April 10, 2000 in Russian National Microorganisms (VKPM), GNU Genet ika. ⁇ B-7925 ⁇ Deposited by number and transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on 18 May 2001.
  • Escherichia coli 3 82 strain Japanese Patent Laid-Open No. 2002-017342
  • Escherichia coli 3 8 2 strain was deposited on April 10, 2000 with the Russian National Institute of Industrial Microorganisms (VKPM) under the number VKPM B-7926.
  • L-arginine biosynthetic enzymes include N-acetyl glutamate synthase (argA), N-acetyl tilyl myristate reductase (argC;), ornithine acetyl transferase.
  • N-Acetylglutamate synthetase (argA) can be obtained by using a mutant gene in which the feedback inhibition by L-arginine is canceled by replacing the amino acid sequence corresponding to positions 15 to 19 of the wild type. More preferred. (European Application Publication No. 1170361)
  • L-citrulline and L-ornithine share the same biosynthetic pathway as L-arginine, and N-acetylmethylglutamate synthase (argA), N-acetylethyldartamyl phosphate reductase (argC), ol
  • argA N-acetylmethylglutamate synthase
  • argC N-acetylethyldartamyl phosphate reductase
  • ol It is preferable that the enzyme activities of acetylene acetyltransferase (argJ), N-acetyl glutamate kinase (argB), acetyl nitronitine transaminase (argD), and acetyl olnitine deacetylase (argE) are increased.
  • Preferred L-proline-producing bacteria of the present invention include 3,4-dehydroxyproline, azathidine-2-capoxylate resistant strain Escherichia coli 702 (VKPMB-8011), and 702 i lvA. 702i lvA strain (VKPMB-8012 strain), which is a deficient strain, and E. coli that enhanced the activity of the protein encoded by b2862 and b2683, or 2 or b3434 gene.
  • L-glutamine producing bacterium of the present invention are bacteria enriched with glutamine synthetase (glnA), and microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae that destroyed glutaminase.
  • glnA glutamine synthetase
  • microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae that destroyed glutaminase European Patent Application Publication No. 1424398
  • a strain having a mutant glutamine synthetase in which the second tyrosine residue is substituted with another amino acid residue can also be exemplified as a suitable L-glutamine producing bacterium.
  • US Patent Application Publication No. 2003-0148474 US Patent Application Publication No. 2003-0148474
  • L-arginine, L-ornithine, L-citrulline, L-proline, and L-glutamine are all amino acids generated through a biosynthetic pathway having L-monovaleric acid as an intermediate. Therefore, the above-described method for breeding L-glutamic acid-producing bacteria can also be applied to breeding L-arginine, L-ornithine, L-citrulline, L-proline, and L-glutamine producing bacteria.
  • the microorganism of the present invention is a microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae, which has L-amino acid-producing ability and has been modified so that the expression of the prpC gene is increased.
  • ⁇ the expression of the prpC gene was enhanced '' means that the number of PrpC product molecules per cell increased compared to the wild-type or prpC-unmodified strain compared to the parent strain or wild-type strain or Pn) This is the case when the activity per C product molecule is increased.
  • Examples of the microorganisms belonging to the wild-type Enterobacteriaceae to be compared include Escherichia coli MG1655 and Pantoea Ananatis A J 1 3 3 5 5.
  • “increased expression of the prpC gene” means that the parent strain originally has the prpC gene as well as a microorganism that has been modified to enhance the expression level of the prpC gene. However, it also includes microorganisms that have been rendered methyl citrate synthetase activity by introducing the prpC gene.
  • the increase in the expression level of the prpC gene can be confirmed by comparing the amount of prpC m-RNA with that of the wild type or non-modified strain.
  • methods for confirming the expression level include Northern hybridization and RT-PCR (Molecular cloning (Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2) 01).
  • the expression level may be any as long as it is increased compared to the wild strain or the unmodified strain, but for example, 1.5 times or more, more preferably 2 times or more, compared to the wild strain or the non-modified strain, It is desirable that it rises more than 3 times.
  • the protein encoded by the prpC gene of the present invention is a methyl citrate synthase, and the methyl quenate synthase increases as the expression level of the prpC gene increases.
  • Methyl citrate synthase activity is an activity that catalyzes the reaction to form 2-methyl citrate and CoA from propynyl CoA, water and oxaloacetate [EC 2.3.3.5], methyl citrate synthase activity Can be measured by the method of Horswill et al. (J Bacteriol. 1999 Sep; 181 (18): 5615-23.).
  • the protein encoded by the prpC gene of the present invention may have citrate synthetase activity together with methyl citrate synthase.
  • the citrate synthase activity is the activity that catalyzes the reaction to form citrate and CoA from acetyl CoA, water, and oxalate acetic acid [EC: 2.3.3-1], and citrate synthase.
  • the activity is preferably not inhibited by 2-oxodaltalic acid, NADH.
  • the citrate synthase activity can be measured by the method described in Biochem., Vol. 8, No. 11, 4497.
  • the fact that 2-oxodaltalic acid and NADH do not inhibit it means that oxalate synthase activity encoded by the prpC gene is not decreased by 2-oxodaltalic acid and NADH present in the medium or cells.
  • the activity was 95% or more, preferably 98% or more, more preferably 99%, with the addition of 2 mM 2-oxodaltalic acid. This means that the activity remains at 70% or more, desirably 80% or more, and more desirably 90% or more when 0.2 mM NADH is added.
  • the microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae of the present invention can be obtained by modifying the microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae having the ability to produce L-amino acid as described above so that expression of the PC gene is enhanced. Can do. However, L-amino acid-producing ability may be imparted after modification so that expression of the prpC gene is enhanced.
  • the microorganism of the parent strain preferably has citrate synthetase activity which is inhibited by 2-oxodaltalic acid and NADH.
  • the gene encoding the citrate synthase of the parent strain is the gl tA gene registered in NPJ15248. Report scitrate synthase [gi: 16128695].
  • the ⁇ prpC gene '' is the prpC gene of Escherichia coli (SEQ ID NO: 5 Genebank access ion No. AAC73436), and homologs thereof, wherein the encoded protein has methyl citrate synthase activity, yzzD, Sometimes called yahS.
  • Examples of the prpC gene of Escherichia coli include a gene encoding a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the prpC gene is cloned from microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae such as Pantoea, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Elpinia, and Yersinia based on the homology with the genes exemplified above. It may be one that is singed.
  • the prpC gene that can be used in the present invention is a primer prepared on the basis of a base sequence of a microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae whose sequence has already been clarified, for example, a primer shown in SEQ ID NO: 1 and PCR using the chromosomal DNA of microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae as a cage (PC: see polymerase chain reaction; see White, TJ et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)).
  • the adjacent region including the control region of prpC can be obtained.
  • PrpC homologues of other microorganisms can be obtained in the same manner.
  • the prpC gene homologue is a gene derived from other microorganisms, showing high similarity to the prpC gene of Escherichia coli and having a methyl citrate synthase.
  • the prpC gene derived from another microorganism has a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more of the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. And a protein encoding a protein having citrate synthase activity.
  • the prpC gene is substituted with 1 or several amino acids at one or several positions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, as long as the activity of the encoded protein, i.e., methyl citrate synthase activity is not impaired. It may encode a protein having an amino acid sequence deleted, inserted or added. Here, several are proteins of amino acid residues The number is preferably 2 to 20, more preferably 2 to 10, particularly preferably 2 to 5, although it varies depending on the position and type of the three-dimensional structure. In addition, such amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions are naturally occurring mutations (mutants or variants) such as those based on individual differences or species differences in the microorganisms that retain the rpC gene. Also included by
  • the substitution is preferably a conservative substitution which is a neutral mutation that does not change functionally.
  • a conservative mutation is between plie, trp, and tyr when the substitution site is an aromatic amino acid, and between leu, ile, and val when the substitution site is a hydrophobic amino acid.
  • a polar amino acid between gi n and asn
  • a basic amino acid between I ys, arg, and his
  • an acidic amino acid between asp and gl u
  • it is a mutation that substitutes between ser and thr.
  • conservative substitutions include ala to ser or thr, arg to gln, his or lys, asn to glu, gin, lys, hi s or asp, asp to asn, gl u or gin, cys to ser or ala, gin to asn, glu, lys, his, asp or arg, glu to gly, asn, gln, lys or asp , Gly to pro, his to asn, lys, gin, arg or tyr, i le to leu, met, val or phe, leu to i le, met, val or phe Replacement, lys to asn, glu> gin, his or ar g, met to i le, leu, val or phe, phe to trp, tyr, met, i le or leu, ser to thr or ala substitution, thr to ser
  • the prpC gene has a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, with respect to the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • a gene encoding a protein having a citrate synthase and / or methyl citrate synthase activity can be used.
  • the degeneracy of the gene may differ depending on the host to be introduced, it may be replaced with a codon that can be easily used by the host to which the prpC gene is introduced.
  • the prpC gene may have an N-terminal side or C-terminal side extended or deleted as long as amplification can improve the production of an L-amino acid.
  • the length of extension 'deletion is 50 or less, preferably 20 or less, more preferably 10 or less, particularly preferably 5 or less in amino acid residues. More specifically, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 may be extended or deleted by 5 amino acids from the 50 amino acids on the N-terminal side and 5 amino acids from the 50 amino acids on the C-terminal side.
  • the prpC gene further hybridizes under stringent conditions with a DNA having the base sequence consisting of the base number of SEQ ID NO: 5 or a DNA that has these base sequences. It may be DNA encoding a protein having acid synthase activity. “Stringent conditions” as used herein refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • Conditions for DM homologs of 5% or more to hybridize and DNAs having lower homology to not hybridize to each other, or conditions for washing ordinary Southern high pridase 60 include high pre-hydration at a salt concentration corresponding to l xSSC, 0.1 3 ⁇ 4 SDS, preferably 0.1 XSSC, 0.1% SDS.
  • the probe may have a partial sequence of the prpC gene.
