KR100979463B1 - 니켈 결합 양자점을 이용한 히스티딘 표지 단백질의검출방법 - Google Patents

니켈 결합 양자점을 이용한 히스티딘 표지 단백질의검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 니켈 결합 양자점을 이용한 히스티딘 표지 단백질의 검출방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 카르복실기를 가지는 양자점을 제조하고, 이 표면에 니켈을 처리하여 세포 독성이 낮고 발광 효율이 좋은 양자점을 제조하여 양자점에 커플링 되어 있는 니켈이 특이 단백질에 표지된 히스티딘을 찾아 결합함으로써 단백질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
또한, 이러한 결합은 원하는 특정 단백질을 세포 또는 생체에서 특이적 결합하여 단백질의 이동 경로뿐만 아니라 이미징을 관찰하는 데 용이하다.
니켈, 양자점, 히스티딘, 단백질, 검출방법

Description

니켈 결합 양자점을 이용한 히스티딘 표지 단백질의 검출방법{Detection method of his-tagged protein by using Ni-QD}
본 발명은 니켈이 결합된 양자점을 이용한 히스티딘이 표지된 단백질의 검출방법에 관한 것이다.
최근 종양을 표적화하여 진단하는 방법이 다양하게 개발되고 있으며, 형광물질의 광학 영상을 이용하는 방법이 새롭게 개발되었다. 이때 사용되는 형광체는 유기물로만 이루어져 있어서 pH 또는 용해도 등의 환경적 요인에 의해 형광 강도가 크게 좌우될 뿐만 아니라, 빛의 노출에 따른 비가역적인 광표백 및 강한 소수성으로 인하여, 생체 내에서 사용되는데 한계를 갖는다. 따라서, 양자점을 이용한 생체 내 광학 영상을 얻어내는 일이 중요하다.
최근에는 양자점을 이용하여 새로운 약물 표적분자와 약효 평가 및 생체 내의 다양한 반응을 모니터링하고자 노력하고 있다. 기존의 유기형광물질 뿐만 아니라 양자점을 이용한 표적 물질 개발과 영상을 관찰하기 위해서는 이들 물질 표면에 각각의 특이적 결합을 할 수 있는 물질을 조작해야하는 번거로운 작업이 이루어지고 있다. 나노 입자를 이용하여 생체 또는 세포 내에서 일어나는 생물학적 변화를 분자 수준에서 실시간으로 관찰가능하고 생명현상 및 질환에 대한 분자 수준의 근원적 이해를 가능하게 한다. 하지만, 나노 입자 자체의 독성에 의해 세포/동물 모델에 적용하기가 어렵다. 그리고 수식되어 진 나노 입자의 세포내로 유입되어지는 기술을 극복해야 하는 과제를 안고 있다. 또한, 형광을 나타내는 나노입자의 개발 및 생체 내에서의 나노입자 특성을 장기간 유지 할 수 있는 형광물질을 개발하여야 한다. 개발되어진 나노입자를 이용하여 생체 영상을 관찰하기 위해서는 생체물질을 표면에 결합시켜 영상을 구현하여야 한다. 기존에 발표된 것들은 항체-항원 반응, 아비딘-바이오틴(avidin-biotin) 결합, 유전자의 상호 결합 및 펩타이드 결합 등을 적용하는 연구가 많이 이루어져왔다.
이에, 본 발명자들은 상기와 문제점을 해결하기 위하여 연구한 결과, 기존의 양자점 표면에 니켈을 처리하여 세포내의 히스티딘 결합 분자와의 특이적 결합에 의하여 표적 단백질을 신속하고 간편하게 검출함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 신속하고 간편하게 히스티딘이 표지된 단백질을 검출하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 니켈 결합된 양자점을 이용한 히스티딘 표지된 단백질의 검출방법을 그 특징으로 한다.
