WO2006009077A1

WO2006009077A1 - 蛍光検出方法

Info

Publication number: WO2006009077A1
Application number: PCT/JP2005/013061
Authority: WO
Inventors: Junji Nishigaki; Masayoshi Kojima; Hiroyuki Hirai; Tatsuya Takahashi
Original assignee: Fujifilm Corporation
Priority date: 2004-07-16
Filing date: 2005-07-14
Publication date: 2006-01-26
Also published as: US20080020483A1; EP1775575A1; EP1775575A4; JPWO2006009077A1

Abstract

　本発明は、発光の半値幅が５０ｎｍ～２００ｎｍであるナノ粒子蛍光体を蛍光物質として含有する試料に紫外領域の励起光を照射し、該試料が発光する可視領域の蛍光を検出する蛍光検出方法を提供する。

Description

蛍光検出方法

技術分野

[0001] 本発明は、蛍光検出方法に係り、より詳細には、蛍光物質を含有する試料が発する蛍光を検出する蛍光検出方法に関する。

背景技術

[0002] 従来、生化学の分野では、蛍光物質を標識物質として使用した画像処理システムが種々知られている。この画像処理システムによれば、蛍光画像を読み取ることによつて、遺伝子配列、遺伝子の発現レベル、蛋白質の分離、同定、あるいは分子量、特性の評価などを行うことができる。

[0003] 例えば、電気泳動させるべき複数の DNA断片を含む溶液の中に蛍光色素を加えた後に、複数の DNA断片をゲル支持体上で電気泳動させる。あるいは、蛍光色素を含有するゲル支持体上で、複数の DNA断片を電気泳動させる。そしてこの複数の D NA断片をゲル支持体上で電気泳動させた後に、ゲル支持体を蛍光色素を含んだ溶液に浸すなどして、電気泳動された DNA断片に標識を付す。次いで、励起光により、蛍光色素を励起して、生じた蛍光を検出し、画像を生成することによって、ゲル支持体上の DNA分布を検出することができる。

[0004] 上述した画像処理システムにおいては、蛍光を検出するために、励起光源と CCD ( Charge Coupled Device)等の撮像素子とを備えた蛍光検出装置を利用し、励起光源力蛍光物質を含む試料に励起光を照射し、この試料力生じた蛍光を撮像素子により撮像して検出している。

[0005] 蛍光物質は、励起光を照射すると励起光の波長より長い波長領域で蛍光を発する。従来は、蛍光波長が異なる蛍光物質では、励起波長も異なっている。従って、複数の蛍光物質を使用する場合は、検出感度を高めるために、複数の蛍光物質の各々をそれに適した波長の励起光で励起する必要がある。

[0006] 一方、生化学的'医科学的研究分野では、複雑な生命現象を正確に検出することが要請されている。このような検出を行うために、複数のナノ粒子蛍光材料を使用した検出システムが開発されている。特に、複数種の蛍光材料の各々に適した励起光光源を使用することによる装置の大型化 ·複雑ィ匕を回避するために、粒径に応じて蛍光波長が変化するという半導体ナノ粒子蛍光材料のサイズ効果を利用した検出システムが開発されている（例えば、特許文献 1)。

特許文献 1：特開 2002— 28797号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] しカゝしながら、ナノ粒子蛍光材料のサイズ効果を利用した検出システムでは、ひとつの励起光光源に対して、異なる粒径を持つ蛍光材料の種類数に応じた数の蛍光選択フィルタを配置させている。このとおり、複数種のナノ粒子蛍光材料に対応して複数の蛍光選択フィルタを設けたのでは、複数種類の標的物質を検出するための装置構成が複雑になり、簡便に蛍光を検出することができない。また、蛍光波長範囲の狭い蛍光ナノ粒子を用いなければならないので、検出感度の低下を招き、フィルタによる蛍光選択の結果、低下の度合いはさらに大きくなる。

[0008] 従って、高価なナノ粒子を多品種用いずに、ひとつの試料中に存在する複数の物質からの蛍光を各々高感度で検出することができる蛍光検出方法が必要とされて、る。

[0009] また、励起光と蛍光の分離が容易な透過型装置での蛍光検出を可能とし、一層の安価で簡便な蛍光検出方法が必要とされている。

課題を解決するための手段

[0010] 本発明は、発光の半値幅が 50nm〜200nmであるナノ粒子蛍光体を蛍光物質として含有する試料に、紫外領域の励起光を照射し、該試料が発光する可視領域の蛍光を検出する蛍光検出方法を提供する。なお、紫外領域とは 400nm未満の波長領域を、、、可視領域とは 400nm〜800nmの波長領域を!、う。

[0011] 発光の半値幅が 50ηπ！〜 200nmであるナノ粒子蛍光体は、紫外領域の励起光で励起され、可視領域に幅広い発光スペクトルを有する蛍光を発光するので、可視領域において任意の波長の蛍光を効率よく取り出すことができる。従って、本発明では、発光の半値幅が 50ηπ！〜 200nmであるナノ粒子蛍光体を蛍光物質として用いることで、高価なナノ粒子を多品種用いずに、ひとつの試料中に存在する複数の物質からの蛍光を各々高感度で検出することができ、蛍光検出方法が非常に簡便になる。発明の効果

[0012] 本発明の蛍光検出方法によれば、高価なナノ粒子を多品種用いずに、ひとつの試料中に存在する複数の物質からの蛍光を各々高感度で検出することができる。また、励起光と蛍光の分離が容易な透過型装置での蛍光検出が可能となり、一層の安価で簡便に蛍光を検出することができる。

発明を実施するための最良の形態

[0013] 以下、図面を参照して、本発明の実施の形態について詳細に説明する。

ナノ粒子蛍光体

本発明におけるナノ粒子蛍光体は蛍光色素として機能し、半値幅が 50〜200nm の蛍光を発する。そのようなナノ粒子蛍光体としては、表面修飾剤によって表面修飾された金属酸ィ匕物又は金属硫ィ匕物であるナノ粒子蛍光体が好適に使用される。

