WO2006047928A1 - Préparation et applications de puces immunodétectrices pour la détection de cellules cancéreuses - Google Patents

Préparation et applications de puces immunodétectrices pour la détection de cellules cancéreuses Download PDF

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cancer
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Zuming Tang
Zuhong Lu
Yuzhi Yang
Chunxiu Zhang
Yinglei Yu
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Southeast University
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Southeast University
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent

Definitions

  • the invention relates to a method for preparing and detecting a nucleated cell immune chip in a peripheral blood of a human tumor patient, and belongs to the technical field of manufacture and detection of a biochip. Background technique
  • Cancer is one of the common diseases that endanger human health. Since the pathogenesis has not been thoroughly explored, there are no specific treatments, especially in the advanced stage. The prognosis of cancer patients is often related to the discovery of cancer sooner or later. Early detection of the use of immunotherapy or surgery can cure. If it is in the middle and late, it is very unfavorable for the prognosis of cancer patients. This shows the importance of early diagnosis of cancer patients. If cancer can be detected early, early diagnosis, most patients get radical cure. However, most of the patients seen in the clinic are not early cancers. Because there are often no special symptoms in the early stages of cancer. Therefore, patients generally do not take the initiative to go to the hospital for examination, and once they feel obvious, the condition is often in the middle and late stages. Therefore, many cancer patients, once found in the middle or late stage, have brought great difficulties to the treatment of patients. If there is a way to diagnose in the early stages of cancer, it will bring hope to patient treatment. It is not an illusion to cure cancer patients in this way.
  • pathological diagnosis requires tumor tissue, so it is generally not possible to obtain tumors from early patients. Because it is a biopsy specimen, the specific material and the sliced part are all sampled. Under the light microscope, only a small part of the lesion is seen, and sometimes it cannot fully represent the whole lesion. In addition, whether the pathological diagnosis is reliable or not is also related to the selection of pathological specimens. Sometimes there are false negative results.
  • the use of tumor-specific antigens and tumor-associated antibody diagnosis is also a more effective early diagnosis method for the diagnosis of tumors.
  • tumors cannot be diagnosed at an early stage because of their limited expression.
  • a more effective early diagnosis method for tumor diagnosis using tumor marker tumor-specific antigen and tumor-associated antigen can be detected at low tumor load; and the concentration of markers in blood or other body fluids is directly related to tumor cell load, tumor markers appear in this type of tumor All patients.
  • Most tumors can release antigenic macromolecular substances into the blood circulation and can be detected by immunological methods.
  • Cancer is caused by genetic, viral infection or some other physicochemical factors. First, it causes normal cells to undergo gene mutation or activation of normal resting genes to express new protein molecules. These proteins can act on cell membranes, and the body has nuclear cell membranes. Corresponding changes will also occur, especially in the blood, the life cycle of nucleated cells is short, the cell membrane is affected, and it is easily recognized by some immune cells in the body. After the new protein is released into the body fluid, these proteins may be some immune cells of the body. Identification, specific antigen presenting cells recognize and present to lymphocytes to produce antibodies. It can be seen that the nucleated cell membrane in the blood changes early in the early stage of cancer. How to find and grasp this change in time is a key to the early diagnosis of tumor.
  • the method has the advantages of high accuracy and convenient use, and has great significance for early diagnosis of tumors and timely treatment of tumor patients.