본 발명은 세포 독성이 낮고 발광 효율이 좋은 양자점을 이용하여 특이 단백질을 검출하는 방법으로서, 이러한 양자점의 개발은 유전체학, 단백체학, 메타볼로믹스, 세포/동물 병리학, 면역학, 신약 개발, 질병 진단뿐만 아니라 생체기능조절물질 연구에 지대한 영향을 미치게 될 것으로 기대된다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 카르복실기를 가지는 양자점을 제조하고, 이 표면에 니켈을 처리하여 세포 독성이 낮고 발광 효율이 좋은 양자점을 제조하여 양자점에 커플링 되어 있는 니켈이 특이 단백질에 표지된 히스티딘을 찾아 결합함으로써 단백질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
이와 같은 니켈 결합 양자점을 이용한 히스티딘 표지 단백질을 검출하는 방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다
먼저, 카르복실기를 가지는 양자점에 킬레이트를 이용하여 니켈을 결합시킨 니켈-킬레이트-양자점을 제작한다.
본 발명에 따른 양자점은 2B ~ 6B족 화합물 및 3B ~ 5B족 화합물 중에서 선택된 단일 화합물 또는 2종 이상의 화합물을 함유되어 이루어지며, 단일 코어(core) 혹은 코어/쉘(shall) 구조로 이루어질 수 있다.
상기 양자점으로 2B ~ 6B족 화합물은 CdS, CdSe, CdTe, ZnS, ZnSe 및 CdTeSe 중에서 선택된 화합물을, 3B ~ 5B족 화합물은 InP, InAs, GaP 및 GaN 중에서 선택 된 화합물을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 양자점은 1 ~ 10 nm의 크기를 사용하는 것이 세포내 단백질 검출에 유리하며, 가사광선의 발광을 하는 것이 적당하다. 특히, 본 발명에서 사용되는 양자점은 친수화 처리하여 수용성을 지니는 것이 바람직하며, 수용성은 싸이올이나 폴리머 등으로 코팅되어 있는 양자점이 더욱 바람직하며, 이렇게 코팅된 수용성 양자점 표면에는 카르복실기(-COOH)가 형성되어 아민기를 가지는 킬레이트와 양자점 간의 공유 결합시킨다.
상기 수용성 양자점은 싸이오 글리콜산, 머캡토벤조익산(mercaptobenzoic acid), 머캡토프로피오닉산(mercaptopropionic acid) 및 머캡토언데카노익산(mercaptoundecanoic acid) 중에서 선택된 1종 이상의 친수화 화합물을 사용하여 코팅된 것을 의미한다. 상기 친수화 화합물에 의해 양자점 표면이 음전하를 띄는 카르복실기를 가지므로 해서 양자점이 수용성을 가지게 된다. 상기 친수화 화합물은 양자점 1몰에 대하여 0.005 ~ 5 몰 범위로 사용하는 것이 바람직하다.
한편, 수용성 양자점의 표면에 실리카로 코팅하면 높은 양자 효율 및 안정성을 지니고 있어서 적은 농도에서도 강한 검출 효율을 보이므로 바이오 이미징 등과 같은 적은 농도를 이용하여 표적자로 사용하면 더욱 바람직하다. 양자점의 표면을 실리카로 코팅하기 위하여, TEOS(Tetra Ethyl Ortho Silicate), APS (Aminopropyltrimethoxysilane 또는 Aminopropyltriethoxysilane) 등을 출발원료로 이용하여 실리카 코팅하였다. 코팅 시 양자점 코어의 농도는 제조시 효율이 좋은 고농도, 구체적으로 2 ~ 64 mM이 바람직하며, 더 바람직하게는 4 ~ 32 mM이 유리하다. 특히, 실리카는 양자점 1몰에 대하여 0.001 ~ 10 범위의 몰비로 사용 하는 것이 더욱 바람직하다.
