WO2005103244A1 - Neue alkalische proteasen und wasch- und reinigungsmittel, enthaltend diese neuen alkalischen proteasen - Google Patents

Neue alkalische proteasen und wasch- und reinigungsmittel, enthaltend diese neuen alkalischen proteasen Download PDF

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WO2005103244A1
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alkaline protease
protease
protein
acid
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PCT/EP2005/003983
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Susanne Wieland
Karl-Heinz Maurer
Beatrix Kottwitz
Frank Niehaus
Patrick Lorenz
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Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38609—Protease or amylase in solid compositions only
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38618—Protease or amylase in liquid compositions only

Definitions

  • the present application relates to two mutually similar novel alkaline proteases whose DNA was obtained from soil samples, C-terminally deleted, also proteolytically active fragments thereof and all sufficiently similar alkaline proteases and nucleic acids and technical applications for these proteases, especially their use in washing and detergents.
  • proteases of the subtilisin type are particularly important, which are attributed to the serine proteases due to the catalytically active amino acids. They act as nonspecific endopeptidases, that is, they hydrolyze any acid amide linkages that are internal to peptides or proteins. Their pH optimum is usually in the clearly alkaline range.
  • Subtilases: Subtilisin-like Proteases by R.
  • subtilisin enzymes are naturally occurring of microorganisms, formed; Of these, in particular, the subtilisins formed and secreted by ⁇ ac / 7 / t / s species are to be mentioned as the most important group within the subtilases.
  • Proteases are, in addition to other enzymes, established active ingredients of detergents and cleaners. They cause the breakdown of protein-containing stains on the items to be cleaned. At best, there are synergies between the enzymes and the remaining components of the funds concerned.
  • subtilases occupy an outstanding position due to their favorable enzymatic properties such as stability or pH optimum. They are also suitable for a variety of other technical uses, for example as components of cosmetics or in the organic-chemical synthesis.
  • the classic approach to obtaining new enzymes is to take samples of microorganisms from natural habitats and among them as appropriate cultivated conditions - for example in an alkaline environment. In this way enrichment cultures of microorganisms are obtained, which with a certain probability also contain enzymes, including alkaline proteases, which are active under the conditions in question. From this, the microorganisms with the most efficient enzymes are then selected and purified or cloned, for example, by plating on proteinaceous agar plates and measuring the lysis farms formed. Such an approach is described, for example, in the textbook "Alkalophilic Microorganisms. A new microbial world "by K. Horikoshi and T. Akiba (1982), Japan Scientific Societies Press, Springer-Verlag, New York, Heidelberg, Berlin, ISBN 0-387-10924-2, Chapter 2, pages 9-26 ,
  • alkaline proteases are used in detergents and cleaners.
  • microbially formed alkaline proteases are used in detergents and cleaners.
  • microbially formed alkaline proteases are used in detergents and cleaners.
  • BP-3376-derived proteinase K-16 from Kao Corp., Tokyo, Japan, (US Pat. No. 5,344,770) and according to WO 96/25489 A1 (from Procter & Gamble, Cincinnati, OH, USA) the protease from the psychrophilic Organism Flavobacterium balustinum.
  • Natural proteases are optimized by mutagenesis methods known per se, for example for use in detergents and cleaners. These include point mutagenesis, deletion, insertion or fusion with other proteins or protein parts or other modifications.
  • the strategy of introducing targeted point mutations into the known molecules, for example to improve the washing performance of subtilisins, is also referred to as rational protein design.
  • a similar performance improvement strategy is to change the surface charges and / or the isoelectric point of the molecules and, above that, their interactions with the substrate.
  • the net charge of the subtilisins can be changed via point mutations in order to influence the substrate binding, in particular for use in detergents and cleaners.
  • Another, and in particular complementary, strategy is to increase the stability of the proteases in question and thereby increase their effectiveness.
  • Stabilization via coupling to a Polymer is described for proteases for cosmetics, for example in the patent US 5230891; it is associated with a better skin tolerance. In contrast, stabilizers by point mutations are more common, especially for detergents and cleaners.
  • a modern direction of enzyme development is to combine elements from known, related proteins via statistical methods into new enzymes with previously unattainable properties.
  • Such methods are also summarized under the generic term Directed Evolution. These include, for example, the following methods: the StEP method (Zhao et al., 1998, Nat. Biotechnol., Vol. 16, pp. 258-261), random priming recombination (Shao et al., (1998), Nucleic Acids Res , Vol. 26, pp. 681-683), DNA shuffling (Stemmer, WPC (1994), Nature, Vol. 370, pp. 389-391) or RACHITT (Coco, WM et al., (2001) Nat. Biotechnol ., Vol. 19, pp. 354-359).
  • RLR recombining ligation reaction
  • Subtilisin BPN ' which is derived from Bacillus amyloliquefaciens, or B. subtilis, is known from the work of Vasantha et al. (1984) in J. Bacteriol., Volume 159, pp. 811-819 and by J.A. Wells et al. (1983) in Nucleic Acids Research, Volume J., Pp. 7911-7925.
  • Subtilisin BPN ' serves as a reference enzyme of the subtilisins, in particular with regard to the numbering of the positions.
  • the point mutations relating to all subtilisins of the application EP 251446 A1 are indicated in the numbering of BPN ', whose application subject is designated by the company Procter & Gamble Comp., Cincinnati, Ohio, USA as “Protease B.”
  • the BPN Variants of Application EP 199404 A1 are referred to by Procter & Gamble Comp.
  • Protease A According to the application WO 91/06637 A1, "proteases C” are characterized in turn by other point mutations of BPN '.
  • “Protease D” is according to WO 95/10591 A1 variants of the protease from Bacillus lentus.
  • protease subtilisin Carlsberg is described in the publications of EL Smith et al. (1968) in J. Blol. Chem., Volume 243, pp. 2184-2191, and Jacobs et al. (1985) in Nucl. Acids Res., Vol. 13, pp. 8913-8926. It is naturally produced by Bacillus licheniformis and was and, respectively under the trade name Maxatase ® from Genencor International Inc., Rochester, New York, USA, and under the trade name Alcalase ® from Novozymes A / S, Bagsvasrd, Denmark, available.
  • protease PB92 is naturally derived from the alkaliphilic bacterium Bacillus nov. spec. 92 and Gist-Brocades, Delft, The Netherlands, available under the trade name was Maxacal ® by the company.. In its original sequence, it is described in the patent application EP 283075 A2.
  • subtilisins 147 and 309 are sold under the trade names Esperase ®, or Savinase ® by the company. Novozymes. They are originally from Bac /// t / s strains, which are disclosed in the application GB 1243784 A.
  • subtilisin DY is originally from Nedkov et al. Chem. Hoppe-Seyler, Vol. 366, pp. 421-430.
  • protease which is the alkaline protease from ß. lentus has a comparatively low homology. At the level of mature proteins, it is only 33% identical (46% similar amino acids).
  • the proteinase K is originally from the microorganism Tritirachium album Limber and is from K.-D. Jany and B. Mayer 1985 in Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Volume 366, pages 485-492 been described.
  • WO 88/07581 A1 discloses the proteases TW3 and TW7, which are very similar to one another, inter alia for use in detergents and cleaners.
  • the bacillopeptidase F from Bacillus subtilis has only a similarity at the amino acid level of 30% identity to the B. / e ⁇ us alkaline protease. This enzyme is described in the above-mentioned work by Siezen et al. listed, but not yet described or claimed for use in detergents and cleaners.
  • the application WO 01/68821 A2 discloses new subtilins with a good performance against egg soiling.
  • alkaline proteases which are formed by microorganisms which are isolatable from natural habitats, go for example from the applications
  • WO 03/054185 A1 from Bacillus gibsonii (DSM 14391)
  • WO 03/056017 A2 from Bacillus sp. (DSM 14390)
  • WO 03/055974 A2 from Bacillus sp. (DSM 14392)
  • proteases Another group of technically important proteases are the metalloproteases, ie those that require a metal cation as a cofactor. Representatives of this can also be assigned to the family of subtilases.
  • US 2003/0113895 A1 discloses metalloproteases from Gram-positive microorganisms such as B. subtilis, but also S. cerevisiae, S. pombe, E. coli and H. influenzae.
  • Detergents and cleaning agents with metalloproteases disclose the applications WO 00/60042 A1 and WO 02/36727 A1.
  • the unpublished application DE 10360805.2 discloses an alkaline metalloprotease whose associated DNA could be isolated from a soil sample and its use in detergents and cleaners.
  • proteases for basically all established fields of application are disclosed in the application WO 2004/033668 A2.
  • Another known protease is StmPr2 from Stenotrophomonas maltophilia, which has been deposited and published under the entry AY253983 at GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).
  • proteases are sold under the trade name Durazym ®, relase ®, Everlase® ®, Nafizym, Natalase ® and Kannase® ® from Novozymes, under the trade names, Maxapem ®, Purafect ®, Purafect OxP ® and Properase.RTM ® from Genencor under the trade name Protosol® ® from Advanced Biochemicals Ltd., Thane, India and under the trade name Wuxi ® from Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, available enzymes.
  • a suitable protease for detergents or cleaners is preferably characterized by a certain insensitivity to the corresponding conditions - such as the presence of per se denaturing surfactants, bleach, high temperatures, etc. - and good performance against corresponding substrates such as those in food residues from finding proteins.
  • the present invention was therefore based on the object to find new alkaline proteases. In particular, those should be found that naturally cause an improvement in the performance of detergents or cleaners.
  • the subtask was connected to establish a suitable method for the isolation of such a protease.
  • Other subtasks were to provide nucleic acids encoding such proteases in order to obtain genetic engineering and microbiological elements that can be used to obtain and further develop such proteases and, if desired, be shuffled.
  • appropriate means, in particular washing and cleaning agents, appropriate washing and cleaning processes and corresponding methods and uses for such proteases should be made available.
  • technical applications for the proteases found should be defined.
  • the associated nucleic acids corresponding natural cells, suitable methods for their identification, in particular molecular biology based on the nucleic acids and process elements and means, detergents and cleaning agents, washing and cleaning processes and applications characterized by the proteases concerned associated.
  • SEQ ID NO. 4 and 7 indicated enzymes or the associated matures enzymes for detergents and cleaners useful proteolytic activities. Due to the DNA provided, additional optimizations of these enzymes, for example via further point mutations, are possible. Furthermore, these DNA can be incorporated into shuffling approaches and thus used to generate completely new proteases.
  • a protein is to be understood as meaning a polymer composed of the natural amino acids and having a largely linear structure and assuming a function which is generally three-dimensional in order to perform its function.
  • the 19 proteinogenic, naturally occurring L-amino acids are designated by the internationally used 1- and 3-letter codes. The combination of one of these designations with a number indicates, for the particular protein, which amino acid residue it carries in the respective position. For point mutations analogous designations are established. Unless stated otherwise, positional information relates to the respective mature forms of the relevant proteins, ie without the signal peptides (see below).
  • an enzyme is to be understood as meaning a protein which has a specific biochemical function.
  • proteolytic enzymes or enzymes having a proteolytic function are generally to be understood as meaning those which hydrolyze the acid amide bonds of proteins.
  • Numerous proteins are formed as so-called pre-proteins, ie together with a signal peptide.
  • pre-proteins ie together with a signal peptide.
  • the signal peptide is cleaved under natural conditions by a signal peptidase from the rest of the protein, so that this exerts its actual catalytic activity without the initially present N-terminal amino acids.
  • the mature peptides ie the enzymes processed after their preparation, are preferred over the preproteins.
  • Pro-proteins are inactive precursors of proteins. Their signal sequence precursors are referred to as pre-pro proteins.
  • nucleic acids are understood to mean the molecules which are naturally constructed from nucleotides and serve as information carriers, which code for the linear amino acid sequence in proteins or enzymes. They can be present as a single strand, as a single strand that is complementary to this single strand, or as a double strand. As the naturally more durable information carrier, the nucleic acid DNA is preferred for molecular biology work. In contrast, for the realization of the invention in a natural environment, such as in an expressing cell, an RNA is formed, which is why essential RNA molecules of the invention are also embodiments of the present invention. From them, for example, (C) DNA molecules can be derived via reverse transcription.
  • the information unit of a nucleic acid corresponding to a protein is also referred to as gene in the sense of the present application.
  • gene The information unit of a nucleic acid corresponding to a protein.
  • DNA consider the sequences of both complementary strands in all three possible reading frames. Further, it should be noted that different codon triplets may encode the same amino acids so that a particular amino acid sequence will have several different and possibly only a small identity Nucleotide sequences can be derived (degeneracy of the genetic code). In addition, various organisms have differences in the use of these codons. For these reasons, both amino acid sequences and nucleotide sequences must be included in the scope of view, and given nucleotide sequences should each be considered as an exemplary coding for a particular amino acid sequence.
  • a person skilled in the art will be able to prepare complete genes by known DNA and / or amino acid sequences via methods that are generally known today, such as, for example, chemical synthesis or the polymerase chain reaction (PCR) in conjunction with molecular biological and / or proteinchemical standard methods.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Such methods are known, for example, from the "Encyclopaedia of Biochemistry", Spektrum Akademischer Verlag, Berlin, 1999, Volume 1, pages 267-271 and Volume 2, pages 227 to 229.
  • PCR primers which can be synthesized by means of a known sequence and / or isolated mRNA molecules, the relevant genes can be synthesized from such strains, cloned and, if desired, further processed, for example mutagenized.
  • mutations Changes in the nucleotide sequence, as can be brought about, for example, by molecular biological methods known per se, are referred to as mutations. Depending on the nature of the change, for example, deletion, insertion or substitution mutations or those in which different genes or parts of genes are shuffled together; these are gene mutations.
  • the associated organisms are called mutants.
  • the proteins derived from mutant nucleic acids are called variants.
  • deletion, insertion, substitution mutations or fusions lead to deletion, insertion, substitution mutated or fusion genes and at the protein level to corresponding deletion, insertion or substitution variants or fusion proteins.
  • amino acid exchanges For the description of point mutations, which concern exactly one amino acid position (amino acid exchanges), the following convention is used: first, the naturally occurring amino acid in the form of the international common one-letter codes, followed by the associated sequence position and finally the inserted amino acid. Several exchanges within the same polypeptide chain are separated by slashes.
  • vectors are understood as consisting of nucleic acids which contain a gene of interest as a characteristic nucleic acid region. They are able to establish this in a species or cell line over several generations or cell divisions as a stable genetic element independently replicating from the rest of the genome.
  • Vectors especially when used in bacteria, are special plasmids, ie circular genetic elements.
  • cloning vectors One differentiates in the genetic engineering on the one hand between those vectors, which serve the storage and thus to a certain extent also the genetic engineering work, the so-called cloning vectors, and on the other hand those, which fulfill the function to realize the gene of interest in the host cell, that is, the expression of the protein. These vectors are referred to as expression vectors.
  • cells Both bacterial cells and eukaryotic cells containing said vectors, regardless of their differences, are commonly referred to as cells.
  • Such cells which contain a vector, in particular an expression vector and can thus be stimulated to express a transgene, are referred to as host cells because they harbor the genetic system in question.
  • Homologization is the comparison of a nucleic acid or amino acid sequence with that of known genes or proteins. It is made, for example, via an alignment.
  • the measure of homology is a percentage of identity, such as can be determined, for example, according to the method given by DJ Lipman and WR Pearson in Science, Vol. 227 (1985), pages 1435-1441. This is preferably done via algorithms, which are now used by commercially available computer programs. This includes for example the Vector NTI ® Suite 7.0 product line, available from InforMax, Inc., Bethesda, USA, preferably with the specified default Parametem.
  • the homology statement may refer to the entire protein or to the particular region to be assigned.
  • a broader homology term, similarity also refers to conserved variations, that is, amino acids with similar chemical activity in the Consideration, as they usually perform similar chemical activities within the protein. With nucleic acids one knows only the percentage of identity.
  • homologous regions of different proteins are those with comparable functions that can be identified by identity or conserved substitutions in the primary amino acid sequence. They include single amino acids, smallest areas, so-called boxes that are few amino acids long, to long areas in the primary amino acid sequence.
  • the functions of the homologous regions thus also include the smallest subfunctions of the function carried out by the entire protein, such as the formation of individual hydrogen bonds for complexing a substrate or transition complex. Other areas of the protein that are not involved in the actual enzymatic reaction can modify them qualitatively or quantitatively. This relates, for example, to enzyme stability, activity, reaction conditions or substrate specificity.
  • proteolytic enzyme or “protease” is therefore understood to mean beyond the functions of the few amino acid residues of the catalytically active center all functions as they are due to the action of the entire remaining protein or a part or more of the remaining protein on the actual catalytically active areas arise. It is also possible that the activities of other proteases are qualitatively or quantitatively modified by one or more parts, for example of the protein according to the invention. This influence on other factors is also considered a proteolytic activity. Proteolytically active enzymes are also those proteases whose activity is blocked at a given time, for example by an inhibitor. Decisive is their basic suitability for the corresponding proteolysis reaction.
  • Fragments are understood to mean all proteins or peptides which are smaller than natural proteins or those which correspond to fully translated genes and, for example, can be obtained synthetically. Due to their amino acid sequences, they can be assigned to the relevant complete proteins. For example, they may adopt the same structures or proteolytic activities or Exercise part activities. Fragments and deletion variants of starting proteins are in principle similar; while fragments tend to be smaller fragments, the deletion mutants tend to lack only short regions, and thus only individual subfunctions.
  • chimeras or hybrid proteins are to be understood as meaning proteins which are composed of elements which naturally originate from different polypeptide chains from the same organism or from different organisms. This procedure is also called shuffling or fusion mutagenesis. The purpose of such a fusion is, for example, to induce or modify an enzymatic function by means of the fused protein part of the invention.
  • proteins obtained by insertion mutation are those variants which have been obtained by methods known per se by inserting a nucleic acid or protein fragment into the starting sequences. They are due to their principle similarity to the chimeric proteins. They differ from those only in the size ratio of the unchanged protein part to the size of the entire protein. In such insertionsmut elected proteins, the proportion of foreign protein is lower than in chimeric proteins.
  • Inversion mutagenesis ie a partial sequence reversal
  • derivatives are understood as meaning those proteins whose pure amino acid chain has been chemically modified.
  • derivatizations can be carried out, for example, biologically in connection with protein biosynthesis by the host organism.
  • molecular biological methods such as co-transformation with genes that provide the modification in question, can be used.
  • derivatizations can also be carried out chemically, for example by the chemical transformation of a side chain of an amino acid or by covalent binding of another compound to the protein.
  • Such a connection may be, for example, others Proteins that are bound, for example via bifunctional chemical compounds to proteins of the invention.
  • Such modifications affect, for example, the substrate specificity or the binding strength to the substrate or cause a temporary blockage of the enzymatic activity when the coupled substance is an inhibitor. This is useful, for example, for the period of storage.
  • derivatization is the covalent attachment to a macromolecular carrier.
  • the performance of an enzyme is understood to mean its effectiveness in the particular technical field considered, preferably in the context of a suitably oriented agent. This is based on the actual enzymatic activity, but moreover depends on further factors which are relevant for the respective process. These include, for example, stability, substrate binding, interaction with the material carrying the substrate, or interactions with other ingredients, particularly synergies.
  • the washing performance or the cleaning performance of a washing or cleaning agent is to be understood as meaning the effect which the agent in question exerts on the soiled articles, for example textiles or objects with hard surfaces.
  • Individual components of such agents for example individual enzymes, are evaluated for their contribution to the washing or cleaning performance of the entire detergent or cleaning agent.
  • an enzyme For from the enzymatic properties of an enzyme can not be readily concluded that its contribution to the washing performance of an agent. For example, stability, substrate binding, binding to the items to be cleaned or interactions with other ingredients of the washing or cleaning agent), in particular synergies in the removal of the contaminants play a role here.
  • the amino acid sequences indicated in Figures 4 and 7 are derived from nucleic acids isolated from soil samples as described in the Examples of the present application. Their sequences are under SEQ ID NO. 3 or 6 indicated.
  • the deduced proteins are designated according to the invention as protease HP70 (for SEQ ID NO 3 and 4) or HP53 (for SEQ ID NO 6 and 7). As can be understood from an alignment, for example via FIG. 4, they have a homology of 93.9% identity to one another at the amino acid level.
  • the data prepared according to the examples can be updated as follows:
  • the protease StmPr2 from St. maltophilia, (GenBank: AY253983) has a sequence homology of 84.7 to the inventive protease HP70 (SEQ ID NO: 4) and to HP53 (SEQ ID NO 7) of 82.5% identity.
  • the SEQ ID NO. 66 protease disclosed in WO 2004/033668 A2 is 83.1% to HP70 and identical to HP53 to 81.1%.
  • WO 2004/033668 A2 discloses homology values of 85.0% identity to HP70 and of 82.3% identity to HP53.
  • all alkaline proteases can be included in the scope of the present application whose amino acid sequences to SEQ ID NO. 4 at least 90%) or to SEQ ID NO. 7 at least 87.5%) are identical.
  • alkaline proteases whose amino acid sequence to the in SEQ ID NO. At least 95%) and more preferably at least 96%, 97%, 98%, 99% and most preferably 100%) or to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. At least 90%, and more preferably at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% and most preferably 100%) of the amino acid sequence indicated, each integer or fractional intermediate value being included accordingly.
  • the most preferred proteases encoded by these vectors and tested in the Examples of the present application are designated HP70 and HP53, respectively.
  • inventive alkaline proteases in which the homology values in each case apply to the region corresponding to the amino acid positions 33 to 581 according to SEQ ID NO. 4 or 39 to 586 according to SEQ ID NO. 7 corresponds.
  • the (presumably) mature protease HP70 (SEQ ID NO. 4, positions 33 to 581) belongs to the homologous region of SEQ ID NO. 66 from WO 2004/033668 A2 to 84.2% identical to that of SEQ ID NO. 70 from WO 2004/033668 A2 to 86.2% and to the protease STmPr2 to 85.8%.
  • the (presumably) mature protease HP53 (SEQ ID NO. 7, positions 39 to 586) is linked to the homologous region of SEQ ID NO. 66 from WO 2004/033668 A2 to 83.8% o identical to that of SEQ ID NO. 70 from WO 2004/033668 A2 to 85.0% and to the protease STmPr2 to 85.2%.
  • both of HP70 and of HP53 could have mentioned therein and hereby from the preferred Schutzbreich excluded C-terminal regions, without the Deletions- variants lost their protease activity, in particular the required during the washing or cleaning process proteolytic activity.
  • the advantage of this drastic deletion is the saving of effort and costs in the biotechnological production of the proteins concerned. This is because in a shorter time more usable according to the invention especially for use in detergents and cleaners enzymes are obtained, which is accompanied, for example, a better utilization of the necessary for the fermentation of the producing microorganisms media components.
  • alkaline proteases described so far having an amino acid sequence according to the consensus sequence of SEQ ID NO. 9, preferably in the range of amino acid positions 39 to 587, more preferably in the range of amino acid positions 39 to 476.
  • SEQ ID NO. 9 represents the two amino acid sequences SEQ ID NO. 4 and 7 available consensus sequence, as it can be set up, for example, via the Align ent of Figure 4. It includes those proteases whose amino acid sequences in each position are either SEQ ID NO. 4 or SEQ ID NO. 7 can be returned. These two sequences thus open up a sequence space of related or similar subtilisin proteases. They have the sequence shown in SEQ ID NO.
  • any of the alkaline proteases described so far which is encoded by a nucleotide sequence corresponding to that shown in SEQ ID NO. 3 nucleotide sequence is at least 85% and increasingly preferably at least 90%, 95%, 96%>, 97%, 98%, 99% and most preferably 100% identical, in particular for the range of nucleotide positions 97 to 1746 according to SEQ ID NO. 3, more particularly for the region corresponding to nucleotide positions 97 to 1410 according to SEQ ID NO. 3, or encoded by a nucleotide sequence corresponding to that shown in SEQ ID NO.
  • nucleotide sequence is at least 85% and increasingly preferably at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% and most preferably 100% identical, in particular for the range of nucleotide positions 115 to 1761 according to SEQ ID NO. 6, more particularly for the region corresponding to nucleotide positions 115 to 1428 according to SEQ ID NO. 6 corresponds to each integer or fractional intermediate value being included accordingly.
  • the particularly preferred proteases have not been detected per se or via a corresponding microorganism but are encoded by nucleic acids discovered in connection with the present invention.
  • the enzyme closest to HP70 and HP53 at the nucleotide level has an extracellular serine protease (EC 3.4.21.-) from Xanthomonas campestris pv. Campestris (ATCC 33913; NP_636242), such as the computer program Vector NTI ® Suite 7.0, available from InforMax, Inc., Bethesda, USA, can be determined with the specified default Parametem, at the nucleotide homology of 74.4 or 75.0% identity. Accordingly, all alkaline proteases and proteins encoded by significantly more similar nucleic acids are included within the scope of protection.
  • the protease StmPr2 from St. maltophilia has a sequence homology of DNA-level to the inventive protease HP70 (SEQ ID No. 3) in the homologizable region 80.8 and to the DNA sequence of HP53 (SEQ ID NO: 6) of 81.2% identity.
  • the SEQ ID NO. The protease DNA sequence disclosed in WO 2004/033668 A2 is 79.6% identical to that of HP70 and 79.9% to that of HP53.
  • WO 2004/033668 A2 discloses homology values of 81.3% identity to the HP70 DNA and of 81.1% identity to the HP53 DNA.
  • the gene for the (presumably) mature protease HP53 (SEQ ID NO: 6, positions 115 to 1761) is linked to the homologous region of SEQ ID NO. 65 from WO 2004/033668 A2 to 81, 0% identical to that of SEQ ID NO. 69 from WO 2004/033668 A2 to 82.2% and to the protease STmPr2 to 82.9%.
  • alkaline proteases are accordingly preferred.
  • the nucleic acid (SEQ ID NO: 6, positions 115 to 1428) coding for the (presumably) mature and C-terminally deleted protease HP53 is part of the homologous region of SEQ ID NO. 65 from WO 2004/033668 A2 to 82.1% identical to that of SEQ ID NO. 69 from WO 2004/033668 A2 to 83.6% and to the protease STmPr2 to 83.9%.
  • alkaline proteases derived from these DNA segments are particularly preferred.
  • any of the alkaline proteases according to the invention which can be isolated from a natural habitat or which is derived from a nucleic acid which can be isolated from a natural habitat.
  • the DNA isolated using the method described in the examples has been formed by natural organisms and also codes for functional proteins in vivo.
  • the isolation of the nucleic acids leads directly to a gene that can be introduced and produced in molecular biological characterizations.
  • alkaline proteases of the invention which themselves or their associated nucleic acid originates from an organism which is isolable from a natural habitat.
  • proteases of the invention can then be isolated from their cell extracts or culture supernatants and prepared.
  • alkaline proteases are preferred, which is a microorganism, preferably a fungus or a bacterium, among these preferably a Gram-positive bacterium, and more preferably one of the genus Bacillus.
  • fragmentation or deletion mutagenesis with at least 100 and increasingly preferably at least 150, 200, 250 and very particularly preferably at least 300 amino acids already linked in the starting molecule.
  • Such mutations are described, for example, in WO 99/49057 A1.
  • WO 01/07575 A2 teaches that deletions of this kind lower the allergenicity of the proteases in question and thus their overall applicability can be improved.
  • Fragmentation benefits the later-described aspect of insertion or substitution mutagenesis and / or fusion with other enzymes. With regard to the intended use of these enzymes, it is preferred if they also have a proteolytic activity after fragmentation or deletion mutagenesis; it is particularly preferred if they have an additional increased thereby activity.
  • alkaline proteases or proteins Preference is furthermore given to alkaline proteases or proteins, as have hitherto been described as being according to the invention and derived from one of the alkaline proteases or proteins described hitherto by insertion mutagenesis, by substitution mutagenesis and / or by fusion with at least one other protein.
  • proteins according to the invention can also be linked with amylases or cellulases, for example, in order to perform a dual function.
  • alkaline proteases or proteins with one or more amino acid substitutions include the alkaline proteases or proteins with one or more amino acid substitutions in the positions 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 and 268 in the count of the alkaline protease from Bacillus lentus, these positions being assigned via the alignment in FIG.
  • fenfc / s alkaline protease the following amino acid residues: S3, V4, S36, N42, A47, T56, G61, T69, E87, A96, R99, A101, 1102, S104, N114, H118, A120, S130, S139, T141, S142 , S154, S157, A188, V193, V199, G205, L211, A224, K229, S236, N237, N242, H243, N255 and T268, respectively.
  • SEQ ID NO. 7 that is to say HP53, the following positions: P146, N147, T188, N194, Y201, A210, G215, T251, K270, K279, (-), Y283, T284, D286, V302, E310, 1312, S323, G332, V334, S335, S347, V351, A382, S387, S399, G405, Y412, V425, Q430, S438, P439, T444, L445, G459 and V472.
  • WO 92/21760 A1 discloses single and multiple variants of the subtilisin from Bacillus lentus DSM 5483 in the following positions: 3, 4, 36, 42, 47, 56, 69, 87, 96, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 157, 188, 193, 199, 205, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 and 268.
  • the application WO 95/23221 A1 additionally discloses exchanges on this molecule in positions 99, 154 and 211, in particular R99G, R99A, R99S, S154D, S154E, L211D and L211E.
  • positions P140, N141, G209, A376, S381, S393 and Y406 correspond to positions P146, N147, G215, A382, S387, S399 and Y412 in HP53, respectively.
  • Preferred embodiments are those in which the molecule is stabilized in several ways. For example, according to WO 89/09819 A1 it can be assumed that several stabilizing mutations act additively.
  • inventive alkaline protease or protein which is additionally derivatized.
  • Derivatives are understood as meaning proteins which are derived from the exported proteins by an additional modification. Such modifications may affect, for example, stability, substrate specificity, or binding strength to the substrate or enzymatic activity. They can also serve to reduce the allergenicity and / or immunogenicity of the protein and thus, for example, increase its skin compatibility.
  • Such derivatizations can be carried out, for example, biologically, for example in connection with the protein biosynthesis by the producing host organism.
  • couplings of low molecular weight compounds such as lipids or oligosaccharides are particularly noteworthy.
  • derivatizations can also be carried out chemically, for example by the chemical transformation of a side chain or by covalent bonding of another, for example macromolecular, compound to the protein.
  • a chemical modification is described for example in the application DE 4013142 A1.
  • the coupling of amines to carboxyl groups of an enzyme to change the isoelectric point is shown in WO 95/26398 A1.
  • macromolecules such as proteins, for example via bifunctional chemical compounds, can be bound to proteins according to the invention.
  • WO 99/57154 A1 it is also possible to provide a protein according to the invention with a specific binding domain via a nonprotein linker.
  • Such derivatives are particularly suitable for use in detergents or cleaners.
  • Derivatives of proteins according to the invention can in the broadest sense also be understood to mean preparations of these enzymes.
  • a protein may be associated with various other substances, for example from the culture of the producing microorganisms.
  • a protein may also, for example to increase its storage stability, with certain others Substances have been deliberately added. Therefore, all preparations of a protein according to the invention are also according to the invention. This is also independent of whether or not it actually exhibits this enzymatic activity in a particular preparation. Because it may be desired that it has no or only low activity during storage, and unfolds its proteolytic function only at the time of use. This can be controlled, for example, via appropriate accompanying substances.
  • the joint preparation of proteases with protease inhibitors is advantageous and known from the prior art (WO 00/01826 A2).
  • inventive alkaline protease or protein which has at least one antigenic determinant in common with one of the abovementioned alkaline proteases or proteins, in particular via at least one of the epitope regions within which positions 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 and 268 in the count of the alkaline protease from Bacillus lentus, attributable to the alignment in Figure 1.
  • nucleic acids having a nucleotide sequence which corresponds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 3 nucleotide sequence at least 85% or to the in SEQ ID NO. 6 nucleotide sequence is at least 85% identical.
  • the detection of the protease described in the examples is based on the isolation of the associated DNA.
  • the nucleic acids can be directly moniert and thus introduced into the genetic engineering of the derived enzymes.
  • those which are increasingly preferred for one of the specified nucleotide sequences are at least 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, and most preferably 100%, each inclusive of all integer or fractional intermediate values.
  • nucleic acids according to the invention in which the homology values in each case apply to the region which corresponds to nucleotide positions 97 to 1746 according to SEQ ID NO. 3 or the nucleotide positions 115 to 1761 according to SEQ ID NO. 6 corresponds.
  • the range coding for the respective mature, ie active protein is included because its existence ensures that not a larger possibly no longer functional, unwanted fusion protein is formed. Thus, it must be ensured in the cloning that there is also a stop codon at this point if it is not intended to bring about a protein fusion via the C-terminus. Should it later turn out that the mature protein is formed by another part of this sequence, the scope of protection applies accordingly to this part.
  • nucleic acids according to the invention in which the homology values in each case apply to the region which corresponds to nucleotide positions 97 to 1410 according to SEQ ID NO. 3 or the nucleotide positions 115 to 1428 according to SEQ ID NO. 6 corresponds.
  • nucleic acids according to the invention which code for an alkaline protease or a protein of the first subject of the invention.
  • nucleic acids which code for only inactive proteins not a solution of the invention.
  • nucleic acids according to the invention of which one or preferably several codons are replaced by synonymous codons.
  • This aspect relates in particular to the heterologous expression of the relevant proteases.
  • every organism, especially every production strain has a certain codon usage. This can lead to bottlenecks in protein biosynthesis, if the lying on the transgenic nucleic acid codons in the host cell of a relatively small number of loaded tRNAs face. Synonymous codons encode the same amino acids and can be better translated depending on the host. This possibly necessary rewriting thus depends on the choice of the expression system. Especially with samples from unknown, possibly non-cultivable organisms, a corresponding adaptation may be necessary.
  • the cells of an organism are furthermore included in the protective range and represent a separate subject of the invention, which naturally contains a nucleic acid according to the invention. Because of their cultivation, the desired enzymes can be directly accessible.
  • Particularly preferred among these are those cells which naturally express and preferably secrete a protease or a protein of the first subject of the invention.
  • proteases according to the invention can be tested immediately with regard to their intended field of use and possibly be obtained in large quantities by immediate cultivation of this organism.
  • those cells are preferred which are microorganisms, preferably fungi or bacteria, including preferably Gram-positive bacteria and more preferably those of the genus Bacillus or Gram-negative bacteria of the genus Xanthomonas.
  • Another independent subject matter of the invention are methods for the identification of an alkaline protease of the first subject of the invention, which are based on the isolation of a nucleic acid from a naturally populated habitat.
  • primers according to methods known per se, which comprise exclusively or in particular N-terminally only slightly more than the mature protein;
  • the isolated nucleic acid is cloned, preferably expressed and particularly preferably identified as protease via the protease activity of the expression product.
  • the essential molecular biological step with the recovery of the associated enzyme is initiated.
  • the expression serves for the biochemical characterization of the protein derived from the nucleic acid.
  • the test for protease activity for example via the degradation of a protein substrate (see examples)
  • vectors which contain a nucleic acid region according to the invention designated above.
  • vectors are commercially available in large numbers and with a wide variety of variations, both for cloning and for expression. These include, for example, vectors derived from bacterial plasmids, bacteriophages or viruses, or predominantly synthetic vectors. Furthermore, they are distinguished according to the type of cell types in which they are able to establish themselves, for example, vectors for Gram-negative, Gram-positive bacteria, yeast or higher eukaryotes. They form suitable starting points for example for molecular biological and biochemical investigations and for the expression of the relevant gene or associated protein.
  • vectors of the invention are cloning vectors.
  • cloning vectors are suitable in addition to the storage, the biological amplification or the selection of the gene of interest for its molecular biological characterization. At the same time they are transportable and storable forms of the claimed nucleic acids and are also starting points for molecular biological techniques that are not bound to cells, such as the PCR or / n-we-mutagenesis method.
  • vectors according to the invention are expression vectors.
  • expression vectors are the basis for realizing the corresponding nucleic acids in biological production systems and thus to produce the associated proteins.
  • the subject of the invention are expression vectors which carry the genetic elements necessary for the expression, for example the natural promoter originally located in front of this gene or a promoter from another organism. These elements can be arranged for example in the form of a so-called expression cassette. Alternatively, individual or all regulatory elements may also be provided by the respective host cell. With particular preference, the expression vectors are matched to the selected expression system, in particular the host cell (see below), with regard to further properties, for example the optimal copy number.
  • a separate subject of the invention are cells which, after genetic engineering modification, contain one of the previously described nucleic acid regions of the invention.
  • these cells contain the genetic information for the synthesis of a protein according to the invention.
  • these are to be understood as meaning those cells which have been provided with the nucleic acids according to the invention by methods known per se or which are derived from such cells.
  • suitable suitable host cells are those which can be cultivated relatively easily and / or yield high product yields.
  • This genetic information can either be extrachromosomally as a separate genetic element, ie be present in bacteria in plasmidaler localization or integrated into a chromosome.
  • the choice of a suitable system depends on issues such as the nature and duration of storage of the gene, or the organism or the type of mutagenesis or selection. Thus, for example, based on bacteriophages - and their specific host cells - based mutagenesis and selection methods for the development of detergent enzymes are described in the prior art (WO 97/09446 A1).
  • the said nucleic acid region is preferably located on one of the above-described vectors according to the invention, in particular on a cloning or expression vector.
  • those cells are preferred which express an alkaline protease or a protein of the first subject of the invention, preferably secrete.
  • protein-forming host cells enable their biotechnological production.
  • all organisms that is prokaryotes, eukaryotes or cyanophyta, are suitable as host cells for protein expression.
  • host cells which can be genetically well handled, for example, the transformation with the expression vector, its stable establishment and the regulation of expression, for example, unicellular fungi or bacteria.
  • preferred host cells are characterized by good microbiological and biotechnological handling. This concerns, for example, easy culturing, high growth rates, low demands on fermentation media and good production and secretion rates for foreign proteins.
  • laboratory strains are selected which are aligned to the expression. Such are available commercially or via publicly available strain collections.
  • Each protein of the invention can thus be theoretically obtained from a variety of host organisms. From the abundance of various systems available in the prior art, the optimal expression systems for the individual case must be determined experimentally.
  • host cells which are themselves protease-negative and thus do not degrade proteins formed.
  • Preferred embodiments are those host cells which are regulatable in activity by virtue of corresponding genetic elements, for example by controlled addition of chemical compounds, by changing the culture conditions or depending on the respective cell density.
  • These controllable expression allows for very economical production of the proteins of interest; It can be realized, for example, via a corresponding element on the relevant vector.
  • the gene, expression vector and host cell are matched to one another, which relates, for example, to the genetic elements required for expression (ribosome binding site, promoters, terminators) or the codon usage.
  • bacteria are characterized by short generation times and low demands on the cultivation conditions. As a result, inexpensive methods can be established. In addition, bacteria have a wealth of experience in fermentation technology. For a specific production gram-negative or gram-positive bacteria may be suitable for a variety of reasons to be determined experimentally in individual cases, such as nutrient sources, product formation rate, time requirement, etc.
  • it is gram-negative bacteria, in particular the genus ash chia coli, Klebsieila, Pseudomonas or Xanthomonas, in particular strains of E. coli K12, E. coli B or Klebsieila planticola, and especially derivatives of the strains Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5 ⁇ , E. coli JM109, E. coli XL-1 or Klebsiella planticola (Rf).
  • Gram-negative bacteria such as E. coli
  • a variety of proteins are secreted into the periplasmic space. This can be advantageous for special applications.
  • the application WO 01/81597 A1 discloses a method according to which it is achieved that gram-negative bacteria also eject the expressed proteins. Such a system is also suitable for the production of proteins according to the invention.
  • the Gram-negative bacteria which are mentioned as preferred are generally light, that is to say commercially or accessible via public strain collections and, in conjunction with also readily available, numerous remaining components, such as vectors, can be optimized for specific production conditions.
  • Xanthomonas but also Pseudomonas are promising host cells because of their suspected relationship to the in vivo HP70 and / or HP53 producing strains; not least because of a probably similar codon usage.
  • it is a Gram-positive bacterium, in particular one of the genera Bacillus, Staphylococcus or Corynebacterium, more particularly the species Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii or ß , alcalophilus, Staphylococcus carnosus or Corynebacterium glutamicum.
  • gram-positive bacteria have the gram-negative compared to the fundamental difference, secreted proteins readily deliver into the nutrient medium surrounding the cells, from which, if desired, the expressed proteins according to the invention can be purified directly from the nutrient medium.
  • they are related or identical to most of the organisms of origin for technically important subtilisins and usually form even comparable subtilisins, so that they have a similar codon Usage and their protein synthesizer is naturally aligned accordingly.