[1]表面修飾剤

ナノ粒子蛍光体が表面修飾剤により修飾された表面を有することで、ナノ粒子蛍光体の水や親水性溶媒への分散性が改良でき、体液などによるナノ粒子蛍光体の溶出や蛍光の消光を防止できる。さらに標的分子を検出するための分子プローブをナノ粒子蛍光体に結合しやすくなる。

以下、本発明に用いられる表面修飾剤について説明する。

[0014] 本発明に用いる表面修飾剤は次の一般式 [I]で表される化合物又はその分解生成物である。

M—（R) —般式 [I]

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式中、 Mはケィ素又はチタン原子を、 Rは有機性基を示す。 Rはそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、 Rのうちの少なくとも 1つは親和性分子に対する反応性を有する基を示す。

[0015] 親和性分子に対する反応性を有する基は、連結基 Lを介して本体に結合したビニル基、ァリルォキシ基、アタリロイル基、メタクリロイル基、イソシアナト基、ホルミル基、エポキシ基、マレイミド基、メルカプト基、アミノ基、カルボキシル基、又はハロゲンなどを末端に有することができる。親和性分子に対する反応性を有する基は好ましくは末端にアミノ基を有する。

[0016] 連結基 Lとしては、例えば、アルキレン基 (例:メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、へキサメチレン基、プロピレン基、ェチルエチレン基、シクロへキシレン基など炭素数力 Sl〜10、好ましくは 1〜8の鎖状または環状のもの）が挙げられる。

[0017] また、連結基 Lは不飽和結合を有して、てもよ、。不飽和基としては、ァルケ-レン基（例：ビ-レン基、プロべ-レン基、 1 ブテ-レン基、 2—ブテ-レン基、 2—ペンテ-レン基、 8 へキサデセ-レン基、 1, 3 ブタンジェ-レン基、シクロへキセ-レン基など炭素数が 1〜10、好ましくは 1〜8の鎖状または環状のもの）、ァリーレン基（例：フエ-レン基、ナフチレン基、など炭素数が 6〜 10、好ましくは 6のフエ-レン基）が挙げられる。

[0018] 連結基 Lは 1個又は 2個以上のへテロ原子 (窒素原子、酸素原子、硫黄原子などの、炭素及び水素原子以外の任意の原子を意味する）を有していてもよい。ヘテロ原子は酸素原子又は硫黄原子が好ましぐ酸素原子力もっとも好ましい。ヘテロ原子の数は特に規定されないが 5個以下であることが好ましぐより好ましくは 3個以下である。

[0019] 連結基 Lは上記へテロ原子と隣接する炭素原子を含む官能基を部分構造として含んでいてもよい。該官能基としてはエステル基 (カルボン酸エステル、炭酸エステル、スルホン酸エステル、スルフィン酸エステルを含む）、アミド基（カルボン酸アミド、ウレタン、スルホン酸アミド、スルフィン酸アミドを含む）、エーテル基、チォエーテル基、ジスルフイド基、アミノ基、イミド基などが挙げられる。上記の官能基はさらに置換基を有していても良ぐ Lはこのような官能基を複数個有してもよい。 Lが官能基を複数個有する場合には、それらの官能基は同一でも異なって、てもよ、。

[0020] 官能基として好ましくは、エステル基、アミド基、エーテル基、チォエーテル基、ジスルフイド基又はアミノ基であり、さらに好ましくはァルケ-ル基、エステル基、エーテル基である。

[0021] Rで表わされるその他の有機性基としては、任意の基が挙げられる力好ましくはメトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、 n—プロポキシ基、 t—ブトキシ基、 n—ブトキシ基などのアルコキシ基及びフエノキシ基である。これらのアルコキシ基及びフエノキシ基はさらに置換基を有して、てもよ、が、各置換基の合計の炭素数は 8以下であることが好ましい。本発明に用いられる表面修飾剤は、アミノ基、カルボキシル基などと、酸又は塩基とが形成した塩でもよい。

[0022] 一般式 [I]で表される化合物の分解生成物とは、アルコキシ基が加水分解した水酸化物、水酸基同士間の脱水縮合反応により生成した低分子量のオリゴマー (これはリニァ構造、環状構造、架橋構造などいずれであってもよい）、水酸基と未加水分解のアルコキシ基による脱アルコール縮合反応生成物、これらがさらに脱水縮合反応して形成したゾル、及びゲルをいう。

[0023] 表面修飾剤の具体例としては、 N— (2 アミノエチル） 3 ァミノプロピルメチルジメトキシシラン、 N— (2 アミノエチル） 3 ァミノプロピルトリメトキシシラン、 N— (

2 アミノエチル） 3 ァミノプロピルトリエトキシシラン、 3 ァミノプロピルトリメトキシシラン、ァミノフエニルトリメトキシシラン、 3—ァミノプロピルトリエトキシシラン、ビス（トリメトキシシリルプロピル）ァミン、 N— (3—ァミノプロピル）一ベンズアミドトリメトキシシラン、 3—ヒドラジドプロピルトリメトキシシラン、 3—マレイミドプロピルトリメトキシシラン、（ p カルボキシ）フエニルトリメトキシシラン、 3—カルボキシプロピルトリメトキシシラン、

3—ァミノプロピルチタニウムトリプロポキシド、 3—ァミノプロピルメトキシェチルチタ- ゥムジェトキシド、 3—カルボキシプロピルチタニウムトリメトキシドが挙げられる力これらに限定されない。

[0024] 本発明に用いられる表面修飾剤は、末端の NH基又は COOH基の代わりに、これ

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らの基が酸又は塩基と形成した塩を有していてもよい。また、本発明に使用する表面修飾剤は、ナノ粒子蛍光体の母粒子の表面全体を被覆していても、その一部に結合していてもよい。また、本発明において表面修飾剤は、単独で用いても複数併用してもよぐナノ粒子表面において合成してもよい。