수용성 양자점 또는 실리카가 코팅된 수용성 양자점 표면에 니켈을 부착시키기 위해 킬레이트를 이용하는 것이 효율이 높다. 상기 킬레이트로는 이미노다이아세트산(IDA, iminodiacetic acid), 바이신코니닉산(BCA, bicinchoninic acid). N,N,N'-트리카르복시메틸에틸렌다이아민(TED, N,N,N'-tris(carboxymethyl)ethylenediamine) 또는 니트릴로트리아세트산(NTA, nitrilotriacetic acid)이 바람직하다. 이들 킬레이트는 니켈과 배위결합하여 전하를 띄고, 킬레이트와 결합하고 남은 니켈의 2개의 배위가 히스티딘에 존재하는 질소를 인식하여 단백질과 결합하게 된다. 이때, 수용성 양자점 : 킬레이트 : 니켈은 1 : 2 ~ 3 : 2 ~ 3 의 몰비가 바람직하다.
상기와 같이 니켈이 결합된 양자점을 제작한 후, 히스티딘이 표지된 단백질 또는 이 단백질이 존재하는 세포를 고정화하고, 상기 제작된 양자점을 첨가시켜 니켈과 히스티딘의 결합 여부를 확인한다.
이때, 히스티딘이 결합된 단백질 검출에 대한 양자점은 0.01 ~ 10 μM의 농도로 사용되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 5 μM 정도가 적당하다. 하지만, 이의 범위를 벗어나면 양자점의 신호가 약하거나 비특이적 결합이 발생하는 문제가 있다.
상기 결합 여부에 의해 히스티딘이 표지된 단백질을 검출한다.
상기에서 제작된 니켈 결합 양자점을 이용하여 세포독성 및 특이 분자 인식 실험을 하였다. 세포독성은 일정 농도로 양자점을 세포에 첨가하여 MTT 검색법 을 이용하여 50%의 세포를 죽도록 한 시료의 농도(0.09 ~ 0.15 mM)를 결정하였고, 니켈-히스티딘 결합특성을 이용하여 세포 내에 존재하는 표적분자를 검출하는 세포 이미징 실험을 하여 양자점의 활용도를 조사하였다.
그 결과, 상기에서 제작된 니켈 결합 양자점을 이용하여 히스티딘 표지 단백질을 신속하게 손쉽게 검출할 수 있었다.
이하, 본 발명은 실시예에 의거 상세히 설명하면 다음과 같은 바, 본 발명은 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 싸이올이 처리된 양자점 제조
(1) QD 제조
Cd(NO3)2ㆍ4H2O 0.4535 g을 도데실아민(Dodecylamine) 5 g과 트리옥틸포스핀 옥사이드(Trioctylphosphine oxide) 5 g이 혼합된 용액에 넣어서 녹인 후, Te 0.16 g을 트리옥틸포스핀 5 g에 녹인 용액을 첨가한 후 가열하여 CdTe 코어를 제조하였다. 제조된 코어를 클로로포름과 메탄올을 이용하여 원심분리를 통하여 분리 및 세척하였다. 제조된 코어에 CdS 쉘을 형성하기 위하여 제조된 코어를 도데실아민 20 g에 분산시킨 후, Cd(NO3)2ㆍ4H2O 0.907 g과 황 0.198 g을 트리옥틸포스핀 5 g에 각각 녹인 후, 두 용액을 코어가 분산된 도데실아민 용액에 넣고 가열하여 CdTe 표면에 CdS 쉘을 형성하였다. 제조된 코어/쉘을 클로로포름과 메탄올 을 이용하여 원심분리를 통하여 분리 및 세척하였다. 이렇게 제조된 양자점을 투과전자현미경을 통하여 크기 및 형상을 조사하였다.