  • a further advantage may be that a mixture of proteins according to the invention can be obtained by this process with the subtilisins formed endogenously by the host strains. Such a co-expression is also apparent from the application WO 91/02792. Should it not be desired, the protease genes naturally present in the host cell would have to be permanently or temporarily inactivated.
  • host cells which are eukaryotic cells, preferably of the genus Saccharomyces.
  • fungi such as Actinomycetes or even yeasts such as Saccharomyces or Kluyveromyces.
  • Thermophilic fungal expression systems are presented, for example, in WO 96/02653 A1. Such are particularly suitable for the expression of temperature-resistant variants.
  • Modifications that eukaryotic systems perform, especially in connection with protein synthesis include, for example, the binding of low molecular weight compounds such as membrane anchors or oligosaccharides. Such oligosaccharide modifications can be used, for example, for Lowering the allergenicity may be desirable.
  • coexpression with the enzymes naturally produced by such cells, such as cellulases may be advantageous.
  • An independent subject of the invention are processes for preparing an alkaline protease or a protein according to the first subject of the invention.
  • nucleic acids in particular those in the sequence listing under SEQ ID NO. 3 or 6 specified nucleic acids, the correspondingly preferred genetic information in microbiologically utilizable form, that is provided for genetic engineering production method.
  • Increasingly preferred is the provision of a particularly successfully utilizable by the host cell vector or of such cells themselves.
  • the relevant production methods are known in the art per se.
  • Embodiments of the present invention may also be cell-free expression systems in which protein biosynthesis is understood in vitro. All of the elements already described above can also be combined to form new methods for producing proteins according to the invention. It is conceivable for each protein according to the invention a variety of possible combinations of process steps, so that optimal procedures must be determined experimentally for each specific case. According to the above, among the cell-bound methods, those in which the nucleotide sequence in one or preferably several codons has been adapted to the codon usage of the host strain are preferred.
  • a separate subject of the invention are agents which contain an above-described alkaline protease according to the invention.
  • compositions especially mixtures, formulations, solutions, etc., the utility of which is improved by addition of a protein of the invention described above, within the scope of the present invention.
  • these may be, for example, solid mixtures, for example powders with freeze-dried or encapsulated proteins, or gel or liquid agents.
  • Preferred formulations contain, for example, buffer substances, stabilizers, reaction partners and / or cofactors of the proteases and / or other ingredients synergistic with the proteases.
  • this appropriation is to be understood as the areas of application set out below. Further fields of application emerge from the prior art and are described, for example, in the manual "Industrial Enzymes and their Applications" by H. Uhlig, Wiley-Verlag, New York, 1998.
  • This subject of the invention are attributed as a preferred embodiment means, which are detergents or cleaning agents.
  • This subject matter of the invention includes all conceivable types of detergents, both concentrates and agents to be used undiluted, for use on a commercial scale, in the washing machine or in hand washing or cleaning.
  • detergents for textiles, carpets, or natural fibers, for which according to the present invention the term laundry detergent is used.
  • laundry detergent include, for example, dishwashing detergents for dishwashers or manual dishwashing detergents or hard cleaners Surfaces such as metal, glass, porcelain, ceramics, tiles, stone, painted surfaces, plastics, wood or leather; for such according to the present invention, the term cleaning agent is used.
  • Embodiments of the present invention include all of the prior art and / or all suitable administration forms of the washing or cleaning agents according to the invention. These include, for example, solid, powdered, liquid, gelatinous or pasty agents, if appropriate also of several phases, compressed or uncompressed; further include, for example: extrudates, granules, tablets or pouches, packed both in large containers and in portions.
  • a washing or cleaning agent according to the invention optionally contains further ingredients such as further enzymes, enzyme stabilizers, surfactants, for example nonionic, anionic and / or amphoteric surfactants, and / or bleaches, and / or builders , as well as other optional ingredients, which are detailed below.
  • further ingredients such as further enzymes, enzyme stabilizers, surfactants, for example nonionic, anionic and / or amphoteric surfactants, and / or bleaches, and / or builders , as well as other optional ingredients, which are detailed below.
  • the detergents or cleaners according to the invention comprise the above-described subtilisin-type alkaline proteases according to the invention in an amount of from 2 ⁇ g to 20 mg, preferably from 5 ⁇ g to 17.5 mg, particularly preferably from 20 ⁇ g to 15 mg , most preferably from 50 ⁇ g to 10 mg per gram of the agent. Included are all integer and non-integer values lying between these numbers.
  • protease activity in such agents can be determined by the method described in Tenside, Vol. 7 (1970), pages 125-132. It is accordingly stated in PE (protease units).
  • the nonionic surfactants used are preferably alkoxylated, advantageously ethoxylated, in particular primary, alcohols having preferably 8 to 18 carbon atoms and on average 1 to 12 moles of ethylene oxide (EO) per mole of alcohol, in which the alcohol radical can be linear or preferably methyl-branched in the 2-position , or may contain linear and methyl-branched radicals in the mixture, as they are usually present in Oxoalkoholresten.
  • EO ethylene oxide
  • alcohol ethoxylates with linear radicals of alcohols of native origin having 12 to 18 carbon atoms, for example of coconut, palm, tallow or oleyl alcohol, and on average 2 to 8 EO per mole of alcohol are preferred.
  • Preferred ethoxylated alcohols include, for example, C 12th 1- alcohols with 3 EO or 4 EO, C 9 . 1 alcohol with 7 EO, C 13 . 15 - alcohols with 3 EO, 5 EO, 7 EO or 8 EO, C 12 . 18- alcohols with 3 EO, 5 EO or 7 EO and mixtures of these, such as mixtures of C 2 . 14 alcohol with 3 EO and C 12 .-
  • the degrees of ethoxylation given represent statistical means which, for a particular product, may be an integer or a fractional number.
  • Preferred alcohol ethoxylates have a narrow homolog distribution (narrow rank ethoxylates, NRE).
  • fatty alcohols with more than 12 EO can also be used. Examples of these are tallow fatty alcohol with 14 EO, 25 EO, 30 EO or 40 EO.
  • nonionic surfactants used either as the sole nonionic surfactant or in combination with other nonionic surfactants are alkoxylated, preferably ethoxylated or ethoxylated and propoxylated fatty acid alkyl esters, preferably having 1 to 4 carbon atoms in the alkyl chain, in particular fatty acid methyl esters.
  • alkyl polyglycosides Another class of nonionic surfactants that can be used to advantage are the alkyl polyglycosides (APG).
  • APG alkyl polyglycosides
  • Usable Alkypolyglycoside meet the general formula RO (G) 2 , in which R is a linear or branched, especially in the 2-position methyl branched, saturated or unsaturated, aliphatic radical having 8 to 22, preferably 12 to 18 carbon atoms and G is the symbol which is a glycose unit having 5 or 6 C atoms, preferably glucose.
  • the degree of glycosylation z is between 1.0 and 4.0, preferably between 1.0 and 2.0 and in particular between 1.1 and 1.4.
  • Preference is given to using linear alkyl polyglucosides that is to say alkyl polyglycosides in which the polyglycosyl radical is a glucose radical and the alkyl radical is an n-alkyl radical.
  • Nonionic surfactants of the amine oxide type for example N-cocoalkyl-N, N-dimethylamine oxide and N-tallowalkyl-N, N-dihydroxyethylamine oxide, and the fatty acid alkanolamides may also be suitable.
  • the proportion of these nonionic surfactants is preferably not higher than that of the ethoxylated fatty alcohols, especially not more than half of them.
  • surfactants are polyhydroxy fatty acid amides of the formula (II)
  • RCO is an aliphatic acyl group having 6 to 22 carbon atoms
  • R 1 is hydrogen, an alkyl or hydroxyalkyl group having 1 to 4 carbon atoms
  • [Z] is a linear or branched polyhydroxyalkyl group having 3 to 10 carbon atoms and 3 to 10 hydroxyl groups.
  • the polyhydroxy fatty acid amides are known substances which can usually be obtained by reductive amination of a reducing sugar with ammonia, an alkylamine or an alkanolamine and subsequent acylation with a fatty acid, a fatty acid alkyl ester or a fatty acid chloride.
  • the group of polyhydroxy fatty acid amides also includes compounds of the formula (III) R 1 -OR 2 l R-CO-N- [Z] (III)
  • R is a linear or branched alkyl or alkenyl radical having 7 to 12 carbon atoms
  • R 1 is a linear, branched or cyclic alkyl radical or an aryl radical having 2 to 8 carbon atoms
  • R 2 is a linear, branched or cyclic alkyl radical or an aryl radical or an oxyalkyl radical having from 1 to 8 carbon atoms
  • Alkyl or phenyl radicals are preferred
  • [Z] is a linear polyhydroxyalkyl radical whose alkyl chain is substituted by at least two hydroxyl groups, or alkoxylated, preferably ethoxylated or propoxylated derivatives of this radical.
  • [Z] is preferably obtained by reductive amination of a reducing sugar, for example glucose, fructose, maltose, lactose, galactose, mannose or xylose.
  • a reducing sugar for example glucose, fructose, maltose, lactose, galactose, mannose or xylose.
  • the N-alkoxy- or N-aryloxy-substituted compounds can be converted into the desired polyhydroxy fatty acid amides, for example, by reaction with fatty acid methyl esters in the presence of an alkoxide as catalyst.
  • anionic surfactants for example, those of the sulfonate type and sulfates are used.
  • the surfactants of the sulfonate type are preferably C 9 . 13 - Alkylbenzenesulfonates, olefinsulfonates, that is mixtures of alkene and hydroxyalkanesulfonates and disulfonates, as they are, for example, from C 2 . 18 - monoolefins with terminal or internal double bond by sulfonation with gaseous sulfur trioxide and subsequent alkaline or acidic hydrolysis of the sulfonation obtained.
  • alkanesulfonates consisting of C ⁇ 2 - 18 are obtained, for example, alkanes by sulfochlorination or sulfoxidation and subsequent hydrolysis or neutralization.
  • esters of .alpha.-sulfo fatty acids esters of .alpha.-sulfo fatty acids (ester sulfonates), for example the .alpha.-sulfonated methyl esters of hydrogenated coconut, palm kernel or tallow fatty acids.
  • sulfated fatty acid glycerol esters are to be understood as meaning the mono-, di- and triesters and mixtures thereof, as produced in the preparation by esterification of a monoglycerol with 1 to 3 moles of fatty acid or in the transesterification of triglycerides with 0.3 to 2 moles of glycerol.
  • Preferred sulfated fatty acid glycerol esters are the sulfonation products of saturated fatty acids having 6 to 22 carbon atoms, for example caproic acid, caprylic acid, capric acid, myristic acid, lauric acid, palmitic acid, stearic acid or behenic acid.
  • Alk (en) ylsulfates are the alkali metal salts and in particular the sodium salts of the sulfuric monoesters of C 12 -C 18 fatty alcohols, for example coconut fatty alcohol, tallow fatty alcohol, lauryl, myristyl, cetyl or stearyl alcohol or the C 10 -C 20 oxo alcohols and those half-esters of secondary alcohols of these chain lengths are preferred. Also preferred are alk (en) ylsulfates of said chain length, which contain a synthetic, produced on a petrochemical basis straight-chain alkyl radical, which have an analogous degradation behavior as the adequate compounds based on oleochemical raw materials.
  • C 12 -C ⁇ 6 alkyl sulfates and C- ⁇ 2 -C 15 alkyl sulfates and C 1 -C 15 alkyl sulfates are preferred.
  • 2,3-alkyl sulfates are also suitable anionic surfactants.
  • 21 -alcohols such as 2-methyl-branched C 9 . ⁇ r alcohols containing on average 3.5 mol ethylene oxide (EO) or C 12th 18 fatty alcohols with 1 to 4 EO are suitable. Due to their high foaming behavior, they are only used in detergents in relatively small amounts, for example in amounts of up to 5% by weight, usually from 1 to 5% by weight.
  • Suitable anionic surfactants are also the salts of alkylsulfosuccinic acid, which are also referred to as sulfosuccinates or as sulfosuccinic acid esters and which are monoesters and / or diesters of sulfosuccinic acid with alcohols, preferably fatty alcohols and in particular ethoxylated fatty alcohols.
  • alcohols preferably fatty alcohols and in particular ethoxylated fatty alcohols.
  • Preferred sulfosuccinates contain C 8 . ⁇ 8 fatty alcohol radicals or mixtures of these.
  • Particularly preferred sulfosuccinates contain a fatty alcohol radical which is derived from ethoxylated fatty alcohols, which in themselves constitute nonionic surfactants (description see above).
  • Sulfosuccinates whose fatty alcohol residues are derived from ethoxylated fatty alcohols with a narrow homolog distribution, are again particularly preferred. It is also possible to use alk (en) ylsuccinic acid with preferably 8 to 18 carbon atoms in the alk (en) ylkette or salts thereof.
  • anionic surfactants are particularly soaps into consideration.
  • Suitable are saturated fatty acid soaps, such as the salts of lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, hydrogenated erucic acid and behenic acid and, in particular, soap mixtures derived from natural fatty acids, for example coconut, palm kernel or tallow fatty acids.
  • the anionic surfactants including the soaps may be in the form of their sodium, potassium or ammonium salts, as well as soluble salts of organic bases such as mono-, di-triethanolamine.
  • the anionic surfactants are preferably present in the form of their sodium or potassium salts, in particular in the form of the sodium salts.
  • the surfactants may be contained in the detergents or detergents according to the invention overall in an amount of preferably from 5% by weight to 50% by weight, in particular from 8% by weight to 30% by weight, based on the finished composition ,
  • Detergents or cleaners according to the invention may contain bleaches.
  • bleaches include the compounds which serve as bleaches and provide H 2 O 2 in water, sodium percarbonate, sodium perborate tetrahydrate and sodium perborate monohydrate are of particular importance.
  • Other useful bleaching agents are, for example, peroxopyrophosphates, citrate perhydrates and H 2 O 2 -producing peracidic salts or peracids, such as persulfates or persulfuric acid.
  • the urea peroxohydrate percarbamide which can be described by the formula H 2 N-CO-NH 2 ⁇ 2 O 2 .
  • Typical organic bleaches are the diacyl peroxides, such as dibenzoyl peroxide.
  • Other typical organic bleaches are the peroxyacids, examples of which include the alkyl peroxyacids and the aryl peroxyacids.
  • Preferred representatives are the peroxybenzoic acid and its ring-substituted derivatives, such as alkylperoxybenzoic acids, but also peroxy- ⁇ -naphthoic acid and magnesium monoperphthalate, the aliphatic or substituted aliphatic peroxyacids, such as Peroxylauric acid, peroxystearic acid, ⁇ -phthalimidoperoxycaproic acid (phthalimidoperoxyhexanoic acid, PAP), o-carboxybenzamidoperoxycaproic acid, N-nonylamidoperadipic acid and N-nonylamidopersuccinates, and aliphatic and araliphatic peroxydicarboxylic acids such as 1,12-diperoxycarboxylic acid, 1,9-diperoxyazelaic acid, diperoxysebacic acid, diperoxybrassic acid, diperoxyphthalate - Acids, 2-Decyldiperoxybutan-1, 4-diacid
  • the content of bleach detergent or cleaning agent may be from 1 to 40% by weight and in particular from 10 to 20% by weight, with perborate monohydrate or percarbonate being advantageously used.
  • the agents may also contain bleach activators.
  • bleach activators it is possible to use compounds which, under perhydrolysis conditions, give aliphatic peroxycarboxylic acids having preferably 1 to 10 C atoms, in particular 2 to 4 C atoms, and / or optionally substituted perbenzoic acid. Suitable substances are those which carry O- and / or N-acyl groups of the stated C atom number and / or optionally substituted benzoyl groups.
  • polyacylated alkylenediamines in particular tetraacetylethylenediamine (TAED), acylated triazine derivatives, in particular 1,5-diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazine (DADHT), acylated glycolurils, in particular 1,3,4,6 Tetraacetylglycoluril (TAGU), N-acylimides, in particular N-nonanoyl-succinimide (NOSI), acylated phenolsulfonates, in particular n-nonanoyl or isononanoyloxybenzenesulfonate (n- or iso-NOBS), acylated hydroxycarboxylic acids, such as triethyl-O-acetylcitrate (TEOC ), Carboxylic acid anhydrides, in particular phthalic anhydride, isatoic anhydride and / or succ
  • hydrophilic substituted acyl acetals known from the German patent application DE 196 16 769 and the acyllactams described in the German patent application DE 196 16 770 and the international patent application WO 95/14075 are also preferably used.
  • the combinations of conventional bleach activators known from German patent application DE 4443 177 can also be used.
  • nitrile derivatives such as cyanopyridines, nitrile quats, for example N-alkylammonium acetonitriles, and / or cyanamide derivatives can be used.
  • Preferred bleach activators are sodium 4- (octanoyloxy) benzenesulfonate, n-nonanoyl or isononanoyloxybenzenesulfonate (n- or iso-NOBS), undecenoyl oxybenzenesulfonate (UDOBS), sodium dodecanoyloxybenzenesulfonate (DOBS), decanoyl oxybenzoic acid (DOBA, OBC 10) and or dodecanoyloxybenzenesulfonate (OBS 12), as well as N-methylmorpholinum acetonitrile (MMA).
  • Such bleach activators can be used in the customary amount range of from 0.01 to 20% by weight, preferably in amounts of from 0.1 to 15% by weight, in particular from 1% to 10% by weight, based on the total composition, be included.
  • bleach catalysts may also be included.
  • These substances are bleach-enhancing transition metal salts or transition metal complexes such as Mn, Fe, Co, Ru or Mo-salene complexes or carbonyl complexes.
  • Mn, Fe, Co, Ru, Mo, Ti, V and Cu complexes with N-containing tripod ligands and also Co, Fe, Cu and Ru ammine complexes are suitable as bleach catalysts, wherein such compounds are preferably used, which are described in DE 19709284 A1.
  • Detergents or cleaners according to the invention generally comprise one or more builders, in particular zeolites, silicates, carbonates, organic cobuilders and, where there are no ecological reasons against their use, also the phosphates.
  • builders in particular zeolites, silicates, carbonates, organic cobuilders and, where there are no ecological reasons against their use, also the phosphates.
  • the latter are particularly preferred builders to be used in automatic dishwashing detergents.
  • NaMSi x O 2x + 1 -yH 2 O where M is sodium or hydrogen, x is a number from 1.6 to 4, preferably 1.9 to 4.0 and y is a number from 0 to 20 and preferred values for x 2, 3 or 4 are.
  • Such crystalline layered silicates are described, for example, in European Patent Application EP 164514.
  • Preferred crystalline layered silicates of the formula given are those in which M is sodium and x assumes the values 2 or 3.
  • Na 2 Si 2 O 5 -yH 2 O is preferred.
  • Such compounds are commercially available, for example, under the name SKS® (Clariant company). That is how it is
  • SKS-6 ® mainly to a ⁇ -sodium disilicate with the formula Na 2 Si 2 O 5 yH 2 O
  • SKS-7 ® mainly to the ß-sodium disilicate.
  • acids for example citric acid or carbonic acid
  • NaHSi 2 O 5 yH 2 O commercially available under the names SKS- 9® or SKS- 10® (Clariant). It may also be advantageous to use chemical modifications of these phyllosilicates.
  • the alkalinity of the layered silicates can be suitably influenced.
  • Phyllosilicates doped with phosphate or with carbonate have altered crystal morphologies in comparison with the ⁇ -sodium disilicate, dissolve more rapidly and show an increased calcium binding capacity in comparison to ⁇ -sodium disilicate.
  • phyllosilicates of the general empirical formula x Na 2 O • y SiO 2 • z P 2 O 5 in which the ratio x to y is a number 0.35 to 0.6, the ratio x to z a number from 1, 75 to 1200 and the ratio y to z correspond to a number from 4 to 2800, described in the patent application DE 196 01 063.
  • the solubility of the layered silicates can also be increased by using particularly finely divided layered silicates. Also compounds from the crystalline layer silicates with other ingredients can be used.
  • compounds with cellulose derivatives which have advantages in the disintegrating effect and are used in particular in detergent tablets, and compounds with polycarboxylates, for example citric acid, or polymeric polycarboxylates, for example copolymers of acrylic acid, may be mentioned.
  • amorphous sodium silicates with a Na 2 O: SiO 2 modulus of from 1: 2 to 1: 3.3, preferably from 1: 2 to 1: 2.8 and in particular from 1: 2 to 1: 2.6, which Delayed and have secondary washing properties.
  • the dissolution delay compared with conventional amorphous sodium silicates may have been caused in various ways, for example by surface treatment, compounding, compaction / densification or by overdrying.
  • the term "amorphous” is also understood to mean "X-ray amorphous”.
  • the silicates do not give sharp X-ray reflexes typical of crystalline substances, but at best one or more maxima of the scattered X-rays which have a width of several degrees of diffraction angle. However, it may well even lead to particularly good builder properties if the silicate particles provide blurred or even sharp diffraction maxima in electron diffraction experiments. This is to be interpreted as meaning that the products have microcrystalline regions of size 10 to a few hundred nm, values of up to max. 50 nm and in particular up to max. 20 nm are preferred. Particularly preferred are compacted / compacted amorphous silicates, compounded amorphous silicates and overdried X-ray amorphous silicates.
  • An optionally usable, finely crystalline, synthetic and bound water-containing zeolite is preferably zeolite A and / or P.
  • zeolite P zeolite MAP ® commercial product from Crosfield
  • zeolite X and mixtures of A, X and / or P are particularly preferred.
  • commercially available and preferably usable in the context of the present invention is, for example, a cocrystal of zeolite X and zeolite A (about 80% by weight of> zeolite X) which is marketed by CONDEA Augusta SpA under the trade name AX VEGOBOND ® and by the formula Na 2 O. • (1-n) K 2 O • Al 2 O 3 (2 to 2.5) SiO 2 ⁇ ( 3.5-5.5) H 2 O
  • Suitable zeolites have an average particle size of less than 10 ⁇ m (volume distribution, measuring method: Coulter Counter) and preferably contain 18 to 22% by weight, in particular 20 to 22% by weight, of bound water.
  • Alkali metal phosphates is the summary term for the alkali metal (especially sodium and potassium) salts of various phosphoric acids, in which one can distinguish metaphosphoric acids (HPO 3 ) n and orthophosphoric H 3 PO 4 in addition to higher molecular weight representatives.
  • the phosphates combine several advantages: they act as alkali carriers, prevent lime deposits on machine parts or lime incrustations in fabrics and also contribute to the cleaning performance.
  • Sodium dihydrogen phosphate, NaH 2 PO exists as a dihydrate (density 1, 91 like “3 , melting point 60 °) and as a monohydrate (density 2.04 like “ 3 ). Both salts are white powders which are very soluble in water and which lose their water of crystallization when heated and at 200 ° C into the weak acid diphosphate (disodium hydrogen diphosphate, Na 2 H 2 P 2 O 7 ), at higher temperature in sodium trimetaphosphate (Na 3 P 3 O 9 ) and Maddrell's salt (see below).
  • NaH 2 PO 4 is acidic; It arises when phosphoric acid is adjusted to a pH of 4.5 with sodium hydroxide solution and the mash is sprayed.
  • Potassium dihydrogen phosphate (potassium phosphate primary or monobasic, potassium bisphosphate, KDP), KH 2 PO 4 , is a white salt of density 2.33 "3 , has a melting point of 253 ° C [decomposition to form potassium polyphosphate (KPO 3 ) x ] and is easily soluble in water.
  • Disodium hydrogen phosphate (secondary sodium phosphate), Na 2 HPO 4 , is a colorless, very slightly water-soluble crystalline salt. It exists anhydrous and with 2 moles (density 2.066 like “3 , loss of water at 95 °), 7 moles (density 1, 68 like “ 3 , melting point 48 ° C with loss of 5 H 2 O) and 12 moles water (Density 1.52 like "3 , melting point 35 ° C with loss of 5 H 2 O) becomes anhydrous at 100 ° C and on more intense heating passes into the diphosphate Na 4 P 2 O 7.
  • Disodium hydrogen phosphate is prepared by neutralization of phosphoric acid prepared with soda solution using phenolphthalein as an indicator
  • Dipotassium hydrogen phosphate (secondary or dibasic potassium phosphate), K 2 HPO 4
  • Dipotassium hydrogen phosphate (secondary or dibasic potassium phosphate), K 2 HPO 4
  • K 2 HPO 4 is an amorphous, white salt that is readily soluble in water.
  • Trisodium phosphate, tertiary sodium phosphate, Na 3 PO are colorless crystals which, as dodecahydrate, have a density of 1.62 "3 and a melting point of 73-76 ° C (decomposition), as decahydrate (corresponding to 19-20% P 2 O 5 ) have a melting point of 100 ° C and in anhydrous form (corresponding to 39-40% P 2 O 5 ) has a density of 2.536 "3 .
  • Trisodium phosphate is readily soluble in water under alkaline reaction and is prepared by evaporation of a solution of exactly 1 mole of disodium phosphate and 1 mole of NaOH.
  • Tripotassium phosphate (tertiary or tribasic potassium phosphate), K 3 PO 4 , is a white, deliquescent, granular powder with a density of 2.56 "3 , has a melting point of 1340 ° and is readily soluble in water with an alkaline reaction When heating Thomas slag with coal and potassium sulfate, despite the higher price, the more soluble, hence highly effective, potassium phosphates are often preferred over the corresponding sodium compounds in the detergent industry.
  • Tetrasodium diphosphate (sodium pyrophosphate), Na 4 P 2 O 7 , exists in anhydrous form (density 2.534 like “3 , melting point 988 ° C, also indicated 880 ° C) and as decahydrate (density 1.815-1.836 like " 3 , melting point 94 ° C under water loss). Both substances are colorless crystals which are soluble in water with alkaline reaction.
  • Na 4 P 2 O 7 is formed on heating of disodium phosphate to> 200 ° C or by reacting phosphoric acid with soda in a stoichiometric ratio and dewatering the solution by spraying. The decahydrate complexes heavy metal salts and hardness agents and therefore reduces the hardness of the water.
  • Potassium diphosphate (potassium pyrophosphate), KP 2 O 7 , exists in the form of the trihydrate and is a colorless, hygroscopic powder of density 2.33 "3" 3 which is soluble in water, the pH of the 1% solution being 25 ° C is 10.4.
  • Condensation of NaH 2 PO 4 or KH 2 PO 4 gives rise to higher molecular weight sodium and potassium phosphates, in which one can distinguish cyclic representatives, the sodium or potassium metaphosphates, and chain-type, the sodium or potassium polyphosphates. In particular, for the latter are a variety of names in use: melting or annealing phosphates, Graham's salt, Kurrolsches and Maddrell's salt. All higher sodium and potassium phosphates are collectively referred to as condensed phosphates.
  • pentasodium triphosphate In the preparation of pentasodium triphosphate, phosphoric acid is reacted with soda solution or sodium hydroxide solution in a stoichiometric ratio and the solution is dehydrated by spraying. Similar to Graham's salt and sodium diphosphate, pentasodium triphosphate dissolves many insoluble metal compounds (including lime soaps, etc.). Pentakaliumtriphosphat, K 5 P 3 O ⁇ 0 (potassium tripolyphosphate), for example, in the form of a 50 wt .-% solution (> 23% P 2 O 5 , 25% K 2 O) in the trade. The potassium polyphosphates are widely used in the washing and cleaning industry. There are also sodium potassium tripolyphosphates which can also be used in the context of the present invention. These arise, for example, when hydrolyzed sodium trimetaphosphate with KOH:
  • organic cobuilders it is possible in particular to use in the detergents and cleaners according to the invention polycarboxylates or polycarboxylic acids, polymeric polycarboxylates, polyaspartic acid, polyacetals, optionally oxidized dextrins, further organic cobuilders (see below) and phosphonates. These classes of substances are described below.
  • Useful organic builder substances are, for example, the polycarboxylic acids which can be used in the form of their sodium salts, polycarboxylic acids meaning those carboxylic acids which carry more than one acid function. These are, for example, citric acid, adipic acid, succinic acid, glutaric acid, malic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, sugar acids, aminocarboxylic acids, nitrilotriacetic acid (NTA), if such use can not be avoided for ecological reasons, and mixtures of these.
  • Preferred salts are the salts of polycarboxylic acids such as citric acid, adipic acid, succinic acid, glutaric acid, tartaric acid, sugar acids and mixtures thereof.
  • the acids themselves can also be used. In addition to their builder effect, they also typically have the property of an acidifying component and thus also serve to set a lower and milder pH of detergents or cleaners, unless the pH resulting from the mixture of the other components is desired.
  • system and environmentally compatible acids such as citric acid, acetic acid, tartaric acid, malic acid, lactic acid, glycolic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, gluconic acid and any mixtures of these are to be mentioned.
  • mineral acids, in particular sulfuric acid or bases, in particular ammonium or alkali hydroxides can serve as pH regulators.
  • Such regulators are contained in the agents according to the invention in amounts of preferably not more than 20% by weight, in particular from 1.2% by weight to 17% by weight.
  • polymeric polycarboxylates for example the alkali metal salts of polyacrylic acid or of polymethacrylic acid, for example those having a relative molecular weight of 500 to 70,000 g / mol.
  • the molecular weights stated for polymeric polycarboxylates are weight-average molar masses M w of the particular acid form, which were determined in principle by means of gel permeation chromatography (GPC), a UV detector being used. The measurement was carried out against an external polyacrylic acid standard, which provides realistic molecular weight values due to its structural relationship with the polymers investigated. These data differ significantly from the molecular weight data, in which polystyrene sulfonic acids are used as standard. The molar masses measured against polystyrenesulfonic acids are generally significantly higher than the molecular weights specified in this document.
  • Suitable polymers are in particular polyacrylates, which preferably have a molecular weight of 2,000 to 20,000 g / mol. Because of their superior solubility, the short-chain polyacrylates, which have molecular weights of from 2,000 to 10,000 g / mol, and particularly preferably from 3,000 to 5,000 g / mol, may again be preferred from this group.
  • copolymeric polycarboxylates in particular those of acrylic acid with methacrylic acid and of acrylic acid or methacrylic acid with maleic acid.
  • Copolymers of acrylic acid with maleic acid which contain 50 to 90% by weight of acrylic acid and 50 to 10% by weight of maleic acid have proven to be particularly suitable.
  • Their molecular weight relative to free acids is generally from 2,000 to 70,000 g / mol, preferably from 20,000 to 50,000 g / mol and in particular from 30,000 to 40,000 g / mol.
  • the (co) polymeric polycarboxylates can be used either as a powder or as an aqueous solution.
  • the content of the (co) polymeric polycarboxylates may be from 0.5 to 20% by weight, in particular from 1 to 10% by weight.
  • the polymers may also contain allylsulfonic acids such as allyloxybenzenesulfonic acid and methallylsulfonic acid as a monomer.
  • biodegradable polymers of more than two different monomer units for example those which contain as monomers salts of acrylic acid and maleic acid and vinyl alcohol or vinyl alcohol derivatives or as monomers salts of acrylic acid and 2-alkylallylsulfonic acid and sugar derivatives.
  • copolymers are those which have as monomers preferably acrolein and acrylic acid / acrylic acid salts or acrolein and vinyl acetate.
  • polymeric aminodicarboxylic acids their salts or their precursors.
  • polyaspartic acids or their salts and derivatives are particularly preferred.
  • polyacetals which are prepared by reacting dialdehydes with polyolcarboxylic acids which have 5 to 7 C atoms and at least 3 Hydroxyl groups can be obtained.
  • Preferred polyacetals are obtained from dialdehydes such as glyoxal, glutaraldehyde, terephthalaldehyde and mixtures thereof and from polyol carboxylic acids such as gluconic acid and / or glucoheptonic acid.
  • dextrins for example oligomers or polymers of carbohydrates, which can be obtained by partial hydrolysis of starches.
  • the hydrolysis can be carried out by customary, for example acid or enzyme catalyzed processes.
  • it is hydrolysis products having average molecular weights in the range of 400 to 500 000 g / mol.
  • a polysaccharide with a dextrose equivalent (DE) in the range from 0.5 to 40, in particular from 2 to 30 is preferred, DE being a customary measure of the reducing action of a polysaccharide in comparison to dextrose, which is a DE of 100 has.
  • DE dextrose equivalent
  • Both maltodextrins with a DE of between 3 and 20 and dry glucose syrups with a DE of between 20 and 37 and also yellow dextrins and white dextrins with relatively high molecular weights in the range from 2 000 to 30 000 g / mol are useful.
  • oxidized derivatives of such dextrins are their reaction products with oxidizing agents which are capable of oxidizing at least one alcohol function of the saccharide ring to the carboxylic acid function.
  • oxidizing agents which are capable of oxidizing at least one alcohol function of the saccharide ring to the carboxylic acid function.
  • Particularly preferred organic builders for agents according to the invention are oxidized starches or their derivatives from the applications EP 472042, WO 97/25399, and EP 755944.
  • Oxydisuccinates and other derivatives of disuccinates are other suitable co-builders.
  • ethylenediamine-N, N'-disuccinate (EDDS) is preferably used in the form of its sodium or magnesium salts.
  • glycerol disuccinates and glycerol trisuccinates are also preferred in this context. Suitable amounts are in zeolith-, carbonate and / or silicate-containing formulations between 3 and 15 wt .-%.
  • acetylated hydroxycarboxylic acids or their salts which may optionally also be present in lactone form and which contain at least 4 carbon atoms and at least one hydroxyl group and a maximum of two acid groups.
  • Another substance class with cobuilder properties are the phosphonates. These are, in particular, hydroxyalkane or aminoalkanephosphonates. Among the hydroxyalkane phosphonates, the 1-hydroxyethane-1,1-diphosphonate (HEDP) is of particular importance as a cobuilder. It is preferably used as the sodium salt, the disodium salt neutral and the tetrasodium salt alkaline (pH 9).
  • Preferred aminoalkanephosphonates are ethylenediamine tetramethylenephosphonate (EDTMP), diethylenetriaminepentamethylenephosphonate (DTPMP) and their higher homologs. They are preferably in the form of neutral sodium salts, eg. B. as hexasodium salt of EDTMP or as hepta- and octa-sodium salt of DTPMP used.
  • the builder used here is preferably HEDP from the class of phosphonates.
  • the aminoalkanephosphonates also have a pronounced heavy metal binding capacity. Accordingly, in particular if the agents also contain bleach, it may be preferable to use aminoalkanephosphonates, in particular DTPMP, or to use mixtures of the phosphonates mentioned.
  • Builder substances may optionally be present in the detergents or cleaners according to the invention in amounts of up to 90% by weight. They are preferably contained in amounts of up to 75% by weight. Detergents according to the invention have builder contents of in particular 5% by weight to 50% by weight. In agents according to the invention for the cleaning of hard surfaces, in particular for the automated cleaning of dishes, the content of builder substances is in particular from 5% by weight to 88% by weight, wherein preferably no water-insoluble builder materials are used in such agents.
  • means for the particular machine cleaning of dishes are 20 wt .-% to 40 wt .-% o water-soluble organic builder, in particular alkali, 5 wt .-% to 15 wt .-% alkali carbonate and 20 wt .-% contain up to 40 wt .-% Alkalidisilikat.
  • Solvents that can be used in the liquid to gelatinous compositions of detergents and cleaners for example, from the group of monohydric or polyhydric alcohols, alkanolamines or glycol ethers, if they are in the specified concentration range are miscible with water.
  • the solvents are preferably selected from ethanol, n- or i-propanol, butanols, ethylene glycol methyl ether, ethylene glycol ethyl ether, ethylene glycol propyl ether, ethylene glycol mono-n-butyl ether, diethylene glycol methyl ether, diethylene glycol ethyl ether, propylene glycol methyl, -ethyl or -propyl ether, dipropylene glycol monomethyl, or -ethyl ether, di-isopropylene glycol monomethyl, or -ethyl ether, methoxy, ethoxy or Butoxytriglykol, 1-butoxyethoxy-2-propanol, 3-methyl-3-methoxybutanol, propylene glycol t-butyl ether and mixtures of these solvents.
  • Solvents may be used in the liquid to gelled detergents and cleaners according to the invention in amounts of between 0.1 and 20% by weight, but preferably below 15% by weight and in particular below 10% by weight.
  • one or more thickeners or thickening systems can be added to the composition according to the invention.
  • These high-molecular substances which are also called swelling agents, usually absorb the liquids and swell up to finally pass into viscous true or colloidal solutions.
  • Suitable thickeners are inorganic or polymeric organic compounds.
  • the inorganic thickeners include, for example, polysilicic acids, clay minerals such as montmorillonites, zeolites, silicas and bentonites.
  • the organic thickeners are derived from the groups of natural polymers, modified natural polymers and fully synthetic polymers.
  • Such naturally derived polymers include, for example, agar-agar, carrageenan, tragacanth, gum arabic, alginates, pectins, polyoses, guar gum, locust bean gum, starch, dextrins, gelatin and casein.
  • Modified natural products, which are used as thickeners come mainly from the group of modified starches and celluloses.
  • Fully synthetic thickeners are polymers such as polyacrylic and polymethacrylic compounds, vinyl polymers, polycarboxylic acids, polyethers, polyimines, polyamides and polyurethanes.
  • the thickeners can be used in an amount of up to 5% by weight, preferably from 0.05 to 2% by weight, and more preferably from 0.1 to 1.5% by weight, based on the finished composition, be included.
  • the washing and cleaning agent according to the invention may optionally contain, as further customary ingredients, sequestrants, electrolytes and other auxiliaries, such as optical brighteners, grayness inhibitors, silver corrosion inhibitors, color transfer inhibitors, foam inhibitors, abrasives, dyes and / or fragrances, as well as microbial active ingredients, UV absorbers and or contain enzyme stabilizers.
  • Detergents according to the invention may contain, as optical brighteners, derivatives of diaminostilbenedisulfonic acid or their alkali metal salts.
  • derivatives of diaminostilbenedisulfonic acid or their alkali metal salts for example, salts of 4,4'-bis (2-anilino-4-morpholino-1, 3,5-triazinyl-6-amino) stilbene-2,2'-disulphonic acid or similarly constructed compounds which replace the morpholino Group carry a diethanolamino group, a methylamino group, an anilino group or a 2-methoxyethylamino group.
  • brighteners of the substituted diphenylstyrene type may be present, for example, the alkali salts of 4,4'-bis (2-sulfostyryl) -diphenyl, 4,4'-bis (4-chloro-3-sulfostyryl) -diphenyl, or 4 - (4-chlorostyryl) -4 '- (2-sulfostyryl) -diphenyls. Mixtures of the aforementioned optical brightener can be used.
  • Graying inhibitors have the task of keeping suspended from the textile fiber dirt suspended in the fleet.
  • Water-soluble colloids of mostly organic nature are suitable for this purpose, for example starch, glue, gelatin, salts of ether carboxylic acids or ether sulfonic acids of starch or of cellulose or salts of acidic sulfuric acid esters of cellulose or starch.
  • water-soluble polyamides containing acidic groups are suitable for this purpose.
  • starch derivatives can be used, for example aldehyde starches.
  • cellulose ethers such as carboxymethylcellulose (Na salt), methylcellulose, hydroxyalkylcellulose and mixed ethers, such as methylhydroxyethylcellulose, methylhydroxypropylcellulose, methylcarboxymethylcellulose and mixtures thereof, for example in amounts of from 0.1 to 5% by weight, based on the compositions ,
  • silver corrosion inhibitors can be used in dishwashing detergents according to the invention.
  • dishwashing detergents for example benzotriazoles, iron (III) chloride or CoSO.
  • suitable silver corrosion inhibitors for use in conjunction with enzymes are manganese, titanium, zirconium, hafnium, vanadium, cobalt or cerium salts and / or complexes, in which the metals mentioned are present in one of the oxidation states II, III, IV, V or VI.
  • Examples of such compounds are MnSO 4 , V 2 O 5 , V 2 O 4 , VO 2 , TiOSO 4 , K 2 TiF 6 , K 2 ZrF 6 , Co (NO 3 ) 2 , Co (NO 3 ) 3 , and the like mixtures.
  • Soil-release or “soil repellents” are mostly polymers which impart soil repellency when used in a laundry detergent detergent and / or aid in the soil release performance of the other detergent ingredients. A similar effect can also be observed in their use in hard surface cleaners.
  • Particularly effective and long-known soil release agents are copolyesters with dicarboxylic acid, alkylene glycol and polyalkylene glycol units.
  • examples of these are copolymers or copolymers of polyethylene terephthalate and polyoxyethylene glycol (DT 16 17 141, or DT 22 00 911).
  • DT 22 53 063 acidic agents which contain, inter alia, a copolymer of a dibasic carboxylic acid and an alkylene or cycloalkylene polyglycol.
