WO2006006608A1 - ステロールの５－エン－３－オン体又は３，６－ジオン体の製造方法、脂質代謝改善剤、飲食品及び動物用飼料の製造方法、並びに分析方法 - Google Patents

ステロールの５－エン－３－オン体又は３，６－ジオン体の製造方法、脂質代謝改善剤、飲食品及び動物用飼料の製造方法、並びに分析方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2006006608A1
WO2006006608A1 PCT/JP2005/012869 JP2005012869W WO2006006608A1 WO 2006006608 A1 WO2006006608 A1 WO 2006006608A1 JP 2005012869 W JP2005012869 W JP 2005012869W WO 2006006608 A1 WO2006006608 A1 WO 2006006608A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sterol
dione
ene
producing
cholesterol oxidase
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/012869
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kunio Suzuki
Tadashi Nagashima
Shinya Nagahashi
Original Assignee
Toyo Hakko Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toyo Hakko Co., Ltd. filed Critical Toyo Hakko Co., Ltd.
Priority to US11/632,072 priority Critical patent/US8008040B2/en
Priority to CN2005800231293A priority patent/CN101006184B/zh
Publication of WO2006006608A1 publication Critical patent/WO2006006608A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/12—Acting on D ring
    • C12P33/16—Acting at 17 position

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a sterol 5-en-3-one or 3,6-dione, a lipid metabolism-improving agent, food and drink, animal feed, and an analysis method. More specifically, the present invention relates to a production method capable of synthesizing a sterol 5-ene 3-one body or a 3,6-dione body excellent in physiological effects such as anti-obesity and lipid metabolism improvement in a high yield, And a method for producing a lipid metabolism-improving agent, food and drink, and animal feed containing 5-ster-3-one or 3,6-dione form of the sterol, and 5-ster-3-one form of sterol and 3, 6 —It relates to an analysis method capable of analyzing dione bodies simultaneously and efficiently.
  • Patent Document 1 discloses an anti-obesity agent and a lipid metabolism improving agent containing 24 alkylcholestane 1-one or 24-alkylcholesten 3one as active ingredients.
  • Patent Document 2 listed below discloses an anti-obesity agent and a lipid metabolism-improving agent containing 24-methylcholesten-3-one, which is a 5-en-3-one sterol, as an active ingredient. Furthermore, compared to the 4-en-3-one form of sterol, the 5-en-3-one form and the 3,6-dione form have superior anti-obesity and lipid metabolism-improving effects.
  • Patent Document 2 discloses an anti-obesity agent and a lipid metabolism improving agent containing 24 alkylcholestane 1-one or 24-alkylcholesten 3one as active ingredients.
  • Patent Document 2 listed below discloses an anti-obesity agent and a lipid metabolism-improving agent containing 24-methylcholesten-3-one, which is a 5-en-3-one sterol, as
  • Non-Patent Document 1 discloses that cholesterol or a derivative thereof can be used as a substrate, and cholesterol 4-en-3-one can be obtained by the enzyme cholesterol oxidase. Yes.
  • 5-ene 3-one isomer is obtained from the substrate cholesterol or its derivative by acid reaction, and then rapidly undergoes isomeric reaction to form 4-en-3-one isomer.
  • the following Non-Patent Document 2 includes an aqueous layer Z organic solvent. In this two-layer system, a method for biologically converting cholesterol from cholesterol 4-en-3-one using a microorganism having the property of producing cholesterol oxidase (Alsulactor) is described.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 11 193296
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-240544
  • Non-Patent Document 1 “Bioscience and Industry” Vol. 57 No. 7 ('99) 464— 4 67
  • Non-Patent Document 2 “Enzyme and Microbial Technology J 1996, Vol. 18: 184 189,
  • Non-Patent Document 1 merely describes biologically obtaining a 4-en-3-one isomer, and the yield of the 5-en-3-one isomer in the biological synthesis method is described.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 do not disclose the biological synthesis of 3,6 diones. Therefore, it has been desired to develop a method for producing a sterol 5-ene-3-one body and a method for producing a 3,6-dione body, which are superior in productivity to conventional methods.
  • the present invention has been made in view of the above-described situation, and yields a 5-ster-3-one or 3,6-dione sterol having excellent physiological effects such as anti-obesity and lipid metabolism improvement. And a method for producing a lipid metabolism-improving agent, food / beverage product and animal feed containing the 5-ster-3-one or 3,6-dione form of the sterol, and a method for producing sterol.
  • the object is to provide an analytical method that can analyze 5-en 3-one and 3,6-dione simultaneously and efficiently.
  • sterol and its two-layer solvent comprising a hydrocarbon solvent layer such as alkane and an aqueous layer.
  • a hydrocarbon solvent layer such as alkane
  • a sterol 5-ene 3-one or 3,6-dione isomer By culturing a microorganism exhibiting cholesterol oxidase activity or cholesterol oxidase activity using the derivative as a substrate, it is possible to obtain a sterol 5-ene 3-one or 3,6-dione isomer at a higher yield than before.
  • the inventors have found that the present invention can be accomplished and have completed the present invention.
  • the present invention was completed by finding that the simultaneous separation and quantification of sterol 5-ene-3-one and 3,6-dione isomers by the HPLC method.
  • the present invention is as follows.
  • a sterol characterized by containing a sterol or a derivative thereof in a two-layer solution composed of a water layer composed of a cholesterol oxidase-containing liquid and a hydrocarbon solvent layer composed of a hydrocarbon solvent.
  • the microorganism is one or two bacteria belonging to the genus Arthrobacter, the genus Streptomyces, the genus Brevibacteriumu, the genus Rhodococcus, and the genus Batisul.
  • a method for producing a lipid metabolism-improving agent comprising a sterol 5-en-3-one or 3,6-dione isomer obtained by the method described in [1] above.
  • a sterol 5-ene-3-one or 3 obtained by the method described in [1] above , 6-Dione body is contained, The manufacturing method of the animal feed characterized by the above-mentioned.
  • [7] Mixing acetonitrile and isopropyl alcohol on a volume basis at a ratio of (3-5) / (5-7), using the mixture as the mobile phase, the sterol 5-
  • a sterol is characterized by the simultaneous separation and quantification of 3-one and 3,6-dione.
  • the method for producing a sterol 5-ene 3-one or 3,6-dione isomer of the present invention comprises the above-described configuration, thereby providing a 5-ster sterol excellent in physiological action such as anti-obesity and lipid metabolism improvement.
  • a 3-one or 3,6-dione isomer can be obtained in a higher yield than before.
  • the method for producing a lipid metabolism improving agent, food and drink, and animal feed of the present invention has a lipid metabolism improving agent, food and drink, and animal feed that exhibit the above-described excellent effects by having the above-described configuration. Can also be obtained efficiently.