(2) 싸이올로 표면 처리된 수용성 양자점 제조
상기 (1)에서 제조된 CdTe/CdS 양자점을 클로로포름 용액 20 ml에 분산시켰다. 싸이오글리콜릭산(Thioglycollic acid) 0.2 ml를 메탄올에 넣고 KOH로 pH 12 이상으로 조절하였다. 이 용액을 양자점이 분산된 클로로포름 용액에 넣고 잠시 교반 후 증류수 20 ml를 첨가하였다. 이 때 양자점은 증류수 쪽으로 흘러 들어가 두 층으로 분리되는데 이것을 분별 깔때기를 이용하여 분리하여 클로로포름이 없는 카르복실기를 가지는 수용성 양자점을 제조하였다.
(3) 광 특성 측정
상기 (2)에서 제조된 양자점의 UV-Vis 및 형광 스펙트럼은 1 cm의 큐벳에서 측정하였다. UV-vis 스펙트럼은 200 ~ 800 nm의 영역에서 측정하였으며, 형광 스펙트럼은 500 ~ 750 nm의 영역에서 여기 파장 390 nm와 480 nm에서 각각 측정하여 그 결과를 도 3과 도 4에 도시하였다.
양자효율은 Rhodamine 6G와 비교하여 계산하였고, 26.7%의 양자효율을 보였다.
(4) 니켈이 결합된 양자점 제조
상기 (2)에서 제조된 양자점에 니켈을 결합시키기 위해 킬레이트로 니트릴로트리아세트산(nitrilotriacetic acid, NTA)을 이용하였다. 10 mM EDC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride) 용액을 이용하여 카르복실기를 가지는 양자점 7.8 mM을 활성화시킨 후 10 mM NTA 용액과 혼합하여 실온에서 2 시간동안 반응시켜 두 물질을 공유 결합시키고(QD-NTA), 10 mM NiSO4를 공유결합되어진 QD-NTA와 반응시켜 니켈이 결합된 QD를 제조하였다(QD-NTA-Ni). 킬레이트와 니켈은 배위결합하여 전하를 띄고, 킬레이트와 결합하고 남은 니켈의 2개의 배위가 히스티딘에 존재하는 질소를 인식하여 단백질과 결합하게 된다.
이때, 수용성 양자점 : 킬레이트 : 니켈은 1 : 2 ~ 3 : 2 ~ 3의 몰비를 사용하였다.
반응이 일어나지 않고 남은 용액을 크기-배제 크로마토그래피를 이용하여 제거하였다.
실시예 2: 실리카가 코팅된 양자점 제조
(1) QD 제조
Cd(NO3)2ㆍ4H2O 0.4535 g을 도데실아민(Dodecylamine) 5 g과 트리옥틸포스핀 옥사이드(Trioctylphosphine oxide) 5 g이 혼합된 용액에 넣어서 녹인 후, Te 0.16 g을 트리옥틸포스핀 5 g에 녹인 용액을 첨가한 후 가열하여 CdTe 코어를 제조하였다. 제조된 코어를 클로로포름과 메탄올을 이용하여 원심분리를 통하여 분리 및 세척하였다. 제조된 코어에 CdS 쉘을 형성하기 위하여 제조된 코어를 도데실아민 20 g에 분산시킨 후, Cd(NO3)2ㆍ4H2O 0.907 g과 황 0.198 g을 트리옥틸포스핀 5 g에 각각 녹인 후, 두 용액을 코어가 분산된 도데실아민 용액에 넣고 가열하여 CdTe 표면에 CdS 쉘을 형성하였다. 제조된 코어/쉘을 클로로포름과 메탄올을 이용하여 원심분리를 통하여 분리 및 세척하였다. 이렇게 제조된 양자점을 투과전자현미경을 통하여 크기 및 형상을 조사하였다.
(2) 싸이올로 표면 처리된 수용성 양자점 제조
상기 (1)에서 제조된 CdTe/CdS 양자점을 클로로포름 용액 20 ml에 분산시켰다. 싸이오글리콜릭산(Thioglycollic acid) 0.2 ml를 메탄올에 넣고 KOH로 pH 12 이상으로 조절하였다. 이 용액을 양자점이 분산된 클로로포름 용액에 넣고 잠시 교반 후 증류수 20 ml를 첨가하였다. 이때 양자점은 증류수 쪽으로 흘러 들어가 두 층으로 분리되는데 이것을 분별깔때기를 이용하여 분리하여 클로로포름이 없는 카르복실기를 가지는 수용성 양자점을 제조하였다.