  • Such a probe is prepared by a PCR reaction using oligonucleotides prepared based on the base sequence of each gene as a primer and a DNA fragment containing each gene in a saddle shape by a method well known to those skilled in the art. Can be made.
  • the conditions for washing after hybridization under the above conditions are as follows: 50 :, 2 X SSC, 0. SDS once or 2 to 3 The conditions for washing twice are mentioned.
  • Such a gene homologous to the prpC gene can be analyzed by, for example, site-directed mutagenesis so that the amino acid residue at a specific site of the encoded protein contains a substitution, deletion, insertion or addition. It can be obtained by modifying the sequence. It can also be obtained by a conventionally known mutation treatment as described below. Mutation treatment includes a method of in vitro treatment of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 with hydroxylamine or the like, and a microorganism carrying the gene, such as coryneform bacteria, by ultraviolet light or N-methyl-nitro-N-nitrosoguanidine.
  • NVG ethyl methane sulfonate
  • EMS ethyl methane sulfonate
  • the first method is to increase the number of copies of the gene by cloning the prpC gene on an appropriate vector and transforming the microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae using the obtained vector.
  • the base sequence of Escherichia coli is already known (GENBANK AAC73436 NP_414867. Reports methylci trate
  • the vector used for transformation can be a plasmid that can replicate autonomously among microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae, pUC19, pUC18, PB322, SF1010 HSG299, pHSG298, PHSG399, pHSG398, pS meta, STV29 (pHSG and pSTV are available from Yubara Bio Inc.), pMW119, pMW118, p ⁇ 219, and p218 218 (pMW is available from Nihon Bonjin).
  • phage DNA or transposon DNA may be used as a vector instead of plasmid.
  • a transformation method for example, a method in which a recipient cell is treated with calcium chloride to increase DNA permeability as described for Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A. , J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), a method for preparing a competent cell from cells in the growth stage as reported for Bacillus sputilis and introducing DNA.
  • DNA-receptive cells such as those known for Bacillus * subtilis, actinomycetes, and yeast, can be put into a protoplast or spheroplast ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ state that readily incorporates recombinant DNA into recombinant DNA. How to introduce (Chang, S. and
  • microorganisms can also be transformed by the electric pulse method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-207791).
  • Increasing the number of copies of a gene can also be achieved by introducing multiple copies of the target gene onto the chromosomal MA of the microorganism.
  • a homologous recombination method Experimentsin Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. ( 1972)
  • Repetitive DNA and inverted repeats present at the ends of transposable elements can be used as sequences that exist in multiple copies on chromosomal DNA.
  • a target gene can be mounted on a transposon and transferred to introduce multiple copies onto chromosomal DNA.
  • the gene of interest can also be integrated into the host chromosome by a method using Mu phage (Japanese Patent Laid-Open No. 2-109985).
  • the second method is to enhance the expression of the target gene by replacing the expression control sequence such as the promoter of the target gene with a strong one on the chromosomal DNA or plasmid.
  • the expression control sequence such as the promoter of the target gene
  • a strong one on the chromosomal DNA or plasmid for example, lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, etc. are known as strong promoters.
  • lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, etc. are known as strong promoters.
  • the replacement of the expression regulatory sequence can be performed, for example, in the same manner as the gene replacement using a temperature sensitive plasmid.
  • Examples of vectors having a temperature-sensitive replication origin that can be used for microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae of the present invention include: ) Plasmid PMAN997 described in the 99/03988 international publication pamphlet.
  • the expression regulatory sequence can also be replaced by a method using red recombinase of ⁇ phage (Datsenko, KA, PNAS (2000) 97 (12), 6640-6645). The modification of the expression regulatory sequence is combined with the method for increasing the gene copy number as described above. It may be allowed.
  • the microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae has the ability to accumulate L-glutamic acid in an amount exceeding the saturation concentration of L-glutamic acid in a liquid medium when cultured under acidic conditions (hereinafter referred to as L under acidic conditions). It may be a microorganism having an ability to accumulate monoglutamic acid). Such a microorganism may be one that has an ability to accumulate L-monophosphate under acidic conditions by enhancing the expression of the prpC gene, or inherently under acidic conditions. -It may have glutamic acid accumulation ability.
  • Pantoea Ananatis AJ 1 3355 was transferred to the Ministry of International Trade and Industry, Institute of Industrial Science, Biotechnology Institute of Technology (current name: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Biotechnology Institute of Technology), with the accession number FERM Deposited as P-16644, transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on January 1, 2001, and assigned the accession number FERM BP-6614.
  • the strain was identified as Enterobacter agglomerans at the time of its isolation, and was deposited as Enterobacter agglomerans AJ 13355. It has been reclassified to Pantoea ananatis (see Examples below).
  • strains A J 13356 and A J 1 3601 derived from A J 13355 are also deposited with the depository in the same manner as the Enteropacter aglomerans, but are described as Pantoea Ananathesis in this specification.
  • AJ13601 was deposited on August 18, 1999 at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry (Postal Code: 305-8566, 1st-3, East 1-3, Tsukuba, Ibaraki) under the accession number FE MP17156. It was transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on July 6, and the accession number FERM BP-7207 was assigned.
  • FERM BP-7207 was assigned.
  • L-amino acid can be produced by culturing the microorganism of the present invention described in ⁇ 1> in a medium, producing and accumulating L single amino acid in the medium, and collecting L single amino acid from the medium. .
  • a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and other organic micronutrients such as amino acids and vitamins as necessary can be used. Either synthetic or natural media can be used. Any kind of carbon source and nitrogen source may be used as long as the strain to be cultured is available.
  • a carbon source sugars such as glucose, glycerol, flack 1 ⁇ 1 s, sucrose, mal] ⁇ 1, mannose, galactose, starch hydrolysate, molasses etc. can be used, other acetic acid, ken acid etc.
  • Organic acids, alcohols such as ethanol can be used alone or in combination with other carbon sources.
  • ammonia salts such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium chloride, ammonium phosphate, and ammonium acetate can be used.
  • organic micronutrients amino acids, vitamins, fatty acids, nucleic acids, peptone containing these, casamino acids, yeast extracts, soybean protein degradation products, etc. can be used, and nutritional requirements that require amino acids for growth When using a sex mutant, it is preferable to capture the required nutrients.
  • inorganic salts phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts and the like can be used.
  • the aeration culture is preferably carried out by controlling the fermentation temperature 20 to 45 ° C> pH to 3 to 9. If the pH drops during the culture, for example, add calcium carbonate or neutralize with an ammonia gas or the like. Under such conditions, a significant amount of L-glutamic acid is accumulated in the culture medium, preferably by culturing for about 10 hours to 120 hours.
  • the culture can be performed while precipitating monoglutamic acid in the medium.
  • the conditions for precipitation of L-glutamic acid are, for example, pH 5.0 to 4.0, preferably pH 4.5 to 4.0, more preferably pH 4.3 to 4.0, particularly preferably Can mention pH 4.0.
  • the method for collecting L-monoglutamic acid from the culture solution after completion of the culture may be performed according to a known recovery method. For example, the cells are collected by removing the cells from the culture solution and then concentrating and crystallizing, or using ion-exchange chromatography.
  • L-glutamic acid precipitated in the culture solution can be collected by centrifugation or filtration.
  • L-glutamic acid dissolved in the medium may be crystallized and then isolated together.
  • prpC gene encoding methyl citrate synthase
  • gl tA gene encoding citrate synthase
  • the prpC gene was amplified and cloned by PCR.
  • the PCR primer was designed according to the base sequence described in GenBank access ion No. AAC73436.
  • primers oligonucleotide GLTEZS0 shown in SEQ ID NO: 1 and GLTEEZA1 shown in SEQ ID NO: 2, and chromosomal DNA of E. coli W31 10 strain (distributed from National Institute of Genetics) as ⁇ -type DNA were used. DNA fragments were amplified using LA-TaQ polymerase under the standard conditions.
  • the amplified DNA fragment was ligated to the plasmid vector pGEM-Teasy from Promega, and the prpC gene was Plasmid pGEMprpC carrying the pup was prepared. Furthermore, the plasmid pGEMprpC was treated with the restriction enzymes Smal and HindlE, and inserted into the same site of pSTV28 manufactured by Kara Bio Inc. to prepare the prpC gene amplification plasmid pSTVprpC.
  • the gl tA fragment encoding wild-type citrate synthase was cloned simultaneously for comparison.
  • the wild-type gltA gene of Escherichia coli encodes oxalate synthase that is inhibited by 2-oxodaltalic acid, NADH.
  • Oligonucleotides GLTES2 (SEQ ID NO: 3) and GLTEA2 (SEQ ID NO: 4) were used as PCR primers, E. coli W3110 strain chromosomal DNA was used as the vertical DNA, and LA-TaQ polymerase from Yukara Bio Inc. was used. The DNA fragment was amplified under the standard conditions. The amplified DNA fragment was ligated to the plasmid vector pGEM-Teasy manufactured by Promega to create a plasmid pGEMgltAW carrying the wild type gl tA gene. Furthermore, plasmid pGEMgl tAW was treated with restriction enzymes Smal and HindlE and inserted into the same site of pSTV28 manufactured by Yubara Bio Inc. to create pSTVgl tAW.
  • Pantoea ananatis AJ13601 was used as a parent strain, and a strain was constructed to verify the effect of introducing the prpC gene.
  • Pantoea Ananatis ⁇ 3601 is registered with the Institute of Biotechnology, Institute of Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry (Postal code: 3 0 5— 8 5 6 6 Tsukuba Sagahigashi 1-3-3, Ibaraki Prefecture) FEEM P-17516 As of August 18, 1999, it was transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on July 6, 2008, and the deposit number FERM BP-7207 was assigned.
  • Pantoea's Ananatis AJ 13601 strain contains plasmid pSTVCB carrying the gene for citrate synthase from coryneform bacteria, glutamate dehydrogenase from Escherichia coli, phosphoenolpyruvate dehydrogenase, and kennate synthase.
  • a plasmid RSFCPG equipped with ZE has already been introduced (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-333769). Therefore, we obtained strains that had lost pSTVCB. Specifically, since pSTVCB carries a chloramphenicol resistance gene, the target strain was obtained using the loss of chloramphenicol resistance as an index, and was named Pantoea Ananatis G106S strain from which STVCB had been dropped.
