WO2005103275A1 - 発酵法によるｌ－トリプトファンの製造法 - Google Patents

発酵法によるｌ－トリプトファンの製造法 Download PDF

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WO2005103275A1
WO2005103275A1 PCT/JP2004/006005 JP2004006005W WO2005103275A1 WO 2005103275 A1 WO2005103275 A1 WO 2005103275A1 JP 2004006005 W JP2004006005 W JP 2004006005W WO 2005103275 A1 WO2005103275 A1 WO 2005103275A1
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tryptophan
bacterium
operon
producing
strain
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PCT/JP2004/006005
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Masahiro Kakehi
Shintaro Iwatani
Kazuo Nakanishi
Naoki Usui
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Ajinomoto Co., Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/227—Tryptophan

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing L-tributophan by a fermentation method.
  • L-triptophan is industrially useful as a feed additive, a pharmaceutical raw material for infusions and the like.
  • L-amino acids are industrially produced by fermentation using microorganisms belonging to the genus Plebipacterium, Corynepacterium, Escherichia, and the like.
  • a method using a recombinant Escherichia coli is described in JP-A-57-71397 or US Patent No. 4,371,614.
  • a method using a mutant strain of subtilis (Bacillus subtilis) is described in JP-B-53-39517 or JP-B-62-34399, and a method using a recombinant Bacillus subtilis is disclosed in
  • a method using a mutant strain of the genus Brevibacterium is described in JP-A-57-74096, which is described in JP-A-104790 or JP-B-62-34399.
  • a method using a recombinant Brevibacterium is described in JP-A-62-51980.
  • breeding of these L-tryptophan-producing bacteria is mainly due to the enhancement of enzymes that catalyze reactions in the common pathway of various amino acid biosynthesis and subsequent pathways unique to L-tributophane biosynthesis, or by L-tryptophan. It has been done by avoiding regulation (feedback inhibition). Specifically, the application of nutritional requirements to microorganisms, the provision of drug resistance, and the amplification of biosynthetic enzyme genes by recombinant DNA techniques have been performed. As such a biosynthetic enzyme gene, L-triptophan operon and the like are known (JP-A-57-71397, JP-A-62-244382, U.S. Pat. No. 4371614).
  • bacteria of the genus Escherichia belonging to the genus Escherichia bacterium which has the ability to produce L-glutamic acid and has a constitutive expression of malate synthase, isocitrate lyase, isocitrate dehydrogenase kinase Z phosphatase operant (hereinafter also referred to as “ace operon”).
  • ace operon isocitrate dehydrogenase kinase Z phosphatase operant
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing L-tributofan by improving the ability of microorganisms to produce L-tributanoic acid.
  • the present inventors have conducted intensive studies on the improvement of L_tributophane production ability of a bacterium belonging to the genus Escherichia, and as a result, an L-tryptophan analog named JAT is produced as a by-product with production of L-tributophane.
  • JAT an L-tryptophan analog
  • the present invention is as follows.
  • L-tryptophan-producing ability, and malate synthase 'isocitrate lyase' isocitrate dehydrogenase ⁇ ⁇ kinase / phosphatase operon is constitutively expressed or the operon
  • a method for producing L-tryptophan comprising culturing bacteria with enhanced expression in a medium, producing and accumulating L-tryptophan amino acids in the medium, and collecting the L-tryptophan amino acids.
  • the bacterium is a bacterium that constitutively expresses the operon when the expression level of the iclR gene decreases or disappears.
  • L-tryptophan-producing bacteria are cultured in a medium to produce and accumulate L-tryptophan in the same medium, and L-tryptophan is collected.
  • Bacteria that express constitutively or have enhanced expression of rate synthase, isocitrate lysate, or isocitrate dehydrogenase kinase / phosphatase operon, or have enhanced expression of tribubutane synthase A method for reducing the by-product of an L-tributophan analog by using the method.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of a plasmid vector pTSl having a temperature-sensitive replication origin.
  • FIG. 2 is a diagram showing an ODS column chromatogram of a fermentation product. The numerical values indicate the elution time (minutes). BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the bacterium used in the method for producing L-tryptophan of the present invention has L-tryptophan-producing ability and constitutively expresses the malate synthase 'isocitrate lyase ⁇ isocitre-1-dehydrogenase kinase ⁇ / phosphatase operon. Or a bacterium with enhanced expression of the same.
  • Examples of the bacterium used in the present invention include a bacterium belonging to the genus Escherichia, the genus Enterobacter, the genus Tarebushiella, the genus Serratia, the genus Erwinia or Pantoea, the genus Pseudomonas, the genus Earthpactor, and the genus Aeropactor.
  • bacteria belonging to the genus Escherichia are preferred.
  • Specific examples of the bacterium belonging to the genus Escherichia include Escherichia coli.
  • L-tributophan-producing ability refers to the ability to accumulate a significant amount of L-tributophan in a medium when a bacterium is cultured in the medium, or the L-tributophan content in a bacterial cell as a wild-type strain. Or, the ability to increase as compared to a non-transformed strain.
  • the bacterium having L-tryptophan-producing ability may be a mutant strain or a genetically modified strain. Mutants that increase the intracellular activity of an enzyme involved in L-tryptophan biosynthesis, specifically, a mutation that increases the expression level of an enzyme, or a mutation that releases feedback inhibition And a mutant having the following formula: Mutants can be obtained, for example, by irradiation with ultraviolet light or a mutagen that is commonly used in mutagenesis treatments such as N-methyl-N'-nitro_N-nitrosogazine (NTG) or nitrite to produce a wild-type strain of a genus Escherichia. Alternatively, it can be obtained by treating a derivative thereof.
  • NTG N-methyl-N'-nitro_N-nitrosogazine
  • transgenic strain a strain in which the copy number of a gene encoding an enzyme involved in biosynthesis of L-tributophane is increased, or a strain in which an expression control sequence is modified so that the expression level of the gene is increased Or a strain into which a gene encoding an enzyme whose feedback inhibition has been released has been introduced.
  • Preferred bacteria having L-tryptophan-producing ability are bacteria in which one or more of the activities of anthranilate synthase activity, phosphodalicerate dehydrogenase activity or tryptophan synthase activity are enhanced.
  • anthranilate synthase and phosphoglycerate dehydrogenase are subject to feedback inhibition by L-tryptophan and L-serine, respectively, the enzyme activity can be enhanced by retaining the desensitized mutant enzyme.
  • the anthranilate synthase gene (trpE) and / or the phosphoglycerate dehydrogenase gene (serA) are subject to feedback inhibition.
  • such a bacterium includes a plasmid having a mutant serA encoding a desensitized phosphodarycelate dehydrogenase in Escherichia coli SV164, which retains a desensitized anthranilate synthase.
  • a transformed strain obtained by introducing PGH5 (see W094 / 08031) may be mentioned.
  • a bacterium into which recombinant DNA containing the tryptophan operon has been introduced is a suitable L-tributophan-producing bacterium.
  • Escherichia coli having a tributophan operon containing a gene encoding a desensitized anthranilate synthase JP-A-57-71397, JP-A-62-244382). No. 4,371,614.
  • the expression of a gene encoding tryptophan synthase (trpBA) can also be enhanced or imparted with L-tributophan-producing ability.
  • Tryptophan synthase consists of ⁇ -subunit mosquito and is encoded by trpA (GenBank Accession No. V00364) and trpB (GenBank Accession No. V00365), respectively.
  • the tryptophan synthase activity can be measured by the method described in Science 1958; 128 (3328): p843-844.
  • the nucleotide sequence of trpA is shown in SEQ ID NO: 15, and the nucleotide sequence of trpB is shown in SEQ ID NO: 17.
  • a target gene can be obtained by synthesizing a primer based on a known sequence and performing PCR with chromosomal DNA of a bacterium belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli K-12 strain as a type III DNA. Noh.
  • a recombinant DNA can be prepared by ligating a gene of interest with a vector that functions in bacteria, and the bacterium can be transformed with the recombinant DNA. Transformation can be performed by the method of DA Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326, 1979), or by treating recipient cells with calcium chloride to increase DNA permeability (Mandel, M. and Higa, A , J. Mol., Biol., 53, 159 (1970)).
