CN103604790B - 一种基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法 - Google Patents

Abstract

一种基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法，包括以下步骤：（1）CdTe量子点的制备；（2）用于检测反应的母液配制；（3）量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法的建立；（4）检测大米谷蛋白样品时的前处理。本发明中的制备CdTe量子点的原料价格较低，量子点制备简单，采用量子点快速测定大米谷蛋白含量时用量少，检测成本低。

Description

一种基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法

技术领域

本发明涉及一种测定大米谷蛋白含量的方法，尤其是涉及一种基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法。

背景技术

大米蛋白被公认为优质食用蛋白，最初Osborne(1924年)根据溶解性质将大米蛋白分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，其中谷蛋白和醇溶蛋白也叫贮藏蛋白，是大米中的主要蛋白成分，谷蛋白占总蛋白的80%以上(OsborneTB.TheVegetableProteins,2nded[M].NewYork:Longmans,Green&Co,1924,154.)。从营养学分析，大米蛋白中只有谷蛋白和球蛋白能被人体消化吸收(KumamaruT,SatohH,LwataN,etal.Mutantsforricestorageproteins[J].THEORAPPLGENET,1988,76:11-16.)，而且，在谷蛋白中,稻米第一限制性氨基酸—赖氨酸(Lys)含量最高,因而谷蛋白不但本身具有较高的营养价值，而且其在大米中的含量能间接反映大米整体的营养价值，因此，建立一种快速检测大米谷蛋白含量的方法可以便捷、准确、可靠的鉴定大米营养品质，为大米品质评级、大米食品安全鉴定提供可靠依据。

现有国内大米蛋白的检测方法主要为一凯氏定氮法(KjeldahlMethod)，国外有少量利用考马斯亮蓝G2250和大米谷蛋白结合，产物引起染料最大吸收峰，反应的速率约2min，产物稳定性也较好(约1h)，但存在灵敏度较低，选择性较差且检测成本高等问题，在大规模工业生产应用上还存在很大的局限性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种灵敏度和回收率高，选择性和重复性好，操作简便，适于广泛使用的基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法，包括以下步骤：

（1）CdTe量子点的制备

称取15~30mgTe粉、20~60mgNaBH₄放入小玻璃瓶中，用注射器向小玻璃瓶中注入1mL蒸馏水，注射器针头留在玻璃瓶的盖子上，且针头不能被玻璃瓶中溶液所掩盖，低温2~8℃避光反应2~6小时，获反应前体物质；

称取200~260mgCdCl₂和280~360mg2-巯基乙胺，将其溶于160mL蒸馏水，然后采用0.5~1.5mol/L盐酸将混合溶液pH调至5~6.5，混合溶液再转入三颈烧瓶中；

向三颈烧瓶通入N₂，磁力搅拌混合溶液，待混合溶液温度上升至85~98℃，冷凝回流，反应20~40min后，注入反应前体物质，反应60~120min，获得CdTe量子点；

CdTe量子点的粒径大小、形态和性质分析：

采用高分辨率透射电子显微镜(HR-TEM)对CdTe量子点粒径大小和形态进行表征；将CdTe量子点分别置于不同pH、温度和NaCl离子强度条件下，分析CdTe量子点的荧光强度变化；

将CdTe量子点分别置于不同pH条件下为3~11（3、4、5、6、7、8、9、10和11）；不同温度条件下为0~55℃（0℃、25℃、35℃、45℃和55℃）；不同NaCl离子强度条件下为0.1~0.9mol/L（0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L、0.9mol/L）；

（2）用于检测反应的母液配制

在100mL三酸混合液中，加入84.7mL0.2mol/L的NaOH溶液，获得pH11的检测反应的母液；

三酸混合液即磷酸、乙酸、硼酸的混合液，浓度均为0.04mol/L；

（3）量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法的建立

大米谷蛋白校准液的制备，即将大米谷蛋白溶于步骤（2）所得母液中，配制成浓度为0.004~0.132mg/L的大米谷蛋白校准液（0、0.004、0.02、0.036、0.052、0.068、0.084、0.1、0.116和0.132mg/L），利用不同浓度的大米谷蛋白校准液与量子点（浓度>0.1g/L）在10mL棕色瓶避光的条件下反应20~40min，采用荧光光谱仪在激发波长365nm，夹缝宽度5nm，发射波长550nm，夹缝宽度5nm，根据量子点的荧光强度变化建立标准曲线，并进行非线性拟合，以此作为大米谷蛋白检测标准方法；