  • the G106S strain was transformed with the plasmid pSTVprpC or pSTVgltAW or the PSTV28 vector, and electrotransformation was performed. Acquired Natis G106S / PSTV28 shares.
  • Pantoea Ananatis G106S / pSTVprpC strain, Pantoea Ananatis pSTVgl tAW strain, Pantoea Ananatis G106S / pSTV28 strain was inoculated into a 1L-soluble jar mentmenter infused with 300mL of the medium shown below at 34, pH 6. The culture was continued for 12 to 14 hours at 0 until the sugar was withered. Culture H was controlled by injecting ammonia gas into the medium.
  • Table 1 shows the amount of L-glutamic acid produced in the culture solution obtained as described above.
  • Pantoea ananatis G106S / pSTVprpC precipitation of glutamic acid crystals was observed.
  • ammonia gas was injected into the culture to adjust the pH to 6.0. It was measured by dissolving all the minic acid.

Abstract

Ｌ―アミノ酸生産能を有し、かつ、prpC遺伝子の発現が増強されるように改変された微生物を作製し、得られた微生物を培地中で培養し、該培地中にＬ―アミノ酸を生成蓄積させ、同培地中Ｌ−アミノ酸を回収することにより、Ｌ−アミノ酸を製造する。

Description

明細書
L—アミノ酸の製造法
技術分野
本発明は、 L—アミノ酸、 特に L一グルタミン酸や L一グルタミン酸を中間体とする生 合成経路を経て生成するアミノ酸 （L—アルギニン、 L一グルタミン、 L—プロリン、 L 一オル二チン、 Lーシトルリン） の製造法に関する。
背景技術
L—グルタミン酸を中心とする L一アミノ酸は、 主としてブレビバクテリウム属、 コリ ネバクテリゥム属、 ミクロパクテリゥム属に属するいわゆるコリネ型 L—グルタミン酸生 産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている。 また、 バチルス属、 ス トレプトミセス属、 ぺニシリウム属、 シユードモナス属、 アースロバクター属、 セラチア 属、 キャンディダ属、 セラチア属に属する微生物、 ァエロパクター ·ァエロゲネス （現ェ ンテロバクタ一 ·ァエロゲネス）、 及びェシエリヒア ·コリの変異株を用いる方法等が知ら れている。 また、 本発明者らは、 クレブシエラ属、 エルビニァ属又はパントエア属に属す る腸内細菌科の微生物を用いた L—アミノ酸の製造法 （米国特許第 6 , 1 9 7 , 5 5 9号 明細書）、及びェンテロパクター属細菌を用いた L一グルタミン酸の製造法（米国特許第 6 , 3 3 1 , 4 1 9号明細書） を提案している。
また、 組換え DN A技術により L一アミノ酸の生合成酵素の活性を増強することによつ て、 L—アミノ酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。 例えば、 L一ダル 夕ミン酸生産菌の開発においては、 コリネパクテリゥム属またはブレビパクテリゥム属細 菌において、 ェシエリヒア ·コリ又はコリネパクテリゥム ·ダルタミクム由来のクェン酸 シンターゼをコードする遺伝子の導入が、 L一グルタミン酸生産能の増強に効果的であつ たことが報告されている （特公平 7— 1 2 1 2 2 8号公報)。 また、 コリネパクテリゥム属 細菌由来のグル夕ミン酸デヒド口ゲナーゼ遺伝子を含む組換え体 D Aを保有した細胞 (特開昭 6 1 - 2 6 8 1 8 5号公報） を用いた L一グルタミン酸製造方法、 グルタミン酸 デヒドロゲナ一ゼ遺伝子、 イソクェン酸デヒドロゲナ一ゼ遣伝子、 アコニット酸ヒドラ夕 ーゼ遺伝子、 及びクェン酸シンターゼ遺伝子を増幅することによって、 L—グルタミン酸 の生産能を増加させる技術 （特開昭 6 3 - 2 1 4 1 8 9号公報） が開示されている。
これまでに発明者らは、 コリネ型細菌由来のクェン酸シン夕ーゼ遺伝子を導入したェン テロパクター属の L一グルタミン酸生産菌 （欧州特許出願公開第 0999282 号明細書） また ェシエリヒア属細菌のクェン酸シンターゼ遺伝子とグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、 及び フォスフォェノールピルピン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したェンテロパクター属ぁ るいはセラチア属細菌の L—グルタミン酸生産菌の開発を行ってきた。 （欧州特許出願公開 第 0952221号明細書）
上記のような微生物の育種や製造法の改良により、 L一ダル夕ミン酸ゃ L一アミノ酸の 生産性はかなり高まってはいるが、 今後の需要の一層の増大に応えるためには、 さらに安 価かつ効率的な L—アミノ酸酸生産能を有する菌株の開発が望まれていた。 発明の開示
本発明の課題は、 L一アミノ酸を効率よく生産することのできる腸内細菌科に属する微 生物を提供すること、 及び該菌株を用いて L一アミノ酸を効率よく生産する方法を提供す ることにある。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、 L一アミノ酸生産能 腸内細菌科に属する微生物に prpC遺伝子を導入することにより、 Lーァミノ酸の発酵収率 を向上させることを見出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、 以下の発明が提供される。
(1) L一アミノ酸生産能を有し、 かつ、 prpC遺伝子の発現が増強されるように改変さ れた腸内細菌科に属する微生物を培地で培養して、 L—アミノ酸を該培地中に生成蓄積さ せ、 該培地より L—アミノ酸を採取する、 L—アミノ酸の製造法。
(2) prpC遺伝子のコピー数を高めること、 又は該遺伝子の発現調節配列を改変するこ とにより prpC遺伝子の発現が増強された、 （ 1 ) に記載の製造法。
(3) 前記 prpC遺伝子が、 下記 （a) 又は （b) に記載の DNAである、 （1) または (2) に記載の製造法：
(a) 配列番号 5に示す塩基配列を含む DNA、
(b) 配列番号 5に示す塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリン ジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつメチルクェン酸シン夕一ゼ活性を有するタン パク質をコードする DNA。
(4) 前記腸内細菌科に属する微生物が、 パントエア属、 ェンテロバクター属、 クレブ シエラ属、 セラチア属、 エルビニァ属、 ェシエリヒア属よりなる群から選択される （1) 〜 （3) に記載の製造法。
( 5 ) 前記腸内細菌科に属する微生物がパントエア ·アナナティス FERM BP— 6 614株あるいは FERM BP- 7207株由来の微生物である、 （1) 〜 （4) のいずれか一項に 記載の製造法。
(6) 前記アミノ酸が L一グルタミン酸、 L一アルギニン、 L一グルタミン、 L—プロ リン、 L—オル二チン、 Lーシトルリンよりなる群から選択される請求項 1〜4のいずれ か一項に記載の製造法。
発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の形態について詳細に説明する。
< 1 >本発明の微生物
.本発明の微生物は、 L—アミノ酸酸生産能を有し、 かつ prpC遺伝子の発現が増強される ように改変されたことを特徴とする腸内細菌科に属する微生物である。 「 L一アミノ酸生産 能」 とは、 本発明の腸内細菌科 （Entrobacteriaciae) に属する微生物を培地中で培養した ときに、 L—アミノ酸を細胞又は培地から回収できる程度に、 細胞又は培地中に生成、 蓄 積する能力をいう。 L一アミノ酸生産能を有する微生物としては、 本来的に L一アミノ酸 生産能を有するものであってもよいが、 以下に示すような微生物を、 変異法や組換え DNA 技術を利用して L—ァミノ酸酸生産能を有するように改変したものや、 本発明の遺伝子を 導入すること.によって L一アミノ酸酸生産能が付与された腸内細菌科に属する微生物であ つてもよい。
ここで L—アミノ酸とは、 L一リジン、 L—グルタミン酸、 Lースレオニン、 L—バリ ン、 L一口イシン、 L—イソロイシン、 L—セリン、 Lーァスパラギン酸、 L—ァスパラ ギン、 L—グルタミン、 L—アルギニン、 L一システィン （シスチン）、 L—メチォニン、 L—フエ二ルァラニン、 L—トリプトファン、 L—チロシン、 L—グリシン、 L—ァラニ ン、 L一プロリン、 L一オル二チン、 L—シトルリン、 L一ホモセリンが挙げられる力^ 特に L一グルタミン酸や L一グルタミン酸を中間体とする生合成経路を経て生成するアミ ノ酸、 L—アルギニン、 L—グルタミン、 L—プロリン、 L一オル二チン、 Lーシトルリ ンが望ましい。
本発明に用いる微生物としては、 ェシエリヒア属、 ェンテロパクター属、パントエア属、 クレブシエラ属、 セラチア属、 エルビニァ属、 サルモネラ属、 モルガネラ属など、 腸内細 菌科に属する微生物であって、 L一アミノ酸を生産する能力を有するものであれば、 特に 限定されない。 具体的には NCBI (Nat ional Center for Biotechnology Informat ion) デー 夕ベースに記載されている分類により腸内細菌科に属するものが利用できる。
(ht tp ://www. ncbi. nlm. ni . gov/htbin - post/Taxo醒 y/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl= 3&keep=l&srclimode=l&unlock)。 改変に用いる腸内細菌科の親株としては、 中でもェシェリ ヒア属細菌、 ェンテロパクタ一属細菌、 パントエア属細菌を用いることが望ましい。