  • Examples of the vector include pUC19, pUC18, pUC118, pUC119, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218, pSTV28, PSTV29 and the like, and other phage vectors can also be used. .
  • Increasing the copy number of a gene can also be achieved by causing multiple copies of the gene of interest on the bacterial chromosomal DNA.
  • homologous recombination is performed using a sequence present in multiple copies on the chromosome DNA as a target.
  • a sequence present in multiple copies on the chromosome DNA repetitive DNA and an inpartite repeat present at the end of a transposable element can be used.
  • the activity of the target enzyme can also be increased by substituting a strong expression regulatory sequence such as the promoter of the gene encoding the target enzyme (see JP-A-1-215280).
  • a strong expression regulatory sequence such as the promoter of the gene encoding the target enzyme (see JP-A-1-215280).
  • lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, PR promoter of lambda phage, PL promoter, tet promoter, amyE promoter and the like are known as strong promoters.
  • L-tryptophan-producing bacteria strains containing L-feralanine and L-orchid synthon-requiring traits Escherichia coli 'AGX17 (pGX44) [NRRL B-12263], and plasmids containing the tryptophan operon Hold PGX50 AGX6 (pGX50) aroP [NRRL B-12264] (all refer to US Pat. No. 4,371,614).
  • the bacterium used in the present invention is a bacterium capable of producing L-tributophan as described above, and further comprises a malate synthase / isocitrate lyase 'isocitreto-dehydrogenase kinase Z phosphatase operon (ace operon).
  • ace operon a malate synthase / isocitrate lyase 'isocitreto-dehydrogenase kinase Z phosphatase operon.
  • a bacterium with enhanced expression or expression of the operon is a bacterium capable of producing L-tributophan as described above, and further comprises a malate synthase / isocitrate lyase 'isocitreto-dehydrogenase kinase Z phosphatase operon.
  • Constitutive expression of malate synthase, isocitrate lyase, isocitrate dehydrogenase kinase Z phosphatase operon indicates that the promoter of the ace operon is suppressed by the repressor protein iclR Means that they are not affected, and that suppression has been lifted.
  • the constitutive expression of the ace operon and the enhanced expression of the operon indicate that the ace operon encodes proteins such as malate synthase (aceB) and isocitrate lyase (aceA). It can be confirmed by the fact that the enzyme activity of isocitrate dehydrogenase kinase Z phosphatase (aceK) is increased as compared with the non-modified strain or the wild-type strain.
  • aceB malate synthase
  • aceA isocitrate lyase
  • the repressor (iclR) binding site on the ace operon may be modified so that iclR cannot bind.
  • suppression can be released by replacing the promoter of the operon with a strong promoter that is not suppressed by iclR (such as the lac promoter).
  • expression of the ace operon can be constitutive.
  • the expression control sequence of the gene encoding iclR is modified so that it does not express the gene, or the coding region is modified so that the function of the repressor is lost, so that the ace Can be suppressed from being suppressed.
  • the iclR gene can be obtained from Escherichia coli (EMBL / GenBank / DDBJ accession M31761, J. Bacteriol. 18, 3656-3656 (1990)). Also, the iclR-like gene is Streptomyces sericolor (EMBL / GenBank / DDBJ accession AL117387, Mol. Microbiol. 21 (1), 77-96 (1996)), Acinetobacter Sp. ). SEQ ID NO: 5 shows the sequence of the iclR gene of Escherichia coli.
  • the bacteria are irradiated with ultraviolet light or a normal mutation such as N-methyl-N'-nitro-N-et-mouth soguanidine (NTG) or nitrite.
  • NTG N-methyl-N'-nitro-N-et-mouth soguanidine
  • a method of treating with the mutagen used in the treatment and selecting a mutant strain in which the expression of iclR or the function of iclR is reduced or eliminated is used.
  • bacteria were transformed with DNA containing the iclR gene (deleted iclR) that was deleted so that the internal sequence of the iclR gene was deleted and did not produce a normally functioning repressor.
  • DNA containing the iclR gene deleted iclR
  • the iclR on the chromosome can be destroyed.
  • Such gene disruption by gene replacement using homologous recombination has already been established, and there are a method using linear DNA and a method using a plasmid containing a temperature-sensitive replication origin.
  • a temperature-sensitive replication origin, a deletion type iclR and a marker gene showing resistance to drugs such as ampicillin are introduced to prepare a recombinant DNA, and a coryneform bacterium is transformed with the recombinant DNA to obtain a temperature-sensitive replication origin.
  • a coryneform bacterium is transformed with the recombinant DNA to obtain a temperature-sensitive replication origin.
  • the strain in which the recombinant DNA has been integrated into the chromosome is originally present on the chromosome
  • the two fusion genes of the chromosomal iclR and the deleted iclR sandwich the other part of the recombinant DNA (vector part, temperature-sensitive replication origin and drug resistance). It is inserted into the chromosome in a state. Therefore, in this state, the normal iclR is dominant, and the transformant expresses a normal repressor.
  • one copy of the iclR is recombined with the vector portion (including the temperature-sensitive replication origin and one drug resistance marker) by recombination of the two iclRs.
  • the vector portion including the temperature-sensitive replication origin and one drug resistance marker
  • the excised DNA is maintained in the form of a plasmid when cultured at a temperature at which the temperature-sensitive replication origin functions.
  • iclR on the plasmid is eliminated from the cell together with the plasmid. Then, by selecting a strain in which the deletion type iclR remains on the chromosome by PCR, Southern hybridization, or the like, a strain in which the iclR has been disrupted can be obtained.
  • the bacterium of the present invention may be one in which the expression of the ace operon is enhanced.
  • To enhance the expression of the ace operon for example, ligating the DNA containing the ace operon to a strong promoter such as a lac promoter and introducing it into bacteria by plasmid homologous recombination, phage DNA or transposon By allowing the DNA to exist in multiple copies on a chromosome.
  • Examples of the DNA containing the ace operator include a DNA containing the nucleotide sequence registered in GenBank Accession No. X12431 (AceBA) and M18974 (AceK).
  • the gene sequence of AceB is shown in SEQ ID NO: 9
  • the gene sequence of AceA is shown in SEQ ID NO: 7
  • the gene sequence of AceK is shown in SEQ ID NO: 11.
  • L-tributophan By culturing the bacterium of the present invention obtained as described above in a medium, producing and accumulating L-tributophan in the medium, and collecting one tributophan from the medium, L-tributophan can be produced.
  • the cultivation of the bacterium of the present invention is carried out by a conventional method using a usual medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and if necessary, organic trace nutrients such as amino acids and vitamins.
  • I can.
  • Either a synthetic medium or a natural medium can be used.
  • the carbon source and the nitrogen source used in the medium may be of any type as long as the strain to be cultured is available.
  • sugars such as glucose, glycerol, fructose, sucrose, maltose, mannose, galactose, starch hydrolyzate, molasses, etc. are used.
  • Others are organic acids such as acetic acid and citric acid, and alcohols such as ethanol. Can be used alone or in combination with other carbon sources.
  • fructose is used as the main carbon source, the yield of L-tryptophan relative to sugar and the production rate are improved.
  • inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate
  • organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, ammonia water and the like
  • potassium phosphate magnesium sulfate, iron ions, manganese ions, etc. are added in small amounts.
  • organic trace nutrients it is desirable to include required substances such as vitamin B1 or yeast extract in an appropriate amount as necessary.
  • the culture may be performed under conditions according to the strain used.Specifically, the culture is preferably performed under aerobic conditions for 16 to 72 hours, and the culture temperature is 30 ° C to 45 ° C. During the culture, the pH is controlled at 5-7. For pH adjustment, an inorganic or organic acidic or alkaline substance, ammonia gas or the like can be used.
  • Collection of L-tryptophan from the fermentation broth can be carried out by appropriately combining known methods such as an ion exchange resin method, a precipitation method and the like.
  • the production of L-tryptophan analogs by-produced with the production of L-tributophan is significantly reduced. That is, the ability to express the ace operon constitutively, or enhancing the expression of the operon, or enhancing the activity of tryptophan synthase, reduces the production of by-products. It is presumed that the improvement in the yield of L-tributophane is based on the results.
