WO2006043615A1 - 免疫抑制受容体の用途 - Google Patents

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Tomoyuki Odani
Hideaki Tada
Kimiho Moroe
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Ono Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • Non-Patent Document 2 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 98 (24): 13866-71 (2001)
  • step (iii) a method that also has the process power of screening for compounds that inhibit the binding by comparing the signal intensity of step (ii) in the presence and absence of the test compound,
  • an immunosuppressant comprising a protein agonist having the same or substantially the same amino acid sequence as the selected amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 6,
  • autoimmune disease is a disease in which lupus anticoagulation factor is high, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis or Takayasu arteritis,
  • inhibitortion of intracellular signal transduction by the protein according to the present invention is, for example, responsible for intracellular signal transduction by the phosphatase bound to the intracellular region of the protein according to the present invention. Examples include molecular dephosphorylation.
  • a region of amino acids 1-42 in the amino acid sequence represented by No. 5 includes a region selected arbitrarily or a region arbitrarily selected from the region of amino acids 1-132 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6,
  • a protein or polypeptide containing an arbitrary region in the extracellular region of the protein of the present invention is a known protein expression method and purification method! / Is prepared by the method described in the Examples. Can do.
  • the “ligand” in the “ligand binding of the protein according to the present invention” means an in vivo substance that binds to the extracellular region of the protein according to the present invention and has an activity of inducing the function of the protein according to the present invention. It is.
  • a ligand is preferably a protein.
  • the “extracellular region of the protein according to the present invention” is a region containing a so-called immunoglobulin or an immunoglobulin-like domain! /, Which is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • radioisotopes as detection labels include [ 32 P], [ 3 H], [ 125 I], [ 35 S] and [ 14 C]
  • luminescent substances as detection labels include luminol, luminol derivatives, luciferin, and lucigenin.
  • the position of the amino acid deletion, substitution or addition or insertion is not particularly limited.
  • a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as one amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 3 to 6 may be referred to as “the protein of the present invention”.
  • an antibody against a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 3 to 6 or a partial peptide thereof (hereinafter referred to as the present invention).
  • an antibody that recognizes the protein of the present invention or its partial peptide as long as it is an antibody that recognizes the protein of the present invention or a partial peptide thereof, a human-derived antibody, a mouse-derived antibody, a rat-derived antibody, a chicken-derived antibody, a rabbit-derived antibody, or a Any of these antibodies may be used, as well as their polyclonal or monoclonal antibodies, complete or truncated (e.g., F (ab ')
  • a DNA encoding the protein or partial peptide of the present invention may be converted to an appropriate vector (eg, retrovirus vector, papilloma violetless vector, vaccinia vineless betater, SV40 strain).
  • An expression vector is prepared by inserting it downstream of an appropriate promoter (eg, SV40 promoter, LTR promoter, metamouthone promoter).
  • an appropriate promoter eg, SV40 promoter, LTR promoter, metamouthone promoter.
  • transform appropriate mammalian cells eg, human HEK293T cells, monkey COS-1 cells, COS-7 cells, Chineseno, Muster CHO cells, mouse L cells, NS0 cells, etc.
  • the protein or partial peptide obtained as described above is obtained by a general biochemical method such as salting out, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography. It can be isolated and purified by chromatography, adsorption chromatography, chromatofocusing, isoelectric precipitation, gel filtration, ultrafiltration, etc.
  • the protein or partial peptide of the present invention can be isolated from other proteins or tags (antibody constant region). , Glutathione S-transferase, protein A, FLAG tag, hexahistidine tag, etc.) and can be expressed as a fusion protein.
  • the fusion protein can be purified by affinity chromatography and cleaved by Z or an appropriate protease (eg, enterokinase, thrombin, etc.), and has an IJ point that can be purified efficiently.
  • Infectious diseases whose prevention and Z or treatment can be expected by administration of the protein antagonist of the present invention or a pharmaceutical composition comprising the same include, for example, human hepatitis virus (for example, hepatitis B , Hepatitis C, hepatitis A and hepatitis E), human retrovirus, human immunodeficiency virus (eg HIV1 and HIV2), human T cell leukemia virus or human T lymphotropic virus (eg HTLV1 and HTLV2) , Simple herpesvirus type 1 or 2, Epstein Barr virus, cytomegalovirus, varicella-zoster virus, human herpesvirus (eg, human herpesvirus 6), poliovirus, measles virus , Rubella virus, Japanese encephalitis virus, mumps virus, influenza virus, cold virus (eg adenovirus) Virus, enterovirus and rhinovirus), viruses that cause severe acute respiratory syndrome (SARS), Ebola virus and West Nile virus infections.
  • human hepatitis virus
  • Inflammatory diseases for which prevention and z or treatment can be expected include, for example, dermatitis (for example, contact dermatitis and atopic dermatitis), colitis (for example, ulcerative colitis and Crohn's disease), Vasculitis (eg Takayasu arteritis, giant cell arteritis (temporal arteritis), polyarteritis nodosa, ugener's granulomatosis, Chearg's Strauss syndrome (allergic granulomatous vasculitis), allergic skin blood vessels Inflammation, Henoch's Sheenline purpura, hypersensitivity vasculitis, vasculitis syndrome, obstructive thrombotic vasculitis (Burger's disease), nodular vasculitis, etc.), arthritis (e.g.
  • antiviral drugs examples include anti-HIV drugs, anti-influenza virus drugs, anti-herpes virus drugs, interferon ⁇ or j8, and various immunoglobulins.
  • inhalants examples include Beclomethasone lopionate, flutizone propionate, budesodium, furosolid, Liamcinolone, ST-126P, ciclesonide, dexamethasone paromithionate, mometasone furan carbonate, plasterone sulfonate, deflazacoat, methylpred-zolone streptinate and methylprednisolone sodium succinate.
  • the protein antagonist or agonist of the present invention When administering the protein antagonist or agonist of the present invention in combination with other drugs, it is used as a solid or liquid for internal use for oral administration, or parenterally. Used as injections, external preparations, suppositories, eye drops or inhalants for administration.
  • the intraoral quick disintegrating tablet is prepared according to a known method.
  • Applied active substances to excipients eg latatose, mannitol, glucose, microcrystalline cellulose, colloidal silica or starch
  • binders eg hydroxypropylcellulose, polybutylpyrrolidone or magnesium aluminate metasilicate) Etc.
  • disintegrants eg starch, L-hydroxypropylcellulose, carboxymethylcellulose, croscarmellose sodium or calcium calcium glycolate
  • lubricants eg steers
  • dispersion aids eg glucose, fructose, mannitol, xylitol, erythritol, maltose, trenorose, phosphate, kenate, cate, glycine, glutamic acid or arginine
  • solubilizers eg, polyethylene glycol, propylene glycol, glutamic acid or aspartic acid
  • flavoring agents eg, orange, strawberry, mint
  • Example 3 Expression of BIR1 in blood cells from patients with autoimmune disease
  • pY3 of BIR1 was combined with SHP-1, SHP-2, and ⁇ 6 was combined with SHP-1, SHP-2, SHIP-1.
  • pY5 did not bind to any phosphatase.
  • Phosphopeptide derived from two ITIM regions of human BIR1 (Biotin— HSQELQ 313 (p Y) ATPVF (SEQ ID NO: 26) or Biotin— YKSGYV 338 (pY) SELNF (SEQ ID NO: 2 8)) was treated with anti-biotin antibody (Sigma To the 96-well plate. After adding the test compound (low molecular weight compound, peptide, antibody, etc.), add a solution of ⁇ 20 ⁇ 1.6 cells and incubate at 4 ° C for 2 hours. After washing 5 times with PBS, add primary antibodies (Santacruz) against SHP-1, SHP-2 and SHIP-1.
  • test compound low molecular weight compound, peptide, antibody, etc.
  • the protein of the present invention or a partial peptide thereof and the antibody against the protein of the present invention or a partial peptide thereof are useful as an antagonist of the protein according to the present invention for the prevention, epilepsy or treatment of cancer, immune disorders or infectious diseases. Furthermore, the protein of the present invention or a partial peptide thereof can be used as an antigen in the production of an antibody against the protein of the present invention or a partial peptide thereof.
  • the polynucleotide of the present invention can be used for the production of the protein of the present invention or a partial peptide thereof.
  • FIG. 2 shows changes in human BIR1 expression due to various inflammatory stimuli.
  • FIG. 3 BIRl expression variation analysis results in monocytes and B cells from patients with autoimmune disease (ND: normal donor, vWD: von Willebrand disease, SLE: systemic lupus erythematosus, RA: rheumatoid arthritis, MS: Multiple sclerosis, LA: Disease with high levels of lupus anticoagulant, TA: Takayasu arteritis, ITP: idiopathic thrombocytopenic purpura). *; P ⁇ 0. 05, * *; p ⁇ 0. 01, water water; p ⁇ 0. 005.

Abstract

　本発明は、本発明に係る蛋白質であるＢＩＲ１（B cell immunoglobulin receptor 1）のアンタゴニストの用途およびそのアンタゴニストのスクリーニング方法、さらに、ＢＩＲ１のサブタイプのポリペプチド、それらをコードするポリヌクレオチドおよびそれらのポリペプチドに対する抗体に関する。 　ＢＩＲ１は免疫抑制受容体として機能し、そのアンタゴニストは免疫賦活活性を有し、癌、免疫不全症もしくは感染症の予防および／または治療に使用できる。

Description

免疫抑制受容体の用途
技術分野
[0001] 本発明は、本発明に係る免疫抑制受容体のアンタゴニストの用途に関する。さらに 詳しく言えば、そのアンタゴ-ストを含有する免疫賦活剤およびそのアンタゴニストの スクリーニング方法に関する。 背景技術
[0002] 免疫抑制受容体として機能する分子として、 CTLA— 4(N. Engl. J. Med. 338(25): 1 813-21 (1998》、 PD— l(Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 98(24): 13866-71 (2001》およ び Fc γ RIIB(Science. 290(5489):84-9 (2000》などが知られている。
本発明に係る蛋白質（以下、 B cell immunoglobulin receptor 1(BIR1)と呼ぶことがあ る。 )のアミノ酸配列およびそれをコードする DNAの塩基配列が国際公開第 99Z33 873号パンフレットに報告されている。しかしながら、本発明に係る蛋白質の機能は 十分解明されて ヽな 、し、ましてやそのアンタゴニストおよびァゴニストの用途にっ ヽ ては全く知られていない。
[0003] 非特許文献 1 : N. Engl. J. Med. 338(25): 1813- 21 (1998)