本発明のェシエリヒア属細菌を得るために用いるェシエリヒア属細菌の親株としては、 特に限定されないが、 具体的にはナイ トハルト らの著書 （Neidhardt, F. C. et al. , Escherichi a col i and Salmone l l a Typhi murium, Amer ican Soc iety for Microbiology, Washington D. C. , 1029 table 1) に挙げられるものが利用できる。 その中では、 例えば ェシエリヒア .コリが挙げられる。 ェシエリヒア ·コリとしては具体的には、 プロト夕ィ プの野生株 K 1 2株由来のェシエリヒア ·コリ W3110 (ATCC ' 27325)、 ェシエリヒア ·コ リ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
これらを入手するには、 例えばアメリカン ·タイプ ·カルチャー ·コレクション （住所 12301 Parkl wn Drive, Rockvi l le, Maryland 20852, Uni ted States of Amer ica) より 分譲を受けることが出来る。 すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、 この 登録番号を利用して分讓を受けることが出来る （ht tp：〃 www. atcc. org/参照）。 各菌株に対 応する登録番号は、 アメリカン ·タイプ，カルチヤ一 ·コレクションのカタログに記載さ れている。
ェンテロパクター属細菌としては、 ェンテロパク夕一'アグロメランス （Enterobacter agglomerans), ェンテロバクタ一 ·ァエロゲネス（Enterobacter aerogenes)等、 パントェ ァ属細菌としてはパントエア ·アナナティス （Pantoea ananatis) が挙げられる。 尚、 近 年、 ェンテロバクタ一 -ァグロメランスは、 16 S r RNAの塩基配列解析などにより、 パントエア 'アグロメランス（Pantoea agglomerans)又はパントエア'アナナティス（Pantoea ananatis), パントエア ·スチューアルティ （Pantoea stewartii) アグロメランス等に再 分類されているものがある。 本発明においては、 腸内細菌科に属する微生物に分類される ものであれば、 ェンテロバクタ一属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよ い。 パントエア ·アナナティスを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、 パントェ ァ ·アナナティス A J 13355株 （FERM BP— 6614)、 AJ 13356株 （F ERM BP— 6615)、 A J 13601株 （FERM B P— 7207) 及びそれらの 誘導体を用いることができる。 これらの株は、 分離された当時はェンテロパクター ·ァグ ロメランスと同定され、 ェンテロパクター 'アグロメランスとして寄託されたが、 上記の とおり、 16S rRNAの塩基配列解析などにより、 パントエア ·アナナティスに再分類されて いる。
L一アミノ酸生産能を付与するには、 栄養要求性変異株、 アナログ耐性株又は代謝制御 変異株の取得や、 L一アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、 従 来、 コリネ型細菌又はェシエリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用すること ができる （アミノ酸発酵、 （株） 学会出版センター、 1986年 5月 30日初版発行、 第 77〜 100頁参照)。 ここで、 L一アミノ酸生産菌の育種において、 付与される栄養要求性、 ァ ナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、 2種又は 3種以上であってもよい。 また、 発現が増強される L一アミノ酸生合成系酵素も、 単独であっても、 2種又は 3種以 上であってもよい。 さらに、 栄養要求性、 アナログ耐性、 代謝制御変異等の性質の付与と、 生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
L—アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、 L一アミノ酸のアナログ耐性株、 又は 代謝制御変異株を取得するには、 親株 は野生株を通常の変異処理、 すなわち X線や紫外 線の照射、 または N—メチル一N' —二トロー N—ニトロソグァ二ジン等の変異剤処理な どによって処理し、 得られた変異株の中から、 栄養要求性、 アナログ耐性、 又は代謝制御 変異を示し、 かつ Lーァミノ酸生産能を有するものを選択することによつて得ることがで きる。 また L一アミノ酸生産菌は、 遺伝子組換えによって、 L—アミノ酸生合成系酵素の 酵素活性を増強することによつても行うことが出来る。
例えば、 L一ダル夕ミン生産菌の育種は次のようにして行うことができる。
L—グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、 例えば、 グルタミン酸デヒドロゲナ ーゼ （以下、 「GDH」 ともいう）、 グルタミンシンテ夕ーゼ、 グルタミン酸シンターゼ、 イソクェン酸デヒドロゲナーゼ、 アコニット酸ヒドラターゼ、 クェン酸シン夕一ゼ（以下、 「CS」 ともいう）、 ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ （以下、 「PEPCJ と もいう）、 ピルビン酸カルポキシラーゼ、 ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、 ピルビン酸キナー ゼ、 ホスホェノールピルビン酸シンターゼ、 エノラーゼ、 ホスホダリセルム夕一ゼ、 ホス ホグリセリン酸キナーゼ、 ダリセルアルデヒド一 3—リン酸デヒドロゲナ一ゼ、 卜リオ一 スリン酸イソメラーゼ、 フルトースビスリン酸アルドラーゼ、 ホスホフルクトキナーゼ、 グルコースリン酸イソメラ一ゼなどをが挙げられる。 これらの酵素の中では、 C S、 P E P Cおよび G D Hのいずれか 1種以上が好ましく、 3種全ての増強がより好ましい。 また CS に関しては本発明のメチルクェン酸シン夕一ゼ （以下 PRPC) を代替しても、 また CS と PRPCと同時に増強してもよい。
例えば、 以下のようにして、 L一グルタミン酸生合成系の酵素をコードする遺伝子を宿 主に導入することによって、 L—グルタミン酸生産能を付与することができる。すなわち、 L一グルタミン酸生合成系遺伝子をコ一ドする遺伝子断片を、 L―グルタミン酸の製造に 用いる宿主微生物で機能するベクター、 好ましくはマルチコピー型べクタ一と連結して組 み換え D NAを作製し、 これで宿主を形質転換する。 形質転換により宿主細胞内の Lーグ ル夕ミン酸系酵素コードする遺伝子のコピー数が上昇し発現量が増強する結果、 これらの 酵素の活性が増強される。
L一グルタミン酸生合成系酵素をコードする遺伝子としては、 宿主微生物中で発現する ことができる遺伝子であれば、 特に限定されないが、 例えば、 ェシエリヒア，コリ由来の 遺伝子、 パントエア属由来の遺伝子が挙げられる。 ェシエリヒア 'コリに関しては、 全ゲ ノム配列が明らかにされているので （Sci ence 277 (5331) , 1453-1474 (1997) )、 これらの 遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、 ェシエリヒア ·コリ K- 12等の微生物の 染色体 D N Aを鎵型とする P C R法により、 これらの遺伝子を取得することが可能である。 遺伝子のクロ一ニングに使用されるプラスミドとしては、 腸内細菌科において自律複製 可能なものであればよく、 具体的には、 pBR322、 PTWV228 (宝バイオ社）、 MW119 (二ッポ ンジーン社)、 pUC 19、 pSTV29 (宝バイオ社製）， RSF 1010 (Gene vol. 75 (2) , p271-288, 1989) , 等が挙げられる。 他にもファージ D NAのベクターも利用できる。
目的遺伝子を上記べクタ一に連結して組み換え D N Aを調製するには、 目的遺伝子を含 む D NA断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。 連結は、 T 4 D NAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。 目的遺伝子は、 それぞれ別個の ベクターに搭載してもよく、 同一のベクターに搭載してもよい。 D NAの切断、 連結、 そ の他、 染色体 DNAの調製、 P C R、 プラスミド D NAの調製、 形質転換、 プライマーと して用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、 当業者によく知られている通常の方法 を採用することができる。 これらの方法は、 Sambrook, L , Fri tsch, E. F. , and Mani at is, T. , "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edi t ion", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。 上記のようにして調製した組換え D NA を微生物に導入するには、 十分な形質転換効率が得られる方法ならば、 いかなる方法を用 いてもよいが、 例えば、 エレクト口ポレーシヨン法 （Canadian Journal of Microbiology, 43. 197 (1997) ) が挙げられる。 また、 L—グルタミン酸生合成系酵素をコードする遺伝子の発現増強は、 目的遺伝子を 微生物の染色体 D N A上に多コピー導入することによつても達成できる。 微生物の染色体 D N A上に目的遺伝子を多コピーで導入するには、 染色体 D N A上に多コピー存在する配 列を標的に利用して相同組換えにより行う。 このような相同組換えを利用した遺伝子置換 による部位特異的変異導入は既に確立しており、 直鎖上 D NAを用いる方法や温度感受性 複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある （米国特許第 6303383号、 又は特開平 05- 007491号公報）。 染色体 D NA上に多コピー存在する配列としては、 レペティティブ D NA、 転移因子の端部に存在するインバ一ティッド · リピー卜が利用できる。 あるいは、 特開平 2-109985号公報に開示されているように、 目的遺伝子をトランスポゾンに搭載して これを転移させて染色体 D N A上に多コピー導入することも可能である。 いずれの方法に よつても形質転換株内の目的遺伝子のコピー数が上昇する結果、 L一ダル夕ミン酸生合成 系の酵素活性が増強される。