[0025] なお、上記表面修飾剤にカ卩えて、公知の表面修飾剤（例えば、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン（1)ラウリルエーテルリン酸、ラウリルエーテルリン酸、トリオクチルホスフィン、トリオクチルホスフィンォキシド、ポリリン酸ナトリウム、ビス（2—ェチルへキシル)スルホこはく酸ナトリウムなど）をナノ粒子合成時、あるいは合成後併用してもよい。

[0026] [2]金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子蛍光体

金属酸ィ匕物又は金属硫ィ匕物中の金属としては、 Znなどの ΠΒ族、 Y、 Eu、 Tbなどの ΙΠΑ族、 Ga、 Inなどの ΠΙΒ族、 Zr、 Hfなどの IVA族、 Si、 Geなどの IVB族、 V、 Nbなどの VA族、 Mo、 Wなどの VIA族などの元素が挙げられる。該金属は生体にやさしい Z nが特に好ましい。また、該金属酸化物は Zn SiO、 CaSiO、 MgWO、 YVO、 Y S

2 4 3 4 4 2 iOなどの複合金属酸ィ匕物であってもよい。

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[0027] さらに、これらの金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子蛍光体は、金属酸化物又は金属硫化物中の金属とは異なる金属のイオンを少量含有することも好ましい。該金属イオンとしては、 Mn、 Cu、 Eu、 Tb、 Tm、 Ce、 Al、 Agなどの金属のイオンが挙げられる。これらの金属イオンは、塩ィ匕物イオンやフッ化物イオンを組み合わせたィ匕合物として金属酸化物又は金属硫化物中にドープされることも好ま U、。ドープする金属イオンは 1種類でも、複数種類でもよい。該金属イオンの最適濃度は、金属酸化物又は金属硫化物の金属の種類および、該金属イオンの種類によって異なる力金属イオンの濃度は 0. 001〜10原子％の範囲が好ましぐ 0. 01〜10原子％の範囲がより好まし、。

[0028] 本発明におけるナノ粒子蛍光体の発光の半値幅は 50〜200nmである力簡易な装置で高感度に発光を検出するためには、発光の半値幅が 60〜180nmであることが好ましい。更に、蛍光標識材料には発光ピーク波長と吸収ピーク波長が異なることが必要で、高感度に発光を検出するためには、本発明の金属酸化物又は金属硫ィ匕物のナノ粒子蛍光体の発光ピーク波長と発光ピークに近い側の吸収端波長との差が 20nm以上であることが好ましぐ 50nm以上であることがより好ましい。このような発光のピーク波長および半値幅を持つナノ粒子蛍光体は、金属酸化物又は金属硫ィ匕物中の金属等を上記条件を満足するように選択することで得ることができる。

本発明におけるナノ粒子蛍光体は、さらに、本発明に用いられる表面修飾剤に修飾されやす、ことが好ま U、。

[0029] 本発明におけるナノ粒子蛍光体の数平均粒径は、好ましくは 0. 5〜100nmであり、より好ましくは 0. 5〜50nmであり、さらに好ましくは l〜10nmである。ナノ粒子蛍光体の粒径分布に関しては、変動係数が好ましくは 0〜50%、より好ましくは 0〜20 %、さらに好ましくは 0〜10%である。なお、変動係数は、算術標準偏差を数平均粒径で除した商を百分率で表した値 (算術標準偏差 X looz数平均粒径)を意味する

[0030] [3]ナノ粒子蛍光体およびその分散液の製造方法

金属酸化物であるナノ粒子蛍光体は、蛍光体に含有されるべき金属を含むアルコキシド、ァセチルァセトナートなどの有機金属化合物を加水分解するゾルーゲル法、前記金属の塩の水溶液にアルカリを加えて金属水酸化物を沈降させた後、これを脱水、ァニールする水酸化物沈殿法、前記金属の塩の溶液に超音波を照射する超音波分解法、高温高圧下で前記金属の塩の分解反応を行なうソルボサーマル法、前記金属の塩の溶液を高温で噴霧するスプレーパイロリシスなどの液相合成法により得ることができる。また、有機金属化合物を用いる熱 CVD法やプラズマ CVD法、前記金属または前記金属の酸ィ匕物のターゲットを用いるスパッタ法ゃレーザーアブレーシヨン法などの気相合成法によってもナノ粒子蛍光体を得ることができる。

[0031] 金属硫化物であるナノ粒子蛍光体は、蛍光体に含有されるべき金属を含むジェチルジチォカルバメートィ匕合物などの熱分解性金属化合物からトリアルキルホスフィンォキシド類、トリアルキルホスフィン類、 ω—アミノアルカン類などの高沸点有機溶媒中で金属硫ィ匕物の結晶を成長させるホットソープ法、前記金属の塩の溶液に硫化ナトリウムや硫ィ匕アンモ-ゥムなどの硫ィ匕物溶液を添加して金属硫ィ匕物の結晶を成長させる共沈法、前記金属の塩の溶液に界面活性剤を添加し、得られた原料水溶液をアルカン類、エーテル類、芳香族炭化水素などの非極性有機溶媒中に添加して逆ミセルを形成し、該逆ミセル中で金属硫ィ匕物の結晶を成長させる逆ミセル法などの液相合成法により得ることができる。また、前記金属酸化物ナノ粒子蛍光体の場合と同様に気相合成法によっても金属硫ィ匕物ナノ粒子蛍光体を得ることができる。

[0032] 上述した表面修飾剤は、ナノ粒子蛍光体の合成時に反応系に添加することもできる力好ましくは合成後に添加し、合成により得られたナノ粒子蛍光体の母粒子の少なくとも一部を加水分解して、該母粒子と結合し、ナノ粒子の表面の少なくとも一部を被覆 (表面修飾)する。なお、ナノ粒子蛍光体の母粒子を遠心分離やろ過などの常法により洗浄、精製後、本発明に用いられる表面修飾剤を含有する溶媒 (好ましくはメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、 2—エトキシエタノールなどの親水性有機溶媒)に該母粒子を分散させて母粒子を表面修飾剤で被覆してもよヽ。