检测方法的特异性和回收率分析：

分别准确称取1.00mg大米谷蛋白和0.05mg、0.50mg和5.00mg大米清蛋白，将谷蛋白和清蛋白一起添加到步骤（2）所得50mL反应的母液中，混合均匀，其余测定操作程序参考大米谷蛋白检测标准方法，确定各种浓度清蛋白对谷蛋白测定结果的干扰；

另外检验Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Na⁺、Cl^-和SO₄ ^2-对谷蛋白测定的干扰试验；

（4）检测大米谷蛋白样品时的前处理

大米粉碎：每次称取准备好的原料大米，放入粉碎机里研磨1~3min，磨成粉末状后，取50g大米粉末，加pH11的NaOH溶液浸泡提取2~3h，再用离心机4500~6500r/min离心15~25min，收集蛋白上清液，采用大米谷蛋白检测标准方法检测大米谷蛋白含量。

本发明之基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法，可以简便、快速的测定大米中的谷蛋白的含量，和现有的凯氏定氮法和考马斯亮蓝法相比，能提高灵敏度、回收率和抗干扰能力，缩短检测时间，提高检测效率。

本方法采用CdTe量子点作为荧光探针与大米谷蛋白进行反应，根据不同浓度的大米谷蛋白与稍过量的CdTe量子点反应时，导致CdTe量子点荧光强度有规律性的变化而建立测定蛋白的含量方法，与现有技术中采用的考马斯亮蓝G2250法相比，具有以下优势：其一、灵敏度高，最低蛋白质检测量可达0.4μg；其二、抗干扰能力强，特别是抗大米中清蛋白的干扰，这样能有效提高检测大米样品中谷蛋白的准确度；其三、CdTe量子点制备简单，受环境温度的影响小，因此对检测环境要求低，而且每次检测用量少，一次性制备的量子点可常温避光长期贮藏备用；其四、量子点测定大米谷蛋白含量的操作简便，使用时间较短（20min），提高了检测的效率。

本发明中的制备CdTe量子点的原料价格较低，量子点制备简单，采用量子点快速测定大米谷蛋白含量时用量少，检测成本低。

附图说明

图1为本发明之CdTe量子点高分辨率透射电子显微镜（HR-TEM）观察图；

图2为pH对CdTe量子点荧光强度的影响图；

图3为温度对CdTe量子点荧光强度的影响图；

图4为NaCl浓度对CdTe量子点荧光强度的影响图；

图5为不同浓度的谷蛋白标准溶液对CdTe量子点荧光强度的影响；注：a→j对应谷蛋白标准溶液的浓度分布是0、0.004、0.02、0.036、0.052、0.068、0.084、0.1、0.116、0.132mg/L；

图6为量子点快速测定大米中谷蛋白含量的标准曲线图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例包括以下步骤：

（1）CdTe量子点的制备：

称取25mgTe粉、40mgNaBH₄放入小玻璃瓶中，用注射器向小玻璃瓶中注入1mL蒸馏水，注射器针头留在玻璃瓶的盖子上，且针头不能被玻璃瓶中溶液所掩盖，低温4℃避光反应4小时，获反应前体物质；

称取200mgCdCl₂和280mg2-巯基乙胺，将其溶于160mL蒸馏水，然后采用1mol/L盐酸将混合溶液pH调至5.5，混合溶液再转入三颈烧瓶中；

向三颈烧瓶通入N₂，磁力搅拌混合溶液，待混合溶液温度上升至90℃，冷凝回流，反应40min后，注入反应前体物质，反应60min，获得CdTe量子点；

CdTe量子点粒径大小、形态和性质分析

采用高分辨率透射电子显微镜(HR-TEM)对CdTe量子点粒径大小和形态进行表征，结果如图1，表明CdTe量子点呈现球状，平均粒径大小为7nm，粒度分布均匀。将CdTe量子点分别置于不同pH（3、4、5、6、7、8、9、10和11）下测试荧光强度，结果如图2，表明CdTe量子点在碱性条件下荧光特性较好。将CdTe量子点分别置于不同温度条件下（0、25、35、45和55℃）测试荧光强度，结果如图3，表明CdTe量子点在温度0~55℃荧光强度高。将CdTe量子点分别置于不同NaCl离子强度条件下（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mol/L）测试荧光强度，结果如图4所示，结果表明NaCl离子强度在0.1~0.5mol/L内对CdTe量子点的荧光强度影响不明显，NaCl离子强度在0.7~0.5mol/L内对CdTe量子点的荧光强度影响较大，因此采用大米谷蛋白检测标准方法检测大米谷蛋白含量要求NaCl浓度≤0.5mol/L。