L—グルタミン酸生合成系酵素の活性増強は、 上記の遺伝子増幅による以外に、 目的遺 伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによつても達成される (特開平 1-215280 号公報参照)。 たとえば、 1 a cプロモーター、 t r pプロモーター、 t r cプロモータ一、 t a。プロモーター、 ラムダファージの P Rプロモーター、 P Lプ 口モータ—、 t e tプロモーター等が強力なプロモー夕一として知られている。 これらの プロモーターへの置換により、 目的遺伝子の発現が強化されることによって酵素活性が増 幅される。 プロモー夕一の強度の評価法および強力なプロモーターの例は、 G o 1 d s t e i nらの論文 (Prokaryot ic promoters in biotechnology. Biotechnol. A匪. Rev. , 1995, 1, 105-128) 等に記載されている。
また、 目的遺伝子の発現調節に関与する因子、 例えばオペレーターやリブレッサーを改 変する こ と に よ つ て も達成さ れる （Haffli l ton et al,； J Bacteriol. 1989 Sep ; 171 (9) : 4617- 22. )。 国際公開 WO 0 0 / 1 8 9 3 5に開示されているように、 目的 遺伝子のプロモータ一領域に数塩基の塩基置換を導入し、 より強力なものに改変すること も可能である。 さらに、 リポソ一ム結合部位 （R B S ) と開始コドンとの間のスぺーサ、 特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換が m R N Aの翻訳効 率に非常に影響を及ぼすことが知られており、 これらを改変することも可能である。 目的 遺伝子のプロモーター等の発現調節領域は、 プロモーター検索ベクターや GENETYX等の遺 伝子解析ソフトを用いて決定することが出来る。 発現調節配列の置換は、 例えば、 上述の 温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。
以上のような方法により、 L一グルタミン酸生合成系酵素の活性を増強した微生物は、 欧州特許出願公開第 1078989号公報、 欧州特許 0952221号公報、 米国特許 6,682,912号公 報に記載された微生物が例示できる。
L -ダル夕ミン酸生産能を付与するための改変は、 L -ダル夕ミン酸の生合成経路から 分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させることに より行ってもよい。 L _グルタミン酸の生合成経路から分岐して L—グルタミン酸以外の 化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、 2—ォキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ ( α—ケトグルタル酸でヒドロゲナーゼ)、 イソクェン酸リア一ゼ、 リン酸ァセチルトラン スフエラーゼ、 酢酸キナーゼ、 ァセトヒドロキシ酸シンターゼ、 ァセト乳酸シン夕一ゼ、 ギ酸ァセチルトランスフェラーゼ、 乳酸デヒドロゲナーゼ、 グルタミン酸デカルポキシラ ーゼ、 1—ピロリンデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。 この中では特に、 2—ォキソグ ルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損させることが好ましい。
これらの酵素活性を低下あるいは欠損させる方法としては、 通常の変異処理法によって、 染色体上の上記酵素の遺伝子に、 細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変 異を導入すればよい。 例えば、 遺伝子組換えによって、 染色体上の酵素をコードする遺伝 子を欠損させたり、 プロモーターやシャインダルガルノ (SD) 配列等の発現調節配列を改 変したりすることなどによって達成される。 また、 染色体上の酵素をコードする領域にァ ミノ酸置換 （ミスセンス変異） を導入すること、 また終始コドンを導入すること （ナンセ ンス変異)、 一〜二塩基付加 ·欠失するフレームシフト変異を導入すること、 遺伝子の一部 分 を 欠失 さ せる こ と に よ つ て も達成 出来 る （ Journal of biological C emi stry272 : 8611-8617 (1997)。 また、 コード領域が欠失したような変異酵素をコードす る遺伝子を構築し、 相同組換えなどによって、 該遺伝子で染色体上の正常遺伝子を置換す ること、 トランスポゾン、 IS 因子を該遺伝子に導入することによつても酵素活性を低下ま たは欠損させることができる。
細胞中の目的酵素の活性が低下または欠損していること、 および活性の低下の程度は、 候補株の菌体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、 野生株と比較することによって 確認することができる。 例えば、 2—ォキソダルタル酸デヒドロゲナーゼ活性は、 Reed ら の方法 (L J. Reed and B. B. Mukherj ee, Methods in Enzymology 1969, 13, p. 55-61) に従 つて測定することができる。
腸内細菌科に属する微生物の 2—ォキソダルタル酸デヒド口ゲナ一ゼ活性を欠損もしく は低下させる方法は、 特開 2000- 106869、 2000-189169に記載されている。 2—ォキソダル タル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下した腸内細菌科に属する微生物としては、 具体的には
パン卜エア ·アナナティス AJ13601 (FERM BP-7207)
クレブシエラ ·プランティコーラ AJ 13410株 （FERM BP-6617)
パントエア ·アナナティス AJ13355 (FERM BP- 6614)
等が挙げられる。
L—アルギニン生産菌としては、 α—メチルメチォニン、 ρ—フルオロフェニルァラニ ン、 D—アルギニン、 アルギニンヒドロキサム酸、 S— ( 2—アミノエチル） 一システィ ン、 α—メチルセリン、 )3— 2—チェ二ルァラニン、 又はスルファグァニジンに耐性を有 するェシェリヒア ·コリ変異株（特開昭 5 6— 1 0 6 5 9 8号公報参照）等が挙げられる。 また、 L—アルギニンによるフィードバック阻害に耐性な変異を有し、 つ、 高い活性を 有する N—ァセチルグルタミン酸シンターゼ及び同酵素を保持する L—アルギニン生産菌 である、 ェシエリヒア .コリ 2 3 7株 （ロシア特許出願第 2 0 0 0 1 1 7 6 7 7号） も、 好適な L—アルギニン生産株である。 同株は、 2000年 4月 10日にロシアン 'ナショナル' コレクション .ォブ ·ィンダストリアル ·マイクロオーガニズム （Russ ian Nat ional Col l ect ion of Indus t rial Microorganisms (VKPM) , GNU Genet ika ) に誦 B-7925 © 番号で寄託され、 2001年 5月 18 日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。 237 株の誘導体で、 酢酸資化能を向上させた L一アルギニン生産菌である、 ェシエリヒア ·コ リ 3 8 2株 （特開 2002-017342 号公報） を用いることもできる。 ェシエリヒア 'コリ 3 8 2株は、 2000年 4月 10日に Russ ian Nat ional Col l ect ion of Industri al Microorganisms (VKPM) に VKPM B - 7926の番号で寄託されている。
また L—アルギニン生産能を有する微生物として、 L一アルギニン生合成に関与する酵 素をコードする遺伝子の発現量を向上させた微生物を用いることが出来る。 例えば、 L一 アルギニン生合成系酵素しては、 N—ァセチルグルタミン酸シン夕ーゼ （argA)、 N—ァセ チルダル夕ミルリン酸レダクターゼ （argC；)、 オル二チンァセチルトランスフェラ一ゼ
(argJ)、 N-ァセチルグルタミン酸キナーゼ （argB)、 ァセチルオル二チントランスァミナ ーゼ （argD)、 ァセチルオル二チンデァセチラーゼ （argE) オル二チン力ルバモイルトラン スフエラ一ゼ （argF)、 アルギニノコハク酸シン夕ーゼ (argG)、 アルギニノコハク酸リア —ゼ （argH) 力ルバモイルリン酸シンターゼ （carAB) から選ばれる 1種又は 2種以上が挙 げられる。 これらの酵素名の後のカツコ内は、 各酵素をコードする遺伝子名である。 N -ァ セチルグルタミン酸シン夕ーゼ （argA) は、 野生型の 1 5位〜 1 9位に相当するアミノ酸 配列が置換された L一アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型の遺伝子 を用いるとより好適である。 （欧州出願公開 1170361号明細書）
Lーシトルリン、 L一オルニチンも L一アルギニンと生合成経路が共通しており、 N—ァセチルグルタミン酸シン夕一ゼ （argA)、 N—ァセチルダルタミルリン酸レダク夕一 ゼ （argC)、 オル二チンァセチルトランスフェラーゼ （argJ)、 N-ァセチルグルタミン酸キ ナーゼ (argB)、 ァセチルオルニチントランスアミナ一ゼ (argD)、 ァセチルオル二チンデ ァセチラーゼ （argE) の酵素活性を上昇させていることが好ましい。
本発明の L—プロリン生産菌として好ましいものは、 3, 4-デヒドロキシプロリン、 ァザ チジン一 2—カルポキシレート耐性株であるェシエリヒア ·コリ 702株（VKPMB- 8011)や、 702の i lvA欠損株である 702i lvA株 (VKPMB- 8012株） や、 b2862および b2683、 又は 2 もしくは b3434遺伝子にコードされるタンパク質の活性を増強した E. col iが挙げられる。
(特開 2002— 300874号公報)。 .