(3) 실리카 쉘 형성
상기 제조된 수용성 양자점에 TEOS(Tetra Ethyl Ortho Silicate) 0.8 ml를 넣고 여기에 암모니아수 0.4 ml를 투입하고 가열하여 실리카로 코팅된 양자점을 제조하였다. 수용성 양자점 1몰에 대해 실리카 0.005몰을 사용하였다.
(4) 광특성 측정
상기 (3)에서 제조된 양자점의 UV-Vis 및 형광 스펙트럼은 1 cm의 큐벳에서 측정하였다. UV-vis 스펙트럼은 200 ~ 800 nm의 영역에서 측정하였으며, 형광 스펙트럼은 500 ~ 750 nm의 영역에서 여기 파장 390 nm와 480 nm에서 각각 측정하여 그 결과를 도 3과 도 4에 도시하였다.
양자효율은 Rhodamine 6G와 비교하여 계산하였고, 38.8%의 양자효율을 보였다.
(5) Ni이 결합된 양자점 제조
상기 (3)에서 제조된 양자점에 니켈을 결합시키기 위해 킬레이트로 니트릴로트리아세트산(nitrilotriacetic acid, NTA)을 이용하였다. 10 mM EDC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride) 용액을 이용하여 카르복실기를 가지는 양자점 7.8 mM을 활성화시킨 후 10 mM NTA 용액과 혼합하여 실온에서 2 시간동안 반응시켜 두 물질을 공유 결합시키고(QD-NTA), 10 mM NiSO4를 공유결합 되어진 QD-NTA와 반응시켜 니켈이 결합된 QD를 제조하였다(QD-NTA-Ni).
킬레이트와 니켈은 배위 결합하여 전하를 띄고, 킬레이트와 결합하고 남은 니켈의 2개의 배위가 히스티딘에 존재하는 질소를 인식하여 단백질과 결합하게 된다.
이때, 수용성 양자점 : 킬레이트 : 니켈은 1 : 2 ~ 3 : 2 ~ 3의 몰비를 사용하였다.
반응이 일어나지 않고 남은 용액을 크기-배제 크로마토그래피를 이용하여 제거하였다.
시험예 1: 세포독성 활성(Cytotoxicity activity) 측정
상기 실시예 1과 2의 양자점의 세포독성을 조사하기 위하여 96-웰 플레이트에 HeLa세포와 Vero세포를 증식시켰다. 독성 실험을 위해 혈청이 제거된 배양액을 세포에 첨가하여 세포 증식을 중지시켰다. 시료들은 세포 배양액에 각 농도로 희석하고, 세포 증식된 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 24 시간 배양한 다음 MTT 검색법으로 시료가 첨가된 각 웰의 살아남은 세포 수를 시료가 첨가되지 않은 세포 대조군 웰과 비교하여 50%의 세포를 죽도록 한 시료의 농도를 CC50(50% Cytotoxicity Concentration)으로 결정하였다. MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 검색법은 살아남은 세포의 미토콘드리아 탈수소화효소(mitochondrial dehydrogenase)가 노란색을 띤 MTT를 보라색을 지닌 프로마잔(formazan)으로 환원시키고, 이 생성물을 유기용매로 녹여 흡광도를 측정하여 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 상대적으로 비교하는 것이다. 마이크로플레이트 리더(Microplate reader)를 이용하여 540 nm와 690 nm에서의 흡광도를 읽었다. A540과 A690의 흡광편차에서 블랭크(blank)값을 뺀 후 세포 대조군과 비교하여 세포독성 값을 구하여 다음 표 1에 나타내었다.