  • the preparation method of the tumor immune cell detecting chip of the invention is:
  • chemical modification is carried out on the carrier, that is, the amino group and the aldehyde group are modified to ensure that the chemical group on the carrier can react with the antibody to bind to the carrier, and can maintain the immunological activity of the antibody bound to the carrier;
  • the above-mentioned antibodies on the slides modified with chemical groups such as: lung cancer, liver cancer, gastric cancer and other tumors, and new protein antibodies expressed by gene mutations such as skeletal tumor leukemia, are placed at 0 ° C—
  • the chemical modification on the carrier that is, the modification of the amino group, the aldehyde group is as follows:
  • a. Slide cleaning Take the slide glass and wash it with water, soak it in a solution consisting of hydrogen peroxide and concentrated sulfuric acid, then rinse it with deionized water or distilled water, boil it, dry it under nitrogen flow, and keep it for use;
  • Aminosiliconization on the surface of the slide The cleaned slide is immersed in a solution containing 0.1-10.0% aminopropyltrimethoxysilane "3-aminopropyltriethoxysilane" in 95% acetone/water for 3-30 minutes. After taking out, the slides are washed successively with acetone and deionized distilled water, and finally dried and stored;
  • PB solution phosphate buffer
  • glutaraldehyde 1%-10% glutaraldehyde
  • the solution is washed, then rinsed with deionized distilled water, dried with nitrogen, and stored for later use;
  • preparation of agarose film on the surface of the slide according to the ratio of 0.5-3.0g agarose to 100ml of double distilled water to form agarose solution, completely mixed and boil; cover the agarose solution in preheated aminosilicon ⁇ modified glass slide; after the agarose solidifies, the slide is dried and stored;
  • calf serum albumin-N-hydroxysuccinimide (BSA-NHS) modification on the surface of the slide 1.76 g of N-N'-disuccinimidyl carbonate, with 1 to 5 ml of NN, -2
  • the ratio of isopropylethylamine was dissolved in 65-69 ml of anhydrous dimethylformamide "DMF”, and the slide was placed in the solution; rinsed with ethanol; the slide was immersed in 0.2-5 % calf serum albumin in PBS solution at room temperature; rinse with deionized water and then with ethanol; remove residual solvent, then immerse in anhydrous dimethylformamide "DMF” solution, leave at room temperature, dry and preserve :
  • the detection method is: adding the white blood cells or lymphocyte separation liquid to the peripheral blood containing the anticoagulant, removing the red blood cells to obtain the nucleated cells in the blood, and suspending the nucleated cells in the PBS or other isotonic solution with the human body, Then, the suspended cells in the solution are added to the tumor immune cell detection chip, placed in an environment of 2 ° C - 55 ° C for 0.1 _ 72 h; the carrier is taken out, with a pH of 4.0-12, the ion concentration of 0.001-1.100 M solution will not The free nucleated cells bound by the antibody on the carrier are washed away; then, the cells are stained on a microscope or CCD or the cells are stained to observe the binding of the cells at each point, that is, the detection is performed.
  • the immune cell chip of the present invention is characterized in that a chemical group is modified on a carrier, and a tumor-associated marker antibody is modified on the carrier, and a specific protein on the surface of the nuclear cell membrane in the blood of the cancer is combined with an antibody on the chip, according to The presence or absence of cells at each point can be used to determine the presence or absence of tumors and tumors.
  • the carrier of the present invention may be a high molecular polymer, or may be a slide glass or the like, and may be repaired on the carrier. Decorated with amino and aldehyde groups.
  • the method of the present invention is in vitro detection, it does not have any other harm to the human body except for collecting peripheral blood, and can be detected before the solid tumor is formed, and the accuracy is high. Easy to use, it is of great significance for the early diagnosis of tumors and for the timely treatment of cancer patients. detailed description
  • the preparation method of the tumor immune cell detecting chip of the invention is as follows: First, chemical modification is performed on the carrier, that is, the amino group and the aldehyde group are modified to ensure that the chemical gene on the carrier can react with the antibody to bind to the carrier, and can maintain The immunological activity of the antibody bound to the carrier; and then the corresponding antibody is spotted on the slide with the chemical gene modified above, such as: lung cancer, liver cancer, gastric cancer and the like, and new protein antibodies expressed by gene mutations such as skeletal tumor leukemia Store in O'C—55 ⁇ in a humid environment for 0.1-72 hours, remove the slide, and wash with a buffer of pH 4.0-10, ion concentration 0.00-0.75m/L.
  • the specific steps are as follows:
  • Chip production
  • the slides were washed with water, placed in a solution consisting of 1/3 hydrogen peroxide and 2/3 concentrated sulfuric acid, and immersed for 0.5-3.0 hours. Then rinse with ionic or distilled water for 2-4 times, then boil with deionized water or distilled water for 2-30 minutes; dry under nitrogen flow and store in a dry place.
  • the cleaned slide is immersed in a solution containing 0.1-10.0% of aminopropyltriethoxysilane in 95% acetone/water for 30-30 minutes. After taking out, the slide is washed with acetone for 2-4 times. Each time for 1 to 5 minutes, rinse with deionized distilled water for 1 to 5 times, each time for 1 to 5 minutes, and finally dry at 60-180 ° C, and store in a dry place.