非特許文献 2 : Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 98(24): 13866-71 (2001)
非特許文献 3 : Science. 290(5489):84- 9 (2000)
特許文献 1：国際公開第 99Z33873号パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明の課題は、本発明に係る受容体の機能を解明し、そのアンタゴニストあるい はァゴニストの用途を見出すことにある。 課題を解決するための手段
[0005] 本発明者らは、その課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、本発明に係る受容 体が免疫抑制受容体として機能することを初めて解明し、そのアンタゴニストおよび ァゴ-ストのそれぞれの用途を見出すとともに、そのアンタゴニストおよびァゴニストの スクリーニング方法を見出して、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
(1) 配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択されるアミノ酸配列と同一ま たは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴ-ストを含有してなる免 疫賦活剤、
(2) アンタゴニストが、細胞内シグナル伝達に対する前記（1)記載の蛋白質による 抑制を減弱な 、し阻害する物質である前記（1)記載の免疫賦活剤、
(3) 前記 (2)記載の物質が、前記（1)記載の蛋白質のリガンド結合を阻害する物質 である前記（2)記載の免疫賦活剤、
(4) 前記（2)記載の物質が、前記（1)記載の蛋白質の細胞内領域へのホスファタ ーゼの結合を阻害する物質である前記（2)記載の免疫賦活剤、
(5) 前記（2)記載の物質が、ホスファターゼ活性を阻害する物質である前記（2)記 載の免疫賦活剤、
(6) リガンド結合を阻害する物質が、前記（1)記載の蛋白質の細胞外領域中の任 意の領域を含む蛋白質もしくはポリペプチドまたはそれらに対する抗体である前記（3 )記載の剤、
(7) 前記（6)記載の蛋白質またはポリペプチドが、配列番号 1で表わされるアミノ酸 配列のアミノ酸 1〜227、配列番号 2で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜227、配 列番号 3で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜132、配列番号 4で表わされるァミノ 酸配列のアミノ酸 1〜137、配列番号 5で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜42お よび配列番号 6で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜132から選択されるアミノ酸 配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質またはポリペプチドで ある前記 (6)記載の免疫賦活剤、
(8) ホスファターゼが、 SHP— 1、 SHP— 2、 SHIP— 1および/または SHIP— 2で ある前記 (4)または前記（5)記載の免疫賦活剤、
(9) 癌、免疫不全症および感染症から選択される疾患の予防および Zまたは治療 剤である前記（1)記載の免疫賦活剤、
(10) 配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力も選択されるアミノ酸配列と同一ま たは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴ-ストをスクリ一ユング する方法であって、
ω被験化合物の存在下で、その細胞外領域を含む蛋白質またはポリペプチドとリガ ンドを接触させる工程、
(ii)その細胞外領域を含む蛋白質またはポリペプチドとリガンドの結合によって変動 するシグナルを検出する工程、および
(iii)被験化合物の存在下と非存在下での工程 (ii)のシグナル強度を比較することに よって、その結合を阻害する化合物をスクリーニングする工程力もなる方法、
(11) 配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択されるアミノ酸配列と同一ま たは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴ-ストをスクリ一ユング する方法であって、
(i)被験化合物の存在下で、その細胞内領域を含む蛋白質またはポリペプチドとホス ファターゼを接触させる工程、
(ii)その細胞内領域を含む蛋白質またはポリペプチドとホスファターゼの結合によつ て変動するシグナルを検出する工程、および
(iii)被験化合物の存在下と非存在下での工程 (ii)のシグナル強度を比較することに よって、その結合を阻害する化合物をスクリーニングする工程力もなる方法、
(12) 配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択されるアミノ酸配列と同一ま たは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴ-ストをスクリ一ユング する方法であって、
(i)被験化合物の存在下で、配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択される アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を発現する 細胞またはその細胞外領域を含む蛋白質もしくはポリペプチドとリガンドを発現する 細胞もしくはリガンドを接触させる工程、
(ii)工程 (ii)における接触によって変動するシグナルを検出する工程および
(iii)被験化合物の存在下と非存在下での工程 (ii)のシグナル強度を比較する工程 からなる方法、
(13) 配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択されるアミノ酸配列と同一ま たは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴニストの有効量を哺乳 動物に投与することを特徴とする免疫賦活方法、
(14) 免疫賦活剤を製造するための、配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列から 選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質の アンタゴニストの使用、
(15) 配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択されるアミノ酸配列と同一ま たは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴニストの有効量を哺乳 動物に投与することを特徴とする癌、免疫不全症および感染症から選択される疾患 の予防および Zまたは治療方法、
(16) 癌、免疫不全症および感染症から選択される疾患の予防および Zまたは治 療剤を製造するための、配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択されるアミ ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴニスト の使用、
(17) 配列番号 3〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択される一つのアミノ酸配列と 同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチド、
(18) 配列番号 3〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択される一つのアミノ酸配列と 同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドを コードするポリヌクレオチド
(19) 配列番号 3〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択される一つのアミノ酸配列と 同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチド に対する抗体、
(20) 配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択されるアミノ酸配列と同一ま たは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のァゴニストを含有してなる免疫抑 制剤、
(21) ァゴニストが、細胞内シグナル伝達に対する前記（20)記載の蛋白質による抑 制を保持な 、し増強する物質である前記 (20)記載の剤、
(22) 前記（21)記載の物質が、前記（20)の蛋白質とその蛋白質が発現する細胞 に発現する受容体を架橋する物質である前記（21)記載の剤、 (23) 前記（21)記載の物質力 前記（20)の蛋白質に対するァゴニスト抗体である 前記（21)記載の剤、
(24) 自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患および炎症性疾 患から選択される疾患の予防および Zまたは治療剤である前記（20)記載の剤、
(25) 自己免疫疾患が、ループス抗凝固因子が高値な疾患、全身性エリテマトーデ ス、関節リウマチ、多発性硬化症または高安動脈炎である前記 (24)記載の剤、
(26) 配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択されるアミノ酸配列と同一ま たは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のァゴニストの有効量を哺乳動物 に投与することを特徴とする免疫抑制方法、
(27) 免疫抑制剤を製造するための、配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列から 選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質の ァゴニストの使用、
(28) 配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択されるアミノ酸配列と同一ま たは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のァゴニストの有効量を哺乳動物 に投与することを特徴とする自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性 疾患および炎症性疾患から選択される疾患の予防および Zまたは治療方法、および
(29) 自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患および炎症性疾 患力も選択される疾患の予防および Zまたは治療剤を製造するための、配列番号 1 〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同 一のアミノ酸配列を有する蛋白質のァゴニストの使用に関する。
発明の効果
[0007] 本発明に係る蛋白質のアンタゴ-ストは、癌、免疫不全症もしくは感染症の予防お よび Zまたは治療に効果が期待できる。また、本発明に係る蛋白質のァゴ-ストは、 自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患もしくは炎症性疾患の 予防および Zまたは治療に効果が期待できる。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 本発明明細書において、「配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列から選択される アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質」における「 実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質」とは、配列番号 1〜6で表わされるアミ ノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する蛋白質と同じ機能を有する蛋白質であ つて、配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択されるアミノ酸の一部のァミノ 酸 (好ましくは 1〜5個、より好ましくは 1〜2個）が欠失したもの、その一部のアミノ酸（ 好ましくは 1〜5個、より好ましくは 1〜2個）が他のアミノ酸と置換したもの、そのアミノ 酸配列に数個のアミノ酸 (好ましくは 1〜5個、より好ましくは 1〜2個）が付加または挿 入されたもの、またはそれらを組み合わせたアミノ酸配列を有する蛋白質を意味する 。ここで、上記アミノ酸の欠失、置換または付加あるいは挿入の位置は特に限定され ない。以下、本発明明細書において、「配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列から 選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質」 を「本発明に係る蛋白質」と呼ぶことがある。
[0009] ここで、本発明に係る蛋白質として、好ましくは、配列番号 1〜4および配列番号 6 で表わされるアミノ酸配列力 選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の アミノ酸配列を有する蛋白質であり、より好ましくは、配列番号 1〜4で表わされるアミ ノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有 する蛋白質であり、さらに好ましくは、配列番号 1または 2で表わされるアミノ酸配列と 同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質であり、さらに好ましくは、配 列番号 1または 2で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質である。
[0010] 本発明明細書において、「配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列から選択される アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴニ スト」とは、細胞内シグナル伝達に対する本発明に係る蛋白質による抑制を減弱ない し阻害する物質を示す。そのような物質として、例えば、
(i)本発明に係る蛋白質へのリガンド結合を阻害し、本発明に係る蛋白質にァゴニス ト活性を有しない物質、
(ii)本発明に係る蛋白質の細胞内領域へのホスファターゼの結合を阻害する物質、
(iii)当該ホスファターゼの活性を阻害する物質、および
(iv)本発明に係る蛋白質の細胞内領域に結合したホスファターゼの活性を阻害する 物質などが挙げられる。 [0011] ここで、「細胞内シグナル」とは、例えば、 B細胞受容体 (B cell receptor(BCR))もしく は B細胞受容体複合体 (BCR、 CD79A(EMBO J. 7 (11): 3457-3464 (1988》および CD79B(Eur.J.Immunol. 22 (6): 1621-1625 (1992)))、活性化 Fc受容体 (例えば、 Fc y RlO- Biol. Chem. 266 (20): 13449-13455 (1991)))、 CD14/TLR4複合体 (Nature 406: 780-785 (2000》、 Fc ε RI(Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 85: 1907—1911 (1988) )などから生じる細胞内シグナルが挙げられる。また、「細胞内シグナル伝達に対する 本発明に係る蛋白質による抑制」としては、例えば、本発明に係る蛋白質の細胞内 領域に結合したホスファターゼによる細胞内シグナル伝達を担う分子の脱リン酸ィ匕が 挙げられる。
[0012] ここで、「本発明に係る蛋白質へのリガンド結合を阻害し、本発明に係る蛋白質にァ ゴニスト活性を有しない物質」としては、例えば、蛋白質、ポリペプチドもしくはぺプチ ド、抗体、非ペプチド性化合物、有機合成化合物または天然物 (例えば、発酵生産 物、細胞抽出物、植物抽出物、および動物組織抽出物など)などが挙げられる。 そのような物質として好ましくは、蛋白質、ポリペプチドまたは抗体であり、具体的に は、本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質もしくはポリべ プチドおよびそれらに対する抗体などが挙げられる。
[0013] 「本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質もしくはポリべ プチド」とは、本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含み、いわゆる、 細胞膜貫通領域および細胞内領域を含まない蛋白質またはポリペプチドである。具 体的には、配列番号 1で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜227の領域から任意 に選択される領域、配列番号 2で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜227の領域か ら任意に選択される領域、配列番号 3で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜132の 領域から任意に選択される領域、配列番号 4で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜 137の領域力も任意に選択される領域、配列番号 5で表わされるアミノ酸配列のアミ ノ酸 1〜42の領域力 任意に選択される領域または配列番号 6で表わされるアミノ酸 配列のアミノ酸 1〜132の領域から任意に選択される領域を含み、細胞膜貫通領域 および細胞内領域を含まない蛋白質またはポリペプチドである。ここで、「細胞膜貫 通領域」とは、配列番号 1で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 228〜250の領域、配 列番号 2で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 228〜250の領域、配列番号 3で表わ されるアミノ酸配列のアミノ酸 133〜 155の領域、配列番号 4で表わされるアミノ酸配 列のアミノ酸 138〜160の領域、配列番号 5で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 43 〜65の領域または配列番号 6で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 133〜 155の領域 であり、「細胞内領域」とは、配列番号 1で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 251〜34 3の領域、配列番号 2で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 251〜343の領域、配列 番号 3で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 156〜248の領域、配列番号 4で表わさ れるアミノ酸配列のアミノ酸 161〜253の領域、配列番号 5で表わされるアミノ酸配列 のアミノ酸 66〜 158の領域または配列番号 6で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 15 6〜 176の領域である。
[0014] 本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリぺプ チドには、他の蛋白質またはポリペプチドと融合されたものも含まれる。例えば、蛋白 質またはポリペプチドの可溶ィ匕のために、免疫グロブリンの Fcドメインと融合されたも のなどが挙げられ、それらは公知の方法により製造することができる。
「本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリぺプ チド」における「任意の領域」とは、本発明に係る蛋白質に対してアンタゴニスト活性 を有するものであれば、本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の 、ずれの領域もの であってもよい。
[0015] それら蛋白質またはポリペプチドには、例えば、そのアンタゴニスト活性の維持ない し向上、蛋白質またはポリペプチドの安定化もしくは抗原性の低減のために、その蛋 白質またはポリペプチドの一部のアミノ酸 (好ましくは 1〜5個、より好ましくは 1〜2個） が欠失したもの、その一部のアミノ酸 (好ましくは 1〜5個、より好ましくは 1〜2個）が 他のアミノ酸と置換したもの、そのアミノ酸配列に数個のアミノ酸 (好ましくは 1〜5個、 より好ましくは 1〜2個）が付加または挿入されたもの、およびそれらを組み合わせた アミノ酸配列を有するものをも含む。
本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリぺプ チドは、公知のタンパク質発現法および精製法ある!/、は実施例に記載の方法によつ て調製することができる。 [0016] 「本発明に係る蛋白質のリガンド結合」における「リガンド」とは、本発明に係る蛋白 質の細胞外領域に結合し、本発明に係る蛋白質の機能を誘導する活性を有する生 体内物質である。そのようなリガンドとして好ましくはタンパク質である。ここで、「本発 明に係る蛋白質の細胞外領域」とは、いわゆる、ィムノグロブリンあるいはィムノグロブ リン様ドメインと!/、われるドメインを含む領域であって、配列番号 1で表わされるァミノ 酸配列のアミノ酸 1〜227の領域、配列番号 2で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1 〜227の領域、配列番号 3で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜132の領域、配 列番号 4で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜137の領域、配列番号 5で表わされ るアミノ酸配列のアミノ酸 1〜42の領域または配列番号 6で表わされるアミノ酸配列の アミノ酸 1〜 132の領域である。
「本発明に係る蛋白質にァゴニスト活性を有しな 、」とは、本発明に係る蛋白質の機 能を刺激する活性を持たな ヽことを意味する。