  • the L-tributophan analog was analyzed by LC / MS and LC / NMR to have the following properties, and was named JAT.
  • the present invention provides a method for producing L-tryptophan, comprising culturing a bacterium having an ability to produce L-tryptophan in a medium, producing and accumulating L-tryptophan in the medium, and collecting the L-tryptophan.
  • Plasmid P CE1134 containing MudII1734 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2-109985 was digested with BamHI to remove the DNA fragment containing the lac operon, and after blunt-ending, Smal linker was inserted.
  • the plasmid obtained by recleaving this plasmid with Smal and self-closing was named pMull34.
  • trp operation gene was excised from plasmid pGXIOO.
  • pGXIOO is the P BR313, E. coli MT 2 strain (U.S. Patent No. 4, 371, 614 Pat) having desensitized type trpE gene is obtained by ⁇ the DNA fragment derived from, XhoI, smal cut As a result, a trp operon-containing DNA fragment of about 7.6 kb can be cut out.
  • a DNA fragment containing the trp operon was excised from pGXIOO by XhoI and Smal digestion, blunt-ended, and inserted into the Smal site of pCE1134 described above.
  • a similar trp-operin-containing DNA fragment can also be cloned from E. coli MT2 strain chromosomal DNA by direct PCR using the primers of SEQ ID NOS: 1 and 2 described in the sequence listing.
  • a plasmid pMudtrp G, lac carrying Mud (named Mudtrp G , lac) into which the trp open gene from the ⁇ 2 strain was inserted was constructed.
  • L-palin resistance was introduced into the L1 strain from an L-sleonine-producing strain B-3996 (Tokuhyohei Hei 55-101682) derived strain.
  • M9 minimal medium (4g / L glucose, 12. 8g / L Na 2 HP0 4 '7 0, 3g / L KH 2 P0 4, 0.
  • ME8581 strain (HfrH (valS-uxuAB): lacZ98:: Tnl0 relAl thi-1, National Institute of Genetics LacZ98 :: TnlO was transduced with P1 into LlValR according to a standard method using tetracycline resistance derived from TnlO as an index. The obtained strain was deficient in ratatose utilization as expected. Then, Ratatosu utilization ability is missing, because TnlO itself to obtain a strain that has been removed, tetra SITA phosphorus sensitive strain 14- l-lac- tet s from transduced strain was obtained by replica process .
  • the 14-1-lac-tet s strain remained defective in assimilating ratatose.
  • TnlO the status of TnlO of the same strain was confirmed in a Southern hybridization experiment, no band that hybridized to the tet gene was detected, but a band that hybridized to the IS10 region of TnlO was detected. It is believed that IS10 remained above.
  • PCR was performed using Pyrobest DNA Polymerase (Takara Shuzo) according to the attached instructions to amplify the iclR fragment.
  • the W3110 genome extracted using the RNA / DNA maxi Kit (Qiagen) was designated as type III, and oligonucleotides of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 shown in the sequence listing were used as primers.
  • the amplified DNA fragment after PCR was purified using Wizard PCR Preps (Pupa Mega). The purified DNA fragment was digested with restriction enzyme 0 RI and ⁇ (Takara Shuzo), and then purified by phenol-cloth form treatment and ethanol precipitation.
  • This digested fragment was ligated with pUC18 (Takara Shuzo) cleaved and purified by the same enzyme using DNA ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo).
  • Use this binding reaction solution with JM109 Bets cells (Takara Shuzo) were transformed, plated on ampicillin (Amp) (Meiji Seika) and 50 ⁇ ⁇ ⁇ containing LB agar plates (LB + Amp plate), and colonies were selected at 37 ° C. The colonies were cultured in test tubes in LB medium containing 50 ⁇ of Amp at 37 ° C, and plasmid extraction was performed using an automatic plasmid extractor PI-50 (Kurabo Industries).
  • the resulting plasmid pUCiclR was digested with restriction enzyme o065I (Takara Shuzo), and then blunt-ended and ligated using BKL kit (Takara Shuzo). JM109 was transformed with the binding reaction solution, and colonies were selected and plasmids were extracted as described above.
  • the resulting flop Rasumi de the CO RI, purified cleaved with V3 ⁇ 477dIII, temperature-sensitive plasmid pTSl purified was cleaved with the same enzymes (pMA 031 (J. Bacteriol 162 ( 3), 1196 -. 1202) and pBR322 (Takara (Sake brewing).
  • JM109 was transformed with the binding reaction solution, and colonies were selected on an LB + Amp plate at 30 ° C. The colonies were cultured in test tubes at 30 ° C in LB medium containing 50 g / mL Amp, and plasmids were extracted as described above. Plasmid from which the desired length fragment was obtained by digestion with coRI and mojjdlll was designated as plasmid pTSAiclR for iclR rupture.
  • No. 202 was transformed with pTSAiclR, and colonies were selected on an LB + Amp plate at 30 ° C. After subjected to liquid culture overnight 10-3 dilutions to plated on LB + Amp plates at 30 ° C, were selected colonies in 42 ° C. After spread on LB + Am P plates at 30 ° C, the cells 1/8 plate fraction were suspended in LB medium 2 mL, and cultured with shaking 4- 5 hours at 42 ° C. 10-5 diluted bacterial cells by hundreds of colonies among the colonies obtained were plated on LB plates to confirm inoculated grown on LB plate and LB + Amp Plate was confirmed Amp sensitivity-resistant.
  • PCR amplification and purification were carried out in the same manner as described above using sequences 13 and 14 described in the sequence listing as primers.
  • ⁇ After cleavage and purification with ⁇ and ⁇ , plus digested and purified with the same enzyme
  • the plasmid was ligated with midpMW118 (Nippon Gene), and JM109 was transformed with the ligated solution. Plasmids were extracted from the transformants, ⁇ 1 ⁇ , fragment of interest length was obtained, et al is intended to trpBA plasmid for amplifying (p ⁇ 118tr P BA) in cutting.
  • the No. 202 was transformed with plasmid P MW118 ⁇ Pi PMW118trpBA, respectively obtained transformant No. 202 / pMW, the No. 202 / pMWtrpBA.
  • Example 4 L-Tributophan-producing culture of iclR broken strain and trpBA amplified strain
  • Soy protein hydrolysis (as total nitrogen) 0.4 g / L
  • This medium was cultured in a 1 L small fermentor at 800 rpm at 30 ° C. for 11 to 15 hours. In addition, the fermentation was transferred to the main culture. The main culture was performed using a 1 L small fermenter. Culture medium The following were used.
  • Soy protein hydrolysis (total nitrogen content) 0.75 g / L
  • NH 4 C1 3.13 g / L 30 ml of seed culture was transferred to a small fermentor, and the starting volume was about 300 ml.
  • the medium was first stirred at 800 rpm, and compressed air sterilized by a sterilizing filter was passed through lvvm.
  • the temperature was maintained at 31 ° C, and the pH was maintained at 6.7 with ammonia gas.
  • the glucose concentration in the small fermenter was adjusted to 5-20 g / L by pumping a glucose solution 700 g / L (W / V) (sterilized with autoclaving).
  • Table 1 shows the fermentation results of L-tributophan (Trp) in the above culture.
  • the fermentation yield and fermentation productivity (production per unit time) of L-tryptophan are shown as relative values when the value in No. 202 is set to 1.
  • the amount of JAT by-product was estimated from the Trp area of HPLC.
  • No. 202 and No. 202 / p ⁇ show the by-product of JAT, while No. 202AiclR and o. 202 / pMWtrpBA show almost no by-product, and the fermentation yield and productivity are low. Improved.
  • Table 1 Fermentation results of 202, 202AiclR, No. 202 / pMW, No. 202pMWtrpBA strains
  • Trp and JAT The analysis of Trp and JAT was performed as follows. That is, 20 samples were injected into L-column 0DS-5 ⁇ , ⁇ 4.6 ⁇ 250 ram, eluted under the following conditions for 65 minutes, and the absorption at 210 nm was detected.
  • L-tributane can be efficiently produced.
  • the production of by-products accompanying the production of L-tryptophan can be reduced.

