CN103604790A - 一种基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法,包括以下步骤:(1)CdTe量子点的制备;(2)用于检测反应的母液配制;(3)量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法的建立;(4)检测大米谷蛋白样品时的前处理。本发明中的制备CdTe量子点的原料价格较低,量子点制备简单,采用量子点快速测定大米谷蛋白含量时用量少,检测成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定大米谷蛋白含量的方法,尤其是涉及一种基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法。
背景技术
大米蛋白被公认为优质食用蛋白,最初Osborne ( 1924年)根据溶解性质将大米蛋白分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白,其中谷蛋白和醇溶蛋白也叫贮藏蛋白,是大米中的主要蛋白成分,谷蛋白占总蛋白的80%以上 (Osborne T B. The Vegetable Proteins, 2nd ed[M]. New York: Longmans, Green & Co, 1924, 154.)。从营养学分析,大米蛋白中只有谷蛋白和球蛋白能被人体消化吸收 (Kum amaru T, Satoh H, Lwata N, et al. Mutants for rice storage proteins[J]. THEOR APPL GENET, 1988, 76: 11-16.),而且,在谷蛋白中, 稻米第一限制性氨基酸—赖氨酸( Lys) 含量最高, 因而谷蛋白不但本身具有较高的营养价值,而且其在大米中的含量能间接反映大米整体的营养价值,因此,建立一种快速检测大米谷蛋白含量的方法可以便捷、准确、可靠的鉴定大米营养品质,为大米品质评级、大米食品安全鉴定提供可靠依据。
现有国内大米蛋白的检测方法主要为一凯氏定氮法(Kjeldahl Method),国外有少量利用考马斯亮蓝G2250和大米谷蛋白结合,产物引起染料最大吸收峰,反应的速率约2 min,产物稳定性也较好(约1 h),但存在灵敏度较低,选择性较差且检测成本高等问题,在大规模工业生产应用上还存在很大的局限性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是,克服现有技术的不足,提供一种灵敏度和回收率高,选择性和重复性好,操作简便,适于广泛使用的基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是,一种基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法,包括以下步骤:
(1)CdTe量子点的制备
称取15~30 mg Te粉、20~60 mg NaBH4放入小玻璃瓶中,用注射器向小玻璃瓶中注入1 mL蒸馏水,注射器针头留在玻璃瓶的盖子上,且针头不能被玻璃瓶中溶液所掩盖,低温2~8℃避光反应2~6小时,获反应前体物质;
称取200~260 mg CdCl2和280~360mg 2-巯基乙胺,将其溶于160 mL蒸馏水,然后采用0.5~1.5 mol/L盐酸将混合溶液pH调至5~6.5,混合溶液再转入三颈烧瓶中;
向三颈烧瓶通入N2,磁力搅拌混合溶液,待混合溶液温度上升至85~98℃,冷凝回流,反应20~40min后,注入反应前体物质,反应60~120 min,获得CdTe量子点;
CdTe量子点的粒径大小、形态和性质分析:
采用高分辨率透射电子显微镜(HR-TEM)对CdTe量子点粒径大小和形态进行表征;将CdTe量子点分别置于不同pH、温度和NaCl离子强度条件下,分析CdTe量子点的荧光强度变化;
将CdTe量子点分别置于不同pH条件下为3~11(3、4、5、6、7、8、9、10和11);不同温度条件下为0~55 ℃(0℃、25℃、35℃、45℃和55℃);不同NaCl离子强度条件下为0.1~0.9 mol/L(0.1 mol/L、0.3 mol/L、0.5 mol/L、0.7 mol/L、0.9 mol/L);
(2)用于检测反应的母液配制
在100mL三酸混合液中,加入84.7 mL 0.2mol/L的NaOH溶液,获得pH11的检测反应的母液;
三酸混合液即磷酸、乙酸、硼酸的混合液,浓度均为0.04mol/L;
(3)量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法的建立