[0033] 表面修飾剤の添加量は、蛍光体の粒子サイズ、粒子の濃度、表面修飾剤の種類 ( 大きさ、構造)等により変動するが、表面修飾剤のモル数は、金属酸化物又は金属硫化物のそれの好ましくは 0. 001〜10倍、より好ましくは 0. 01〜2倍である。

[0034] 前述した通り、公知の表面修飾剤を一般式 [I]で表される表面修飾剤と併用することができる。公知の表面修飾剤のモル数は、特に制限はないが、金属酸化物又は金属硫化物のそれの好ましくは 0. 01〜： LOO倍、より好ましくは 0. 05〜10倍である。

[0035] 表面修飾剤が母粒子に結合したナノ粒子蛍光体の分散液において、ナノ粒子の濃度は、蛍光強度によって異なるので特に限定されないが、 0. OlmM〜： LOOOmM力 S 好ましぐより好ましくは 0. ImM〜： LOOmMである。分散媒としては、アルコール類、 DMF、 DMSO、 THFなどの親水性有機溶媒や水が好ましい。

[0036] なお、ナノ粒子蛍光体の表面が表面修飾剤で被覆されてヽることは、 FE-TEM 等の高分解性 TEMで蛍光体を観察した際に粒子間に一定の間隔があることを確認することにより、および蛍光体の化学分析により確認することができる。

[0037] 一般式 [I]で表される表面修飾剤の被覆層を有するナノ粒子蛍光体では、その表面修飾剤の末端基であるアミノ基ゃカルボキシル基などの反応基がアミド化反応等により核酸 (単量体やオリゴヌクレオチド等）、抗体 (モノクローナルやポリクローナル）や、その他のタンパク質 (アミノ酸)や多糖類などの親和性分子と共有結合を形成することができ、前記反応基が結合部として作用することができる。この結果、ナノ粒子蛍光体は特定の生体内分子などに対する蛍光標識物質として作用することが可能になる。

[0038] 標識を付される物質としては、抗体、タンパク、ペプチド、酵素基質、ホルモン、リンフォカイン、代謝産物、レセプター、抗原、ハプテン、レクチン、アビジン、ストレプタビジン、トキシン、炭水化物、多糖類、核酸、デォキシ核酸、誘導核酸、誘導デォキシ核酸、 DNAフラグメント、 RNAフラグメント、誘導 DNAフラグメント、誘導 RNAフラグメント、天然薬物、ウィルス粒子、バクテリア粒子、ウィルス成分、イースト成分、血液細胞、血液細胞成分、バクテリア、バクテリア成分、天然若しくは合成脂質、薬物、毒薬、環境汚染物質、重合体、重合体粒子、ガラス粒子、プラスチック粒子、重合体膜などを含む物質を挙げることができる。

[0039] アミドィ匕反応は、カルボキシル基あるいはその誘導基 (エステル、酸無水物、酸ノ、口ゲンィ匕物など）とァミノ基の縮合により行なわれる。酸無水物や酸ハロゲン化物を用いる場合にはこのような化合物と共に塩基を共存させることが好ま、。カルボン酸のメチルエステルやェチルエステルなどのエステルを用いる場合には、生成するアルコールを除去するために反応系の加熱や減圧を行なうことが望まヽ。カルボキシル基を直接アミド化する場合には、 DCC、 Morpho— CDI、 WSCなどのアミド化試薬、 H BTなどの縮合添加剤、 N—ヒドロキシフタルイミド、 p— -トロフエ-ルトリフルォロアセテート、 2, 4, 5—トリクロ口フエノールなどの活性エステル剤などのアミドィ匕反応を促進する物質を蛍光体と共存させたり、カルボキシル基を有する粒子又は標識化合物と活性エステル化剤を別途反応させ、その後にアミドィ匕反応を行ってもよい。また、ァミド化反応時、アミド化により蛍光体に結合させる親和性分子のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを常法に従って適当な保護基で保護し、反応後脱保護することが望ましい。

[0040] アミドィ匕反応により親和性分子が結合したナノ粒子蛍光体は、ゲルろ過などの常法により洗浄、精製後、水または親水性溶媒 (好ましくはメタノール、エタノール、イソプロバノール、 2—エトキシエタノールなど）に分散させて、得られた分散液を蛍光検出に使用する。この分散液中のナノ粒子蛍光体の濃度は、所望の蛍光強度によって異なるので特に限定されないが、 10— iM lO— ¹⁵Mが好ましぐより好ましくは 10— ²M〜1 0— ^1QMである。

[0041] [4]蛍光色素

本発明にかかるナノ粒子蛍光体の表面には、蛍光体に結合可能な他の機能性物質として他の蛍光色素を直接結合させることができる。この場合、ナノ粒子蛍光体が励起することによってエネルギーが蛍光体力蛍光体の表面に結合している他の蛍光色素に移動して蛍光体と他の蛍光色素を同時に発光させることができる。ここで使用可能な蛍光色素は、ナノ粒子蛍光体力の可視域の光で励起して可視域で蛍光発光することができる色素であることが好ましく、 400nmから 800nmの間に蛍光スぺタトル極大を有する色素であることがより好ま、。

このような蛍光色素としては、シァニン系色素（例えば、 CyDyeTMシリーズの Cy3、 Cy5等）、フルォレセイン系色素、ローダミン系色素、インビトロジェン社の Alexa色素シリーズ、 BODIPY色素シリーズ、 TexasRed色素シリーズ、 WO01Z021624号のィ匕合物例 1—1から 1— 74に記載されたァザシァニン系色素などを挙げることができる。

[0042] 蛍光色素を複数種併用する場合には、同時に蛍光を測定して標的物質を容易に検出するために、これらの蛍光色素の蛍光発光の波長が異なることが好ましい。蛍光色素の蛍光波長を短い順に並べたときに、一つの蛍光色素の蛍光発光のピーク波長と次の蛍光色素の蛍光発光のピーク波長の差力 15〜250nmであることがより好ましぐ 40〜150nmであることがさらにより好ましい。