[0017] 「本発明に係る蛋白質の細胞内領域」とは、具体的には、配列番号 1で表わされる アミノ酸配列のアミノ酸 251〜343の領域、配列番号 2で表わされるアミノ酸配列のァ ミノ酸 251〜343の領域、配列番号 3で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 156〜248 の領域、配列番号 4で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 161〜253の領域、配列番 号 5で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 66〜 158の領域または配列番号 6で表わさ れるアミノ酸配列のアミノ酸 156〜176の領域である。本発明に係る蛋白質の細胞内 領域に fま、 ヽゎゆる、 ITIM (Immunoreceptor tyrosine— based innibitory motif)様トメ インが存在し、具体的には、配列番号 1で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 311〜3 16および Zまたは 336〜341、配列番号 2で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 311 〜316および Zまたは 336〜341、配列番号 3で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 2 16〜221および Zまたは 241〜246、配列番号 4で表わされるアミノ酸配列のァミノ 酸 221〜226および Zまたは 246〜251、配列番号 5で表わされるアミノ酸配列のァ ミノ酸 126〜 131および Zまたは 151〜 156または配列番号 6で表わされるアミノ酸 配列のアミノ酸 169〜174に存在する。
[0018] 「本発明に係る蛋白質の細胞内領域へのホスファターゼの結合を阻害する物質」、 「そのホスファターゼの活性を阻害する物質」、または「本発明に係る蛋白質の細胞 内領域に結合したホスファターゼの活性を阻害する物質」における「ホスファターゼ」 としては、例えば、 SHP- 1 (Nature 352 (6337): 736-739 (1991))、 SHP— 2 (Proc. Nat. Acad. Sci. 90: 2197-2201 (1993》、 SHIP— 1 (Proc. Nat. Acad. Sci. 93: 1689- 1693 (1996》、 SHIP— 2(Biochem Biophys Res Commun. 239(3):697- 700 (1997》と 呼ばれるホスファターゼなどが挙げられる。
[0019] 「本発明に係る蛋白質の細胞内領域へのホスファターゼの結合を阻害する物質」に おける「細胞内領域へのホスファターゼの結合」とは、 ITIM様ドメインにホスファタ一 ゼが結合することであり、その結合には ITIM様ドメインに含まれるチロシン残基がリ ン酸化されることを必要とする。そのようなチロシン残基は、配列番号 1で表わされる アミノ酸配列のアミノ酸 313番目および 338番目のチロシン残基、配列番号 2で表わ されるアミノ酸配列のアミノ酸 313番目および 338番目のチロシン残基、配列番号 3 で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 218番目および 243番目のチロシン残基、配列 番号 4で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 223番目および 248番目のチロシン残基 、配列番号 5で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 128番目および 153番目のチロシ ン残基または配列番号 6で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 171番目のチロシン残 基である。
[0020] 「当該ホスファターゼの活性を阻害する物質」または「本発明に係る蛋白質の細胞 内領域に結合したホスファターゼの活性を阻害する物質」におけるホスファターゼに より脱リン酸ィ匕される標的として、例えば、細胞内シグナル伝達分子であるキナーゼ、 イノシトールリン酸などが挙げられる。そのようなキナーゼとしては、例えば、セリン z スレオニンキナーゼ（例えば、プロテインキナーゼ八、プロテインキナーゼじ、 Ca2+/ カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ、 MAPキナーゼおよび MosZRafキナー ゼなど）およびチロシンキナーゼ (例えば、受容体型チロシンキナーゼおよび非受容 体型チロシンキナーゼなど)などが挙げられる。イノシトールリン酸としては、例えば、 ホスファチジルイノシトール— 3, 4, 5—三りん酸 (Phosphatidylinosito卜 3,4,5- trisphos phate)などが挙げられる。
[0021] 当該ホスファターゼの標的であるキナーゼとしては、例えば、 ERK2(Biochem. Biop hys. Res. Commun. 182: 1416-1422 (1992》、 BTK(Nature 361 (6409), 226—233 (19 93》および SYKO. Biol. Chem. 266: 15790-15796 (1991》、 JAKl(Molec. Cell. Biol. 11: 2057-2065 (1991》、 JAK2(Biochem. Biophys. Res. Commun. 246: 627—633 (19 98》、 JAK3(Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 6374-6378 (1994》、 ZAP70(Cell 71: 649-66 2 (1992》、 BLNKdmmunity 9: 93-103 (1998》、 FYN(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83 (15): 5459-5463 (1986》、 LCK(Biochim. Biophys. Acta 888 (3): 286-295 (1986)) などが挙げられ、より好ましくは ERK2である。
[0022] 「本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリぺプ チドに対する抗体」とは、本発明に係る蛋白質へのリガンド結合を阻害し、本発明に 係る蛋白質にァゴニスト活性を有しない抗体であれば、ヒト由来抗体、マウス由来抗 体、ラット由来抗体、ニヮトリ由来抗体、ゥサギ由来抗体またはャギ由来抗体のいず れの抗体でもよぐさらにそれらのポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、完全型 もしくは短縮型 (例えば、 F(ab')、 Fab'、 Fabおよび Fv断片など)抗体、キメラ化抗体、
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ヒトイ匕抗体または完全ヒト型抗体のいずれのものでもよい。そのような抗体は、本発明 に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリペプチドを抗 原として、公知の抗体または抗血清の製造法あるいは実施例に記載の方法に従って 製造することができる。本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋 白質またはポリペプチドは、公知のタンパク質発現および精製法あるいは実施例に 記載の方法によって調製することができる。
[0023] 以上のような、細胞内シグナル伝達に対する本発明に係る蛋白質による抑制を減 弱ないし阻害する物質は、癌、免疫不全症もしくは感染症の予防および Zまたは治 療薬として有用である。
[0024] 本発明明細書において、「配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列から選択される アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のァゴニスト」 とは、細胞内シグナル伝達に対する本発明に係る蛋白質による抑制を保持ないし増 強する物質を示す。そのような物質として、例えば、
(i)本発明に係る蛋白質とその蛋白質が発現する細胞に発現する受容体を架橋する 物質、
(ii)本発明に係る蛋白質に対するァゴニスト抗体および (iii)本発明に係る蛋白質に対するリガンドなどが挙げられる。
ここで、「細胞内シグナル」とは、例えば、 B細胞受容体もしくは B細胞受容体複合 体、活性化 Fc受容体、 CD14ZTLR4複合体、 Fc ε RIなどから生じる細胞内シグナ ルが挙げられる。また、「細胞内シグナル伝達に対する本発明に係る蛋白質による抑 制を保持ないし増強する」こととしては、例えば、本発明に係る蛋白質の細胞内領域 に結合したホスファターゼによる細胞内シグナル伝達を担う分子の脱リン酸ィ匕状態の 持続あるいは頻度の増加などが挙げられる。
[0025] ここで、「本発明に係る蛋白質とその蛋白質が発現する細胞に発現する受容体を架 橋する物質」における「受容体」としては、例えば、 B細胞受容体もしくは B細胞受容 体複合体、活性化 Fc受容体、 CD14ZTLR4複合体、 Fc ε RIなどが挙げられる。 細胞内シグナル伝達に対する本発明に係る蛋白質による抑制を保持ないし増強す る物質としての「本発明に係る蛋白質とその蛋白質が発現する細胞に発現する受容 体を架橋する物質」としては、例えば、蛋白質、ポリペプチドおよび抗体などが挙げら れる。そのような物質として好ましくは、本発明に係る蛋白質とその蛋白質が発現する 細胞に発現する受容体をともに認識する抗体が挙げられる。
[0026] 細胞内シグナル伝達に対する本発明に係る蛋白質による抑制を保持ないし増強す る物質としての「本発明に係る蛋白質に対するァゴニスト抗体」とは、本発明に係る蛋 白質を活性化させる抗体であれば、ヒト由来抗体、マウス由来抗体、ラット由来抗体、 ニヮトリ由来抗体、ゥサギ由来抗体またはャギ由来抗体のいずれの抗体でもよぐさら にそれらのポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、完全型もしくは短縮型 (例え ば、 F(ab')、 Fab'、 Fabおよび Fv断片など)抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体または完全
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ヒト型抗体のいずれのものでもよい。そのような抗体は、本発明に係る蛋白質の細胞 外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリペプチドを抗原として、公知の抗体 または抗血清の製造法あるいは実施例に記載の方法に従って製造することができる 。本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリぺプ チドは、公知のタンパク質発現ならびに精製法によって調製することができる。
[0027] 細胞内シグナル伝達に対する本発明に係る蛋白質による抑制を保持ないし増強す る物質としての「本発明に係る蛋白質に対するリガンド」とは、本発明に係る蛋白質の 細胞外領域に結合し、本発明に係る蛋白質の機能を誘導する活性を有する生体内 物質であり、そのような物質が蛋白質である場合には、その部分ペプチドを有するポ リペプチドをも含む。
以上のように、細胞内シグナル伝達に対する本発明に係る蛋白質による抑制を保 持ないし増強する物質は、自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾 患または炎症性疾患の予防および Zまたは治療薬として有用である。
[0028] [本発明のスクリーニング方法]
本発明明細書にぉ ヽて、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストあるいはァゴ-ストを スクリーニングする方法 (以下、本発明のスクリーニング方法と呼ぶこともある。）として は、例えば、蛍光偏光ホモジニアスアッセィ、時間分解蛍光アツセィ、蛍光共鳴エネ ルギ一転移アツセィ、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティーホモジ-アスアッセ ィ、 RIアツセィ、バイオルミネッセンス共鳴エネルギー転移アツセィ、 Two—ハイブリツ ドレポータージーンアツセィ、細胞内 Ca2+濃度測定アツセィ、 ELISAアツセィなどを 用いて実施することができる。
[0029] 本発明に係る蛋白質のアンタゴ-ストをスクリーニングする方法における「本発明に 係る蛋白質の細胞外領域を含む蛋白質またはポリペプチド」とは、配列番号 1で表わ されるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜227の領域力 任意に選択される領域、配列番号 2 で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜227の領域から任意に選択される領域、配 列番号 3で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜132の領域から任意に選択される 領域、配列番号 4で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜137の領域力も任意に選 択される領域、配列番号 5で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜42の領域から任 意に選択される領域また配列番号 6で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜132の 領域から任意に選択される領域を含むポリペプチドである。ここで、「任意に選択され る領域」とは、本発明に係る蛋白質のリガンドに対する結合活性を維持するのに必要 とされる領域を意味する。
[0030] 「本発明に係る蛋白質の細胞内領域を含む蛋白質またはポリペプチド」とは、上記 I TIM様ドメインの領域を含む蛋白質またはポリペプチドである。ここで、 ITIM様ドメイ ンに含まれるチロシン残基はリン酸ィ匕されて 、てもよ 、。 これらポリペプチドには、任意に、酵素、蛍光物質、蛍光蛋白質、発光物質または 放射性同位元素などの検出ラベルが付加されたものが使用できる。これら検出ラベ ルの付カ卩は、本発明に係る蛋白質の細胞外領域を含む蛋白質またはポリペプチドと リガンドの結合の後あるいは前に、これらを認識する物質あるいは抗体を介して付カロ されてもよい。具体的には、本発明に係る蛋白質の細胞外領域を含む蛋白質または ポリペプチドある 、はリガンドをピオチン標識し、一方にアビジン標識された上記検出 ラベルを添加することによって付加することができる。本発明に係る蛋白質の細胞内 領域を含む蛋白質またはポリペプチドとホスファターゼの結合においても同様である
[0031] 検出ラベルとしての酵素としては、例えば、 13 ガラクトシダーゼ、 13—ダルコシダ ーゼ、アルカリホスファターゼ、パーォキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが挙げら れる。検出ラベルとしての蛍光物質としては、例えば、 FITC(Fluorescein isothiociana te)、 PI(propidium iodide)、 Cy— Cnrome、 APC(Allophycocyanin入 R— PE(R- phyco erythrin),蛍光ランタ-ドキレート（例えば、ユーロピウム、サマリウム、テルビウム、デ イスプロシゥムなど)などが挙げられる。検出ラベルとしての蛍光蛋白質としては、例え は、 GFP(Green Fluorescent Protein) ^ AmCyan、 ZsGreen、 ZsYellow、 AsRed、 RCFP(Reef Coral Fluorescent Protein), DsRed、 AcGFPl、 HcRedl、 CopGFP、 PhiYFP、 PhiYFP— m、 EYFP、 KFP— Redなど挙げられる。検出ラベルとしての 放射性同位元素としては、例えば、〔32P〕、 〔3H〕、 〔125I〕、 〔35S〕および〔14C〕が挙げ られる。検出ラベルとしての発光物質としては、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフ エリン、ルシゲニンなどが挙げられる。
[0032] 本発明明細書において、本発明のスクリーニング方法の「それらの細胞外領域を含 む蛋白質またはポリペプチドとリガンドを接触させる工程」における「リガンド」とは、本 発明に係る蛋白質の細胞外領域に結合し、本発明に係る蛋白質の機能を誘導する 活性を有する生体内物質である。そのようなリガンドとして好ましくは蛋白質である。
「本発明に係る蛋白質の細胞外領域を含む蛋白質またはポリペプチドとリガンドの 結合によって変動するシグナル」あるいは「本発明に係る蛋白質の細胞内領域を含 む蛋白質またはポリペプチドとホスファターゼの結合によって変動するシグナル」とは 、上記検出ラベルとしての蛍光物質または蛍光蛋白質より発せられる蛍光、あるいは 放射性同位元素からの放射線などが挙げられる。また、上記検出ラベルとしての酵 素と発色基質との反応による発色も挙げられる。上記酵素、蛍光物質、蛍光蛋白質、 発光物質、放射性同位元素および発色基質は、市販のものを使用することができる
[0033] 「配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択されるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を発現する細胞」とは、本発明に係る 蛋白質を発現する細胞であればよいが、好ましくは、本発明に係る蛋白質を発現す る発現ベクターによって、一過的ないし定常的に形質転換された細胞である。そのよ うな発現ベクターとしては、一般に市販されているものを用いることができる。また、形 質転換される細胞として、サル COS— 1細胞、 COS— 7細胞、チャイニーズハムスタ 一 CHO細胞、ヒト HEK293T細胞、 U937細胞、 Jurkat細胞、 Hela細胞、 Daudi細 胞、 K562細胞、マウス L細胞などが挙げられる。
[0034] 「リガンドを発現する細胞」とは、リガンドを発現する細胞であれば!/、ずれの細胞で あってもよいが、好ましくは、リガンドを発現する発現ベクターによって、一過的ないし 定常的に形質転換された細胞である。そのような発現ベクターとしては、一般に市販 されているものを用いることができ、形質転換される細胞としては、前記した細胞が挙 げられる。
「配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択されるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を発現する細胞とリガンドを発現する細 胞もしくはリガンドの接触によって変動するシグナル」としては、例えば、それら細胞の 細胞内 cAMP濃度、細胞内 Ca2+濃度、 IP濃度、細胞内シグナル伝達分子 (例えば
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、 Erk2など）のリン酸ィ匕あるいは脱リン酸化、本発明に係る蛋白質へのホスファタ一 ゼの結合、産生サイト力イン (例えば、インターロイキン 2 (IL— 2)など）量などに対応 するシグナル (例えば、発色、蛍光、発光、放射線など)などが挙げられる。
[0035] 本発明のスクリーニング方法として、具体的には、以下の方法により行うことができる 。すなわち、本発明に係る蛋白質と共発現する活性化受容体 (例えば、 BCR)に対 する抗体、本発明に係る蛋白質に対する抗体または本発明に係る蛋白質のリガンド をァガロースビーズなどの担体あるいは培養プレートに一緒に固定する。本発明に 係る蛋白質を発現している細胞 (BIR1強制発現細胞、 BCRと BIR1が共発現してい る B細胞株、 B細胞、単球、末梢血単核球など）を上記固定化担体あるいはプレート に添加して刺激する際に、被験化合物 (低分子化合物、ペプチド、可溶化蛋白質、 抗体など)を同時に添加する。一定時間培養後、培養上清中に分泌されるインター口 ィキン 2 (IL— 2)量、細胞内 Ca2+濃度、本発明に係る蛋白質の細胞内チロシン残基 のリン酸化、本発明に係る蛋白質へのホスファターゼの結合、または Erk2などの細 胞内シグナル伝達分子のリン酸ィ匕を指標に、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストを スクリーニングすることができる。
[0036] また、本発明に係る蛋白質の ITIM様ドメインの領域を含むリン酸ィ匕ペプチドをピオ チンィ匕し、抗ビォチン抗体を固定したァガロースビーズなどの担体あるいは培養プレ ートに結合させ、被験化合物 (例えば、低分子化合物、ペプチド、可溶化蛋白質、抗 体など）と A20IIA1. 6細胞の溶解液を添加し、一定時間保温する。 SHP— 1、 SHP 2、 SHIP— 1または SHIP— 2に対する一次抗体を反応させた後、二次抗体を用 V、てリン酸ィ匕ペプチドに結合したホスファタ一ゼ量を測定する。結合ホスファターゼ量 を減少させる化合物を、本発明に係る蛋白質のアンタゴ-ストとしてスクリーニングす ることがでさる。
[0037] 本発明に係る蛋白質の発現量を減少または増加させる化合物をスクリーニングする 方法として、例えば、以下の方法により行うことができる。すなわち、細胞 (例えば、 BI R1強制発現細胞、ヒト単球細胞株 THP— 1細胞、 U937細胞、ヒト末梢血から単離し た CD14陽性細胞 (単球)、 CD19陽性細胞 (B細胞)など）を培養プレートに撒き、炎 症刺激剤（例えば、リポポリサッカライド (LPS)、フオルボールミリステートアセテート（ PMA)、インターフェロンガンマ (iFN-r)、 TNF— aなど）の存在下あるいは非存 在下で被験化合物 (例えば、低分子化合物、ペプチド、可溶化蛋白質、抗体など)と 共に一定時間培養する。細胞から RNAを抽出し、本発明に係る蛋白質に特異的な プライマーを用いて定量的 RT— PCRにより RNAレベルでの発現量を測定する。あ るいは、培養後の細胞に抗ヒト BIR1モノクローナル抗体を添カ卩し、次に FITC標識し た二次抗体を添加し、細胞表面に発現している BIR1をフローサイトメーターにより定 量する。あるいは、培養後に細胞溶解液を調製し、本発明に係る蛋白質に対する抗 体を用いてウェスタンブロッテイングにより蛋白質レベルでの発現量を測定する。
[0038] さらに、以下の方法によっても行うことができる。具体的には、 BIR1遺伝子の発現 制御領域（例えば、プロモーター、ェンハンサー、 CAATボックス、 TATAボックスな ど）、 5'非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域を含む DNAとレポーター遺伝子 (例え ば、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ（CAT) 遺伝子、 j8—ガラクトシダーゼ遺伝子など）を連結した組み換えベクターを作製し、適 当な細胞に導入する。被験化合物の存在下および非存在下で、 BIR1遺伝子が転 写される環境のもとで該細胞を培養し、該レポーター遺伝子の発現量を測定すること によって被験化合物の転写促進活性または転写抑制活性を確認する。 BIR1遺伝子 の発現制御領域、 5 '非翻訳領域および翻訳開始部位近傍領域は公知の方法により 取得可能である。
[0039] [本発明の蛋白質]
本発明明細書において、「配列番号 3〜6で表わされるアミノ酸配列から選択される 一つのアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質もしく はその部分ペプチド」における「実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質」とは、 配列番号 3〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択される一つのアミノ酸配列を有する 蛋白質の機能と同じ機能を有する蛋白質であって、その配列番号 3〜6から選択され るアミノ酸配列中の一部のアミノ酸 (好ましくは 1〜 5個、より好ましくは 1〜 2個）が欠 失したもの、その一部のアミノ酸 (好ましくは 1〜5個、より好ましくは 1〜2個）が他のァ ミノ酸と置換したもの、そのアミノ酸配列に数個のアミノ酸 (好ましくは 1〜5個、より好 ましくは 1〜2個）が付加または挿入されたもの、およびそれらを組み合わせたァミノ 酸配列を有するものも含まれる。ここで、上記アミノ酸の欠失、置換または付加あるい は挿入の位置は特に限定されない。以下、「配列番号 3〜6で表わされるアミノ酸配 列から選択される一つのアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 有する蛋白質」を「本発明の蛋白質」と呼ぶこともある。