Figure 112007089441603-pat00001
상기 표 1에서 나타낸 바와 같이, 실시예 1과 2의 양자점은 세포를 50% 죽이는 농도가 HeLa 세포와 Vero 세포에서 0.09 ~ 0.15 mM 사이에 나타내고 있다.
이들 양자점은 이미 개발되어진 물질 보다 세포독성이 낮으며 안전성이 우수한 물질이다. 기존에 개발되어진 CdSe/ZnS에 DHLA(dihydrolipoic acid)로 컨쥬게이션된 양자점에서 HeLa 세포에서 아급성 독성실험에서 400 ~ 600 nM, 아비딘이 컨쥬게이션된 CdSe/ZnS는 0.5 ~ 1.5 nM의 독성을 나타냈다.
시험예 2: QD-Ni의 시험관 내 히스티딘 인식 실험
니켈이 결합된 양자점의 폴리히스티딘(6x histidine) 인식 실험을 위해 폴리히스티딘이 결합된 단백질을 96-웰 플레이트에 코팅하고, 잔존물의 단백질을 제거하였다. 단백질로 코팅되어진 각 웰에 QD-NTA-Ni를 0, 1, 10 μM로 첨가하고, 1시간 동안 교반 후 잔존물의 QD-NTA-Ni를 세척하여 제거하였다. 히스티딘 결합 단백질과 니켈이 부착된 양자점은 FLIPR(Fluorometric imaging plate reader)을 이용하여 확인하였고 이를 실험구로 하였다. 비교예 1로 니켈이 부착되지 않은 양자점만 동일 농도로 첨가하여 준비하였다.
도 2는 시험관 내에서 니켈과 폴리히스티딘의 결합력을 이용하여 단백질을 검출하는 방법을 효소결합 면역흡착 분석법과 비교한 도식도이다.
실시예 1과 실시예 2의 양자점을 이용하여 히스티딘이 부착된 재조합 단백질(HIV-1 p66)을 시험관 내에서 검출하였다. 니켈은 단백질에 존재하는 연속적인 6개의 히스티딘을 인식하여 히스티딘의 이미다졸 링에 존재하는 질소와 결합하여 이를 인식하게 된다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 먼저 시험관 내 실험에서 니켈이 결합된 양자점과 HIV-1 p66 재조합 단백질과 결합시켜 두 물질간의 특이적 결합 유무를 조사하였다. 단백질을 넣지 않은 샘플이나 히스티딘이 결합되지 않은 다른 단백질을 넣은 샘플을 대조군으로 하였다. 니켈과 6개의 히스티딘 사이의 결합은 10 μM 농도의 니켈이 결합된 양자점을 첨가했을 때 비교예 1 (Fluorescence intensity: 36 ± 19, 30 ± 12) 보다 200 ~ 300배 이상 높은 결합력을 나타냈다 (Fluorescence intensity: 실시예 1, 11324 ± 897; 실시예 2, 9986 ± 363). 기존에는 시험관 내에서 특이 단백질을 검출하기 위해서는 효소결합 면역흡착 분석법을 이용하였다. 이는 각각 단백질을 인식하는 특이 항체가 필요하며 여러 단계를 거쳐 반응시켜야 하므로 많은 시간을 필요로 하는 작업이다. 하지만, 니켈이 결합된 양자점을 이용할 경우 특이 항체가 필요 없이 손쉽고 빠른 시간 내에 검출할 수 있는 장점이 있다. 또한, 니켈과 6개의 히스티딘의 결합력은 항원-항체반응보다 103 이상 더 높은 결합력을 가져서 특정 단백질을 검출 시 우수한 결과를 얻을 수 있다.
시험예 3: QD-Ni의 세포내 히스티딘 표지된 단백질 인식
니켈이 결합된 양자점을 이용한 세포 이미징 실험은 폴리히스티딘과 니켈과의 결합특성을 활용하여 세포내에 존재하는 폴리히스티딘이 결합된 단백질을 검출하였다.