  • the siliconized wafer is placed in a PB solution (0.001 - 0.150M PH4.5 - 11.0) containing 1% - 10% glutaraldehyde, soaked at room temperature for 0.1-10 hours, and then taken out with PB ( 0.001 - 0.150 M pH 4.5 - 11.0) Wash 2-6 times, then rinse 3 times with deionized distilled water, blow dry with nitrogen, and store at 4 ° C for later use. (3) Poly-lysine modification on the surface of the slide
  • agarose 0.5-3.0g is added to 100ml of double distilled water to form agarose solution, completely mixed in a microwave oven and boiled for 2-10 minutes;
  • the slide is dried overnight at 10 to 120 °C. It can be stored under room temperature and dry conditions;
  • the agarose membrane should be immersed in 0.1-100 mM NaI04 solution, left at room temperature for 0.05-6.00 hours, rinsed thoroughly with double distilled water, dried with nitrogen, and dried at room temperature or low temperature.
  • the corresponding antibody (a new protein antibody expressed by a gene mutation such as a lung cancer, a liver cancer, a gastric cancer, or a skeletal tumor leukemia) is manually or by a spotting instrument. Place in a humidified environment (put the carrier in a humid box) for 0.1-72 hours, remove the carrier, and wash it for 1 to 5 times with a buffer solution of pH 4.0-10, ion concentration 0.00-0.75 m/L. . To remove unbound antibody on the carrier. The prepared chip is dried and stored in the dark.
  • Human peripheral blood and leukocyte separation fluid or lymphocytes containing anticoagulant at a ratio of 1 to 1 by volume Separate the solution, centrifuge 500-3000 rpm to remove red blood cells in the blood, then suspend the nucleated cells in the buffer, and centrifuge the cells at 500-4000 rpm to remove the leukocyte separation solution or lymphocyte separation solution from the supernatant.