  • the 5-ster-3-one and 3,6-sterols of sterols by the HPLC method which had been difficult in the past, were used. 6 Simultaneous separation and quantification of dione bodies can be performed.
  • the “water layer comprising a cholesterol oxidase-containing liquid” constituting the “bilayer solution” of the present invention is a layer containing cholesterol oxidase in an aqueous solvent.
  • the type of the aqueous solvent is not particularly limited as long as it has the property of being separated into two layers without being mixed with the hydrocarbon solvent.
  • As the aqueous solvent water is usually used.
  • cholesterol oxidase is an enzyme that catalyzes a reaction between one molecule of 3 ⁇ -hydroxysteroid and one molecule of oxygen, and generates the corresponding 3-oxosteroid and peroxyhydrogen. Yes (EC. 1. 1. 3. 6).
  • the above-mentioned cholesterol oxidase catalyzes the above-mentioned reaction, which is the force used by naturally-occurring cholesterol oxidase normally produced by microorganisms. Cholesterol oxidase whose amino acid sequence or higher order structure has been modified by genetic engineering techniques, etc. may be used.
  • the cholesterol oxidase-containing solution is usually prepared by adding and adding cholesterol oxidase directly to an aqueous solvent.
  • a microorganism exhibiting cholesterol oxidase activity is added to the aqueous solvent. It may be prepared by culturing. That is, the cholesterol oxidase-containing liquid includes a microorganism-containing liquid exhibiting cholesterol oxidase activity.
  • microorganism is not particularly limited as long as it is a microorganism exhibiting cholesterol oxidase activity.
  • the above-mentioned “microorganism” includes basidiomycetes such as Agaricus spp. (Rhodococcus) genus, and bacteria belonging to the genus Batisul.
  • basidiomycetes such as Agaricus spp. (Rhodococcus) genus
  • bacteria belonging to the genus Batisul include, for example, Arthrobacter Simplex (also known as Nocardioidos Simplex).
  • microorganisms As the above-mentioned microorganisms, commercially available microorganisms are usually used, but other natural or EMS (ethyl methane sulfonate), jetyl sulfate, NTG (N-methyl-N, 1-tallow) N--trosoguanidine) and chemical substances such as -trosoguanidine, and even microorganisms obtained by artificial mutagenesis using X-rays, ⁇ -rays, ultraviolet rays, etc. Any oxidase activity can be used.
  • a transformed microorganism in which a gene encoding cholesterol oxidase is introduced into a microorganism such as Escherichia coli using an appropriate vector and transformed to enable expression of cholesterol oxidase can be used.
  • the ⁇ of the above-mentioned cholesterol oxidase-containing liquid is not particularly limited as long as it does not impair the activity of cholesterol oxidase, and can be in various ranges according to the type of cholesterol oxidase or microorganism used.
  • the above-mentioned cholesterol oxidase-containing solution has a pHi of usually ⁇ or 5.0 to 9.0, preferably ⁇ 6.0 to 8.0, and more preferably 6.5 to 7.5.
  • the regulation of ⁇ of the cholesterol oxidase-containing liquid is, for example, This can be done by adding a basic solution such as a moor aqueous solution, potassium hydroxide aqueous solution, sodium hydroxide aqueous solution, sodium carbonate aqueous solution or potassium carbonate aqueous solution, or an acidic solution such as phosphoric acid.
  • a basic solution such as a moor aqueous solution, potassium hydroxide aqueous solution, sodium hydroxide aqueous solution, sodium carbonate aqueous solution or potassium carbonate aqueous solution, or an acidic solution such as phosphoric acid.
  • the cholesterol oxidase-containing liquid may contain other components as long as the action effect of the present invention is not impaired as long as the cholesterol oxidase or the microorganism exhibiting the cholesterol oxidase activity is essential.
  • it may contain a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, amino acids, vitamins and the like necessary for the growth of the microorganism exhibiting the cholesterol oxidase activity.
  • a coenzyme for assisting the action of the cholesterol oxidase can be included.
  • a pH adjuster for adjusting the pH of the cholesterol oxidase-containing solution may be included.
  • the content of the cholesterol oxidase and the number of inoculated microorganisms in the cholesterol oxidase-containing liquid are not particularly limited, and can be set to an appropriate content and the number of inoculated as necessary.
  • the "hydrocarbon solvent layer having a hydrocarbon solvent power" constituting the "two-layer solution” of the present invention is not completely mixed with the water layer constituting the two-layer solution. Any solvent can be used as long as it has the property of separating into two.
  • the “hydrocarbon solvent” may be any of an aliphatic hydrocarbon, an alicyclic hydrocarbon, and an aromatic hydrocarbon solvent. Further, only one of these may be used, or two or more mixed solvents may be used.
  • the carbon number of the “hydrocarbon solvent” is not particularly limited, but usually a hydrocarbon solvent having 4 or more carbon atoms, preferably 4 to 12 carbon atoms, more preferably 5 to 8 carbon atoms is used. .
  • hydrocarbon solvent examples include, for example, alkanes such as n-butane, n-hexane and heptane, and cycloalkanes such as cyclohexane.
  • alkanes such as n-butane, n-hexane and heptane
  • cycloalkanes such as cyclohexane.
  • the hydrocarbon solvent may contain other substances as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • a hydrocarbon solvent is added to an aqueous layer that also has cholesterol oxidase-containing liquid power to prepare a two-layer solution consisting of two layers of an aqueous layer and a hydrocarbon solvent layer.
  • the order of adding the cholesterol oxidase-containing liquid and the hydrocarbon solvent is not particularly limited.
  • the above hydrocarbon solvent On the contrary, the above hydrocarbon-based solvent may be added to the cholesterol oxidase-containing liquid.
  • the ratio of the water layer and the hydrocarbon solvent layer in the two-layer solution is not particularly limited, and can be set in various ranges as necessary.
  • the ratio (volume ratio) between the aqueous layer and the hydrocarbon solvent layer is 1: (0.2-2), preferably 1: (0.4-1.5), more preferably 1: (0.5-1).
  • the above-mentioned bilayer solution contains "sterol or a derivative thereof” serving as a substrate, and the reaction with the cholesterol oxidase is performed.
  • the type of “sterol” is not particularly limited, and various derivatives can be used as necessary.