（2）用于检测反应的母液配制

在100mL三酸混合液中，加入84.7mL0.2mol/L的NaOH溶液，获得pH11的检测反应的母液；三酸混合液即磷酸、乙酸、硼酸的混合液，浓度均为0.04mol/L。

（3）量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法的建立

在10个25mL容量瓶中，编号为0－9，首先分别添加步骤（2）所制得的反应母液2.0mL（含约3μg/L量子点），在编号0～9的容量瓶中分别加入谷蛋白，并用pH11.0的母液稀释至刻度，摇匀，最终定容后编号0～9的容量瓶中谷蛋白浓度分别是，0.000、0.004、0.020、0.036、0.052、0.068、0.084、0.100、0.116、0.132mg/L，在25℃温度下避光反应20min，在激发波长365nm（夹缝宽度5nm），发射波长550nm（夹缝宽度5nm）的条件下测定，实验重复三次，结果如图4，结果表明量子点强度随谷蛋白浓度增加呈现有规律的增加，且呈线性关系，结果如图5，回归系数R ²为0.9985，说明线性关系良好，建立检测谷蛋白的直线回归方程为y=3143x+187.74。检测灵敏度达4μg，检测范围为0.004～0.132mg/L。

检测方法的特异性和回收率分析

分别准确称取1.00mg大米谷蛋白和0.05mg、0.50mg和5.00mg大米清蛋白，将谷蛋白和清蛋白一起添加到50mL的母液中，混合均匀，其余测定操作参考上述大米谷蛋白检测标准方法，确定各种浓度清蛋白对谷蛋白测定结果的干扰。另外检验Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Na⁺、Cl^-和SO₄ ^2-对谷蛋白测定的干扰试验。上述共存物质对检测的干扰如表1。

结果表明清蛋白和其它离子对该检测谷蛋白的含量方法干扰少，且回收率较高。

结果显示，采用本发明所述的基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法，具有操作简单，灵敏度高，检测范围宽，抗干扰强和回收率高优势。

Claims (1)

1.一种基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）CdTe量子点的制备

称取15~30mgTe粉、20~60mgNaBH₄放入小玻璃瓶中，用注射器向小玻璃瓶中注入1mL蒸馏水，低温2~8℃避光反应2~6小时，获得反应前体物质；

称取200~260mgCdCl₂和280~360mg2-巯基乙胺，将其溶于160mL蒸馏水，然后采用0.5~1.5mol/L盐酸将混合溶液pH调至5~6.5，混合溶液再转入三颈烧瓶中；

向三颈烧瓶通入N₂，磁力搅拌混合溶液，待混合溶液温度上升至85~98℃，冷凝回流，反应20~40min后，注入反应前体物质，反应60~120min，获得CdTe量子点；

（2）用于检测反应的母液配制

在100mL三酸混合液中，加入84.7mL0.2mol/L的NaOH溶液，获得pH11的检测反应的母液；

三酸混合液即磷酸、乙酸、硼酸的混合液，浓度均为0.04mol/L；

（3）量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法的建立

大米谷蛋白校准液的制备，即将大米谷蛋白溶于步骤（2）所得母液中，配制成大米谷蛋白校准液，所述大米谷蛋白校准液的浓度分别为0、0.004、0.02、0.036、0.052、0.068、0.084、0.1、0.116和0.132mg/L，利用不同浓度的大米谷蛋白校准液与浓度>0.1g/L的量子点在10mL棕色瓶避光的条件下反应20~40min，采用荧光光谱仪，在激发波长365nm，夹缝宽度5nm，发射波长550nm，夹缝宽度5nm的条件下，根据量子点的荧光强度变化建立标准曲线，并进行非线性拟合，以此作为大米谷蛋白检测标准方法；

（4）检测大米谷蛋白样品时的前处理

大米粉碎：每次称取准备好的原料大米，放入粉碎机里研磨1~3min，磨成粉末状后，取50g大米粉末，加pH11的NaOH溶液浸泡提取2~3h，再用离心机4500~6500r/min离心15~25min，收集蛋白上清液，采用大米谷蛋白检测标准方法检测大米谷蛋白含量。