고정화되어진 세포에 실시예 1과 2의 양자점을 첨가시켜 형광 현미경을 이용하여 표적분자를 검출하였다. 특이 결합을 확인하기 위하여, 실시예 1과 2의 양자점을 1 : 100 ~ 1 : 1000으로 희석하여 세포에 첨가하고 1 시간 교반하여 실험구로 하였다. 비교예 2로 표면에 Ni이 부착되지 않은 양자점을 동일 농도로 첨가하여 준비하였다.
본 실험을 위하여 히스티딘이 결합된 HSV-1 TK를 세포 내에 지속적으로 발현하는 FTK143B 세포를 이용하였다. 고정화되고 투과(permeabilization)되어진 FTK143B 세포에 실시예 1과 2의 양자점을 첨가하여 세포 내에 존재하는 HSV-1 TK를 확인하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, FTK143B 세포에서는 히스티딘이 결합되어진 재조합 단백질과 특이적으로 결합하여 단백질의 세포내 위치를 나타냈다. 이와 같이, 니켈이 결합된 양자점을 이용할 경우 항체를 양자점에 결합시켜 특이 단백질을 인식하는 것보다 많은 잇점을 가진다. 먼저, 강한 결합력에 의해 표적분자를 표지하는데 용이하고, 항체를 이용하는 경우 보다 크기가 작아서 세포내 유입이 용이하다. 또한, 항체를 이용할 경우 각 물질에 대한 항체가 필요하거나, 이차 항체를 이용하여 표적분자를 검출하여야 하지만, 니켈을 이용할 경우 직접적으로 표지가 가능하여 높은 해상도를 나타내고, 각 물질에 대한 항체가 필요없다는 장점을 가지고 사용하기가 보다 용이하다.
도 1은 니켈이 결합된 양자점과 세포내 히스티딘 표지된 단백질의 결합 모식도이다.
도 2는 니켈이 결합된 양자점과 플레이트에 코팅된 히스티딘 표지된 단백질의 결합 모식도이다.
도 3은 실시예 1과 2에서 제조한 양자점에 대한 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 1과 2에서 제조한 양자점에 대한 형광 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 비교예 1, 실시예 1과 2에서 제조한 양자점에 대한 히스티딘 표지된 단백질의 결합 여부를 나타낸 것이다.
도 6은 비교예 2, 실시예 1과 2에서 제조한 양자점에 대한 히스티딘 표지된 단백질의 세포 영상 이미징을 나타낸 것이다.

Claims (6)

  1. InP 화합물이 함유되어 이루어진 양자점을 친수화 처리한 수용성 양자점에 킬레이트를 이용하여 니켈을 결합시킨 니켈-킬레이트-양자점을 제작하는 단계;
    히스티딘이 표지된 단백질 또는 이 단백질이 존재하는 세포를 고정화한 후, 상기 양자점을 첨가시켜 니켈과 히스티딘의 결합여부를 확인하는 단계; 및
    상기 결합여부에 의해 히스티딘이 표지된 단백질을 검출하는 단계
    를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 니켈이 결합된 양자점을 이용한 히스티딘이 표지된 단백질의 검출방법.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 양자점은 단일 코어 또는 코어/쉘 구조로 이루어진 것을 특징으로 하는 검출방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 양자점은 직경이 0.001 ~ 10 nm인 것을 특징으로 하는 검출방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 친수화 처리는 싸이오 글리콜산, 머캡토벤조익산 (mercaptobenzoic acid), 머캡토프로피오닉산(mercaptopropionic acid) 및 머캡토언데카노익산(mercaptoundecanoic acid) 중에서 선택된 1종 이상의 친수화 화합물을 사용하여 코팅하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 킬레이트는 이미노다이아세트산(IDA), 바이신코니닉산(BCA), N,N,N'-트리스카르복시메틸에틸렌다이아민(TED) 또는 니트로트리아세트산(NTA)인 것을 특징으로 하는 검출방법.
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