  • Examples of the above-mentioned “sterol or a derivative thereof” include, for example, plant sterols (plant-derived sterols and derivatives thereof such as j8-sitosterol, camsterol, stigmasterol, etc.), cholesterol, ergosterol, lanosterol, and Examples include cholestane-3-one, cholesterol 3-one, and derivatives of these 24 alkyls.
  • sterol or a derivative thereof may be added after preparing the two-layer solution.
  • “sterol or a derivative thereof” is added to the cholesterol oxidase-containing liquid or the hydrocarbon solvent before preparing the bilayer solution, and then the cholesterol oxidase-containing liquid and the hydrocarbon solvent are added.
  • the above-mentioned “sterol or a derivative thereof” may be contained simultaneously with the preparation of the two-layer solution.
  • the reaction conditions are not particularly limited.
  • the reaction temperature can usually be 25-42 ° C, preferably 28-38 ° C.
  • the reaction time is usually 5 to 72 hours, preferably 24 to 48 hours.
  • shaking or stirring can be appropriately performed during the reaction.
  • the method for purifying and recovering the 5-en-3-one or 3,6-dione sterol sterol obtained by the present invention can be recovered and purified by appropriate means as necessary.
  • the sterol 5-en-3-one Alternatively, the hydrocarbon solvent layer containing the 3,6-dione compound is separated, and if necessary, the active ingredient is concentrated by evaporating the solvent, etc., and then dried by an appropriate method such as freeze drying, spray drying, or vacuum drying. Can be recovered.
  • the reaction solution or the separated hydrocarbon solvent layer can be sterilized by passing it through a sterilizing filter, if necessary.
  • the reaction solution when an alcohol such as methanol or ethanol is added to the reaction solution, the reaction solution can be easily divided into two layers, an aqueous layer and a hydrocarbon solvent layer. It is preferable because it makes it easy to purify and recover 3-n-one or 3,6-dione.
  • the "sterol pentene 3-one" obtained by the present invention is not particularly limited in its structure as long as it has a double bond at the 5-position of the sterol skeleton and a ketone group at the 3-position.
  • the “sterol 3,6-dione” obtained by the present invention is not particularly limited in its structure as long as it has a ketone group at the 3rd and 6th positions of the sterol skeleton.
  • the sterol skeleton or side chain may have an appropriate functional group such as an alkyl group (methyl group, ethyl group, etc.).
  • the number of double bonds is not particularly limited, and it may have one or more, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 2 other double bonds in the sterol skeleton or side chain. Good.
  • sterol 5-ene-3-one examples include, for example, 24 alkylcholest-5-ene-3-one, 24 alkylcholestone 5, 7-gen 3-one, 24 alkyl Strike 5, 8 Gen 3—On, 24 Alkylcholest 1,5, 9 (11) —Gen 1 3-On, 24 Alkylcholest 5,22 Gen 3—On, 24 Alkircholes— 5, 7, 22 ⁇ Rien—3—one, 24 alkylcholes ⁇ — 5, 8, 22 Trienone 3—on, 24 alkylcholests 5, 9 (11), 22 Trienone—3-on, 24— alkylcholests —5, 25 (27) Gen 3 on and so on.
  • alkyl in the above substances include methyl group and ethyl group.
  • Specific examples of the above-mentioned “sterol 3,6-dione” include, for example, 4-cholestene 3,6-dione, 4-campest 1,3,6 dione, 24 anolequinoles 4 For example, 1, 3, 6 dione.
  • the present invention obtains a 3,6-dione body that can be used to obtain a 5-ene-3on body. You may go for that. Furthermore, in the present invention, both the 5-en-3-one body and the 3,6-dione body can be obtained at the same time.
  • the sterol 5-en-3-one and 3,6-dione isomers obtained by the present invention have superior physiological effects such as anti-obesity and lipid metabolism-improving action, compared with the 4-en-3-one sterol. Have. Therefore, the sterol 5-ene-3-one obtained by the present invention can be used in various applications. For example, it can be used as pharmaceuticals such as anti-obesity agents and lipid metabolism improving agents, additives to foods and drinks, and feed additives.
  • the sterol 5-en-3one and 3,6-dione isomers of the present invention are obtained by mixing acetonitrile and isopropyl alcohol in a ratio of (3-5) / (5-7) on a volume basis. Using the resulting mixed solution as a mobile phase, the sterol 5-en-3-one and 3,6-dione isomers are simultaneously separated and quantified by high performance liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • acetonitrile and isopropyl alcohol are used as the mixed solution.
  • the ratio of acetonitrile and isopropyl alcohol is (3-5) / (5-7), preferably (3.5-4.5) / (5.5-6.5) on a volume basis. is there.
  • the length of the column can be 20 to 80 cm, preferably 40 to 60 cm.
  • column temperature Can be 10-30 ° C, preferably 15-25 ° C.
  • the flow rate of the mobile phase is preferably 0.1 to 5 mlZmin. 0.1 to LmlZmin is more preferred.
  • an aqueous liquid medium (pH: 7.0 ⁇ 0.1) having the composition described in Table 1 (A) below was prepared.
  • an aqueous liquid medium (pH: 7.0 ⁇ 0.1) having the composition described in Table 1 (B) below was prepared as the main culture medium.
  • a commercially available Anolelobacter simplex (Arthrobacter Simplex), which is a Gram-positive rod, was used.
  • the upper layer was passed through a sterilizing filter and then dried in a vacuum dryer to recover the product in powder form.
  • This product was analyzed by HPLC. The results are shown in Table 2 below.
  • the product was analyzed by performing a reaction in the same manner as described above except that cholesterol was used as a substrate and the above hexane was not obtained. The results are also shown in Table 2 below.
  • a mobile phase was prepared by mixing acetonitrile and isopropyl alcohol at a ratio of 4Z6 (volume basis) and degassing under reduced pressure using an aspirator. Next, the mobile phase was passed through 10 times the column volume to equilibrate the column. Column equilibration was completed when the baseline was monitored and the baseline was stable.
  • HPLC HPLC was performed under the following conditions.
  • the obtained peak area value and calibration curve force The content of each component in the sample was determined, and the concentration of each component was quantified by the following formula.
  • Example 1 in which cholesterol was added as a substrate to a two-layer solution composed of a water phase containing cholesterol oxidase and a hexane layer as a hydrocarbon solvent, the reaction was carried out in Comparative Example 1. It can be seen that, unlike 1, it is possible to obtain a 5-en body. In addition, when plant sterol is used as a substrate, as shown in Example 2, it can be seen that a 5-ene body can be obtained and a 3,6-dione body can be obtained.
  • the present invention can efficiently produce sterol 5-ene-3-one or 3,6-dione isomers having excellent anti-obesity and physiological effects such as lipid metabolism improvement.
  • Book The invention can be suitably used in the fields of food and drink, pharmaceuticals, animal feeds and the like.