  • the precipitated nucleated cells were suspended in a buffer to prepare a nucleated cell suspension.
  • the prepared chip Take out the prepared chip, add the appropriate amount of the separated nucleated cell suspension, and place it at 2 ⁇ —60°C for 0.1-72 hours.
  • the cell suspension should not be dry. Always keep the cells in the liquid and remove them. Rinse with buffer to remove unbound free cells. The cells are then observed or stained on a microscope or CCD to observe the binding of the cells to each point to determine if the patient has a tumor and what kind of tumor.

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Description

肿瘤免疫细胞检测芯片的制备和检测方法 技 术 领 域
本发明涉及一种人体肿瘤患者的外周血中有核细胞免疫芯片的制备和检测 方法， 属生物芯片的制造和检测的技术领域。 背 景 技 术
癌症是危害人类健康的常见疾病之一， 由于发病机制尚未有彻底探讨清楚， 到目前亦无特效的治疗方法， 尤其是中晚期病人。癌症患者的预后往往与癌症的 发现的早晚有一定关系。早期发现应用免疫治疗或手术可以根治。如果到了中晚 期对于癌症患者预后非常不利。 这样就显示出对于癌症患者早期诊断的重要意 义。 癌症如能早期发现， 早期诊断， 大多数病人获得根治。 但临床所见到的大多 数病人不是早期癌症。 因为癌症早期常无特殊症状。故病人一般不会主动到医院 就诊检査， 而一旦感觉明显病情常常已到中晚期。所以很多癌症病人一旦发现就 是中晚期或晚期， 为病人的治疗带来了很大的困难。如能有一种能在癌症行成的 早期即可诊断的方法， 那就为患者治疗带来了希望。这样根治癌症患者亦不是幻 想了。
肿瘤的确诊方法有多种， 如生化、免疫及影像方法这几种诊断方法在近几年 有很大进展， 但目前仍以病理学方法诊断最为可靠， 当然病理诊断也存在一些问 题。 首先病理诊断需要肿瘤组织， 所以一般能取到肿瘤亦非早期患者。 另因其是 活检标本、具体取材和切片部位均属抽样检査， 在光镜下见到的仅是病变的一小 部分， 有时不能完全代表整个病变。另外病理诊断是否可靠也与病理标本的选取 有关。有时也有假阴性的结果。应用肿瘤特异抗原和肿瘤相关抗体诊断亦是对肿 瘤诊断的一种较为有效的早期诊断方法。但有些肿瘤因其表达量有限亦不能在早 期得到诊断。应用肿瘤标志物肿瘤特异抗原和肿瘤相关抗原对肿瘤诊断的一种较 为有效的早期诊断方法。对肿瘤类型有特异性 (直接针对肿瘤)； 灵敏度高，在低肿 瘤负荷时即能检测出来；并且在血液或其他体液中的标志浓度和肿瘤细胞负荷高 低直接相关,肿瘤标志出现于该型肿瘤的所有患者.大部分肿瘤能释放具有抗原性 的大分子物质进入血循环，并可用免疫方法检测。
但目前用于肿瘤早期诊断或大量肿瘤筛选检查则仍缺乏特异性或敏感性的 肿瘤标志物。