Abstract

Ｌ−トリプトファン生産能を有し、かつ、マレートシンターゼ・イソシトレートリアーゼ・イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼオペロンが構成的に発現する細菌を培地に培養し、同培地中にＬ−トリプトファンを生成蓄積せしめ、これを採取することにより、Ｌ−トリプトファンを製造する。

Description

明細書 発酵法による L—トリプトファンの製造法 技術分野
本発明は、 発酵法による L—トリブトファンの製造方法に関する。 L—トリプ トフアンは、 飼料添加物、 輸液等の医薬品原料等として、 産業上有用である。 背景技術
L—アミノ酸は、 プレビパクテリゥム属、 コリネパクテリゥム属、 ェシエリヒ ァ属等に属する微生物を用いた発酵法により工業生産されている。
微生物を利用した L一トリブトファンの製造法としては、 組換え体ェシヱリヒ ァ ·コリを用いる方法が特開昭 57- 71 397号公報又は米国特許第 4371 614号明細書に記載されており、 バチルス ·ズブチリス （Bacillus subtil is) の変異株を用いる方法が特公昭 53-3951 7号公報又は特公昭 62-343 99号公報に記載されており、 組換え体バチルス ·ズブチリスを用いる方法が特 開昭 6 1— 104790号公報又は特公昭 62— 34399号公報に記載されて おり、 ブレビバタテリゥム （Brevibacterium) 属の変異株を用いる方法が特開昭 57- 1 74096号公報に記載されており、 更に組換え体ブレビパクテリゥム 属を用いる方法が特開昭 62-51980号公報に記載されている。
これらの L一トリプトファン生産菌の育種は、 主として各種アミノ酸生合成の 共通経路、 及ぴそれに続く L—トリブトファンの生合成の固有の経路における反 応を触媒する酵素の増強、 あるいは、 L—トリブトファンによる調節 （フィード バック阻害） を回避することにより行われてきた。 具体的には、 微生物への栄養 要求性の付与、 薬剤耐性の付与、 組換え DNA手法による生合成系酵素遺伝子の 増幅などが行われてきた。 このような生合成系酵素遺伝子としては、 L—トリプ トフアンオペロン等が知られている （特開昭 57 _ 7 1397号公報、 特開昭 6 2-244382号公報、 米国特許第 43716 14号明細書、 欧州特許公開第 9789073号明細書又は特開平 5— 244970号公報） 。 一方、 L一グルタミン酸生産能を有し、 マレートシンターゼ ·イソシトレート リァーゼ ·イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ Zフォスファターゼオペ口 ン （以下、 「a c eオペロン」 ともいう） の発現が構成的になったェシエリヒア 属細菌の変異株は、 α—ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損による生育の低下 が改善され (J. Bacteriol. , 96, 2185-2186， 1968) 、 L一グルタミン酸の生産能 が向上することが知られている （特開平 5— 2 4 4 9 7 0号公報） 。 しかし、 a c eオペロンの発現と、 L—トリプトフアンの生産能の関係については知られて いない。
また、 微生物を用いてタンパク質の大量発現を行う際に、 炭素源としてフルク トースを用いると酢酸の副生が低減して菌体収率が上昇することが報告されてい る （Biotechnol. Prog. , 15， 140 - 145 (1999) )。 しかし、 L—トリプトファンの 生産に伴い、 L—トリブトファン類似物質が副生し、 L—トリブトファン収率に 影響を及ぼすことについては知られていない。 発明の開示
本発明は、 微生物の L一トリブトファン酸生産能を向上させ、 効率的な Lート リブトファンの製造法を提供することを課題とする。
本発明者らは、 ェシヱリヒア属細菌の L _トリブトファン生産能向上に関し鋭 意研究を重ねた結果、 L一トリブトファン生産に伴い J A Tと名付けた L—トリ プトファン類似物質が副生すること、 及ぴ、 a c eオペロンを構成的に発現させ ること又はトリプトファンシンターゼ活性を増強することによって、 J A Tの副 生を低減させ、 L一トリブトファンの収率を高めることができることを見出し、 本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は以下のとおりである。
( 1 ) L一トリプトファン生産能を有し、 かつ、 マレートシンターゼ 'イソ シトレートリァーゼ 'イソシトレートデヒ ドロゲ^ ^一ゼキナーゼ/フォスファタ ーゼオペロンが構成的に発現するか、 又は同オペロンの発現が強化された細菌を 培地に培養し、 同培地中に L一トリプトファンアミノ酸を生成蓄積せしめ、 これ を採取する、 L一トリブトファンの製造法。 (2) 前記細菌は、 iclR遺伝子の発現量が低下又は消失することにより、 前 記オペロンが構成的に発現する細菌である、 （1) の製造法。
(3) 前記細菌がェシエリヒア属細菌である、 （1) 又は （2) の製造法。
(4) L—トリプトファン生産能を有し、 かつ、 マレートシンターゼ 'イソ シトレートリァーゼ 'イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ Zフォスファタ ーゼオペ口ンが構成的に発現するか、 又は同オペ口ンの発現が強化されたェシェ リヒァ属細菌。
(5) i c 1 R遺伝子が破壊されたことにより前記オペロンが構成的に発現 する （4) のェシヱリ ヒア属細菌。
(6) L-トリブトファン生産能を有する細菌を培地中で培養して同培地中 に L—トリプトファンを生成蓄積せしめ、 L一トリプトファンを採取する L—ト リブトフアンの製造法において、 前記細菌として、 マレートシンターゼ ·イソシ トレートリァーゼ ·ィソシトレートデヒ ドロゲナーゼキナーゼ/フォスファタ一 ゼォペロンが構成的に発現するか、もしくは同オペロンの発現が強化された細菌、 またはトリブトファンシンターゼの発現が強化された細菌を用いることにより、 L-トリブトファン類似物質の副生を減少させる方法。
(7) L一トリブトファン類似物質が J ATである、 （6) の方法。 図面の簡単な説明
図 1は温度感受性複製開始起点を有するプラスミドベクター pTSlの構造を示す 図である。
図 2は発酵生産物の ODSカラムクロマトグラムを示す図である。 数値は溶出 時間 （分） を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明の L一トリプトファンの製造法に用いる細菌は、 L—トリプトファン生 産能を有し、 かつ、 マレートシンターゼ 'イソシトレートリアーゼ ·イソシトレ 一 デヒドロゲナーゼキナーゼ^ /フォスファターゼオペロンが構成的に発現する か、 又は同オペ口ンの発現が強化された細菌である。
本発明に用いる細菌としては、 ェシエリヒア細菌、 ェンテロバクター属、 タレ ブシエラ属、 セラチア属、 エルビニァ属又はパントエア属、 シユードモナス属、 アース口パクター属、 ァエロパクター属に属する細菌等が挙げられる。 これらの 中では、ェシヱリヒア属細菌が好ましい。ェシエリヒア属細菌として具体的には、 ェシエリヒア ·コリが挙げられる。
本発明において 「L一トリブトファン生産能」 とは、 細菌を培地に培養したと きに、 培地中に有意な量の L一トリブトファンを蓄積する能力、 又は菌体中の L 一トリブトファン含量を野生株又は非形質転換株に比べて増加させる能力をいう。
L—トリプトファン生産能を有する細菌は、 変異株であっても、 遺伝子組換え 株であってもよい。 変異株としては、 L—トリプトファンの生合成に関与する酵 素の細胞内の活性が上昇するような変異、 具体的には酵素の発現量が上昇する変 異、 又はフィードバック阻害が解除される変異を有する変異株が挙げられる。 変 異株は、 例えば、 紫外線照射または N—メチルー N'—ニトロ _N—二トロソグァ二 ジン （NTG) もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤により、 ェ シェリヒァ属細菌の野生株又はその誘導体を処理することによって得ることがで きる。
一方、 遺伝子組換え株としては、 L一トリブトファンの生合成に関与する酵素 をコードする遺伝子のコピー数が高められた株、 該遺伝子の発現量が上昇するよ うに発現調節配列が改変された株、 又はフィードバック阻害が解除された酵素を コードする遺伝子が導入された株等が挙げられる。