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Non-Alcoholic Beverages (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

【課題】　ステロールの５－エン－３－オン体又は３，６－ジオン体を収率よく合成することができる製造方法、並びに該ステロールの５－エン－３－オン体又は３，６－ジオン体を含有する脂質代謝改善剤、飲食品及び動物用飼料の製造方法を提供する。 【解決手段】　本発明のステロールの５－エン－３－オン体又は３，６－ジオン体の製造方法は、コレステロールオキシダーゼ活性を示す微生物であるアルスロバクター属細菌を含む培養液を調製し、次いで、この培養液に等量のヘキサンを添加し、水層－炭化水素系溶媒層で構成される二層溶液を調製し、その後、基質であるステロール又はその誘導体を含有させて、３０°Cで２日間、コレステロールオキシダーゼによる反応を行い、次いでエタノールを添加して炭化水素系溶媒層を分離し、その後、真空乾燥機により乾固させて５－エン－３－オン体又は３，６－ジオン体を得ることを特徴とする。

Description

明 細 書
ステロールの 5—ェン _ 3_オン体又は 3， 6—ジオン体の製造方法、脂 質代謝改善剤、飲食品及び動物用飼料の製造方法、並びに分析方法
技術分野
[0001] 本発明は、ステロールの 5 ェンー 3 オン体又は 3, 6 ジオン体、脂質代謝改善 剤、飲食品及び動物用飼料の製造方法、並びに分析方法に関する。更に詳しくは、 本発明は、抗肥満及び脂質代謝改善等の生理作用に優れたステロールの 5—ェン 3—オン体又は 3, 6—ジオン体を収率よく合成することができる製造方法、並びに 該ステロールの 5—ェン 3—オン体又は 3, 6 ジオン体を含有する脂質代謝改善 剤、飲食品及び動物用飼料の製造方法、並びにステロールの 5—ェンー 3—オン体 及び 3, 6—ジオン体を同時に且つ効率的に分析できる分析方法に関する。
背景技術
[0002] コレステロール誘導体には、様々な生理的作用があることが知られており、現在、医 薬、飲食品及び飼料等の様々な分野で使用されている。例えば、下記特許文献 1に は、 24 アルキルコレスタン一 3 -オン又は 24 -アルキルコレステン 3 オン等を 有効成分として含む抗肥満剤及び脂質代謝改善剤が開示されている。また、下記特 許文献 2には、ステロールの 5 ェン一 3 オン体である 24 -メチルコレスト一 5 ェ ンー 3—オンを有効成分として含む抗肥満剤及び脂質代謝改善剤が開示されている 。更に、ステロールの 4—ェン— 3—オン体と比べて、 5—ェン— 3—オン体や 3, 6- ジオン体の方が抗肥満及び脂質代謝改善作用に優れて 、ることが知られて 、る。
[0003] コレスロール誘導体の合成方法としては、化学的な合成方法の他、微生物等を培 養することによる生物学的な合成方法等が知られている。生物学的な合成方法とし て、例えば、下記非特許文献 1には、コレステロール又はその誘導体を基質とし、酵 素であるコレステロールォキシダーゼによりコレスト 4ーェン 3—オンが得られるこ とが開示されている。この方法では、基質であるコレステロール又はその誘導体から 酸ィ匕反応により 5—ェン 3—オン体が得られ、次 、で速やかに異性ィ匕反応を経て 4 —ェン—3—オン体が生成する。そして、下記非特許文献 2には、水層 Z有機溶媒 の 2層系で、コレステロールォキシダーゼを産生する性質を有する微生物（ァルスロ パクター）を用いて、生物学的にコレステロールからコレストー4ーェンー3—オンへ 変換する方法が記載されて ヽる。
[0004] 特許文献 1 :特開平 11 193296号公報
特許文献 2：特開 2001— 240544号公報
非特許文献 1 :「バイオサイエンスとインダストリ一」 Vol. 57 No. 7 ( ' 99) 464— 4 67
非特許文献 2：「Enzyme and Microbial TechnologyJ 1996, Vol. 18 : 184 189,
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] しかし、コレステロールォキシダーゼでは、酸化速度は異性化速度に比べ、数倍か ら数十倍程度小さぐ反応の律速は、酸ィ匕過程にあることが知られている。よって、上 記非特許文献 1のようなコレステロールォキシダーゼを用いた生物学的な合成方法 の場合、速やかに異性ィ匕が進んで 4 ェンー 3—オン体となり、 5—ェンー 3—オン体 の収率が極めて低いという問題がある。また、上記非特許文献 2も、単に生物学的に 4 ェンー 3—オン体を得ることが記載されているのみであり、生物学的な合成方法 において、 5—ェンー 3—オン体の収率を向上させる点についての技術的知見は存 在しない。更に、上記非特許文献 1及び 2には、 3, 6 ジオン体の生物学的な合成 についての開示はない。そこで、従来の方法よりも生産性に優れたステロールの 5— ェンー 3—オン体の製造方法及び 3, 6—ジオン体の製造方法の開発が望まれてい た。
[0006] 本発明は、上記現状に鑑みてなされたものであり、抗肥満及び脂質代謝改善等の 生理作用に優れたステロールの 5—ェンー 3—オン体又は 3, 6—ジオン体を収率よ く合成することができる製造方法、並びに該ステロールの 5—ェンー3—オン体又は 3 , 6—ジオン体を含有する脂質代謝改善剤、飲食品及び動物用飼料の製造方法、並 びにステロールの 5—ェンー 3—オン体及び 3, 6—ジオン体を同時に且つ効率的に 分析できる分析方法を提供することを目的とする。 課題を解決するための手段
[0007] 本発明者等は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、全く意外にも、 アルカン等の炭化水素系溶媒層と水層とからなる二層溶媒で、ステロール及びその 誘導体を基質とし、コレステロールォキシダーゼ又はコレステロールォキシダーゼ活 性を示す微生物を培養することにより、従来よりも高収率でステロールの 5—ェン 3 オン体又は 3, 6—ジオン体を得ることができることを見出して、本発明を完成する に至った。また、ステロールの 5—ェン— 3—オン体及び 3, 6—ジオン体を分析する 際、移動相及びカラム温度を特定することにより、従来は困難であった高速液体クロ マトグラフィ（以下、「HPLC」という。）法によるステロールの 5—ェン一 3—オン体及 び 3, 6—ジオン体の同時分離定量が可能になることを見出して、本発明を完成する に至った。
[0008] 本発明は以下に示す通りである。
〔1〕コレステロールォキシダーゼ含有液力 なる水層と、炭化水素溶媒からなる炭 化水素溶媒層で構成される二層溶液に、ステロール又はその誘導体を含有させて反 応させることを特徴とするステロールの 5—ェン 3—オン体又は 3, 6 ジオン体の 製造方法。