[0040] さらに、本発明の蛋白質には、少なくとも 20個以上、好ましくは 50個以上、より好ま しくは 100個以上、さらに好ましくは全領域において、配列番号 3〜6から選択される アミノ酸配列と約 70%以上、好ましくは約 80%以上、さらに好ましくは約 90%以上、 特に好ましくは約 95%以上、最も好ましくは約 98%以上の相同性を有するアミノ酸 配列が含まれる。
[0041] 本発明明細書における蛋白質は、ペプチド標記の慣例に従って左端力 末端 (ァ ミノ末端)、右端が C末端 (カルボキシル末端)である
本発明の蛋白質には、 C末端がカルボキシル基、カルボキシレート、アミドまたはェ ステル（一COOR)のいずれであってもよい。ここで、エステルにおける Rとしては、例 えば、 Cl〜6アルキル基（例えば、メチル、ェチル、 n—プロピル、イソプロピル、 n- ブチルなど）、 C3〜8シクロアルキル基（例えば、シクロペンチル、シクロへキシルなど )、 C6〜12ァリール基（例えば、フエ-ル、 a ナフチルなど）、フエ-ルー Cl〜2ァ ルキル基（例えば、ベンジル、フエネチルなど）、 a ナフチルー Cl〜2アルキル基（ 例えば、 α ナフチルメチルなど）、 C7〜 14ァラルキル基、ビバロイルォキシメチル 基などが用いられる。
[0042] 本発明の蛋白質が C末端以外にカルボキシル基を有して ヽる場合、カルボキシル 基がアミドィ匕またはエステルイ匕されているものも本発明の蛋白質に含まれる。この場 合のエステルとしては、例えば、上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の蛋白質には、 N末端のアミノ酸残基 (例えば、メチォニン残基など )のァミノ基が保護基 (例えば、 Cl〜6ァシル基 (例えば、ホルミル基、ァセチル基な ど)など)で保護されて ヽるもの、生体内で切断されて生成する N末端のグルタミン残 基がピログルタミン酸ィ匕したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 (例えば、—O H、— SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グァ -ジノ基など）が適当な保護 基 (例えば、 Cl〜6ァシル基 (例えば、ホルミル基、ァセチル基など)など)で保護され ているもの、あるいは糖鎖が結合した糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
[0043] 本発明の蛋白質として好ましくは、配列番号 3で表わされるアミノ酸配列を有する蛋 白質、配列番号 4で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号 5で表わされ るアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号 6で表わされるアミノ酸配列を有する 蛋白質であり、より好ましくは配列番号 3で表わされるアミノ酸配列力 なる蛋白質、 配列番号 4で表わされるアミノ酸配列力 なる蛋白質、配列番号 5で表わされるァミノ 酸配列からなる蛋白質、または配列番号 6で表わされるアミノ酸配列力 なる蛋白質 である。
[0044] 本発明明細書において、「配列番号 3〜6で表わされるアミノ酸配列から選択される アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその 部分ペプチド」における「部分ペプチド」（以下、本発明の部分ペプチドと呼ぶこともあ る。）としては、例えば、本発明の蛋白質の細胞外領域中の任意の領域 (例えば、配 列番号 3で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜132の領域から任意に選択される 領域、配列番号 4で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜137の領域力も任意に選 択される領域、配列番号 5で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜42の領域から任 意に選択される領域または配列番号 6で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜132 の領域から任意に選択される領域を含むポリペプチド)および、本発明の蛋白質の 細胞内領域中の任意の領域 (例えば、配列番号 3で表わされるアミノ酸配列のァミノ 酸 156〜248の領域力も任意に選択される領域、配列番号 4で表わされるアミノ酸配 列のアミノ酸 161〜253の領域から任意に選択される領域、配列番号 4で表わされる アミノ酸配列のアミノ酸 66〜158の領域から任意に選択される領域または配列番号 6 で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 156〜 176の領域から任意に選択される領域な ど)などが挙げられる。ここで、「任意に選択される領域」とは、例えば、本発明の蛋白 質のアミノ酸配列のうち少なくとも 10個以上、好ましくは 20個以上、より好ましくは 50 個以上、最も好ましくは 100個以上のアミノ酸配列を有する領域などが挙げられる。
[0045] また、本発明の部分ペプチドには、そのアミノ酸配列中の一部のアミノ酸 (好ましく は 1〜5個、より好ましくは 1〜2個）が欠失したもの、その一部のアミノ酸 (好ましくは 1 〜5個、より好ましくは 1〜2個）が他のアミノ酸と置換したもの、そのアミノ酸配列に数 個のアミノ酸 (好ましくは 1〜5個、より好ましくは 1〜2個）が付加または挿入されたも の、およびそれらを組み合わせたアミノ酸配列を有するものも含まれる。上記のように アミノ酸配列が欠失、置換、付加または挿入されている場合、その位置は特に限定さ れない。
本発明の部分ペプチドは、 C末端がカルボキシル基、カルボキシレート、アミドまた はエステル（一COOR)のいずれであってもよい。ここで、エステルにおける Rとしては 、本発明の蛋白質について前記したと同様のものが挙げられる。本発明の部分ぺプ チドカ 末端以外にカルボキシル基を有して 、る場合、カルボキシル基がアミドィ匕ま たはエステルイ匕されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエス テルとしては、例えば、上記した C末端のエステルなどが用いられる。
[0046] 本発明の部分ペプチドには、上記した本発明の蛋白質と同様に、 N末端のメチォ ニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生 成した Ginがピログルタミン酸ィ匕したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適 当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合した糖蛋白質などの複合蛋 白質なども含まれる。
[0047] 本発明の蛋白質またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学 的に許容される塩が挙げられ、酸付加塩として、例えば、無機酸 (例えば、塩酸、リン 酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸 (例えば、酢酸、ギ酸、プロピオ ン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クェン酸、リンゴ酸、シユウ酸、安息 香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられ、塩基付カロ 塩として、例えば、水酸ィ匕アンモニゥム、アルカリまたはアルカリ土類金属水酸ィ匕物（ 例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸ィ匕カリウム、水酸ィ匕カルシウム、水酸 化マグネシウムおよび水酸ィ匕マンガン）との塩が用いられる。とりわけ生理学的に許 容される酸付加塩が好まし ヽ。
[0048] 本発明の蛋白質の部分ペプチドは、本発明に係る蛋白質へのリガンド結合を阻害 する物質として、癌、免疫不全症もしくは感染症の予防および Zまたは治療薬あるい は診断用および Zまたは検査用試薬として有用である。さらに、本発明に係る蛋白 質のアンタゴ-ストあるいはァゴ-ストのスクリーニングに用いることができる。また、本 発明の蛋白質またはその部分ペプチドは抗原として用いることにより、本発明の蛋白 質または部分ペプチドに対する抗体の作製にも使用できる。
[0049] [本発明のポリヌクレオチド]
本発明明細書において、「配列番号 3〜6で表わされるアミノ酸配列から選択される 一つのアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質また はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド」としては、本発明の蛋白質または 部分ペプチドをコードする塩基配列を有するものであればいかなるものであってもよ い。一つのアミノ酸をコードするコドンは 1〜6種類知られており、例えば、 Pheには T TTまたは TTC、 Leuには TTA、 TTG、 CTT、 CTC、 CTAまたは CTG、 lieには AT T、 ATCまたは ATA、 Metには ATG、 Valには GTT、 GTC、 GTAまたは GTG、 Se rには TCT、 TCC、 TCAまたは TCG、 Proには CCT、 CCC、 CCAまたは CCG、 Th rには ACT、 ACC、 ACAまたは ACG、 Alaには GCT、 GCC、 GCAまたは GCG、 T yrには TATまたは TAC、 Hisには CATまたは C AC、 Ginには CAAまたは CAG、 A snには AATまたは AAC、 Lysには AAAまたは AAG、 Aspには GATまたは GAC、 Gluには GAAまたは GAG、 Cys〖こは TGTまたは TGC、 Trpには TGG、 Argには C GT、 CGC、 CGAまたは CGG、 Serには AGTまたは AGC、 Argには AGAまたは A GG、および Glyには GGT、 GGC、 GGAまたは GGGがそれぞれ対応しているので、 本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドには、各ァミノ 酸に対応する各コドンが任意に組み合わされたポリヌクレオチドが含まれる。以下、 配列番号 3〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択される一つのアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドをコード するポリヌクレオチドを「本発明のポリヌクレオチド」と呼ぶこともある。
本発明のポリヌクレオチドは、ゲノム DNA、 cDNA、合成 DNA、 RNA、 DNA— R NAノヽイブリツドの 、ずれでもよ!/ヽ。
本発明明細書において、本発明のポリヌクレオチドには、配列番号 9〜12で表わさ れる塩基配列から選択される一つの塩基配列を有する DNA以外に、該 DNAの相 補鎖 DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、本発明 の蛋白質と実質的に同じ性質を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドも含まれ る。ハイブリダィゼーシヨンは、公知の方法（Molecular Cloning (SambrookJ., Fritsch, E.F., Maniatis.T., Cold Spring Harbor Laboratory Press) (1989)、 Gene 10: 63 (1980 )など）に従って行うことができる。ノ、イブリダィゼーシヨン条件は温度、イオン強度、プ ライマー長などを適宜選択することによって決定できるが、通常、温度が高いほど、ま たイオン強度が低いほどストリンジエンシーが高まる。高ストリンジェントな条件として は、例えば、 0. 5M NaHPO , 7%SDS, ImM EDTAを含む緩衝液による 65°C でのハイブリダィゼーシヨン、および 0. 1XSSC, 0. 1%SDSを含む緩衝液による 65 °Cでの洗浄処理を挙げることができる。
[0051] そのようなポリヌクレオチドとしては、少なくとも 20塩基、好ましくは 50塩基、より好ま しくは 100塩基、さらに好ましくは全領域において、配列番号 9〜 12で表わされる塩 基配列から選択される一つの塩基配列を有する DNAと、 90%以上、好ましくは 95 %以上、より好ましくは 98%以上の相同性を有する塩基配列を有する DNAなどが挙 げられる。
[0052] 本発明のポリヌクレオチドのうち、配列番号 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードす るポリヌクレオチドとして好ましくは、配列番号 9で表わされる塩基配列を有する DNA またはその部分配列を有する DNAであり、より好ましくは、配列番号 9で表わされる 塩基配列を有する DNAであり、さらに好ましくは配列番号 9で表わされる塩基配列か らなる DNAである。
[0053] 本発明のポリヌクレオチドのうち、配列番号 4で表わされるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードす るポリヌクレオチドとして好ましくは、配列番号 10で表わされる塩基配列を有する DN Aまたはその部分配列を有する DNAであり、より好ましくは、配列番号 10で表わされ る塩基配列を有する DNAであり、さらに好ましくは配列番号 10で表わされる塩基配 列からなる DNAである。
[0054] 本発明のポリヌクレオチドのうち、配列番号 5で表わされるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードす るポリヌクレオチドとして好ましくは、配列番号 11で表わされる塩基配列を有する DN Aまたはその部分配列を有する DNAであり、より好ましくは、配列番号 11で表わされ る塩基配列を有する DNAであり、さらに好ましくは配列番号 11で表わされる塩基配 列からなる DNAである。
[0055] 本発明のポリヌクレオチドのうち、配列番号 6で表わされるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードす るポリヌクレオチドとして好ましくは、配列番号 12で表わされる塩基配列を有する DN Aまたはその部分配列を有する DNAであり、より好ましくは、配列番号 12で表わされ る塩基配列を有する DNAであり、さらに好ましくは配列番号 12で表わされる塩基配 列からなる DNAである。
[0056] 本発明のポリヌクレオチドは、本発明の蛋白質またはその部分ペプチドを生産する ための铸型として使用することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のスクリーニングにも使用できる。
本発明のポリヌクレオチドは、公知の方法に従って、トランスジエニック動物、ノックァ ゥト動物または本発明の蛋白質もしくは本発明に係る蛋白質の発現が低下した動物 を作製するために使用することができる。
[0057] 本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオ チドは、例えば、プライマーあるいはプローブとして使用することにより、本発明の蛋 白質の mRNAを検出することができるので、免疫不全症、癌もしくは感染症あるいは 自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患もしくは炎症性疾患の 診断用および Zまたは検査用のプライマーあるいはプローブとして用いることができ る。このようなプライマーあるいはプローブは、それらを公知の方法に従い、酵素、蛍 光物質、発光物質あるいは放射性同位元素などで標識することができる。
[0058] 本発明のポリヌクレオチドあるいは本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列ま たはその一部を有するポリヌクレオチドを生体内の細胞に導入し、癌、免疫不全症も しくは感染症あるいは自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患も しくは炎症性疾患を予防および Zまたは治療するための遺伝子治療にも使用できる
[0059] 本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオ チドには、いわゆる、アンチセンス DNA、 siRNA(small interfering RNA)、リボザィム などが含まれる。
本発明のポリヌクレオチドに対するアンチセンス DNAは、本発明のポリヌクレオチド の一部（好ましくは DNA)を上記のようなベクターのアンチセンス領域に挿入すること により製造することができる。
[0060] 本発明のポリヌクレオチドに対する siRNAは、本発明の蛋白質をコードする RNA の一部とそれに相補的な RNAを含有する二重鎖 RNAである。 siRNAは、公知の方 法 (Nature 411: 494-498 (2001》に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設 計して製造することができる。
[0061] リボザィムは、公知の方法 (TRENDS in Molecular Medicine 7: 221 (2001》に準じて 、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本 発明の蛋白質をコードする RNAの一部に公知のリボザィムを連結することによって 製造することができる。本発明の蛋白質をコードする RNAの一部としては、公知のリ ボザィムによって切断され得る部位に近接した部分 (RNA断片）が挙げられる。この ようなアンチセンス DNA、 siRNAあるいはリボザィムは、細胞中の本発明の蛋白質 のレベルを下げることができるので、癌、免疫不全症もしくは感染症の予防および Z または治療薬として有用である。
[0062] 本発明のポリヌクレオチドあるいは本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列ま たはその一部を有するポリヌクレオチドを、癌、免疫不全症もしくは感染症あるいは自 己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患もしくは炎症性疾患の予 防および Zまたは治療薬として使用する場合は、そのポリヌクレオチドを単独ある ヽ はレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した 後、定法に従って、ヒトゃ哺乳動物に投与することができる。そのようなポリヌクレオチ ドは、そのままであるいは細胞への導入を促進するための補助剤（例えば、リポソ一 ム、 HVJリボソームなど)などの担体とともに製剤化して用いることができる。
[0063] 本発明明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、当該分野に おける慣用略号に基づくものであり、例えば、 DNA (デォキシリボ核酸）、 cDNA (相 補的デォキシリボ核酸）、 RNA (リボ核酸）、 A (アデニン）、 T (チミン）、 G (グァニン）、 C (シトシン）、 Gly (グリシン）、 Ala (ァラニン）、 Val (パリン）、 Leu (ロイシン）、 lie (イソ ロイシン）、 Ser (セリン）、 Thr (スレオニン）、 Cys (システィン）、 Met (メチォニン）、 G1 u (グルタミン酸）、 Asp (ァスパラギン酸）、 Lys (リジン）、 Arg (アルギニン）、 His (ヒス チジン）、 Phe (フエ-ルァラニン）、 Tyr (チロシン）、 Trp (トリプトファン）、 Pro (プロリ ン）、 Asn (ァスパラギン）、 Gin (グルタミン)などが挙げられる。また、アミノ酸に関し光 学異性体があり得る場合は、特に明示しなければ L体を示すものとする。 [0064] [本発明の蛋白質に対する抗体]
本発明明細書において、配列番号 3〜6で表わされるアミノ酸配列から選択されるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部 分ペプチドに対する抗体 (以下、本発明の抗体と呼ぶことがある。）とは、本発明の蛋 白質またはその部分ペプチドを認識する抗体であれば、ヒト由来抗体、マウス由来抗 体、ラット由来抗体、ニヮトリ由来抗体、ゥサギ由来抗体またはャギ由来抗体のいず れの抗体でもよぐさらにそれらのポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、完全型 もしくは短縮型 (例えば、 F(ab')
2、 Fab'、 Fabおよび Fv断片など)抗体、キメラ化抗体、 ヒトイ匕抗体または完全ヒト型抗体のいずれのものでもよい。そのような抗体は、本発明 の蛋白質の細胞外領域の部分ペプチドを抗原として、公知の抗体または抗血清の製 造法に従って製造することができる。細胞外領域の部分ペプチドは、公知のタンパク 質発現ならびに精製法によって調製することができる。
[0065] 本発明の抗体として好ましくはモノクローナル抗体であり、より好ましくはモノクロ一 ナル抗体の短縮型抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体および完全ヒト型抗体であり、さら に好ましくはモノクローナル抗体の完全ヒト型抗体である。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチドに対する抗体は、本発明の蛋白質を検 出することができるので、免疫不全症、癌もしくは感染症あるいは自己免疫疾患、臓 器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患もしくは炎症性疾患の診断用および Zまた は検査用試薬として用いることができる。
[0066] [蛋白質またはポリペプチドの製造および精製方法]
本発明に係る蛋白質のアンタゴニストとして挙げられる当該蛋白質の細胞外領域中 の任意の領域を含む蛋白質もしくはポリペプチド、本発明のスクリーニング方法にお いて使用される本発明に係る蛋白質の細胞外領域を含む蛋白質またはポリペプチド もしくはその細胞内領域を含む蛋白質またはポリペプチドならびに本発明の蛋白質 もしくはその部分ペプチドは、公知のタンパク質発現法および精製法あるいは実施 例に記載の方法によって製造することができる。例えば、
(1)生体または培養細胞から精製単離する方法、
(2)ペプチドを合成する方法、および (3)遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法などが挙げられる。
[0067] 工業的には（3)に記載した方法が好ま 、が、そのための一般的な技術として、例 ば Molecularし loning (SambrookJ., Fritsch'E.F., Maniatis.T., Cold bpnng Harbor Laboratory Press) (1989)、 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel.F.M., Jo hn Wiley & Sonsjnc. (1989))に記載されるような標準技術を使用できる。