大米谷蛋白校准液的制备,即将大米谷蛋白溶于步骤(2)所得母液中,配制成浓度为0.004~0.132 mg/L的大米谷蛋白校准液(0、0.004、0.02、0.036、0.052、0.068、0.084、0.1、0.116和0.132 mg/L),利用不同浓度的大米谷蛋白校准液与量子点(浓度>0.1 g/L)在10mL棕色瓶避光的条件下反应20~40 min,采用荧光光谱仪在激发波长365 nm,夹缝宽度5 nm,发射波长 550 nm,夹缝宽度5 nm,根据量子点的荧光强度变化建立标准曲线,并进行非线性拟合,以此作为大米谷蛋白检测标准方法;
检测方法的特异性和回收率分析:
分别准确称取1.00 mg 大米谷蛋白和0.05 mg、0.50 mg和5.00 mg大米清蛋白,将谷蛋白和清蛋白一起添加到步骤(2)所得50 mL 反应的母液中,混合均匀,其余测定操作程序参考大米谷蛋白检测标准方法,确定各种浓度清蛋白对谷蛋白测定结果的干扰;
另外检验Ca2+、Mg2+、Fe3+、Na+、Cl-和SO4 2-对谷蛋白测定的干扰试验;
(4)检测大米谷蛋白样品时的前处理
大米粉碎:每次称取准备好的原料大米,放入粉碎机里研磨1~3 min,磨成粉末状后,取50 g大米粉末,加pH11的NaOH溶液浸泡提取2~3h,再用离心机4500~6500 r/min离心15~25 min,收集蛋白上清液,采用大米谷蛋白检测标准方法检测大米谷蛋白含量。
本发明之基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法,可以简便、快速的测定大米中的谷蛋白的含量,和现有的凯氏定氮法和考马斯亮蓝法相比,能提高灵敏度、回收率和抗干扰能力,缩短检测时间,提高检测效率。
本方法采用CdTe量子点作为荧光探针与大米谷蛋白进行反应,根据不同浓度的大米谷蛋白与稍过量的CdTe量子点反应时,导致CdTe量子点荧光强度有规律性的变化而建立测定蛋白的含量方法,与现有技术中采用的考马斯亮蓝G2250法相比,具有以下优势:其一、灵敏度高,最低蛋白质检测量可达0.4μg;其二、抗干扰能力强,特别是抗大米中清蛋白的干扰,这样能有效提高检测大米样品中谷蛋白的准确度;其三、CdTe量子点制备简单,受环境温度的影响小,因此对检测环境要求低,而且每次检测用量少,一次性制备的量子点可常温避光长期贮藏备用;其四、量子点测定大米谷蛋白含量的操作简便,使用时间较短(20 min),提高了检测的效率。
本发明中的制备CdTe量子点的原料价格较低,量子点制备简单,采用量子点快速测定大米谷蛋白含量时用量少,检测成本低。
附图说明
图1为本发明之CdTe量子点高分辨率透射电子显微镜(HR-TEM)观察图;
图2为pH对CdTe量子点荧光强度的影响图;
图3为温度对CdTe量子点荧光强度的影响图;
图4为NaCl浓度对CdTe量子点荧光强度的影响图;
图5为不同浓度的谷蛋白标准溶液对CdTe量子点荧光强度的影响;注:a→j对应谷蛋白标准溶液的浓度分布是0、0.004、0.02、0.036、0.052、0.068、0.084、0.1、0.116、0.132 mg/L;
图6为量子点快速测定大米中谷蛋白含量的标准曲线图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例包括以下步骤:
(1)CdTe量子点的制备:
称取 25 mg Te粉、40 mg NaBH4放入小玻璃瓶中,用注射器向小玻璃瓶中注入1mL蒸馏水,注射器针头留在玻璃瓶的盖子上,且针头不能被玻璃瓶中溶液所掩盖,低温4℃避光反应4小时,获反应前体物质;
称取200 mg CdCl2和280mg 2-巯基乙胺,将其溶于160 mL蒸馏水,然后采用1mol/L盐酸将混合溶液pH调至5.5,混合溶液再转入三颈烧瓶中;
向三颈烧瓶通入N2,磁力搅拌混合溶液,待混合溶液温度上升至90℃,冷凝回流,反应40min后,注入反应前体物质,反应60 min,获得CdTe量子点;
CdTe量子点粒径大小、形态和性质分析
采用高分辨率透射电子显微镜(HR-TEM)对CdTe量子点粒径大小和形态进行表征,结果如图1,表明CdTe量子点呈现球状,平均粒径大小为7 nm,粒度分布均匀。将CdTe量子点分别置于不同pH(3、4、5、6、7、8、9、10和11)下测试荧光强度,结果如图2,表明CdTe量子点在碱性条件下荧光特性较好。将CdTe量子点分别置于不同温度条件下(0、25、35、45和55℃)测试荧光强度,结果如图3,表明CdTe量子点在温度0~55 ℃荧光强度高。将CdTe量子点分别置于不同NaCl离子强度条件下(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mol/L)测试荧光强度,结果如图4所示,结果表明NaCl离子强度在0.1~0.5 mol/L内对CdTe量子点的荧光强度影响不明显,NaCl离子强度在0.7~0.5 mol/L内对CdTe量子点的荧光强度影响较大,因此采用大米谷蛋白检测标准方法检测大米谷蛋白含量要求NaCl浓度≤0.5 mol/L。