また使用する蛍光色素は、エネルギー移動により、波長の短い蛍光から波長の長 Vヽ蛍光へ順次蛍光を発することが好ま、。このような組み合わせとしては例えば A1 exa488、 546、 594、 647の組み合わせが挙げられる。本発明はこの組み合わせに限らず、第一の蛍光色素と、この第 1の蛍光色素の蛍光スペクトルの極大の波長より 15nm以上長い波長に吸収帯を有する第二の蛍光色素とを選択することにより同様な測定が可能である。第三、第四の色素を用いる場合も同様にしてこれらの色素を選択することができる。

[0043] ナノ粒子蛍光体と蛍光色素との結合を形成するための反応方法は、蛍光色素の種類に応じて異なるが、ナノ粒子蛍光体と連結体との結合を形成するためのそれと同様に、当業者が容易に選択することができる。

[0044] 蛍光検出方法

図 1は、上述のナノ粒子蛍光体を蛍光物質として含有する試料の蛍光を、本発明の蛍光検出方法により検出するための装置の概略構成を示す図である。

この装置は、試料 10を担持する固相担体としての基板 12、試料 10に紫外領域の励起光 14を照射する励起光源 16、基板 12に対し励起光源 16とは反対側に配置され、且つ試料 10から発生した可視領域の蛍光 18を検出する高感度 CCDカメラ等の撮像素子 20、及び基板 12と撮像素子 20との間に配置される UVカットフィルタ 22を備えている。また、この装置は、パーソナルコンピュータ等で構成された制御装置 28 、励起光源 16用のコントローラ 24、及び撮像素子 20用の 26を備え、励起光源 16及び撮像素子 20はそれぞれコントローラ 24、 26を介して制御装置 28に電気的に接続され、制御装置 28により各々駆動、制御されている。

[0045] 基板 12には、試料 10から発生した可視領域の蛍光 18に対して透明な (蛍光 18をとおす)榭脂フィルム、ガラス基板等が使用される。この基板は、波長 250nm以下の紫外領域に吸収帯を有していないことが好ましい。また、前記榭脂フィルムとしては、公知の榭脂フィルムを使用することができるが、充分な強度と平滑な表面を有することが好ましい。また、 DNAの解析に蛍光指示薬を使用するためには、榭脂フィルムは無蛍光性であることが好まし、。

[0046] 高強度の榭脂フィルムとしては、一般的にエンジニアリング 'プラスチックスと呼ばれる機械的強度の高い樹脂のフィルムを使用することができる。例えば、化学工業日報社発行の「エンジニアリング 'プラスチックス（改訂第 3版、昭和 60年発行)」に記載の榭脂フィルムをいずれも基板 12として使用することができる。

[0047] 上記高強度の榭脂フィルムの中でも、例えば、セルロースアセテートブチレート、セルローストリアセテート、セルローストリブチレート、ポリアセタール、ポリアミド (脂肪族ポリアミドゃァラミドなどの芳香族ポリアミドを含む）、ポリアミドイミド、ポリアリレート、ポリイミド、ポリエーテルイミド（PEI)、ポリエーテルエーテルケトン（PEEK)、ポリエーテルサルフォン（PES)、ポリエチレンテレフタレート（PET)、ポリエチレンナフタレート（ PEN)、ポリカーボネート、ポリサルフォン（PSF)、ポリスチレン、ポリセルローストリアセテート、ポリフエ-レンサルファイド（PPS)、ポリフエ-レンォキシド（PPO)、ポリべンゾォキサゾール、非晶ポリアタリレート (PAR)等力基板として特に好適に使用される。

[0048] また、無蛍光性の榭脂フィルムはポリマー骨格に芳香族基が含まな、ことが好ましく、具体的には、ポリメチルメタタリレート、セルロースアセテートブチレート、セルローストリアセテート、セルローストリブチレート、ポリアセタール、ポリアミドなどが好ましい

[0049] さらに、エポキシ榭脂、アクリル榭脂、ウレタン榭月旨、フエノール榭脂、スチレン系榭脂、ビュル系榭脂、ポリエステル榭脂、ポリアミド系榭脂、メラミン系榭脂、フオルマリン榭脂などの合成樹脂も、基板 (固相担体)の材料として使用することができる。

[0050] 励起光源 16は紫外領域の励起光 14を射出し、励起光源 16としては、ブロードな発光スペクトルを有する紫外線ランプ等のランプ光源が好適に使用される。紫外線ランプとしては、水銀灯やハロゲンランプ等を用いることができる力輝度が高い点で、ハロゲンランプが特に好まし、。

[0051] 上記の装置では、制御装置 28からの制御信号に基づいて、コントローラ 24により励起光源 16が駆動され、紫外領域の励起光 14が基板 12上の試料 10に照射される。励起光 14の照射により、試料 10に蛍光物質として含有されるナノ粒子蛍光体が励起され、可視領域の蛍光 18が発生する。発生した蛍光 18は、基板 12及び UVカットフィルタ 22を透過して、撮像素子 20によって検出される。一方、照射された励起光 1 4の一部は、基板 12を透過するが、 UVカットフィルタ 22で遮断され、撮像素子 20には到達しない。こうして撮像素子 20で撮像された蛍光画像は、図示しないアナログ Z デジタル (A/D)変換回路によりデジタルデータに変換され、該データはコントローラ 26を介して制御装置 28に入力され、画像処理される。

[0052] 以上の通り、本実施の形態では、ブロードな発光スペクトルを有するナノ粒子蛍光体を用いて、るため、励起光源に単一波長の光を発生するレーザ光源を用いなくても、可視領域において任意の波長の蛍光を高感度、安価且つ簡便に検出することができる。

[0053] また、励起光は紫外領域の光であり、検出する蛍光は可視領域の光である。従って、基板の撮像素子側に UVカットフィルタ等を配置することにより、蛍光と励起光を容易に分離することができ、ノックグラウンド 'ノイズの量が低減されて、検出信号の SZ N比が向上する。