〔2〕上記コレステロールォキシダーゼ含有液は、コレステロールォキシダーゼ活性 を示す微生物の培養液である上記〔 1〕記載のステロールの 5 ェン 3 オン体又 は 3, 6—ジオン体の製造方法。
〔3〕上記微生物は、ァルスロパクター（Arthrobacter)属、ストレプトマイセス（Stre ptomyces)属、ブレビバタテリゥム（Brevibacteriumu)属、又はロドコッカス（Rhod ococcus)属、及びバチスル属に属する細菌の 1種又は 2種以上である上記〔2〕記載 のステロールの 5—ェン— 3—オン体又は 3, 6—ジオン体の製造方法。
〔4〕上記〔1〕に記載の方法により得られたステロールの 5 ェンー 3 オン体又は 3 , 6—ジオン体を含有させることを特徴とする脂質代謝改善剤の製造方法。
〔5〕上記〔1〕に記載の方法により得られたステロールの 5 ェンー 3 オン体又は 3 , 6—ジオン体を含有させることを特徴とする飲食品の製造方法。
〔6〕上記〔1〕に記載の方法により得られたステロールの 5 ェンー 3 オン体又は 3 , 6—ジオン体を含有させることを特徴とする動物用飼料の製造方法。 〔7〕ァセトニトリル及びイソプロピルアルコールを体積基準で（3〜5) / (5〜7)の割 合で混合して得られた混合液を移動相として、 HPLC法にてステロールの 5—ェン—
3—オン体及び 3, 6—ジオン体を同時に分離定量することを特徴とするステロールの
5—ェンー3—オン体及び 3, 6—ジオン体の分析方法。
〔8〕 HPLC法におけるカラムの温度を 10〜30°Cとする上記〔7〕記載のステロール の 5—ェン— 3—オン体及び 3 , 6 -ジオン体の分析方法。
発明の効果
[0009] 本発明のステロールの 5 ェンー 3 オン体又は 3, 6 ジオン体の製造方法は、 上記構成を備えることにより、抗肥満及び脂質代謝改善等の生理作用に優れたステ ロールの 5—ェンー3—オン体又は 3, 6—ジオン体を、従来よりも高収率で得ること ができる。
また、本発明の脂質代謝改善剤、飲食品、動物用飼料の製造方法は、上記構成を 有することにより、上述の優れた作用を奏する脂質代謝改善剤、飲食品及び動物用 飼料を、従来よりも効率的に得ることができる。
更に、本発明のステロールの 5—ェンー3—オン体及び 3, 6—ジオン体の分析方 法によれば、従来は困難であった HPLC法によるステロールの 5—ェンー3—オン体 及び 3, 6 ジオン体の同時分離定量を行うことができる。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 以下、本発明を説明する。
本発明の上記「二層溶液」を構成する上記「コレステロールォキシダーゼ含有液か らなる水層」は、水系溶媒中にコレステロールォキシダーゼを含有する層である。該 水系溶媒の種類は、上記炭化水素系溶媒と混合せずに二層に分離する性質を有す る限り、特に限定はない。上記水系溶媒として、通常は水が用いられる。
[0011] 上記「コレステロールォキシダーゼ」は、 3 β—ヒドロキシステロイド 1分子と酸素 1分 子との間の反応を触媒し、相当する 3—ォキソステロイドと過酸ィ匕水素とを生じる酵素 である（EC. 1. 1. 3. 6)。上記コレステロールォキシダーゼは、通常は微生物が産 生する天然由来のコレステロールォキシダーゼが用いられる力 上記反応を触媒す る性質を有する限り、遺伝子工学的手法等により、アミノ酸配列や高次構造が改変さ れたコレステロールォキシダーゼを用いてもょ 、。
[0012] 上記コレステロールォキシダーゼ含有液は、通常は、水系溶媒にコレステロールォ キシダーゼを直接添加含有させることにより調製されるが、その他、水系溶媒中にコ レステロールォキシダーゼ活性を示す微生物を添加し、培養することにより調製して もよい。即ち、上記コレステロールォキシダーゼ含有液は、コレステロールォキシダー ゼ活性を示す微生物の含有液をも含む。
[0013] 上記「微生物」は、コレステロールォキシダーゼ活性を示す微生物であれば、その 種類に特に限定はない。例えば、上記「微生物」としては、ァガリカス属ゃカワラタケ 等の担子菌類、ァスペルギルス属及びモナスカス属等の糸状菌類、ァルスロバクタ 一（Arthrobacter)属、ストレプトマイセス属、ブレビバタテリゥム（Brevibacteriumu )属、ロドコッカス (Rhodococcus)属、並びにバチスル属に属する細菌等が挙げら れる。上記微生物として具体的には、例えば、ァルスロパクター シンプレックス (Art hrobacter Simplex、別名ノカルディオイデス シンプレックス〔Nocardioidos Si mplex〕）等が挙げられる。
[0014] 上記微生物は、通常は、市販されている微生物が用いられるが、その他、自然的又 は EMS (ェチルメタンスルフォネート）、ジェチルサルフェート、 NTG (N—メチルー N， 一-トロー N— -トロソグァ-ジン）及び-トロソグァ-ジン等の化学物質、並びに X線、 γ線及び紫外線等による人為的変異手段により得られ、菌学的性質が変異し た微生物であっても、コレステロールォキシダーゼ活性を示す限り、利用することがで きる。また、コレステロールォキシダーゼをコードする遺伝子を適当なベクター等によ り大腸菌等の微生物内に導入し、形質転換を行ってコレステロールォキシダーゼの 発現を可能にした形質転換微生物も使用することができる。
[0015] 上記コレステロールォキシダーゼ含有液の ρΗは、コレステロールォキシダーゼの 活性を損なわない限り特に限定はなぐ用いるコレステロールォキシダーゼや微生物 の種類等に合わせて種々の範囲とすることができる。上記コレステロールォキシダー ゼ含有液の pHiま、通常 ίま 5. 0〜9. 0、好ましく ίま 6. 0〜8. 0、更に好ましく ίま 6. 5 〜7. 5である。上記コレステロールォキシダーゼ含有液の ρΗの調節は、例えばアン モ-ァ水溶液、水酸ィ匕カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶 液、炭酸カリウム水溶液等の塩基性溶液、リン酸等の酸性溶液の添加によって行うこ とがでさる。
[0016] 上記コレステロールォキシダーゼ含有液は、上記コレステロールォキシダーゼ又は 上記コレステロールォキシダーゼ活性を示す微生物を必須として含む力 本発明の 作用効果を損なわない限り、他の成分を含んでもよい。例えば、上記コレステロール ォキシダーゼ活性を示す微生物の生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩類、ァミノ 酸、及びビタミン等を含んでいてもよい。また、上記コレステロールォキシダーゼの働 きを助けるための補酵素を含めることもできる。更に、上記コレステロールォキシダー ゼ含有液の pHを調整するための pH調整剤を含んで 、てもよ 、。