本発明の L—グルタミン生産菌として好ましいものは、 グルタミンシンセタ一ゼ （glnA) を強化した細菌、 グルタミナ一ゼを破壊した腸内細菌科に属する微生物である。 （欧州特許 出願公開 1424398号明細書） また、 ェシエリヒア属に属し、 グルタミンシンセターゼの 397 番目のチロシン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型グルタミンシンセターゼを有 する菌株も好適な L一グルタミン生産菌として例示できる。 （米国特許出願公開第 2003- 0148474号明細書）
また、 L—アルギニン、 L—オル二チン、 Lーシトルリン、 L—プロリン、 L一グルタ ミンは全て L一ダル夕ミン酸を中間体とする生合成経路を経て生成するアミノ酸である。 従って、 上述の L—グルタミン酸生産菌の育種方法は、 L—アルギニン、 L—オル二チン、 L—シトルリン、 L—プロリン、 L—グルタミン生産菌の育種にも適用できる。
本発明の微生物は、 L-アミノ酸生産能を有し、 かつ、 prpC遺伝子の発現が増加されるよ うに改変された腸内細菌科に属する微生物である。ここで、「prpC遺伝子の発現が増強した」 ことは、 野生株又は prpC非改変株と比較して、 親株、 あるいは野生株に対して細胞当たり の PrpC産物分子の数が増加した場合や Pn)C産物分子当たりの活性が上昇した場合が該当 する。 また、 比較対象となる野生型の腸内細菌科に属する微生物とは、 例えばェシエリヒ ァ 'コリ MG1655 や、 パントエア ·アナナティス A J 1 3 3 5 5が該当する。 また、 「prpC 遺伝子の発現が増強した」 とは、 親株が本来 prpC遺伝子を有しておりさらに prpC遺伝子 の発現量を増強するように改変したた微生物だけでなく、 親株が本来 prpC遺伝子を有して いないが prpC遺伝子の導入により、 メチルクェン酸シン夕ーゼ活性が付与された微生物も 含む。
ここで prpC遺伝子の発現量が上昇したことの確認は、 prpCの m-RNAの量を野生型、 ある いは非改変株と比較することによって確認出来る。 発現量の確認方法としては、 ノーザン ハイブリダィゼーシヨン、 RT- PCRが挙げられる （Molecular cloning (Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA) , 2り 01) )。 発現量については、 野生株あるいは 非改変株と比較して、 上昇していればいずれでもよいが、 例えば野生株、 非改変株と比べ て 1 . 5倍以上、 より好ましくは 2倍以上、 さらに好ましくは 3倍以上上昇していること が望ましい。
本発明の prpC遺伝子がコードするタンパク質とは、 メチルクェン酸シン夕一ゼであり、 prpC遺伝子の発現量が向上することにより、 メチルクェン酸シン夕ーゼが上昇する。 メチ ルクェン酸シン夕一ゼ活性は、 プロピニル CoAと水とォキサ口酢酸から 2—メチルクェン 酸と CoAを生成する反応を触媒する活性であり [EC 2. 3. 3. 5 ] , メチルクェン酸シンターゼ 活性は Horswi l l らの方法 (J Bacteriol. 1999 Sep; 181 (18) : 5615- 23. ) の方法で測定でき る。
また、 本発明の prpC遺伝子がコードするタンパク質は、 メチルクェン酸シンターゼとと もにクェン酸シン夕ーゼの活性を有していてもよい。 クェン酸シン夕ーゼ活性とは、 ァセ チル CoA と水とォキサ口酢酸からクェン酸と CoA を生成する反応を触媒する活性 [EC : 2. 3. 3· 1]であり、 クェン酸シンターゼ活性は、 2—ォキソダルタル酸、 NADH によって 阻害を受けないことが好ましい。クェン酸シンターゼ活性は、 Biochem. , Vol. 8, No. 11, 4497 に記載の方法で測定出来る。 ここで、 2—ォキソダルタル酸、 NADH によって阻害を受けないとは、 培地中或いは細胞 内に存在する 2—ォキソダルタル酸、 NADHによって、 prpC遺伝子がコードするクェン酸シ ンターゼ活性が低下しないことを意味し、 上記記載の方法で 2—ォキソダルタル酸、 NADH 存在下で活性を測定した際に、 2mM の 2—ォキソダルタル酸添加下で活性が 95%以上、 望 ましくは 98%以上、 さらに望ましくは 99%以上、 0. 2mMの NADH添加下で活性が 70 %以上、 望ましくは 80 %以上、 さらに望ましくは 90 %以上残存していることを意味する。
本発明の腸内細菌科に属する微生物は、 上述したような L一アミノ酸生産能を有する腸 内細菌科に属する微生物を P卬 C遺伝子の発現が増強するように改変することによつて得る ことができる。 ただし、 先に prpC遺伝子の発現が増強するように改変を行った後に、 L— アミノ酸生産能を付与してもよい。 ここで親株の微生物は、 2—ォキソダルタル酸、 NADH によって阻害を受けるクェン酸シン夕ーゼ活性を有していることが好ましい。 例えば、 親 株がェシエリヒア ·コリの場合、 親株の有するクェン酸シンターゼをコードする遺伝子は NPJ15248. Report s c i trate syn thase . . . [gi： 16128695]で登録されている gl tA遺伝子 である。
本発明による「prpC遺伝子」とは、ェシエリヒア'コリの prpC遺伝子 (配列番号 5 Genebank access ion No. AAC73436) , 及びそのホモログであり、 コードするタンパクがメチルクェン 酸シンターゼ活性を有するものをいい、 yzzD, yahS と名づけられている場合もある。 ェシ エリヒア ·コリの prpC遺伝子としては、 配列番号 6に示すアミノ酸配列を有するタンパク 質をコードする遺伝子を例示することができる。 さらに、 prpC 遺伝子は、 上記で例示され た遺伝子との相同性に基づいて、 パントエア属、 ェンテロバク夕ー属、 クレブシエラ属、 セラチア属、 エルピニァ属、 エルシニア属等の腸内細菌科に属する微生物からクロ一ニン グされるものであってもよい。 本発明に用いることが出来る prpC遺伝子は、 既に配列が明 らかにされている腸内細菌科に属する微生物の塩基配列に基づいて作製したプライマー、 例えば配列番号 1及び に示すプライマーを用いて、 腸内細菌科に属する微生物の染色体 DNAを鍩型とする PCR法 (PC ： po lymerase chain reac t ion； Whi te, T. J. et al. , Trends Genet. 5, 185 (1989)参照） によって、 prpCと prpCの制御領域を含む、 その隣接領域を取 得することができる。 他の微生物の prpCのホモログも、 同様にして取得され得る。
prpC遺伝子ホモログとは、 他の微生物由来で、 ェシエリヒア 'コリの prpC遺伝子と高い 類似性を示し、かつメチルクェン酸シン夕一ゼを持つ遺伝子をいう。他の微生物由来の prpC 遺伝子は、 配列番号 6のアミノ酸配列全体の 8 0 %以上、 好ましくは 9 0 %以上、 より好 ましくは 9 5 %以上、 特に好ましくは 9 7 %以上の相同性を有し、 かつ、 クェン酸シン夕 ーゼ活性を有するタンパク質をコードするものを意味する。
prpC 遺伝子は、 コードされるタンパク質の活性、 すなわち、 メチルクェン酸シン夕一ゼ 活性が損なわれない限り、 配列番号 6のアミノ酸配列において、 1若しくは数個の位置で 1若しくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入または付加されたアミノ酸配列を有する夕 ンパク質をコードするものであってもよい。 ここで、 数個とは、 アミノ酸残基のタンパク 質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、 好ましくは 2〜2 0個、 より好ま しくは 2〜1 0個特に好ましくは 2〜5個である。 また、 このようなアミノ酸の置換、 欠 失、 挿入、 付加、 または逆位等には、 rpC遺伝子を保持する微生物の個体差、 種の違いに 基づく場合などの天然に生じる変異 （mutant 又は variant) によって生じるものも含まれ る。
上記置換は機能的に変化しない中性変異である保存的置換が好ましい。 保 存的変異とは、 置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、 plie, t rp, tyr 間 で、 置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、 l eu, i l e, va l 間で、 極性ァ ミノ酸である場合には、 gi n, asn間で、 塩基性アミノ酸である場合には、 I ys, arg, h i s間で、 酸性アミノ酸である場合には、 asp, gl u間で、 ヒ ドロキシル基 を持つアミノ酸である場合には、 se r, thr間でお互いに置換する変異である。 より具体的には、 保存的置換としては、 alaから ser又は thrへの置換、 argから gln、 his又は lysへの置換、 asnから glu、 gin, lys、 hi s又は aspへの置換、 aspから asn、 gl u又は ginへの置換、 cysから ser又は alaへの置換、 ginから asn、 glu, lys、 his、 asp 又は argへの置換、 gluから gly、 asn, gln、 lys又は aspへの置換、 glyから proへの置 換、 hisから asn、 lys、 gin, arg又は tyrへの置換、 i leから leu、 met, val又は pheへ の置換、 leuから i le、 met, val又は pheへの置換、 lysから asn、 glu> gin, his又は ar gへの置換、 metから i le、 leu、 val又は pheへの置換、 pheから trp、 tyr, met, i le又は leuへの置換、 serから thr又は alaへの置換、 thrから ser又は alaへの置換、 trpから p he又は tyrへの置換， tyrから his、 phe又は trpへの置換、 及び、 valから met、 i le又は leuへの置換が挙げられる。
さらに、 prpC遺伝子は、 配列番号 6のアミノ酸配列全体に対して、 8 0 %以上、 好まし くは 9 0 %以上、 より好ましくは 9 5 %以上、 特に好ましくは 9 7 %以上の相同性を有す るタンパク質をコードし、 かつ、 クェン酸シンターゼ及び/またはメチルクェン酸シン夕一 ゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を利用することができる。 また、 それぞれ 導入する宿主により、 遺伝子の縮重性が異なるので、 それぞれ prpC遺伝子が導入される宿 主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。 同様に prpC遺伝子は、 増幅することに より L一アミノ酸の生産を向上させることができる限り、 N末端側、 C末端側が延長したも のあるいは削られているものでもよい。 例えば延長 '削除する長さは、 アミノ酸残基で 50 以下、 好ましくは 20以下、 より好ましくは 10以下、 特に好ましくは 5以下である。 より 具体的には、 配列番号 6のアミノ酸配列の N末端側 50アミノ酸から 5アミノ酸、 C末端側 50アミノ酸から 5アミノ酸延長 ·削除したでもよい。
prpC遺伝子は、 さらに、 配列番号 5の塩基番号からなる塩基配列を有する DNAまたはこ れらの塩基配列を有する DNA から調製され得るプローブと、 ストリンジェン卜な条件下で ハイブリダィズし、 力、つクェン酸シンタ一ゼ活性を有するタンパク質をコードする DNAで あってもよい。 ここでいう 「ストリンジェントな条件」 とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、 非特異的なハイプリッドが形成されない条件をいう。 この条件を明確に数値化することは 困難であるが、 一例を示せば、 相同性が高い DNA 同士、 例えば 7 0 %以上、 好ましくは 8 0 %以上、 より好ましく 9 0 %以上、 特に好ましくは 9 5 %以上の相同性を有する DM 同 士がハイブリダィズし、 それより相同性が低い DNA 同士がハイブリダィズしない条件、 あ るいは、通常のサザンハイプリダイゼ一シヨンの洗いの条件である 60 :、l xSSC, 0. 1¾SDS, 好ましくは 0. 1 XSSC, 0. 1%SDSに相当する塩濃度でハイプリダイズする条件が挙げられる。 プローブは、 prpC遺伝子の一部の配列を有するものであってもよい。 そのようなプロ一 ブは、 当業者によく知られた方法により、 各遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴ ヌクレオチドをプライマ一とし、 各遺伝子を含む DNA断片を鎵型とする PCR反応により作 製することができる。 なお、 プローブに 300bp程度の長さの DNA断片を用いる場合には、 上記の条件でハイブリダィズさせた後の洗いの条件としては、 50：、 2 X SSC, 0. SDSで 1 回または 2〜 3回洗浄する条件が挙げられる。