[0054] 更に、励起光源としてブロードな発光スペクトルを有するランプ光源を使用することで、単一の励起光源で複数の蛍光物質を励起することも可能である。

[0055] なお、上記の実施の形態では、基板と撮像素子との間に UVカットフィルタを配置し、この UVカットフィルタにより、基板を透過した励起光を遮断する例について説明したが、基板自体が励起光を遮断する機能を備えていてもよい。また、基板と UVカットフィルタとを一体化してもよ、。

[実施例]

[0056] 以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

蛍光検出装置

図 2に示すように、暗室 30内に、 CCDカメラ 32とディスプレイ（図示せず）を備えたルミノ'イメージアナライザー「LAS-1000plus (R)」（富士写真フィルム社製）を設置した。この CCDカメラ 32の真下に紫外線透過トレー 36を設置した。また、紫外線透過トレー 36に向けて紫外線が照射されるように、紫外線透過トレー 36の下方に紫外線ィルミネータ 38を設置した。紫外線イルミネータ 38としては「Mini Transilluminatior NT M- 10 (R)」（フナコシ社製)を使用した。紫外線透過トレー 36上には紫外線をとおす基板 34が置かれ、基板 34の上面に蛍光物質 (酸ィ匕亜鉛ナノ粒子) 40が担持された。 CCDカメラ 32の画像データは、画像解析ソフト「Image Gauge (R)」（富士写真フィルム社製）により解析された。なお、 CCDカメラ 32による撮像画像は、ルミノ'イメージアナライザーのディスプレイに表示された。

実施例 1

[0057] 表面修飾された金属酸化物ナノ粒子蛍光体の合成

酢酸亜鉛 2水和物 8. 8gを脱水エタノール 400mlに溶解し、得られた溶液を 93°C で 2時間還流しながら 240mlの溶媒を留去した。得られた反応液に脱水エタノール 2 40mlをカ卩えて、得られた混合物を室温まで冷却した。水酸ィ匕テトラメチルアンモ-ゥムの 25質量％メタノール溶液 18mlを混合物に添加し、得られた系を 30分攪拌した。 3—ァミノプロピルトリメトキシシラン 7. 2mlおよび水 2. 2mlを系に添カ卩して、得られたものを 60°Cで 4時間攪拌した。生成した白色沈殿を濾別し、エタノールで洗浄し、乾燥した。

[0058] 沈殿物は XRDおよび TEMの解析から平均粒子径約 4nmの酸化亜鉛（ZnO)ナノ粒子であることがわかった。また、 ZnOナノ粒子はケィ素（Si)およびァミノプロピル基が結合した表面を有して、ることを元素分析、 IR分光吸収測定法により確認した。

[0059] 沈殿物に水を添カ卩して 1. 0 X 10— ⁴M力ら 1. 0 X 10— ⁹Mまで水分散液中の ZnOナノ粒子の濃度の異なる水分散液を調製し、ァミノプロビルシランで表面処理した ZnOナノ粒子の各分散液を、厚さ lmmの石英基板（25. 4mm X 76. 2mm)上に滴下した

[0060] 各水分散液の滴下スポット (2 μ 1)を保持した石英基板を基板 34として、図 2に示す装置の紫外線透過トレー 36に載置し、基板 34に紫外線イルミネーター 38の紫外光を 0. 5秒照射し CCDカメラ 32によりスポットの蛍光を撮像した。画像解析の結果、 Zn Oナノ粒子の濃度が 1. 2 X 10— ⁸M以上の場合に、高感度で蛍光を検出することができた。即ち、本発明では前記濃度が 1. 2 X 10— ⁸Mと希薄な場合でも、蛍光を高感度で検出できた。

実施例 2

[0061] (1)ナノ粒子作成と粒子表面のアミノィ匕（ZnO-APSの合成）

酢酸亜鉛 2水和物（5. 49g、 25ミリモル（mmol) )に脱水エタノール（250ミリリットル (ml) )をカ卩え、ディーン 'スターク（Dean-Steark)脱水装置にて溶媒を留去しながら穏やかに 2時間得られた溶液を加熱還流した。留去された溶媒の量は 150mlであった。白濁した反応液に脱水エタノール 150ml添カ卩して、得られた混合物を加熱還流し、透明になった反応液を室温まで水冷した。

[0062] 該反応液にテトラメチルアンモ-ゥムヒドロキシド（25% メタノール溶液、 11. 4ml 、 28mmol)を添加して得られた混合物を室温にて 15分間攪拌した。

[0063] 続いて 3—ァミノプロピルトリメトキシシラン（4. 7ml、 25mmol)と水（1. 5ml、 83. 3 mmol)を混合物に添加して、得られたブレンドを 60°Cにて 4時間攪拌した。反応開始 7分後に白色固体が析出した。反応液を室温まで水冷した後、固体を吸引ろ過し、エタノールで洗浄した。得られた白色粉末を減圧下で乾燥すると表面がァミノ化された酸化亜鉛ナノ粒子が得られた。収量は 6. Ogであった。

本処方により合成したナノ粒子を溶媒に分散した分散液は分散液中のナノ粒子の含有率が 10質量％(wt%)の場合でも透明であり、ナノ粒子は分散液中に良好に分散されていた。粉末 X線回折空間群 P6 mcに属する六方昌系（ウルッ鉱型)酸ィ匕亜

3

鉛の標品のピークパターンと得られたナノ粒子のそれが一致し、ナノ粒子の粒径は 3 nmであつ 7こ。 [0064] (2)脱塩

上記粒子 200mgを蒸留水 10mlに溶解し、「Sephadex G25 (R)」を充填したカラムを用いて、得られた脱塩水溶液のゲルろ過を行った。以降の反応では全て該脱塩水溶液を使用した。

(3)蛍光強度

上記粒子に水を添加し、 340nmにおける吸光度が 0. 50である水溶液を調製した。実施例 1と同様にしてこの水溶液の蛍光を検出し、蛍光スペクトルの面積値を測定した。比較のために、クウオンタム'ドット（Quantum dot)社製の「Q- dot655 biotin conj ugatejの水溶液を前記ナノ粒子の水溶液と同様に調製して、この水溶液の蛍光を検出し、蛍光スペクトルの面積値を測定した。結果を表 1に示す。