[0068] 遺伝子組み換え技術を用いて蛋白質またはペプチドを生産するための発現系（宿 主 ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発 現系が挙げられる。
例えば、大腸菌で発現させる場合には、成熟蛋白部分をコードする DNAの 5 '末端 に開始コドン (ATG)を付加し、得られた cDNAを、適当なプロモーター（例えば、 trp プロモーター、 lacプロモーター、 λ PLプロモーター、 T7プロモーターなど）の下流 に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、 pBR322、 pUC18、 pUC19など )に挿入して発現ベクターを作製する。次に、この発現ベクターで形質転換した大腸 菌（例えば、 E. Coli DH1、E. Coli JM109、 E. Coli HB101株など）を適当な 培地で培養して、その菌体より目的とする蛋白質またはペプチドを得ることができる。 また、バクテリアのシグナルペプチド（例えば、 pelBのシグナルペプチドなど）を利用 すれば、ペリブラズム中に目的とする蛋白質またはペプチドを分泌することもできる。 さらに、他のポリペプチドとの融合蛋白質を生産することもできる。
[0069] また、酵母で発現させる場合には、本発明の蛋白質または部分ペプチドをコードす る DNAを適当なプロモーター（例えば、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 G APプロモーター、 ADHプロモーターなど）の下流に接続し、酵母で機能するべクタ 一（例えば、 PSH19、 pSH15など）に挿入して発現ベクターを作製する。次に、この 発現ベクターで形質転換した酵母（例えば、サッカロミセス'セレピシェ AH22、 AH2 2R―、 20B— 12、シゾサッカロミセス 'ボンべ NCYC1913、ピッキァ 'パストリス KM7 1など）を適当な培地で培養して、 目的とする蛋白質またはペプチドを得ることができ る。
[0070] また、昆虫細胞で発現させる場合には、本発明の蛋白質または部分ペプチドをコ ードする DNAを適当なプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター、 P10プロモ 一ターなど）の下流に接続し、昆虫細胞で機能するウィルスベクターに挿入して発現 ベクターを作製する。昆虫細胞としては、例えば、ウィルスが AcNPVの場合は、夜盗 蛾の幼虫由来株化細胞（Sf細胞）が用いられる。ウィルスが BmNPVの場合は、蚕由 来株化細胞 (BmN細胞)などが用いられる。 Sf細胞としては、例えば、 Sf9細胞 (ATC C CRL1711), Sf 21細胞 (In Vivo 13: 213-217 (1977》が用いられる。昆虫としては、 カイコの幼虫などが用いられる。昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、 Bio/Technology 6: 47-55 (1988)に記載の方法に従って行うことができる。
[0071] また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、本発明の蛋白質または部分ペプチド をコードする DNAを適当なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、パピローマウイ ノレスベクター、ワクシニアウイノレスベタター、 SV40系ベクターなど）中の適当なプロモ 一ター（例えば、 SV40プロモーター、 LTRプロモーター、メタ口チォネインプロモー ターなど）の下流に挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベクター で適当な哺乳動物細胞（例えば、ヒト HEK293T細胞、サル COS— 1細胞、 COS— 7細胞、チャイニーズノ、ムスター CHO細胞、マウス L細胞、 NS0細胞など）を形質転 換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、本発明の蛋白質または部 分ペプチドが発現される。さらに、その他のポリペプチド、例えば、抗体の定常領域（ Fc部分)をコードする cDNA断片と連結することによって、融合蛋白質を生産するこ とちでさる。
[0072] また、遺伝子組み換え技術を用いて蛋白質またはペプチドを生産する方法として、 無細胞合成系 (Sambrook J. , Molecular Cloning 2ed. (1989》も利用可能である。 ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。本 発明の蛋白質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生 成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造 することができる。ここで、縮合や保護基の脱離は、公知の方法、例えば、
) M. Bodanszky, M.A. Ondetti, Peptide synthesis, Interscience Publishers, New Y ork (1966)、
u) Schroeder, Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)、
(iii)泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善 (株)（1975)、 (iv)矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、蛋白質の化学 IV, 205, (1977)
(V)矢島治明監修、続医薬品の開発、第 14卷，ペプチド合成，広川書店に記載され た方法に従って行われる。
[0073] 以上のようにして得られた蛋白質または部分ペプチドは、一般的な生化学的方法、 例えば、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ァフィ-ティ 一クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、クロマトフォー カシング、等電点沈殿、ゲル濾過、限外濾過などによって単離精製することができる また、本発明の蛋白質または部分ペプチドを他の蛋白質あるいはタグ (抗体の定常 領域、グルタチオン Sトランスフェラーゼ、プロテイン A、 FLAGタグ、へキサヒスチジン タグなど）との融合蛋白質として発現させることも可能である。融合蛋白質は、ァフィ二 ティークロマトグラフィーによる精製および Zあるいは適当なプロテアーゼ (例えば。 ェンテロカイネース、トロンビンなど）による切り出しが可能であり、効率よく精製できる 禾 IJ点がある。
[0074] [ポリヌクレオチドの取得または製造方法]
本発明に係る蛋白質をコードするポリヌクレオチドおよび本発明の蛋白質または部 分ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の取得な!/、し製造方法および精製 法あるいは実施例に記載の方法によって取得な 、し製造することができる。例えば、 化学合成によって、または本発明の蛋白質または部分ペプチドの一部をコードする 合成 DNAプライマーを用いて PCR法により増幅することによって、あるいは本発明 の蛋白質または部分ペプチドの一部をコードする合成 DNAをプローブとしたハイブ リダィゼーシヨン法によって得ることができる。
[0075] 本発明の蛋白質または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを PCR法ある 、 はハイブリダィゼーシヨン法によって取得するために使用するヒト組織ある 、は細胞と しては、脾臓、リンパ節、骨髄、白血球、単球、 B細胞などが挙げられる。標準的な遺 伝子組み換え技術により上記組織あるいは細胞力 mRNAを取り出し cDNAライブ ラリーを作製する。配列番号 7〜12で表わされる塩基配列から選択される一つの塩 基配列に基づき合成した特異的プローブを用いて該ライブラリーをスクリーニングし 目的の cDNAを得ることができる。あるいは、配列番号 7〜 12で表わされる塩基配列 から選択される塩基配列に基づいて、 目的とする塩基配列を増幅するためのセンス およびアンチセンスプライマーを合成し、該 cDNAライブラリーを铸型にして PCRを 行 、、 目的の cDNAを増幅することができる。 PCRは自動サーマルサイクラ一を用い て実施するのがよぐその反応は、耐熱性ポリメラーゼ (例えば、 Taqなど）、铸型 DN Aおよびプライマーの存在下、 DNAの変性（例えば、 98°C, 10〜30秒）、プライマ 一のアニーリング（例えば、 56°C, 30秒〜 1分）、および 4種類の基質（dNTP)の共 存下での伸長反応（例えば、 72°C, 30秒〜 10分）を 1サイクルとして約 25〜40サイ クル実施し、さらに 70〜75°Cで 5〜15分加熱することによって行うことができる。また 、最近では、ヒトの種々の組織の cDNAライブラリーが市販されており、これらを使用 する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。ハイブリダィ ゼーシヨンの方法は、例えば、 Molecular Cloning (SambrookJ., Fritsch.E.F., Maniati s,T.， Cold Spring Harbor Laboratory Press) (1989)または Gene 10: 63 (1980)に記載 の方法に従って行うことができる。このようにして得られた DNAは、該 DNAを含有す るベクター DNAを適当な宿主に導入し、これを増殖させること〖こよって、必要量得る ことができる。
[0076] [抗体の取得または製造方法]
本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質もしくはポリぺプ チドに対する抗体または本発明の蛋白質またはその部分ペプチドに対する抗体は、 本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質もしくはポリぺプ チドまたは本発明の蛋白質もしくはその部分ペプチドのそれぞれを認識し得る抗体 であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよいが、特に 哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好まし 、。哺乳動物由来のモノクローナル抗 体としては、ハイプリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗 体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるものがある。
[0077] 抗体産生ノ、イブリドーマは、公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すな わち、本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリ ペプチド、本発明の蛋白質の部分ペプチドまたは本発明に係る蛋白質あるいは本発 明の蛋白質を発現して ヽる細胞 (例えば、強制発現細胞など)を感作抗原として使用 して、これを通常の免疫方法に従って免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合 法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル 抗体産生細胞をクローニングする。感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限 定はされないが、細胞融合に使用する親細胞 (ミエローマ細胞）との適合性を考慮し て選択するのが好ましぐ一般的にはげつ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハム スターなどが使用される。感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法に従って行 われる。上記免疫細胞と融合されるミエローマ細胞としては、公知の種々の細胞株が 使用可能である。免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は公知の方法、例えば、ミル スタインらの方法 (Methods Enzymol. 73: 3-46 (1981》などに準じて行うことができる。 得られた融合細胞は、通常の選択培地、例えば、 HAT培地 (ヒポキサンチン、ァミノ プテリンおよびチミジンを含む培養液)で培養することにより選択される。この HAT培 地での培養は、 目的とするハイプリドーマ以外の細胞 (非融合細胞）が死滅するまで 、通常数日力ゝら数週間継続される。次に、通常の限界希釈法を実施し、本発明の蛋 白質に結合する抗体を産生しているノ、イブリドーマのスクリーニングおよびクローニン グが行われる。このようにして得られたノヽイブリドーマの培養上清を精製することによ つて抗体を取得することができる。精製は、一般的な生化学的方法、例えば塩析、ィ オン交換クロマトグラフィー、ァフィユティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせ ること〖こより行うことができる。
[0078] ポリクローナル抗体は、哺乳動物（例えば、ゥサギ、ャギ、ヒッジなど）に、本発明に 係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリペプチドあるいは 本発明の蛋白質または部分ペプチドを感作抗原として免疫し、抗血清を回収し、精 製する、通常の方法により製造することができる。精製は、一般的な生化学的方法、 例えば塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィユティークロマトグラフィーなどを適 宜組み合わせることにより行うことができる。
[0079] また、遺伝子工学的手法を用いても抗体を得ることができる。すなわち、本発明に 係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリペプチド、本発 明の蛋白質の部分ペプチド、または本発明に係る蛋白質あるいは本発明の蛋白質 を発現して 、る細胞 (例えば、強制発現細胞など)を感作抗原として免疫した動物の 脾細胞、リンパ球、あるいはモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ力 mRN Aを取得し、これを铸型として cDNAライブラリーを作製する。感作抗原と反応する抗 体を産生しているクローンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培養上清 力 一般的な生化学的方法、例えば塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ-テ ィークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより目的とする抗体を精製するこ とができる。抗体を医薬として用いるには、免疫原性の低いヒト化抗体あるいはヒト型 抗体が好ましい。ヒト化抗体は、上記モノクローナル抗体の超可変領域を用いて遺伝 子工学的手法により作製することができる (Method in Enzymology 203: 99-121(199》 。ヒト型抗体は、免疫系をヒトのものと入れ替えたマウス (Nat.Genet. 15: 146-156 (199 7》を免疫することにより取得できる。
[0080] 本発明に係る蛋白質に対するアンタゴニストであって、本発明に係る蛋白質の細胞 外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリペプチドに対する抗体は、以下の方 法により選別することができる。すなわち、本発明に係る蛋白質と共発現する活性ィ匕 受容体 (例えば、 BCRなど）に対する抗体または本発明に係る蛋白質のリガンドをァ ガロースビーズなどの担体あるいは培養プレートに一緒に固定する。本発明に係る 蛋白質を発現している細胞 (例えば、 B細胞、単球、強制発現細胞など)を上記固定 化担体あるいはプレートに添加して刺激する際に、被験抗体を同時に添加する。細 胞内 Ca2+濃度、本発明に係る蛋白質の細胞内チロシン残基のリン酸化、本発明に 係る蛋白質へのホスファターゼの結合、 Erk2などのシグナル伝達分子のリン酸化、 またはサイト力イン (例えば、 IL— 2など）産生量を指標に、細胞内シグナル伝達に対 する本発明に係る蛋白質の抑制を、減弱ないし阻害するかどうかを評価する。
[0081] 本発明に係る蛋白質に対するァゴニスト抗体は以下の方法により選別することがで きる。すなわち、被験抗体をァガロースビーズなどの担体あるいは培養プレートに一 緒に固定する。本発明の蛋白質を発現している細胞 (例えば、 B細胞、単球、強制発 現細胞など）を上記固定ィ匕担体あるいはプレートに添加し、細胞内 Ca2+濃度、本発 明の蛋白質の細胞内チロシン残基のリン酸化、本発明に係る蛋白質へのホスファタ ーゼの結合、 Erk2などのシグナル伝達分子のリン酸化、またはサイト力イン (例えば 、 IL 2など)産生量を指標に、細胞内シグナル伝達に対する本発明に係る蛋白質 の抑制を、保持ないし増強するかどうかを評価する。
[0082] [医薬品への適用]
本発明に係る蛋白質のアンタゴ-ストまたはそれを含んでなる医薬組成物は、免疫 賦活活性を有することから、癌、免疫不全症もしくは感染症の予防および Zまたは治 療に用いることができる。
[0083] 本発明に係る蛋白質のアンタゴ-ストまたはそれを含んでなる医薬組成物の投与 により、その予防および Zまたは治療が期待できる癌または腫瘍として、例えば、舌 癌、歯肉癌、悪性リンパ腫、悪性黒色腫 (メラノーマ）、上顎癌、鼻癌、鼻腔癌、喉頭 癌、咽頭癌、神経膠腫、髄膜腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、甲状乳頭腺癌、甲状腺 濾胞癌、甲状腺髄様癌、原発性肺癌、扁平上皮癌、腺癌、肺胞上皮癌、大細胞性 未分化癌、小細胞性未分化癌、カルチノイド、睾丸腫瘍、前立腺癌、乳癌 (例えば、 乳頭腺癌、面疱癌、粘液癌、髄様癌、小葉癌、硬癌肉腫、転移腫瘍)、乳房べーシジ ット病、乳房肉腫、骨腫瘍、甲状腺癌、胃癌、肝癌、急性骨髄性白血病、急性前髄 性白血病、急性骨髄性単球白血病、急性単球性白血病、急性リンパ性白血病、急 性未分化性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型 τ細胞白血 病、悪性リンパ腫 (例えば、リンパ肉腫、細網肉腫、ホジキン病など)、多発性骨髄腫、 原発性マクログロブリン血症、小児性白血病、食道癌、胃癌、胃 ·大腸平滑筋肉腫、 胃 ·腸悪性リンパ腫、脾，胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、原発性肝癌 (例えば、肝細 胞癌、胆管細胞癌など)、肝芽腫、子宮上皮内癌、子宮頸部扁平上皮癌、子宮腺癌 、子宮腺扁平上皮癌、子宮体部腺類癌、子宮肉腫、子宮癌肉腫、子宮破壊性奇胎 、子宮悪性絨毛上皮腫、子宮悪性黒色腫、卵巣癌、中胚葉性混合腫瘍、腎癌、腎 盂移行上皮癌、尿管移行上皮癌、膀胱乳頭癌、膀胱移行上皮癌、尿道扁平上皮癌 、尿道腺癌、ウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、滑液膜肉 腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、ユーイング肉腫、皮膚扁平上皮癌、皮膚基底細胞癌、皮 膚ボーエン病、皮膚ページ ット病、皮膚悪性黒色腫、悪性中皮癌、転移性腺癌、 転移性扁平上皮癌、転移性肉腫、中皮腫 (例えば、胸膜中皮腫、腹膜中皮腫、心膜 中皮腫など)などが挙げられる。
[0084] 本発明に係る蛋白質のアンタゴ-ストまたはそれを含んでなる医薬組成物の投与 により、その予防および Zまたは治療が期待できる免疫不全疾患としては、例えば、 ヒト免疫不全ウィルス感染症による後天性免疫不全症候群 (AIDS) (例えば、カンジ ダ食道炎、カリ-肺炎、トキソプラズマ症、結核、マイコバクテリゥム -アビゥム複合体 感染症、クリプトスポリジゥム症、タリプトコッカス髄膜炎、サイトメガロウィルス感染症あ るいは進行性多巣性白質脳症などの日和見感染症など）、重症疾患 (例えば、癌、 再生不良性貧血、白血病、骨髄線維症、腎不全、糖尿病、肝疾患もしくは脾疾患）に 伴う免疫不全および原発性免疫不全症候群などが挙げられる。
[0085] ウィルスは、感染宿主の免疫防御力 逃れるための 1つの方法として、免疫細胞の 共役抑制因子を利用していると考えられている (Journal Experimental Medicine 191, 11: 1987-1997 (2000))。ウィルス感染は、このようなウィルスのエスケープ機能に一部 起因しており、本発明に係る蛋白質のアンタゴ-ストまたはそれを含んでなる医薬組 成物の投与によって、免疫細胞のウィルスに対する免疫反応を高めることができると 考えられる。
[0086] 本発明に係る蛋白質のアンタゴ-ストまたはそれを含んでなる医薬組成物の投与 により、その予防および Zまたは治療が期待できる感染症としては、例えば、ヒト肝炎 ウィルス (例えば、 B型肝炎、 C型肝炎、 A型肝炎および E型肝炎）、ヒトレトロウイルス 、ヒト免疫不全ウィルス（例えば、 HIV1および HIV2)、ヒト T細胞白血病ウィルスまた はヒト Tリンパ向性ウィルス（例えば、 HTLV1および HTLV2)、単純へルぺスウィル ス 1型もしくは 2型、ェプスタイン'バーウィルス、サイトメガロウィルス、水痘一帯状疱 疹ウィルス、ヒトヘルぺスウィルス（例えば、ヒトヘルぺスウィルス 6など）、ポリオウィル ス、麻疹ウィルス、風疹ウィルス、 日本脳炎ウィルス、おたふくウィルス、インフルェン ザウィルス、風邪ウィルス（例えば、アデノウイルス、ェンテロウィルスおよびライノウィ ルスなど）、重症急性呼吸器症候群（SARS)を発症するウィルス、エボラウィルスお よび西ナイルウィルスの感染症などが挙げられる。
その他、例えば、病原性原生動物（例えば、トリパノソ一マ、マラリアおよびトキソプラ ズマ）、細菌（例えば、マイコバクテリゥム、サルモネラおよびリステリア）および真菌（ 例えば、カンジダ）による感染などに対しても有効であると考えられる。
[0087] 本発明に係る蛋白質のァゴニストは、免疫抑制活性を有することから、自己免疫疾 患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患および炎症性疾患から選択される疾 患の予防および Zまたは治療に用いることができる。
[0088] 本発明に係る蛋白質のァゴニストまたはそれを含んでなる医薬組成物の投与により 、その予防および Zまたは治療が期待できる自己免疫疾患として、例えば、関節炎、 自己免疫性肝炎、自己免疫性糸球体腎炎、自己免疫性膝島炎、自己免疫性精巣 炎、自己免疫性卵巣炎、潰瘍性大腸炎、シエーダレン症候群、クローン病、ベーチェ ット病、 Wegener肉芽腫症、過敏性血管炎、結節性動脈周囲炎、橋本病、粘液水腫 、バセドウ病、アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、突発性血小板減少症、悪性貧 血、重症筋無力症、脱髄疾患、大動脈炎症群、乾癬、天疱瘡、類天疱瘡、膠原病（ 例えば、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、汎発性強皮症、全身性進行性 硬化症、皮膚筋炎、結節性多発性動脈炎およびリウマチ熱など）、ギラン ·バレー症 候群、多腺性自己免疫症候群 II型、原発性胆汁性肝硬変、尋常性白斑および 1型 糖尿病などが挙げられる。さらに、ループス抗凝固因子が高値な疾患も挙げられる。 ここで、ループス抗凝固因子が高値な疾患としては、例えば、全身性エリテマトーデ ス、動脈血栓症 (例えば、脳梗塞など）、静脈血栓症、習慣性流産、血小板減少症お よび抗リン脂質抗体症候群などが挙げられる。