L一トリプトファン生産能を有する細菌として好ましいものは、 アントラニル 酸合成酵素活性、 ホスホダリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性もしくはトリプトフ ァンシンターゼ活性のうち、 1又は 2以上の活性が増強された細菌である。
アントラニル酸合成酵素及ぴホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼは、 それぞ れ L—トリプトファン及ぴ L—セリンによるフィードバック阻害を受けるため、 脱感作型の変異酵素を保持させることにより、酵素活性を強化することができる。 具体的には、 例えば、 アントラニル酸合成酵素遺伝子 （trpE) 、 及び//又はホス ホグリセレートデヒドロゲナーゼ遺伝子 （serA) を、 フィードバック阻害を受け ないように変異させ、 得られた変異型遺伝子をェシエリヒア属細菌に導入するこ とによって、 脱感作型酵素を保持する細菌を取得することができる。
このような細菌としてより具体的には、 脱感作型ァントラニル酸合成酵素を保 持するェシェリヒア.コリ SV164に、脱感作型ホスホダリセレートデヒドロゲナー ゼをコードする変異型 serAを持つプラスミド PGH5 (W094/08031号参照） を導入す ることによって得られる形質転換株が挙げられる。
また、 トリプトファンオペロンを含む組換え D N Aが導入された細菌も、 好適 な L—トリブトファン生産菌である。 具体的には、 脱感作型アントラニル酸合成 酵素をコードする遺伝子を含むトリブトファンオペロンが導入されたェシヱリヒ ァ ·'コリが挙げられる （特開昭 57-71397号、 特開昭 62- 244382号、 米国特許第 4， 371， 614号） 。 また、 トリプトファンオペロンのうち、 トリプトフアンシンター ゼをコードする遺伝子 （trpBA) の発現を強化することによつても、 L—トリブト ファン生産能を向上又は付与することができる。 トリプトファンシンターゼは、 及ぴ βサブュニットカ らなり、それぞれ trpA (GenBank Accession No. V00364)、 trpB (GenBank Access ion No. V00365) によってコードされている。 なお、 トリ プトファンシンターゼ活†生は、 Science 1958 ; 128 (3328) : p843- 844に記載の方法 によって測定することができる。 trpAの塩基配列を配列番号 15、 trpBの塩基配列 を配列番号 1 7に示す。
また、 L一トリブトファン生産能を有するェシエリヒア属細菌細胞内のホスホ エノールビルビン酸の生産能を上昇させることによって、 L一トリブトファン生 産能を強化することができる （TO97/08333号） 。
前記の各酵素遺伝子又はオペロンは、 当業者によく知られた通常の遺伝子の単 離法にしたがって取得することができる。 例えば、 既知の配列に基づいてプライ マーを合成し、 ェシェリヒア ' コリ K一 1 2株等のェシェリヒア属細菌の染色体 D N Aを铸型にして P C Rを行うことにより、 目的の遺伝子を取得することが可 能である。
染色体 D N Aの調製、 染色体 D N Aライブラリーの作製、 ハイブリダィゼーシ ヨン、 P C R、 プラスミ ド D N Aの調製、 D N Aの切断及ぴ連結、 形質転換、 プ ライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等、 遺伝子のクローニング法及 び宿主への導入方法は、 当業者によく知られている通常の方法を採用することが できる。 これらの方法は、 Sambrook, J. , Fritsch, E. F.， and Maniatis, T. , "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
遺伝子のコピー数を高めるには、 目的遺伝子と細菌で機能するべクターを連結 して組換え D N Aを調製し、同組換え D N Aで細菌を形質転換すればよい。また、 形質転換は、 D. A. Morrisonの方法 （Methods in Enzymology, 68, 326, 1979) あ るいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理して D N Aの透過性を増す方法 (Mandel, M. and Higa, A.， J. Mol. , Biol.， 53， 159 (1970) ) 等により行うことができ る。 前記ベクターとしては、 pUC19、 pUC18、 pUC118、 pUC119、 pBR322、 pHSG299、 pHSG298、 pHSG399、 pHSG398、 RSF1010、 pMW119、 pMW118、 pMW219、 pMW218、 pSTV28、 PSTV29等が挙げられ、 その他ファージベクターも使用することができる。
遺伝子のコピー数を高めることは、 目的遺伝子を細菌の染色体 D NA上に多コ ピー存在させることによつても達成できる。 細菌の染色体 D N A上に目的遺伝子 を多コピーで導入するには、 染色体 D N A上に多コピー存在する配列を標的に利 用して相同組換えにより行う。染色体 D N A上に多コピー存在する配列としては、 レペティティブ D N A、 転移因子の端部に存在するインパーティッド ' リピート が利用できる。 あるいは、 特開平 2- 109985号公報に開示されているように、 目的 遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体 D N A上に多コピー 導入することも可能である。
目的酵素の活性を上昇させるには、 目的酵素をコードする遺伝子のプロモータ 一等の発現調節配列を強力なものに置換することによつても達成される （特開平 1 - 215280号公報参照） 。 たとえば、 lacプロモーター、 trpプロモーター、 trcプロ モーター、 tacプロモーター、 ラムダファージの PRプロモーター、 P Lプロモータ 一、 tetプロモーター、 amyEプロモーター等が強力なプロモーターとして知られて いる。
さらに、 L—トリプトファン生産菌として、 L—フエ-ルァラニン及ぴ Lーチ 口シン要求性の形質を有する菌株ェシエリ ヒア ' コリ AGX17 (pGX44) [NRRL B - 12263〕 、 及ぴトリプトファンオペロンを含むプラスミ ド PGX50を保持する AGX6 (pGX50) aroP 〔NRRL B- 12264〕 （いずれも米国特許第 4， 371， 614号参照） 株が 挙げられる。
本発明に用いる細菌は、 上記のような L一トリブトファン生産能を有する細菌 であって、 さらに、 マレートシンターゼ ·イソシトレートリアーゼ 'イソシトレ 一トデヒドロゲナーゼキナーゼ Zフォスファターゼオペロン ( a c eオペロン) が構成的に発現する力、 又は同オペロンの発現が強化された細菌である。
マレートシンターゼ ·イソシトレートリァーゼ ·イソシトレートデヒ ドロゲナ ーゼキナーゼ Zフォスファターゼオペロン （a c eオペロン） が構成的に発現す るとは、 a c eオペロンのプロモーターが、 リプレッサータンパク質である icl Rにより抑制を受けないこと、 抑制が解除されていることを意味する。
a c eオペロンを構成的に発現していること、 また同オペロンの発現が強化さ れていることは、 aceオペロンがコードするタンパク質であるマレートシンターゼ (aceB)、 イソシトレートリァーゼ（aceA)、 イソシトレートデヒドロゲナーゼキナ ーゼ Zフォスファターゼ （aceK) の酵素活性が非改変株、 あるいは野生株と比べ て増大していることによって確認出来る。
酵素活性の測定は、 マレートシンターゼに関しては、 グリォキシル酸に依存す るァセチル CoAのチォェステル結合の分解を A232の減少で測定する方法
(Dixon, G. H. , Kornberg, H. L.， 1960， Biochem. J, 1 ;41 :ρ217— 233) 、 イソシトレー トリアーゼに関しては、 イソシトレートから生じるダリオキシル酸を 2 , 4—ジ 二ト口フエ-ルヒドラゾン誘導体として測定する方法 (Roche, T. E. . Williams J. 0.， 1970, Biochim. Biophys. Acta, 22 ; 206 (1) : pl93- 195)、 イソシトレートデ ヒドロゲナーゼキナーゼに関しては、 イソシトレートデヒドロゲナーゼに対する リン酸の脱着を32 Pを使用して測定する方法 （Wang, J. Y. J, and Koshland, D. E. , Jr. , 1982, Arch Biochem. Biophys. , 218, p59- 67)などで確認出来る。