  • Polymers of ethylene terephthalate and polyethylene oxide terephthalate and their use in detergents are described in German patents DE 28 57 292 and DE 33 24 258 and European patent EP 0253 567.
  • European patent EP 066944 relates to compositions containing a copolyester of ethylene glycol, polyethylene glycol, aromatic dicarboxylic acid and sulfonated aromatic dicarboxylic acid in certain molar ratios.
  • European Patent EP 0 185427 discloses methyl or ethyl group end-capped polyesters having ethylene and / or propylene terephthalate and polyethylene oxide terephthalate units and laundry detergents containing such soil release polymer.
  • European patent EP 0 241 984 relates to a polyester which, besides oxyethylene groups and terephthalic acid units, also contains substituted ethylene units and also glycerine units.
  • polyesters which in addition to oxyethylene groups and terephthalic acid units 1, 2-propylene, 1,2-butylene and / or 3-methoxy-1, 2- contain propylene groups and glycerol units and end-capped with C to C alkyl groups.
  • European Patent Application EP 0 272 033 discloses, at least in part, end-capped polyesters containing poly (propylene terephthalate) and polyoxyethylene terephthalate units by C 1 -C 4 -alkyl or acyl radicals.
  • European Patent EP 0 274 907 describes sulfoethyl end-capped terephthalate-containing soil release polyesters.
  • the color transfer inhibitors which are suitable for use in textile detergents according to the invention include in particular polyvinylpyrrolidones, polyvinylimidazoles, polymeric N-oxides such as poly (vinylpyridine-N-oxide) and copolymers of vinylpyrrolidone with vinylimidazole.
  • foam inhibitors When used in automated cleaning processes, it may be advantageous to add foam inhibitors to the agents concerned.
  • foam inhibitors are, for example, soaps of natural or synthetic origin, which have a high proportion of C 18 -C 24 fatty acids.
  • Suitable non-surfactant foam inhibitors are, for example, organopolysiloxanes and mixtures thereof with microfine, optionally signed silica and paraffins, waxes, microcrystalline waxes and mixtures thereof with signed silica or bistearylethylenediamide. It is also advantageous to use mixtures of various foam inhibitors, for example those of silicones, paraffins or waxes.
  • the foam inhibitors in particular silicone and / or paraffin-containing foam inhibitors, are bound to a granular, water-soluble, or dispersible carrier substance.
  • a hard surface cleaning agent according to the invention may contain abrasive constituents, in particular from the group comprising quartz flours, wood flours, plastic flours, chalks and glass microspheres and mixtures thereof.
  • Abrasive substances are preferably not more than 20% by weight, in particular from 5% by weight to 15% by weight, in the cleaning agents according to the invention.
  • Dyes and fragrances are added to detergents and cleaners in order to improve the aesthetic appearance of the products and to provide the consumer with a visually and sensory "typical and unmistakable" product in addition to the washing and cleaning performance.
  • perfume oils or fragrances individual perfume compounds, for example the synthetic products of the ester type, ethers, aldehydes, ketones, alcohols and hydrocarbons can be used.
  • Fragrance compounds of the ester type are, for example, benzyl acetate, phenoxyethyl isobutyrate, p-tert-butylcyclohexyl acetate, linalyl acetate, dimethylbenzylcarbinyl acetate, phenylethyl acetate, linalyl benzoate, benzyl formate, ethylmethylphenyl glycinate, allylcyclohexyl propionate, styrallyl propionate and benzyl salicylate.
  • the ethers include, for example, benzyl ethyl ether, to the aldehydes, for example, the linear alkanals having 8-18 C atoms, citral, citronellal, citronellyloxyacetaldehyde, cyclamen aldehyde, hydroxycitronellal, lilial and bourgeonal, to the ketones, for example, the ionone, -slomomionionne and methyl cedryl ketone, to the alcohols anethole, citronellol, eugenol, geraniol, linalool, phenylethyl alcohol and terpineol, the hydrocarbons mainly include the terpenes such as limonene and pinene.
  • fragrance oils may also contain natural fragrance mixtures such as are available from vegetable sources, for example, pine, citrus, jasmine, patchouly, rose or ylang-ylang oil. Also suitable are muscatel, sage, chamomile, clove, lemon balm, mint, cinnamon, lime, juniper, vetiver, olibanum, galbanum and labdanum, and orange blossom, neroliol, orange peel and sandalwood.
  • the content of detergents and cleaners to dyes is less than 0.01 wt .-%, while perfumes can account for up to 2 wt .-% of the total formulation.
  • the fragrances can be incorporated directly into the detergents or cleaners, but it may also be advantageous to apply the fragrances on carriers that the Increase the adhesion of the perfume on the items to be cleaned and ensure a long-lasting fragrance, in particular of treated textiles, by a slower release of fragrance.
  • carrier materials for example, cyclodextrins have been proven, the cyclodextrin-perfume complexes can be additionally coated with other excipients.
  • a further preferred carrier for fragrances is the described zeolite X, which can also absorb fragrances instead of or in mixture with surfactants. Preference is therefore given to washing and cleaning agents containing the described zeolite X and fragrances, which are preferably at least partially absorbed on the zeolite.
  • Preferred dyes the selection of which presents no difficulty to the skilled person, have a high storage stability and insensitivity to the other ingredients of the agents and to light and no pronounced substantivity to textile fibers so as not to stain them.
  • Detergents or cleaners may contain antimicrobial agents to combat microorganisms. Depending on the antimicrobial spectrum and mechanism of action, a distinction is made between bacteriostatic agents and bactericides, fungistatics and fungicides, etc. Important substances from these groups are, for example, benzalkonium chlorides, alkylarylsulfonates, halophenols and phenolmercuric acetate.
  • antimicrobial action and antimicrobial active substance have the usual meaning within the scope of the teaching according to the invention, which is described, for example, by KH Wallophußer in "Praxis der Sterilisation, Disinfection - Conservation: Germ Identification - Company Hygiene” (5th edition - Stuttgart, New York: Thieme, 1995
  • Suitable antimicrobial agents are preferably selected from the groups of alcohols, amines, aldehydes, antimicrobial acids or their salts, carboxylic esters, acid amides, phenols, phenol derivatives, diphenyls, diphenylalkanes, Urea derivatives, oxygen, nitrogen acetals and formals, benzamidines, isothiazolines, phthalimide derivatives, pyridine derivatives, antimicrobial surface-active compounds, guanidines, antimicrobial amphoteric compounds, quinolines, 1,2-dibromo-2,4-dicyanobutane, iodo-2- propyl-but
  • the antimicrobial agent may be selected from ethanol, n-propanol, i-propanol, 1,3-butanediol, phenoxyethanol, 1,2-propylene glycol, glycerol, undecylenic acid, benzoic acid, salicylic acid, dihydracetic acid, o-phenylphenol, N-methylmorpholine.
  • acetonitrile MMA
  • 2-benzyl-4-chlorophenol 2,2'-methylenebis (6-bromo-4-chlorophenol), 4,4'-dichloro-2'-hydroxydiphenyl ether (dichlosan), 2,4 , 4'-trichloro-2'-hydroxydiphenylether (trichlosan), chlorhexidine, N- (4-chlorophenyl) -N- (3,4-dichlorophenyl) -urea, N, N '- (1, 10-decanediyldi- 1-pyridinyl-4-ylidene) bis (1-octanamine) dihydrochloride, N, N'-bis (4-chlorophenyl) -3,12-diimino-2,4,11,13-tetraaza tetradecandiimidamide, glucoprotamines, antimicrobial surface-active quaternary compounds, guanidines, including the bi- and polyguanidine
  • halogenated xylene and cresol derivatives such as p-chlorometacresol or p-chloro-meta-xylene, and natural antimicrobial agents of plant origin (for example, from spices or herbs), animal and microbial origin.
  • antimicrobial surface-active quaternary compounds a natural antimicrobial agent of plant origin and / or a natural antimicrobial agent of animal origin, most preferably at least one natural antimicrobial agent of plant origin from the group comprising caffeine, theobromine and theophylline and essential oils such as eugenol, thymol and geraniol, and / or at least one natural antimicrobial agent of animal origin from the group, comprising enzymes such as protein from milk, lysozyme and lactoperoxidase, and / or at least one antimicrobial surface-active quaternary compound with an ammonium, sulfonium, phosphonium, iodonium - or Arsonium distr, peroxo compounds and chlorine compounds are used. Also substances of microbial origin, so-called bacteriocins, can be used.
  • the suitable as antimicrobial agents quaternary ammonium compounds have the general formula (R 1 ) (R 2 ) (R 3 ) (R 4 ) N + X " , in the R 1 to R 4 identical or different CC 22 alkyl radicals , C 7 -C 28 -Aralkylreste or heterocyclic radicals, wherein two or in the case of an aromatic inclusion as in pyridine even three radicals together with the nitrogen atom, the heterocycle, for example a pyridinium or imidazolinium compound, form, and X " halide ions, sulfate ions , Hydroxide ions or similar anions.
  • at least one of the radicals has a chain length of 8 to 18, in particular 12 to 16, carbon atoms.
  • QACs can be prepared by reacting tertiary amines with alkylating agents, such as, for example, methyl chloride, benzyl chloride, dimethyl sulfate, dodecyl bromide, but also ethylene oxide.
  • alkylating agents such as, for example, methyl chloride, benzyl chloride, dimethyl sulfate, dodecyl bromide, but also ethylene oxide.
  • alkylating agents such as, for example, methyl chloride, benzyl chloride, dimethyl sulfate, dodecyl bromide, but also ethylene oxide.
  • alkylating agents such as, for example, methyl chloride, benzyl chloride, dimethyl sulfate, dodecyl bromide, but also ethylene oxide.
  • Suitable QACs are, for example, benzalkonium chloride (N-alkyl-N, N-dimethylbenzylammonium chloride, CAS No. 8001-54-5), benzalkone B (m, p-dichlorobenzyl-dimethyl-C 12 -alkylammonium chloride, CAS No. 58390- 78-6), benzoxonium chloride (benzyldodecyl bis (2-hydroxyethyl) ammonium chloride), cetrimonium bromide (N-hexadecyl-N, N-trimethylammonium bromide, CAS No.
  • benzetonium chloride N, N-dimethyl-N- [2- [p- (1, 1, 3,3-tetramethylbutyl) phenoxy] ethoxy] ethyl] benzyl ammonium chloride, CAS No. 121-540
  • Dialkyldimethylammonium chlorides such as di-n-decyldimethylammonium chloride (CAS No. 7173-51-5-5), didecyldimethylammonium bromide (CAS No. 2390-68-3), dioctyldimethylammoniumchloric, 1-cetylpyridinium chloride (CAS No.
  • QACs are the benzalkonium chlorides with C 8 -C 8 -alkyl radicals, in particular C 12 -C 1 -alkyl benzyl-dimethyl-ammonium chloride.
  • Benzalkonium halides and / or substituted benzalkonium halides are for example commercially available as Barquat ® ex Lonza, Marquat® ® ex Mason, Variquat ® ex Witco / Sherex and Hyamine ® ex Lonza and as Bardac ® ex Lonza.
  • antimicrobial agents are N- (3-chloroallyl) hexaminium chloride such as Dowicide and Dowicil ® ® ex Dow, benzethonium chloride such as Hyamine ® 1622 ex Rohm & Haas, methylbenzethonium as Hyamine ® 10X ex Rohm & Haas, cetylpyridinium chloride such as Cepacol ex Merrell Labs ,
  • the antimicrobial agents are used in amounts of 0.0001 wt .-% to 1 wt .-%, preferably from 0.001 wt .-% to 0.8 wt .-%, particularly preferably from 0.005 wt .-% to 0.3 wt .-% and in particular from 0.01 to 0.2 wt .-%> used.
  • the detergents or cleaners according to the invention may contain UV absorbents (UV absorbers) which are applied to the treated textiles and improve the lightfastness of the fibers and / or the lightfastness of other formulation components.
  • UV absorbents UV absorbers
  • Under UV absorber are organic substances (sunscreen) to understand that are able to absorb ultraviolet rays and to release the absorbed energy in the form of longer-wave radiation, for example heat.
  • Compounds having these desired properties include, for example, the non-radiative deactivating compounds and derivatives of benzophenone having substituents in the 2- and / or 4-position. Also suitable are substituted benzotriazoles, in the 3-position phenyl-substituted acrylates (cinnamic acid derivatives, optionally with cyano groups in the 2-position), salicylates, organic Ni complexes and natural substances such as umbelliferone and the body's own urocanic acid.
  • UV-B absorbers may be mentioned: 3-Benzylidencampher or 3-Benzylidennorcampher and its derivatives, for example 3- (4-methylbenzylidene) camphor, as described in EP 0693471 B1; 4-aminobenzoic acid derivatives, preferably 2-ethylhexyl 4- (dimethylamino) benzoate, 2-octyl 4- (dimethylamino) benzoate and 4- (dimethylamino) benzoic acid ester; Esters of cinnamic acid, preferably 4-methoxycinnamic acid 2-ethylhexyl ester, 4-methoxycinnamic acid propyl ester, 4-methoxycinnamic acid isoamyl ester, 2-cyano-3,3-phenylcinnamic acid 2-ethylhexyl ester (octocrylene); Esters of salicylic acid, preferably 2-ethylhexyl salicylate,
  • 2-phenylbenzimidazole-5-sulfonic acid and its alkali metal, alkaline earth metal, ammonium, alkylammonium, alkanolammonium and glucammonium salts Sulfonic acid derivatives of benzophenones, preferably 2-hydroxy-4-methoxybenzophenone-5-sulfonic acid and its salts
  • Sulfonic acid derivatives of 3-Benzylidencamphers such as 4- (2-oxo-3-bomylidenemethyl) benzenesulfonic acid and 2-methyl-5- (2-oxo-3-bomylidene) sulfonic acid and salts thereof.
  • UV-A filter in particular derivatives of benzoylmethane come into question, such as 1- (4'-tert-butylphenyl) -3- (4'-methoxyphenyl) propane-1, 3-dione, 4-tert-butyl 4'-methoxydibenzoylmethane (Parsol 1789), 1-phenyl-3- (4'-isopropylphenyl) propane-1,3-dione and also enamine compounds as described in DE 19712033 A1 (BASF).
  • the UV-A and UV-B filters can also be used in mixtures.
  • insoluble photoprotective pigments namely finely dispersed, preferably nano-metal oxides or salts
  • suitable metal oxides are in particular zinc oxide and titanium dioxide and, in addition, oxides of iron, zirconium, silicon, manganese, aluminum and cerium and mixtures thereof.
  • salts silicates (talc), barium sulfate or zinc stearate can be used.
  • the oxides and salts are already used in the form of the pigments for skin-care and skin-protecting emulsions and decorative cosmetics.
  • the particles should have an average diameter of less than 100 nm, preferably between 5 and 50 nm and in particular between 15 and 30 nm.
  • the pigments may have a spherical shape, but it is also possible to use those particles which have an ellipsoidal or otherwise deviating shape from the spherical shape.
  • the pigments may also be surface-treated, that is to say hydrophilized or hydrophobicized.
  • Typical examples are coated titanium dioxides, such as titanium dioxide T 805 (Degussa) or Eusolex® T2000 (Merck; preferred hydrophilic coating agents are silicones and particularly preferably trialkoxyoctylsilanes or simethicones.
  • Sunscreen filters can be found in the review by P. Finkel in S ⁇ FW-Journal 122 (1996), p. 543.
  • the UV absorbents are usually used in amounts of from 0.01% by weight to 5% by weight, preferably from 0.03% by weight to 1% by weight.
  • Agents according to the invention may comprise further enzymes for increasing the washing or cleaning performance, it being possible in principle to use all enzymes established for this purpose in the prior art. These include in particular other proteases, amylases, lipases, hemicellulases, cellulases or oxidoreductases, and preferably mixtures thereof. These enzymes are basically of natural origin; Based on the natural molecules, improved variants are available for use in detergents and cleaners be used according to preferred. Agents according to the invention preferably contain enzymes in total amounts of 1 ⁇ 10 -8 to 5-weight percent, based on active protein.
  • subtilisin type examples thereof are the subtilisins BPN 'and Carlsberg, the protease PB92, the subtilisins 147 and 309, the alkaline protease from Bacillus lentus, subtilisin DY and the enzymes thermitase, proteinase K and the subtilases, but not the subtilisins in the narrower sense Proteases TW3 and TW7.
  • subtilisin Carlsberg in a developed form under the trade names Alcalase ® from Novozymes A / S, Bagsvasrd, Denmark.
  • subtilisins 147 and 309 are sold under the trade names Esperase ®, or Savinase ® from Novozymes.
  • Esperase ® or Savinase ® from Novozymes.
  • the protease from Bacillus lentus DSM 5483 (WO 91/02792 A1) the listed under the name BLAP ® variants, particularly in WO 92/21760 A1, WO 95/23221 A1, WO 02/088340 A2 and WO 03 derive, / 038082 A2.
  • Other useful proteases from various Bacillus sp. and ß. gibsonii are apparent from the aforementioned patent applications WO 03/054185 A1, WO 03/056017 A2, WO 03/055974 A2 and WO 03/054184 A1.
  • proteases are, for example, under the trade names Durazym ®, relase ®, Everlase® ®, Nafizym, Natalase ®, Kannase® ® and Ovozymes ® from Novozymes, under the trade names Purafect ®, Purafect ® OxP and Properase.RTM ® by the company Genencor, that under the trade name Protosol® ® from Advanced Biochemicals Ltd., Thane, India, under the trade name Wuxi ® from Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, under the trade names Proleather® ® and protease P ® by the company Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, and the enzyme available under the name Proteinase K-16 from Kao Corp., Tokyo, Japan.
  • amylases which can be used according to the invention are the ⁇ -amylases from Bacillus licheniformis, from B. amyloliquefaciens or from ⁇ . stearothermophilus and their improved for use in detergents and cleaners further developments.
  • the enzyme from ß. licheniformis is available from Novozymes under the name Termamyl ® and from Genencor under the name Purastar® ® ST.
  • Development products of this ⁇ -amylase are available from Novozymes under the trade names Duramyl ® and Termamyl ® ultra, from Genencor under the name Purastar® ® OxAm and from Daiwa Seiko Inc., Tokyo, Japan, as Keistase ®.
  • the ⁇ -amylase of ⁇ . amyloliquefaciens is sold by Novozymes under the name BAN ®, and derived variants from the ⁇ - amylase from ß. stearothermophilus under the names BSG ® and Novamyl ®, likewise from Novozymes.
  • Amylase from Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) and in the application
  • WO 02/44350 A2 described cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) from ß. agaradherens (DSM 9948). Furthermore, the amylolytic enzymes belonging to the sequence space of ⁇ -amylases can be used, which in the application
  • WO 03/002711 A2 is defined, and those which are described in the application WO 03/054177 A2.
  • fusion products of the molecules mentioned can be used, for example those from application DE 10138753 A1.
  • compositions according to the invention may contain lipases or cutinases, in particular because of their triglyceride-cleaving activities, but also in order to generate in situ peracids from suitable precursors.
  • lipases or cutinases include, for example, the lipases originally obtainable from Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus) or further developed, in particular those with the amino acid exchange D96L. They are for example marketed by Novozymes under the trade names Lipolase ®, Lipolase Ultra ®, LipoPrime® ®, Lipozyme® ® and Lipex ®.
  • the cutinases can be used, which have been originally isolated from Fusa to solani pisi and Humicola insolens.
  • lipases are available from Amano under the designations Lipase CE ®, Lipase P ®, Lipase B ®, or lipase CES ®, Lipase AKG ®, Bacillis sp. Lipase® , Lipase AP® , Lipase M- AP® and Lipase AML® are available. From the company Genencor, for example, the lipases, or cutinases can be used whose Ranzyme originally isolated from Pseudomonas mendocina and Fusarium solanii.
  • Detergents according to the invention may contain cellulases, depending on the purpose, as pure enzymes, as enzyme preparations or in the form of mixtures in which the individual components advantageously supplement each other in terms of their various performance aspects.
  • These performance aspects include, in particular, contributions to the primary washing performance, the secondary washing performance of the composition (anti-redeposition effect or graying inhibition) and softening (fabric effect), up to the exercise of a "stone washed" effect.
  • EG endoglucanase
  • Novozymes under the trade name Celluzyme ®.
  • the products Endolase® ® and Carezyme ® available also from Novozymes based on the 50 kD EG and 43 kD EG applicable from H. insolens DSM 1800.
  • Further commercial products of this company are Cellusoft® ® and Renozyme ®. The latter is based on the application WO 96/29397 A1.
  • Performance-enhanced cellulase variants are disclosed, for example, in the application WO 98/12307 A1.
  • the cellulases disclosed in the application WO 97/14804 A1 can be used; For example, it revealed 20 kD EG Melanocarpus, available from AB Enzymes, Finland, under the trade names Ecostone® ® and Biotouch ®. Further commercial products from AB Enzymes are Econase® ® and ECOPULP ®. Other suitable cellulases from Bacillus sp. CBS 670.93 and CBS 669.93 are disclosed in WO 96/34092 A2, wherein those derived from Bacillus sp. CBS 670.93 from the company Genencor under the trade name Puradax ® is available. Further commercial products of the company Genencor are "Genencor detergent cellulase L" and lndiAge ® Neutra.
  • Suitable mannanases are available, for example under the name Gamanase ® and Pektinex AR ® from Novozymes, under the name Rohapec ® B1 from AB Enzymes and under the name Pyrolase® ® from Diversa Corp., San Diego, CA, United States.
  • a suitable ß-glucanase from a ß. alcalophilus results from the application WO 99/06573 A1.
  • the from ß. subtilis .beta.-glucanase obtained is available under the name Cereflo ® from Novozymes.
  • detergents and cleaners according to the invention may contain oxidoreductases, for example oxidases, oxygenases, catalases, peroxidases, such as halo-, chloro-, bromo-, lignin, glucose or manganese peroxidases, dioxygenases or laccases (phenol oxidases, polyphenol oxidases).
  • oxidoreductases for example oxidases, oxygenases, catalases, peroxidases, such as halo-, chloro-, bromo-, lignin, glucose or manganese peroxidases, dioxygenases or laccases (phenol oxidases, polyphenol oxidases).
  • organic, particularly preferably aromatic, compounds which interact with the enzymes in order to enhance the activity of the relevant oxidoreductases (enhancers) or to ensure the flow of electrons (mediators) at greatly varying redox potentials between the oxidizing enzymes and the soils.
  • the enzymes used in agents of the invention are either originally from microorganisms, such as the genera Bacillus, Streptomyces, Humicola, or Pseudomonas, and / or are produced by biotechnological methods known per se by suitable microorganisms, such as transgenic expression hosts of the genera Bacillus or filamentous fungi.
  • the purification of the relevant enzymes is conveniently carried out by conventional methods, for example by precipitation, sedimentation, concentration, filtration of the liquid phases, microfiltration, ultrafiltration, exposure to chemicals, desodor- tion or suitable combinations of these steps.
  • the agents of the invention may be added to the enzymes in any form known in the art. These include, for example, the solid preparations obtained by granulation, extrusion or lyophilization, or in particular in the case of liquid or gel-form compositions, solutions of the enzymes, advantageously as concentrated as possible, sparing with water and / or added with stabilizers.
  • the enzymes may be encapsulated for both the solid and liquid dosage forms, for example by spray-drying or extruding the enzyme solution together with a preferably natural polymer or in the form of capsules, for example those in which the enzymes are entrapped as in a solidified gel or in those of the core-shell type, in which an enzyme-containing core is coated with a water, air and / or chemical impermeable protective layer.
  • further active ingredients for example stabilizers, emulsifiers, pigments, bleaches or dyes, may additionally be applied.
  • Such capsules are applied by methods known per se, for example by shaking or rolling granulation or in fluid-bed processes.
  • such granules for example by applying polymeric film-forming agent, low in dust and storage stable due to the coating.
  • a protein and / or enzyme contained in an agent according to the invention can be protected against damage, for example inactivation, denaturation or decomposition, for example by physical influences, oxidation or proteolytic cleavage, in particular during storage.
  • damage for example inactivation, denaturation or decomposition, for example by physical influences, oxidation or proteolytic cleavage, in particular during storage.
  • inhibition of proteolysis is particularly preferred, especially if the agents also contain proteases.
  • Preferred agents according to the invention contain stabilizers for this purpose.
  • One group of stabilizers are reversible protease inhibitors.
  • Benzamidine hydrochloride, borax, boric acids, boronic acids or their salts or esters are frequently used for this purpose, including, in particular, derivatives with aromatic groups, for example ortho, meta or para-substituted phenylboronic acids, in particular 4-formylphenylboronic acid, or the salts or Esters of the compounds mentioned.
  • peptide aldehydes that is oligopeptides with a reduced C-terminus, especially those of 2 to 50 monomers are used for this purpose.
  • To the peptidic reversible protease inhibitors include, among others, ovomucoid and leupeptin.
  • specific, reversible peptide inhibitors for the protease subtilisin and fusion proteins from proteases and specific peptide inhibitors are suitable.
  • enzyme stabilizers are amino alcohols such as mono-, di-, triethanol- and -propanolamine and mixtures thereof, aliphatic carboxylic acids up to C 12 , such as succinic acid, other dicarboxylic acids or salts of said acids. End-capped fatty acid amide alkoxylates are also suitable for this purpose. Certain organic acids used as builders are capable, as disclosed in WO 97/18287, of additionally stabilizing a contained enzyme.
  • Lower aliphatic alcohols but especially polyols such as glycerol, ethylene glycol, propylene glycol or sorbitol are other frequently used enzyme stabilizers.
  • Di-glycerol phosphate also protects against denaturation due to physical influences.
  • calcium and / or magnesium salts are used, such as calcium acetate or calcium formate.
  • Polyamide oligomers or polymeric compounds such as lignin, water-soluble vinyl copolymers or cellulose ethers, acrylic polymers and / or polyamides stabilize the enzyme preparation, inter alia, against physical influences or pH fluctuations.
  • Polyamine N-oxide containing polymers act simultaneously as enzyme stabilizers and as dye transfer inhibitors.
  • Other polymeric stabilizers are linear C 8 -C 8 polyoxyalkylenes.
  • alkylpolyglycosides can stabilize the enzymatic components of the agent according to the invention and, preferably, are capable of additionally increasing their performance.
  • Crosslinked N-containing compounds preferably perform a dual function as soil release agents and as enzyme stabilizers. Hydrophobic, nonionic polymer stabilizes in particular an optionally contained cellulase.
  • Reducing agents and antioxidants increase the stability of the enzymes to oxidative degradation;
  • sulfur-containing reducing agents are familiar.
  • Other examples are sodium sulfite and reducing sugars.
  • Particular preference is given to using combinations of stabilizers, for example of polyols, boric acid and / or borax, the combination of boric acid or borate, reducing salts and succinic acid or other dicarboxylic acids or the combination of boric acid or borate with polyols or polyamino compounds and with reducing salts.
  • the effect of peptide-aldehyde stabilizers is favorably enhanced by the combination with boric acid and / or boric acid derivatives and polyols, and still further by the additional action of divalent cations, such as calcium ions.
  • enzymes according to the invention or proteins in all formulations suitable for addition to the respective compositions represent respective embodiments of the present invention. These include, for example, liquid formulations, solid granules or capsules.
  • the encapsulated form lends itself to protecting the enzymes or other ingredients from other ingredients, such as bleaches, or to allow for controlled release.
  • Such capsules are disclosed, for example, with the patent applications WO 97/24177 and DE 19918267.
  • a possible encapsulation method is that the proteins are encapsulated in this substance, starting from a mixture of the protein solution with a solution or suspension of starch or a starch derivative. Such an encapsulation process is described in the application WO 01/38471.
  • the proteins can be used, for example, in dried, granulated and / or encapsulated form. They may be added separately, ie as a separate phase, or with other ingredients together in the same phase, with or without compaction.
  • the water can be removed by methods known from the prior art from the aqueous solutions resulting from the workup, such as spray drying, centrifuging or by solubilization.
  • the particles obtained in this way usually have a particle size between 50 and 200 microns.
  • the enzymes, and also the protein according to the invention can be added to liquid, gelatinous or pasty agents according to the invention starting from a protein recovery and preparation carried out in concentrated aqueous or non-aqueous solution, suspension or emulsion, but also in gel form or encapsulated or as dried Powder.
  • Such detergents or cleaners according to the invention are generally prepared by simple mixing of the ingredients which can be added in bulk or as a solution in an automatic mixer.
  • the proteases contained in detergents can also fulfill the function of activating other enzymatic constituents by proteolytic cleavage or of inactivating them after appropriate exposure time, as disclosed, for example, in the applications WO 94/29426 or EP 747471. Comparable regulatory functions are also possible via the protein according to the invention.
  • An embodiment of the present invention is also such agents with capsules of protease-sensitive material, which are hydrolyzed, for example, of proteins of the invention at an intended time and release their contents. A comparable effect can also be achieved with other multiphasic agents.
  • a further embodiment provides agents for the treatment of textile raw materials or for textile care, which contain an alkaline protease according to the invention.
  • Another embodiment provides means for treating fibers or textiles with natural ingredients, especially those with wool or silk.
  • the natural raw materials are treated with agents according to the invention which, for example, help to smooth the shingled surface structure based on protein structures and thus counteract entanglement.
  • the agent with a protease according to the invention is designed so that it can be used regularly as a care agent, for example by adding it to the washing process, applied after washing or applied independently of the washing. The desired effect is to maintain a smooth surface texture of the fabric over a long period of time and / or to prevent and / or reduce damage to the fabric.
  • a separate subject of the invention are processes for the automated cleaning of textiles or of hard surfaces, in which at least in one of the process steps an alkaline protease according to the invention becomes active.
  • inventive alkaline protease in an amount of 40 micrograms to 4 g, preferably from 50 micrograms to 3 g, more preferably from 100 micrograms to 2 g and most preferably from 200 micrograms to 1 g per application is used. All integer and non-integer values between these numbers are included.
  • Methods for cleaning textiles are generally distinguished by the fact that various cleaning-active substances are applied to the items to be cleaned and washed off after the contact time, or that the items to be cleaned are otherwise treated with a detergent or a solution of this agent.
  • the relevant alkaline protease according to the invention is provided in the context of one of the formulations set forth above for agents according to the invention, preferably detergents or cleaners according to the invention.
  • Preferred embodiments of this subject matter represent processes for the treatment of textile raw materials or for textile care, in which an alkaline protease according to the invention becomes active in at least one of the process steps.
  • These may be, for example, processes in which materials for processing in textiles are prepared, for example for anti-fungal finishing, or, for example, for processes which enrich the cleaning of worn textiles with a nourishing component.
  • processes in which materials for processing in textiles are prepared for example for anti-fungal finishing, or, for example, for processes which enrich the cleaning of worn textiles with a nourishing component.
  • they are processes for the treatment of textile raw materials, fibers or textiles with natural constituents, in particular with wool or silk.
  • a separate subject of the invention is the use of an inventive alkaline protease described above for cleaning textiles or hard surfaces.
  • proteases according to the invention can be used in particular according to the properties described above and the methods described above be used to remove proteinaceous contaminants from textiles or hard surfaces.
  • Embodiments include, for example, hand washing, manual removal of stains from fabrics or hard surfaces, or use in conjunction with a machine process.
  • alkaline proteases according to the invention are provided in the context of one of the formulations set forth above for compositions according to the invention, preferably detergents or cleaners.
  • a further embodiment of this subject of the invention is the use of an alkaline protease according to the invention for activating or deactivating ingredients of detergents or cleaners.
  • proteolysis activates another component, for example, if it is a hybrid protein of the actual enzyme and the corresponding inhibitor, as has been disclosed, for example, in the application WO 00/01831 A2.
  • Another example of such regulation is that in which an active component for protection or control of its activity is encapsulated in a material which is attacked by proteolysis. Proteins of the invention can thus be used for inactivation, activation or release reactions, in particular in multiphase agents.
  • alkaline protease for the recovery or treatment of raw materials or intermediates in textile production, in particular for the removal of protective layers on fabrics;
  • an alkaline protease according to the invention for the treatment of textile raw materials or for textile care and among these are preferred
  • the present invention is also realized in the form of such an alkaline protease-containing agent of the present invention, which are cosmetics. This is understood to mean all types of cleansing and conditioning agents for human skin or hair, in particular cleansing agents.
  • proteases also play a crucial role in the cell renewal process of the human skin (desquamation) (T. Egelrud et al., Acta Derm. Venerol., Vol. 71 (1991), pages 471-474). Accordingly, proteases are also used as bioactive components in skin care agents to aid in the breakdown of desmosome structures that are increased in dry skin.
  • the use of subtilisin proteases with amino acid substitutions in the positions R99G / A / S, S154D / E and / or L211D / E for cosmetic purposes is described, for example, in WO 97/07770 A1.
  • proteases according to the invention can be further developed via the corresponding point mutations.
  • proteases according to the invention in particular those which are controlled in their activity, for example after mutagenesis or by addition of corresponding substances interacting with them, are also suitable as active components in skin or hair cleansing or care preparations.
  • subtilases In addition to the use in detergents and cleaners and cosmetics numerous applications of proteases, in particular subtilases are established in the prior art. For example, the manual “Industrial enyzmes and their applications "by H. Uhlig, Wiley-Verlag, New York, 1998. All of these techniques can be supplemented with alkaline proteases according to the invention, and if they are found to be capable of further development through the use of proteases of the invention, they are within the scope of protection These include, in particular, the following fields of use:
  • an alkaline protease for the biochemical analysis or for the synthesis of low molecular weight compounds or of proteins
  • an alkaline protease for the preparation, purification or synthesis of natural substances or biological valuable substances, preferably in the context of appropriate agents or processes;
  • an alkaline protease for the treatment of natural raw materials, in particular for surface treatment, more particularly in a process for the treatment of leather, preferably in the context of appropriate agents or processes;
  • an alkaline protease according to the invention for the treatment of photographic films, in particular for the removal of gelatin-containing or similar protective layers;
  • the present application encompasses any field of technology enriched by the novel alkaline proteases presented here, or processes or uses based thereon.
  • Soil samples were taken from various locations in Germany, taken up in water and sedimented by suspended solids for 30 minutes. The supernatant was assayed on 5% agar plates with HSP10 solid medium (0.1 g yeast extract, Difco Co., Heidelberg, 0.1 g casein peptone, tryptic digested, Difco Co., 0.1 g soluble starch (Merck , Order No. 1.01251), 2 g of Na 2 CO 3 , 1000 ml of distilled water, pH 10) and cultured for about 2 weeks at 30 ° C. The resulting bacterial lawn was mechanically recovered from the agar surface.
  • HSP10 solid medium 0.1 g yeast extract, Difco Co., Heidelberg, 0.1 g casein peptone, tryptic digested, Difco Co., 0.1 g soluble starch (Merck , Order No. 1.01251), 2 g of Na 2 CO 3 , 1000 ml of distilled water, pH 10) and cultured for about
  • the vector pUC18 (GenBank, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA, accession number L08752, Figure 3) was selected in Escherichia coli DH12S.
  • This vector carries the ⁇ -galactosidase promoter which can be induced by the addition of IPTG of the lac operon, so that a controlled expression of the DNA integrated into the multiple cloning site is possible in these cells.
  • the DH12S strain is suitable for IPTG induction because of its laclq genotype and is advantageous for protease activity screening because of its sufficiently low endogenous proteolytic activity. Preliminary experiments had shown that E. coli JM109 also fulfilled the same conditions.
  • the optimal restriction incubation period was determined by taking up enzyme kinetics. For this purpose, 2.8 ⁇ g of the DNA preparation were incubated at 37 ° C. in the appropriate reaction buffer offered by the manufacturer of Alu I (New England Biolabs, Schwalbach, Germany, catalog No. R0137S). By addition of 0.2 U of Alu I per ⁇ g of DNA, the reaction was started in a total volume of 21 .mu.l and then taken at two-minute intervals in each case 1, 5 .mu.l from the batch, where immediately each reaction by the addition of 10 mM Tris / HCl , pH 7.0; 20% glycerol; 0.1% SDS and cooling to 0 ° C was completed. Subsequent analysis on a 0.7% agarose gel determined the optimal restriction period for partial digestion. It is approximately 6 to 7 minutes for the isolation of the DNA isolated according to Example 1 in order to obtain fragments in the size range from 2 to 10 kb.
  • the preparative partial digestion was carried out accordingly in 30 parallel runs. After stopping the reaction accordingly, the batch was electrophoresed on a preparative 0.7% agarose gel, the gel region was excised with DNA of sizes 2 to 10 kb and this was isolated by electroelution in dialysis tubing at 4 ° C. The DNA was finally precipitated with 1/10 volume 3 M Na-acetate and 2.5 times the volume of ethanol and taken up in an adequate volume. To further separate any smaller fragments of DNA present, gel electrophoresis, electroporation and precipitation were repeated.
  • LB medium 10 g tryptone, 5 g yeast extract, 5 g NaCl, 1 ml 1 N NaOH per I
  • the plasmids were isolated by minipreparation (kit from Qiagen, Hilden, Germany), a restriction digest with the restriction enzymes Sac I and Hind III was carried out to excise the insert (see FIG. 3) and the fragments separated on a 0.7% agarose gel. In fact, all vectors contained inserts of about 2 to 10 kb in size.
  • the gene bank generated according to Example 2 was screened on 5% agar plates 14 cm in diameter with LB medium ampicillin / IPTG / X-Gal (see above) and additionally 2% skimmed milk powder (Skim Milk, Fa. Difco, Best. No. 232100). On 10 of these selection agar plates, corresponding volumes of the transformation batch of approximately 10,000 cfu in each case were uniformly plated out using glass beads (primary plating).
  • protease-forming clones showed up through clarification farms in the cloudy substrate. Separate cell lysis to detect unexported proteases was not necessary.
  • the validation of the plasmid-mediated protease formation was carried out by re-separation of the primary clones and then by isolation of the respective insert-containing pUC18 vectors, retransformation and rescreening (as above, secondary plating). The resulting transformants also showed halo formation on skim milk medium and thus confirmed the localization of a protease gene on each cloned DNA fragment.
  • protease-positive clone designated HP70Pa_2 the plasmid DNA was isolated by standard methods, the insert over Sac I / Hind III digestion prepared (see above) and sequenced by standard methods.
  • Sequencing of this clone yielded an open reading frame region whose DNA sequence is shown in SEQ ID NO. 3 is indicated. Due to its origin, it is noted as an organism "unknown” and additionally stated that this sequence is due to a DNA isolate Furthermore, based on the available data (in particular on sequence comparisons, see below) it must be assumed that the nucleotide positions 1 to 96 coding for the signal peptide and extending the total coding region from 1 to 1746. The deduced amino acid sequence disclosed SEQ ID NO: 4, with the same information on the origin.
  • the next-described enzyme described was an extracellular serine protease (EC 3.4.21.-) from Xanthomonas campestris pv. Campestris (ATCC 33913) available from GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD). USA) has the accession number NP_636242. Via the computer program Vector NTI ® Suite 7.0, available from InforMax, Inc., Bethesda, USA, with the specified default Parametem determined homology at the amino acid level is too HP70 75.0% identity. Further proteins found in this search that still appear most similar at the amino acid level are listed in Table 1 below. Table 1: Amino acid level next to HP70 found similar sequences
  • the protease found is most likely also a serine protease.
  • ß. / er / fr / s alkaline protease (WO 92/21760 A1) result in a homology of 26.2% identity at the amino acid level and an identity of 33.6% at the nucleic acid level>.
  • the associated vector with the designation 70-pUC was deposited on October 2, 2003 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) where it has the accession number DSM 15977.
  • the protease encoded thereby is called HP70.
  • Example 3 From another obtained according to Example 3 protease-positive clone designated HP53Pa_2 as in Example 4, the insert was prepared and sequenced. The sequences obtained are shown in SEQ ID NO. 6 and 7 are shown. Due to its origin, it is noted as an organism "unknown” and additionally stated that these sequences are due to a DNA isolate Furthermore, based on the available data (in particular on sequence comparisons, see below) it must be assumed that the nucleotide positions 1 to 114 coding for the signal peptide and extending overall the coding region from 1 to 1761.
  • subtilisin protease which, at the amino acid level, forms the next-found extracellular serine protease (EC 3.4.21.-) from Xanthomonas campestris pv. Campestris (ATCC 33913, see above) Homology of 75.4% identity. Further proteins found in this search that still appear most similar at the amino acid level are listed in Table 2 below.
  • the identity of the extracellular serine protease gene (E.C. 3.4.21.-) from Xanthomonas campestris pv. Campestris is 75.0%.