[0089] 本発明に係る蛋白質のァゴニストまたはそれを含んでなる医薬組成物の投与により 、その予防および Zまたは治療が期待できる臓器移植後の拒絶反応として、例えば 、腎移植、肝移植、心移植および Zまたは肺移植後の拒絶反応、骨髄移植における 拒絶反応および移植片対宿主病などが挙げられる。
本発明に係る蛋白質のァゴニストまたはそれを含んでなる医薬組成物の投与により 、その予防および Zまたは治療が期待できるアレルギー性疾患として、例えば、喘息 、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、蓴麻疹、アレルギー性鼻炎 (例えば、花粉症など） 、アレルギー性結膜炎 (例えば、花粉症など）、アレルギー性胃腸炎、ァナフイラキシ 一ショック、食物アレルギーなどが挙げられる。
[0090] 本発明に係る蛋白質のァゴニストまたはそれを含んでなる医薬組成物の投与により 、その予防および zまたは治療が期待できる炎症性疾患として、例えば、皮膚炎 (例 えば、接触性皮膚炎およびアトピー性皮膚炎など)、大腸炎 (例えば、潰瘍性大腸炎 およびクローン病など)、血管炎 (例えば、高安動脈炎、巨細胞動脈炎 (側頭動脈炎） 、結節性多発動脈炎、ゥ ゲナー肉芽腫症、チヤーグ 'ストラウス症候群 (アレルギー 性肉芽腫性血管炎）、アレルギー性皮膚血管炎、へノッホ 'シヱーンライン紫斑病、過 敏性血管炎、血管炎症候群、閉塞性血栓性血管炎 (バージャ一病)、結節性血管炎 など)、関節炎 (例えば、リウマチ関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、結核性 関節炎、化膿性関節炎、乾癬性関節炎、膝内症、特発性骨壊死症および骨関節炎 など）、肝炎 (例えば、ウィルス性肝炎および自己免疫性肝炎など）、腎炎 (例えば、 急性糸球体腎炎、慢性腎炎、急速進行性腎炎症候群、溶連菌感染後急性糸球体 腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、 Goodpasture症候群、メサンギゥム増殖性糸球体 腎炎 (IgA腎症)および間質性腎炎など)、胃炎 (例えば、急性感染性胃炎およびァ レルギ一性胃炎、慢性胃炎など)、膝炎、腸炎、喉頭炎、神経炎などが挙げられる。
[0091] 本発明に係る蛋白質のアンタゴ-ストあるいはァゴニストは、
(1)本発明の予防剤または治療剤の予防および Zまたは治療効果の補完および Z または増強、
(2)本発明の予防剤または治療剤の動態、吸収改善、投与量の低減および Zまた は
(3)本発明の予防剤または治療剤の副作用の軽減のために他の薬剤と組み合わせ て、併用剤として投与してもよい。
[0092] 本発明に係る蛋白質のアンタゴ-ストあるいはァゴ-ストと他の薬剤の併用剤は、 1 つの製剤中に両成分を配合した配合剤の形態で投与してもよぐまた別々の製剤に して投与する形態をとつてもよい。この別々の製剤にして投与する場合には、同時投 与および時間差による投与が含まれる。また、時間差による投与は、本発明に係る蛋 白質のアンタゴ-ストあるいはァゴニストを先に投与し、他の薬剤を後に投与してもよ いし、他の薬剤を先に投与し、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストあるいはァゴ- ストを後に投与してもよく、それぞれの投与方法は同じでも異なって 、てもよ 、。
[0093] 前記他の薬剤は、低分子化合物であってもよぐまた高分子の蛋白、ポリペプチド、 ポリヌクレオチド（DNA、 RNA、遺伝子）、アンチセンス、デコイ、抗体であるか、また はワクチンなどであってもよい。他の薬剤の投与量は、臨床上用いられている用量を 基準として適宜選択することができる。また、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストあ るいはァゴニストと他の薬剤の配合比は、投与対象の年齢、体重、投与方法、投与時 間、対象疾患もしくは症状またはそれらの組み合わせなどにより適宜選択することが できる。例えば、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストあるいはァゴ-スト 1質量部に 対し、他の薬剤を 0. 01〜： LOO質量部用いればよい。他の薬剤は任意の 2種以上を 適宜の割合で組み合わせて投与してもよい。また、本発明に係る蛋白質のアンタゴ 二ストあるいはァゴ-ストの予防および Zまたは治療効果を補完および Zまたは増強 する他の薬剤には、上記したメカニズムに基づいて、現在までに見出されているもの だけでなく今後見出されるものも含まれる。
[0094] 上記併用剤により、予防および Zまたは治療効果を奏する疾患は特に限定されず 、本発明に係る蛋白質のアンタゴ-ストあるいはァゴニストの予防および Zまたは治 療効果を補完および Zまたは増強する疾患であればよい。
[0095] 癌に対する化学療法および放射線療法は、リンパ球の増殖を激しく減少させるとい う副作用が不可避である。本発明に係る蛋白質のアンタゴニストまたはそれを含んで なる医薬組成物の投与は、減少したリンパ球細胞を刺激な ヽし増殖させる効果を示 すと共に、通常の化学療法に付随する激烈な副作用を最小限に抑制することができ る。また、放射線療法についても同様である。また、本発明に係る蛋白質のアンタゴ 二ストまたはそれを含んでなる医薬組成物との併用によって、化学療法剤の用量また は照射放射線量を通常使用される用量あるいは照射量力 減少させることができる。
[0096] 本発明に係る蛋白質のアンタゴニストは、既存の化学療法薬と併用あるいは合剤化 することができる。そのような化学療法薬として、例えば、アルキル化剤、ニトロソウレ ァ薬、代謝拮抗薬、抗癌性抗生物質、植物由来アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害 薬、ホルモン療法薬、ホルモン拮抗薬、ァロマターゼ阻害薬、 P糖蛋白阻害薬、白金 錯体誘導体、その他免疫療法薬およびその他の抗癌薬が挙げられる。さらに、癌治 療補助薬である白血球 (好中球)減少症治療薬、血小板減少症治療薬、制吐薬、癌 性疼痛治療薬と併用あるいは合剤化できる。 [0097] 本発明に係る蛋白質のアンタゴ-ストは、その他の免疫賦活物質と併用あるいは合 剤化することができる。そのような免疫賦活物質としては、例えば、各種サイト力イン や腫瘍抗原などが挙げられる。免疫反応を刺激するサイト力インとしては、例えば、 G M— CSFゝ M— CSFゝ G— CSF、インターフェロン一 a、 j8、 γ、 IL— 1、 IL— 2、 IL —3および IL— 12などが挙げられる。また、 B7リガンド誘導体、 CD3抗体、 CD28抗 体、 CTLA— 4抗体も免疫反応を高めることができる。
[0098] 癌抗原の投与も、癌細胞に対する免疫担当細胞の特異的免疫反応を高めることが でき、本発明に係る蛋白質のアンタゴ-ストとの併用によって、付カ卩的あるいは相乗 的な増強を与えることができる。癌抗原は、遺伝子が明らかなものについては精製タ ンパク質として、また不明なものについては、癌細胞自体の溶解物として調製するこ とができる。そのような癌抗原として、例えば、悪性黒色腫の MAGE— 1、 MAGE— 3由来の HLA—A1および HLA—A2拘束ペプチド、 MART— 1および gplOOが挙 げられる。また、乳癌や卵巣癌の HER2Zneuペプチドや腺癌の MUC— 1ペプチド 、さらに、転移性癌の NY— ESO— 1も挙げることができる。
[0099] 本発明に係る蛋白質のアンタゴ-ストは、抗ウィルス薬、抗生物質製剤、抗菌薬、 内臓真菌症治療薬と併用あるいは合剤化することができる。
抗ウィルス薬としては、例えば、抗 HIV薬、抗インフルエンザウイルス薬、抗ヘルべ スウィルス薬、インターフェロン αもしくは j8および各種免疫グロブリンが挙げられ る。
[0100] 本発明に係る蛋白質のアンタゴ-ストは、ウィルスもしくは病原体のワクチンと併用 あるいは共に製剤化することができる。そのようなワクチンとしては、例えば、ポリオワ クチン、麻疹ワクチン、 日本脳炎ワクチン、 BCGワクチン、 3種混合ワクチン、おたふく ワクチン、水痘ワクチン、インフルエンザワクチン、 A型肝炎ワクチン、 B型肝炎ヮクチ ンおよびコレラワクチンが挙げられる。ここで、抗 HIV薬として、例えば、逆転写酵素 阻害薬 (例えば、 AZT、 ddl、 3TCおよび d4Tなど）、プロテアーゼ阻害薬 (例えば、 メシル酸サキナビル、リトナビル、メシル酸ネルフィナビル、アンプレナビル、メシル酸 デラビルジン、サキナビルおよび口ピナビル Zリトナビルなど）、または CCR5受容体 拮抗薬が挙げられる。抗インフルエンザウイルス薬としては、例えば、インフルエンザ ワクチン、リン酸ォセルタミビル、ザナミビル水和物および塩酸アマンタジンなどが挙 げられる。
[0101] 本発明に係る蛋白質のァゴニストの自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、ァレ ルギー性疾患もしくは炎症性疾患の予防および Zまたは治療効果の補完および Z または増強のための他の薬剤としては、例えば、ステロイド薬、非ステロイド系抗炎症 薬、免疫抑制薬、抗アレルギー薬 (例えば、化学伝達物質遊離抑制薬、抗ヒスタミン 薬、トロンボキサン合成酵素阻害薬、トロンボキサン拮抗薬および Th2サイト力イン阻 害薬など）、ホスホジエステラーゼ阻害薬 (PDE4)およびメディエーター遊離抑制薬 などが挙げられる。
[0102] ステロイド薬のうち、外用薬としては、例えば、プロピオン酸クロべタゾール、酢酸ジ フロラゾン、フルオシノ -ド、フランカルボン酸モメタゾン、ジプロピオン酸べタメタゾン 、酪酸プロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ジフルプレドナート、プデソ- ド、吉草酸ジフルコルトロン、アムシノ -ド、ハルシノ -ド、デキサメタゾン、プロピオン 酸デキサメタゾン、吉草酸デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン 、酪酸ヒドロコルチゾン、酪酸プロピオン酸ヒドロコルチゾン、プロピオン酸デプロドン、 吉草酸酢酸プレドニゾロン、フルオシノロンァセトニド、プロピオン酸べクロメタゾン、ト リアムシノロンァセトニド、ピバル酸フルメタゾン、プロピオン酸アルクロメタゾン、酪酸 クロベタゾン、プレドニゾロン、プロピオン酸ぺクロメタゾンおよびフルドロキシコルチド などが挙げられる。
[0103] ステロイド薬のうち、内服薬あるいは注射剤としては、例えば、酢酸コルチゾン、ヒド 口コルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、 酢酸フルド口コルチゾン、プレド-ゾロン、酢酸プレド-ゾロン、コハク酸プレド -ゾロ ンナトリウム、ブチル酢酸プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロンナトリウム、酢酸ハロプ レドン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、コハク酸メチルプレドニゾロ ンナトリウム、トリアムシノロン、酢酸トリアムシノロン、トリァムシノロンァセトニド、デキサ メタゾン、酢酸デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、パルミチン酸デキサメ タゾン、酢酸パラメタゾンおよびべタメタゾンなどが挙げられ、吸入剤としては、例えば 、プロピオン酸べクロメタゾン、プロピオン酸フルチ力ゾン、ブデソ -ド、フル-ソリド、ト リアムシノロン、 ST-126P,シクレソニド、デキサメタゾンパロミチオネート、モメタゾンフ ランカルボネート、プラステロンスルホネート、デフラザコート、メチルプレド-ゾロンス レプタネートおよびメチルプレドニゾロンナトリウムスクシネートなどが挙げられる。
[0104] 非ステロイド抗炎症薬としては、例えば、アスピリン、ロキソニン、ジクロフエナク、セ レコキシブ、チアプロフェン酸、アルミノプロフェン、フルルビプロフェンアキセチル、 ザルトプロフェン、スプロフェン、ケトプロフェン、プラノプロフェン、フェンチアザク、ド ロキシカム、イブプロフェン、ァセクロフエナク、アンフエナク 'ナトリウム、テノキシカム、 ォキサプロジン、ピロキシカム、ェモルファゾン、トルフエナム酸、インドメタシンフアル ネシル、マレイン酸プログルメタシン、スリンダク、モフエゾラク、エトドラク、ロナゾラク' カルシウム、アンピロキシカム、メサラジン、デフラザコート、二メスリド、エトリコキシブ、 ケトロラック.トロメタモール、パレコキシブ、口ベンザリット'ニナトリウム、オーラノフィン 、ロキソプロフェン'ナトリウム、ブシラミン、ァクタリット、けい皮酸ピロキシカム、ナブメト ン、サラゾスルファピリジン、ロルノキシカム、メロキシカム、ジァセレイン、口フエコキシ ブおよびバルデコキシブなどが挙げられる。
[0105] 塩基性非ステロイド抗炎症薬としては、例えば、塩酸チアラミド、塩酸チノリジン、ェ ピリゾール、ェモルファゾンなどが挙げられる。
免疫抑制薬としては、例えば、ァザチォプリン、ァスコマイシン、エベロリムス、オル ソクローン OKT3、コルチコステロイド、サラゾスルファピリジン、シクロスポリン、シクロ フォスフアミド、シロリムス、タク口リムス水和物、デォキシスパーガリン、ブシラミン、プ レドニゾロン、ミコフエノール酸モフエチル、ミゾリビン、メチルプレドニゾロン、メトトレキ サート、レフルノミドおよび抗ヒトリンパ球グロブリンなどが挙げられる。
[0106] 抗アレルギー薬のうち、化学伝達物質遊離抑制薬としては、例えば、クロモグリク酸 ナトリウム、トラ-ラスト、アンレキサノクス、レビリナスト、イブジラスト、ぺミロラスト力リウ ム、ダザノラスト、ネドクロミル、クロモグリカートおよびイスラパファントなどが挙げられ る。
[0107] 抗アレルギー薬のうち、抗ヒスタミン薬としては、例えば、ジフェンヒドラミン、塩酸ジ フエ-ルビラリン、テオクル酸ジフエ-ルビラリン、フマル酸クレマスチン、ジメンヒドリ ナート、 dl—マレイン酸クロルフエ-ラミン、 d—マレイン酸クロルフエ-ラミン、塩酸トリ プロリジン、塩酸プロメタジン、酒石酸ァリメマジン、塩酸イソチペンジル、塩酸ホモク 口ルシクリジン、ヒドロキシジン、塩酸シプロへプタジン、塩酸レボカバスチン、ァステミ ゾール、べポタスチン、デス口ラタジン、 TAK-427、 ZCR-2060、 NIP-530、モメタゾンフ 口エート、ミゾラスチン、 BP-294、アンドラスト、オーラノフィンおよびアタリバスチンなど が挙げられる。
[0108] 抗アレルギー薬のうち、トロンボキサン合成酵素阻害薬としては、例えば、塩酸ォザ ダレルおよびイミトロダストナトリウムなどが挙げられ、トロンボキサン拮抗薬としては、 例えば、セラトロダスト、ラマトロバン、ドミトロバンカルシウム水和物、 KT-2-962などが 挙げられ、 Th2サイト力イン阻害薬としては、例えば、トシル酸スブラタストソナチモド、 T-614、 SR-31747などが挙げられる。
[0109] ホスホジエステラーゼ阻害薬 (PDE4)としては、例えば、シロミラスト、口フルミラスト 、ァロフィリン、ァチゾラム、シパムフィリン、ロリプラム、 OPC- 6535、 ΟΝΟ- 6126、 IC- 4 85、 AWD- 12- 281、 CC- 10004、 CC- 1088、 KW- 4490、 Iirimilast、 ZK- 117137、 YM-97 6、 BY- 61- 9987、 CC- 7085、 CDC- 998、 MEM- 1414、 ND- 1251、 Bayl9- 8004、 D- 439 6、 PD-168787, NIK-616、 SCH-351591、 V-11294Aなどが挙げられる。
[0110] メディエーター遊離抑制薬としては、例えば、アンレキサノクス、イブジラスト、クロモ グリク酸ナトリウム、ダザノラスト、トラニラスト、ぺミロラストカリウム、レビリナストなどが 挙げられる。
[0111] 本発明に係る蛋白質のアンタゴ-ストあるいはァゴニストの活性成分を医薬として用 いる場合、単独あるいは薬理的に許容される各種製剤補助剤と混合して、医薬組成 物として投与することができる。一般的には、 目的に応じて、経口投与、静脈内投与 、局所投与、経皮投与など、使用に適した製剤調製物の形態で投与される。
[0112] そのような成分の投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間な どにより異なるが、通常、成人一人あたり、 1回につき、 lngから lOOOOmgの範囲で、 数日に 1回、 3日に 1回、 2日に 1回、 1日 1回力ら数回経口投与される力、または成人 一人あたり、 1回につき、 lng力ら lOOOmgの範囲で、数曰に 1回、 3曰に 1回、 2曰に 1 回、 1日 1回力も数回非経口投与 (好ましくは、静脈内投与)されるか、または 1日 1時 間から 24時間の範囲で静脈内に持続投与される。 もちろん前記したように、投与量は種々の条件により変動するので、上記投与量より 少な 、量で充分な場合もあるし、また範囲を越えて投与の必要な場合もある。
[0113] 本発明に係る蛋白質のアンタゴ-ストあるいはァゴ-ストと他の薬剤の併用剤を投 与する際には、経口投与のための内服用固形剤もしくは内服用液剤として、あるいは 非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤もしくは吸入剤などとして用いら れる。
経口投与のための内服用固形剤には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤および顆粒 剤などが含まれる。カプセル剤には、ハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる 。また錠剤には舌下錠、口腔内貼付錠および口腔内速崩壊錠などが含まれる。
[0114] このような内服用固形剤においては、ひとつまたはそれ以上の活性物質はそのまま 力 または賦形剤（例えば、ラタトース、マン-トール、グルコース、微結晶セルロース またはデンプンなど）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビュルピロ リドンまたはメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなど）、崩壊剤（例えば、繊維素グリコー ル酸カルシウムなど）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムなど）、安定剤、溶 解補助剤 (例えば、グルタミン酸またはァスパラギン酸など)などと混合され、常法に 従って製剤化して用いられる。また、必要によりコーティング剤（例えば、白糖、ゼラチ ン、ヒドロキシプロピルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート など)で被覆していてもよいし、また 2以上の層で被覆していてもよい。さらにゼラチン のような吸収されうる物質のカプセルも包含される。
[0115] 舌下錠は公知の方法に準じて製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性 物質に賦形剤（例えば、ラタトース、マン-トール、グルコース、微結晶セルロース、コ ロイダルシリカまたはデンプンなど）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、 ポリビニルピロリドンまたはメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなど）、崩壊剤（例えば、 デンプン、 Lーヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、クロス力 ルメロースナトリウムまたは繊維素グリコール酸カルシウムなど）、滑沢剤（例えば、ス テアリン酸マグネシウムなど）、膨潤剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロ キシプロピルメチルセルロース、カーボポーノレ、カルボキシメチルセルロース、ポリビ -ルアルコール、キサンタンガムまたはグァーガムなど）、膨潤補助剤（例えば、ダル コース、フノレクトース、マンニトーノレ、キシリトーノレ、エリスリトーノレ、マノレトース、トレノヽロ ース、リン酸塩、クェン酸塩、ケィ酸塩、グリシン、グノレタミン酸またはァノレギニンなど） 安定剤、溶解補助剤（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グルタ ミン酸またはァスパラギン酸など）、香味料 (例えば、オレンジ、ストロベリー、ミント、レ モンまたはバニラなど)などと混合され、常法に従って製剤化して用いられる。また、 必要によりコーティング剤（例えば、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースま たはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなど）で被覆して 、てもよ 、し、また
2以上の層で被覆していてもよい。また、必要に応じて常用される防腐剤、抗酸化剤 、着色剤、甘味剤などの添加物を加えることもできる。 口腔内貼付錠は公知の方法に 準じて調製される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質に賦形剤 (例えば、ラ クトース、マン-トール、グルコース、微結晶セルロース、コロイダルシリカまたはデン プンなど）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビュルピロリドンまた はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、 Lーヒドロキシ プロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、クロスカルメロースナトリウムまた は繊維素グリコール酸カルシウムなど）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムな ど）、付着剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセル口 ース、カーボポール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、キサンタ ンガムまたはグァーガムなど）、付着補助剤（例えば、グルコース、フルクトース、マン 二トール、キシリトール、エリスリトール、マルトース、トレハロース、リン酸塩、クェン酸 塩、ケィ酸塩、グリシン、グルタミン酸またはアルギニンなど）安定剤、溶解補助剤（例 えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グルタミン酸またはァスパラギン 酸など）、香味料 (例えば、オレンジ、ストロベリー、ミント、レモンまたはバニラなど）な どと混合され、常法に従って製剤化して用いられる。また、必要によりコーティング剤（ 例えば、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチ ルセルロースフタレートなど）で被覆して 、てもよ 、し、また 2以上の層で被覆して!/ヽ てもよい。また、必要に応じて常用される防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの 添加物を加えることもできる。 口腔内速崩壊錠は公知の方法に準じて調製される。例 えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質をそのまま、あるいは原末もしくは造粒原末 粒子に適当なコーティング剤（例えば、ェチルセルロース、ヒドキシプロピルセルロー ス、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはアクリル酸メタクリル酸コポリマーなど） 、可塑剤（例えば、ポリエチレングリコールまたはクェン酸トリェチルなど）を用いて被 覆を施した活性物質に賦形剤（例えば、ラタトース、マン-トール、グルコース、微結 晶セルロース、コロイダルシリカまたはデンプンなど）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロ ピルセルロース、ポリビュルピロリドンまたはメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなど）、 崩壊剤（例えば、デンプン、 Lーヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセル ロース、クロスカルメロースナトリウムまたは繊維素グリコール酸カルシウムなど）、滑沢 剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムなど）、分散補助剤（例えば、グルコース、フル クトース、マン-トール、キシリトール、エリスリトール、マルトース、トレノヽロース、リン酸 塩、クェン酸塩、ケィ酸塩、グリシン、グルタミン酸またはアルギニンなど)安定剤、溶 解補助剤（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グルタミン酸また はァスパラギン酸など）、香味料 (例えば、オレンジ、ストロベリー、ミント、レモンまたは バニラなど)などと混合され、常法に従って製剤化して用いられる。また、必要によりコ 一ティング剤（例えば、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースまたはヒドロキシ プロピルメチルセルロースフタレートなど）で被覆して!/、てもよ!/、し、また 2以上の層で 被覆していてもよい。また、必要に応じて常用される防腐剤、抗酸化剤、着色剤また は甘味剤などの添加物を加えることもできる。