抑制を解除するためには、 例えば、 a c eオペロン上のリプレッサー （iclR) の結合部位を、 iclRが結合できないように改変すればよい。 また、 同オペロンの プロモーターを、 iclRによって発現抑制を受けない強力なプロモーター （lacプロ モーターなど） に置換することによって、 抑制を解除することもできる。
また、 iclR遺伝子の発現が低下又は欠失するように細菌を改変することによつ て、 a c eオペロンの発現を構成的にすることもできる。 具体的には、 iclRをコ 一ドする遺伝子の発現調節配列を同遺伝子が発現しないように改変するか、 同リ プレッサーの機能が失われるようにコード領域を改変することによって、 a c e オペ口ンの発現の抑制を解除することができる。
iclR遺伝子は、 ェシエリヒア 'コリ （EMBL/GenBank/DDBJ accession M31761, J. Bacteriol. 172, 2642-2649 (1990) ) 、 サルモネラ ' チフ ィ ム リ ウム ( EMBL/GenBank/DDBJ accession X52950 , Nucleic Acids Res. 18, 3656-3656 (1990) ) 等で報告されている。 また、 iclR様遺伝子も、 ストレプトマイ セス ·セリカラー （EMBL/GenBank/DDBJ accession AL117387, Mol. Microbiol. 21 (1) , 77-96 (1996) ) 、 ァシネトパクター Sp. NCIMB9871 (EMBL/GenBank/DDBJ accession AB026669) 等で報告されている。 ェシェリヒア ' コリの iclR遺伝子の 配列を配列番号 5に示す。
前記 iclRの発現もしくは iclRの機能を低下または消失させるには、 細菌を紫外 線照射または N—メチル一N'—二トロ一 N—ェト口ソグァ二ジン （NTG) もしくは亜 硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、 iclRの発現もし くは iclRの機能が低下又は消失した変異株を選択する方法が挙げられる。
また、 変異処理の他に、 iclR遺伝子の内部配列を欠失し、 正常に機能するリブ レッサーを産生しないように改変した iclR遺伝子 （欠失型 iclR) を含む D N Aで 細菌を形質転換し、 欠失型 iclRと染色体上の iclRとの間で組換えを起こさせるこ とにより、 染色体上の iclRを破壊することができる。 このような相同組換えを利 用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、 直鎖 D N Aを用いる方 法や温度感受性複製起点を含むブラスミドを用いる方法などがある。
欠失型 iclRを、 宿主染色体上の iclRと置換するには、 例えば以下のようにすれ ばよい。 温度感受性複製起点と欠失型 iclRとアンピシリン等の薬剤に耐性を示す マーカー遺伝子とを揷入して組換え D N Aを調製し、 この組換え D N Aでコリネ 型細菌を形質転換し、 温度感受性複製起点が機能しない温度で形質転換株を培養 し、 続いてこれを薬剤を含む培地で培養することにより、 組換え D NAが染色体 D NAに組み込まれた形質転換株が得られる。
こうして染色体に組換え D N Aが組み込まれた株は、 染色体上にもともと存在 する iclR配列との組換えを起こし、 染色体 iclRと欠失型 iclRとの融合遺伝子 2個 が組換え D N Aの他の部分 （ベクター部分、 温度感受性複製起点及び薬剤耐性マ 一力一） を挟んだ状態で染色体に挿入されている。 したがって、 この状態では正 常な iclRが優性であるので、 形質転換株は正常なリプレッサーを発現する。
次に、 染色体 D N A上に欠失型 iclRのみを残すために、 2個の iclRの組換えに より 1コピーの iclRを、 ベクター部分 （温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカ 一を含む） とともに染色体 D N Aから脱落させる。 その際、 正常な iclRが染色体 D NA上に残され、 欠失型 iclRが切り出される場合と、 反対に欠失型 iclRが染色 体 D N A上に残され、 正常な iclRが切り出される場合がある。 いずれの場合も、 温度感受性複製起点が機能する温度で培養すれば、 切り出された D NAはプラス ミド状で細胞内に保持される。 次に、 温度感受性複製起点が機能しない温度で培 養すると、 プラスミド上の iclRは、 プラスミドとともに細胞から脱落する。 そし て、 PCRまたはサザンハイブリダィゼーション等により、 染色体上に欠失型 iclR が残った株を選択することによって、 iclRが破壊された株を取得することができ る。
また、本発明の細菌は a c eオペロンの発現が強化されたものであってもよい。 a c eオペロンの発現の強化は、 例えば、 a c eオペロンを含む DNAを lacプロモ 一ターなどの強力なプロモーターに連結し、 これをプラスミドゃ相同組換えによ つて細菌に導入することや、 ファージ D N Aやトランスポゾンにより上記 D N A を染色体上に多コピー存在させることによって行うことができる。 a c eオペ口 ンを含む DNAとしては、 GenBank Accession No. X12431 (AceBA)及ぴ M18974 (AceK) に登録されている塩基配列を含む DNAが挙げられる。 AceBの遺伝子配列を配列番号 9に、 AceAの遺伝子配列を配列番号 7に、 AceKの遺伝子配列を配列番号 1 1に示 す。
上記のようにして得られる本発明の細菌を培地で培養し、 L—トリブトファン を培地中に生成蓄積させ、該培地より 一トリブトファンを採取することにより、 L—トリブトファンを製造することができる。
本発明の細菌の培養は、 炭素源、 窒素源、 無機塩類、 その他必要に応じてアミ ノ酸、 ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いて常法により行 うことができる。 合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。 培地に使 用される炭素源および窒素源は培養する菌株の利用可能であるものならばレ、ずれ の種類を用いてもよい。
炭素源としては、 グルコース、 グリセロール、 フラクトース、 スクロース、 マ ルトース、 マンノース、 ガラクトース、 澱粉加水分解物、 糖蜜等の糖類が使用さ れ、 その他、 酢酸、 クェン酸等の有機酸、 エタノール等のアルコール類も単独あ るいは他の炭素源と併用して用いられる。 尚、 フルクトースを主要な炭素源とし て用いると、 L—トリプトファンの対糖収率及ぴ生産速度が向上する。
窒素源としては、 硫酸アンモ-ゥム、 塩化アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム 等の無機アンモ-ゥム塩、 大豆加水分解物などの有機窒素、 アンモニアガス、 了 ンモニァ水等を用いることができる。
無機塩類としては、 リン酸カリウム、 硫酸マグネシウム、 鉄イオン、 マンガン イオン等が少量添カ卩される。 有機微量栄養素としては、 ビタミン B 1などの要求 物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。
培養は、 用いる菌株に応じた条件で行えばよいが、 具体的には、 好気的条件下 で 1 6〜 7 2時間実施するのがよく、 培養温度は 3 0 °C〜 4 5 に、 培養中 p H は 5〜 7に制御する。 尚、 p H調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアル力 リ性物質、 更にアンモニアガス等を使用することができる。
発酵液からの L一トリプトファンの採取は、 ィオン交換樹脂法、 沈澱法その他 の公知の方法を適宜組み合わせることにより実施できる。
本発明の方法によれば、 L一トリブトファンの生産に伴い副生する L—トリプ トフアン類似物質の産生が著しく減少する。 すなわち、 a c eオペロンを構成的 に発現させる力、 もしくは同オペロンの発現を強化すること、 又はトリプトファ ンシンターゼ活性を增強することによって、 副生物の産生が減少する。 L一トリ ブトファンの収率が向上するのは、 その結果によると推定される。 前記 L一トリ ブトファン類似物質は、 LC/MS、 LC/NMRによる分析によって、 以下の性質を有する 物質であり、 J ATと名付けられた。
( 1 ) LC/MSにより測定される分子量： 189
( 2 ) 化学式 CuHu ^ ( 3 ) インドール骨格を有する。
( 4 ) 水酸基を有する。