癌症无论是遗传， 病毒感染还是一些其他物理化学因素的刺激所引起， 首先 都会致正常细胞发生基因突变或正常静止基因的激活而表达新的蛋白质分子，这 些蛋白质可作用于细胞膜， 机体有核细胞膜亦会发生相应改变， 尤其是血液中有 核细胞生命周期短， 细胞膜受影响明显， 易被机体某些免疫细胞识别， 另外新的 蛋白质被释放到体液当中后， 这些蛋白质可能被机体一些免疫细胞识别， 特别抗 原呈递细胞识别而递呈给淋巴细胞产生抗体。可见癌症发生早期血液中的有核细 胞膜最早发生改变，如何发现并及时抓住这一变化是对肿瘤能否进行早期诊断的 一个技术关键。我们应用目前已明确定与肿瘤基因及所表达蛋白相关的抗体来检 测患者与正常机体之间差异。 经临床试用， 发现能较早地发现肿瘤， 在机体实体 瘤形成之前即可确诊。为肿瘤患者能及早发现并及时得到治疗提供了一种可靠的 诊断方法。 目前还没有通过外周血中有核细胞的检测来判断和较早地发现肿瘤 方法。 发 明 内 容
技术问题
本发明的目的是提供一种肿瘤免疫细胞芯片的制备技术以及用该免疫细胞 芯片进行肿瘤检测的方法。 该方法具有准确率高、 使用方便的效果， 对于肿瘤早 期诊断以及使肿瘤患者可以及时治疗都有非常大的意义。
技术方案
本发明的肿瘤免疫细胞检测芯片的制备方法是：
首先在载体上进行化学修饰， 即修饰上氨基， 醛基， 以保证载体上的化学基 团可与抗体发生反应而结合在载体上， 并能保持结合在载体上抗体的免疫学活 性； 然后在以上修饰有化学基团的载玻片上点上相应的抗体， 如： 肺癌、 肝癌、 胃癌等肿瘤以及骨骼系肿瘤白血病等基因突变表达的新蛋白抗体等， 置于 0°C—
55 °C 潮湿环境中存放 0.1— 72小时后取出载玻片， 用 pH4.0_ 10， 离子浓度 0.00
-0.75m/L的缓冲液清洗。
在载体上进行化学修饰， 即修饰上氨基， 醛基的方法为：
a、 载玻片清洗： 取载玻片用水清洗干净， 放入由过氧化氢和浓硫酸组成的 溶液中浸泡，然后用去离子水或蒸馏水冲洗、煮沸，在氮气流下干燥，保存备用； b、 载玻片表面的氨基硅垸化： 将清洗好的载玻片浸入含有 0.1— 10.0%氨基 丙基三甲氧基硅垸 " 3-aminopropyltriethoxysilane" 的 95%丙酮 /水的溶液 3— 30 分钟， 取出后， 玻片用丙酮、 去离子蒸馏水依次冲洗， 最后烘干， 保存；
c、 玻片表面的醛基修饰： 将硅垸化后的玻片放入含 1 %— 10%戊二醛的 PB 溶液 （磷酸盐缓冲液） 中， 在室温下浸泡， 取出后先用 PB溶液清洗， 然后用去 离子蒸馏水冲洗， 用氮气吹干， 保存备用；
d、 玻片表面的聚赖氨酸修饰： 将清洗干净的玻片放入含 2%〜5 %聚赖氨 酸的 PBS溶液（磷酸盐氯化钠缓冲液） 中反应， 取出后先用 PB洗， 然后用去离 子蒸馏水冲洗， 吹干， 保存：
e、玻片表面琼脂糖膜的制备： 按 0.5— 3.0g的琼脂糖加至 100ml的双蒸水的 比例配成琼脂糖溶液， 完全混合后煮沸； 将琼脂糖溶液覆盖在预热的氨基硅垸修 饰的载玻片上； 琼脂糖凝固后， 载玻片干燥、 保存；
f、 载玻片表面的小牛血清白蛋白一 N—羟基丁二酰亚胺（BSA-NHS)修饰： 按 1.76g N-N'-disuccinimidyl 碳酸盐，与 1一 5ml的 N-N、-二异丙基乙胺的比 例， 将上述两材料溶解于 65— 69ml 的无水二甲基甲酰胺 "DMF"， 取玻片放入 此溶液； 用乙醇冲洗； 将载玻片浸入含 0.2— 5% 小牛血清白蛋白的 PBS溶液中 室温反应； 用去离子水冲洗， 然后再用乙醇冲洗； 除去残留溶剂， 再浸入无水二 甲基甲酰胺 "DMF"溶液中， 室温放置， 吹干保存：
g、 选用相关癌基因及其表达蛋白质制备抗体， 将这些抗体固定在载体上。 检测方法为：对所取已含有抗凝剂的外周血，加白细胞或者淋巴细胞分离液， 除去红细胞得到血液中的有核细胞， 将有核细胞悬浮在 PBS或其他与人体等渗 溶液中， 然后将溶液中的悬浮细胞滴加到肿瘤免疫细胞检测芯片上， 置于 2°C— 55°C环境中 0.1 _72h; 取出载体， 用 pH4.0—12, 离子浓度 0.001-1.100M溶液将 没有被载体上抗体结合的游离有核细胞洗去； 然后在显微镜或 CCD上观察或将 细胞染色观察各点结合细胞情况， 即进行检测。
本发明所述免疫细胞芯片是在一载体上修饰有化学基团，并将肿瘤相关标志 物抗体修饰在载体上，患有癌症的血液中有核细胞膜表面的特种蛋白质与芯片上 抗体结合， 根据各点细胞有无及分布可判断有无肿瘤以及患何肿瘤。
本发明所述载体可以是高分子聚合物， 亦可以是载玻片等， 在载体上可以修 饰氨基、 醛基。