[0116] 経口投与のための内服用液剤は、薬剤的に許容される水剤、懸濁剤、乳剤、シロッ プ剤およびエリキシル剤などを含む。このような液剤においては、ひとつまたはそれ 以上の活性物質が、一般的に用いられる希釈剤 (例えば、精製水、エタノールまたは それらの混液など）に溶解、懸濁または乳化される。さらにこの液剤は、湿潤剤、懸濁 ィ匕剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤または緩衝剤などを含有していても よい。
[0117] 非経口投与のための外用剤の剤形には、例えば、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、湿 布剤、貼付剤、リニメント剤、噴霧剤、吸入剤、スプレー剤、エアゾル剤、点眼剤およ び点鼻剤などが含まれる。これらはひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、公知 の方法または通常使用されている処方により調製される。 [0118] 軟膏剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつま たはそれ以上の活性物質を基剤に研和、または溶融させて調製される。軟膏基剤は 公知あるいは通常使用されているもの力も選ばれる。例えば、高級脂肪酸または高 級脂肪酸エステル (例えば、アジピン酸、ミリスチン酸、ノルミチン酸、ステアリン酸、 ォレイン酸、アジピン酸エステル、ミリスチン酸エステル、パルミチン酸エステル、ステ アリン酸エステルまたはォレイン酸エステルなど）、ロウ類 (例えば、ミツロウ、鯨ロウま たはセレシンなど）、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン 酸エステルなど）、高級アルコール（例えば、セタノール、ステアリルアルコールまたは セトステアリルアルコールなど）、シリコン油（例えば、ジメチルポリシロキサンなど）、炭 化水素類 (例えば、親水ワセリン、白色ワセリン、精製ラノリンまたは流動パラフィンな ど）、グリコール類（例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレング リコール、ポリエチレングリコールまたはマクロゴールなど）、植物油（例えば、ヒマシ油 、ォリーブ油、ごま油またはテレビン油など）、動物油（例えば、ミンク油、卵黄油、スク ヮランまたはスクワレンなど）、水、吸収促進剤、かぶれ防止剤から選ばれるものが単 独でまたは 2種以上を混合して用いられる。さらに、保湿剤、保存剤、安定化剤、抗 酸化剤または着香剤などを含んで 、てもよ 、。
[0119] ゲル剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつま たはそれ以上の活性物質を基剤に溶融させて調製される。ゲル基剤は公知あるいは 通常使用されているもの力も選ばれる。例えば、低級アルコール (例えば、エタノール またはイソプロピルアルコールなど）、ゲル化剤（例えば、カルボキシメチルセルロー ス、ヒドロキシェチノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレセノレロースまたはェチノレセノレロー スなど）、中和剤（例えば、トリエタノールァミンまたはジイソプロパノールァミンなど）、 界面活性剤（例えば、モノステアリン酸ポリエチレングリコールなど）、ガム類、水、吸 収促進剤およびかぶれ防止剤力 選ばれるものが単独でまたは 2種以上を混合して 用いられる。さらに、保存剤、抗酸化剤または着香剤などを含んでいてもよい。
[0120] クリーム剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつ またはそれ以上の活性物質を基剤に溶融または乳化させて製造される。クリーム基 剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、高級脂肪酸エス テル、低級アルコール、炭化水素類、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール または 1, 3—ブチレングリコールなど）、高級アルコール（例えば、 2—へキシルデカ ノールまたはセタノールなど）、乳化剤（例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテ ル類または脂肪酸エステル類など）、水、吸収促進剤およびかぶれ防止剤から選ば れるものが単独でまたは 2種以上を混合して用いられる。さらに、保存剤、抗酸化剤 または着香剤などを含んで 、てもよ 、。
[0121] 湿布剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつま たはそれ以上の活性物質を基剤に溶融させ、練合物とし支持体上に展延塗布して 製造される。湿布基剤は公知あるいは通常使用されているものカゝら選ばれる。例えば 、増粘剤（例えば、ポリアクリル酸、ポリビュルピロリドン、アラビアゴム、デンプン、ゼラ チンまたはメチルセルロースなど）、湿潤剤（例えば、尿素、グリセリンまたはプロピレ ングリコールなど）、充填剤（例えば、カオリン、酸化亜鉛、タルク、カルシウムまたはマ グネシゥムなど）、水、溶解補助剤、粘着付与剤およびかぶれ防止剤カゝら選ばれるも のが単独でまたは 2種以上を混合して用いられる。さら〖こ、保存剤、抗酸化剤または 着香剤などを含んで 、てもよ 、。
[0122] 貼付剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつま たはそれ以上の活性物質を基剤に溶融させ、支持体上に展延塗布して製造される。 貼付剤用基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、高分 子基剤、油脂、高級脂肪酸、粘着付与剤およびかぶれ防止剤力 選ばれるものが単 独でまたは 2種以上を混合して用いられる。さらに、保存剤、抗酸化剤または着香剤 などを含んでいてもよい。
[0123] リニメント剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひと つまたはそれ以上の活性物を水、アルコール（例えば、エタノールまたはポリエチレ ングリコールなど）、高級脂肪酸、グリセリン、セッケン、乳化剤および懸濁化剤などか ら選ばれるもの単独または 2種以上に溶解、懸濁または乳化させて製造される。さら に、保存剤、抗酸化剤または着香剤などを含んでいてもよい。
[0124] 噴霧剤、吸入剤、およびスプレー剤は、一般的に用いられる希釈剤以外に亜硫酸 水素ナトリウムのような安定剤と等張性を与えるような緩衝剤、例えば、塩化ナトリウム 、クェン酸ナトリウムあるいはクェン酸のような等張剤を含有していてもよい。スプレー 剤の製造方法は、例えば、米国特許第 2,868,691号および同第 3,095,355号に詳しく 記載されている。
非経口投与のための注射剤としては、すべての注射剤を含み、点滴剤をも包含す る。例えば、筋肉への注射剤、皮下への注射剤、皮内への注射剤、動脈内への注射 剤、静脈内への注射剤、腹腔内への注射剤、脊髄腔への注射剤および静脈内への 点滴剤などを含む。
[0125] 非経口投与のための注射剤としては、溶液、懸濁液、乳濁液および用時溶剤に溶 解または懸濁して用いる固形の注射剤を包含する。注射剤は、ひとつまたはそれ以 上の活性物質を溶剤に溶解、懸濁または乳化させて用いられる。溶剤として、例えば 、注射用蒸留水、生理食塩水、植物油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー ル、エタノールのようなアルコール類などおよびそれらの組み合わせが用いられる。さ らにこの注射剤は、安定剤、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、ァスパラギン酸また はポリソルベート 80 (登録商標)など）、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤または 保存剤などを含んで 、てもよ 、。これらは最終工程にぉ 、て滅菌するか無菌操作法 によって調製される。また無菌の固形剤、例えば凍結乾燥品を製造し、その使用前 に無菌化または無菌の注射用蒸留水または他の溶剤に溶解して使用することもでき る。
非経口投与のための点眼剤には、点眼液、懸濁型点眼液、乳濁型点眼液、用時 溶解型点眼液および眼軟膏が含まれる。
[0126] これらの点眼剤は公知の方法に準じて製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上 の活性物質を溶剤に溶解、懸濁または乳化させて用いられる。点眼剤の溶剤として は、例えば、滅菌精製水、生理食塩水、その他の水性溶剤または注射用非水性用 剤（例えば、植物油など)などおよびそれらの組み合わせが用いられる。点眼剤は、 等張化剤 (例えば、塩ィ匕ナトリウム、濃グリセリンなど）、緩衝化剤 (例えば、リン酸ナト リウムまたは酢酸ナトリウムなど）、界面活性化剤（例えば、ポリソルベート 80 (商品名） 、ステアリン酸ポリオキシル 40、例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油など）、安定 ィ匕剤 (例えば、クェン酸ナトリウムまたはェデト酸ナトリウムなど）、防腐剤 (例えば、塩 化ベンザルコ -ゥムまたはパラベンなど）などを必要に応じて適宜選択して含んで!/ヽ てもよい。これらは最終工程において滅菌するか、無菌操作法によって調製される。 また無菌の固形剤、例えば、凍結乾燥品を製造し、その使用前に無菌化または無菌 の滅菌精製水または他の溶剤に溶解して使用することもできる。
[0127] 非経口投与のための吸入剤としては、エアロゾル剤、吸入用粉末剤または吸入用 液剤が含まれ、当該吸入用液剤は用時に水または他の適当な媒体に溶解または懸 濁させて使用する形態であってもよい。
これらの吸入剤は公知の方法に準じて製造される。
例えば、吸入用液剤の場合には、防腐剤（例えば、塩ィ匕ベンザルコニゥムまたはパ ラベンなど）、着色剤、緩衝化剤 (例えば、リン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウムなど） 、等張化剤 (例えば、塩ィ匕ナトリウムまたは濃グリセリンなど）、増粘剤 (例えば、カリボ キシビュルポリマーなど）、吸収促進剤などを必要に応じて適宜選択して調製される
[0128] 吸入用粉末剤の場合には、滑沢剤（例えば、ステアリン酸およびその塩など）、結合 剤（例えば、デンプンまたはデキストリンなど）、賦形剤（例えば、乳糖またはセルロー スなど）、着色剤、防腐剤 (例えば、塩ィ匕ベンザルコ -ゥムまたはパラベンなど）、吸収 促進剤などを必要に応じて適宜選択して調製される。
吸入用液剤を投与する際には通常噴霧器 (例えば、アトマイザ一またはネブライザ 一)が使用され、吸入用粉末剤を投与する際には通常粉末薬剤用吸入投与器が使 用される。
非経口投与のためその他の組成物としては、ひとつまたはそれ以上の活性物質を 含み、常法により処方される直腸内投与のための坐剤および睦内投与のためのぺッ サリーなどが含まれる。
実施例
[0129] 以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は何らこれらに限 定されるものではない。
[0130] 実施例 1 :ヒト BIR1の発現プロファイル
ヒト正常組織、血液細胞および細胞株における BIR1の mRNA発現を調べるため に、 BIR1特異的プライマーを設計し、 TaKaRa Ex Taq (TaKaRa社製）を用いて PCR を行った。この時使用したプライマーの配列を以下に示す。
5， - GAACAGGCTCCTCTTCTGGAG - 3 ' (配列番号 13)
5， - GGTTCACCTTTTCCATCCTGG - 3 ' (配列番号 14)
PCRは、最初 96°C下で 1分間保持し、続いて、 98°C下で 10秒間、 56°C下で 30秒 間、 72°C下で 30秒間の温度操作を 35回繰り返し、最後に 72°Cで 10分間保持して 行った。
ヒト正常組織および血液細胞の発現解析には、 Human MTC Panel I、 Human MTC Panel II、 Human Immune System MTC Panel、 Human Blood Fractions MTC Panel (B D Clontech社製)を用い、ヒト細胞株の発現解析には常法に従い全 RNA力も逆転写 反応にて作製した cDN Aを用いた。 PCR産物をァガロースゲル電気泳動後、ゲルを ェチジゥムブロマイド（Ethidium bromide)染色し、 BioDoc- It System (U VP社製）にて 画像データを得た。その結果を図 1に示す。
BIR1は脾臓、リンパ節などの免疫系組織および CD14陽性細胞（単球）、 CD19陽 性細胞 (B細胞)で高発現していた。また、ヒト細胞株では、 BIR1は単球分化能を有 する K562、 HL— 60、単球系細胞株である U937、 THP—1、 B細胞株である Raji、 CCRF— SBおよび FLEB— 14— 14で発現が確認された。
実施例 2 :各種炎症刺激によるヒト BIR1の発現
ヒト単球系細胞株を用い、各種炎症刺激による BIR1の発現を検討した。 THP - 1 細胞および U937細胞を 1 X 106cellsZ2mLでリポポリサッカライド（LPS) ( 1 μ gZ mL)、フオルボールミリステートアセテート（PMA) ( lOOng/mL) , IFN - y ( 100η gZmL)ゝ TNF— a ( lOngZmL)あるいは LPS +IFN— y ( 1 ^ g/mL + lOOng ZmL)で 1、 3、 8、 24、 48および 120時間刺激し、全 RNAを回収した。 BIR1に特 異的なプライマー； 5 ' - CACAGCCATGGAAGTTGGAATC - 3 ' (配列番号 15 )および 5， - GAGTGTTTGGCCTCATCTTGG - 3 ' (配列番号 16)と QuantiTec t SYBR Green RT— PCR Kit (QIAGEN社製）を用いて、 ABI PRISM 7000 Sequence De tection System (Applied Biosystems社製）により BIR1の RNAを定量した。 PCRの反 応は、最初 50°C下で 30分間保持し、続いて 95°C下で 15分間保持した。次に、 94 °C下で 10秒間、 56°C下で 30秒間、 72°C下で 1分間の温度操作を 45回繰り返して 行った。その結果、図 2に示すように、 BIR1の遺伝子発現は THP— 1細胞では TNF — α以外の刺激で 8〜48時間以降に上昇し、 U937細胞ではいずれの刺激でも 24 〜48時間以降で上昇した。
[0132] 実施例 3：自己免疫疾患患者由来の血液細胞における BIR1の発現
Autoimmune Disease Profiling Array (BD Clontech社製）を用いて、自己免疫疾患 患者由来の各種血液細胞における BIR1の発現を調べた。ヒト BIR1部分長 cDNA 断片を铸型として、 Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2 (TaKaRa社製）を用いて [ a 32 P] dCTP (PerkinElmer社製)標識した BIR1特異的プローブを作製した。使用 した部分長 cDNA断片を配列番号 17に示す。
プローブ作製以降のプレハイブリダィゼーシヨン、ハイブリダィゼーシヨンおよび洗 浄の操作は添付文書に従った。 BAS2000 (FUJIFILM社製）を用いて画像データを取 得し、 BAStation Ver.2.21の Image Analyzer IIにて画像データから各ドットの PSL (Ph oto- Stimulated Luminescence ;放射線量と比例）値を求め、各サンプルにおける BIR 1の発現量を数値化した。統計解析は健常人に対して Wilcoxon (Mann-Whitney) te stを実施した。その結果を図 3に示す。
健常人と比較して、ループス抗凝固因子患者の単球、関節リウマチ、多発性硬化 症および高安動脈炎患者の B細胞で BIR1の発現量は有意に増加していた。
[0133] 実施例 4：ヒト BIR1スプライシングノリアントの同定
ヒト CD14陽性細胞（単球）および CD19陽性細胞（B細胞）由来 cDNA (Human Bl ood Fractions MTC Panel) (BD Clontech社製）を铸型として、 TaKaRa LA Taq (TaKa Ra社製)を用いて PCRを行った。設計したヒト BIR1に特異的なプライマーを以下に 示す。
5， - ATGTGGAGCCATTTGAACAGGCTCCTC - 3 ' (配列番号 18)
5， - TCAGAAGTTGAGTTCAGAATAGAC - 3，（配列番号 19)
PCRは、最初 96°C下で 1分間保持し、続いて、 98°C下で 10秒間、 56°C下で 30秒 間、 72°C下で 1分 30秒間の温度操作を 35回繰り返し、最後に 72°Cで 10分間保持 して行った。 PCR産物をァガロースゲル電気泳動後に単離し、 ΤΖ Aベクターにサブ クロ ~~ニングした。 BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem s社製）の添付文書に従い、 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems 社製）にて各 cDNA断片の配列を決定した。
その結果、既知のァイソフォーム (免疫グロブリン (Ig)ドメインが 2個存在; BIR1L) ( 配列番号 1および 2)以外に、新たに C末端側の Igドメインが欠失したァイソフォーム（ BIR1S1) (配列番号 3)、 N末端側の Igドメインが欠失したァイソフォーム（BIR1S 2) (配列番号 4)、両方の Igドメインが欠失したァイソフォーム (BIRl A lg) (配列番号 5) および BIR1S1の細胞内領域の一部が欠失したァイソフォーム（BIR1 A Cyt) (配列 番号 6)が同定された。 N末端側の Igドメインは配列番号 1に記載のアミノ酸配列中ァ ミノ酸番号 41— 122に、 C末端側の Igドメインは配列番号 1に記載のアミノ酸配列中 アミノ酸番号 138— 203に相当する部分である。
実施例 5 :マウス Fc y RIIB—ヒト BIR1キメラ安定発現細胞の作製
BIR1が抑制性シグナルを伝達するか否かを検討した。 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 98: 13866-13871 (2001)や J. Immunol. 162: 3168-3175 (1999)などで報告された 方法に従い、以下の材料を作製した。マウス FC Y RIIB (FCR)の細胞外領域、膜貫 通領域および細胞内領域 6アミノ酸 (アミノ酸番号 1〜252)の C末端側に BIR1の細 胞内領域（配列番号 1のアミノ酸番号 251〜343)を連結した FcR-hBIRl (wt)キメ ラ蛋白（配列番号 20)をコードする DNAを、 βーァクチンプロモーターの下流に挿入 し、 FcRキメラ蛋白発現ベクターを構築した。また、 QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene社製）を用いて、 BIR1の細胞内領域の 6つのチロシン残 基のすべてをフエ-ルァラニン残基に置換した変異体 (FcR—hBIRl (YWF) ) (配 列番号 21)の発現ベクターを作製した。これらの FcRキメラ発現ベクターと、既知の 抑制性レセプターであるヒト KIR2DL3の FcRキメラ（FcR— hKIR2DL3) (配列番号 22)発現ベクターを Gene Pulser Xcell Electroporation System (BIO- RAD社製）を用 いて、マウス B細胞株 A20IIA1. 6 (マウス Fc γ RIIB欠損細胞株）（J.Immunol. 136: 348-356 (1986》に導入した。各導入細胞を FITC標識ラット抗マウス CD16ZCD32 抗体（2. 4G2) (BD Pharmingen社製）で染色後、 FACSCal¾ur (BD Biosciences社製 )にて FcRキメラ蛋白の発現量を確認した。 図 4に示すように、それぞれ同程度の FcRキメラ蛋白を安定発現した細胞であった
[0135] 実施例 6：ヒト BIR1による B細胞受容体を介した細胞内 Ca +濃度上昇の抑制
FcRキメラ安定発現細胞に 2. 5mmol/L probenecid存在下 37°Cで 30分間 Fura 2—AM (終濃度 /z molZL) (和光純薬工業 (株)製)を取り込ませた。 Fum2—A Mを除去後、 2. 5mmol/L probenecid含有 HEPES/Hanks，緩衝液中に 37°C で 30分間静置した。遠心して上清を除去した後、細胞を 5 X 106cells/mLで 2. 5m mol/L probenecid含有 HEPESZHanks '緩衝液に懸濁し、 Ca2+測定用 96ゥェ ルプレートに 100 /z L/wellで播種した。細胞外 Ca2+非存在下での実験では、 Ca2 +不含 Hanks，溶液にて調製した ImmolZL EGTA/2. 5mmol/L probenecid 含有 HEPESZHanks '緩衝液を用い、同様の操作を行った。室温で 30分間静置 後、 Spectrofluorometer FDSS- 4000 (浜松ホトニタス社製）を用いて 340nmZ380n mの蛍光強度比を測定し、細胞内 Ca2+濃度の変動を検出した。測定開始 30秒後に 、ゥサギ抗マウス IgG (H +L)抗体の F (ab，） （33 gZmL)もしくはインタクト（intact
2
) (49. 5 μ g/mL) (Zymed社製）を 10 μ LZwellで添カ卩した。