(2)用于检测反应的母液配制
在100mL三酸混合液中,加入84.7 mL 0.2mol/L的NaOH溶液,获得pH11的检测反应的母液;三酸混合液即磷酸、乙酸、硼酸的混合液,浓度均为0.04mol/L。
(3)量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法的建立
在10个25mL容量瓶中,编号为0-9,首先分别添加步骤(2)所制得的反应母液2.0 mL (含约3 μg/L量子点),在编号0~9的容量瓶中分别加入谷蛋白,并用 pH 11.0 的母液稀释至刻度,摇匀,最终定容后编号0~9的容量瓶中谷蛋白浓度分别是,0.000、0.004、0.020、0.036、0.052、0.068、0.084、0.100、0.116、0.132 mg/L,在25℃温度下避光反应 20min,在激发波长365nm(夹缝宽度5nm),发射波长 550nm(夹缝宽度5nm)的条件下测定,实验重复三次,结果如图4,结果表明量子点强度随谷蛋白浓度增加呈现有规律的增加,且呈线性关系,结果如图5,回归系数R 2为0.9985,说明线性关系良好,建立检测谷蛋白的直线回归方程为y=3143x+187.74。检测灵敏度达4μg,检测范围为0.004~0.132 mg/L。
检测方法的特异性和回收率分析
分别准确称取1.00 mg 大米谷蛋白和0.05 mg、0.50 mg和5.00 mg大米清蛋白,将谷蛋白和清蛋白一起添加到50 mL的母液中,混合均匀,其余测定操作参考上述大米谷蛋白检测标准方法,确定各种浓度清蛋白对谷蛋白测定结果的干扰。另外检验Ca2+、Mg2+、Fe3+、Na+、Cl-和SO4 2-对谷蛋白测定的干扰试验。上述共存物质对检测的干扰如表1。
结果表明清蛋白和其它离子对该检测谷蛋白的含量方法干扰少,且回收率较高。
结果显示,采用本发明所述的基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法,具有操作简单,灵敏度高,检测范围宽,抗干扰强和回收率高优势。
Claims (1)
1. 一种基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)CdTe量子点的制备
称取15~30 mg Te粉、20~60 mg NaBH4放入小玻璃瓶中,用注射器向小玻璃瓶中注入1 mL蒸馏水,低温2~8℃避光反应2~6小时,获反应前体物质;
称取200~260 mg CdCl2和280~360mg 2-巯基乙胺,将其溶于160 mL蒸馏水,然后采用0.5~1.5 mol/L盐酸将混合溶液pH调至5~6.5,混合溶液再转入三颈烧瓶中;
向三颈烧瓶通入N2,磁力搅拌混合溶液,待混合溶液温度上升至85~98℃,冷凝回流,反应20~40min后,注入反应前体物质,反应60~120 min,获得CdTe量子点;
(2)用于检测反应的母液配制
在100mL三酸混合液中,加入84.7 mL 0.2mol/L的NaOH溶液,获得pH11的检测反应的母液;
三酸混合液即磷酸、乙酸、硼酸的混合液,浓度均为0.04mol/L;
(3)量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法的建立
大米谷蛋白校准液的制备,即将大米谷蛋白溶于步骤(2)所得母液中,配制成浓度为0.004~0.132 mg/L的大米谷蛋白校准液(0、0.004、0.02、0.036、0.052、0.068、0.084、0.1、0.116和0.132 mg/L),利用不同浓度的大米谷蛋白校准液与量子点(浓度>0.1 g/L)在10mL棕色瓶避光的条件下反应20~40 min,采用荧光光谱仪在激发波长365 nm,夹缝宽度5 nm,发射波长 550 nm,夹缝宽度5 nm,根据量子点的荧光强度变化建立标准曲线,并进行非线性拟合,以此作为大米谷蛋白检测标准方法;
(4)检测大米谷蛋白样品时的前处理
大米粉碎:每次称取准备好的原料大米,放入粉碎机里研磨1~3 min,磨成粉末状后,取50 g大米粉末,加pH11的NaOH溶液浸泡提取2~3h,再用离心机4500~6500 r/min离心15~25 min,收集蛋白上清液,采用大米谷蛋白检测标准方法检测大米谷蛋白含量。
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