[0065] [表 1]

[0066] 表 1から明らかなように、本発明に係るナノ粒子蛍光体を用いる蛍光検出法は、従来知られて!/ヽるナノ粒子を用いた検出法よりも強ヽ蛍光を示す。

実施例 3

[0067] (1)酸化亜鉛ナノ粒子の合成

酢酸亜鉛 2水和物（2. 2g, lOmmol)に脱水エタノール（100ml)をカ卩え、 Dean- St eark脱水装置にて溶媒を留去しながら穏ゃ力に 2時間得られた溶液を加熱還流した。留去された溶媒の量は 60mlであった。白濁した反応液を脱水した後に、 EtOHを 60ml反応液に添加して、得られた混合物を加熱還流を行い、透明になった反応液を室温まで水冷した。該反応液にテトラメチルアンモ-ゥムヒドロキシド（25%メタノール溶液、 4. 05ml, lOmmol)を添カ卩して、得られた混合物を室温にて 4時間攪拌し続いて 2— (トリメトキシシリルェチル）ピリジン（2. 27g, lOmmol)と水（0. 55ml, 3 Ommol)を混合物に添加して、得られたものを 60°Cにて 4時間攪拌を行い、酸ィ匕亜鉛ナノ粒子分散液を得た。

[0068] (2)化合物 1の合成

無水マレイン酸 (1. 6g, 16. 3mmol)に脱水ァセトニトリル（16ml)および 3—ァミノ —1—プロパノールを加え、得られた混合物を 60°Cで 3時間撹拌した。溶媒を留去後、残查を酢酸ェチルで洗浄し、白色結晶（2. 6g,収率 93%)を得た。得られた白色結晶をトルエンに溶解し、得られた溶液を 5時間加熱還流した。上澄を留去して、無色透明の液体（76mg,収率 17%)を得た。この液体をジクロロメタンに溶解し、得られた液を 0°Cに保ち、トリェチルァミン（55mg, 0. 5mmol)および p—トルエンスルホユルクロリド（95mg, 0. 5mmol)を該液に加えた。その後、該液を室温に戻し、 21時間撹拌した。得られた反応溶液を水に注ぎ、生成物を酢酸ェチルで抽出した。有機相を水および飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより有機層を乾燥後、溶媒を留去した。残查をカラムクロマトグラフィーにより精製し、下記化合物 l (78mg,収率 56%)を得た。

[0069] [化 1]

(3)化合物 2の合成

ポリエチレングリコール 350モノメチルエーテル（5. Og, 14mmol)をジクロロメタン（ 50ml)に溶解し、得られた溶液にトリェチルァミン（2. 4ml, 17mmol)および p—トルエンスルホ-ルクロリド（3. Og, 16mmol)をカ卩え、得られた混合物を室温で 18時間撹拌した。溶媒を留去後、残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、下記化合物 2 (6. 12g,収率 87%)を得た。

[0071] [化 2]

[0072] (4)酸化亜鉛ナノ粒子の表面修飾及び色素の粒子への結合

1)化合物 1およびブロモ酢酸による表面修飾

上記工程 (1)で得られた酸化亜鉛ナノ粒子分散液 (3ml)を容器に入れ分散液からエタノールを留去した後に、脱水ァセトニトリル（lml)およびィ匕合物 1 (3 lmg, 0. lm mol)を得られた残渣に加え、得られた混合物を 60°Cで 2時間撹拌した。次に、プロモ酢酸（28mg, 0. 2mmol)を系に加え、得られたブレンドを 60°Cで 1時間撹拌した。溶媒を留去後、残渣をゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより精製し、酸化亜鉛ナノ粒子水溶液を得た。ここで得られた酸ィ匕亜鉛ナノ粒子はマレイミド基が結合した表面を有して、ることを元素分析、 IR分光吸収測定法により確認した。

[0073] 2)マレイミド基への色素 1の結合

上述の該ナノ粒子分散液（lml)に緩衝液（lml, 0. 1Mの MES, pH6. 6)および下記色素 1 (lmg, 1. 95 mol)を加え、得られた混合物を室温で 2時間撹拌した。次に、得られた系をゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより精製し、下記色素 1が結合した酸ィ匕亜鉛ナノ粒子分散液を得た。なお、酸化亜鉛ナノ粒子の表面への色素 1 の結合は、元素分析、 IR分光吸収測定法により確認した。

[0074] [化 3]

[0075] (5)酸ィ匕亜鉛ナノ粒子の化合物 1およびィ匕合物 2による表面修飾

上記工程 (1)で得られた酸化亜鉛ナノ粒子分散液 (3ml)を容器に入れ分散液からエタノールを留去した後に、脱水ァセトニトリル（lml)およびィ匕合物 1 (3 lmg, 0. lm mol)を残渣に加え、得られた混合物を 60°Cで 2時間撹拌した。次に、化合物 2 (99 mg, 0. 2mmol)を得られた系に加え、 60°Cで 3時間撹拌した。溶媒を留去後、残渣をゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより精製し、酸ィ匕亜鉛ナノ粒子水溶液を得た。ここで得られた酸ィ匕亜鉛ナノ粒子はマレイミド基及びィ匕合物 2からメシレート基が離脱したポリエチレングリコール構造が結合した表面を有して、ることを元素分析、 IR分光吸収測定法により確認した。

実施例 4

[0076] 抗テオフィリン抗体連結表面 PEG化酸化亜鉛ナノ粒子の蛍光検出

(1)表面 PEG化酸ィ匕亜鉛ナノ粒子と抗テオフイリン抗体の連結

HC1-NH—PEG— COOH (MW= 5000 :NEKTAR社製；) 50mgを0. 1Μ (ρΗ8

2

. 0) HEPES緩衝液に溶解し、 5. Omgの N— (2—マレイミドエチルォキシ）コハク酸イミドを得られた溶液に添加し室温で 6時間反応を行った。平均直径 3nmの酸ィ匕亜鉛粒子表面をァミノプロビルシランで被覆したナノ粒子を、濃度 14mgZmlで 0. 1M の HEPES (pH7. 0)緩衝液に分散した。このナノ粒子分散液 lmlに上記マレイミドィ匕 PEG溶液 100 1と、 5mgの WSC (1— ethyl— 3— ( 3 - dimethylaminopropyl) carbo diimide, hydrochloride)を加えて室温で反応を行った。 30分後、 CH O (CH CH O)