( 5 ) O D Sカラムクロマトグラフィー （L— column 0DS 5 μπι, Φ4. 6 χ 250 匪 ； (財)化学物質評価研究機構） において、 実施例 4に示すリン酸バッファーとァセ トニトリルの濃度勾配で溶出したときに、 L一トリブトファンの直後に検出され る （図 2参照） 。 したがって、 本発明には、 L—トリブトファン生産能を有する細菌を培地に培 養し、 同培地中に L一トリプトファンを生成蓄積せしめ、 これを採取する、 L— トリプトファンの製造法において、 a c eオペロンが構成的に発現するか、 もし くは同オペロンの発現が強化されたェシエリヒア属細菌、 またはトリブトファン シンターゼが強化された細菌を用いることにより、 J A T副生を低減させ、 L— トリブトファンの収率を高める方法も含まれる。 実施例
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。 実施例 1 . L一トリブトファン生産菌の構築
く 1— 1 > serA遺伝子の導入
プラスミ ド PGH5 (国際公開第 9408031号パンフレット） 上のホスホダリセレート デヒドロゲナーゼ遺伝子 （serA) の、 トランスポゾン Mudを用いた染色体上への揷 入を試みた。 MudII1734を含有するプラスミド PCE1134 (特開平 2— 1 0 9 9 8 5 号公報） を BamHIで切断して lacオペロン含有 DNA断片を除去し、 平滑末端後 Smal リンカ一を挿入した。 このプラスミ ドを Smalで再切断し自己閉環して得られたプ ラスミ ドを pMull34と命名した。 E. Goli由来の serA遺伝子を含有するプラスミ ド PGH5から Scal、 Sail切断にて serA含有 DNA断片を切り出し、 平滑末端後、 上記の pMull34の Smalサイトに揷入することによって、 pGH5由来の serA遺伝子が挿入され た Mud (MudserAと命名） を搭載するプラスミド pMudserAを構築した。
L一トリプトファン生産菌 SV164株 （国際公開第 9408031号パンフレッ ト） を受 容菌として、 pMudserAを用いて定法に従いカナマイシン耐性付与を指標にして MudserAを染色体上に転移させた菌株 L1株を取得した。 L1株は、 サザンハイブリダ ィゼーシヨン実験の結果、 MudserAの揷入位置は一箇所のみと推定された。 また、 PCRによる MudserA含有染色体 DNA断片のクローエングとその塩基配列決定にて、 E. coliK- 12染色体 (GenBank Accession No. U00096) 上の No. 240, 950の位置に揷 入されていると同定された。 く 1 - 2 rpオペ口ンの導入
次に、 trpオペロンのトランスポゾンを用いた染色体上への揷入によるコピー数 の追加を試みた。 trpオペ口ン遺伝子はプラスミド pGXIOOより切り出した。 pGXIOO は、 PBR313に、脱感作型 trpE遺伝子を有する E. coli MT 2株（米国特許第 4, 371, 614 号明細書）由来の DNA断片を揷入したものであり、 XhoI、 Smal切断によって約 7. 6kb の trpオペロン含有 DNA断片を切り出すことができる。 pGXIOOから XhoI、 Smal切断 にて trpオペロン含有 DNA断片を切り出し、平滑末端後、上記の pCE1134の Smalサイ トに揷入した。同様の trpオペ口ン含有 DNA断片は、 E. coli MT 2株染色体 DNAより、 配列表に記載した配列番号 1及ぴ 2のプライマーを用いて直接 PCR法によってク ローニングすることも可能である。 以上のようにして、 ΜΤ 2株由来の trpオペ口 ン遺伝子が挿入された Mud ( MudtrpG，lacと命名） を搭載するプラスミ ド pMudtrpG,lac が構築された。
MudtrpG'lacの染色体上への挿入によるコピー数の追加に先立ち、揷入株の選択 マーカーとしてラタトース資化能相補を用いる目的で、 宿主株へのラタトース資 化能欠損の性質付与を実施した。 L1株に、 Lースレオニン生産菌 B-3996 (特表平 3 - 5 0 1 6 8 2 )の誘導株より L1株に L—パリン耐性を導入した。定法に従い、 P1形質導入実験を実施し、 M9最小培地（4g/L glucose, 12. 8g/L Na2HP04' 7 0、 3g/L KH2P04、 0. 5g/L NaCls lg/L NH4Cl、 5mM MgS04、 0. lmM CaCl2、 lmg/L thiamine、 20mg/l L-Phe 20mg/L L-Tyr, 20mg/L Met、 3mg/L pyridoxine, 20mg/L L~Val, 20mg/L tetracycline) に塗布し、 出現したコロニーを Val耐性株とし、 本菌株を LlValR と名づけた。
ME8581株 （HfrH (valS— uxuAB) : lacZ98 : :Tnl0 relAl thi- 1、 国立遺伝学研究所 に寄託） より TnlO由来のテトラサイクリン耐性を指標として、 lacZ98 : : TnlOを定 法に従い LlValRに P1形質導入した。 得られた株は、 予想通りラタトース資化能は 欠損していた。 次いで、 ラタトース資化能は欠損しているが、 TnlO自体は除去さ れた株を取得するため、 形質導入株からテトラサイタリン感受性株 14- l-lac- tets を、 レプリカ処理によって取得した。 14- 1- lac- tets株は、 ラタトース資化能は欠 損したままであった。 サザンハイプリダイゼーション実験にて同株の TnlOの状況 を確認したところ、 tet遺伝子にハイプリするバンドは検出されなかったが、 TnlO の IS10領域にハイブリするバンドは検出されたので、 本株では lacZ遺伝子上に IS10が残存していると考えられた。
14-1- lac- tets株を受容菌として、 pMudtrpG，lacを用いて定法に従いラタトース 資化能相補を指標にして MudtrpG，laCを染色体上に転移させた菌株 NO. 202株を取得 した。 得られたトランスポゾン挿入株から挿入トランスポゾンあるいはトランス ポゾン上の遺伝子が脱落しやすい場合には、 栄養培地上で植え継ぎ、 カナマイシ ン耐性、 ラタトース資化能等を安定に保持する菌株を選択すればよい。 No. 202株 は、 サザンハイプリダイゼーシヨン実験の結果、 MudtrpG，lacの揷入位置は一箇所 のみと推定された。 また、 PCRによる MudtrpG，lac含有染色体 DNA断片のクローニン グとその塩基配列決定にて、 E. coliK- 12染色体 （GenBank Accession No. U00096) 上の No. 530, 249の位置に挿入されていると同定された。 実施例 2 . Trp生産菌 iclR破壊株の取得
く 2— 1 > iclR破壊用プラスミド構築
Pyrobest DNA Polymerase (宝酒造） を用い、 添付説明書にしたがって PCRを行 い iclR断片を増幅した。 その際、 RNA/DNA maxi Kit (キアゲン） を用いて抽出し た W3110ゲノムを錶型とし、 プライマーには配列表に示した配列番号 3、配列番号 4のオリゴヌクレオチドを用いた。 PCR後の増幅 DNA断片は、 Wizard PCR Preps (プ 口メガ） を用いて精製した。精製した DNA断片を制限酵素 0RI、 ΗίηάΙΙΙ (宝酒造） にて切断したのち、 フエノールクロ口ホルム処理、 エタノール沈殿を行い精製し た。この切断断片と、同酵素にて切断し精製した pUC18 (宝酒造）とを、 DNA ligation Kit Ver. 2 (宝酒造） をもちいて結合した。 この結合反応液にて JM109コンビテン ト細胞 （宝酒造） を形質転換し、 アンピシリン （Amp) (明治製菓） を 50 μ§ ΐ 含む LB寒天プレート （LB+Ampプレート） にまき、 37°Cでコロニーを選択した。 コ ロニーを 50 μ§ の Ampを含む LB培地で 37°Cにて試験管培養し、 自動プラスミ ド 抽出機 PI- 50 (クラボウ） を用いてプラスミド抽出を行った。
得られたプラスミド pUCiclRを制限酵素 o065I (宝酒造） にて切断した後、 BKL kit (宝酒造） を用いて末端平滑化及び結合を行った。 結合反応液にて JM109を形 質転換し、 上記のようにコロニーの選択、 プラスミド抽出を行った。 得られたプ ラスミ ドを CORI、 v¾77dIIIで切断後精製し、 同酵素で切断後精製した温度感受性 プラスミ ド pTSl (pMA 031 (J. Bacteriol. 162 (3)， 1196 - 1202) と pBR322 (宝酒 造） のそれぞれの尸 si I - i/7d III断片を繋ぎ換えたもの） と結合した。 結合反応 液にて JM109を形質転換し、 LB+Ampプレートにて 30°Cでコロニーを選択した。 コロ ニーを 50 g/mL の Ampを含む LB培地で 30°Cにて試験管培養し、 上記のようにプラ スミドを抽出した。 coRI、 ガ i jdlllで切断して目的長断片が得られるプラスミ ド を、 iclR破壌用プラスミド pTSAiclRとした。