  • HP70Pa_2 C'-terminal 332 bp From the protease obtained according to Example 3 and described in Example 4 of the clone designated HP70Pa_2 C'-terminal 332 bp were deleted. This amino acid sequence HP70_deltaC is shown in SEQ ID NO. 5 is shown. Because of its construction, it is noted that it is an artificial sequence, substantiated by the phrase "DNA isolate, Delta C.” According to SEQ ID NOS: 3 and 4, the portion of positions 1 to 32 can again be considered a signal peptide ,
  • HP53Pa_2 C'-terminal 330 bp From the protease obtained according to Example 3 and described in Example 5 of the clone designated HP53Pa_2 C'-terminal 330 bp were deleted. This amino acid sequence HP53_deltaC is shown in SEQ ID NO. 8 is shown.
  • the desired candidate can be identified from the resulting transformants by restriction analysis with SacII (pUC_HP53_dc contains such an interface), actively expressed and thus obtained in sufficient quantity for further investigations.
  • SacII SacII
  • SEQ ID NO. 8 notes that it is as in SEQ ID NO. 5 is an artificial sequence concretized with the term "DNA isolate, Delta C.” Furthermore, the section of positions 1 to 32 according to SEQ ID NO 5 was introduced so that it must be considered as a signal peptide of HP70.
  • the expression clones obtained according to Examples 3 to 6 were taken up in 100 ml of LB medium (10 g / l tryptone, 5 g / l, yeast extract, 10 g / l NaCl) and in 500 ml Erlenmeyer flasks at 37 ° C and cultured with shaking at 200 rpm.
  • LB medium 10 g / l tryptone, 5 g / l, yeast extract, 10 g / l NaCl
  • proteolytic activity over a so-called MTP assay was determined on a fluorescence-coupled the casein substrate (BODIPY ® FL Conjugate, from Molecular Probes, Goettingen, Germany; Cat # 6638th) is based to which fluorophores (emitter) and Damper (quencher) are coupled.
  • fluorophores emitter
  • Damper quencher
  • fluorescence of the emitters is suppressed by the quenchers.
  • the oligopeptides with the groups coupled to them separate from one another and, with appropriate excitation, fluorescence emission occurs, the intensity of which thus represents a measure of the proteolysis.
  • the protease sample used was first preincubated for 15 min at 50 ° C. in 50 mM NaHCO 3 buffer, pH 10.9, and then the residual activity in the abovementioned assay at 37 ° C. and 50 ° C., in each case at pH 8, 6 measured.
  • the activity of the same extract was set to 100% without preincubation but otherwise the same treatment. In this way a residual activity of 11% was determined for 37 ° C and for 50 ° C of 13%.
  • standardized texturised textiles were used which had been purchased from the Eidgenössische Material-Prüfungs- und-Versuchs GmbH, St. Gallen, Switzerland (EMPA).
  • EMPA Eidgenössische Material-Prüfungs- und-Versuchs GmbH, St. Gallen, Switzerland
  • Stains and textiles used A (blood / milk / ink on cotton), B (blood / milk / ink on a polyester-cotton blend) and C (egg / soot on cotton).
  • control detergent was a detergent base formulation of the following composition (all figures in percent by weight): 4% linear alkylbenzenesulfonate (sodium salt), 4% C 2 -C 18 fatty alcohol sulfate (sodium salt), 5.5 % C 12 -C 18 fatty alcohol with 7 EO, 1% sodium soap, 11% sodium carbonate, 2.5% amorphous sodium disilicate, 20% sodium perborate tetrahydrate, 5.5% TAED, 25% zeolite A, 4.5% Polycarboxylate, 0.5%> phosphonate, 2.5% foam inhibitor granules, 5% sodium sulfate, balance: water, optical brightener, salts.
  • the B. / e ⁇ us alkaline protease F49 (WO 95/23221 A1, manufacturer: Biozym, Kundl, Austria) served as a control.
  • formulations were prepared which, dispensing with an appropriate amount of salts, each contained 0.5%, ie two and a half times the amount of protease.
  • the protease according to the invention was added to the same base formulation in the same activity concentrations. In this respect, the weight percentages given for F49 in the following table are correct and are approximate for HP70.
  • Table 3 Contribution of the protease HP70 according to the invention to the washing performance at a temperature of 40 ° C.
  • protease HP70 provides an improvement in the washing performance of protein-containing soils compared to protease-free detergents. That is, it also exhibits proteolytic activity in the presence of denaturing agents such as surfactants.
  • Example 9 Contribution of the protease HP53 according to the invention to the washing performance at a lower temperature
  • Table 4 Contribution of the protease HP53 according to the invention to the washing performance at a temperature of 40 ° C.
  • protease HP53 also provides an improvement in the washing performance of protein-containing soils compared to protease-free detergents. That is, it also exhibits proteolytic activity in the presence of denaturing agents such as surfactants or bleach.
  • the determined values are those for the ß.
  • Tenft / s alkaline protease F49 at least comparable, in the series A and B even clearly superior.
  • protease HP53dc also provides an improvement in the washing performance of protein-containing soils compared to protease-free detergents. That is, it also exhibits proteolytic activity in the presence of denaturing agents such as surfactants or bleach.
  • the determined values are in the measurement series A and B those for the ß. / errfus alkaline protease F49 clearly superior and in series C at least comparable.
  • Example 11 Contribution of the protease HP53dc according to the invention to the washing performance at a higher temperature
  • FIG. 1 Alignment of the inventive alkaline proteases HP70 and HP53 (SEQ ID NO 4 or 7) with alkaline proteases from the prior art. In this mean:
  • HP70 Alkaline protease according to the invention according to SEQ ID NO. 4;
  • HP53 Alkaline protease according to the invention according to SEQ ID NO. 7;
  • SP Extracellular serine protease (E.C. 3.4.21.-) from Xanthomonas campestris pv. Campestris (ATCC 33913) (Accession No. NP_636242 at GenBank); BLAP: Alkaline protease from Bacillus lentus DSM 5483 (WO 92/21760 A1).
  • FIG. 2 Alignment of the genes of the alkaline proteases HP70 and HP53 (SEQ ID NO: 3 or 6) according to the invention with those of alkaline proteases from the prior art.
  • HP70 gene of the inventive alkaline protease HP70 according to SEQ ID NO. 3
  • HP53 Gen of the inventive alkaline protease HP53 according to SEQ ID NO. 6
  • SP Extracellular serine protease gene (E.C. 3.4.21.-) from Xanthomonas campestris pv. Campestris (ATCC 33913) (Accession No. NP_636242 to GenBank)
  • BLAP Gene of the alkaline protease from Bacillus lentus DSM 5483 (WO 92/21760 A1).
  • FIG. 3 Schematic representation of the plasmid vector pUC18 used to create an expression library according to Example 2.
  • the vector was linearized with Sma I to accept the Alu I digested metagenomic DNA.
  • ORI origin of replication
  • lac promoter lacZ-alpha gene for the alpha-peptide of beta-glactosidase amp R : ampicillin-resistance-mediating beta-lactamase
  • FIG. 4 Alignment of the amino acid sequences of the two proteases HP70 according to the invention (SEQ ID NO. 4) and HP53 (SEQ ID NO. 7) for the development of the consensus sequence of SEQ ID NO. 9.
  • the amino acid positions designated as variables X in this illustration can be attributed either to HP70 or to HP53.

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Abstract

Der vorliegende Anmeldung betrifft zwei zueinander ähnliche neue Alkalische Proteasen (SEQ ID NO. 4 und 7), deren DNA aus Bodenproben erhalten wurde, und C-terminal deletierte, ebenfalls proteolytisch aktive Fragmente davon (SEQ ID NO. 5 und 8), alle mindestens zu 90% zu SEC ID NO. 4 oder zu 87,5% zu SEQ ID NO. 7 ähnlichen Alkalischen Proteasen, und jene, die unter einer von SEQ ID NO. 4 und 7 abgeleiteten Consensus-Sequenz (SEQ ID NO. 9) zusammengefaßt werden können. Ferner betrifft sie alle Nukleinsäuren, die zu den zugehörigen Nukleinsäuren (SEQ ID NO. 3 und 6) beziehungsweise den betreffenden Fragmenten eine Homologie von mindestens 85% Identität aufweisen. Ferner definiert sie technische Einsatzmöglichkeiten für diese Proteasen und beschreibt vor allem ihren Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln.

Description

Neue Alkalische Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neuen Alkalischen Proteasen
Die vorliegende Anmeldung betrifft zwei zueinander ähnliche neue Alkalische Proteasen, deren DNA aus Bodenproben erhalten wurde, C-terminal deletierte, ebenfalls proteolytisch aktive Fragmente davon und alle hinreichend ähnlichen Alkalischen Proteasen und Nukleinsäuren sowie technische Einsatzmöglichkeiten für diese Proteasen, vor allem ihren Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln.
Proteasen gehören zu den technisch bedeutendsten Enzymen überhaupt. Hierunter sind wiederum Proteasen vom Subtilisin-Typ (Subtilasen, Subtilopeptidasen, EC 3.4.21.62) besonders wichtig, welche aufgrund der katalytisch wirksamen Aminosäuren den Serin- Proteasen zugerechnet werden. Sie wirken als unspezifische Endopeptidasen, das heißt, sie hydrolysieren beliebige Säureamidbindungen, die im Inneren von Peptiden oder Proteinen liegen. Ihr pH-Optimum liegt meist im deutlich alkalischen Bereich. Einen Überblick über diese Familie bietet beispielsweise der Artikel „Subtilases: Subtilisin-like Proteases" von R. Siezen, Seite 75-95 in „Subtilisin enzymes", herausgegegeben von R.Bott und C.Betzel, New York, 1996. Subtilasen werden natürlicherweise von Mikroorganismen, gebildet; hierunter sind insbesondere die von ßac/7/t/s-Spezies gebildeten und sekretierten Subtilisine als bedeutendste Gruppe innerhalb der Subtilasen zu erwähnen.
Proteasen sind neben anderen Enzymen etablierte aktive Inhaltsstoffe von Wasch- und Reinigungsmitteln. Sie bewirken dabei den Abbau proteinhaltiger Anschmutzungen auf dem Reinigungsgut. Günstigenfalls ergeben sich Synergieeffekte zwischen den Enzymen und den übrigen Bestandteilen der betreffenden Mittel. Unter den Wasch- und Reinigungsmittelproteasen nehmen Subtilasen aufgrund ihrer günstigen enzymatischen Eigenschaften wie Stabilität oder pH-Optimum eine herausragende Stellung ein. Sie eignen sich daneben noch für eine Vielzahl weiterer technischer Verwendungsmöglichkeiten, beispielsweise als Bestandteile von Kosmetika oder in der organisch-chemischen Synthese.
Das klassische Vorgehen zur Gewinnung neuer Enzyme besteht darin, Mikroorganismen-haltige Proben aus natürlichen Habitaten zu entnehmen und unter den als geeignet angesehenen Bedingungen - zum Beispiel in alkalischem Milieu - zu kultivieren. Auf diese Weise erhält man Anreicherungskulturen von Mikroorganismen, die mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit auch Enzyme, darunter Alkalische Proteasen enthalten, welche unter den betreffenden Bedingungen aktiv sind. Hieraus werden dann beispielsweise über Ausplattieren auf proteinhaltigen Agarplatten und Ausmessen der gebildeten Lysehöfe die Mikroorganismen mit den leistungsfähigsten Enzyme ausgewählt und aufgereinigt beziehungsweise die betreffenden Gene kloniert. Solch ein Vorgehen wird beispielsweise in dem Lehrbuch „Alkalophilic Mikroorganisms. A new microbial world" von K.Horikoshi und T.Akiba (1982), Japan Scientific Societies Press, Springer- Verlag, New York, Heidelberg, Berlin, ISBN 0-387-10924-2, Kapitel 2, Seiten 9-26 beschrieben.
So werden bereits natürlicherweise, vorzugsweise mikrobiell gebildete Alkalische Proteasen in Wasch- und Reinigungsmitteln eingesetzt. Beispielsweise ist nach der Anmeldung WO 93/07276 A1 die aus Bacillus spec. 164-A1 erhältliche Protease 164-A1 der Firmen Chemgen Corp., Gaithersburg, MD, USA, und Vista Chemical Company, Austin, TX, USA, für den Gebrauch in Wasch- und Reinigungsmitteln geeignet. Andere Beispiele sind die Alkalische. Protease aus Bacillus sp. PD138, NCIMB 40338 der Fa. Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dänemark, (WO 93/18140 A1), die aus Bacillus sp. ferm. BP-3376 stammende Proteinase K-16 der Fa. Kao Corp., Tokyo, Japan, (US- Patent 5344770) und gemäß WO 96/25489 A1 (Fa. Procter & Gamble, Cincinatti, OH, USA) die Protease aus dem psychrophilen Organismus Flavobacterium balustinum.
Natürliche Proteasen werden über an sich bekannte Mutagenese-Verfahren beispielsweise für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln optimiert. Dazu gehören Punktmutagenese, Deletion, Insertion oder Fusion mit anderen Proteinen oder Proteinteilen oder über sonstige Modifikationen. Die Strategie, in die bekannten Moleküle gezielte Punktmutationen einzuführen, etwa um die Waschleistung der Subtilisine zu verbessern, wird auch als Rationales Protein-Design bezeichnet. Eine ähnliche Strategie der Leistungsverbesserung besteht darin, die Oberflächenladungen und/oder den isoelektrischen Punkt der Moleküle und darüber ihre Wechselwirkungen mit dem Substrat zu verändern. So kann beispielsweise über Punktmutationen die Nettoladung der Subtilisine verändert werden, um darüber die Substratbindung insbesondere für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln zu beeinflussen. Eine weitere, insbesondere ergänzende Strategie besteht darin, die Stabilität der betreffenden Proteasen zu erhöhen und damit ihre Wirksamkeit zu erhöhen. Eine Stabilisierung über Kopplung an ein Polymer ist für Proteasen für Kosmetika beispielsweise in dem Patent US 5230891 beschrieben; sie geht mit einer besseren Hautverträglichkeit einher. Insbesondere für Wasch- und Reinigungsmittel sind dagegen Stabilisierungen durch Punktmutationen geläufiger.
Eine moderne Richtung der Enzymentwicklung besteht darin, Elemente aus bekannten, miteinander verwandten Proteinen über statistische Verfahren zu neuen Enzymen mit bislang nicht erreichten Eigenschaften zu kombinieren. Solche Verfahren werden auch unter dem Oberbegriff Directed Evolution zusamengefaßt. Dazu gehören beispielsweise folgende Verfahren: Die StEP-Methode (Zhao et al. (1998), Nat. Biotechnol., Band 16, S. 258-261), Random priming recombination (Shao et al., (1998), Nucleic Acids Res., Band 26, S. 681-683), DNA-Shuffling (Stemmer, W.P.C. (1994), Nature, Band 370, S. 389-391) oder RACHITT (Coco, W.M. et al. (2001), Nat. Biotechnol., Band 19, S. 354- 359). Eine weitere Shuffling-Methode mit der Bezeichnung „Recombining ligation reaction" (RLR) ist in WO 00/09679 A1 beschrieben.
Im folgenden soll ein Überblick über die technisch wichtigsten Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ gegeben werden. Subtilisin BPN', welches aus Bacillus amyloliquefaciens, beziehungsweise B. subtilis stammt, ist aus den Arbeiten von Vasantha et al. (1984) in J. Bacteriol., Volume 159, S. 811-819 und von J. A. Wells et al. (1983) in Nucleic Acids Research, Volume J ., S. 7911-7925 bekannt. Subtilisin BPN' dient insbesondere hinsichtlich der Numerierung der Positionen als Referenzenzym der Subtilisine.
So werden beispielsweise die auf alle Subtilisine bezogenen Punktmutationen der Anmeldung EP 251446 A1 in der Numerierung von BPN' angegeben, deren Anmeldungsgegenstand von der Fa. Procter & Gamble Comp., Cincinnati, Ohio, USA, als „Protease B" bezeichnet wird. Die BPN'-Varianten der Anmeldung EP 199404 A1 werden von Procter & Gamble Comp. als „Protease A" bezeichnet. „Proteasen C" zeichnen sich gemäß der Anmeldung WO 91/06637 A1 durch wiederum andere Punktmutationen von BPN' aus. Bei der „Protease D" handelt es sich gemäß WO 95/10591 A1 um Varianten der Protease aus Bacillus lentus.
Die Protease Subtilisin Carlsberg wird in den Publikationen von E. L. Smith et al. (1968) in J. Blol. Chem., Volume 243, S. 2184-2191, und von Jacobs et al. (1985) in Nucl. Acids Res., Band 13, S. 8913-8926 beschrieben. Sie wird natürlicherweise von Bacillus licheniformis gebildet und war, beziehungsweise ist unter dem Handelsnamen Maxatase® von der Firma Genencor International Inc., Rochester, New York, USA, sowie unter dem Handelsnamen Alcalase® von der Firma Novozymes A/S, Bagsvasrd, Dänemark, erhältlich.
Die Protease PB92 wird natürlicherweise von dem alkaliphilen Bakterium Bacillus nov. spec. 92 produziert und war unter dem Handelsnamen Maxacal® von der Fa. Gist- Brocades, Delft, Niederlande, erhältlich. In ihrer ursprüglichen Sequenz wird sie in der Patentanmeldung EP 283075 A2 beschrieben.
Die Subtilisine 147 und 309 werden unter den Handelsnamen Esperase®, beziehungsweise Savinase® von der Fa. Novozymes vertrieben. Sie stammen ursprünglich aus Bac///t/s-Stämmen, die mit der Anmeldung GB 1243784 A offenbart werden.
Das Subtilisin DY ist ursprünglich von Nedkov et al. 1985 in Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Band 366, S. 421-430 beschrieben worden.
Bei der Alkalischen Protease aus ß. lentus handelt es sich um eine Alkalische Protease aus Bacillus species, die in der Anmeldung WO 91/02792 A1 beschrieben ist. Sie besitzt an sich bereits eine vergleichsweise hohe Stabilität gegenüber Oxidation und dem Einwirken von Detergenzien. In den Anmeldungen WO 91/02792 A1, beziehungsweise den Patenten EP 493398 B1 und US 5352604, wird deren heterologe Expression in dem Wirt B. licheniformis ATCC 53926 beschrieben. In den Ansprüchen des genannten US- Patents werden die Positionen 208, 210, 212, 213 und 268 als charakteristisch für die B. /enfc/s-Alkalische Protease bezeichnet; diese entsprechen in der Zählung des maturen Proteins den Positionen 97, 99, 101, 102 und 157, in denen sich dieses Enzym von dem maturen Subtilisin 309 (Savinase®) unterscheidet. Die dreidimensionale Struktur dieses Enzyms wird in der Veröffentlichung von Goddette et al. (1992) in J. Mol. Biol., Band 228, S. 580-595: "The crystal structure of the Bacillus lentus alkaline protease, Subtilisin BL, at 1.4 A resolution" beschrieben. Technisch wichtige, insbesondere für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln geeignete, über Punktmutagenese stabilisierte Varianten dieses Enzyms werden unter anderem in den Anmeldungen WO 92/21760 A1, WO 95/23221 A1 , WO 02/088340 A2) und WO 03/038082 A2 offenbart. Das von Thermoactinomyces vulgaris natürlicherweise gebildete Enzym Thermitase ist ursprünglich von Meloun et al. (FEBS Lett., 1983, S. 195-200) beschrieben worden. Dabei handelt es sich um ein Molekül, das insgesamt erhebliche Sequenzabweichungen gegenüber den übrigen Subtilisinen aufweist. So beträgt die Homologie zwischen den maturen Proteinen Thermitase und der Alkalischen Protease aus ß. lentus DSM 5483 (siehe unten) 45% Identität (62% ähnliche Aminosäuren).
Auch bei der Proteinase K handelt es sich um eine Protease, die zu der Alkalischen Protease aus ß. lentus eine vergleichsweise geringe Homologie aufweist. Sie beträgt auf der Ebene der maturen Proteine nur 33% Identität (46% ähnliche Aminosäuren). Die Proteinase K stammt ursprünglich aus dem Mikroorganismus Tritirachium album Limber und ist von K.-D. Jany und B. Mayer 1985 in Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Band 366, Seite 485-492 beschrieben worden.
WO 88/07581 A1 offenbart die zueinander sehr ähnlichen Proteasen TW3 und TW7 unter anderem für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln.
Die Bacillopeptidase F aus Bacillus subtilis besitzt auf Aminosäureebene nur eine Ähnlichkeit von 30% Identität zu der B. /eπ us-Alkalischen Protease. Dieses Enzym ist in der oben erwähnten Arbeit von Siezen et al. aufgeführt, bislang aber noch nicht für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln beschrieben oder beansprucht.
Aus der Anmeldung WO 01/68821 A2 gehen neue Subtilsine mit einer guten Leistung gegenüber Ei-Anschmutzungen hervor.
Weitere Alkalische Proteasen, die von Mikroorganismen gebildet werden, die aus natürlichen Habitaten isolierbar sind, gehen beispielsweise aus den Anmeldungen
WO 03/054185 A1 (aus Bacillus gibsonii (DSM 14391)), WO 03/056017 A2 (aus Bacillus sp. (DSM 14390)), WO 03/055974 A2 (aus Bacillus sp. (DSM 14392)) und
WO 03/054184 A1 (aus Bacillus gibsonii (DSM 14393)) hervor. All diese Anmeldungen offenbaren auch entsprechende Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neuen
Alkalischen Proteasen.
Eine weitere Gruppe technisch wichtiger Proteasen stellen die Metalloproteasen dar, das heißt solche, die ein Metallkation als Cofaktor benötigen. Vertreter hiervon können ebenfalls der Familie der Subtilasen zugeordnet werden. So gehen beispielsweise aus der Anmeldung US 2003/0113895 A1 Metalloproteasen aus grampositiven Mikroorganismen wie B. subtilis, aber auch aus S. cerevisiae, S. pombe, E. coli und H. influenzae hervor. Wasch- und Reinigungsmittel mit Metalloproteasen offenbaren beispielsweise die Anmeldungen WO 00/60042 A1 und WO 02/36727 A1. Die nicht vorveröffentlichte Anmeldung DE 10360805.2 offenbart eine alkalische Metalloprotease, deren zugehörige DNA aus einer Bodenprobe isoliert werden konnte, sowie deren Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln.
Eine Vielzahl neuer Proteasen für prinzipiell alle etablierten Anwendungsgebiete geht aus der Anmeldung WO 2004/033668 A2 hervor. Eine weitere bekannte Protease ist StmPr2 aus Stenotrophomonas maltophilia, die unter dem Eintrag AY253983 bei GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) hinterlegt und veröffentlicht worden ist.
Weitere bekannte Proteasen sind die unter den Handelsnamen Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase® und Kannase® von der Firma Novozymes, unter den Handelsnamen, Maxapem®, Purafect®, Purafect OxP® und Properase® von der Firma Genencor, unter dem Handelsnamen Protosol® von der Firma Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien und unter dem Handelsnamen Wuxi® von der Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, erhältlichen Enzyme.
Wie all diese über einen langen Zeitraum durchgeführten Arbeiten belegen, besteht ein hoher Bedarf an technisch einsetzbaren Proteasen, die sich zum Teil drastisch, zum Teil nur in wenigen Positionen von bisher bekannten Proteasen unterscheiden. Sie sollen damit ein breites Spektrum an Leistungsunterschieden abdecken, was vor allem für ihren Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln gilt, welche ihrerseits ein breites Anwendungsgebiet darstellen. So zeichnet sich eine geeignete Protease für Wasch- oder Reinigungsmittel vorzugsweise durch eine gewisse Unempfindlichkeit gegenüber den entsprechenden Bedingungen - wie Anwesenheit von an sich denaturierenden Tensiden, von Bleiche, hohen Temperaturen etc. - und durch gute Leistungen gegenüber entsprechenden Substraten wie etwa den in Lebensmittelresten zu findenden Proteinen aus.
Wie ebenfalls deutlich wird, besteht nach wie vor auch ein ungebrochener Bedarf nach neuen Alkalischen Proteasen, die an sich bereits brauchbar sind und die über die diversen Mutagenesemöglichkeiten spezifisch weiter optimiert werden können. Insbesondere aufgrund der jüngst etablierten Shuffling-Technologien sind derartige neue Proteasen von Interesse. Denn deren bislang unbekannte Nukleotidsequenzen erweitern - auch wenn das betreffende Enzym selbst eine vergleichsweise bescheidene Leistung erbringen sollte - den Varianzraum für neue Shuffling-Ansätze etwa mit bekannten Sequenzen und damit für wiederum völlig neue artifizielle Enzyme.
Der vorliegenden Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde, neue Alkalische Proteasen aufzufinden. Insbesondere sollten solche gefunden werden, die naturgemäß bereits eine Leistungsverbesserung von Wasch- oder Reinigungsmitteln bewirken.
Hiermit war die Teilaufgabe verbunden, ein geeignetes Verfahren zur Isolierung solch einer Protease zu etablieren. Weitere Teilaufgaben bestanden darin, Nukleinsäuren zur Verfügung zu stellen, die für derartige Proteasen codieren, um darüber gentechnische und mikrobiologische Elemente zu erhalten, die zur Gewinnung und Weiterentwicklung derartiger Proteasen genutzt werden können und gegebenenfalls in ein Shuffling eingebracht werden können. Ferner sollten entsprechende Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren sowie entsprechende Verfahren und Verwendungsmöglichkeiten für derartige Proteasen zur Verfügung gestellt werden. Schließlich sollten technische Einsatzmöglichkeiten für die gefundenen Proteasen definiert werden.
Zur Bewältigung dieser Aufgabe wurde ein bislang kaum beschrittener Weg genutzt. So wurde keine klassische Anreichungskultur für alkaliphile, proteasepositive Mikroorganismen angelegt sondern ohne diesen Umweg eventuelle für Alkalische Proteasen codierende Nukleinsäuren aus Bodenproben isoliert. Weil die betreffenden Nukleinsäuren originär nicht einem speziellen Stamm, das heißt nicht einem speziellen Genom zugeordnet werden können, handelt es sich dabei um sogenannte Metagenom-DNA.
Überraschenderweise konnten nach diesem Verfahren zwei neue Proteasen gefunden werden, die zueinander eine außerordentliche Ähnlichkeit aufweisen und als vollständige mature Enzyme oder als C-terminale Deletionsmutanten erfolgreich in Wasch- und Reinigungsmitteln einsetzbar sind. Die gestellte Aufgabe wird somit durch eine Alkalische Protease gelöst, deren Aminosäuresequenz zu der in SEQ ID NO. 4 angebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 90% oder zu der in SEQ ID NO. 7 angebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 87,5% identisch ist.
Hiermit sind als weitere Erfindungsgegenstände die zugehörigen Nukleinsäuren, entsprechende natürliche Zellen, geeignete Verfahren zu ihrer Identifizierung, insbesondere auf den Nukleinsäuren aufbauende molekularbiologische Verfahren und Verfahrenselemente sowie Mittel, Wasch- und Reinigungsmittel, Wasch- und Reinigungsverfahren und über die betreffenden Proteasen gekennzeichnete Verwendungsmöglichkeiten verbunden.
Wie die Ausführungsbeispiele belegen, weisen bereits die in SEQ ID NO. 4 und 7 angegebenen Enzyme beziehungsweise die zugehörigen maturen Enzyme für Wasch- und Reinigungsmittel brauchbare proteolytische Aktivitäten auf. Aufgrund der zur Verfügung gestellten DNA sind zusätzliche Optimierungen dieser Enzyme, beispielsweise über weitere Punktmutationen möglich. Ferner können diese DNA in Shuffling- Ansätze eingebracht und damit zur Erzeugung völlig neuartiger Proteasen genutzt werden.
Unter einem Protein ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein aus den natürlichen Aminosäuren zusammengesetztes, weitgehend linear aufgebautes, zur Ausübung seiner Funktion zumeist dreidimensionale Struktur annehmendes Polymer zu verstehen. In der vorliegenden Anmeldung werden die 19 proteinogenen, natürlich vorkommenden L- Aminosäuren mit den international gebräuchlichen 1- und 3-Buchstaben-Codes bezeichnet. Die Kombination einer dieser Bezeichnungen mit einer Nummer bezeichnet für das jeweilige Protein, welchen Aminosäure-Rest es in der jeweiligen Position trägt. Für Punktmutationen sind analoge Bezeichnungen etabliert. Positionsangaben beziehen sich, soweit nicht anders angegeben, auf die jeweils maturen Formen der betreffenden Proteine, also ohne die Signalpeptide (siehe unten).
Unter einem Enzym ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein Protein zu verstehen, das eine bestimmte biochemische Funktion ausübt. Beispielsweise unter proteolytischen Enzymen oder Enzymen mit proteolytischer Funktion sind im allgemeinen solche zu verstehen, die die Säureamidbindungen von Proteinen hydrolysieren. Zahlreiche Proteine werden als sogenannte Präproteine, also zusammen mit einem Signalpeptid gebildet. Darunter ist dann der N-terminale Teil des Proteins zu verstehen, dessen Funktion zumeist darin besteht, die Ausschleusung des gebildeten Proteins aus der produzierenden Zelle in das Periplasma oder das umgebende Medium und/oder dessen korrekte Faltung zu gewährleisten. Anschließend wird das Signalpeptid unter natürlichen Bedigungen durch eine Signalpeptidase vom übrigen Protein abgespalten, so daß dieses seine eigentliche katalytische Aktivität ohne die zunächst vorhandenen N- terminalen Aminosäuren ausübt.
Für technische Anwendungen sind aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität die maturen Peptide, das heißt die nach ihrer Herstellung prozessierten Enzyme gegenüber den Präproteinen bevorzugt.
Pro-Proteine sind inaktive Vorstufen von Proteinen. Deren Vorläufer mit Signalsequenz werden als Prä-Pro-Proteine bezeichnet.
Unter Nukleinsäuren sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung die natürlicherweise aus Nukleotiden aufgebauten als Informationsträger dienenden Moleküle zu verstehen, die für die lineare Aminosäureabfolge in Proteinen oder Enzymen codieren. Sie können als Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Als der natürlicherweise dauerhaftere Informationsträger ist die Nukleinsäure DNA für molekularbiologische Arbeiten bevorzugt. Demgegenüber wird für die Realisierung der Erfindung in natürlicher Umgebung, wie beispielsweise in einer exprimierenden Zelle, eine RNA gebildet, weshalb erfindungswesentliche RNA-Moleküle ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen. Aus ihnen können beispielsweise über reverse Transkription wiederum (c-)DNA-Moleküle abgeleitet werden.
Die einem Protein entsprechende Informationseinheit einer Nukleinsäure wird auch im Sinne der vorliegenden Anmeldung als Gen bezeichnet. Bei DNA sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen. Ferner ist zu berücksichtigen, daß verschiedene Codon-Triplets für dieselben Aminosäuren codieren können, so daß eine bestimmte Aminosäure-Abfolge von mehreren unterschiedlichen und möglicherweise nur geringe Identität aufweisenden Nukleotidsequenzen abgeleitet werden kann (Degeneriertheit des genetischen Codes). Außerdem weisen verschiedene Organismen Unterschiede im Gebrauch dieser Codons auf. Aus diesen Gründen müssen sowohl Aminosäuresequenzen als auch Nukleotidsequenzen in die Betrachtung des Schutzbereichs einbezogen und angegebene Nukleotidsequenzen jeweils nur als eine beispielhafte Codierung für eine bestimmte Aminosäurefolge angesehen werden.
Einem Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekularbiologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA- und/oder Aminosäuresequenzen vollständige Gene herzustellen. Derartige Methoden sind beispielsweise aus dem „Lexikon der Biochemie", Spektrum Akademischer Verlag, Berlin, 1999, Band 1 , S. 267-271 und Band 2, S. 227- 229, bekannt. Dies ist insbesondere dann möglich, wenn auf einen bei einer Stammsammlung hinterlegten Stamm zurückgegriffen werden kann. Beispielsweise mit PCR-Primern, die anhand einer bekannten Sequenz synthetisierbar sind, und/oder über isolierte mRNA-Moleküle können aus solchen Stämmen die betreffenden Gene synthetisiert, kloniert und gewünschtenfalls weiter bearbeitet, beispielsweise mutagenisiert werden.
Änderungen der Nukleotidsequenz, wie sie beispielsweise durch an sich bekannte molekularbiologische Methoden herbeigeführt werden können, werden als Mutationen bezeichnet. Je nach Art der Änderung kennt man beispielsweise Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutationen oder solche, bei denen verschiedene Gene oder Teile von Genen miteinander fusioniert (shuffling) werden; dies sind Genmutationen. Die zugehörigen Organismen werden als Mutanten bezeichnet. Die von mutierten Nukleinsäuren abgeleiteten Proteine werden als Varianten bezeichnet. So führen beispielsweise Deletions-, Insertions-, Substitutionsmutationen oder Fusionen zu deletions-, insertions-, substitutionsmutierten oder Fusionsgenen und auf Proteinebene zu entsprechenden Deletions-, Insertions- oder Substitutionsvarianten, beziehungsweise Fusionsproteinen.
Für die Beschreibung von Punktmutationen, die genau eine Aminosäureposition betreffen (Aminosäureaustausche), wird folgende Konvention angewendet: zunächst wird die natürlicherweise vorhandene Aminosäure in Form des international gebräuchlichen Einbuchstaben-Codes bezeichnet, dann folgt die zugehörige Sequenzposition und schließlich die eingefügte Aminosäure. Mehrere Austausche innerhalb derselben Polypeptidkette werden durch Schrägstriche voneinander getrennt.
Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich ein interessierendes Gen enthalten. Sie vermögen dieses in einer Spezies oder einer Zellinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als vom übrigen Genom unabhängig replizierendes, stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkuläre genetische Elemente. Man unterscheidet in der Gentechnik einerseits zwischen solchen Vektoren, die der Lagerung und somit gewissermaßen auch der gentechnischen Arbeit dienen, den sogenannten Klonierungsvektoren, und andererseits denen, die die Funktion erfülllen, das interessierende Gen in der Wirtszelle zu realisieren, das heißt, die Expression des betreffenden Proteins zu ermöglichen. Diese Vektoren werden als Expressionsvektoren bezeichnet.
Sowohl Bakterienzellen als auch eukaryontische Zellen, die die genannten Vektoren enthalten, werden ungeachtet ihrer Unterschiede allgemein als Zellen bezeichnet. Solche Zellen, die einen Vektor, insbesondere einen Expressionsvektor enthalten und somit zur Expression eines Transgens angeregt werden können, werden als Wirtszellen bezeichnet, denn sie beherbergen das betreffende genetische System.
Homologisierung ist der Vergleich einer Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz mit der von bekannten Genen oder Proteinen. Sie wird beispielsweise über ein Alignment vorgenommen. Das Maß für die Homologie ist ein Prozentsatz an Identität, wie er beispielsweise nach der von D. J. Lipman und W. R. Pearson in Science, Band 227 (1985), Seite 1435-1441 angegebenen Methode bestimmt werden kann. Vorzugsweise geschieht dies über Algorithmen, welche inzwischen von kommerziell erhältlichen Computergrogrammen angewendet werden. Hierzu gehört beispielsweise das Programm Vector NTI® Suite 7.0, erhältlich von der Firma InforMax, Inc., Bethesda, USA, vorzugsweise mit den vorgegebenen Default-Parametem. Die Homologie-Angabe kann sich auf das gesamte Protein oder auf den jeweils zuzuordnenden Bereich beziehen. Ein weiter gefaßter Homologie-Begriff, die Ähnlichkeit, bezieht auch konservierte Variationen, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer Aktivität in die Betrachtung mit ein, da diese innerhalb des Proteins meist ähnliche chemische Aktivitäten ausüben. Bei Nukleinsäuren kennt man nur den Prozentsatz an Identität.
Durch Homologisierung lassen sich aus der Aminosäure- oder Nukleotid-Sequenz die Funktionen einzelner Sequenzbereiche sowie die enzymatische Aktivität des betrachteten gesamten Enzyms folgern. Homologe Bereiche von verschiedenen Proteinen sind solche mit vergleichbaren Funktionen, die sich durch Identität oder konservierte Austausche in der primären Aminosäuresequenz erkennen lassen. Sie umfassen einzelne Aminosäuren, kleinste Bereiche, sogenannte Boxen, die wenige Aminosäuren lang sind, bis hin zu langen Bereichen in der primären Aminosäuresequenz. Unter den Funktionen der homologen Bereiche sind somit auch kleinste Teilfunktionen der vom gesamten Protein ausgeübten Funktion zu verstehen, wie beispielsweise die Ausbildung einzelner Wasserstoffbrückenbindungen zur Komplexierung eines Substrats oder Übergangskomplexes. Andere Bereiche des Proteins, die nicht an der eigentlichen enzymatischen Reaktion beteiligt sind, können sie qualitativ oder quantitativ modifizieren. Dies betrifft beispielsweise die Enzymstabilität, die Aktivität, die Reaktionsbedingungen oder die Substratspezifität.
Unter dem Begriff eines proteolytischen Enzyms oder dem einer Protease sind deshalb über die Funktionen der wenigen Aminosäurereste des katalytisch aktiven Zentrums hinaus alle Funktionen zu verstehen, wie sie sich durch das Einwirken des gesamten übrigen Proteins oder eines Teils oder mehrerer Teile des übrigen Proteins auf die eigentlich katalytisch aktiven Bereiche ergeben. Es ist darüberhinaus möglich, daß auch die Aktivitäten anderer Proteasen durch einen oder mehrere Teile, beispielsweise des erfindungsgemäßen Proteins qualitativ oder quantitativ modifiziert werden. Diese Beeinflussung anderer Faktoren wird ebenfalls als proteolytische Aktivität angesehen. Proteolytisch aktive Enzyme sind auch solche Proteasen, deren Aktivität zu einem gegebenen Zeitpunkt, etwa durch einen Inhibitor blockiert ist. Entscheidend ist ihre prinzipielle Eignung zur entsprechenden Proteolyse-Reaktion.
Unter Fragmenten werden alle Proteine oder Peptide verstanden, die kleiner sind als natürliche Proteine oder solche, die vollständig translatierten Genen entsprechen, und beispielsweise auch synthetisch erhalten werden können. Aufgrund ihrer Aminosäuresequenzen können sie den betreffenden vollständigen Proteinen zugeordnet werden. Sie können beispielsweise gleiche Strukturen annehmen oder proteolytische Aktivitäten oder Teilaktivitäten ausüben. Fragmente und Deletionsvarianten von Ausgangsproteinen sind prinzipiell gleichartig; während Fragmente eher kleinere Bruchstücke darstellen, fehlen den Deletionsmutanten eher nur kurze Bereiche, und damit nur einzelne Teilfunktionen.
Unter Chimären oder hybriden Proteinen sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine zu verstehen, die aus Elementen zusammengesetzt sind, die natürlicherweise von verschiedenen Polypeptidketten aus demselben Organismus oder aus verschiedenen Organismen stammen. Dieses Vorgehen wird auch Shuffling oder Fusionsmutagenese genannt. Der Sinn einer solchen Fusion besteht beispielsweise darin, mithilfe des heranfusionierten erfindungsgemäßen Proteinteils eine enzymatische Funktion herbeizuführen oder zu modifizieren.
Unter durch Insertionsmutation erhaltenen Proteinen sind solche Varianten zu verstehen, die über an sich bekannte Methoden durch Einfügen eines Nukleinsäure-, beziehungsweise Proteinfragments in die Ausgangssequenzen erhalten worden sind. Sie sind ihrer prinzipiellen Gleichartigkeit wegen den Chimären Proteinen zuzuordnen. Sie unterscheiden sich von jenen lediglich im Größenverhältnis des unveränderten Proteinteils zur Größe des gesamten Proteins. In solchen insertionsmutierten Proteinen ist der Anteil an Fremdprotein geringer als in Chimären Proteinen.
Inversionsmutagenese, also eine partielle Sequenzumkehrung, kann als Sonderform sowohl der Deletion, als auch der Insertion angesehen werden. Dasselbe gilt für eine von der ursprünglichen Aminosäureabfolge abweichende Neugruppierung verschiedener Molekülteile. Sie kann sowohl als Deletionsvariante, als Insertionsvariante, als auch als Shuffling-Variante des ursprünglichen Proteins angesehen werden.