[0017] 上記コレステロールォキシダーゼ含有液中の上記コレステロールォキシダーゼの含 有量及び微生物の植菌数についても特に限定はなぐ必要に応じて適宜の含有量 及び植菌数とすることができる。
[0018] 本発明の上記「二層溶液」を構成する上記「炭化水素系溶媒力 なる炭化水素系 溶媒層」は、上記二層溶液を構成する上記水層と完全に混合せず、二層に分離する 性質を有する溶媒であれば使用することができる。上記「炭化水素溶媒」は、脂肪族 炭化水素、脂環式炭化水素、及び芳香族炭化水素系溶媒のいずれでも構わない。 また、これら 1種のみでもよぐあるいは 2種以上の混合溶媒でもよい。上記「炭化水 素溶媒」の炭素数についても特に限定はないが、通常は炭素数 4以上、好ましくは炭 素数 4〜12、更に好ましくは炭素数 5〜8の炭化水素系溶媒が使用される。上記炭 化水素系溶媒としては、例えば、アルカンの具体例としては、例えば、 n—ブタン、 n 一へキサン及びヘプタン等のアルカン、シクロへキサン等のシクロアルカン等が挙げ られる。また，上記炭化水素系溶媒には、本発明の作用効果を阻害しない限り、他の 物質を含んでいてもよい。
[0019] 本発明では、コレステロールォキシダーゼ含有液力もなる水層に炭化水素系溶媒 を添加して、水層—炭化水素系溶媒層の二層からなる二層溶液を調製する。尚、該 二層溶液を調製する場合、上記コレステロールォキシダーゼ含有液と上記炭化水素 系溶媒の添加順序については特に限定はない。例えば、上記炭化水素系溶媒に上 記コレステロールォキシダーゼ含有液を加えてもよぐ逆に、上記コレステロールォキ シダーゼ含有液に上記炭化水素系溶媒を加えてもよい。また、上記二層溶液におけ る上記水層と上記炭化水素系溶媒層の割合についても特に限定はなぐ必要に応じ て種々の範囲とすることができる。通常、上記水層と上記炭化水素系溶媒層との比（ 体積比）は、 1： (0. 2〜2)、好ましくは 1： (0. 4〜1. 5)、更に好ましくは 1： (0. 5〜1 )である。
[0020] 本発明では、上記二層溶液に、基質となる「ステロール又はその誘導体」を含有さ せ、上記コレステロールォキシダーゼによる反応を行う。上記「ステロール」の種類に は特に限定はなぐ必要に応じて様々な誘導体を使用することができる。上記「ステロ ール又はその誘導体」としては、例えば、植物ステロール (植物由来のステロール及 びその誘導体、例えば、 j8—シトステロール、カンべステロール、スティグマステロ一 ノレ等）、コレステロール、エルゴステロール、ラノステロール、並びにコレスタン一 3— オン、コレステン 3 オン及びこれらの 24 アルキル体等の誘導体等が挙げられる
[0021] 上記二層溶液に上記「ステロール又はその誘導体」を含有させる方法については 特に限定はない。例えば、上記二層溶液を調製後、「ステロール又はその誘導体」を 添加してもよい。あるいは、上記二層溶液を調製する前の上記コレステロールォキシ ダーゼ含有液又は上記炭化水素系溶媒に「ステロール又はその誘導体」を添加し、 次いで上記コレステロールォキシダーゼ含有液と上記炭化水素系溶媒とを混合し、 上記二層溶液の調製と同時に上記「ステロール又はその誘導体」を含有させてもよい
[0022] 上記反応の条件については特に限定はない。例えば、反応温度は通常 25〜42°C 、好ましくは 28〜38°Cとすることができる。また、反応時間は通常 5〜72時間、好まし くは 24〜48時間とすることができる。更に、反応中は適宜振とう又は攪拌を行うことも できる。
[0023] 本発明により得られたステロールの 5 ェンー 3 オン体又は 3, 6 ジオン体の精 製、回収方法については特に限定はなぐ必要に応じて適宜に手段により回収、精 製することができる。通常は、上記反応液のうち、ステロールの 5—ェンー3—オン体 又は 3, 6—ジオン体が含まれる炭化水素溶媒層を分離し、必要に応じて溶媒留去 等により有効成分を濃縮した後、凍結乾燥、噴霧乾燥、真空乾燥等の適宜の方法で 乾燥することにより回収することができる。また、この精製、回収方法において、必要 に応じて上記反応液又は分離した炭化水素溶媒層を滅菌フィルターに通す等の処 理をすることにより、滅菌処理をすることもできる。尚、上記回収方法において、上記 反応液にメタノール、エタノール等のアルコールを添加すると、上記反応液を水層 炭化水素溶媒層の二層に分けることが容易になり、その結果、ステロールの 5—ェン —3—オン体又は 3, 6—ジオン体の精製、回収が容易になることから好ましい。
[0024] 本発明により得られる「ステロールの 5 ェン体 3 オン体」は、ステロール骨格の 5位に二重結合を有し、 3位にケトン基を有する限り、特にその構造に限定はない。ま た、本発明により得られる「ステロールの 3, 6—ジオン体」は、ステロール骨格の 3位 及び 6位にケトン基を有する限り、特にその構造に限定はない。例えば、ステロール 骨格又は側鎖にアルキル基 (メチル基、ェチル基等)等の適宜の官能基を有して 、 てもよい。また、二重結合の数についても特に限定はなぐステロール骨格又は側鎖 中に 1個以上、好ましくは 1〜4個、更に好ましくは 1〜2個の他の二重結合を有して いてもよい。
[0025] 上記「ステロールの 5 ェンー3 オン体」として具体的には、例えば、 24 アルキ ルコレスト一 5 ェン一 3—オン、 24 アルキルコレスト一 5, 7 ジェン 3—オン、 2 4 アルキルコレスト一 5, 8 ジェン 3—オン、 24 アルキルコレスト一 5, 9 (11) —ジェン一 3—オン、 24 アルキルコレスト一 5, 22 ジェン 3—オン、 24 アル キルコレス卜— 5, 7, 22 卜リエン— 3—オン、 24 アルキルコレス卜— 5, 8, 22 トリ ェン一 3—オン、 24 アルキルコレスト一 5, 9 (11) , 22 トリェン一 3—オン、 24— アルキルコレスト—5, 25 (27) ジェンー3 オン等が挙げられる。尚、上記各物質 中の「アルキル」としては、メチル基やェチル基等が挙げられる。また、上記「ステロ一 ルの 3, 6—ジオン体」として具体的には、例えば、 4—コレステン一 3, 6—ジオン、 4 —カンペスト一 3, 6 ジオン、 24 ァノレキノレコレスト一 4 ェン一 3, 6 ジオン等が 挙げられる。
[0026] 本発明は、 5 ェンー3 オン体を得るために行ってもよぐ 3, 6 ジオン体を得る ために行ってもよい。更に、本発明では、 5—ェンー3—オン体及び 3, 6—ジオン体 の両方を同時に得ることができるので、両者を同時に得るために行ってもよい。
[0027] 本発明により得られるステロールの 5 ェンー3 オン体及び 3, 6 ジオン体の分 離定量方法については特に限定はなぐ必要に応じて種々の方法により行うことがで きる。通常は、以下に詳述する本発明の分析方法により行うことができる。