< 2 - 2 > iclR破壊株の取得
pTSAiclRで No. 202を形質転換し、 LB+Ampプレートで 30°Cでコロニーを選択した。 30°Cで液体培養を一晩おこなった後 10— 3希釈して LB+Ampプレートにまき、 42°Cでコ ロニーを選択した。 30°Cで LB+AmPプレートに塗り広げた後、 1/8プレート分の菌体 を LB培地 2 mLに懸濁し、 42°Cで 4- 5時間振とう培養した。 10— 5希釈した菌体を LB プレートにまき得られたコロニーのうち数百コロニーを LBプレートと LB+Ampプ レートに植菌し生育を確認することで、 Amp感受性 ·耐性を確認した。 Amp感受性 株について配列番号 3及ぴ 4のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてコロニー PCRを行い、 増幅断片が^ o065Iによ り切断されないものを iclR欠損株 (No. 202AiclR) として取得した。 実施例 3 . trpBA増幅株構築
配列表に記載した配列 13及ぴ 14をプライマーとして上記と同様に PCR増幅、精製 をおこなった。 ·ηάΙΙΙ、 Μにて切断、 精製後、 同酵素で切断、 精製したプラス ミド pMW118 (日本ジーン） と結合し、 結合液にて JM109を形質転換した。 得られた 形質転換体よりプラスミドを抽出し、 κ1ΠΙ、 切断にて目的長の断片が得ら れるものを trpBA増幅用プラスミド （p丽 118trPBA) とした。
No. 202をプラスミド PMW118及ぴ pMW118trpBAにて形質転換し、それぞれ形質転換 体 No. 202/pMW, No. 202/pMWtrpBAを得た。 実施例 4 . iclR破壌株、 trpBA増幅株の L-トリブトファン生産培養
これら No. 202、 No. 202AiclR、 No. 202/pMW, No. 202pMWtrpBAを用いて、 500mlの 三角フラスコに 50mlの LBG培地 （トリプトン 1%、 酵母抽出液 0. 5%、 塩化ナトリウム 0. 5%、 グルコース 0. 5%) を張り込み、 前培養を行った。 30°Cで 150回転で撹拌し ながらの 7〜8時間の培養後にその前培養物の約 1mlを 300mlの種培地中に移行させ た。 種培地は、 以下の組成のものを用いた。 グノレコース I0g/L
KH2P04 2g/L
MgS04 · 7H20 0. 5g/L
(NH4) 2S04 2. 5g/L
大豆蛋白加水分解 （全窒素として） 0. 4g/L
FeS04 · 7H20 10mg/L
MnS04 lOmg/L
L一メチォニン 50mg/L
L一フエ-ノレァラニン 125mg/L
L -チロシン 125mg/L
ビタミン^ 5mg/L
ピリ ドキシン 30mg/L
(水酸ィ匕カリウムにて pH6. 5に調節） 。 この培地を 1Lの小型発酵槽を用いて 30°C、 800回転で 11〜： 15時間培養させた。 さ らに発酵を主培養に移行した。 主培養は 1Lの小型発酵槽を用いて実施した。 培地 は、 以下の,祖成のものを用いた。
グルコース I5g/L
KH2P04 lg/L
MgS04 · 7H20 0. 3g/L
(NH4) 2S04 lg/L
大豆蛋白加水分解 （全窒素量） 0. 75g/L
FeS04 · 7H20 10mg/L
MnS04 7. 5mg/L
L-メチォニン 300mg/L
L-フエ二ルァラニン 1050mg/L
L-チロシン 1050mg/L
ビタミン 5mg/L
ピリ ドキシン 30mg/L
塩化ナトリウム 0. 5g/L
CaCl2-2H20 14. 7mg/L
NH4C1 3. 13g/L 種培養液 30mlを小型発酵槽へ移送し、 開始容量は約 300mlであった。 この培地を まず 800回転で撹拌し、かつ滅菌フィルタ一により滅菌した圧縮空気を lvvm通気し た。 また、 培養期間中温度を 31°Cで保持し、 pHをアンモニアガスで 6. 7に保った。 グルコース溶液 700g/L (W/V) (ォートクレープで殺菌した） をポンプ輸送するこ とによって小型発酵槽内のグルコース濃度を 5〜20g/Lに調節した。
上記培養における L—トリブトファン （Trp) の発酵成績を表 1に示した。 表 1 中、 L一トリプトファンの発酵収率及ぴ発酵生産性 （単位時間当たりの生産量） は、 No. 202における値を 1としたときの相対値で示した。 また、 JATの副生量に関 しては、 HPLCの Trpの面積から推定した。
No. 202及ぴ No. 202/p丽が JATの副生を示しているのに対し、 No. 202AiclR及び o. 202/pMWtrpBAはこの副生がほとんど認められず、発酵収率並びに生産性が向上 した。 表 1 . 202、 202AiclR、 No. 202/pMW, No. 202pMWtrpBA株の発酵成績
Figure imgf000018_0001
なお、 Trp及び JATの分析は以下のようにして行った。 すなわち、 20 の試料を L - column 0DS-5 μπι, Φ4. 6 χ 250 ramにインジェクションし、 以下の条件で 65分間 溶出を行い、 210nmの吸収を検出した。
ノ ッファ一 A 25mM NaH2P04 (リン酸で pH2. 5に調整したもの）： CH3CN = 90： 10 ノ ッファ一 B 25mM NaH2P04 (リン酸で pH2. 5に調整したもの）： CH3CN = 60： 40 バッファー C H20 :CH3CN = 30：70
温度 40°C
流速 1. 0 mL/分
溶出条件
( 1 ) 0分 （A 100%) →32. 5分 （A： B=65%： 35%) というリニアな濃度勾配
( 2 ) 32. 5分 （A： B=65%： 35%) →38分 （C100%) というリニアな濃度勾配
( 3 ) 38- 48分（C100%)
( 4 ) 48分（C 100°/0)→53分 (A 100%)というリニアな濃度勾配
( 5 ) 53- 65分 （A 100%) 産業上の利用の可能性
本発明により、 L一トリブトファンを効率よく製造することができる。 また、 L一トリプトファンの製造に伴う副生物の生成を減少させることができる。

Claims

請求の範囲
1 . L—トリプトファン生産能を有し、 かつ、 マレートシンターゼ 'イソシ トレートリァーゼ ·ィソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ /フォスファタ一 ゼオペ口ンが構成的に発現する力、、 又は同オペ口ンの発現が強化された細菌を培 地に培養し、 同培地中に L一トリブトファンアミノ酸を生成蓄積せしめ、 これを 採取する、 L一トリブトファンの製造法。
2 . 前記細菌は、 iclR遺伝子の発現量が低下又は消失することにより、 前記 オペロンが構成的に発現する細菌である、 請求項 1に記載の製造法。
3 . 前記細菌がェシエリヒア属細菌である、 請求項 1又は 2に記載の Lート リブトフアンの製造法。
4 . L一トリプトファン生産能を有し、 かつ、 マレートシンターゼ .イソシ トレートリァーゼ ·ィソシトレートデヒ ド口ゲナーゼキナーゼ Zフォスファタ一 ゼォペロンが構成的に発現するか、 又は同オペロンの発現が強化されたェシエリ ヒァ属細菌。
5 . i c 1 R遺伝子が破壊されたことにより前記オペロンが構成的に発現す る請求項 4に記載のェシヱリヒァ属細菌。
6 . Lートリブトフアン生産能を有する細菌を培地中で培養して同培地中に L一トリブトファンを生成蓄積せしめ、 L—トリブトファンを採取する L一トリ プトファンの製造法において、 前記細菌として、 マレートシンターゼ 'イソシト レートリァーゼ ·ィソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ Zフォスファターゼ オペロンが構成的に発現するか、 もしくは同オペロンの発現が強化された細菌、 またはトリプトファンシンターゼの発現が強化された細菌を用いることにより、 L一トリプトファン類似物質の副生を減少させる方法。
7 . L一トリブトファン類似物質が J A Tである、 請求項 6に記載の方法。
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