Unter Derivaten werden im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine verstanden, deren reine Aminosäurekette chemisch modifiziert worden ist. Solche Derivatisierungen können beispielsweise biologisch im Zusammenhang mit der Proteinbiosynthese durch den Wirtsorganismus erfolgen. Hierfür können beispielsweise molekularbiologische Methoden, etwa die Cotransformation mit Genen, die für die betreffende Modifikation sorgen, eingesetzt werden. Derivatisierungen können aber auch chemisch durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette einer Aminosäure oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung an das Protein. Bei solch einer Verbindung kann es sich beispielsweise auch um andere Proteine handeln, die beispielsweise über bifunktionelle chemische Verbindungen an erfindungsgemäße Proteine gebunden werden. Derartige Modifikationen beeinflussen beispielsweise die Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat oder führen eine vorübergehende Blockierung der enzymatischen Aktivität herbei, wenn es sich bei der angekoppelten Substanz um einen Inhibitor handelt. Dies ist beispielsweise für den Zeitraum der Lagerung sinnvoll. Ebenso ist unter Derivatisierung die kovalente Bindung an einen makromolekularen Träger zu verstehen.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden alle Enzyme, Proteine, Fragmente, Fusionsproteine und Derivate, sofern sie nicht explizit als solche angesprochen zu werden brauchen, unter dem Oberbegriff Proteine zusammengefaßt.
Unter der Leistung eines Enzyms wird dessen Wirksamkeit im jeweils betrachteten technischen Bereich, vorzugsweise im Rahmen eines entsprechend ausgerichteten Mittels verstanden. Diese basiert auf der eigentlichen enzymatischen Aktivität, hängt darüberhinaus aber von weiteren, für den jeweiligen Prozeß relevanten Faktoren ab. Dazu gehören beispielsweise Stabilität, Substratbindung, Wechselwirkung mit dem das Substrat tragenden Material oder Wechselwirkungen mit anderen Inhaltsstoffen, insbesondere Synergien.
Unter der Waschleistung oder der Reinigungsleistung eines Wasch-, beziehungsweise Reinigungsmittels ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung der Effekt zu verstehen, den das betrachtete Mittel auf die verschmutzten Artikel, beispielsweise Textilien oder Gegenstände mit harten Oberflächen ausübt. Einzelne Komponenten solcher Mittel, beispielsweise einzelne Enzyme, werden hinsichtlich ihres Beitrags zur Wasch- oder Reinigungsleistung des gesamten Wasch-, beziehungsweise Reinigungsmittels beurteilt. Denn aus den enzymatischen Eigenschaften eines Enzyms kann nicht ohne weiteres auf seinen Beitrag zur Waschleistung eines Mittels geschlossen werden. Hier spielen als weitere Faktoren beispielsweise Stabilität, Substratbindung, Bindung an das Reinigungsgut oder Wechselwirkungen mit anderen Inhaltsstoffen der Wasch- oder Reinigungsmitte), insbesondere Synergien bei der Entfernung der Verschmutzungen eine Rolle.
Die in SEQ ID NO. 4 und 7 angegebenen Aminosäuresequenzen sind, wie in den Beispielen zur vorliegenden Anmeldung beschrieben, von Nukleinsäuren abgeleitet worden, die aus Bodenproben isoliert worden sind. Deren Sequenzen sind unter SEQ ID NO. 3 beziehungsweise 6 angegeben. Die abgeleiteten Proteine werden erfindungsgemäß als Protease HP70 (für SEQ ID NO. 3 und 4) beziehungsweise HP53 (für SEQ ID NO. 6 und 7) bezeichnet. Wie anhand eines Alignments, beispielsweise über Figur 4 nachvollzogen werden kann, weisen sie zueinander auf Aminosäureebene eine Homologie von 93,9% Identität auf.
Als zu diesen beiden gefundenen und gemäß den Beispielen der vorliegenden Anmeldung charakterisierten Proteasen nächstähnliches beschriebenes Enzym wurde eine extrazelluläre Serin-Protease (E.C. 3.4.21.-) aus Xanthomonas campestris pv. campestris (ATCC 33913) ermittelt, die bei GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) die Zugangsnummer NP_636242 trägt. Die wie alle nachfolgenden Homologiewerte über das Computer-Programm Vector NTI® Suite 7.0, erhältlich von der Firma InforMax, Inc., Bethesda, USA, mit den vorgegebenen Default-Parametem ermittelte Homologie dieses Enzyms beträgt auf Aminosäureebene zu HP70 75,0% Identität und zu HP53 75,4% Identität.
Die nächstähnlichen, ermittelten Enzyme sind in den Beispielen 4 und 5 in Tabellenform zusammengestellt; es handelt sich dabei jeweils um extrazelluläre Proteasen aus Xanthomonas campestris und X axonopodis. Zu der etablierten ß. /eπrus-Alkalischen Protease (WO 92/21760 A1) ergibt sich über die Gesamtlänge der Alkalischen Protease HP70 auf Aminosäureebene eine Homologie von 26,2% Identität und auf Nukleotid- ebene von 33,6%. HP53 weist zu der ß. fenfus-Alkalischen Protease Homologiewerte von 25,9% beziehungsweise 33,5% Identität auf.
Diese nach den Beispielen erarbeiteten Angaben können folgendermaßen aktualisiert werden: Die Protease StmPr2 aus St. maltophilia, (GenBank: AY253983) weist zu der erfindungsgemäßen Protease HP70 (SEQ ID NO. 4) eine Sequenzhomologie von 84,7 und zu HP53 (SEQ ID NO. 7) von 82,5% Identität auf. Die unter SEQ ID NO. 66 in WO 2004/033668 A2 offenbarte Protease ist zu HP70 zu 83,1% und zu HP53 zu 81 ,1% identisch. Im Vergleich zu der unter SEQ ID NO. 70 in WO 2004/033668 A2 offenbarten Protease ergeben sich Homologiewerte von 85,0% Identität zu HP70 und von 82,3% Identität zu HP53. Damit können alle Alkalischen Proteasen in den Schutzbereich der vorliegenden Anmeldung eingeschlossen werden, deren Aminosäuresequenzen zu SEQ ID NO. 4 mindestens zu 90%) oder zu SEQ ID NO. 7 mindestens zu 87,5%) identisch sind.
Darunter sind funktioneile Alkalische Proteasen bevorzugt, das heißt keine defekten oder lediglich putativen Enzyme sondern solche, die tatsächlich aufgrund dieser enzymatischen Aktivität für eine technische Anwendnung genutzt werden können.
Zunehmend bevorzugt sind alle derartigen Alkalischen Proteasen, deren Aminosäuresequenz zu der in SEQ ID NO. 4 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 95%) und zunehmend bevorzugt zu mindestens 96%, 97%, 98%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100%) oder zu der in SEQ ID NO. 7 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 90% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%o, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100%) identisch sind, wobei jeweils alle ganzzahligen oder gebrochenen Zwischenwerte entsprechend eingeschlossen werden.
Die zugehörigen in den Beispielen beschriebenen, für die zu 100% identischen Proteine codierenden Vektoren, die sich von dem in Figur 3 dargestellten Vektor ableiten, erhielten die Bezeichnungen 70-pUC(AWB403) für HP70 und 53-pUC(AWB403) für HP53. Sie wurden unter diesen Namen am 2.10.2003 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) hinterlegt und tragen dort die Hinterlegungsnummern DSM 15977 beziehungsweise DSM 15976. Die jeweilige Lebensfähigkeit wurde von der DSMZ am 17.10.2003 bestätigt. Die von diesen Vektoren codierten, in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung untersuchten und deshalb am stärksten bevorzugten Proteasen werden als HP70 beziehungsweise HP53 bezeichnet.
Weiter bevorzugt sind solche erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen, bei denen die Homologiewerte jeweils für den Bereich gelten, der den Aminosäurepositionen 33 bis 581 gemäß SEQ ID NO. 4 oder 39 bis 586 gemäß SEQ ID NO. 7 entspricht.
Hiermit ist jeweils das tatsächlich aktive mature Protein gemeint, weil dieses die technisch relevante Funktion ausübt. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt kann noch nicht zweifelsfrei gesagt werden, welche Aminosäure jeweils den N-Terminus des maturen Proteins darstellt. Derzeit erscheint der Beginn in den Positionen 33 beziehungsweise 39 lediglich am wahrscheinlichsten. Sollte sich zu einem späteren Zeitpunkt herausstellen, daß andere Aminosäuren den jeweiligen N-Terminus darstellen, so wird der beanspruchte Schutzbereich darauf bezogen, wobei die genannte Position jeweils die erste Aminosäure des maturen Proteins bezeichnet.
Ein wie in Beispiel 4 durchgeführter Sequenzvergleich dieser maturen Enzyme mit den nächstähnlichen aus dem Stand der Technik hat folgendes Ergebnis geliefert: die (vermutlich) mature Protease HP70 (SEQ ID NO. 4, Positionen 33 bis 581) ist zu dem homologen Bereich von SEQ ID NO. 66 aus WO 2004/033668 A2 zu 84,2% identisch, zu dem von SEQ ID NO. 70 aus WO 2004/033668 A2 zu 86,2% und zu dem der Protease STmPr2 zu 85,8%. Die (vermutlich) mature Protease HP53 (SEQ ID NO. 7, Positionen 39 bis 586) ist zu dem homologen Bereich von SEQ ID NO. 66 aus WO 2004/033668 A2 zu 83,8%o identisch, zu dem von SEQ ID NO. 70 aus WO 2004/033668 A2 zu 85,0% und zu dem der Protease STmPr2 zu 85,2%.
Ähnliches gilt für den C-Terminus. Derzeit erscheinen hierfür die Positionen 581 beziehungsweise 586 gemäß SEQ ID NO. 4 beziehungsweise 7 plausibel, weil die Nukleotidpositionen 1744 bis 1746 gemäß SEQ ID NO. 3 und die Positionen 1759 bis 1761 gemäß SEQ ID NO. 6 jeweils ein Stop-Codon darstellen. Sollte sich zu einem späteren Zeitpunkt jedoch herausstellen, daß durch Prozessierung eine andere Aminosäure den C-Terminus des maturen, aktiven Proteins darstellt, so wird der beanspruchte Schutzbereich darauf bezogen, wobei die angegebenen Nummern jeweils die letzte Aminosäure des maturen, aktiven Proteins bezeichnen. Prinzipiell das gleiche gilt für den Fall, daß bei der Reifung des Proteins eventuell interne Fragmente herausgeschnitten werden. Besonders bevorzugt ist jeweils die Aminosäuresequenz des maturen, aktiven Proteins.
Weiterhin bevorzugt ist jede der bislang beschriebenen Alkalischen Proteasen, bei denen die Homologiewerte ab mindestens 90% Identität jeweils für den Bereich gelten, der den Aminosäurepositionen 33 bis 470 gemäß SEQ ID NO. 5 oder 33 bis 470 gemäß SEQ ID NO. 8 entspricht.
Denn wie in den Beispielen beschrieben ist, konnten sowohl von HP70 als auch von HP53 die darin genannten und hiermit aus dem bevorzugten Schutzbreich ausgeschlossenen C-terminalen Bereiche deletiert werden, ohne daß die Deletions- varianten ihre Proteaseaktivität, insbesondere die während des Wasch- oder Reinigungsvorgangs benötigte proteolytische Aktivität verloren. Der Vorteil in dieser drastischen Deletion besteht in der Ersparnis von Aufwand und Kosten bei der biotechnologischen Herstellung der betreffenden Proteine. Denn damit werden in kürzerer Zeit mehr erfindungsgemäß besonders für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln verwendbare Enzyme erhalten, womit beispielsweise auch eine bessere Ausnutzung der für die Fermentation der produzierenden Mikroorganismen notwendigen Medienbestandteile einhergeht.
Ein wie in Beispiel 4 durchgeführter Sequenzvergleich dieser maturen und C-terminal deletierten Enzyme mit den nächstähnlichen aus dem Stand der Technik hat folgendes Ergebnis geliefert: die (vermutlich) mature und C-terminal deletierte Protease HP70 (SEQ ID NO. 5, Positionen 33 bis 470) ist zu dem homoigen Bereich von SEQ ID NO. 66 aus WO 2004/033668 A2 zu 85,2% identisch, zu dem von SEQ ID NO. 70 aus WO 2004/033668 A2 zu 88,1% und zu dem der Protease STmPr2 zu 87,7%. Die (vermutlich) mature und C-terminal deletierte Protease HP53 (SEQ ID NO. 8, Positionen 33 bis 470) ist zu dem homologen Bereich von SEQ ID NO. 66 aus WO 2004/033668 A2 zu 85,4% identisch, zu dem von SEQ ID NO. 70 aus WO 2004/033668 A2 zu 87,0% und zu dem der Protease STmPr2 ebenfalls zu 87,0%.
Weiterhin bevorzugt ist jede der bislang beschriebenen Alkalischen Proteasen mit einer Aminosäuresequenz gemäß der Consensus-Sequenz von SEQ ID NO. 9, vorzugsweise im Bereich der Aminosäurepositionen 39 bis 587, besonders bevorzugt im Bereich der Aminosäurepositionen 39 bis 476.
SEQ ID NO. 9 stellt die aus den beiden Aminosäuresequenzen SEQ ID NO. 4 und 7 erhältliche Consensussequenz dar, wie sie beispielsweise über das Align ent der Figur 4 aufgestellt werden kann. Sie umfaßt diejenigen Proteasen, deren Aminosäuresequenzen in jeder ihrer Position entweder auf SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 7 zurückgeführt werden können. Diese beiden Sequenzen eröffnen somit einen Sequenzraum an miteinander verwandten oder ähnlichen Subtilisin-Proteasen. Sie besitzen die in SEQ ID NO. 9 angegebene allgemeine Sequenz, wobei in folgenden 35 Positionen jeweils zwei verschiedene Aminosäuren vorliegen können beziehungsweise eine bestimmte (angegeben in Dreibuchstabencode) oder keine (-); und zwar sind das folgende Möglichkeiten (in Sequenzprotokoll jeweils als „Variante" definiert): Position 2: - oder lle, Position 3: Ser oder Thr, Position 4: His oder Asn, Position 5: Asp oder Ser, Position 7: - oder Ser, Position 8: - oder Val, Position 9: - oder Pro, Position 10: - oder Gly, Position 11: - oder Asp, Position 12: Gin oder Pro, Position 13: Pro oder Gin, Position 25: Ala oder Gly, Position 48: Ser oder Ala, Position 65: Asn oder Thr, Position 66: Leu oder Asp, Position 82: Ser oder Gin, Position 149: Ala oder Ser, Position 234: Ser oder Ala, Position 236: lle oder Tyr, Position 259: Ser oder Thr, Position 267: Phe oder Tyr, Position 321: Thr oder Ser, Position 386: lle oder Val, Position 406: Thr oder Ala, Position 438: Thr oder Ser, Position 487: Thr oder -, Position 488: Val oder Thr, Position 501: Ala oder Ser, Position 507: Ser oder Ala, Position 511: Val oder Ala, Position 522: Ser oder Thr, Position 527: Ser oder Thr, Position 546: Asn oder Thr, Position 562: Ser oder Ala und, schließlich, Position 574: Gly oder Ala.
Da die beiden Enzyme HP70 und HP53 in den mit den vorliegenden Beispielen dokumentierten Untersuchungen erfindungsgemäße Vorteile aufweisen und zudem zu 93,9% übereinstimmen, ist zu erwarten, daß jedes weitere Enzym, das dieser Protease- Unterfamilie angehört, über vergleichbar günstige Eigenschaften verfügt.
Das gilt entsprechend dem oben Gesagten insbesondere für die Teile des jeweils maturen, das heißt aktiven Enzyms und ganz besonders für diejenigen Deletions- Varianten, bei denen ohne nennenswerten Verlust der Proteaseaktivität große Teile des C-Terminus entfernt sind.
Weiterhin bevorzugt ist jede der bislang beschriebenen Alkalischen Proteasen, die von einer Nukleotidsequenz codiert wird, die zu der in SEQ ID NO. 3 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 90%, 95%, 96%>, 97%, 98%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist, insbesondere für den Bereich, der den Nukleotidpositionen 97 bis 1746 gemäß SEQ ID NO. 3 entspricht, ganz besonders für den Bereich, der den Nukleotidpositionen 97 bis 1410 gemäß SEQ ID NO. 3 entspricht, oder die von einer Nukleotidsequenz codiert wird, die zu der in SEQ ID NO. 6 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist, insbesondere für den Bereich, der den Nukleotidpositionen 115 bis 1761 gemäß SEQ ID NO. 6 entspricht, ganz besonders für den Bereich, der den Nukleotidpositionen 115 bis 1428 gemäß SEQ ID NO. 6 entspricht, wobei jeweils alle ganzzahligen oder gebrochenen Zwischenwerte entsprechend eingeschlossen werden.
Denn wie aus dem oben Gesagten und insbesondere den Beispielen hervorgeht, sind die besonders bevorzugten Proteasen nicht an sich oder über einen entsprechenden Mikroorganismus detektiert worden sondern werden von in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung entdeckten Nukleinsäuren codiert.
Wie in den Beispielen 3 und 4 erläutert ist, weist das zu HP70 und HP53 auf Nukleotidebene nächstähnliche Enzym, eine extrazelluläre Serin-Protease (E.C. 3.4.21.-) aus Xanthomonas campestris pv. campestris (ATCC 33913; NP_636242), wie über das Computer-Programm Vector NTI® Suite 7.0, erhältlich von der Firma InforMax, Inc., Bethesda, USA, mit den vorgegebenen Default-Parametem ermittelt werden kann, auf Nukleotidebene eine Homologie von 74,4 beziehungsweise 75,0% Identität auf. Dementsprechend werden alle Alkalischen Proteasen und Proteine, die von signifikant ähnlicheren Nukleinsäuren codiert werden, in den Schutzbereich eingeschlossen.
Diese nach den Beispielen erarbeiteten Angaben können folgendermaßen aktualisiert werden: Die Protease StmPr2 aus St. maltophilia, (GenBank: AY253983) weist auf DNA- Ebene zu der erfindungsgemäßen Protease HP70 (SEQ ID NO. 3) in dem homologi- sierbaren Bereich eine Sequenzhomologie von 80,8 und zu der DNA-Sequenz von HP53 (SEQ ID NO. 6) von 81 ,2% Identität auf. Die unter SEQ ID NO. 65 in WO 2004/033668 A2 offenbarte Protease-DNA-Sequenz ist zu der von HP70 zu 79,6% und zu der von HP53 zu 79,9% identisch. Im Vergleich zu der unter SEQ ID NO. 69 in WO 2004/033668 A2 offenbarten Protease-codierenden DNA-Sequenz ergeben sich Homologiewerte von 81,3% Identität zu der HP70-DNA und von 81 ,1% Identität zu der HP53-DNA.
Die bisherigen Ausführungen gelten entsprechend besonders für die Nukleinsäure- sequenzen, die für die maturen Proteine und ganz beonders für die C-terminal deletierten, proteolytisch aktiven Varianten davon codieren. Denn das sind die Enzyme, deren proteolytische Aktivitäten und insbesondere deren Beiträge zur Wasch- beziehungsweise Reinigungsleistung entsprechender Rezepturen in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung belegt sind. Ein wie in Beispiel 4 durchgeführter Sequenzvergleich dieser für die maturen Enzyme codierenden DNA-Abschnitte mit den nächstähnlichen aus dem Stand der Technik hat folgendes Ergebnis geliefert: das Gen für die (vermutlich) mature Protease HP70 (SEQ ID NO. 3, Positionen 97 bis 1746) ist zu dem homologen Bereich von SEQ ID NO. 65 aus WO 2004/033668 A2 zu 80,0% identisch, zu dem von SEQ ID NO. 69 aus WO 2004/033668 A2 zu 81 ,8% und zu dem der Protease STmPr2 zu 81 ,3%. Das Gen für die (vermutlich) mature Protease HP53 (SEQ ID NO. 6, Positionen 115 bis 1761) ist zu dem homologen Bereich von SEQ ID NO. 65 aus WO 2004/033668 A2 zu 81 ,0% identisch, zu dem von SEQ ID NO. 69 aus WO 2004/033668 A2 zu 82,2% und zu dem der Protease STmPr2 zu 82,9%.
Die hiervon abgeleiteten Alkalischen Proteasen sind dementsprechend bevorzugt.
Ein weiterer wie in Beispiel 4 durchgeführter Sequenzvergleich der für diese maturen und C-terminal deletierten Enzyme codierenden DNA-Abschnitte mit den nächstähnlichen aus dem Stand der Technik hat folgendes Ergebnis geliefert: das Gen für die (vermutlich) mature und C-terminal deletierte Protease HP70 (SEQ ID NO. 3, Positionen 97 bis 1410) ist zu dem homoigen Bereich von SEQ ID NO. 65 aus WO 2004/033668 A2 zu 81 ,4% identisch, zu dem von SEQ ID NO. 69 aus WO 2004/033668 A2 zu 83,7% und zu dem der Protease STmPr2 zu 83,2%. Die für die (vermutlich) mature und C-terminal deletierte Protease HP53 codierende Nukleinsäure (SEQ ID NO. 6, Positionen 115 bis 1428) ist zu dem homologen Bereich von SEQ ID NO. 65 aus WO 2004/033668 A2 zu 82,1% identisch, zu dem von SEQ ID NO. 69 aus WO 2004/033668 A2 zu 83,6% und zu dem der Protease STmPr2 zu 83,9%.
Die von diesen DNA-Abschnitten abgeleiteten Alkalischen Proteasen sind dementsprechend besonders bevorzugt.
Weiterhin bevorzugt ist jede der bislang beschriebenen erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen, die aus einem natürlichen Habitat isolierbar ist oder die sich von einer aus einem natürlichen Habitat isolierbaren Nukleinsäure ableitet.
Denn es ist anzunehmen, daß die mit dem in den Beispielen beschriebenen Verfahren isolierte DNA von natürlichen Organismen gebildet worden sind und auch in vivo für funktioneile Proteine codieren. Somit müssen über analoge Verfahren auch die zugehörigen Enzyme selbst gefunden werden können, insbesondere dann, wenn es sich nicht um Pseudogene sondern um tatsächlich gebildete Proteine handelt. Demgegenüber führt die Isolierung der Nukleinsäuren unmittelbar zu einem Gen, das in molekularbiologische Charakterisierungen eingebracht und produziert werden kann. Zudem kann nicht immer erwartet werden, daß die betreffenden Gene unter allen Bedingungen exprimiert werden, so daß über die Nukleinsäure-Isolierung auch augenblicklich nicht translatierte Gene zugänglich sind.
Weiterhin bevorzugt ist jede der bislang beschriebenen erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen, die selbst oder deren zugehörige Nukleinsäure aus einem Organismus stammt, der aus einem natürlichen Habitat isolierbar ist.
Diese Ausführungsform ist deshalb besonders vorteilhaft, weil dann der zugehörige Organismus selbst in Kultur genommen werden kann. Vorteilhafterweise lassen sich dann aus dessen Zellextrakten oder Kulturüberständen die erfindungsgemäßen Proteasen isolieren und herstellen.
Hierunter sind jene Alkalischen Proteasen bevorzugt, wobei es sich um einen Mikroorganismus handelt, vorzugsweise um einen Pilz oder ein Bakterium, hierunter bevorzugt um ein grampositives Bakterium und besonders bevorzugt um eines der Gattung Bacillus.
Denn besonders für diese Organismen sind im Stand der Technik Kultivierungsmethoden bekannt und etabliert. Das gilt insbesondere für Bacilli, die in der technischen Enzymherstellung eine herausragende Rolle einnehmen. Eine weitere Ausführungsform stellen solche Alkalischen Proteasen und Proteine dar, die aus Xanthomonas-Spez\es stammen. Denn aus einer dieser gramnegativen Spezies stammen die als nächstähnlich ermittelten, bekannten Enzyme (siehe oben); auch in der biotechnologischen Fermentation von Xanthomonaden hat man bereits Erfahrungen.
Weiterhin bevorzugt sind von einer der bislang beschriebenen erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen durch Fragmentierung oder Deletionsmutagenese abgeleitete Alkalische Proteasen oder Proteine mit mindestens 100 und zunehmend bevorzugt mindestens 150, 200, 250 und ganz besonders bevorzugt mindestens 300 bereits im Ausgangsmolekül zusammenhängenden Aminosäuren. So ist es beispielsweise möglich, an den Termini oder in den Loops des Enzyms einzelne Aminosäuren zu deletieren, ohne daß dadurch die proteolytische Aktivität verlorengeht. Solche Mutationen werden beispielsweise in WO 99/49057 A1 beschrieben. WO 01/07575 A2 lehrt, daß durch derartige Deletionen die Allergenizität betreffender Proteasen gesenkt und somit insgesamt ihre Einsetzbarkeit verbessert werden kann. Die Fragmentierung kommt dem später ausgeführten Aspekt der Insertions- oder Substitutionsmutagenese und/oder Fusion mit anderen Enzymen zugute. Hinsichtlich des beabsichtigten Einsatzes dieser Enzyme ist es bevorzugt, wenn sie auch nach der Fragmentierung oder Deletionsmutagenese eine proteolytische Aktivität besitzen; besonders bevorzugt ist es, wenn sie eine hierdurch zusätzlich gesteigerte Aktivität aufweisen.
Weiterhin bevorzugt sind Alkalische Proteasen oder Proteine, wie sie bisher als erfindungsgemäß beschrieben worden sind und von einer der bislang beschriebenen Alkalischen Proteasen oder Proteinen durch Insertionsmutagenese, durch Substitutionsmutagenese und/oder durch Fusion mit mindestens einem anderen Protein abgeleitet sind.
Denn zahlreiche Dokumente des Stands der Technik offenbaren vorteilhafte Wirkungen von Insertionen und Substitionen in Proteasen; darunter auch die genannten Publikationen WO 99/49057 A1 und WO 01/07575 A2. Prinzipiell gehören hierzu auch Einzelaustausche von Aminosäuren, es können aber auch mehrere zusammenhängende Aminosäuren gegen andere ausgetauscht werden. Hierzu gehören auch Neukombinationen von größeren Enzymabschnitten, so den oben genannten Fragmenten, mit anderen Proteasen oder Proteinen anderer Funktion. So ist es beispielsweise in Anlehnung an WO 99/57254 A1 möglich, ein erfindungsgemäßes Protein oder Teile davon über peptidische Linker oder direkt als Fusionsprotein mit Bindungsdomänen aus anderen Proteinen, etwa der Cellulose-Bindungsdomäne, zu versehen und dadurch die Hydrolyse des Substrats effektiver zu gestalten. Ebenso können erfindungsgemäße Proteine beispielsweise auch mit Amylasen oder Cellulasen verknüpft werden, um eine Doppelfunktion auszuüben.
Hierunter sind die Alkalischen Proteasen oder Proteine mit einem oder mehreren Aminosäureaustauschen in den Positionen 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101 , 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141 , 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211 , 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268 in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus, bevorzugt, wobei diese Positionen über das Alignment in Figur 1 zuzuordnen sind.
Hier liegen in dem Wildtypmolekül der ß. fenfc/s-Alkalischen Protease folgende Aminosäurereste: S3, V4, S36, N42, A47, T56, G61 , T69, E87, A96, R99, A101 , 1102, S104, N114, H118, A120, S130, S139, T141 , S142, S154, S157, A188, V193, V199, G205, L211 , A224, K229, S236, N237, N242, H243, N255 beziehungsweise T268.
Da neben der Alkalischen Protease aus Bacillus licheniformis die ß. /er/fi/s-Alkalische Protease im Stand der Technik ein wichtiges Referenzmolekül zur Beschreibung neuer Proteasen und von Punktmutationen darstellt, die hier beschriebene neue Protease und somit auch ihre Sequenz bislang unbekannt sind, erscheint es vorteilhaft, in der Zuordnung der Punktmutationen auf diese Zählung Bezug zu nehmen. Zum anderen richtet sich die Zählung im allgemeinen nach dem maturen Protein, und wie oben ausgeführt steht zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch nicht fest, mit welcher Aminosäure das mature Protein beginnt. In der Zählung der SEQ ID NO. 4 (HP70) entsprechen diese Positionen - wie über Figur 1 nachvollzogen werden kann - folgenden Positionsnummern: P140, N141 , T182, N188, Y195, A204, G209, T245, K264, K273, (-), Y277, T278, D280, V296, E304, I306, S317, G326, V328, S329, S341 , V345, A376, S381 , S393, G399, Y406, V419, Q424, T432, P433, T438, L439, G453 und V466.
Das sind in der Zählung von SEQ ID NO. 7, das heißt HP53 folgende Positionen: P146, N147, T188, N194, Y201 , A210, G215, T251 , K270, K279, (-), Y283, T284, D286, V302, E310, 1312, S323, G332, V334, S335, S347, V351 , A382, S387, S399, G405, Y412, V425, Q430, S438, P439, T444, L445, G459 und V472.
So gehen aus der Anmeldung WO 92/21760 A1 Einfach- und Mehrfachvarianten des Subtilisins aus Bacillus lentus DSM 5483 in folgenden Positionen hervor: 3, 4, 36, 42, 47, 56, 69, 87, 96, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 157, 188, 193, 199, 205, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268. Die Anmeldung WO 95/23221 A1 offenbart zusätzlich Austausche an diesem Molekül in den Positionen 99, 154 und 211 , insbesondere R99G, R99A, R99S, S154D, S154E, L211 D und L211 E. Solche Varianten eignen sich der Anmeldung WO 95/07770 A1 zufolge besonders auch für den Einsatz in Kosmetika. Neben anderen Austauschen ist in der Anmeldung WO 02/088340 A2 auch der Austausch L211G beschrieben, und in WO 03/038082 A2 der Austausch G61A.
Hierunter sind dementsprechend solche bevorzugt, bei denen die weiteren Aminosäureaustausche in einer oder mehreren der Positionen 3, 4, 61 , 188, 193, 199 und 211 vorliegen. Dem entsprechen bei HP70 die Positionen P140, N141, G209, A376, S381 , S393 und Y406 beziehungsweise bei HP53 die Positionen P146, N147, G215, A382, S387, S399 und Y412.
Hierunter sind entsprechend dem oben Gesagten wiederum solche bevorzugt, bei denen es sich um einen oder mehrere der Aminosäureaustausche 3T, 41, 61 A, 188P, 193M, 1991 und 211D oder 211G handelt, sofern die entsprechend homologen Positionen nicht schon natürlicherweise von einer dieser bevorzugten Aminosäuren eingenommen werden.
Die Austausche S3T und V4I führen, wie insbesondere in WO 02/088340 A2 erläutert ist, vermutlich über einen Stabilisierungeffekt auf das Molekül zu einer Verbesserung dessen Beitrags zur Waschleistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels. Die Austausche S3T, V4I, A188P, V193M, V199I und L211D kennzeichnen die gemäß WO 95/23221 A1 als F49 bezeichnete Protease, die in den Beispielen 7 und 8 der vorliegenden Anmeldung als leistungsfähiges, im Stand der Technik etabliertes Vergleichsenzym herangezogen worden ist. Demgegenüber handelt es sich bei den Proteasen HP70 und HP53 noch um unveränderte Wildtyp-Moleküle, deren Aktivität, insbesondere deren Beitrag zur Waschleistung durch ebendiese Austausche verbessert werden dürfte.
Weiter bevorzugt ist eine zuvor beschriebene erfindungsgemäße Alkalische Protease oder ein solches Protein, die beziehungsweise das zusätzlich stabilisiert ist.
Denn eine Erhöhung der Stabilität bei der Lagerung und/oder während des Einsatzes, beispielsweise beim Waschprozeß führt dazu, daß ihre Aktivität länger anhält und damit in der Wirkung verstärkt wird. Als Stabilisierungsmöglichkeiten kommen alle im Stand der Technik beschriebenen und zweckmäßigen Strategien in Betracht, bespielsweise gemäß US 5230891 die kovalente Kopplung an ein Polymer. Bevorzugt sind Stabilisierungen, die über Punktmutagenese des Moleküls selbst möglich sind. Denn diese erfordern im Anschluß an die Proteingewinnung keine weiteren Arbeitsschritte. Einige hierfür geeignete Punktmutationen sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt. So können gemäß US 6087315 und US 6110884 Proteasen dadurch stabilisiert werden, daß man bestimmte Tyrosin-Reste gegen andere austauscht.
Weitere Möglichkeiten sind beispielsweise:
- Veränderung der Bindung von Metallionen, insbesondere der Calcium-Bindungsstellen, beispielsweise gemäß der Lehre der Anmeldungen WO 88/08028 A1 und
WO 88/08033 A1; gemäß der ersten dieser Schriften müßten eine oder mehrere der an der Caicium-Bindung beteiligten Aminosäure-Reste gegen negativ geladene Aminosäuren ausgetauscht werden; gemäß der Lehre der Anmeldung WO 88/08033 müßten zur Stabilisierung über die Caicium-Bindung gleichzeitig in mindestens einer der Folgen der beiden Reste Arginin/Glycin Punktmutationen eingeführt werden;
- Gemäß dem Patent US 5453372 können Proteine durch bestimmte Mutationen auf der Oberfläche gegen den Einfluß von denaturierenden Agentien wie Tensiden geschützt werden.
Eine andere Möglichkeit zur Stabilisierung gegenüber erhöhter Temperatur und dem Einwirken von Tensiden wäre in Anwendung der Lehre aus WO 92/21760 A1 , WO 02/088340 A2 und WO 03/038082 A2 die Stabilisierung über den Austausch von Aminosäuren, die nahe dem N-Terminus liegen, gegen solche, die vermutlich über nicht- kovalente Wechselwirkungen mit dem Rest des Moleküls in Kontakt treten und somit einen Beitrag zur Aufrechterhaltung der globulären Struktur leisten. Dies ist insbesondere für Alkalische Proteasen empfehlenswert, die ursprünglich as ß. lentus erhalten worden sind. Entsprechende Mutanten sind mit den Varianten gemäß SEQ ID NO. 12 und 16 in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung beschrieben.
Bevorzugte Ausführungsformen sind solche, bei denen das Molekül auf mehrere Arten stabilisiert wird. Denn beispielsweise nach WO 89/09819 A1 kann davon ausgegangen werden, daß mehrere stabilisierende Mutationen additiv wirken.
Weiter bevorzugt ist eine zuvor beschriebene erfindungsgemäße Alkalische Protease oder ein solches Protein, die beziehungsweise das zusätzlich derivatisiert ist. Unter Derivaten werden solche Proteine verstanden, die sich über eine zusätzliche Modifikation von den ausgeführten Proteinen ableiten. Derartige Modifikationen können beispielsweise die Stabilität, Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat oder die enzymatische Aktivität beeinflussen. Sie können auch dazu dienen, um die Allergenizität und/oder Immunogenizität des Proteins herabzusetzen und damit beispielsweise dessen Hautverträglichkeit zu erhöhen.
Solche Derivatisierungen können beispielsweise biologisch erfolgen, etwa im Zusammenhang mit der Proteinbiosynthese durch den produzierenden Wirtsorganismus. Hier sind Kopplungen niedrigmolekularer Verbindungen wie von Lipiden oder Oligosacchariden besonders hervorzuheben.
Derivatisierungen können aber auch chemisch durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette oder durch kovalente Bindung einer anderen, beispielsweise makromolekularen Verbindung an das Protein. Eine chemische Modifikation wird beispielsweise in der Anmeldung DE 4013142 A1 beschrieben. Beispielsweise die Kopplung von Aminen an Carboxylgruppen eines Enzyms zur Veränderung des isoelektrischen Punkts geht aus WO 95/26398 A1 hervor. Es können beispielsweise Makromoleküle wie Proteine, etwa über bifunktionelle chemische Verbindungen an erfindungsgemäße Proteine gebunden werden. So ist es beispielsweise in Anwendung der Lehre von WO 99/57154 A1 möglich, ein erfindungsgemäßes Protein auch über einen Nichtprotein-Linker mit einer spezifischen Bindungsdomäne zu versehen. Solche Derivate eignen sich besonders für den Einsatz in in Wasch- oder Reinigungsmitteln. Analog WO 00/01831 A2 können auch Protease- Inhibitoren über Linker, insbesondere Aminosäure-Linker an die erfindungsgemäßen Proteine gebunden werden. Kopplungen mit sonstigen makromolekularen Verbindungen, wie etwa Polyethylenglykol verbessern das Molekül hinsichtlich weiterer Eigenschaften wie Stabilität oder Hautverträglichkeit; das wurde bereits erläutert.
Unter Derivaten erfindungsgemäßer Proteine können im weitesten Sinne auch Präparationen dieser Enzyme verstanden werden. Je nach Gewinnung, Aufarbeitung oder Präparation kann ein Protein mit diversen anderen Stoffen vergesellschaftet sein, beispielsweise aus der Kultur der produzierenden Mikroorganismen. Ein Protein kann auch, beispielsweise zur Erhöhung seiner Lagerstabilität, mit bestimmten anderen Stoffen gezielt versetzt worden sein. Erfindungsgemäß sind deshalb auch alle Präparationen eines erfindungsgemäßen Proteins. Das ist auch unabhängig davon, ob es in einer bestimmten Präparation tatsächlich diese enzymatische Aktivität entfaltet oder nicht. Denn es kann gewünscht sein, daß es bei der Lagerung keine oder nur geringe Aktivität besitzt, und erst zum Zeitpunkt der Verwendung seine proteolytische Funktion entfaltet. Dies kann beispielsweise über entsprechende Begleitstoffe gesteuert werden. Insbesondere die gemeinsame Präparation von Proteasen mit Protease- Inhibitoren ist vorteilhaft und aus dem Stand der Technik bekannt (WO 00/01826 A2).
Weiter bevorzugt ist eine zuvor beschriebene erfindungsgemäße Alkalische Protease oder ein solches Protein, die beziehungsweise das wenigstens eine antigene Determinante mit einem der in den zuvor bezeichneten Alkalischen Proteasen oder Proteinen gemeinsam hat, insbesondere über mindestens eine der Epitop-Regionen, innerhalb derer die Positionen 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141 , 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268 in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus liegen, zuzuordnen über das Alignment in Figur 1.
Das gilt insbesondere für die oben beschriebenen Varianten in diesen Positionen, da sie zum einen an sich bevorzugt sind und zum anderen über Antikörper, die spezifisch gegen diese Regionen gebildet worden sind, von den Proteasen unterschieden werden können, die in diesen Positionen mit dem Wildtypmolekül übereinstimmen.
Die Lösung einer Teilaufgabe und somit einen eigenständigen Erfindungsgegenstand stellen Nukleinsäuren mit einer Nukleotidsequenz dar, die zu der in SEQ ID NO. 3 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% oder zu der in SEQ ID NO. 6 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% identisch ist.
Denn zum einen beruht die Detektion der in den Beispielen beschriebenen Protease auf der Isolierung der zugehörigen DNA. Zum anderen können die Nukleinsäuren unmittelbar Moniert und somit in die gentechnische Produktion der angeleiteten Enzyme eingebracht werden.
Hierunter sind diejenigen zunehmend bevorzugt, die zu einer der angegebenen Nukleotidsequenzen zunehmend bevorzugt zu mindestens 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch sind, wobei jeweils alle ganzzahligen oder gebrochenen Zwischenwerte eingeschlossen werden.
Denn entsprechend den oben gemachten Ausführungen und wie in den Beispielen beschrieben ist, konnten im Stand der Technik als zu der SEQ ID NO. 3 und SEQ ID NO. 6 nächstähnliche Nukleotidsequenzen nur solche mit 74,4%> beziehungsweise 75,0% Identität gefunden werden.
Die weiteren, aus WO 2004/033668 A2 und dem GenBank-Eintrag AY253983 hervorgehenden DNA-Sequenzen sind bereits oben diskutiert worden und sind zu den hier beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen hinreichend unterschiedlich.
Weiterhin bevorzugt sind solche erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, bei denen die Homologiewerte jeweils für den Bereich gelten, der den Nukleotidpositionen 97 bis 1746 gemäß SEQ ID NO. 3 beziehungsweise den Nukleotidpositionen 115 bis 1761 gemäß SEQ ID NO. 6 entspricht.
Hiermit ist entsprechend dem oben Gesagten der Bereich gemeint, der für das jeweils mature, das heißt aktive Protein codiert. Auch das Stop-Codon ist einbezogen, denn dessen Existenz sorgt dafür, daß nicht ein größeres evtl. nicht mehr funktionsfähiges, ungewolltes Fusionsprotein gebildet wird. Somit ist bei der Klonierung darauf zu achten, daß an dieser Stelle ebenfalls ein Stop-Codon liegt, wenn nicht gezielt über den C- Terminus eine Proteinfusion herbeigeführt werden soll. Sollte sich später herausstellen, daß das mature Protein von einem anderen Teil dieser Sequenz gebildet wird, so gilt der Schutzbereich entsprechend für diesen Teil.
Weiterhin bevorzugt sind solche erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, bei denen die Homologiewerte jeweils für den Bereich gelten, der den Nukleotidpositionen 97 bis 1410 gemäß SEQ ID NO. 3 beziehungsweise den Nukleotidpositionen 115 bis 1428 gemäß SEQ ID NO. 6 entspricht.