3 2 2 nCH COOH (平均分子量 350) lOmgを反応液に添カ卩して 6時間反応を行った。 P

2

D— 10カラム（フアルマシアバイオサイエンス社)で生成物を精製し、マレイミド基を導入した表面 PEG化酸化亜鉛ナノ粒子分散液を得た。この粒子は 460nm (励起： 373 nm)に蛍光極大を有していた。

抗テオフィリン抗体をペプシン処理、メルカプトェチルァミン還元することにより得た精製した Fab，分画溶液 1. 5ml (25mM、 pH7. 2、 HEPES緩衝液； 1. 6mg/ml) を、マレイミドィ匕酸ィ匕亜鉛ナノ粒子分散液（lOmgZml) 200 1と混合し、室温で一晚反応を行った。反応系を攪拌した後、生成物を SephadexG100 (pH7. 4、 0. 1 Mの HEPES緩衝液で溶離)でゲルろ過により精製し、 Fab，連結 PEG化酸化亜鉛ナノ粒子を得た。

[0077] (2)テオフィリン結合石英基板の作成と蛍光ナノ粒子の検出

合成石英基板 (信越化学製)を 0. 1%トリメトキシァミノプロビルシラン (信越化学)水溶液に 1時間浸漬した後、表面の水滴を窒素ガスで除去し表面アミノ化石英基板を作成した。 Theophylline- 8- Butanoic Acid (Sigma社製） 35mg、 WSC (同仁化学製） 3 Omg、 Sulfo- NHS (Pierce社製）30mgをDMSO20mlに溶解し、この溶液にアミノィ匕石英基板を浸漬し、室温で一晩反応を行い、表面にテオフィリン部位を共有結合させた。精製水で表面を洗浄し、室温で風乾させた。この基板を、以下の実験に用いた。

Fab'連結 PEG化酸ィ匕亜鉛ナノ粒子 (ナノ粒子濃度 1. 0 X 10— ⁵M)分散液と、その 10倍、及び 100倍希釈液のそれぞれ 1 μ 1で石英基板をスポットし、室温で 30分静置後、精製水で洗浄した。表面の水滴を除き、紫外線 LED (励起光 365nm)を内蔵した LAS3000 (富士写真フィルム）でスポットの蛍光を測定した。その結果、ナノ粒子濃度に依存した強度の蛍光が観察された。また、紫外線照射 (5分間)を繰り返しても、観測される石英基板上の蛍光強度は変化せず、耐光性に優れた蛍光検出試薬であることを確認した。

図面の簡単な説明

[0078] [図 1]本発明の蛍光検出方法を実施するための装置の概略構成を示す図である。圆 2]実施例で蛍光検出に使用した装置の概略構成を示す図である。

Claims

請求の範囲

[I] 発光の半値幅が 50ηπ！〜 200nmであるナノ粒子蛍光体を蛍光物質として含有する試料に、紫外領域の励起光を照射し、該試料が発する可視領域の蛍光を検出する、蛍光検出方法。

[2] 前記ナノ粒子蛍光体が、下記一般式 (I)で表される化合物又はその分解生成物である表面修飾剤によって表面修飾された金属酸ィ匕物又は金属硫ィ匕物のナノ粒子蛍光体である請求項 1に記載の蛍光検出方法。

M—（R) [I]

4

[3] 前記ナノ粒子蛍光体が、他分子と結合する結合部を備えた請求項 1に記載の蛍光検出方法。

[4] 前記ナノ粒子蛍光体が、他分子と結合する結合部を備えた請求項 2に記載の蛍光検出方法。

[5] 前記蛍光をとおす基板上に保持された前記試料に励起光を照射し、前記基板を透過する蛍光を検出する請求項 1に記載の蛍光検出方法。

[6] 前記蛍光をとおす基板上に保持された前記試料に励起光を照射し、前記基板を透過する蛍光を検出する請求項 2に記載の蛍光検出方法。

[7] 前記蛍光をとおす基板上に保持された前記試料に励起光を照射し、前記基板を透過する蛍光を検出する請求項 3に記載の蛍光検出方法。

[8] 前記基板が励起光を遮断する機能を有する請求項 5に記載の蛍光検出方法。

[9] 前記基板が励起光を遮断する機能を有する請求項 6に記載の蛍光検出方法。

[10] 前記基板が励起光を遮断する機能を有する請求項 7に記載の蛍光検出方法。

[II] 前記基板の少なくとも一方の側に励起光を遮断する部材を設ける請求項 5に記載の蛍光検出方法。

[12] 前記基板の少なくとも一方の側に励起光を遮断する部材を設ける請求項 6に記載の蛍光検出方法。

[13] 前記基板の少なくとも一方の側に励起光を遮断する部材を設ける請求項 7に記載の蛍光検出方法。

[14] 前記基板が波長 250nm以下の紫外領域に吸収帯を有しない請求項 8に記載の蛍光検出方法。

[15] 前記基板が波長 250nm以下の紫外領域に吸収帯を有しない請求項 9に記載の蛍光検出方法。

[16] 前記基板が波長 250nm以下の紫外領域に吸収帯を有しない請求項 10に記載の蛍光検出方法。

[17] ランプ光源により紫外領域の励起光を照射する請求項 1に記載の蛍光検出方法。

[18] ランプ光源により紫外領域の励起光を照射する請求項 2に記載の蛍光検出方法。

[19] ランプ光源により紫外領域の励起光を照射する請求項 3に記載の蛍光検出方法。

[20] ランプ光源により紫外領域の励起光を照射する請求項 5に記載の蛍光検出方法。