[0028] 本発明により得られたステロールの 5 ェンー 3 オン体及び 3, 6 ジオン体は、 ステロールの 4 ェンー 3—オン体と比べて、優れた抗肥満及び脂質代謝改善作用 等の生理作用を有する。よって、本発明により得られたステロールの 5—ェンー3—ォ ン体は、様々な用途に用いることができる。例えば、抗肥満剤及び脂質代謝改善剤 等の医薬品、飲食品への添加剤、飼料用添加剤として用いることができる。その結果 、ステロールの 5—ェンー 3—オン体を含有する抗肥満剤及び脂質代謝改善剤等の 医薬品、抗肥満及び脂質代謝改善作用を有する健康飲料又は健康食品、肉質改善 等を目的とした家畜用飼料又は魚類用飼料、及び愛玩動物の肥満等の防止のため のペットフード等を得ることができる。
[0029] 本発明のステロールの 5 ェンー 3 オン体及び 3, 6 ジオン体の分析方法は、 ァセトニトリル及びイソプロピルアルコールを体積基準で（3〜5) / (5〜7)の割合で 混合して得られた混合液を移動相として、高速液体クロマトグラフィ (HPLC)法にて ステロールの 5—ェンー 3—オン体及び 3, 6—ジオン体を同時に分離定量することを 特徴とする。
[0030] 本発明のステロールの 5 ェンー 3 オン体及び 3, 6 ジオン体の分析方法にお いて、上記混合液は、ァセトニトリル及びイソプロピルアルコールを用いる。そして、ァ セトニトリル及びイソプロピルアルコールの割合は、体積基準で（3〜5) / (5〜7)、 好ましくは（3. 5〜4. 5) / (5. 5〜6. 5)の割合である。力かる範囲とすることにより、 従来は困難であったステロールの 5—ェンー 3—オン体及び 3, 6—ジオン体の同時 分離定量を実現することができる。また、上記 HPLC法において、その他の条件につ いては特に限定はなぐカラムの種類、長さ、温度、移動相の流量等は必要に応じて 種々の範囲とすることができる。例えば、分離効率及び作用効率の観点から、カラム の長さは 20〜80cm、好ましくは 40〜60cmとすることができる。また、カラムの温度 を 10〜30°C、好ましくは 15〜25°Cとすることができる。更に、移動相の流量としては 0. l〜5mlZminが好ましぐ 0. 1〜： LmlZminがより好ましい。
実施例
[0031] 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
前培養培地として、以下の表 1 (A)に記載の組成の水系液体培地 (pH ; 7. 0±0. 1)を調製した。また、本培養培地として、以下の表 1 (B)に記載の組成の水系液体培 地 (pH ; 7. 0±0. 1)を調製した。更に、使用菌体として、グラム陽性桿菌である市販 のァノレスロバクタ一 シンプレックス（Arthrobacter Simplex)を用いた。
[0032] [表 1] 表 1
(A)前培養培地
Figure imgf000011_0001
[0033] アクティブスラントより 1白金耳の上記菌体を搔き取り、上記前培養培地に植菌した 。そして、 30°C、約 180rpmの条件で 2日間振とう培養した。次いで、植菌濃度が 2% 程度となるように、上記前培養培地を上記本培養培地に植菌した。そして、通気量を 1WM、 pHを 7. 0±0. 2、温度を 30。C±0. 3、羽根の回転を 250rpm、溶存酸素 を適宜調整するという条件で、 2日間培養を継続した。この際、コレステロールォキシ ダーゼの誘導剤として、植物ステロールの一種である「PHS— FK」（タマ生化学社製 )を 0. 1%、乳化剤「0— 10V」（花王株式会社製)を 0. 1%添加した。
[0034] 培養終了後、該本培養培地 100mlに、これと等量のへキサンを添加し、更に、最 終濃度が 1%となるように、以下の表 2に記載の基質をそれぞれ添加して、水層—炭 化水素系溶媒層からなる二層溶液を調整した。そして、該本培養培地を密閉後、上 層と下層が混合する程度に攪拌しながら 2日間反応を継続した。反応終了後、上記 二層溶液の 2倍量のエタノールを添加して攪拌を行!ヽ、更に少しずつエタノールを添 加し、上層 (炭化水素系溶媒層）と下層 (水層）とを分離した。下層を完全除去後、上 層を滅菌フィルターに通塔し、次いで、真空乾燥機にて乾固することにより、生成物 を粉末状で回収した。この生成物を HPLCにて分析した。その結果を以下の表 2に 示す。尚、比較例として、基質としてコレステロールを用い、上記へキサンをカ卩えない 他は、上記と同様の方法により反応を行って、生成物を分析した。その結果を以下の 表 2に併記する。
[0035] 生成物の HPLC分析は、以下の方法により行った。
ァセトニトリル及びイソプロピルアルコールを 4Z6 (体積基準）の割合で混合し、ァ スピレーターを用いて減圧脱気することにより、移動相を調製した。次いで、該移動 相をカラムボリュームの 10倍量通液し、カラムの平衡ィ匕を行った。カラムの平衡化は 、ベースラインをモニターし、ベースラインが安定したら完了した。
そして、上記生成物を正確に秤量し、上記移動相に 0. 2% (vZv)となるように溶解 した。溶解後、該溶液をフィルター処理 (0. 42 m)し、 HPLC試料とした。そして、 以下の条件で HPLCを行った。
〔HPLC条件〕
カラム；「Cadenza CD C— 18」（4. 6 X 500mm;インタタト社製） 検出器及び検出波長；「UV detecter」 210nm
カラム温度； 18°C
試料溶解溶媒;移動相と同じ
注入量；20 1
得られたピーク面積の値と検量線力 試料中の各成分の含量を求め、以下の式に より各成分濃度を定量した。
各成分濃度（％、 v/v) =検量線より求めた試料中の各成分の含量 X 100Z40 [0036] [表 2]
表 2
Figure imgf000013_0001
*：界面活性剤を添加し、基質を懸濁して反応（反応時有機溶媒無添加)
[0037] 表 2より、炭化水素系溶媒であるへキサン層がない状態で反応を行った場合、比較 例 1に示すように、得られるのは 4ーェン体のみであり、本願発明が目的とする 5—ェ ン体及び 3, 6—ジオン体は得ることができな力つたことが分かる。
一方、コレステロールォキシダーゼ含有液力 なる水層と、炭化水素系溶媒である へキサン層で構成される二層溶液に基質であるコレステロールを添加し、反応を行つ た実施例 1では、比較例 1と異なり、 5—ェン体を得ることができることが分かる。また、 植物ステロールを基質として用いた場合、実施例 2に示すように、 5—ェン体を得ると 共に、 3, 6—ジオン体をも得ることができることが分かる。
[0038] 尚、本発明では、上記具体的実施例に示すものに限られず、目的、用途に応じて 本発明の範囲内で種々変更した実施例とすることができる。
産業上の利用可能性
[0039] 本発明は、優れた抗肥満及び脂質代謝改善作用等の生理作用を有するステロー ルの 5—ェン— 3—オン体又は 3, 6—ジオン体を効率よく製造することができる。本 発明は、飲食品、医薬品、動物用飼料等の分野に好適に利用できる。