Denn wie in den Beispielen beschrieben ist, reicht es bei den Proteinen HP70 und HP53 aus, den N-terminalen Teil des Gesamtproteins zu verwenden; eine erhebliche C- terminale Deletion führte in beiden Fällen zu einem in Wasch- und Reinigungsmitteln proteolytisch aktiven Enzym, welches einen entsprechenden Beitrag zur Gesamt- reinigungsleistung des betreffenden Mittels geliefert hat. Nukleinsäuren, die für derartige Varianten codieren, stellen deshalb bevorzugte Ausführungsformen dar, weil sie eine kosteneffizientere biotechnologische Herstellung der betreffenden Proteine ermöglichen.
Weiterhin und den bisherigen Ausführungen entsprechend bevorzugt sind solche erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, die für eine Alkalische Protease oder ein Protein des ersten Erfindungsgegenstands codieren.
Denn ebensolche Proteine sollten mit der vorliegenden Anmeldung zur Verfügung gestellt werden, so daß Nukleinsäuren, die für lediglich inaktive Proteine codieren, keine erfindungsgemäße Lösung darstellen. Bevorzugt sind solche Nukleinsäuren die für mature Proteine codieren, und zunehmend besonders solche, die für zunehmend aktivere Varianten codieren.
Weiterhin bevorzugt sind solche der genannten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, von denen ein eines oder vorzugsweise mehrere Codons durch synonyme Codons ersetzt sind.
Dieser Aspekt bezieht sich insbesondere auf die heterologe Expression der betreffenden Proteasen. So besitzt jeder Organismus, insbesondere jeder Produktionsstamm über eine gewisse Codon-Usage. Hierbei kann es zu Engpässen in der Proteinbiosynthese kommen, wenn die auf der transgenen Nukleinsäure liegenden Codons in der Wirtszelle einer vergleichsweise geringen Zahl von beladenen tRNAs gegenüberstehen. Synonyme Codons codieren dagegen für dieselben Aminosäuren und können in Abhängigkeit vom Wirt besser translatiert werden. Dieses gegebenenfalls notwendige Umschreiben hängt somit von der Wahl des Expressionssystems ab. Insbesondere bei Proben aus unbekannten, eventuell nicht kultivierbaren Organismen kann eine entsprechende Anpassung notwendig sein.
Entsprechend den oben gemachten Ausführungen werden weiterhin die Zellen eines Organismus in den Schutzbreich einbezogen und stellen einen eigenen Erfindungsgegenstand dar, der natürlicherweise eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält. Denn über deren Kultivierung können die gewünschten Enzyme direkt zugänglich sein.
Besonders bevorzugt sind hierunter solche Zellen, die natürlicherweise eine Protease oder ein Protein des ersten Erfindungsgegenstands exprimieren und vorzugsweise sekretieren.
Denn hierüber können erfindungsgemäße Proteasen hinsichtlich ihres beabsichtigten Anwendungsgebiets sofort getestet und möglicherweise durch sofortige Kultivierung dieses Organismus in größeren Mengen gewonnen werden.
Hierunter sind wiederum solche Zellen bevorzugt, bei denen es sich um Mikroorganismen handelt, vorzugsweise um Pilze oder Bakterien, hierunter bevorzugt um grampositive Bakterien und besonders bevorzugt um solche der Gattung Bacillus oder um gramnegative Bakterien der Gattung Xanthomonas.
Denn mit Mikroorganismen hat man im Stand der Technik reichhaltige Erfahrungen hinsichtlich der molekularbiologischen Techniken und der Produktion sammeln können. Das gilt besonders für grampositive Bakterien, von denen solche der Gattung Bacillus zu den geläufigsten Produktionsstämmen gehören. Nicht minder bevorzugt sind jedoch gramnegative Bakterien der Gattung Xanthomonas, die bislang insbesondere für die Produktion des extrazellulären Polysaccharids Xanthan genutzt werden. Aufgrund der bereits diskutierten und in den Beispielen gezeigten Homologievergleiche erscheint es darüber hinaus möglich, daß natürlicherweise Stämme dieser Gattung die erfindungsgemäß besonders bevorzugten Proteasen HP70 und HP53 produzieren. Zumindest sollte deren Produktion in nahe verwandten Stämmen besonders vorteilhaft realisierbar sein, beipielsweise was deren Codon-Usage betrifft.
Einen weiteren eigenständigen Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur Identifizierung einer Alkalischen Protease des ersten Erfindungsgegenstands dar, welche auf der Isolierung einer Nukleinsäure aus einem natürlich besiedelten Habitat beruhen.
Denn wie mit der vorliegenden Erfindung belegt ist, ist es zur Identifizierung neuer Proteasen nicht unbedingt notwendig, auch die betreffenden Proteasen und Mikroorganismen aus der Natur zu isolieren. Insbesondere über Schrotschußklonierungen oder alternativ über PCR-Primer zu bekannten Sequenzmotiven ist es möglich, direkt die betreffenden Nukleinsäuren aufzufinden. Solch ein Verfahren ist in den Beispielen 1 bis 3 der vorliegenden Anmeldung dargestellt. Demnach ist es beispielsweise möglich, die Mikroorganismenflora von Bodenproben zu kultivieren, daraus DNA zu isolieren und über eine Klonierung in einen Expressionsvektor auf Proteaseexpression zu testen.
Unter den genannten Verfahren sind diejenigen bevorzugt, bei denen ein, vorzugsweise zwei einander entsprechende Oligonukleotide eingesetzt werden, die als PCR-Primer dienen können und von einer der beiden Sequenzen SEQ ID NO. 3 oder 6 abgeleitet sind.
Ein vergleichbarer, auf einer PCR mit geeigneten Primern beruhender Ansatz geht beispielsweise aus der Anmeldung WO 03/002711 A2 am Beispiel von α-Amylasen hervor. So ist es möglich, anstatt die Mikroorganismen zu kultivieren und daraus die DNA zu präparieren, direkt die in einer Bodenprobe enthaltenen Nukleinsäuren zu amplifizieren. Hierfür eignen sich PCR-basierte Ansätze. Dabei können die unter SEQ ID NO. 3 und 6 angegebenen Nukleotidsequenzen als Vorlage zum Entwerfen von entsprechenden PCR-Primern dienen. Dabei ist es vorteilhaft, nach an sich bekannten Methoden Primer zu entwerfen, die ausschließlich oder insbesondere N-terminal nur wenig mehr als das mature Protein umfassen; zudem kann man die an den dc-Varianten (Beispiel 6) gewonnenen Erkenntnisse dahingehend nutzen, daß man über die PCR lediglich für entsprechend verkürzte Proteine codierende Nukleinsäuren amplifiziert
Weiterhin sind solche Verfahren bevorzugt, bei denen die isolierte Nukleinsäure kloniert, vorzugsweise exprimiert und besonders bevorzugt über die Protease-Aktivität des Expressionsprodukts als Protease identifiziert wird.
Denn die Klonierung stellt meist, auch wenn nicht zuvor eine PCR durchgeführt worden ist, den wesentlichen molekularbiologischen Schritt dar, mit dem die Gewinnung des zugehörigen Enzyms eingeleitet wird. Die Expression dient der biochemischen Charakterisierung des von der Nukleinsäure abgeleiteten Proteins. Insbesondere, wenn der Test auf Proteaseaktivität, beispielsweise über den Abbau eines Protein-Substrats (vergleiche Beispiele) erfolgreich ist, kann man sicher sein, eine Protease gefunden zu haben, welche in nachfolgenden Tests hinsichtlich ihrer technischen Verwendbarkeit untersucht werden kann.
Einen weiteren eigenständigen Erfindungsgegenstand stellen Vektoren dar, die einen zuvor bezeichneten erfindungsgemäßen Nukleinsäurebereich enthalten.
Denn um mit den erfindungsrelevanten Nukleinsäuren umzugehen, und damit insbesondere die Produktion erfindungsgemäßer Proteine vorzubereiten, werden sie geeigneterweise in Vektoren ligiert. Solche Vektoren sowie die zugehörigen Arbeitsmethoden sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben. Vektoren sind in großer Zahl und Variationsbreite, sowohl für die Klonierung als auch für die Expression kommerziell erhältlich. Dazu gehören beispielsweise Vektoren, die sich von bakteriellen Plasmiden, von Bacteriophagen oder von Viren ableiten, oder überwiegend synthetische Vektoren. Ferner werden sie nach der Art der Zelltypen, in denen sie sich zu etablieren vermögen, beispielsweise nach Vektoren für gramnegative, für grampositive Bakterien, für Hefen oder für höhere Eukaryonten unterschieden. Sie bilden geeignete Ausgangspunkte beispielsweise für molekularbiologische und biochemische Untersuchungen sowie für die Expression des betreffenden Gens oder zugehörigen Proteins.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei erfindungsgemäßen Vektoren um Klonierungsvektoren.
Denn Klonierungsvektoren eignen sich neben der Lagerung, der biologischen Amplifikation oder der Selektion des interessierenden Gens für dessen molekularbiologische Charakterisierung. Gleichzeitig stellen sie transportierbare und lagerfähige Formen der beanspruchten Nukleinsäuren dar und sind auch Ausgangspunkte für molekularbiologische Techniken, die nicht an Zellen gebunden sind, wie beispielsweise die PCR oder /n-wϊro-Mutagenese-Verfahren.
Vorzugsweise handelt es sich bei erfindungsgemäßen Vektoren um Expressionsvektoren.
Denn derartige Expressionsvektoren sind die Basis dafür, die entsprechenden Nukleinsäuren in biologischen Produktionssystemen zu realisieren und damit die zugehörigen Proteine zu produzieren. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands sind Expressionsvektoren, die die zur Expression notwendigen genetischen Elemente tragen, beispielsweise den natürlichen, ursprünglich vor diesem Gen lokalisierten Promotor oder einen Promotor aus einem anderen Organismus. Diese Elemente können beispielsweise in Form einer sogenannten Expressionskassette angeordnet sein. Alternativ können einzelne oder alle Regulationselemente auch von der jeweiligen Wirtszelle bereitgestellt werden. Besonders bevorzugt sind die Expressionsvektoren hinsichtlich weiterer Eigenschaften, wie beispielsweise die optimale Kopienzahl, auf das gewählte Expressionssystem, insbesondere die Wirtszelle (siehe unten) abgestimmt.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand bilden Zellen, die nach gentechnischer Modifizierung einen der zuvor bezeichneten, erfindungsgemäßen Nukleinsäurebereiche enthalten.
Denn diese Zellen enthalten die genetische Information zur Synthese eines erfindungsgemäßen Proteins. Hierunter sind im Gegensatz zu den oben beschriebenen, ebenfalls beanspruchten natürlichen Produzenten diejenigen Zellen gemeint, die nach an sich bekannten Verfahren mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren versehen worden sind, beziehungsweise die sich von solchen Zellen ableiten. Dafür werden geeigneterweise solche Wirtszellen ausgewählt, die sich vergleichsweise einfach kultivieren lassen und/oder hohe Produktausbeuten liefern.
Sie ermöglichen beispielsweise die Amplifikation der entsprechenden Gene, aber auch deren Mutagenese oder Transkription und Translation und letztlich die biotechnologische Produktion der betreffenden Proteine. Diese genetische Information kann entweder extrachromosomal als eigenes genetisches Element, das heißt bei Bakterien in plasmidaler Lokalisation vorliegen oder in ein Chromosom integriert sein. Die Wahl eines geeigneten Systems hängt von Fragestellungen, wie beispielsweise die Art und Dauer der Lagerung des Gens, beziehungsweise des Organismus oder die Art der Mutagenese oder Selektion ab. So sind im Stand der Technik beispielsweise auf Bakteriophagen - und deren spezifischen Wirtszellen - beruhende Mutagenese- und Selektionsverfahren zur Entwicklung von Waschmittelenzymen beschrieben (WO 97/09446 A1).
In den Ländern, wo entsprechende nationale Gesetze verlangen, daß von solch einem Anmeldungsgegenstand menschliche embryonale Stammzellen ausgenommen werden, wird die vorliegende Erfindung nur für einen entsprechend eingeschränkten Gegenstand beansprucht.
Vorzugsweise liegt der genannte Nukleinsäurebereich auf einem der oben bezeichneten, erfindungsgemäßen Vektoren, insbesondere auf einem Klonierungs- oder Expressionsvektor.
Denn hierdurch werden sie zur Realisierung der vorliegenden Erfindung relevant.
Weiterhin sind solche Zellen bevorzugt, die eine Alkalische Protease oder ein Protein des ersten Erfindungsgegenstands exprimieren, vorzugsweise sekretieren.
Denn Protein-bildende Wirtszellen ermöglichen deren biotechnologische Produktion. Als Wirtszellen zur Proteinexpression eignen sich prinzipiell alle Organismen, das heißt Prokaryonten, Eukaryonten oder Cyanophyta. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch gut handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit dem Expressionsvektor, dessen stabile Etablierung und die Regulation der Expression angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien. Zudem zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. Vorzugsweise werden Laborstämme gewählt, die auf die Expression ausgerichtet sind. Solche sind kommerziell oder über allgemein zugängliche Stammsammlungen erhältlich. Jedes erfindungsgemäße Protein kann auf diese Weise theoretisch aus einer Vielzahl von Wirtsorganismen gewonnen werden. Aus der Fülle an verschiedenen nach dem Stand der Technik zur Verfügung stehenden Systeme müssen die optimalen Expressionssysteme für den Einzelfall experimentell ermitteln werden.
Besonders vorteilhaft sind Wirtszellen, die selbst Protease-negativ sind und somit gebildete Proteine nicht abbauen.
Bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund entsprechender genetischer Elemente in ihrer Aktivität regulierbar sind, beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder in Abhängigkeit von der jeweiligen Zelldichte. Diese kontrollierbare Expression ermöglicht eine sehr wirtschaftliche Produktion der interessierenden Proteine; sie ist beispielsweise über ein entsprechendes Element auf dem betreffenden Vektor realisierbar. Geeigneterweise sind Gen, Expressionsvektor und Wirtszelle aufeinander abgestimmt, was beispielsweise die zur Expression notwendigen genetischen Elemente (Ribosomen-Bindungsstelle, Promotoren, Terminatoren) oder die Codon-Usage betrifft.
Bevorzugt sind darunter Wirtszellen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie Bakterien sind.
Denn Bakterien zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Verfahren etabliert werden. Zudem verfügt man bei Bakterien in der Fermentationstechnik über einen reichhaltigen Erfahrungsschatz. Für eine spezielle Produktion können aus verschiedensten, im Einzelfall experimentell zu ermittelnden Gründen wie Nährstoffquellen, Produktbildungsrate, Zeitbedarf etc. gramnegative oder grampositive Bakterien geeignet sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um gramnegative Bakterien, insbesondere der Gattungen Esche chia coli, Klebsieila, Pseudomonas oder Xanthomonas, insbesondere um Stämme von E. coli K12, E. coli B oder Klebsieila planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E. coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
Denn bei gramnegativen Bakterien, wie beispielsweise E. coli, wird eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sekretiert. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. In der Anmeldung WO 01/81597 A1 wird ein Verfahren offenbart, nach welchem erreicht wird, daß auch gramnegative Bakterien die exprimierten Proteine ausschleusen. Solch ein System ist auch für die Herstellung erfindungsgemäßer Proteine geeignet. Die als bevorzugt genannten gramnegativen Bakterien sind in der Regel leicht, das heißt kommerziell oder über öffentliche Stammsammlungen zugänglich und im Zusammenspiel mit ebenfalklks in großer Zahl zur Verfügung stehenden übrigen Komponenten wie etwa Vektoren auf spezifische Herstellbedingungen hin optimierbar. Wie oben erwähnt stellen Xanthomonas, aber auch Pseudomonas aufgrund ihrer vermuteten Verwandtschaft zu den in vivo HP70 und/oder HP53 produzierenden Stämmen erfolgversprechende Wirtszellen dar; nicht zuletzt auch wegen einer vermutlich ähnlichen Codon-Usage.
In einer alternativen, nicht minder bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um ein grampositives Bakterium, insbesondere eines der Gattungen Bacillus, Staphylococcus oder Corynebakterium, ganz besonders der Species Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii oder ß. alcalophilus, Staphylococcus carnosus oder Corynebacterium glutamicum.
Denn grampositive Bakterien besitzen den gramnegativen gegenüber den grundsätzlichen Unterschied, sekretierte Proteine sogleich in das die Zellen umgebende Nährmedium abzugeben, aus welchem sich, wenn das gewünscht ist, die exprimierten erfindungsgemäßen Proteine direkt aus dem Nährmedium aufreinigen lassen. Zudem sind sie mit den meisten Herkunftsorganismen für technisch wichtige Subtilisine verwandt oder identisch und bilden meist selbst vergleichbare Subtilisine, so daß sie über eine ähnliche Codon-Usage verfügen und ihr Protein-Syntheseapparat naturgemäß entsprechend ausgerichtet ist. Ein weiterer Vorteil kann darin bestehen, daß über dieses Verfahren eine Mischung erfindungsmäßer Proteine mit den endogen von den Wirtsstämmen gebildeten Subtilisinen erhalten werden kann. Solch eine Coexpression geht ebenfalls aus der Anmeldung WO 91/02792 hervor. Sollte sie nicht gewünscht sein, müßten die in der Wirtszelle natürlicherweise vorhandenen Proteasegene dauerhaft oder vorübergehend inaktiviert werden.
Weiter bevorzugt sind Wirtszellen, bei denen es sich um eukaryontische Zellen, vorzugsweise der Gattung Saccharomyces handelt.
Beispiele hierfür sind Pilze wie Actinomyceten oder eben Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Thermophile pilzliche Expressionssysteme werden beispielsweise in WO 96/02653 A1 vorgestellt. Solche eignen sich besonders zur Expression temperaturbeständiger Varianten. Zu den Modifikationen, die eukaryontische Systeme besonders im Zusammenhang mit der Proteinsynthese durchführen, gehören beispielsweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccharide. Derartige Oligosaccharid-Modifikationen können beispielsweise zur Senkung der Allergenizität wünschenswert sein. Auch eine Coexpression mit den natürlicherweise von derartigen Zellen gebildeten Enzymen, wie beispielsweise Cellulasen, kann vorteilhaft sein.
Einen eigenständigen Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur Herstellung einer Alkalischen Proteasen oder eines Proteins nach dem ersten Erfindungsgegenstand dar.
Dazu gehört jedes Verfahren zur Herstellung eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteins, beispielsweise chemische Syntheseverfahren.
Demgegenüber bevorzugt sind jedoch alle im Stand der Technik etablierten, oben in einzelnen Aspekten bereits angesprochenen molekularbiologischen, mikrobiologischen, beziehungsweise biotechnologischen Herstellverfahren.
Vorzugsweise handelt es sich dabei um Verfahren, die unter Einsatz einer oben bezeichneten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren erfolgen, vorzugsweise unter Einsatz eines zuvor bezeichneten Vektors und besonders bevorzugt unter Einsatz einer zuvor bezeichneten Zelle erfolgen.
Durch die genannten Nukleinsäuren, insbesondere den im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 3 oder 6 angegebenen Nukleinsäuren wird die entsprechend bevorzugte genetische Information in mikrobiologisch verwertbarer Form, das heißt für gentechnische Produktionsverfahren zur Verfügung gestellt. Zunehmend bevorzugt ist die Bereitstellung auf einem von der Wirtszelle besonders erfolgreich verwertbaren Vektor beziehungsweise von solchen Zellen selbst. Die betreffenden Produktionsverfahren sind dem Fachmann an sich bekannt.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können auf der Grundlage der zugehörigen Nukleinsäuresequenzen auch zellfreie Expressionssysteme sein, bei denen die Proteinbiosynthese in vitro nachvollzogen wird. Alle bereits oben ausgeführten Elemente können auch zu neuen Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Proteine herzustellen. Es ist dabei für jedes erfindungsgemäße Protein eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten an Verfahrensschritten denkbar, so daß optimale Verfahren für jeden konkreten Einzelfall experimentell ermittelt werden müssen. Entsprechend dem oben Gesagten sind unter den zellgebundenen Verfahren solche bevorzugt, bei denen die Nukleotidsequenz in einem oder vorzugsweise mehreren Codons an die Codon-Usage des Wirtsstamms angepaßt worden ist.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen Mittel, dar, die eine oben beschriebene, erfindungsgemäße Alkalische Protease enthalten.
Hiermit werden alle Arten von Mitteln, insbesondere Gemische, Rezepturen, Lösungen etc., deren Einsetzbarkeit durch Zugabe eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteins verbessert wird, in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Es kann sich dabei je nach Einsatzgebiet beispielsweise um feste Gemische, beispielsweise Pulver mit gefriergetrockeneten oder verkapselten Proteinen, oder um gelförmige oder flüssige Mittel handeln. Bevorzugte Rezepturen enthalten beispielsweise Puffersubstanzen, Stabilisatoren, Reaktionspartner und/oder Cofaktoren der Proteasen und/oder andere mit den Proteasen synergistische Inhaltsstoffe. Insbesondere sind darunter Mittel für die weiter unten ausgeführten Einsatzgebiete zu verstehen. Weitere Einsatzgebiete gehen aus dem Stand der Technik hervor und werden beispielsweise in dem Handbuch „Industrial enyzmes and their applications" von H. Uhlig, Wiley-Verlag, New York, 1998 dargestellt.
Diesem Erfindungsgegenstand werden als bevorzugte Ausführungsform Mittel zugerechnet, bei denen es sich um Wasch- oder Reinigungsmittel handelt.
Denn wie in den Ausführungsbeispielen der vorliegenden Anmeldung gezeigt ist, konnte für Wasch- und Reinigungsmittel mit einer erfindungsgemäß bevorzugten Protease überraschenderweise eine Leistungssteigerung gegenüber dem proteasefreien Mittel festgestellt werden.
Zu diesem Erfindungsgegenstand zählen alle denkbaren Reinigungsmittelarten, sowohl Konzentrate als auch unverdünnt anzuwendende Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Hand-Wäsche, beziehungsweise -Reinigung. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder; für solche wird nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen alle nach dem Stand der Technik etablierten und/oder alle zweckmäßigen Darreichungsformen der erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel. Dazu zählen beispielsweise feste, pulver- förmige, flüssige, gelförmige oder pastöse Mittel, gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen, komprimiert oder nicht komprimiert; ferner gehören beispielsweise dazu: Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches, sowohl in Großgebinden als auch portionsweise abgepackt.
Neben einer erfindungsgemäßen Alkalischen Protease vom Subtilisin-Typ enthält ein erfindungsgemäßes Wasch- oder Reinigungsmittel entsprechend seinem Einsatzgebiet gegebenenfalls weitere Inhaltsstoffe wie weitere Enzyme, Enzymstabilisatoren, Tenside, zum Beispiel nichtionische, anionische und/oder amphotere Tenside, und/oder Bleichmittel, und/oder Builder, sowie gegebenenfalls weitere übliche Inhaltsstoffe, die unten detaillierter ausgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel die oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ in einer Menge von 2 μg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg, ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 mg pro Gramm des Mittels. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Die Proteaseaktivität in derartigen Mitteln kann nach der in Tenside, Band 7 (1970), Seite 125-132 beschriebenen Methode ermittelt werden. Sie wird dementsprechend in PE (Protease-Einheiten) angegeben.
Bei dem Vergleich der Leistungen zweier Waschmittelenzyme, wie etwa in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung, muß zwischen proteingleichem und aktivitätsgleichem Einsatz unterschieden werden. Insbesondere bei gentechnisch erhaltenen, weitgehend nebenaktivitätsfreien Präparationen ist der proteingleiche Einsatz angebracht. Denn damit ist eine Aussage darüber möglich, ob dieselben Proteinmengen - als Maß für den Ertrag der fermentativen Produktion - zu vergleichbaren Ergebnissen führen. Klaffen die jeweiligen Verhältnisse von Aktivsubstanz zu Gesamtprotein (die Werte der spezifischen Aktivität) auseinander, so ist ein aktivitätsgleicher Vergleich zu empfehlen, weil hierüber die jeweiligen enzymatischen Eigenschaften verglichen werden. Generell gilt, daß eine niedrige spezifische Aktivität durch Zugabe einer größeren Proteinmenge ausgeglichen werden kann. Hierbei handelt es sich letztlich um eine ökonomische Erwägung.
Nun folgt eine nicht erschöpfende Zusammenstellung wichtiger, für Wasch- und Reinigungsmittel üblicher Inhaltsstoffe. Ersatzweise oder ergänzend können weitere für den jeweiligen Zweck geeignete Inhaltsstoffe hinzukommen.
Als nichtionische Tenside werden vorzugsweise alkoxylierte, vorteilhafterweise ethoxylierte, insbesondere primäre Alkohole mit vorzugsweise 8 bis 18 C-Atomen und durchschnittlich 1 bis 12 Mol Ethylenoxid (EO) pro Mol Alkohol eingesetzt, in denen der Alkoholrest linear oder bevorzugt in 2-Stellung methylverzweigt sein kann, beziehungsweise lineare und methylverzweigte Reste im Gemisch enthalten kann, so wie sie üblicherweise in Oxoalkoholresten vorliegen. Insbesondere sind jedoch Alkoholethoxylate mit linearen Resten aus Alkoholen nativen Ursprungs mit 12 bis 18 C-Atomen, zum Beispiel aus Kokos-, Palm-, Taigfett- oder Oleylalkohol, und durchschnittlich 2 bis 8 EO pro Mol Alkohol bevorzugt. Zu den bevorzugten ethoxylierten Alkoholen gehören beispielsweise C12.1 -Alkohole mit 3 EO oder 4 EO, C9.1 Alkohol mit 7 EO, C13.15- Alkohole mit 3 EO, 5 EO, 7 EO oder 8 EO, C12.18-Alkohole mit 3 EO, 5 EO oder 7 EO und Mischungen aus diesen, wie Mischungen aus Cι2.14-Alkohol mit 3 EO und C12.-|8-Alkohol mit 5 EO. Die angegebenen Ethoxylierungsgrade stellen statistische Mittelwerte dar, die für ein spezielles Produkt eine ganze oder eine gebrochene Zahl sein können. Bevorzugte Alkoholethoxylate weisen eine eingeengte Homologenverteilung auf (narrow ränge ethoxylates, NRE). Zusätzlich zu diesen nichtionischen Tensiden können auch Fettalkohole mit mehr als 12 EO eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind Taigfettalkohol mit 14 EO, 25 EO, 30 EO oder 40 EO.
Eine weitere Klasse bevorzugt eingesetzter nichtionischer Tenside, die entweder als alleiniges nichtionisches Tensid oder in Kombination mit anderen nichtionischen Tensiden eingesetzt werden, sind alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder ethoxylierte und propoxylierte Fettsäurealkylester, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette, insbesondere Fettsäuremethylester.
Eine weitere Klasse von nichtionischen Tensiden, die vorteilhafterweise eingesetzt werden kann, sind die Alkylpolyglycoside (APG). Einsetzbare Alkypolyglycoside genügen der allgemeinen Formel RO(G)2, in der R einen linearen oder verzweigten, insbesondere in 2-Stellung methylverzweigten, gesättigten oder ungesättigten, aliphatischen Rest mit 8 bis 22, vorzugsweise 12 bis 18 C-Atomen bedeutet und G das Symbol ist, das für eine Glykoseeinheit mit 5 oder 6 C-Atomen, vorzugsweise für Glucose, steht. Der Glycosylierungsgrad z liegt dabei zwischen 1,0 und 4,0, vorzugsweise zwischen 1,0 und 2,0 und insbesondere zwischen 1,1 und 1,4. Bevorzugt eingesetzt werden lineare Alkylpolyglucoside, also Alkylpolyglycoside, in denen der Polyglycosylrest ein Glucoserest und der Alkylrest ein n-Alkylrest ist.
Auch nichtionische Tenside vom Typ der Aminoxide, beispielsweise N-Kokosalkyl-N,N- dimethylaminoxid und N-Talgalkyl-N,N-dihydroxyethylaminoxid, und der Fettsäure- alkanolamide können geeignet sein. Der Anteil dieser nichtionischen Tenside liegt vorzugsweise nicht über dem der ethoxylierten Fettalkohole, insbesondere bei nicht mehr als der Hälfte davon.
Weitere geeignete Tenside sind Polyhydroxyfettsäureamide der Formel (II),
I
R-CO-N-[Z] (II)
in der RCO für einen aliphatischen Acylrest mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, R1 für Wasserstoff, einen Alkyl- oder Hydroxyalkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und [Z] für einen linearen oder verzweigten Polyhydroxyalkylrest mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen und 3 bis 10 Hydroxylgruppen steht. Bei den Polyhydroxyfettsäureamiden handelt es sich um bekannte Stoffe, die üblicherweise durch reduktive Aminierung eines reduzierenden Zuckers mit Ammoniak, einem Alkylamin oder einem Alkanolamin und nachfolgende Acylierung mit einer Fettsäure, einem Fettsäurealkylester oder einem Fettsäurechlorid erhalten werden können.
Zur Gruppe der Polyhydroxyfettsäureamide gehören auch Verbindungen der Formel (III), R1-O-R2 l R-CO-N-[Z] (III)
in der R für einen linearen oder verzweigten Alkyl- oder Alkenylrest mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, R1 für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylrest oder einen Arylrest mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen und R2 für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylrest oder einen Arylrest oder einen Oxy-Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen steht, wobei C-|. -Alkyl- oder Phenylreste bevorzugt sind und [Z] für einen linearen Polyhydroxyalkylrest steht, dessen Alkylkette mit mindestens zwei Hydroxylgruppen substituiert ist, oder alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder propoxylierte Derivate dieses Restes.
[Z] wird vorzugsweise durch reduktive Aminierung eines reduzierenden Zuckers erhalten, beispielsweise Glucose, Fructose, Maltose, Lactose, Galactose, Mannose oder Xylose. Die N-Alkoxy- oder N-Aryloxy-substituierten Verbindungen können beispielsweise durch Umsetzung mit Fettsäuremethylestern in Gegenwart eines Alkoxids als Katalysator in die gewünschten Polyhydroxyfettsäureamide überführt werden.
Als anionische Tenside werden beispielsweise solche vom Typ der Sulfonate und Sulfate eingesetzt. Als Tenside vom Sulfonat-Typ kommen dabei vorzugsweise C9.13- Alkylbenzolsulfonate, Olefinsulfonate, das heißt Gemische aus Alken- und Hydroxyalkansulfonaten sowie Disulfonaten, wie man sie beispielsweise aus Cι2.18- Monoolefinen mit end- oder innenständiger Doppelbindung durch Sulfonieren mit gasförmigem Schwefeltrioxid und anschließende Alkalische oder saure Hydrolyse der Sulfonierungsprodukte erhält, in Betracht. Geeignet sind auch Alkansulfonate, die aus Cι2-18-Alkanen beispielsweise durch Sulfochlorierung oder Sulfoxidation mit anschließender Hydrolyse beziehungsweise Neutralisation gewonnen werden. Ebenso sind auch die Ester von α-Sulfofettsäuren (Estersulfonate), zum Beispiel die α-sulfonierten Methylester der hydrierten Kokos-, Palmkern- oder Taigfettsäuren geeignet.
Weitere geeignete Aniontenside sind sulfierte Fettsäureglycerinester. Unter Fettsäureglycerinestern sind die Mono-, Di- und Triester sowie deren Gemische zu verstehen, wie sie bei der Herstellung durch Veresterung von einem Monoglycerin mit 1 bis 3 Mol Fettsäure oder bei der Umesterung von Triglyceriden mit 0,3 bis 2 Mol Glycerin erhalten werden. Bevorzugte sulfierte Fettsäureglycerinester sind dabei die Sulfierpro- dukte von gesättigten Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, beispielsweise der Capronsäure, Caprylsäure, Caprinsäure, Myristinsäure, Laurinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure oder Behensäure.
Als Alk(en)ylsulfate werden die Alkali- und insbesondere die Natriumsalze der Schwefelsäurehalbester der C12-C18-Fettalkohole, beispielsweise aus Kokosfettalkohol, Taigfettalkohol, Lauryl-, Myristyl-, Cetyl- oder Stearylalkohol oder der C10-C20- Oxoalkohole und diejenigen Halbester sekundärer Alkohole dieser Kettenlängen bevorzugt. Weiterhin bevorzugt sind Alk(en)ylsulfate der genannten Kettenlänge, welche einen synthetischen, auf petrochemischer Basis hergestellten geradkettigen Alkylrest enthalten, die ein analoges Abbauverhalten besitzen wie die adäquaten Verbindungen auf der Basis von fettchemischen Rohstoffen. Aus waschtechnischem Interesse sind die C12-Cι6-Alkylsulfate und C-ι2-C15-Alkylsulfate sowie C1 -C15-Alkylsulfate bevorzugt. Auch 2,3-Alkylsulfate sind geeignete Aniontenside.
Auch die Schwefelsäuremonoester der mit 1 bis 6 Mol Ethylenoxid ethoxylierten geradkettigen oder verzweigten C7.21-Alkohole, wie 2-Methyl-verzweigte C9.ιrAlkohole mit im Durchschnitt 3,5 Mol Ethylenoxid (EO) oder C12.18-Fettalkohole mit 1 bis 4 EO, sind geeignet. Sie werden in Reinigungsmitteln aufgrund ihres hohen Schaumverhaltens nur in relativ geringen Mengen, beispielsweise in Mengen bis 5 Gew.-%, üblicherweise von 1 bis 5 Gew.-%, eingesetzt.
Weitere geeignete Aniontenside sind auch die Salze der Alkylsulfobemsteinsäure, die auch als Sulfosuccinate oder als Sulfobernsteinsäureester bezeichnet werden und die Monoester und/oder Diester der Sulfobernsteinsäure mit Alkoholen, vorzugsweise Fettalkoholen und insbesondere ethoxylierten Fettalkoholen darstellen. Bevorzugte Sulfosuccinate enthalten C8.ι8-Fettalkoholreste oder Mischungen aus diesen. Insbesondere bevorzugte Sulfosuccinate enthalten einen Fettalkoholrest, der sich von ethoxylierten Fettalkoholen ableitet, die für sich betrachtet nichtionische Tenside darstellen (Beschreibung siehe oben). Dabei sind wiederum Sulfosuccinate, deren Fettalkohol-Reste sich von ethoxylierten Fettalkoholen mit eingeengter Homologenverteilung ableiten, besonders bevorzugt. Ebenso ist es auch möglich, Alk(en)ylbernsteinsäure mit vorzugsweise 8 bis 18 Kohlenstoffatomen in der Alk(en)ylkette oder deren Salze einzusetzen.
Als weitere anionische Tenside kommen insbesondere Seifen in Betracht. Geeignet sind gesättigte Fettsäureseifen, wie die Salze der Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, hydrierte Erucasäure und Behensäure sowie insbesondere aus natürlichen Fettsäuren, zum Beispiel Kokos-, Palmkern- oder Taigfettsäuren, abgeleitete Seifengemische.
Die anionischen Tenside einschließlich der Seifen können in Form ihrer Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalze sowie als lösliche Salze organischer Basen, wie Mono-, Dioder Triethanolamin, vorliegen. Vorzugsweise liegen die anionischen Tenside in Form ihrer Natrium- oder Kaliumsalze, insbesondere in Form der Natriumsalze vor.
Die Tenside können in den erfindungsgemäßen Reinigungs- oder Waschmitteln insgesamt in einer Menge von vorzugsweise 5 Gew.-% bis 50 Gew.-%, insbesondere von 8 Gew.-% bis 30 Gew.-%, bezogen auf das fertige Mittel, enthalten sein.
Erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel können Bleichmittel enthalten. Unter den als Bleichmittel dienenden, in Wasser H2O2 liefernden Verbindungen haben das Natriumpercarbonat, das Natriumperborattetrahydrat und das Natriumperborat- monohydrat besondere Bedeutung. Weitere brauchbare Bleichmittel sind beispielsweise Peroxopyrophosphate, Citratperhydrate sowie H2O2 liefernde persaure Salze oder Persäuren, wie Persulfate beziehungsweise Perschwefelsäure. Brauchbar ist auch das Harnstoffperoxohydrat Percarbamid, das durch die Formel H2N-CO-NH2Η2O2 beschrieben werden kann. Insbesondere beim Einsatz der Mittel für das Reinigen harter Oberflächen, zum Beispiel beim maschinellen Geschirrspülen, können sie gewünschten- falls auch Bleichmittel aus der Gruppe der organischen Bleichmittel enthalten, obwohl deren Einsatz prinzipiell auch bei Mitteln für die Textilwäsche möglich ist. Typische organische Bleichmittel sind die Diacylperoxide, wie zum Beispiel Dibenzoylperoxid. Weitere typische organische Bleichmittel sind die Peroxysäuren, wobei als Beispiele besonders die Alkylperoxysäuren und die Arylperoxysäuren genannt werden. Bevorzugte Vertreter sind die Peroxybenzoesäure und ihre ringsubstituierten Derivate, wie Alkylperoxybenzoesäuren, aber auch Peroxy-α-Naphthoesäure und Magnesium- monoperphthalat, die aliphatischen oder substituiert aliphatischen Peroxysäuren, wie Peroxylaurinsäure, Peroxystearinsäure, ε-Phthalimidoperoxycapronsäure (Phthalimidoperoxyhexansäure, PAP), o-Carboxybenzamidoperoxycapronsäure, N- Nonenylamidoperadipinsäure und N-Nonenylamidopersuccinate, und aliphatische und araliphatische Peroxydicarbonsäuren, wie 1,12-Diperoxycarbonsäure, 1,9- Diperoxyazelainsäure, Diperoxysebacinsäure, Diperoxybrassylsäure, die Diperoxyphthal- säuren, 2-Decyldiperoxybutan-1 ,4-disäure, N,N-Terephthaloyl-di(6-aminopercapron- säure) können eingesetzt werden.
Der Gehalt der Wasch- oder Reinigungsmittel an Bleichmittel kann 1 bis 40 Gew.-% und insbesondere 10 bis 20 Gew.-%, betragen, wobei vorteilhafterweise Perboratmonohydrat oder Percarbonat eingesetzt wird.
Um beim Waschen bei Temperaturen von 60 °C und darunter, und insbesondere bei der Wäschevorbehandlung eine verbesserte Bleichwirkung zu erreichen, können die Mittel auch Bleichaktivatoren enthalten. Als Bleichaktivatoren können Verbindungen, die unter Perhydrolysebedingungen aliphatische Peroxocarbonsäuren mit vorzugsweise 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere 2 bis 4 C-Atomen, und/oder gegebenenfalls substituierte Perbenzoesäure ergeben, eingesetzt werden. Geeignet sind Substanzen, die O- und/oder N-Acylgruppen der genannten C-Atomzahl und/oder gegebenenfalls substituierte Benzoylgruppen tragen. Bevorzugt sind mehrfach acylierte Alkylendiamine, insbesondere Tetraacetylethylendiamin (TAED), acylierte Triazinderivate, insbesondere 1 ,5-Diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1 ,3,5-triazin (DADHT), acylierte Glycolurile, insbesondere 1,3,4,6-Tetraacetylglycoluril (TAGU), N-Acylimide, insbesondere N-Nonanoyl- succinimid (NOSI), acylierte Phenolsulfonate, insbesondere n-Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat (n- beziehungsweise iso-NOBS), acylierte Hydroxycarbonsäuren, wie Triethyl-O-acetylcitrat (TEOC), Carbonsäureanhydride, insbesondere Phthalsäureanhydrid, Isatosäureanhydrid und/oder Bernsteinsäureanhydrid, Carbonsäureamide, wie N-Methyldiacetamid, Glycolid, acylierte mehrwertige Alkohole, insbesondere Triacetin, Ethylenglycoldiacetat, Isopropenylacetat, 2,5- Diacetoxy-2,5-dihydrofuran und die aus den deutschen Patentanmeldungen DE 196 16 693 und DE 196 16 767 bekannten Enolester sowie acetyliert.es Sorbitol und Mannitol beziehungsweise deren in der europäischen Patentanmeldung EP 0 525 239 beschriebene Mischungen (SORMAN), acylierte Zuckerderivate, insbesondere Pentaacetylglucose (PAG), Pentaacetylfructose, Tetraacetylxylose und Octaacetyllactose sowie acetyliertes, gegebenenfalls N-alkyliertes Glucamin beziehungsweise Gluconolacton, Triazol beziehungsweise Triazolderivate und/oder teilchenförmige Caprolactame und/oder Caprolactamderivate, bevorzugt N-acylierte Lactame, beispielsweise N-Benzoylcaprolactam und N-Acetylcaprolactam, die aus den internationalen Patentanmeldungen WO 94/27970, WO 94/28102, WO 94/28103, WO 95/00626, WO 95/14759 und WO 95/17498 bekannt sind. Die aus der deutschen Patentanmeldung DE 196 16 769 bekannten hydrophil substituierten Acylacetale und die in der deutschen Patentanmeldung DE 196 16 770 sowie der internationalen Patentanmeldung WO 95/14075 beschriebenen Acyllactame werden ebenfalls bevorzugt eingesetzt. Auch die aus der deutschen Patentanmeldung DE 4443 177 bekannten Kombinationen konventioneller Bleichaktivatoren können eingesetzt werden. Ebenso können Nitrilderivate wie Cyanopyridine, Nitrilquats, zum Beispiel N-Alkylammonium- acetonitrile, und/oder Cyanamidderivate eingesetzt werden. Bevorzugte Bleichaktivatoren sind Natrium-4-(octanoyloxy)-benzolsulfonat, n-Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat (n- beziehungsweise iso-NOBS), Undecenoyl- oxybenzolsulfonat (UDOBS), Natriumdodecanoyloxybenzolsulfonat (DOBS), Decanoyl- oxybenzoesäure (DOBA, OBC 10) und/oder Dodecanoyloxybenzolsulfonat (OBS 12), sowie N-Methylmorpholinum-acetonitril (MMA). Derartige Bleichaktivatoren können im üblichen Mengenbereich von 0,01 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise in Mengen von 0,1 bis 15 Gew.-%, insbesondere 1 Gew.-% bis 10 Gew.-%, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, enthalten sein.