有益效果； 由于本发明的方法属体外检测， 因此除采集用外周血外， 不接触 人体， 对人体不会有其他任何危害， 而且可以在实体瘤未形成之前即可检出， 且 准确率高、使用方便， 对于肿瘤早期诊断以及使肿瘤患者可以及时治疗都有非常 大的意义。 具 体 实 施 方 式
本发明的肿瘤免疫细胞检测芯片的制备方法是： 首先在载体上进行化学修 饰， 即修饰上氨基， 醛基， 以保证载体上的化学基因可与抗体发生反应而结合在 载体上， 并能保持结合在载体上抗体的免疫学活性； 然后在以上修饰有化学基因 的载玻片上点上相应的抗体， 如： 肺癌、 肝癌、 胃癌等肿瘤以及骨骼系肿瘤白血 病等基因突变表达的新蛋白抗体等，置于 O'C— 55Ό 潮湿环境中存放 0.1— 72小 时后取出载玻片， 用 pH4.0— 10， 离子浓度 0.00— 0.75m/L的缓冲液清洗， 具体 步骤为：
1.芯片制作：
1 ) 载玻片清洗
取载玻片用水清洗干净， 放入由 1/3过氧化氢和 2/3浓硫酸组成的溶液中， 浸泡 0.5— 3.0小时。 然后用去离子水或蒸馏水冲洗 2— 6遍， 再用去离子水或蒸 馏水煮沸 2— 30分钟； 在氮气流下干燥， 于干燥处保存备用。
( 1 ) 载玻片表面的氨基硅垸化
清洗好的载玻片浸入含有 0.1— 10.0%氨基丙基三甲氧基硅烷 ( 3-aminopropyltriethoxysilane ) 的 95%丙酮 /水的溶液 3— 30分钟， 取出后， 玻 片用丙酮洗 2— 6遍， 每次 1一 5 分钟， 再用去离子蒸馏水冲洗 1一 5遍， 每次 1 一 5分钟， 最后在 60— 180°C下烘干， 置于干燥处保存。
(2) 玻片表面的醛基修饰
将硅垸化后的玻片放入含 1 %— 10%戊二醛的 PB 溶液 （0.001— 0.150M PH4.5- 11.0) 中， 在室温下浸泡 0.1— 10小时， 取出后先用 PB (0.001— 0.150M pH4.5— 11.0)洗 2— 6次，然后用去离子蒸馏水冲洗 3遍，用氮气吹干，置于 4°C 保存备用。 (3 ) 玻片表面的聚赖氨酸修饰
将清洗干净的玻片放入含 3 %聚赖氨酸的 PBS溶液 · ( 0.01 -0.14M pH405— 11.0) 中反应 0.1— 10小时， 取出后先用 PB洗 2— 6次， 然后用去离子蒸馏水冲 洗 2— 6遍， 吹干， 于 4°C保存。
2 ) 玻片表面琼脂糖膜的制备
( 1 ) 0.5-3.0g的琼脂糖加至 100ml的双蒸水配成琼脂糖溶液， 完全混合微波炉 煮沸 2— 10分钟；
(2) 将 1 _5 ml琼脂糖溶液覆盖在 60°C左右预热的氨基硅垸修饰的载玻片上；
(3 ) 琼脂糖凝固后， 玻片在 10— 120°C下过夜干燥。 可室温干燥条件下保存；
(4 ) 在使用之前， 琼脂糖膜要浸入 0.1-lOOmM 的 NaI04 溶液， 室温下放置 0.05-6.00小时， 再用双蒸水彻底冲洗干净， 并用氮气流干燥， 于室温或低温干燥 保存。
3 ) . 玻片表面的小牛血清白蛋白一 N—羟基丁二酰亚胺 （BSA-NHS ) 修饰
( 1 ) 1.76g N-N^-disuccinimidyl 碳酸盐， 与 l _5ml的 N-N、-二异丙基乙胺， 溶 解于 65—69ml的无水二甲基甲酰胺 （DMF)。 取玻片放入此溶液， 室温 1一 6小 时。
(2) 用 95%乙醇冲洗数遍。
(3 ) 将玻片浸入含 0.2— 5% BSA的 PBS (0.01M pH7.4) 溶液， 室温反应 05— 24小时。
(4) 用去离子水冲洗数遍， 然后再用 95% 乙醇冲洗两遍。
(5 ) 除去残留溶剂， 再浸入 DMF溶液， 室温放置 0.5— 6小时。 除去溶剂， 气 吹干于 4°C保存。
在以上修饰有化学基因的载体上用手工或用点样仪点上相应的抗体 （肺癌、 肝癌、 胃癌等肿瘤以及骨骼系肿瘤白血病等基因突变表达的新蛋白抗体等）。 置 于 0Ό— 55Ό 潮湿环境中（将载体放在潮湿盒子内）内存放 0.1— 72小时后取出 载体， 用 pH4.0— 10， 离子浓度 0.00—0.75m/L的缓冲液清洗 1一5遍。 以除去载 体上未结合的抗体。 制好的芯片吹干， 避光保存备用。