Claims

請求の範囲
[1] コレステロールォキシダーゼ含有液力 なる水層と、炭化水素系溶媒からなる炭化 水素系溶媒層とで構成される二層溶液に、ステロール又はその誘導体を含有させて 反応させることを特徴とするステロールの 5—ェン 3—オン体又は 3, 6 ジオン体 の製造方法。
[2] 上記コレステロールォキシダーゼ含有液は、コレステロールォキシダーゼ活性を示 す微生物の培養液である請求項 1記載のステロールの 5 ェンー 3 オン体又は 3, 6—ジオン体の製造方法。
[3] 上記微生物は、ァルスロパクター（Arthrobacter)属、ストレプトマイセス (Strepto myces)属、ブレビノ クテリゥム (Brevibacteriumu)属、又はロドコッカス (Rhodoco ecus)属、及びバチスル属に属する細菌の 1種又は 2種以上である請求項 2記載のス テロールの 5—ェンー3—オン体又は 3, 6—ジオン体の製造方法。
[4] 請求項 1に記載の方法により得られたステロールの 5 ェンー3 オン体又は 3, 6 ージオン体を含有させることを特徴とする脂質代謝改善剤の製造方法。
[5] 請求項 1に記載の方法により得られたステロールの 5 ェンー3 オン体又は 3, 6 ージオン体を含有させることを特徴とする飲食品の製造方法。
[6] 請求項 1に記載の方法により得られたステロールの 5 ェンー3 オン体又は 3, 6 ージオン体を含有させることを特徴とする動物用飼料の製造方法。
[7] ァセトニトリル及びイソプロピルアルコールを体積基準で（3〜5) / (5〜7)の割合 で混合して得られた混合液を移動相として、高速液体クロマトグラフィ (HPLC)法に てステロールの 5—ェンー 3—オン体及び 3, 6—ジオン体を同時に分離定量すること を特徴とするステロールの 5—ェン— 3—オン体及び 3 , 6 -ジオン体の分析方法。
[8] 高速液体クロマトグラフィ (HPLC)法におけるカラムの温度を 10〜30°Cとする請求 項 7記載のステロールの 5—ェン 3—オン体及び 3 , 6 ジオン体の分析方法。
PCT/JP2005/012869 2004-07-14 2005-07-12 ステロールの５－エン－３－オン体又は３，６－ジオン体の製造方法、脂質代謝改善剤、飲食品及び動物用飼料の製造方法、並びに分析方法 WO2006006608A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/632,072 US8008040B2 (en) 2004-07-14 2005-07-12 Process for production of 5-ene-3-one or 3,6-dione derivatives of sterols, processes for production of lipid metabolism improvers, foods, drinks, and animal feeds, and analytical method
CN2005800231293A CN101006184B (zh) 2004-07-14 2005-07-12 甾醇的5-烯-3-酮衍生物或3,6-二酮衍生物的制造方法，脂质代谢改善剂、饮食品以及动物饲料的制造方法，和分析方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004207885A JP4404710B2 (ja) 2004-07-14 2004-07-14 ステロールの５−エン−３−オン体の製造方法、及び分析方法
JP2004-207885 2004-07-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006006608A1 true WO2006006608A1 (ja) 2006-01-19

Family

ID=35783947

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/012869 WO2006006608A1 (ja) 2004-07-14 2005-07-12 ステロールの５－エン－３－オン体又は３，６－ジオン体の製造方法、脂質代謝改善剤、飲食品及び動物用飼料の製造方法、並びに分析方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US8008040B2 (ja)
JP (1) JP4404710B2 (ja)
KR (1) KR101040099B1 (ja)
CN (1) CN101006184B (ja)
TW (1) TWI421256B (ja)
WO (1) WO2006006608A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011051939A (ja) * 2009-09-02 2011-03-17 Toyo Hakko:Kk 血中ｈｄｌコレステロール上昇剤、並びにそれを含む飲食品添加剤、飲食品及び医薬
KR20210053284A (ko) 2018-08-30 2021-05-11 다이산카세이 컴파니 리미티드 피토스테논의 신규 용도

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999045106A1 (fr) * 1998-03-03 1999-09-10 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Oxydase du cholesterol
JP2001055333A (ja) * 1999-08-19 2001-02-27 House Foods Corp 神経細胞突起伸展剤

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3873097B2 (ja) 1997-11-06 2007-01-24 独立行政法人理化学研究所 抗肥満剤及び脂質代謝改善剤
US20030153051A1 (en) * 1998-03-03 2003-08-14 Rikizo Aono Cholesterol oxidase
JP3858055B2 (ja) 2000-02-29 2006-12-13 独立行政法人理化学研究所 抗肥満剤及び脂質代謝改善剤

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999045106A1 (fr) * 1998-03-03 1999-09-10 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Oxydase du cholesterol
JP2001055333A (ja) * 1999-08-19 2001-02-27 House Foods Corp 神経細胞突起伸展剤

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DOUKYU N. ET AL.: "Control with organic solvents of efficiency of persolvent cholesterol fermentation by Pseudomonas sp. strain ST-200", BIOSCI. BIOTECH. BIOCHEM., vol. 60, no. 10, 1996, pages 1612 - 1616, XP002926516 *
MICHIHISA N. ET AL.: "Yuki Yobai Taisei Biseibutsu no Tansaku to Riyo", BIOSCIENCE & INDUSTRY, vol. 61, no. 1, 2003, pages 17 - 22, XP003000500 *
YAMASHITA M. ET AL.: "Separation of the two reactions oxidation and isomerization, catalyzed by Streptomyces cholesterol oxidase", PROTEIN ENGINEERING, vol. 11, no. 11, 1998, pages 1075 - 1081, XP003000501 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP4404710B2 (ja) 2010-01-27
US8008040B2 (en) 2011-08-30
CN101006184B (zh) 2011-08-03
CN101006184A (zh) 2007-07-25
KR20070041450A (ko) 2007-04-18
US20080248520A1 (en) 2008-10-09
TW200606173A (en) 2006-02-16
TWI421256B (zh) 2014-01-01
KR101040099B1 (ko) 2011-06-09
JP2007284348A (ja) 2007-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102321678A (zh) 一种微生物转化制造1α-羟基维生素D的方法
WO2018155485A1 (ja) 新規微生物、およびそれを用いたウロリチン類の製造方法
CN86103879A (zh) 制备2-芳基丙酸的方法
WO2006006608A1 (ja) ステロールの５－エン－３－オン体又は３，６－ジオン体の製造方法、脂質代謝改善剤、飲食品及び動物用飼料の製造方法、並びに分析方法
JP3630344B2 (ja) イノシトール立体異性体の製造方法
JP2792600B2 (ja) メバロン酸生産菌
CN105802872B (zh) 一种荧光假单胞菌和生产吩嗪酰胺的方法及其应用
JP2663294B2 (ja) ビタミンｄ類の製造方法
CN103451242A (zh) 一种微生物转化制造1α-羟基维生素D的方法
JP2006314248A (ja) トリテルペン誘導体の製造方法
JP2020058319A (ja) ６−ヒドロキシダイゼインの製造方法
JP2009215231A (ja) 結晶１，５−ｄ−アンヒドログルシトールの製造法
JP3892427B2 (ja) ヒドロキシクエン酸の製造方法
JP2005278525A (ja) 芳香族化合物の製造方法
JP3747640B2 (ja) 光学活性１，２−ジオール環状炭酸エステルの製造法
JP2019180283A (ja) ウロリチン類の製造方法
UA122249C2 (uk) Спосіб одержання поверхнево-активних речовин
JPH01172398A (ja) アンスラサイクリン化合物ｒ２０ｘ２の製造法
CN118146999A (zh) 自养假诺卡氏菌及其应用
RU2205224C2 (ru) Способ получения андрост-4-ен-3,17-диона из стеринов растительного и животного происхождения или их производных
JP2004041146A (ja) ホモグルタチオンの製造方法
UA131043U (uk) Спосіб одержання поверхнево-активних речовин
BE526313A (ja)
JPS6244915B2 (ja)
JPS637795A (ja) ７α−ヒドロキシアンドロスタ−４−エン−３，１７−ジオンの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020067026761

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200580023129.3

Country of ref document: CN

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11632072

Country of ref document: US