このような prpC遺伝子と相同な遺伝子は、 例えば、 部位特異的変異法によって、 コード されるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、 欠失、 挿入または付加を含むよう に配列番号 5の塩基配列を改変することによって取得することができる。 また、 以下のよ うな従来知られている変異処理によっても取得され得る。 変異処理としては、 配列番号 5 に示す塩基配列をヒドロキシルアミン等でインビト口処理する方法、 および該遺伝子を保 持する微生物、 例えばコリネ型細菌を、 紫外線または N-メチル -ニトロ- N-ニトロソグ ァニジン (NTG)もしくはェチルメタンスルフォネート （EMS) 等の通常変異処理に用いられ ている変異剤によって処理する方法、 エラーブローン PCR 、 DNA shuf f l ing, S P— PCRに よって、 遺伝子組換えにより人工的に prpCに変異を導入して活性の高い fasR遺伝子を取 得することが出来る。 (Firth AE, Patrick丽; Bioinformat ics. 2005 Jun 2 ; Stat ist ics of protein l ibrary construct ion. ) これらの prpC の相同遺伝子がメチルクェン酸シンター ゼをコードしているか否かは、 例えば、 これらの遺伝子を L—アミノ酸生産能を有する腸 内細菌科に属する微生物に導入し、 L一アミノ酸の生産能が向上するかどうか、 また上述 の方法でメチルクェン酸シン夕一ゼ活性を測定することにより、 確かめることができる。 次に、 prpC遺伝子の発現が増強するように腸内細菌科に属する微生物を改変する方法に ついて説明する。 1つ目の方法は、 prpC遺伝子を適当なベクター上にクローニングし、 得 られたベクターを用いて腸内細菌科に属する微生物を形質転換することにより、 該遺伝子 のコピ一数を高める方法である。 例えば、 ェシェリヒア ·コリの塩基配列は既に明らかで あることから （GENBANK AAC73436 NP_414867. Reports methylci trate
syn. . . [gi : 161283181 ) 、 それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、 染色体 D N Aを铸型にして P C R法により取得することが可能である。
形質転換に用いるベクタ一は、 腸内細菌科に属する微生物に属する微生物の中で自律複 製可能なプラスミドを用いることが出来、 pUC19、 pUC18、 PB 322, SF1010 HSG299, pHSG298、 PHSG399, pHSG398、 pS而、 STV29 (pHSG、 pSTVは夕カラバイオ社より入手可）、 pMW1 19、 pMW1 18、 p蕭 219、 p匿 218 (pMWは二ツボンジーン社より入手可） 等が挙げられる。 なお、 プ ラスミドの代わりにファージ D N Aやトランスポゾン DNAをべクタ一として用いてもよい。 形質転換法としては、 例えば、 ェシエリヒア 'コリ K— 1 2について報告されている ような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理して D N Aの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A. , J. Mol. Biol. , 53, 159 (1970) )、 バチルス ·ズプチリスについて報告されてい るような増殖段階の細胞からコンビテントセルを調製して D N Aを導入する方法
( Duncan, C. H. , Wi l son, G. A. and Young, F. E. , Gene, 1, 153 (1977) ) などが挙げられる。 あるいは、 バチルス *ズプチリス、 放線菌類及び酵母について知られているような、 D N A受容菌の細胞を、 組換え D NAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフエロプラス 卜の状態にして組換え D NAを D NA受容菌に導入する方法 （ Chang, S. and
Choen, S. N. , Molec. Gen. Genet. , 168, 111 (1979)； B ibb, M. J. , Ward, J. M. and
Hopwood, 0. A. . Nature, 274, 398 (1978)； Hinnen, A. , Hicks, J. B. and Fink, G. . , Proc. Nat l. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978) ) も応用できる。 また、 電気パルス法 （特開平 2-207791 号公報） によっても、 微生物の形質転換を行うこともできる。
遺伝子のコピ一数を高めることは、 目的遺伝子を微生物の染色体 MA上に多コピー導入 することによつても達成できる。 微生物の染色体 DNA上に遺伝子を多コピ一で導入するに は、染色体 DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して、相同組換え法（Experimentsin Mol ecular Genet ics, Cold Spring Harbor Lab. (1972) ) により行うことができる。 染色 体 DNA上に多コピー存在する配列としては、 レペティティブ DNA、 転移因子の端部に存在す るィンバーテツド · リピー卜が利用できる。 あるいは、 特開平 2-109985号公報に開示され ているように、 目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体 DNA上に 多コピ一導入することも可能である。 さらに、 Muファージを用いる方法 （特開平 2-109985 号） で宿主染色体に目的遺伝子を組み込むこともできる。
2つ目の方法は、 染色体 DNA上またはプラスミド上において、 目的遺伝子のプロモータ 一等の発現調節配列を強力なものに置換することによって目的遺伝子の発現を増強させる 方法である。 例えば、 lacプロモーター、 trpプロモーター、 trcプロモー夕一、 tacプロ モーター等が強力なプロモーターとして知られている。 また、 国際公開 W000/18935に開示 されているように、 遺伝子のプロモー夕一領域に数塩基の塩基置換を導入し、 より強力な ものに改変することも可能である。 発現調節配列の置換は、 例えば、 温度感受性プラスミ ドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。 本発明の腸内細菌科に属する微生 物に用いることが出来る、 温度感受性複製起点を有するベクターとしては、 例えば！） 99/03988号国際公開パンフレットに記載のプラスミド PMAN997等が挙げられる。 また、 λ ファージのレッド · リコンビナーゼ （Red recombinase) を利用した方法 （Datsenko, K. A. , PNAS (2000) 97 (12) , 6640-6645) によっても、 発現調節配列の置換を行うことができる。 なお、 発現調節配列の改変は、 上述したような遺伝子のコピー数を高める方法と組み合わ せてもよい。
本発明の腸内細菌科に属する微生物は、 酸性条件下で培養したときに液体培地中に L一 グルタミン酸の飽和濃度を越える量の L—グルタミン酸を蓄積する能力 （以下、 酸性条件 下での L一グルタミン酸蓄積能ということがある） を有する微生物であってもよい。 この ような微生物は、 prpC遺伝子の発現が増強することによって、 酸性条件下での L一ダル夕 ミン酸蓄積能を有するようになったものであってもよいし、 本来的に酸性条件下での — グルタミン酸蓄積能を有するものであってもよい。
本来的に酸性条件下での L一グルタミン酸蓄積能を有する微生物として具体的には、 パ ントエア.アナナティス ΑΠ3355株（FERM BP— 66 14)、 AJ13356株（FERM B P— 66 15)、 及び AJ13601 株 （FERM BP- 7207) (以上、 特開 200 1— 333769号 公報参照）、 クレブシエラ -プランティコーラ AJ13399株 （FERM BP- 6616) などが挙げられ る。 パントエア ·アナナティス A J 1 3355は、 平成 1 0年 2月 1 9日に、 通産省工業 技術院生命工学工業技術研究所 （現名称、 産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所） に、 受託番号 FERM P-16644として寄託され、 平成 1 1年 1月 1 1日にプダぺ スト条約に基づく国際寄託に移管され、 受託番号 FERM BP— 66 14が付与されて いる。 尚、 同株は、 分離された当時はェンテロバクタ一 'アグロメランス （Enterobacter agglomerans) と同定され、 ェンテロパクター 'アグロメランス A J 13355として寄託 されたが、 近年 1 6 S r RN Aの塩基配列解析などにより、 パントエア ·アナナティス (Pantoea ananatis) に再分類されている （後記実施例参照）。 また、 A J 13355から 誘導された菌株 A J 13356、 及び A J 1 3601も、 同様にェンテロパクター 'ァグ ロメランスとして前記寄託機関に寄託されているが、 本明細書ではパントエア ·アナナテ イスと記述する。 AJ13601は、 1999年 8月 18日に経済産業省工業技術院生命工学工業 技術研究所 （郵便番号 305 - 8566 茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号） に受託番号 FE MP17156 として寄託され、 2000年 7月 6日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移 管され、 受託番号 FERM BP-7207が付与されている。 く 2 >本発明の Lーァミノ酸の製造方法
L -アミノ酸生産能を有し、 かつ、 prpC遺伝子の発現が増加されるように改変された腸内 細菌科に属する微生物を培地で培養して、 L一アミノ酸を該培地中に生成蓄積させ、 該培 地から L—アミノ酸を採取する L一アミノ酸の製造法である。 従って、 く 1>に記載した 本発明の微生物を培地に培養し、 培地中に L一アミノ酸を生成蓄積せしめ、 L一アミノ酸 を該培地から採取することにより、 Lーァミノ酸を製造することが出来る。
培養に用いる培地は、 炭素源、 窒素源、 無機塩類、 その他必要に応じてアミノ酸、 ビタ ミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。 合成培地または天 然培地のいずれも使用可能である。 培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株 が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。 炭素源としては、 グルコース、 グリセロール、 フラク 1 ^一ス、 スクロース、 マル] ^一ス、 マンノース、 ガラク卜ース、 澱粉加水分解物、 糖蜜等の糖類が使用でき、 その他、 酢酸、 クェン酸等の有機酸、 エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して 用いることができる。 窒素源としては、 アンモニア、 硫酸アンモニゥム、 炭酸アンモニゥ ム、 塩化アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム、 酢酸アンモニゥム等のアンモニゥム塩また は硝酸塩等が使用することができる。 有機微量栄養素としては、 アミノ酸、 ビタミン、 脂 肪酸、 核酸、 更にこれらのものを含有するペプトン、 カザミノ酸、 酵母エキス、 大豆たん 白分解物等が使用でき、 生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合 には要求される栄養素を捕添することが好ましい。 無機塩類としてはりん酸塩、 マグネシ ゥム塩、 カルシウム塩、 鉄塩、 マンガン塩等が使用できる。