2、 检测方法：
按体积 1比 1的比例取含有抗凝剂的人体外周血与白细胞分离液或淋巴细胞 分离液， 离心 500— 3000转除去血液中的红细胞， 然后将有核细胞的悬浮在缓冲 液中， 再 500— 4000转离心沉淀细胞， 以除去上清中白细胞分离液或淋巴细胞分 离液， 再将沉淀的有核细胞混悬在缓冲液中， 制备成有核细胞混悬液。
取出 1置备好的芯片， 加上适量上述已分离好的有核细胞混悬液， 在 2Ό— 60°C放置 0.1— 72小时， 细胞悬液不能干， 要始终使细胞在液体内， 取出后用缓 冲液冲洗， 除去未结合的游离细胞。 然后在显微镜或 CCD上观察或将细胞染色 观察各点结合细胞情况以确定该患者是否患肿瘤以及是何种肿瘤。

Claims

权利要求 书
1、一种肿瘤免疫细胞检测芯片的制备方法， 其特征在于首先在载体上进行 化学修饰， 即修饰上氨基， 醛基， 以保证载体上的化学基团可与抗体发生反应而 结合在载体上， 并能保持结合在载体上抗体的免疫学活性； 然后在以上修饰有化 学基团的载玻片上点上相应的抗体， 如： 肺癌、 肝癌、 胃癌等肿瘤以及骨骼系肿 瘤白血病等基因突变表达的新蛋白抗体等， 置于 0Ό— 55°C 潮湿环境中存放 0.1 -72小时后取出载玻片，用 pH4.0_ 10，离子浓度 0.00—0.75m/L的缓冲液清洗。
2、按照权利要求 1所述的一种肿瘤免疫细胞检测芯片的制备方法， 其特征 在于在载体上进行化学修饰， 即修饰上氨基， 醛基的方法为：
a、 载玻片清洗： 取载玻片用水清洗干净， 放入由过氧化氢和浓硫酸组成的 溶液中浸泡，然后用去离子水或蒸馏水冲洗、煮沸，在氮气流下干燥，保存备用； b、 载玻片表面的氨基硅垸化： 将清洗好的载玻片浸入含有 0.1— 10.0%氨基 丙基三甲氧基硅垸 "3-aminopropyltriethoxysilane" 的 95%丙酮 /水的溶液 3— 30 分钟， 取出后， 玻片用丙酮、 去离子蒸馏水依次冲洗， 最后烘干， 保存；
c、 玻片表面的醛基修饰： 将硅垸化后的玻片放入含 1 %— 10%戊二醛的磷 酸盐缓冲液中， 在室温下浸泡， 取出后先用 PB溶液清洗， 然后用去离子蒸馏水 冲洗， 用氮气吹干， 保存备用；
d、 玻片表面的聚赖氨酸修饰： 将清洗干净的玻片放入含 2%〜5%聚赖氨 酸的磷酸盐氯化钠缓冲液中反应，取出后先用 PB洗，然后用去离子蒸熘水冲洗， 吹干， 保存：
e、玻片表面琼脂糖膜的制备： 按 0.5— 3.0g的琼脂糖加至 100ml的双蒸水的 比例配成琼脂糖溶液， 完全混合后煮沸； 将琼脂糖溶液覆盖在预热的氨基硅垸修 饰的载玻片上； 琼脂糖凝固后， 载玻片干燥、 保存；
f、 载玻片表面的小牛血清白蛋白一 N—羟基丁二酰亚胺（BSA-NHS)修饰： 按 1.76g N-N'-disuccinimidyl 碳酸盐，与 1— 5ml的 Ν-Ν'-二异丙基乙胺的比 例， 将上述两材料溶解于 65— 69ml 的无水二甲基甲酰胺 "DMF"， 取玻片放入 此溶液； 用乙醇冲洗； 将载玻片浸入含 0.2— 5% 小牛血清白蛋白的 PBS溶液中 室温反应； 用去离子水冲洗， 然后再用乙醇冲洗； 除去残留溶剂， 再浸入无水二 甲基甲酰胺 " DMF"溶液中， 室温放置， 吹干保存；
g、 选用相关癌基因及其表达蛋白质制备抗体， 将这些抗体固定在载体上。
3、 一种如权利要求 1所述的肿瘤免疫细胞检测芯片的制备方法制备的芯片 的检测方法， 其特征在于， 对所取已含有抗凝剂的外周血， 加白细胞或者淋巴细 胞分离液， 除去红细胞得到血液中的有核细胞， 将有核细胞悬浮在 PBS或其他 与人体等渗溶液中， 然后将溶液中的悬浮细胞滴加到肿瘤免疫细胞检测芯片上， 置于 2°C— 55°C环境中 0.1—72h;取出载体，用 pH4.0—12,离子浓度 0.001-U00M 溶液将没有被载体上抗体结合的游离有核细胞洗去； 然后在显微镜或 CCD上观 察或将细胞染色观察各点结合细胞情况， 即进行检测。
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