Zusätzlich zu den konventionellen Bleichaktivatoren oder an deren Stelle können auch sogenannte Bleichkatalysatoren enthalten sein. Bei diesen Stoffen handelt es sich um bleichverstärkende Übergangsmetallsalze beziehungsweise Übergangsmetallkomplexe wie beispielsweise Mn-, Fe-, Co-, Ru - oder Mo-Salenkomplexe oder -carbonylkomplexe. Auch Mn-, Fe-, Co-, Ru-, Mo-, Ti-, V- und Cu-Komplexe mit N-haltigen Tripod-Liganden sowie Co-, Fe-, Cu- und Ru-Amminkomplexe sind als Bleichkatalysatoren geeignet, wobei solche Verbindungen bevorzugt eingesetzt werden, die in der DE 19709284 A1 beschrieben sind.
Erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel enthalten in der Regel einen oder mehrere Builder, insbesondere Zeolithe, Silikate, Carbonate, organische Cobuilder und - wo keine ökologischen Gründe gegen ihren Einsatz sprechen - auch die Phosphate. Letztere sind insbesondere in Reinigungsmitteln für das maschinelle Geschirrspülen bevorzugt einzusetzende Gerüststoffe. Zu nennen sind hier kristalline, schichtförmige Natriumsilicate der allgemeinen Formel
NaMSixO2x+1-yH2O, wobei M Natrium oder Wasserstoff bedeutet, x eine Zahl von 1,6 bis 4, vorzugsweise 1 ,9 bis 4,0 und y eine Zahl von 0 bis 20 ist und bevorzugte Werte für x 2, 3 oder 4 sind. Derartige kristalline Schichtsilicate werden beispielsweise in der europäischen Patentanmeldung EP 164514 beschrieben. Bevorzugte kristalline Schichtsilicate der angegebenen Formel sind solche, in denen M für Natrium steht und x die Werte 2 oder 3 annimmt. Insbesondere sind sowohl ß- als auch δ-Natriumdisilicate
Na2Si2O5-yH2O bevorzugt. Im Handel befinden sich derartige Verbindungen beispielsweise unter der Bezeichnung SKS® (Firma Clariant). So handelt es sich bei
SKS-6® vorwiegend um ein δ-Natriumdisilicat mit der Formel Na2Si2O5 yH2O, bei SKS-7® vorwiegend um das ß-Natriumdisilicat. Durch Reaktion mit Säuren (zum Beispiel Citronensäure oder Kohlensäure) entsteht aus dem δ-Natriumdisilicat Kanemit
NaHSi2O5 yH2O, im Handel unter den Bezeichnungen SKS-9® beziehungsweise SKS- 10® (Firma Clariant). Von Vorteil kann es auch sein, chemische Modifikationen dieser Schichtsilicate einzusetzen. So kann beispielsweise die Alkalität der Schichtsilicate geeignet beeinflußt werden. Mit Phosphat beziehungsweise mit Carbonat dotierte Schichtsilicate weisen im Vergleich zu dem δ-Natriumdisilicat veränderte Kristallmorphologien auf, lösen sich schneller und zeigen im Vergleich zu δ- Natriumdisilicat ein erhöhtes Calciumbindevermögen. So sind Schichtsilicate der allgemeinen Summenformel x Na2O • y SiO2 • z P2O5, in der das Verhältnis x zu y einer Zahl 0,35 bis 0,6, das Verhältnis x zu z einer Zahl von 1 ,75 bis 1200 und das Verhältnis y zu z einer Zahl von 4 bis 2800 entsprechen, in der Patentanmeldung DE 196 01 063 beschrieben. Die Löslichkeit der Schichtsilicate kann auch erhöht werden, indem besonders feinteilige Schichtsilicate eingesetzt werden. Auch Compounds aus den kristallinen Schichtsilicaten mit anderen Inhaltsstoffen können eingesetzt werden. Dabei sind insbesondere Compounds mit Cellulosederivaten, die Vorteile in der desintegrierenden Wirkung aufweisen und insbesondere in Waschmitteltabletten eingesetzt werden, sowie Compounds mit Polycarboxylaten, zum Beispiel Citronensäure, beziehungsweise polymeren Polycarboxylaten, zum Beispiel Copolymeren der Acrylsäure, zu nennen.
Einsetzbar sind auch amorphe Natriumsilikate mit einem Modul Na2O : SiO2 von 1:2 bis 1:3,3, vorzugsweise von 1 :2 bis 1:2,8 und insbesondere von 1:2 bis 1:2,6, welche löseverzögert sind und Sekundärwascheigenschaften aufweisen. Die Löseverzögerung gegenüber herkömmlichen amorphen Natriumsilikaten kann dabei auf verschiedene Weise, beispielsweise durch Oberflächenbehandlung, Compoundierung, Kompaktierung/ Verdichtung oder durch Übertrocknung hervorgerufen worden sein. Im Rahmen dieser Erfindung wird unter dem Begriff "amorph" auch "röntgenamorph" verstanden. Dies heißt, daß die Silikate bei Röntgenbeugungsexperimenten keine scharfen Röntgen- reflexe liefern, wie sie für kristalline Substanzen typisch sind, sondern allenfalls ein oder mehrere Maxima der gestreuten Röntgenstrahlung, die eine Breite von mehreren Gradeinheiten des Beugungswinkels aufweisen. Es kann jedoch sehr wohl sogar zu besonders guten Buildereigenschaften führen, wenn die Silikatpartikel bei Elektronenbeugungsexperimenten verwaschene oder sogar scharfe Beugungsmaxima liefern. Dies ist so zu interpretieren, daß die Produkte mikrokristalline Bereiche der Größe 10 bis einige Hundert nm aufweisen, wobei Werte bis max. 50 nm und insbesondere bis max. 20 nm bevorzugt sind. Insbesondere bevorzugt sind verdichtete/kompaktierte amorphe Silikate, compoundierte amorphe Silikate und übertrocknete röntgenamorphe Silikate.
Ein gegebenenfalls einsetzbarer, feinkristalliner, synthetischer und gebundenes Wasser enthaltender Zeolith ist vorzugsweise Zeolith A und/oder P. Als Zeolith P wird Zeolith MAP® (Handelsprodukt der Firma Crosfield) besonders bevorzugt. Geeignet sind jedoch auch Zeolith X sowie Mischungen aus A, X und/oder P. Kommerziell erhältlich und im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt einsetzbar ist beispielsweise auch ein Co-Kristallisat aus Zeolith X und Zeolith A (ca. 80 Gew.-%> Zeolith X), das von der Firma CONDEA Augusta S.p.A. unter dem Markennamen VEGOBOND AX® vertrieben wird und durch die Formel nNa2O • (1-n)K2O • AI2O3 (2 - 2,5)SiO2 ■ (3,5 - 5,5) H2O
beschrieben werden kann. Geeignete Zeolithe weisen eine mittlere Teilchengröße von weniger als 10 μm (Volumenverteilung; Meßmethode: Coulter Counter) auf und enthalten vorzugsweise 18 bis 22 Gew.-%, insbesondere 20 bis 22 Gew.-% an gebundenem Wasser.
Selbstverständlich ist auch ein Einsatz der allgemein bekannten Phosphate als Buildersubstanzen möglich, sofern ein derartiger Einsatz nicht aus ökologischen Gründen vermieden werden sollte. Unter der Vielzahl der kommerziell erhältlichen Phosphate haben die Alkalimetallphosphate unter besonderer Bevorzugung von Pentanatrium- beziehungsweise Pentakaliumtriphosphat (Natrium- beziehungsweise Kaliumtripolyphosphat) in der Wasch- und Reinigungsmittel-Industrie die größte Bedeutung.
Alkalimetallphosphate ist dabei die summarische Bezeichnung für die Alkalimetall- (insbesondere Natrium- und Kalium-) -Salze der verschiedenen Phosphorsäuren, bei denen man Metaphosphorsäuren (HPO3)n und Orthophosphorsäure H3PO4 neben höhermolekularen Vertretern unterscheiden kann. Die Phosphate vereinen dabei mehrere Vorteile in sich: Sie wirken als Alkaliträger, verhindern Kalkbeläge auf Maschinenteilen beziehungsweise Kalkinkrustationen in Geweben und tragen überdies zur Reinigungsleistung bei.
Natriumdihydrogenphosphat, NaH2PO , existiert als Dihydrat (Dichte 1 ,91 gern"3, Schmelzpunkt 60°) und als Monohydrat (Dichte 2,04 gern"3). Beide Salze sind weiße, in Wasser sehr leicht lösliche Pulver, die beim Erhitzen das Kristallwasser verlieren und bei 200°C in das schwach saure Diphosphat (Dinatriumhydrogendiphosphat, Na2H2P2O7), bei höherer Temperatur in Natiumtrimetaphosphat (Na3P3O9) und Maddrellsches Salz (siehe unten), übergehen. NaH2PO4 reagiert sauer; es entsteht, wenn Phosphorsäure mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und die Maische versprüht wird. Kaliumdihydrogenphosphat (primäres oder einbasiges Kaliumphosphat, Kaliumbiphosphat, KDP), KH2PO4, ist ein weißes Salz der Dichte 2,33 gern"3, hat einen Schmelzpunkt von 253°C [Zersetzung unter Bildung von Kaliumpolyphosphat (KPO3)x] und ist leicht löslich in Wasser.
Dinatriumhydrogenphosphat (sekundäres Natriumphosphat), Na2HPO4, ist ein farbloses, sehr leicht wasserlösliches kristallines Salz. Es existiert wasserfrei und mit 2 Mol. (Dichte 2,066 gern"3, Wasserverlust bei 95°), 7 Mol. (Dichte 1 ,68 gern"3, Schmelzpunkt 48°C unter Verlust von 5 H2O) und 12 Mol. Wasser (Dichte 1,52 gern"3, Schmelzpunkt 35°C unter Verlust von 5 H2O), wird bei 100°C wasserfrei und geht bei stärkerem Erhitzen in das Diphosphat Na4P2O7 über. Dinatriumhydrogenphosphat wird durch Neutralisation von Phosphorsäure mit Sodalösung unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator hergestellt. Dikaliumhydrogenphosphat (sekundäres od. zweibasiges Kaliumphosphat), K2HPO4, ist ein amorphes, weißes Salz, das in Wasser leicht löslich ist. Trinatriumphosphat, tertiäres Natriumphosphat, Na3PO , sind farblose Kristalle, die als Dodecahydrat eine Dichte von 1,62 gern"3 und einen Schmelzpunkt von 73-76°C (Zersetzung), als Decahydrat (entsprechend 19-20% P2O5) einen Schmelzpunkt von 100°C und in wasserfreier Form (entsprechend 39-40% P2O5) eine Dichte von 2,536 gern"3 aufweisen. Trinatriumphosphat ist in Wasser unter Alkalischer Reaktion leicht löslich und wird durch Eindampfen einer Lösung aus genau 1 Mol Dinatriumphosphat und 1 Mol NaOH hergestellt. Trikaliumphosphat (tertiäres oder dreibasiges Kaliumphosphat), K3PO4, ist ein weißes, zerfließliches, körniges Pulver der Dichte 2,56 gern"3, hat einen Schmelzpunkt von 1340° und ist in Wasser mit Alkalischer Reaktion leicht löslich. Es entsteht zum Beispiel beim Erhitzen von Thomasschlacke mit Kohle und Kaliumsulfat. Trotz des höheren Preises werden in der Reinigungsmittel-Industrie die leichter löslichen, daher hochwirksamen, Kaliumphosphate gegenüber entsprechenden Natrium-Verbindungen vielfach bevorzugt.
Tetranatriumdiphosphat (Natriumpyrophosphat), Na4P2O7, existiert in wasserfreier Form (Dichte 2,534 gern"3, Schmelzpunkt 988°C, auch 880°C angegeben) und als Decahydrat (Dichte 1,815-1,836 gern"3, Schmelzpunkt 94°C unter Wasserverlust). Beide Substanzen sind farblose, in Wasser mit Alkalischer Reaktion lösliche Kristalle. Na4P2O7 entsteht beim Erhitzen von Dinatriumphosphat auf >200°C oder indem man Phosphorsäure mit Soda im stöchiometrischem Verhältnis umsetzt und die Lösung durch Versprühen entwässert. Das Decahydrat komplexiert Schwermetall-Salze und Härtebildner und verringert daher die Härte des Wassers. Kaliumdiphosphat (Kaliumpyrophosphat), K P2O7, existiert in Form des Trihydrats und stellt ein farbloses, hygroskopisches Pulver mit der Dichte 2,33 gern"3 dar, das in Wasser löslich ist, wobei der pH-Wert der 1%igen Lösung bei 25°C 10,4 beträgt.
Durch Kondensation des NaH2PO4 beziehungsweise des KH2PO4 entstehen höhermolekulare Natrium- und Kaliumphosphate, bei denen man cyclische Vertreter, die Natrium- beziehungsweise Kaliummetaphosphate und kettenförmige Typen, die Natriumbeziehungsweise Kaliumpolyphosphate, unterscheiden kann. Insbesondere für letztere sind eine Vielzahl von Bezeichnungen in Gebrauch: Schmelz- oder Glühphosphate, Grahamsches Salz, Kurrolsches und Maddrellsches Salz. Alle höheren Natrium- und Kaliumphosphate werden gemeinsam als kondensierte Phosphate bezeichnet. Das technisch wichtige Pentanatriumtriphosphat (Na5P3O10; Natriumtripolyphosphat) ist ein wasserfrei oder mit 6 H2O kristallisierendes, nicht hygroskopisches, weißes, wasserlösliches Salz der allgemeinen Formel NaO-[P(O)(ONa)-O]n-Na mit n=3. In 100 g Wasser lösen sich bei Zimmertemperatur etwa 17 g, bei 60°C ca. 20 g, bei 100°C rund 32 g des kristallwasserfreien Salzes; nach zweistündigem Erhitzen der Lösung auf 100°C entstehen durch Hydrolyse etwa 8% Orthophosphat und 15% Diphosphat. Bei der Herstellung von Pentanatriumtriphosphat wird Phosphorsäure mit Sodalösung oder Natronlauge im stöchiometrischen Verhältnis zur Reaktion gebracht und die Lösung durch Versprühen entwässert. Ähnlich wie Grahamsches Salz und Natriumdiphosphat löst Pentanatriumtriphosphat viele unlösliche Metall-Verbindungen (auch Kalkseifen usw.). Pentakaliumtriphosphat, K5P3Oι0 (Kaliumtripolyphosphat), kommt beispielsweise in Form einer 50 Gew.-%-igen Lösung (> 23% P2O5, 25% K2O) in den Handel. Die Kaliumpolyphosphate finden in der Wasch- und Reinigungsmittel-Industrie breite Verwendung. Weiter existieren auch Natriumkaliumtripolyphosphate, welche ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzbar sind. Diese entstehen beispielsweise, wenn man Natriumtrimetaphosphat mit KOH hydrolysiert:
(NaPO3)3 + 2 KOH -» Na3K2P3O10 + H2O
Diese sind erfindungsgemäß genau wie Natriumtripolyphosphat, Kaliumtripolyphosphat oder Mischungen aus diesen beiden einsetzbar; auch Mischungen aus Natriumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat oder Mischungen aus Kaliumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat oder Gemische aus Natriumtripolyphosphat und Kaliumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat sind erfindungsgemäß einsetzbar.
Als organische Cobuilder können in den erfindungsgemäßen Wasch- und Reinigungsmitteln insbesondere Polycarboxylate oder Polycarbonsäuren, polymere Polycarboxylate, Polyasparaginsäure, Polyacetale, gegebenenfalls oxidierte Dextrine, weitere organische Cobuilder (siehe unten) sowie Phosphonate eingesetzt werden. Diese Stoffklassen werden nachfolgend beschrieben.
Brauchbare organische Gerüstsubstanzen sind beispielsweise die in Form ihrer Natriumsalze einsetzbaren Polycarbonsäuren, wobei unter Polycarbonsäuren solche Carbonsäuren verstanden werden, die mehr als eine Säurefunktion tragen. Beispielsweise sind dies Citronensäure, Adipinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Zuckersäuren, Aminocarbonsäuren, Nitrilotriessigsäure (NTA), sofern ein derartiger Einsatz aus ökologischen Gründen nicht zu vermeiden ist, sowie Mischungen aus diesen. Bevorzugte Salze sind die Salze der Polycarbonsäuren wie Citronensäure, Adipinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Weinsäure, Zuckersäuren und Mischungen aus diesen.
Auch die Säuren an sich können eingesetzt werden. Sie besitzen neben ihrer Builderwirkung typischerweise auch die Eigenschaft einer Säuerungskomponente und dienen somit auch zur Einstellung eines niedrigeren und milderen pH-Wertes von Wasch- oder Reinigungsmitteln, sofern nicht der sich durch die Mischung der übrigen Komponenten ergebende pH-Wert gewünscht ist. Insbesondere sind hierbei System- und umweltverträgliche Säuren wie Citronensäure, Essigsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Glykolsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Gluconsäure und beliebige Mischungen aus diesen zu nennen. Aber auch Mineralsäuren, insbesondere Schwefelsäure oder Basen, insbesondere Ammonium- oder Alkalihydroxide können als pH-Regulatoren dienen. Derartige Regulatoren sind in den erfindungemäßen Mitteln in Mengen von vorzugsweise nicht über 20 Gew.-%, insbesondere von 1 ,2 Gew.-% bis 17 Gew.-%, enthalten.
Als Builder sind weiter polymere Polycarboxylate geeignet, dies sind beispielsweise die Alkalimetallsalze der Polyacrylsäure oder der Polymethacrylsäure, beispielsweise solche mit einer relativen Molekülmasse von 500 bis 70 000 g/mol.
Bei den für polymere Polycarboxylate angegebenen Molmassen handelt es sich im Sinne dieser Schrift um gewichtsmittlere Molmassen Mw der jeweiligen Säureform, die grundsätzlich mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) bestimmt wurden, wobei ein UV-Detektor eingesetzt wurde. Die Messung erfolgte dabei gegen einen externen Polyacrylsäure-Standard, der aufgrund seiner strukturellen Verwandtschaft mit den untersuchten Polymeren realistische Molgewichtswerte liefert. Diese Angaben weichen deutlich von den Molgewichtsangaben ab, bei denen Polystyrolsulfonsäuren als Standard eingesetzt werden. Die gegen Polystyrolsulfonsäuren gemessenen Molmassen sind in der Regel deutlich höher als die in dieser Schrift angegebenen Molmassen. Geeignete Polymere sind insbesondere Polyacrylate, die bevorzugt eine Molekülmasse von 2 000 bis 20000 g/mol aufweisen. Aufgrund ihrer überlegenen Löslichkeit können aus dieser Gruppe wiederum die kurzkettigen Polyacrylate, die Molmassen von 2 000 bis 10 000 g/mol, und besonders bevorzugt von 3 000 bis 5 000 g/mol, aufweisen, bevorzugt sein.
Geeignet sind weiterhin copolymere Polycarboxylate, insbesondere solche der Acryl- säure mit Methacrylsäure und der Acrylsäure oder Methacrylsäure mit Maleinsäure. Als besonders geeignet haben sich Copolymere der Acrylsäure mit Maleinsäure erwiesen, die 50 bis 90 Gew.-% Acrylsäure und 50 bis 10 Gew.-% Maleinsäure enthalten. Ihre relative Molekülmasse, bezogen auf freie Säuren, beträgt im allgemeinen 2 000 bis 70000 g/mol, vorzugsweise 20 000 bis 50 000 g/mol und insbesondere 30000 bis 40 000 g/mol. Die (co-) polymeren Polycarboxylate können entweder als Pulver oder als wässerige Lösung eingesetzt werden. Der Gehalt der Mittel an (co-)polymeren Polycarboxylaten kann von 0,5 bis 20 Gew.-%, insbesondere 1 bis 10 Gew.-%, betragen.
Zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit können die Polymere auch Allylsulfonsäuren, wie beispielsweise Allyloxybenzolsulfonsäure und Methallylsulfonsäure, als Monomer enthalten.
Insbesondere bevorzugt sind auch biologisch abbaubare Polymere aus mehr als zwei verschiedenen Monomereinheiten, beispielsweise solche, die als Monomere Salze der Acrylsäure und der Maleinsäure sowie Vinylalkohol beziehungsweise Vinylalkohol- Derivate oder die als Monomere Salze der Acrylsäure und der 2-Alkylallylsulfonsäure sowie Zucker-Derivate enthalten.
Weitere bevorzugte Copolymere sind solche, die als Monomere vorzugsweise Acrolein und Acrylsäure/Acrylsäuresalze beziehungsweise Acrolein und Vinylacetat aufweisen.
Ebenso sind als weitere bevorzugte Buildersubstanzen polymere Aminodicarbonsäuren, deren Salze oder deren Vorläufersubstanzen zu nennen. Besonders bevorzugt sind Polyasparaginsäuren beziehungsweise deren Salze und Derivate.
Weitere geeignete Buildersubstanzen sind Polyacetale, welche durch Umsetzung von Dialdehyden mit Polyolcarbonsäuren, welche 5 bis 7 C-Atome und mindestens 3 Hydroxylgruppen aufweisen, erhalten werden können. Bevorzugte Polyacetale werden aus Dialdehyden wie Glyoxal, Glutaraldehyd, Terephthalaldehyd sowie deren Gemischen und aus Polyolcarbonsäuren wie Gluconsäure und/oder Glucoheptonsäure erhalten.
Weitere geeignete organische Buildersubstanzen sind Dextrine, beispielsweise Oligomere beziehungsweise Polymere von Kohlenhydraten, die durch partielle Hydrolyse von Stärken erhalten werden können. Die Hydrolyse kann nach üblichen, beispielsweise säure- oder enzym katalysierten Verfahren durchgeführt werden. Vorzugsweise handelt es sich um Hydrolyseprodukte mit mittleren Molmassen im Bereich von 400 bis 500 000 g/mol. Dabei ist ein Polysaccharid mit einem Dextrose-Äquivalent (DE) im Bereich von 0,5 bis 40, insbesondere von 2 bis 30 bevorzugt, wobei DE ein gebräuchliches Maß für die reduzierende Wirkung eines Polysaccharids im Vergleich zu Dextrose ist, welche ein DE von 100 besitzt. Brauchbar sind sowohl Maltodextrine mit einem DE zwischen 3 und 20 und Trockenglucosesirupe mit einem DE zwischen 20 und 37 als auch sogenannte Gelbdextrine und Weißdextrine mit höheren Molmassen im Bereich von 2 000 bis 30 000 g/mol.
Bei den oxidierten Derivaten derartiger Dextrine handelt es sich um deren Umsetzungsprodukte mit Oxidationsmitteln, welche in der Lage sind, mindestens eine Alkoholfunktion des Saccharidrings zur Carbonsäurefunktion zu oxidieren. Besonders bevorzugte organische Builder für erfindungsgemäße Mittel sind oxidierte Stärken, beziehungsweise deren Derivate aus den Anmeldungen EP 472042, WO 97/25399, und EP 755944.
Auch Oxydisuccinate und andere Derivate von Disuccinaten, vorzugsweise Ethylendiamindisuccinat, sind weitere geeignete Cobuilder. Dabei wird Ethylendiamin- N,N'-disuccinat (EDDS) bevorzugt in Form seiner Natrium- oder Magnesiumsalze verwendet. Weiterhin bevorzugt sind in diesem Zusammenhang auch Glycerindisuccinate und Glycerintrisuccinate. Geeignete Einsatzmengen liegen in zeolith-, carbonat- und/oder silicathaltigen Formulierungen zwischen 3 und 15 Gew.-%.
Weitere brauchbare organische Cobuilder sind beispielsweise acetylierte Hydroxycarbonsäuren beziehungsweise deren Salze, welche gegebenenfalls auch in Lactonform vorliegen können und welche mindestens 4 Kohlenstoffatome und mindestens eine Hydroxygruppe sowie maximal zwei Säuregruppen enthalten. Eine weitere Substanzklasse mit Cobuildereigenschaften stellen die Phosphonate dar. Dabei handelt es sich insbesondere um Hydroxyalkan- beziehungsweise Aminoalkanphosphonate. Unter den Hydroxyalkanphosphonaten ist das 1- Hydroxyethan-1,1-diphosphonat (HEDP) von besonderer Bedeutung als Cobuilder. Es wird vorzugsweise als Natriumsalz eingesetzt, wobei das Dinatriumsalz neutral und das Tetranatriumsalz alkalisch (pH 9) reagiert. Als Aminoalkanphosphonate kommen vorzugsweise Ethylendiamintetramethylenphosphonat (EDTMP), Diethylentriamin- pentamethylenphosphonat (DTPMP) sowie deren höhere Homologe in Frage. Sie werden vorzugsweise in Form der neutral reagierenden Natriumsalze, z. B. als Hexanatriumsalz der EDTMP beziehungsweise als Hepta- und Octa-Natriumsalz der DTPMP, eingesetzt. Als Builder wird dabei aus der Klasse der Phosphonate bevorzugt HEDP verwendet. Die Aminoalkanphosphonate besitzen zudem ein ausgeprägtes Schwermetallbindevermögen. Dementsprechend kann es, insbesondere wenn die Mittel auch Bleiche enthalten, bevorzugt sein, Aminoalkanphosphonate, insbesondere DTPMP, einzusetzen, oder Mischungen aus den genannten Phosphonaten zu verwenden.
Darüberhinaus können alle Verbindungen, die in der Lage sind, Komplexe mit Erdalkaliionen auszubilden, als Cobuilder eingesetzt werden.
Buildersubstanzen können in den erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmitteln gegebenenfalls in Mengen bis zu 90 Gew.-% enthalten sein. Sie sind vorzugsweise in Mengen bis zu 75 Gew.-% enthalten. Erfindungsgemäße Waschmittel weisen Buildergehalte von insbesondere 5 Gew.-%> bis 50 Gew.-% auf. In erfindungsgemäßen Mitteln für die Reinigung harter Oberflächen, insbesondere zur maschinellen Reinigung von Geschirr, beträgt der Gehalt an Buildersubstanzen insbesondere 5 Gew.-% bis 88 Gew.-%, wobei in derartigen Mitteln vorzugsweise keine wasserunlöslichen Buildermaterialien eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel zur insbesondere maschinellen Reinigung von Geschirr sind 20 Gew.-% bis 40 Gew.-%o wasserlöslicher organischer Builder, insbesondere Alkalicitrat, 5 Gew.-% bis 15 Gew.-% Alkalicarbonat und 20 Gew.-% bis 40 Gew.-% Alkalidisilikat enthalten.
Lösungsmittel, die in den flüssigen bis gelförmigen Zusammensetzungen von Wasch- und Reinigungsmitteln eingesetzt werden können, stammen beispielsweise aus der Gruppe ein- oder mehrwertigen Alkohole, Alkanolamine oder Glycolether, sofern sie im angegebenen Konzentrationsbereich mit Wasser mischbar sind. Vorzugsweise werden die Lösungsmittel ausgewählt aus Ethanol, n- oder i-Propanol, Butanolen, Ethylenglykolmethylether, Ethylenglykolethylether, Ethylenglykolpropylether, Ethylenglykolmono-n-butylether, Diethylenglykol-methylether, Diethylenglykolethylether, Propylenglykolmethyl-, -ethyl- oder -propyl-ether, Dipropylenglykolmonomethyl-, oder -ethylether, Di-isopropylenglykolmonomethyl-, oder -ethylether, Methoxy-, Ethoxy- oder Butoxytriglykol, 1-Butoxyethoxy-2-propanol, 3-Methyl-3-methoxybutanol, Propylen-glykol- t-butylether sowie Mischungen dieser Lösungsmittel.
Lösungsmittel können in den erfindungsgemäßen flüssigen bis gelförmigen Wasch- und Reinigungsmitteln in Mengen zwischen 0,1 und 20 Gew.-%, bevorzugt aber unter 15 Gew.-% und insbesondere unterhalb von 10 Gew.-% eingesetzt werden.
Zur Einstellung der Viskosität können der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ein oder mehrere Verdicker, beziehungsweise Verdickungssysteme zugesetzt werden. Diese hochmolekularen Stoffe, die auch Quell(ungs)mittel genannt werden, saugen meist die Flüssigkeiten auf und quellen dabei auf, um schließlich in zähflüssige echte oder kolloide Lösungen überzugehen.
Geeignete Verdicker sind anorganische oder polymere organische Verbindungen. Zu den anorganischen Verdickern zählen beispielsweise Polykieselsäuren, Tonmineralien wie Montmorillonite, Zeolithe, Kieselsäuern und Bentonite. Die organischen Verdicker stammen aus den Gruppen der natürlichen Polymere, der abgewandelten natürlichen Polymere und der vollsynthetischen Polymere. Solche aus der Natur stammenden Polymere sind beispielsweise Agar-Agar, Carrageen, Tragant, Gummi arabicum, Alginate, Pektine, Polyosen, Guar-Mehl, Johannisbrotbaumkernmehl, Stärke, Dextrine, Gelatine und Casein. Abgewandelte Naturstoffe, die als Verdicker verwendet werden, stammen vor allem aus der Gruppe der modifizierten Stärken und Cellulosen. Beispielhaft seien hier Carboxymethylcellulose und andere Celluloseether, Hydroxyethyl- und -propylcellulose sowie Kernmehlether genannt. Vollsynthetische Verdicker sind Polymere wie Polyacryl- und Polymethacryl-Verbindungen, Vinylpolymere, Polycarbonsäuren, Polyether, Polyimine, Polyamide und Polyurethane. Die Verdicker können in einer Menge bis zu 5 Gew.-%, vorzugsweise von 0,05 bis 2 Gew.-%>, und besonders bevorzugt von 0,1 bis 1,5 Gew.-%>, bezogen auf die fertige Zusammensetzung, enthalten sein.
Das erfindungsgemäße Wasch- und Reinigungsmittel kann gegebenenfalls als weitere übliche Inhaltsstoffe Sequestrierungsmittel, Elektrolyte und weitere Hilfsstoffe, wie optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Silberkorrosionsinhibitoren, Farbüber- tragungsinhibitoren, Schauminhibitoren, Abrasivstoffe, Färb- und/oder Duftstoffe, sowie mikrobielle Wirkstoffe, UV-Absorbenzien und/oder Enzymstabilisatoren enthalten.
Erfindungsgemäße Textilwaschmittel können als optische Aufheller Derivate der Diaminostilbendisulfonsäure beziehungsweise deren Alkalimetallsalze enthalten. Geeignet sind zum Beispiel Salze der 4,4'-Bis(2-anilino-4-morpholino-1 ,3,5-triazinyl-6- amino)stilben-2,2'-disulfonsäure oder gleichartig aufgebaute Verbindungen, die anstelle der Morpholino-Gruppe eine Diethanolaminogruppe, eine Methylaminogruppe, eine Anilinogruppe oder eine 2-Methoxyethylaminogruppe tragen. Weiterhin können Aufheller vom Typ der substituierten Diphenylstyryle anwesend sein, zum Beispiel die Alkalisalze des 4,4'-Bis(2-sulfostyryl)-diphenyls, 4,4'-Bis(4-chlor-3-sulfostyryl)-diphenyls, oder 4-(4- Chlorstyryl)-4'-(2-sulfostyryl)-diphenyls. Auch Gemische der vorgenannten optischen Aufheller können verwendet werden.
Vergrauungsinhibitoren haben die Aufgabe, den von der Textilfaser abgelösten Schmutz in der Flotte suspendiert zu halten. Hierzu sind wasserlösliche Kolloide meist organischer Natur geeignet, beispielsweise Stärke, Leim, Gelatine, Salze von Ethercarbonsäuren oder Ethersulfonsäuren der Stärke oder der Cellulose oder Salze von sauren Schwefelsäureestern der Cellulose oder der Stärke. Auch wasserlösliche, saure Gruppen enthaltende Polyamide sind für diesen Zweck geeignet. Weiterhin lassen sich andere als die obengenannten Stärkederivate verwenden, zum Beispiel Aldehydstärken. Bevorzugt werden Celluloseether, wie Carboxymethylcellulose (Na-Salz), Methylcellulose, Hydroxyalkylcellulose und Mischether, wie Methylhydroxyethylcellulose, Methylhydroxy- propylcellulose, Methylcarboxymethylcellulose und deren Gemische, beispielsweise in Mengen von 0,1 bis 5 Gew.-%, bezogen auf die Mittel, eingesetzt.
Um einen Silberkorrosionsschutz zu bewirken, können in erfindungsgemäßen Reinigungsmitteln für Geschirr Silberkorrosionsinhibitoren eingesetzt werden. Solche sind aus dem Stand der Technik bekannt, beispielsweise Benzotriazole, Eisen(lll)-chlorid oder CoSO . Wie beispielsweise aus der europäischen Patentschrift EP 0736 084 B1 bekannt ist, sind für die gemeinsame Verwendung mit Enzymen besonders geeignete Silberkorrosionsinhibitoren Mangan-, Titan-, Zirkonium-, Hafnium-, Vanadium-, Cobalt- oder Cersalze und/oder -komplexe, in denen die genannten Metalle in einer der Oxidationsstufen II, III, IV, V oder VI vorliegen. Beispiele für derartige Verbindungen sind MnSO4, V2O5, V2O4, VO2, TiOSO4, K2TiF6, K2ZrF6, Co(NO3)2, Co(NO3)3, sowie deren Gemische.
"Soil-Release"-Wirkstoffe oder "Soil-Repellents" sind zumeist Polymere, die bei der Verwendung in einem Waschmittel der Wäschefaser schmutzabstoßende Eigenschaften verleihen und/oder das Schmutzablösevermögen der übrigen Waschmittelbestandteile unterstützen. Ein vergleichbarer Effekt kann auch bei deren Einsatz in Reinigungsmitteln für harte Oberflächen beobachtet werden.
Besonders wirksame und seit langer Zeit bekannte Soil-Release-Wirkstoffe sind Copolyester mit Dicarbonsäure-, Alkylenglykol- und Polyalkylenglykoleinheiten. Beispiele dafür sind Copolymere oder Mischpolymere aus Polyethylenterephthalat und Polyoxyethylenglykol (DT 16 17 141, beziehungsweise DT 22 00 911). In der deutschen Offenlegungsschrift DT 22 53 063 sind saure Mittel genannt, die unter anderem ein Copolymer aus einer dibasigen Carbonsäure und einem Alkylen- oder Cycloalkylenpolyglykol enthalten. Polymere aus Ethylenterephthalat und Polyethylenoxid-terephthalat und deren Einsatz in Waschmitteln sind in den deutschen Schriften DE 28 57 292 und DE 33 24 258 und der Europäischen Patentschrift EP 0253 567 beschrieben. Das europäische Patent EP 066944 betrifft Mittel, die einen Copolyester aus Ethylenglykol, Polyethylenglykol, aromatischer Dicarbonsäure und sulfonierter aromatischer Dicarbonsäure in bestimmten Molverhältnissen enthalten. Aus dem europäischen Patent EP 0 185427 sind Methyl- oder Ethylgruppen- endverschlossene Polyester mit Ethylen- und/oder Propylen-terephthalat- und Polyethylenoxid-terephthalat-Einheiten und Waschmitel, die derartiges Soil-release- Polymer enthalten, bekannt. Das europäische Patent EP 0 241 984 betrifft einen Polyester, der neben Oxyethylen-Gruppen und Terephthalsäureeinheiten auch substituierte Ethyleneinheiten sowie Glycerineinheiten enthält. Aus dem europäischen Patent EP 0 241 985 sind Polyester bekannt, die neben Oxyethylen-Gruppen und Terephthalsäureeinheiten 1 ,2-Propylen-, 1,2-Butylen- und/oder 3-Methoxy-1 ,2- propylengruppen sowie Glycerineinheiten enthalten und mit C bis C -Alkylgruppen endgruppenverschlossen sind. Aus der europäischen Patentanmeldung EP 0 272 033 sind zumindest anteilig durch C^-Alkyl- oder Acylreste endgruppenverschlossene Polyester mit Poly-propylenterephthalat- und Polyoxyethylenterephthalat-Einheiten bekannt. Das europäische Patent EP 0 274 907 beschreibt sulfoethyl- endgruppenverschlossene terephthalathaltige Soil-release-Polyester. Gemäß der europäischen Patentanmeldung EP 0 357280 werden durch Sulfonierung ungesättigter Endgruppen Soil-Release-Polyester mit Terephthalat-, Alkylenglykol- und Poly-C2. - Glykol-Einheiten hergestellt. Die internationale Patentanmeldung WO 95/32232 betrifft saure, aromatische schmutzablösevermögende Polyester. Aus der internationalen Patentanmeldung WO 97/31085 sind nicht polymere soil-repellent-Wirkstoffe für Materialien aus Baumwolle mit mehreren funktioneilen Einheiten bekannt: Eine erste Einheit, die beispielsweise kationisch sein kann, ist zur Adsorption auf die Baumwolloberfläche durch elektrostatische Wechselwirkung befähigt, und eine zweite Einheit, die hydrophob ausgebildet ist, ist verantwortlich für das Verbleiben des Wirkstoffs an der Wasser/ Baumwolle-Grenzfläche.
Zu den für den Einsatz in erfindungsgemäßen Textilwaschmitteln in Frage kommenden Farbübertragungsinhibitoren gehören insbesondere Polyvinylpyrrolidone, Polyvinyl- imidazole, polymere N-Oxide wie Poly-(vinylpyridin-N-oxid) und Copolymere von Vinyl- pyrrolidon mit Vinylimidazol.
Beim Einsatz in maschinellen Reinigungsverfahren kann es von Vorteil sein, den betreffenden Mitteln Schauminhibitoren zuzusetzen. Als Schauminhibitoren eignen sich beispielsweise Seifen natürlicher oder synthetischer Herkunft, die einen hohen Anteil an C18-C24-Fettsäuren aufweisen. Geeignete nichttensidartige Schauminhibitoren sind beispielsweise Organopolysiloxane und deren Gemische mit mikrofeiner, gegebenenfalls signierter Kieselsäure sowie Paraffine, Wachse, Mikrokristallinwachse und deren Gemische mit signierter Kieselsäure oder Bistearylethylendiamid. Mit Vorteilen werden auch Gemische aus verschiedenen Schauminhibitoren verwendet, zum Beispiel solche aus Silikonen, Paraffinen oder Wachsen. Vorzugsweise sind die Schauminhibitoren, insbesondere Silikon- und/oder Paraffin-haltige Schauminhibitoren, an eine granuläre, in Wasser lösliche, beziehungsweise dispergierbare Trägersubstanz gebunden. Insbesondere sind dabei Mischungen aus Paraffinen und Bistearylethylendiamiden bevorzugt. Ein erfindungsgemäßes Reinigungsmittel für harte Oberflächen kann darüber hinaus abrasiv wirkende Bestandteile, insbesondere aus der Gruppe umfassend Quarzmehle, Holzmehle, Kunststoffmehle, Kreiden und Mikroglaskugeln sowie deren Gemische, enthalten. Abrasivstoffe sind in den erfindungsgemäßen Reinigungsmitteln vorzugsweise nicht über 20 Gew.-%>, insbesondere von 5 Gew.-% bis 15 Gew.-%, enthalten.