培養は、 好ましくは、 発酵温度 2 0〜4 5 °C> p Hを 3〜9に制御し、 通気培養を行う。 培養中に p Hが下がる場合には、 例えば、 炭酸カルシウムを加えるか、 アンモニアガス等 のアル力リで中和する。 このような条件下で、 好ましくは 1 0時間〜 1 2 0時間程度培養 することにより、 培養液中に著量の L―グルタミン酸が蓄積される。
また、 L—グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、 培地中 に 一グル夕ミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。 L—グルタミン酸が析出 する条件としては、 例えば、 p H 5 . 0〜4. 0、 好ましくは p H 4 . 5〜4 . 0、 さら に好ましくは p H 4. 3〜4 . 0、 特に好ましくは p H 4 . 0を挙げることができる。 培養終了後の培養液から L一グルタミン酸を採取する方法は、 公知の回収方法に従って 行えばよい。 例えば、 培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交 換クロマトグラフィ一等によつて採取される。 L -ダル夕ミン酸が析出するような条件下 で培養した場合、 培養液中に析出した L—グルタミン酸は、 遠心分離又は濾過等により採 取することができる。 この場合、培地中に溶解している L—グルタミン酸を晶析した後に、 併せて単離してもよい。
[実施例]
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 本発明は以下の実施例に限定 されるものではない。
実施例 1 prpC遺伝子のパントエア属細菌への導入効果
< 1 - 1 >prpC (メチルクェン酸シンターゼをコードする遺伝子)、 gl tA (クェン酸シン ターゼをコードする遺伝子） のクローニング
prpC 遺伝子は PCRにより増幅、 クローン化を行った。 PCRプライマーの設計は GenBank access ion No. AAC73436に記載の塩基配列に従った。 プライマーとしては配列番号 1に示す ォリゴヌクレオチド GLTEZS0と配列番号 2に示す GLTEEZA1、铸型 DNAとしては E. col i W31 10 株 （国立遺伝研究所より分譲） の染色体 DNAを用い、 夕カラバイオ製の LA- TaQポリメラー ゼを用いてその標準条件にて DNA断片の増幅を行つた。
増幅した DNA断片を Promega社製のプラスミドベクター pGEM- Teasyに連結し、 prpC遺伝 子を搭載したプラスミド pGEMprpCを作成した。 さらに、 プラスミド pGEMprpC を制限酵素 Smalと HindlEにて処理し、 夕カラバイオ社製の pSTV28の同サイ卜に挿入することで、 prpC 遺伝子増幅プラスミド pSTVprpCを作成した。
—方、 比較対象として野生型のクェン酸シンターゼをコードする gl tA断片のクローニン グを同時に行った。 ェシエリヒアの野生型の gl tA遺伝子は、 2—ォキソダルタル酸、 NADH によって阻害を受けるクェン酸シン夕一ゼをコードしている。
PCRプライマーとしてオリゴヌクレオチド GLTES2 (配列番号 3 ) と GLTEA2 (配列番号 4 ) を用い、 铸型 DNAとしては E. col i W3110株のクロモゾーム DNAを用い、 夕カラバイオ社製 の LA - TaQポリメラ一ゼを用いてその標準条件にて DNA断片の増幅を行った。 増幅した DNA 断片を Promega社製のプラスミドベクター pGEM- Teasyに連結し、野生型 gl tA遺伝子を搭載 したプラスミド pGEMgl tAWを作成した。 さらに、 プラスミド pGEMgl tAWを制限酵素 Smalと HindlEにて処理し、 夕カラバイオ社製の pSTV28 の同サイトに挿入することで、 pSTVgl tAW を作成した。
< 1 - 2 > prpC増幅プラスミド、 gl tA増幅プラスミドのパントエア属 L -グルタミン酸生 産菌への導入
パントエア ·アナナティス AJ13601株を親株として、 prpC遺伝子の導入効果を検証する 菌株の構築を行った。 なお、 パントエア ·アナナティス ΑΠ3601 株は経済産業省工業技術 院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 3 0 5— 8 5 6 6 茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3 号） に受託番号 FEEM P- 17516として 1999年 8月 18日に寄託され、 2 0 0.0年 7月 6日に ブ夕ぺスト条約に基づく国際寄託に移管され、 受託番号 FERM BP- 7207が付与されている 。 パントエア · 'アナナティス AJ 13601 株にはコリネ型細菌由来のクェン酸シンターゼの遺 伝子を搭載したプラスミド pSTVCBと、 ェシェリヒア ·コリ由来のグルタミン酸デヒドロゲ ナーゼ、 ホスホェノールピルビン酸デヒドロゲナ一ゼ、 クェン酸シン夕一ゼを搭載したプ ラスミド RSFCPGが既に導入されている （特開 2001-333769)。 そこで、 pSTVCBを脱落した 菌株の取得を行った。 具体的には、 pSTVCB にはクロラムフエ二コール耐性遺伝子が搭載さ れているため、 クロラムフエ二コール耐性の消失を指標に目的株を取得し、 STVCB が脱落 したパントエア ·アナナティス G106S株と命名した。
続いて G106S株をプラスミド pSTVprpC もしくは pSTVgl tAW もしくはベクタ一である PSTV28 にてエレクトロボレ一シヨン法にて形質転換を行い、 それぞれパントエア ·ァナナ テイス G106S/ pSTVprpC株、 パントエア ·アナナティス pSTVgl tAW株、 パントエア .アナ ナティス G106S/ PSTV28株を取得した。
く 1一 3 > prpC遺伝子増幅の L -ダル夕ミン酸生産の効果
パントエア ·アナナティス G106S/ pSTVprpC 株、 パントエア .アナナティス pSTVgl tAW 株、 パントエア ·アナナティス G106S/ pSTV28株を下記に示す組成の培地 300mLを注入し た 1L溶のジャーフアーメンターに植菌し、 34で、 pH6. 0にて糖が枯渴するまで 12時間〜 14 時間培養を行つた。培養 Hの制御は培地にアンモニアガスを注入することによつて行つた。 その結果、 パントエア ·アナナティス G106S/ PSTV28株では 17. 5g/Lの L-グルタミン酸蓄 積が得られ、 パントエア ·アナナティス pSTVgl tAW株では 21. 3g/Lの L-グルタミン酸蓄積 であった。 一方、 パントエア ·アナナティス G106S/ pSTYprpC株では 24 5g/Lの L-グルタ ミン酸蓄積が得られ、 rpC遺伝子を導入することにより g】t A遺伝子を導入したときよりさ らに高い L-グルタミン酸生産量の向上が確認された。
〔培養培地組成〕
シュ一クロース 50g/L
MgS04 - 7H20 0. 4g/L
(NH4) 2S04 4. Og/L
K¾P04 2. Og/L
酵母エキス 4. Og/L
FeS04 - 7¾0 0. O lg/L
MnSO4 - 5H20 0. O l g/L
L—リジン塩酸塩 0. 4g/L
DL-メチォニン 0. 4g/L
ε—ジアミノピメリン酸 0. 4g/L
テ卜ラサイクリン塩酸塩 25mg/L
クロラムフエ二コール 25mg/L
続いて、 以上のようにして得られた培養液 60mLを加えることで下記に示す組成となるよ うに調整した培地 300mLを注入した 1L溶のジャーフアーメン夕一に植菌し、 34°C、 pH4. 5 にて 32時間培養を行った。 培養 pHの制御は培地にアンモニアガスを注入することによつ て行った。 また、 最初に加えたグルコースの枯渴に伴い 700g/Lのグルコース溶液を連続的 に添加した。
以上のようにして得られた培養液中の L -グルタミン酸生産量を表 1に示す。 なお、 パン トエア ·アナナティス G106S/pSTVprpC株を用いた培養ではグルタミン酸の結晶の析出が観 察されたため、 培養終了後に培養液にアンモニアガスを注入し pH6. 0 に調整することによ り結晶ダル夕ミン酸をすベて溶解して測定した。
〔培養培地組成〕
グルコース 5 Og/L
MgS04 - 7¾0 0. 4g/L
麵 4) 2S04 5. Og/L
KH2P04 6. Og/L
酵母エキス 6. Og/L
FeSO, - 7H20 0. 02g/L MnS04-5¾0 0.02g/L
L一リジン塩酸塩 0.6g/L
DL-メチォニン 0.6g/L
ε—ジアミノピメリン酸 0.6g/L
CaCl2 0.75g/L
テトラサイクリン塩酸塩 25mg/L
クロラムフエ二コール 25mg/L
【表 1】
Figure imgf000019_0001
その結果、 パントエア ·アナナティス G106S/ PSTV28株では 24.8 g/Lの L-グルタミン酸蓄 積が得られ、 パントエア ·アナナティス pSTVgltAW株では 30, 8/Lの L -グルタミン酸蓄積で あった。 一方、 パントエア ·アナナティス G106S/ pSTVprpC株では 105.3/Lの L -ダルタミ ン酸蓄積が得られ、 prpC遺伝子を導入することにより大幅に L -グルタミン酸生産量が向上 した。
【オリゴヌクレオチド配列】
配列番号 名称 配列
配列番号 1 GLTEZS0 5 gagcgacacaacgatcctgcaaaa 3'
配列番号 2 GLTEZA1 5 aaaagcttcatgggctttgatcattgcggtc 3
配列番号 3 GLTES2 5 cccccgggatttccttcctccggtctgctt 3'
配列番号 4 GLTEA2 5 gaaagcttcatcagcagcataaacaggtg 3'

Claims

請求の範囲
[1] L一アミノ酸生産能を有し、 かつ、 prpC遺伝子の発現が増強されるように改変され た腸内細菌科に属する微生物を培地で培養して、 L—アミノ酸を該培地中に生成蓄積させ、 該培地より L一アミノ酸を採取する、 L一アミノ酸の製造法。
[2]prpC遺伝子のコピー数を高めること、 又は該遺伝子の発現調節配列を改変すること により prpC遺伝子の発現が増強された、 請求項 1に記載の製造法。
[3]前記 prpC遺伝子が、 下記 （a) 又は （b) に記載の DNAである、 請求項 1または 2に記載の製造法：
( a ) 配列番号 5に示す塩基配列を含む D N A、
(b) 配列番号 5に示す塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプロ一ブとストリン ジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつメチルクェン酸シン夕ーゼ活性を有するタン パク質をコードする DNA。
[4]前記腸内細菌科に属する微生物が、 パントエア属、 ェンテロバクター属、 クレブシ エラ属、 セラチア属、 エルビニァ属、 ェシエリヒア属よりなる群から選択される請求項 1 〜 3のいずれか一項に記載の製造法。
[ 5]前記腸内細菌科に属する微生物がパントエア ·アナナティス FERM BP— 66 14株あるいは FERM BP-7207株由来の微生物である、 請求項 1〜4のいずれか一項に記載 の製造法。
[6]前記アミノ酸が L一グルタミン酸、 L—アルギニン、 L—グルタミン、 L—プロリ ン、 L—オル二チン、 Lーシトルリンよりなる群から選択される一種または二種以上のァ ミノ酸である、 請求項 1〜 5のいずれか一項に記載の製造法。
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