図 5に示すように、インタタトの抗体を添加して BIR1キメラ蛋白力 ¾CRと架橋された 場合に、 BIR1キメラ蛋白は BCRを介した細胞内 Ca2+濃度の上昇を抑制することが 明ら力となった。一方、 BIR1の細胞内チロシン残基をフエ-ルァラニン残基に置換し た変異体では細胞内 Ca2+濃度の上昇は抑制されな力つた。また、 BIR1の細胞内 C a2+濃度上昇の抑制パターンは陽性対照である KIR2DL3と異なって 、た。細胞外 C a2+非存在下で BIR1と KIR2DL3の細胞内 Ca2+濃度上昇の抑制パターンを比較し た結果、 KIR2DL3は細胞外 Ca2+非存在下でも細胞内 Ca2+濃度上昇を完全に抑 制したのに対して、 BIR1は抑制することができなかった。 BIR1は既知の抑制性レセ プターである Fe y RIIBと同様の結果を示した (Cell 90: 293-301 (1997))。
以上の結果から、本発明に係る蛋白質である BIR1は、免疫抑制受容体として機能 することが示された。
[0136] 実施例 7：抑制性シグナル伝達におけるヒト BIR1の細胞内チロシン残基のリン酸ィ匕 およびリクルートされるホスファターゼの同定 BIR1が活性ィ匕されたときに細胞内チロシン残基がリン酸ィ匕され、ホスファターゼが リクルートされるかどうかを検討した。 Ca2+含有 HEPESZHanks，緩衝液に懸濁し た 3 X 107個の FcRキメラ安定発現細胞をゥサギ抗マウス IgG (H + L)抗体の F (ab， )
30 μ gZmLあるいはインタタト 45 μ g/mL (Zymed社製）で、 37°Cで 3分間刺激し
2
た。その後、細胞を lysis buffer (1% NP— 40, 50mmol/L Tris— HC1, pH8. 0 , 150mmol/L NaCl, 50mmol/L NaF, 10% glycerol, lmmol/L Na V
3
O , lmol/L PMSF, protease inhibitor cocktail tablet (Roche Diagnostics社製) )
4
で溶解した。細胞溶解液をラット抗マウス CD16ZCD32抗体（2. 4G2) (BD Pharmi ngen社製）を結合させた Protein A/G PLUS- Agarose (Santacruz社製）と 4°Cで 5時間 以上反応させた。 FcRキメラ蛋白およびそれらの結合分子を免疫沈降した後、定法 に従って、ウェスタンブロッテイングを行った。メンブレンを phosphotyrosine(4G10) (Up state社製）、 SHP - 1、 SHP - 2、 SHIP - 1に対する一次抗体（Santacruz社製）で 反応後、ホースラディッシュペルォキシダーゼ (HRP)標識した二次抗体（Santacruz 社製）を反応させ、 ECL検出システム（Amersham Biosciences社製）にてバンドを検 出した。
その結果、図 6に示すように、インタタト抗体を添加して BIR1キメラ蛋白力 ¾CRと架 橋された場合に、 BIR1キメラ蛋白の細胞内チロシン残基がリン酸ィ匕された。またその 時、 BIR1キメラ蛋白の細胞内領域に SHP— 1、 SHP— 2、 SHIP— 1がリクルートさ れた。一方、 BIR1の細胞内チロシン残基をフエ二ルァラニン残基に置換した変異体 ではホスファターゼはリクルートされなかった。
実施例 8：ヒト BIR1による Erk2のリン酸化の抑制
BIR1が BCRを介した下流のシグナル伝達分子のリン酸ィ匕を抑制するかどうかを検 討した。 Ca2+含有 HEPES/Hanks，緩衝液に懸濁した 6 X 106個の FcRキメラ安定 発現細胞を、 30 gZmL ゥサギ抗マウス IgG (H+L)抗体の F (ab' ) あるいは 45
2
gZmL インタクト（Zymed社製）で、 37°Cで 3分間刺激した。 Lysing solution (Cell Lysis Kit;BIO- RAD社製）で細胞溶解液（500ngZ w L)を調製した。各シグナル伝 達分子のリン酸化は Bio- Hex Phospho 7- Hex Assay (BIO- RAD社製）を用いて定量 した。 その結果、図 7に示すように、 KIR2DL3と同様に、インタタト抗体を添カ卩して BIR1 キメラ蛋白力 ¾CRと架橋された場合に、 BIR1キメラ蛋白は BCRを介した Erk2のリン 酸化を抑制した。一方、 BIR1の細胞内チロシン残基をフエ-ルァラニン残基に置換 した変異体は Erk2のリン酸ィ匕を抑制しな力つた。
[0138] 実施例 9：ヒト BIR1によるインターロイキン 2 (IL— 2)産生の抑制
BIR1が BCRを介した IL— 2産生を抑制するかどうかを検討した。 1 X 105個の FcR キメラ安定発現細胞を 96ゥエルプレートに播種し、 lO ^ g/mL ゥサギ抗マウス IgG 0¾+1^)抗体の？（& ） あるいは 5 /z gZmL インタク HZymed社製）にて 37°Cで 24
2
時間刺激した。 Quantikine Immunoassay Mouse IL- 2 ELISA Kit (R & D Systems社製 )を用いて、各培養上清中の IL— 2量を測定した。
その結果、図 8に示すように、インタタト抗体を添加して BIR1キメラ蛋白力 ¾CRと架 橋された場合に、 BIR1キメラ蛋白は BCRを介した IL— 2産生を抑制した。一方、 BI R1の細胞内チロシン残基をフエ-ルァラニン残基に置換した変異体は IL 2産生を 抑制しなかった。また、以前に報告された通り、 KIR2DL3も IL— 2産生を抑制した。
[0139] 実施例 10 :ヒト BIR1の ITIMドメインおよび結合するホスファターゼの同定
BIR1が抑制性シグナルを伝達するのに重要な配列 ITIMドメインおよび結合する ホスファターゼを同定した。 BIR1 (配列番号 1)の細胞内チロシン残基を含むぺプチ ド（Y3： Biotin— HSQELQ313YATPVF (配列番号 23)、 Y5： Biotin— DSYKSG3 36YVYSEL (配列番号 24)、 Y6： Biotin - YKSGYV338YSELNF (配列番号 25) ) およびそれに対応するリン酸化ペプチド（pY3： Biotin -HSQELQ313 (pY) ATPV F (配列番号 26)、 pY5 : Biotin— DSYKSG336 (pY)VYSEL (配列番号 27)、 pY6 ： Biotin -YKSGYV338 (pY) SELNF (配列番号 28) )を合成した (Sigma Genosys 社に委託）。また、マウス PIR— Bの ITIM配列を含むペプチドおよびリン酸化ぺプチ ド（Y3： Biotin-ESQDVT794YAQLCS (配列番号 29)および pY3： Biotin -ESQ DVT794 (pY) AQLCS (配列番号 30) )を陽性対照として合成した。これらのペプチド を抗ビォチン抗体（Sigma社製）を介して Protein A/G PLUS- Agarose (Santacruz社製 )に結合させた後、 A20IIA1. 6細胞の溶解液と 4°Cで 2時間反応させた。免疫沈降 後、定法に従ってウェスタンブロッテイングを行った。メンブレンを SHP— 1、 SHP- 2 、 SHIP— 1 (Santacruz社製）に対する一次抗体で反応後、 HRP標識した二次抗体（ ¾antacruz社製)を反 J¾、させ、 Eしし plus Western Blotting Detection System (Amersha m Biosciences社製）を用いてバンドを検出した。
その結果、図 9に示すように、 BIR1の pY3が SHP— 1、 SHP— 2と結合し、 ρΥ6は SHP— 1、 SHP— 2、 SHIP— 1と結合した。一方、 pY5はいずれのホスファターゼと も結合しなかった。 BIR1の細胞内領域には従来の ΙΤΙΜのコンセンサス配列（IZV /L/SXYXXL/V)と一致する配列は存在しないが、ヒト BIR1の 313番目と 338 番目のチロシン残基が新たな ITIMとして機能することが明ら力となった。
実施例 12 :抗ヒト BIR1抗体の作製
(1)可溶ィ匕ヒト BIRlLZFcキメラ蛋白を用いた抗原感作
可溶化ヒト BIRlLZFcキメラ蛋白 60 μ gを TiterMaxアジュバント（Sigma社製）と混 合し、 BALBZcマウスの腹腔内に投与した。初回投与 2週間後に、抗原（60 /z g)を TiterMaxアジュバントと混合し、マウスの腹腔内に投与した。追加免疫約 10日後に、 抗原 (40 μ g)をマウスの腹腔内に最終投与した。 3日後に、マウス力も脾臓を摘出し た。
(2)抗ヒト BIR1モノクローナル抗体の作製
上記（1)で得た脾臓よりリンパ球を分離し、マウスミエローマ P3U1と約 4 : 1で混合 し、ポリエチレングリコールを用いて細胞融合を行った。 RPMI1640Z15%FCSZ HAT培地によりハイプリドーマを選択し、可溶ィ匕ヒト BIRlLZFcキメラ蛋白を用いた ELISAおよびヒト BIR1L安定発現 CHO細胞を用いたフローサイトメトリーにより目的 の抗体を産生して 、るハイプリドーマのスクリーニングを行った。陽性ハイプリドーマ を限界希釈法によりクローユングし、抗ヒト BIR1モノクローナル抗体産生ハイプリドー マを取得した。このようにして得たノヽイブリドーマを BALB/cマウスの腹腔に接種後 , 2週間以降に腹水を採取した.腹水中に産生された抗体は Prosep— Gカラム（ミリ ポア社製)などを用いて精製した。
図 10に示すように、作製された抗ヒト BIR1モノクローナル抗体はヒト BIR1を認識し た（図中、 Clone#170、 #68、 #95、 #31は抗ヒト BIR1モノクローナル抗体の各クローンを 表わし、 2ndAbは陰性対照を、 Antト FLAG M2は陽性対照を表わす。 ) 0 (3)抗ヒト BIR1ポリクローナル抗体の作製
可溶化ヒト BIRlLZFcキメラ蛋白（100 g/O. 5mL)を等量のフロイント完全アジ ュバント (DIFCO社製)と混合し、ゥサギの背部皮下に投与した。 2週間後、抗原（100 μ &/0. 5mL)を等量のフロイント不完全アジュバント (DIFCO社製）と混合し、ゥサ ギの背部皮下に投与した。 2週間後、尾静脈より試験採血し、抗体価の上昇をヒト BI R1L安定発現 CHO細胞を用いてフローサイトメトリーにて確認した。抗体価が低い 場合は、さらに 1〜2回の追加免疫を行い、抗血清を作製した。
[0141] 実施例 13：ヒト BIR1のシグナル伝達を変化させる化合物のスクリーニング
10 μ g/mL ゥサギ抗マウス IgG (H + L)抗体 (Zymed社製）および実施例 3で作 製した 10 /z gZmL 抗ヒト BIR1モノクローナル抗体を、定法に従い、 96ゥエルプレ ートに固定する。被験化合物 (低分子化合物、ペプチド、抗体など)を添加し、ヒト BI R1を安定発現させた Α20ΠΑ1. 6細胞を 1 X 105個 ZlOO /z LZwellで播種する。 3 7°Cで 24時間培養後、 Quantikine Immunoassay Mouse IL- 2 ELISA Kit (R & D Syste ms社製)を用いて、各培養上清中の IL— 2量を測定する。被験化合物非添加の陰性 対照と比較して IL— 2量を減少させる化合物または増加させる化合物をヒト BIR1の シグナル伝達を変化させる化合物として選別する。
[0142] 実施例 14 :ホスファターゼの結合を制御する化合物のスクリーニング
ヒト BIR1の 2箇所の ITIM領域由来のリン酸化ペプチド（Biotin— HSQELQ313 (p Y) ATPVF (配列番号 26)または Biotin— YKSGYV338 (pY) SELNF (配列番号 2 8) )を抗ビォチン抗体 (Sigma社製)を固定した 96ゥエルプレートに結合させる。被験 化合物 (低分子化合物、ペプチド、抗体など）を添加した後、 Α20ΠΑ1. 6細胞の溶 解液を添加し、 4°Cで 2時間保温する。 PBSで 5回洗浄後、 SHP—1、 SHP— 2およ び SHIP— 1に対する一次抗体 (Santacruz社製)を添加する。室温で 2時間反応後、 PBSで 5回洗浄し、 HRP標識した二次抗体 (Santacruz社製)を添加する。室温でさら に 2時間反応後、ペルォキシダーゼ用発色キット (住友ベークライト (株)製)を用いてリ ン酸ィ匕ペプチドに結合したホスファタ一ゼ量を測定する。被験化合物非添加の陰性 対照と比較してホスファタ一ゼ量を減少させる化合物または増加させる化合物を選別 する。 [0143] 実施例 15 :ヒト BIRlの発現量を変化させる化合物のスクリーニング
ヒト単球細胞株 THP— 1細胞（1 X 106cells/2mL)に LPS (1 μ g/mL)および/ または IFN— y (lOOngZmL)の存在下または非存在下で被験化合物 (低分子化 合物、ペプチド、抗体など）を添加し、 37°Cで 24時間培養する。各細胞力も全 RNA を抽出し、ヒト BIR1に特異的なプライマー； 5' - CACAGCCATGGAAGTTGGA ATC- 3' (配列番号 15)および 5， - GAGTGTTTGGCCTC ATCTTGG - 3 ' ( 配列番号 16)と QuantiTect SYBR Green RT- PCR Kit (QIAGEN社製）を用いて ABI P RISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems社製）により BIRlの RN Aを定量する。 LPSおよび Zまたは IFN— yの存在下で被験化合物非添加の陰性 対照と比較して RNA量を減少させる化合物または増加させる化合物を選別する。あ るいは LPSおよび IFN— γの非存在下で被験化合物非添加の陰性対照と比較して RNA量を減少させる化合物または増加させる化合物を選別する。
産業上の利用可能性
[0144] 本発明は医薬品開発において、非常に有用である。すなわち、本発明に係る蛋白 質のアンタゴ-ストは、癌、免疫不全症もしくは感染症の予防および Ζまたは治療に 有用である。また、本発明に係る蛋白質のァゴ-ストは、自己免疫疾患、臓器移植後 の拒絶反応、アレルギー性疾患もしくは炎症性疾患の予防および Ζまたは治療に有 用である。本発明のスクリーニング方法は、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストの 選別に有用である。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチドおよび本発明の蛋白質またはその部分 ペプチドに対する抗体は、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストとして、癌、免疫不 全症もしくは感染症の予防および Ζまたは治療に有用である。さらに、本発明の蛋白 質またはその部分ペプチドは、本発明の蛋白質またはその部分ペプチドに対する抗 体の製造において、抗原として使用できる。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の 蛋白質またはその部分ペプチドの製造に使用できる。
図面の簡単な説明
[0145] [図 1]ヒト正常組織、血液細胞および細胞株における BIR1の mRNA発現量を示す。
[図 2]各種炎症刺激によるヒト BIR1の発現変動を示す。 [図 3]自己免疫疾患患者由来の単球および B細胞における BIRlの発現変動解析の 結果を示す（ND :正常ドナー、 vWD:von Willebrand病、 SLE :全身性エリテマト 一デス、 RA:関節リウマチ、 MS :多発性硬化症、 LA:ループス抗凝固因子が高値な 疾患、 TA：高安動脈炎、 ITP：特発性血小板減少性紫斑病)。 *； p < 0. 05, * * ;p< 0. 01, 水水水 ;p< 0. 005。
[図 4]FcR— hBIRl (wt)、 FcR— hBIRl (YWF)および FcR— hKIR2DL3安定発 現細胞における FcRキメラ蛋白の発現量を示す。
[図 5]ヒト BIR1による BCRを介した細胞内 Ca2+濃度上昇の抑制を示す。
[図 6]抑制性シグナル伝達におけるヒト BIR1の細胞内チロシン残基のリン酸ィ匕および リクルートされるホスファターゼを示す（U： Unstimulated, F： F (ab，） 、 I： Intact)
2 。
[図 7]ヒト BIRlによる BCRを介した Erk2のリン酸化の抑制を示す。
[図 8]ヒト BIR1による BCRを介した IL - 2産生の抑制を示す。
[図 9]ヒト BIR1の ITIMドメインおよび結合するホスファターゼの同定を示す。
[図 10]ヒト BIR1モノクローナル抗体の抗原結合反応を示す。

Claims

請求の範囲
[1] 配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択されるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴ-ストを含有してなる免疫賦 活剤。
[2] アンタゴニストが、細胞内シグナル伝達に対する請求項 1記載の蛋白質による抑制 を減弱ないし阻害する物質である請求項 1記載の免疫賦活剤。
[3] 請求項 2記載の物質が、請求項 1記載の蛋白質のリガンド結合を阻害する物質であ る請求項 2記載の免疫賦活剤。
[4] 請求項 2記載の物質が、請求項 1記載の蛋白質の細胞内領域へのホスファターゼ の結合を阻害する物質である請求項 2記載の免疫賦活剤。
[5] 請求項 2記載の物質が、ホスファターゼ活性を阻害する物質である請求項 2記載の 免疫賦活剤。
[6] リガンド結合を阻害する物質が、請求項 1記載の蛋白質の細胞外領域中の任意の 領域を含む蛋白質もしくはポリペプチドまたはそれらに対する抗体である請求項 3記 載の免疫賦活剤。
[7] 請求項 6記載の蛋白質またはポリペプチドが、配列番号 1で表わされるアミノ酸配列 のアミノ酸 1〜227、配列番号 2で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜227、配列番 号 3で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜132、配列番号 4で表わされるアミノ酸配 列のアミノ酸 1〜137、配列番号 5で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜42および 配列番号 6で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜132から選択されるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質またはポリペプチドである 請求項 6記載の免疫賦活剤。
[8] ホスファターゼが、 SHP— 1、 SHP— 2、 SHIP— 1および Zまたは SHIP— 2である 請求項 4または 5記載の免疫賦活剤。
[9] 癌、免疫不全症および感染症から選択される疾患の予防および Zまたは治療剤で ある請求項 1記載の免疫賦活剤。
[10] 配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択されるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴニストをスクリ一二ングする方 法であって、
(i)被験化合物の存在下で、その細胞外領域を含む蛋白質またはポリペプチドとリガ ンドを接触させる工程、
(ii)その細胞外領域を含む蛋白質またはポリペプチドとリガンドの結合によって変動 するシグナルを検出する工程、および
(iii)被験化合物の存在下と非存在下での工程 (ii)のシグナル強度を比較することに よって、その結合を阻害する化合物をスクリーニングする工程力もなる方法。
[11] 配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択されるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴニストをスクリ一二ングする方 法であって、
(i)被験化合物の存在下で、その細胞内領域を含む蛋白質またはポリペプチドとホス ファターゼを接触させる工程、
(ii)その細胞内領域を含む蛋白質またはポリペプチドとホスファターゼの結合によつ て変動するシグナルを検出する工程、および
(iii)被験化合物の存在下と非存在下での工程 (ii)のシグナル強度を比較することに よって、その結合を阻害する化合物をスクリーニングする工程力もなる方法。
[12] 配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択されるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴニストをスクリ一二ングする方 法であって、
(i)被験化合物の存在下で、配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択される アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を発現する 細胞またはその細胞外領域を含む蛋白質もしくはポリペプチドとリガンドを発現する 細胞もしくはリガンドを接触させる工程、
(ii)工程 (ii)における接触によって変動するシグナルを検出する工程および (iii)被験 化合物の存在下と非存在下での工程 (ii)のシグナル強度を比較することによって、そ の結合を阻害する化合物をスクリーニングする工程力 なる方法。
[13] 配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択されるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴニストの有効量を哺乳動物 に投与することを特徴とする免疫賦活方法。
[14] 免疫賦活剤を製造するための、配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力も選択 されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアン タゴニストの使用。
[15] 配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択されるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴニストの有効量を哺乳動物 に投与することを特徴とする癌、免疫不全症および感染症から選択される疾患の予 防および Zまたは治療方法。
[16] 癌、免疫不全症および感染症から選択される疾患の予防および Zまたは治療剤を 製造するための、配列番号 1〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択されるアミノ酸配 列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴ-ストの使用
[17] 配列番号 3〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択される一つのアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチド。
[18] 配列番号 3〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択される一つのアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドをコー ドするポリヌクレオチド。
[19] 配列番号 3〜6で表わされるアミノ酸配列力 選択される一つのアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドに対 する抗体。
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