Färb- und Duftstoffe werden Wasch- und Reinigungsmitteln zugesetzt, um den ästhetischen Eindruck der Produkte zu verbessern und dem Verbraucher neben der Wasch- und Reinigungsleistung ein visuell und sensorisch "typisches und unverwechselbares" Produkt zur Verfügung zu stellen. Als Parfümöle beziehungsweise Duftstoffe können einzelne Riechstoffverbindungen, zum Beispiel die synthetischen Produkte vom Typ der Ester, Ether, Aldehyde, Ketone, Alkohole und Kohlenwasserstoffe verwendet werden. Riechstoffverbindungen vom Typ der Ester sind zum Beispiel Benzylacetat, Phenoxyethylisobutyrat, p-tert.-Butylcyclohexylacetat, Linalylacetat, Dimethylbenzyl-carbinylacetat, Phenylethylacetat, Linalylbenzoat, Benzylformiat, Ethylmethylphenyl-glycinat, Allylcyclohexylpropionat, Styrallylpropionat und Benzylsalicylat. Zu den Ethern zählen beispielsweise Benzylethylether, zu den Aldehyden zum Beispiel die linearen Alkanale mit 8-18 C-Atomen, Citral, Citronellal, Citronellyloxyacetaldehyd, Cyclamenaldehyd, Hydroxycitronellal, Lilial und Bourgeonal, zu den Ketonen zum Beispiel die Jonone, -lsomethylionon und Methyl-cedrylketon, zu den Alkoholen Anethol, Citronellol, Eugenol, Geraniol, Linalool, Phenylethylalkohol und Terpineol, zu den Kohlenwasserstoffen gehören hauptsächlich die Terpene wie Limonen und Pinen. Bevorzugt werden jedoch Mischungen verschiedener Riechstoffe verwendet, die gemeinsam eine ansprechende Duftnote erzeugen. Solche Parfümöle können auch natürliche Riechstoffgemische enthalten, wie sie aus pflanzlichen Quellen zugänglich sind, zum Beispiel Pine-, Citrus-, Jasmin-, Patchouly-, Rosen- oder Ylang-Ylang-Öl. Ebenfalls geeignet sind Muskateller, Salbeiöl, Kamillenöl, Nelkenöl, Melissenöl, Minzöl, Zimtblätteröl, Lindenblütenöl, Wacholderbeeröl, Vetiveröl, Olibanumöl, Galbanumöl und Labdanumöl sowie Orangenblütenöl, Neroliol, Orangenschalenöl und Sandelholzöl. Üblicherweise liegt der Gehalt von Wasch- und Reinigungsmitteln an Farbstoffen unter 0,01 Gew.-%, während Duftstoffe bis zu 2 Gew.-% der gesamten Formulierung ausmachen können.
Die Duftstoffe können direkt in die Wasch- oder Reinigungsmittel eingearbeitet werden, es kann aber auch vorteilhaft sein, die Duftstoffe auf Träger aufzubringen, die die Haftung des Parfüms auf dem Reinigungsgut verstärken und durch eine langsamere Duftfreisetzung für langanhaltenden Duft, insbesondere von behandelten Textilien sorgen. Als solche Trägermaterialien haben sich beispielsweise Cyclodextrine bewährt, wobei die Cyclodextrin-Parfüm-Komplexe zusätzlich noch mit weiteren Hilfsstoffen beschichtet werden können. Ein weiter bevorzugter Träger für Duftstoffe ist der beschriebene Zeolith X, der anstelle von oder in Mischung mit Tensiden auch Duftstoffe aufnehmen kann. Bevorzugt sind daher Wasch- und Reinigungsmittel, die den beschriebenen Zeolith X und Duftstoffe, die vorzugsweise zumindest teilweise an dem Zeolithen absorbiert sind, enthalten.
Bevorzugte Farbstoffe, deren Auswahl dem Fachmann keinerlei Schwierigkeit bereitet, besitzen eine hohe Lagerstabilität und Unempfindlichkeit gegenüber den übrigen Inhaltsstoffen der Mittel und gegen Licht sowie keine ausgeprägte Substantivität gegenüber Textilfasern, um diese nicht anzufärben.
Zur Bekämpfung von Mikroorganismen können Wasch- oder Reinigungsmittel antimikrobielle Wirkstoffe enthalten. Hierbei unterscheidet man je nach antimikrobiellem Spektrum und Wirkungsmechanismus zwischen Bakteriostatika und Bakteriziden, Fungistatika und Fungiziden usw. Wichtige Stoffe aus diesen Gruppen sind beispielsweise Benzalkoniumchloride, Alkylarylsulfonate, Halogenphenole und Phenolmercuriacetat. Die Begriffe antimikrobielle Wirkung und antimikrobieller Wirkstoff haben im Rahmen der erfindungsgemäßen Lehre die fachübliche Bedeutung, die beispielsweise von K. H. Wallhäußer in „Praxis der Sterilisation, Desinfektion - Konservierung : Keimidentifizierung - Betriebshygiene" (5. Aufl. - Stuttgart; New York : Thieme, 1995) wiedergegeben wird, wobei alle dort beschriebenen Substanzen mit antimikrobieller Wirkung eingesetzt werden können. Geeignete antimikrobielle Wirkstoffe sind vorzugsweise ausgewählt aus den Gruppen der Alkohole, Amine, Aldehyde, antimikrobiellen Säuren beziehungsweise deren Salze, Carbonsäureester, Säureamide, Phenole, Phenolderivate, Diphenyle, Diphenylalkane, Harnstoffderivate, Sauerstoff-, Stickstoff-acetale sowie -formale, Benzamidine, Isothiazoline, Phthalimidderivate, Pyri- dinderivate, antimikrobiellen oberflächenaktiven Verbindungen, Guanidine, antimikrobiellen amphoteren Verbindungen, Chinoline, 1,2-Dibrom-2,4-dicyanobutan, lodo-2- propyl-butyl-carbamat, lod, lodophore, Peroxoverbindungen, Halogenverbindungen sowie beliebigen Gemischen der voranstehenden. Der antimikrobielle Wirkstoff kann dabei ausgewählt sein aus Ethanol, n-Propanol, i- Propanol, 1,3-Butandiol, Phenoxyethanol, 1,2-Propylenglykol, Glycerin, Undecylensäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Dihydracetsäure, o-Phenylphenol, N-Methylmorpholin- acetonitril (MMA), 2-Benzyl-4-chlorphenol, 2,2'-Methylen-bis-(6-brom-4-chlorphenol), 4,4'-Dichlor-2'-hydroxydiphenylether (Dichlosan), 2,4,4'-Trichlor-2'-hydroxydiphenylether (Trichlosan), Chlorhexidin, N-(4-Chlorphenyl)-N-(3,4-dichlorphenyl)-harnstoff, N,N'-(1 ,10- decan-diyldi-1-pyridinyl-4-yliden)-bis-(1-octanamin)-dihydrochlorid, N,N'-Bis-(4-chlorphe- nyl)-3,12-diimino-2,4,11,13-tetraaza-tetradecandiimidamid, Glucoprotaminen, antimikrobiellen oberflächenaktiven quaternären Verbindungen, Guanidinen einschl. den Bi- und Polyguanidinen, wie beispielsweise 1,6-Bis-(2~ethylhexyl-biguanido-hexan)- dihydrochlorid, 1 ,6-Di-(Nι,N1'-phenyldiguanido-N5,N5')-hexan-tetrahydochlorid, 1,6-Di- (Ni.Ni'-phenyl-Ni.Nrmethyldiguanido-Ns^e'J-hexan-dihydrochlorid, 1 ,6-Di-(N1,N1'-o- chlorophenyldiguanido- N5,N5')-hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N1,N1'-2,6- dichlorophenyldiguanido-N5,N5')hexan-dihydrochlorid, 1 ,6-Di-[N1,N1'-beta-(p- methoxyphenyl) diguanido-N5,N5']-hexane-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N1,N1'-alpha-methyl- .beta.-phenyldiguanido-N5,N5')-hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N1,Nι'-p- nitrophenyldiguanido-N5,N5')hexan-dihydrochlorid, omega:omega-Di-( Ni.Ni'- phenyldiguanido-N5,N5')-di-n-propylether-dihydrochlorid, omega:omega'-Di-(N1,Nι'-p- chlorophenyldiguanido-N5,N5')-di-n-propylether-tetrahydrochlorid, 1,6-Di-(N1,N1'-2,4- dichlorophenyldiguanido-N5,N5')hexan-tetrahydrochlorid, 1 ,6-Di-(Nι,Nι'-p- methylphenyldiguanido- N5,N5')hexan-dihydrochlorid,
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trichlorophenyldiguanido-N5,N5')hexan-tetrahydrochlorid, 1 ,6-Di-[Nι,N1'-alpha-(p- chlorophenyl) ethyldiguanido-N5,N5'] hexan-dihydrochlorid, omega:omega-Di-(N1,Nι'-p- chlorophenyldiguanido-N5,N5')m-xylene-dihydrochlorid, 1,12-Di-(N1,N1'-p- chlorophenyldiguanido-N5,N5') dodecan-dihydrochlorid, 1 ,10-Di-(N ,N1'-phenyldiguanido- N5,N5')-decan-tetrahydrochlorid, ^^^^(N^NT'-phenyldiguanido- N5,N5') dodecan- tetrahydrochlorid, l^-Di^Ni.Ni'-o-chlorophenyldiguanido- N5,N5') hexan-dihydrochlorid, 1 ,6-Di-(Nι,Nι'-o-chlorophenyldiguanido- N5,N5') hexan-tetrahydrochlorid, Ethylen-bis-(1- tolyl biguanid), Ethylen-bis-(p-tolyl biguanide), Ethylen-bis-(3,5-dimethylphenylbiguanid), Ethylen-bis-(p-tert-amylphenylbiguanid), Ethylen-bis-(nonylphenylbiguanid), Ethylen-bis- (phenylbiguanid), Ethylen-bis-(N-butylphenylbiguanid), Ethylen-bis (2,5- diethoxyphenylbiguanid), Ethylen-bis (2,4-dimethylphenyl biguanid), Ethylen-bis (o- diphenylbiguanid), Ethylen-bis (mixed amyl naphthylbiguanid), N-Butyl-ethylen-bis- (phenylbiguanid), Trimethylen bis (o-tolylbiguanid), N-Butyl-trimethyle- bis-(phenyl biguanide) und die entsprechenden Salze wie Acetate, Gluconate, Hydrochloride, Hydrobromide, Citrate, Bisulfite, Fluoride, Polymaleate, N-Cocosalkylsarcosinate, Phosphite, Hypophosphite, Perfluorooctanoate, Silicate, Sorbate, Salicylate, Maleate, Tartrate, Fumarate, Ethylendiamintetraacetate, Iminodiacetate, Cinnamate, Thiocyanate, Arginate, Pyromellitate, Tetracarboxybutyrate, Benzoate, Glutarate, Monofluorphosphate, Perfluorpropionate sowie beliebige Mischungen davon. Weiterhin eignen sich halogenierte Xylol- und Kresolderivate, wie p-Chlormetakresol oder p-Chlor- meta-xylol, sowie natürliche antimikrobielle Wirkstoffe pflanzlicher Herkunft (zum Beispiel aus Gewürzen oder Kräutern), tierischer sowie mikrobieller Herkunft. Vorzugsweise können antimikrobiell wirkende oberflächenaktive quaternäre Verbindungen, ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff pflanzlicher Herkunft und/oder ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff tierischer Herkunft, äußerst bevorzugt mindestens ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff pflanzlicher Herkunft aus der Gruppe, umfassend Coffein, Theobromin und Theophyllin sowie etherische Öle wie Eugenol, Thymol und Geraniol, und/oder mindestens ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff tierischer Herkunft aus der Gruppe, umfassend Enzyme wie Eiweiß aus Milch, Lysozym und Lactoperoxidase, und/oder mindestens eine antimikrobiell wirkende oberflächenaktive quaternäre Verbindung mit einer Ammonium-, Sulfonium-, Phosphonium-, lodonium- oder Arsoniumgruppe, Peroxoverbindungen und Chlorverbindungen eingesetzt werden. Auch Stoffe mikrobieller Herkunft, sogenannte Bakteriozine, können eingesetzt werden.
Die als antimikrobielle Wirkstoffe geeigneten quaternären Ammoniumverbindungen (QAV) weisen die allgemeine Formel (R1)(R2)(R3)(R4) N+ X" auf, in der R1 bis R4 gleiche oder verschiedene C C22-Alkylreste, C7-C28-Aralkylreste oder heterozyklische Reste, wobei zwei oder im Falle einer aromatischen Einbindung wie im Pyridin sogar drei Reste gemeinsam mit dem Stickstoffatom den Heterozyklus, zum Beispiel eine Pyridinium- oder Imidazoliniumverbindung, bilden, darstellen und X" Halogenidionen, Sulfationen, Hydroxidionen oder ähnliche Anionen sind. Für eine optimale antimikrobielle Wirkung weist vorzugsweise wenigstens einer der Reste eine Kettenlänge von 8 bis 18, insbesondere12 bis 16, C-Atomen auf.
QAV sind durch Umsetzung tertiärer Amine mit Alkylierungsmitteln, wie zum Beispiel Methylchlorid, Benzylchlorid, Dimethylsulfat, Dodecylbromid, aber auch Ethylenoxid herstellbar. Die Alkylierung von tertiären Aminen mit einem langen Alkyl-Rest und zwei Methyl-Gruppen gelingt besonders leicht, auch die Quaternierung von tertiären Aminen mit zwei langen Resten und einer Methyl-Gruppe kann mit Hilfe von Methylchlorid unter milden Bedingungen durchgeführt werden. Amine, die über drei lange Alkyl-Reste oder Hydroxy-substituierte Alkyl-Reste verfügen, sind wenig reaktiv und werden bevorzugt mit Dimethylsulfat quaterniert.
Geeignete QAV sind beispielweise Benzalkoniumchlorid (N-Alkyl-N,N-dimethyl-benzyl- ammoniumchlorid, CAS No. 8001-54-5), Benzalkon B (m,p-Dichlorbenzyl-dimethyl-C12- alkylammoniumchlorid, CAS No. 58390-78-6), Benzoxoniumchlorid (Benzyl-dodecyl-bis- (2-hydroxyethyl)-ammonium-chlorid), Cetrimoniumbromid (N-Hexadecyl-N,N-trimethyl- ammoniumbromid, CAS No. 57-09-0), Benzetoniumchlorid (N,N-Dimethyl-N-[2-[2-[p- (1 ,1 ,3,3-tetramethylbutyl)-pheno-xy]ethoxy]ethyl]-benzylammoniumchlorid, CAS No. 121- 54-0), Dialkyldimethylammonium-chloride wie Di-n-decyl-dimethyl-ammoniumchlorid (CAS No. 7173-51-5-5), Didecyldi-methylam oniumbromid (CAS No. 2390-68-3), Dioctyl-dimethyl-ammoniumchloric, 1-Cetylpyridiniumchlorid (CAS No. 123-03-5) und Thiazoliniodid (CAS No. 15764-48-1) sowie deren Mischungen. Besonders bevorzugte QAV sind die Benzalkoniumchloride mit C8-Cι8-Alkylresten, insbesondere C12-C1 -Aklyl- benzyl-dimethyl-ammoniumchlorid.
Benzalkoniumhalogenide und/oder substituierte Benzalkoniumhalogenide sind beispielsweise kommerziell erhältlich als Barquat® ex Lonza, Marquat® ex Mason, Variquat® ex Witco/ Sherex und Hyamine® ex Lonza, sowie Bardac® ex Lonza. Weitere kommerziell erhältliche antimikrobielle Wirkstoffe sind N-(3-Chlorallyl)-hexaminiumchlorid wie Dowicide® und Dowicil® ex Dow, Benzethoniumchlorid wie Hyamine® 1622 ex Rohm & Haas, Methylbenzethoniumchlorid wie Hyamine® 10X ex Rohm & Haas, Cetylpyridiniumchlorid wie Cepacolchlorid ex Merrell Labs.
Die antimikrobiellen Wirkstoffe werden in Mengen von 0,0001 Gew.-% bis 1 Gew.-%, bevorzugt von 0,001 Gew.-% bis 0,8 Gew.-%, besonders bevorzugt von 0,005 Gew.-% bis 0,3 Gew.-% und insbesondere von 0,01 bis 0,2 Gew.-%> eingesetzt.
Die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel können UV-Absorbenzien (UV- Absorber) enthalten, die auf die behandelten Textilien aufziehen und die Lichtbeständigkeit der Fasern und/oder die Lichtbeständigkeit sonstiger Rezepturbestandteile verbessern. Unter UV-Absorber sind organische Substanzen (Lichtschutzfilter) zu verstehen, die in der Lage sind, ultraviolette Strahlen zu absorbieren und die aufgenommene Energie in Form längerwelliger Strahlung, zum Beispiel Wärme wieder abzugeben.
Verbindungen, die diese gewünschten Eigenschaften aufweisen, sind beispielsweise die durch strahlungslose Desaktivierung wirksamen Verbindungen und Derivate des Benzophenons mit Substituenten in 2- und/oder 4-Stellung. Weiterhin sind auch substituierte Benzotriazole, in 3-Stellung Phenylsubstituierte Acrylate (Zimtsäurederivate, gegebenenfalls mit Cyanogruppen in 2-Stellung), Salicylate, organische Ni-Komplexe sowie Naturstoffe wie Umbelliferon und die körpereigene Urocansäure geeignet. Besondere Bedeutung haben Biphenyl- und vor allem Stilbenderivate wie sie beispielsweise in der EP 0728749 A beschrieben werden und kommerziell als Tinosorb® FD oder Tinosorb® FR ex Ciba erhältlich sind. Als UV-B-Absorber sind zu nennen: 3- Benzylidencampher beziehungsweise 3-Benzylidennorcampher und dessen Derivate, zum Beispiel 3-(4-Methylbenzyliden)campher, wie in der EP 0693471 B1 beschrieben; 4- Aminobenzoesäurederivate, vorzugsweise 4-(Dimethylamino)benzoesäure-2- ethylhexylester, 4-(Dimethylamino)benzoesäure-2-octylester und 4- (Dimethylamino)benzoesäureamylester; Ester der Zimtsäure, vorzugsweise 4- Methoxyzimtsäure-2-ethylhexylester, 4-Methoxyzimtsäurepropylester, 4-Methoxyzimt- säureisoamylester, 2-Cyano-3,3-phenylzimtsäure-2-ethylhexylester (Octocrylene); Ester der Salicylsäure, vorzugsweise Salicylsäure-2-ethylhexylester, Salicylsäure-4- isopropylbenzylester, Salicylsäurehomomenthylester; Derivate des Benzophenons, vorzugsweise 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon, 2-Hydroxy-4-methoxy-4'- methylbenzophenon, 2,2'-Dihydroxy-4-methoxybenzophenon; Ester der Benzalmalonsäure, vorzugsweise 4-Methoxybenzmalonsäuredi-2-ethylhexylester; Triazinderivate, wie zum Beispiel 2,4,6-Trianilino-(p-carbo-2'-ethyl-1'-hexyloxy)-1 ,3,5- triazin und Octyl Triazon, wie in der EP 0818450 A1 beschrieben oder Dioctyl Butamido Triazone (Uvasorb® HEB); Propan-1,3-dione, wie zum Beispiel 1-(4-tert.Butylphenyl)-3- (4'methoxyphenyl)propan-1,3-dion; Ketotricyclo(5.2.1.0)decan-Derivate, wie in der EP 0694521 B1 beschrieben. Weiterhin geeignet sind 2-Phenylbenzimidazol-5-sulfonsäure und deren Alkali-, Erdalkali-, Ammonium-, Alkylammonium-, Alkanolammonium- und Glucammoniumsalze; Sulfonsäurederivate von Benzophenonen, vorzugsweise 2- Hydroxy-4-methoxybenzophenon-5-sulfonsäure und ihre Salze; Sulfonsäurederivate des 3-Benzylidencamphers, wie zum Beispiel 4-(2-Oxo-3-bornylidenmethyl)benzol- sulfonsäure und 2-Methyl-5-(2-oxo-3-bornyliden)sulfonsäure und deren Salze. Als typische UV-A-Filter kommen insbesondere Derivate des Benzoylmethans in Frage, wie beispielsweise 1-(4'-tert.Butylphenyl)-3-(4'-methoxyphenyl)propan-1 ,3-dion, 4-tert- Butyl-4'-methoxydibenzoylmethan (Parsol 1789), 1-Phenyl-3-(4'-isopropylphenyl)- propan-1,3-dion sowie Enaminverbindungen, wie beschrieben in der DE 19712033 A1 (BASF). Die UV-A und UV-B-Filter können selbstverständlich auch in Mischungen eingesetzt werden. Neben den genannten löslichen Stoffen kommen für diesen Zweck auch unlösliche Lichtschutzpigmente, nämlich feindisperse, vorzugsweise nanoisierte Metalloxide beziehungsweise Salze in Frage. Beispiele für geeignete Metalloxide sind insbesondere Zinkoxid und Titandioxid und daneben Oxide des Eisens, Zirkoniums, Siliciums, Mangans, Aluminiums und Cers sowie deren Gemische. Als Salze können Silicate (Talk), Bariumsulfat oder Zinkstearat eingesetzt werden. Die Oxide und Salze werden in Form der Pigmente bereits für hautpflegende und hautschützende Emulsionen und dekorative Kosmetik verwendet. Die Partikel sollten dabei einen mittleren Durchmesser von weniger als 100 nm, vorzugsweise zwischen 5 und 50 nm und insbesondere zwischen 15 und 30 nm aufweisen. Sie können eine sphärische Form aufweisen, es können jedoch auch solche Partikel zum Einsatz kommen, die eine ellipsoide oder in sonstiger Weise von der sphärischen Gestalt abweichende Form besitzen. Die Pigmente können auch oberflächenbehandelt, das heißt hydrophilisiert oder hydrophobiert vorliegen. Typische Beispiele sind ummantelte Titandioxide, wie zum Beispiel Titandioxid T 805 (Degussa) oder Eusolex® T2000 (Merck; als hydrophobe Coatingmittel kommen dafür bevorzugt Silicone und besonders bevorzugt Trialkoxyoctylsilane oder Simethicone in Frage. Vorzugsweise wird mikronisiert.es Zinkoxid verwendet. Weitere geeignete UV-Lichtschutzfilter sind der Übersicht von P. Finkel in SÖFW-Journal 122 (1996), S. 543 zu entnehmen.
Die UV-Absorbenzien werden üblicherweise in Mengen von 0,01 Gew.-% bis 5 Gew.-%, vorzugsweise von 0,03 Gew.-% bis 1 Gew.-%, eingesetzt.
Erfindungsgemäße Mittel können zur Steigerung der Wasch-, beziehungsweise Reinigungsleistung weitere Enzyme enthalten, wobei prinzipiell alle im Stand der Technik für diese Zwecke etablierten Enzyme einsetzbar sind. Hierzu gehören insbesondere weitere Proteasen, Amylasen, Lipasen, Hemicellulasen, Cellulasen oder Oxidoreduktasen, sowie vorzugsweise deren Gemische. Diese Enzyme sind im Prinzip natürlichen Ursprungs; ausgehend von den natürlichen Molekülen stehen für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln verbesserte Varianten zur Verfügung, die entsprechend bevorzugt eingesetzt werden. Erfindungsgemäße Mittel enthalten Enzyme vorzugsweise in Gesamtmengen von 1 x 10"8 bis 5 Gewichts-Prozent bezogen auf aktives Protein.
Unter den weiteren Proteasen sind solche vom Subtilisin-Typ bevorzugt. Beispiele hierfür sind die Subtilisine BPN' und Carlsberg, die Protease PB92, die Subtilisine 147 und 309, die Alkalische Protease aus Bacillus lentus, Subtilisin DY und die den Subtilasen, nicht mehr jedoch den Subtilisinen im engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme Thermitase, Proteinase K und die Proteasen TW3 und TW7. Subtilisin Carlsberg ist in weiterentwickelter Form unter dem Handelsnamen Alcalase® von der Firma Novozymes A/S, Bagsvasrd, Dänemark, erhältlich. Die Subtilisine 147 und 309 werden unter den Handelsnamen Esperase®, beziehungsweise Savinase® von der Firma Novozymes vertrieben. Von der Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 (WO 91/02792 A1) leiten sich die unter der Bezeichnung BLAP® geführten Varianten ab, die insbesondere in WO 92/21760 A1, WO 95/23221 A1, WO 02/088340 A2 und WO 03/038082 A2 beschrieben werden. Weitere verwendbare Proteasen aus verschiedenen Bacillus sp. und ß. gibsonii gehen aus den einleitend bereits erwähnten Patentanmeldungen WO 03/054185 A1 , WO 03/056017 A2, WO 03/055974 A2 und WO 03/054184 A1 hervor.
Weitere brauchbare Proteasen sind beispielsweise die unter den Handelsnamen Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase®, Kannase® und Ovozymes® von der Firma Novozymes, die unter den Handelsnamen, Purafect®, Purafect® OxP und Properase® von der Firma Genencor, das unter dem Handelsnamen Protosol® von der Firma Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien, das unter dem Handelsnamen Wuxi® von der Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, die unter den Handelsnamen Proleather® und Protease P® von der Firma Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, und das unter der Bezeichnung Proteinase K-16 von der Firma Kao Corp., Tokyo, Japan, erhältlichen Enzyme.
Beispiele für erfindungsgemäß einsetzbare Amylasen sind die α-Amylasen aus Bacillus licheniformis, aus B. amyloliquefaciens oder aus ß. stearothermophilus sowie deren für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln verbesserte Weiterentwicklungen. Das Enzym aus ß. licheniformis ist von der Firma Novozymes unter dem Namen Termamyl® und von der Firma Genencor unter dem Namen Purastar®ST erhältlich. Weiterentwicklungsprodukte dieser α-Amylase sind von der Firma Novozymes unter den Handelsnamen Duramyl® und Termamyl®ultra, von der Firma Genencor unter dem Namen Purastar®OxAm und von der Firma Daiwa Seiko Inc., Tokyo, Japan, als Keistase® erhältlich. Die α-Amylase von ß. amyloliquefaciens wird von der Firma Novozymes unter dem Namen BAN® vertrieben, und abgeleitete Varianten von der α- Amylase aus ß. stearothermophilus unter den Namen BSG® und Novamyl®, ebenfalls von der Firma Novozymes.
Desweiteren sind für diesen Zweck die in der Anmeldung WO 02/10356 A2 offenbarte α-
Amylase aus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) und die in der Anmeldung
WO 02/44350 A2 beschriebene Cyclodextrin-Glucanotransferase (CGTase) aus ß. agaradherens (DSM 9948) hervorzuheben. Ferner sind die amylolytischen Enzyme einsetzbar, die dem Sequenzraum von α-Amylasen angehören, der in der Anmeldung
WO 03/002711 A2 definiert wird, und die, die in der Anmeldung WO 03/054177 A2 beschrieben werden. Ebenso sind Fusionsprodukte der genannten Moleküle einsetzbar, beispielsweise die aus der Anmeldung DE 10138753 A1.
Darüber hinaus sind die unter den Handelsnamen Fungamyl® von der Firma Novozymes erhältlichen Weiterentwicklungen der α-Amylase aus Aspergillus niger und A. oryzae geeignet. Ein weiteres Handelsprodukt ist beispielsweise die Amylase-LT®.
Erfindungsgemäße Mittel können Lipasen oder Cutinasen, insbesondere wegen ihrer Triglycerid-spaltenden Aktivitäten enthalten, aber auch, um aus geeigneten Vorstufen in situ Persäuren zu erzeugen. Hierzu gehören beispielsweise die ursprünglich aus Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus) erhältlichen, beziehungsweise weiterentwickelten Lipasen, insbesondere solche mit dem Aminosäureaustausch D96L. Sie werden beispielsweise von der Firma Novozymes unter den Handelsnamen Lipolase®, Lipolase®Ultra, LipoPrime®, Lipozyme® und Lipex® vertrieben. Desweiteren sind beispielsweise die Cutinasen einsetzbar, die ursprünglich aus Fusa um solani pisi und Humicola insolens isoliert worden sind. Ebenso brauchbare Lipasen sind von der Firma Amano unter den Bezeichnungen Lipase CE®, Lipase P®, Lipase B®, beziehungsweise Lipase CES®, Lipase AKG®, Bacillis sp. Lipase®, Lipase AP®, Lipase M-AP® und Lipase AML® erhältlich. Von der Firma Genencor sind beispielsweise die Lipasen, beziehungsweise Cutinasen einsetzbar, deren Ausgangsenzyme ursprünglich aus Pseudomonas mendocina und Fusarium solanii isoliert worden sind. Als weitere wichtige Handelsprodukte sind die ursprünglich von der Firma Gist-Brocades vertriebenen Präparationen M1 Lipase® und Lipomax® und die von der Firma Meito Sangyo KK, Japan, unter den Namen Lipase MY-30®, Lipase OF® und Lipase PL® vertriebenen Enzyme zu erwähnen, ferner das Produkt Lumafast® von der Firma Genencor.
Erfindungsgemäße Mittel können, insbesondere wenn sie für die Behandlung von Textilien gedacht sind, Cellulasen enthalten, je nach Zweck als reine Enzyme, als Enzympräparationen oder in Form von Mischungen, in denen sich die einzelnen Komponenten vorteilhafterweise hinsichtlich ihrer verschiedenen Leistungsaspekte ergänzen. Zu diesen Leistungsaspekten zählen insbesondere Beiträge zur Primärwaschleistung, zur Sekundärwaschleistung des Mittels (Antiredepositionswirkung oder Vergrauungsinhibition) und Avivage (Gewebewirkung), bis hin zum Ausüben eines „stone washed"-Effekts.
Eine brauchbare pilzliche, Endoglucanase(EG)-reiche Cellulase-Präparation, beziehungsweise deren Weiterentwicklungen werden von der Firma Novozymes unter dem Handelsnamen Celluzyme® angeboten. Die ebenfalls von der Firma Novozymes erhältlichen Produkte Endolase® und Carezyme® basieren auf der 50 kD-EG, beziehungsweise der 43 kD-EG aus H. insolens DSM 1800. Weitere einsetzbare Handelsprodukte dieser Firma sind Cellusoft® und Renozyme®. Letzteres basiert auf der Anmeldung WO 96/29397 A1. Leistungsverbesserte Cellulase-Varianten gehen beispielsweise aus der Anmeldung WO 98/12307 A1 hervor. Ebenso sind die in der Anmeldung WO 97/14804 A1 offenbarten Cellulasen einsetzbar; beispielsweise die darin offenbarte 20 kD-EG aus Melanocarpus, die von der Firma AB Enzymes, Finnland, unter den Handelsnamen Ecostone® und Biotouch® erhältlich ist. Weitere Handelprodukte der Firma AB Enzymes sind Econase® und Ecopulp®. Weitere geeignete Cellulasen aus Bacillus sp. CBS 670.93 und CBS 669.93 werden in WO 96/34092 A2 offenbart, wobei die aus Bacillus sp. CBS 670.93 von der Firma Genencor unter dem Handelsnamen Puradax® erhältlich ist. Weitere Handelsprodukte der Firma Genencor sind „Genencor detergent cellulase L" und lndiAge®Neutra.
Erfindungsgemäße Mittel können insbesondere zur Entfernung bestimmter Problemanschmutzungen weitere Enzyme enthalten, die unter dem Begriff Hemicellulasen zusammengefaßt werden. Hierzu gehören beispielsweise Mannanasen, Xanthanlyasen, Pektinlyasen (=Pektinasen), Pektinesterasen, Pektatlyasen, Xyloglucanasen (=Xylanasen), Pullulanasen und ß-Glucanasen. Geeignete Mannanasen sind beispielsweise unter den Namen Gamanase® und Pektinex AR® von der Firma Novozymes, unter dem Namen Rohapec® B1L von der Firma AB Enzymes und unter dem Namen Pyrolase® von der Firma Diversa Corp., San Diego, CA, USA erhältlich. Eine geeignete ß-Glucanase aus einem ß. alcalophilus geht beispielsweise aus der Anmeldung WO 99/06573 A1 hervor. Die aus ß. subtilis gewonnene ß-Glucanase ist unter dem Namen Cereflo® von der Firma Novozymes erhältlich.
Zur Erhöhung der bleichenden Wirkung können erfindungsgemäße Wasch- und Reinigungsmittel Oxidoreduktasen, beispielsweise Oxidasen, Oxygenasen, Katalasen, Peroxidasen, wie Halo-, Chloro-, Bromo-, Lignin-, Glucose- oder Mangan-peroxidasen, Dioxygenasen oder Laccasen (Phenoloxidasen, Polyphenoloxidasen) enthalten. Als geeignete Handelsprodukte sind Denilite® 1 und 2 der Firma Novozymes zu nennen. Vorteilhafterweise werden zusätzlich vorzugsweise organische, besonders bevorzugt aromatische, mit den Enzymen wechselwirkende Verbindungen zugegeben, um die Aktivität der betreffenden Oxidoreduktasen zu verstärken (Enhancer) oder um bei stark unterschiedlichen Redoxpotentialen zwischen den oxidierenden Enzymen und den Anschmutzungen den Elektronenfluß zu gewährleisten (Mediatoren).
Die in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzten Enzyme stammen entweder ursprünglich aus Mikroorganismen, etwa der Gattungen Bacillus, Streptomyces, Humicola, oder Pseudomonas, und/oder werden nach an sich bekannten biotechnologischen Verfahren durch geeignete Mikroorganismen produziert, etwa durch transgene Expressionswirte der Gattungen Bacillus oder filamentöse Fungi.
Die Aufreinigung der betreffenden Enzyme erfolgt günstigerweise über an sich etablierte Verfahren, beispielsweise über Ausfällung, Sedimentation, Konzentrierung, Filtration der flüssigen Phasen, Mikrofiltration, Ultrafiltration, Einwirken von Chemikalien, Desodorie- rung oder geeignete Kombinationen dieser Schritte.
Erfindungsgemäßen Mitteln können die Enzyme in jeder nach dem Stand der Technik etablierten Form zugesetzt werden. Hierzu gehören beispielsweise die durch Granulation, Extrusion oder Lyophilisierung erhaltenen festen Präparationen oder, insbesondere bei flüssigen oder gelförmigen Mitteln, Lösungen der Enzyme, vorteilhafterweise möglichst konzentriert, wasserarm und/oder mit Stabilisatoren versetzt.
Alternativ können die Enzyme sowohl für die feste als auch für die flüssige Darreichungsform verkapselt werden, beispielsweise durch Sprühtrocknung oder Extrusion der Enzymlösung zusammen mit einem, vorzugsweise natürlichen Polymer oder in Form von Kapseln, beispielsweise solchen, bei denen die Enzyme wie in einem erstarrten Gel eingeschlossen sind oder in solchen vom Kern-Schale-Typ, bei dem ein enzymhaltiger Kern mit einer Wasser-, Luft- und/oder Chemikalien-undurchlässigen Schutzschicht überzogen ist. In aufgelagerten Schichten können zusätzlich weitere Wirkstoffe, beispielsweise Stabilisatoren, Emulgatoren, Pigmente, Bleich- oder Farbstoffe aufgebracht werden. Derartige Kapseln werden nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise durch Schüttel- oder Rollgranulation oder in Fluid-bed-Prozessen aufgebracht. Vorteilhafterweise sind derartige Granulate, beispielsweise durch Aufbringen polymerer Filmbildner, staubarm und aufgrund der Beschichtung lagerstabil.
Weiterhin ist es möglich, zwei oder mehrere Enzyme zusammen zu konfektionieren, so daß ein einzelnes Granulat mehrere Enzymaktivitäten aufweist.
Ein in einem erfindungsgemäßen Mittel enthaltenes Protein und/oder Enzym kann besonders während der Lagerung gegen Schädigungen wie beispielsweise Inaktivierung, Denaturierung oder Zerfall etwa durch physikalische Einflüsse, Oxidation oder proteolytische Spaltung geschützt werden. Bei mikrobieller Gewinnung der Proteine und/oder Enzyme ist eine Inhibierung der Proteolyse besonders bevorzugt, insbesondere wenn auch die Mittel Proteasen enthalten. Bevorzugte erfindungsgemäße Mittel enthalten zu diesem Zweck Stabilisatoren.
Eine Gruppe von Stabilisatoren sind reversible Proteaseinhibitoren. Häufig werden hierfür Benzamidin-Hydrochlorid, Borax, Borsäuren, Boronsäuren oder deren Salze oder Ester eingesetzt, darunter vor allem Derivate mit aromatischen Gruppen, etwa ortho-, meta- oder para-substituierte Phenylboronsäuren, insbesondere 4-Formylphenyl- Boronsäure, beziehungsweise die Salze oder Ester der genannten Verbindungen. Auch Peptidaldehyde, das heißt Oligopeptide mit reduziertem C-Terminus, insbesondere solche aus 2 bis 50 Monomeren werden zu diesem Zweck eingesetzt. Zu den peptidischen reversiblen Proteaseinhibitoren gehören unter anderem Ovomucoid und Leupeptin. Auch spezifische, reversible Peptid-Inhibitoren für die Protease Subtilisin sowie Fusionsproteine aus Proteasen und spezifischen Peptid-Inhibitoren sind hierfür geeignet.
Weitere Enzymstabilisatoren sind Aminoalkohole wie Mono-, Di-, Triethanol- und -Propanolamin und deren Mischungen, aliphatische Carbonsäuren bis zu C12, wie beispielsweise Bernsteinsäure, andere Dicarbonsäuren oder Salze der genannten Säuren. Auch endgruppenverschlossene Fettsäureamidalkoxylate sind für diesen Zweck geeignet. Bestimmte als Builder eingesetzte organische Säuren vermögen, wie in WO 97/18287 offenbart, zusätzlich ein enthaltenes Enzym zu stabilisieren.
Niedere aliphatische Alkohole, vor allem aber Polyole, wie beispielsweise Glycerin, Ethylenglykol, Propylenglykol oder Sorbit sind weitere häufig eingesetzte Enzymstabilisatoren. Auch Di-Glycerinphosphat schützt gegen Denaturierung durch physikalische Einflüsse. Ebenso werden Calcium- und/oder Magnesiumsalze eingesetzt, wie beispielsweise Calciumacetat oder Calcium-Formiat.
Polyamid-Oligomere oder polymere Verbindungen wie Lignin, wasserlösliche Vinyl- Copolymere oder Cellulose-Ether, Acryl-Polymere und/oder Polyamide stabilisieren die Enzym-Präparation unter anderem gegenüber physikalischen Einflüssen oder pH-Wert- Schwankungen. Polyamin-N-Oxid-enthaltende Polymere wirken gleichzeitig als Enzymstabilisatoren und als Farbübertragungsinhibitoren. Andere polymere Stabilisatoren sind lineare C8-Cι8 Polyoxyalkylene. Auch Alkylpolyglycoside können die enzymatischen Komponenten des erfindungsgemäßen Mittels stabilisieren und vermögen vorzugsweise, diese zusätzlich in ihrer Leistung zu steigern. Vernetzte N- haltige Verbindungen erfüllen vorzugsweise eine Doppelfunktion als Soil-release- Agentien und als Enzym-Stabilisatoren. Hydrophobes, nichtionisches Polymer stabilisiert insbesondere eine gegebenenfalls enthaltene Cellulase.
Reduktionsmittel und Antioxidantien erhöhen die Stabilität der Enzyme gegenüber oxidativem Zerfall; hierfür sind beispielsweise schwefelhaltige Reduktionsmittel geläufig. Andere Beispiele sind Natrium-Sulfit und reduzierende Zucker. Besonders bevorzugt werden Kombinationen von Stabilisatoren eingesetzt, beispielsweise aus Polyolen, Borsäure und/oder Borax, die Kombination von Borsäure oder Borat, reduzierenden Salzen und Bernsteinsäure oder anderen Dicarbonsäuren oder die Kombination von Borsäure oder Borat mit Polyolen oder Polyamino- verbindungen und mit reduzierenden Salzen. Die Wirkung von Peptid-Aldehyd- Stabilisatoren wird günstigerweise durch die Kombination mit Borsäure und/oder Borsäurederivaten und Polyolen gesteigert und noch weiter durch die zusätzliche Wirkung von zweiwertigen Kationen, wie zum Beispiel Calcium-Ionen.
Da erfindungsgemäße Mittel in allen denkbaren Formen angeboten werden können, stellen erfindungsgemäße Enzyme, beziehungsweise Proteine in allen für die Zugabe zu den jeweiligen Mitteln zweckmäßigen Formulierungen jeweilige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Dazu gehören beispielsweise flüssige Formulierungen, feste Granulate oder Kapseln.
Die verkapselte Form bietet sich an, um die Enzyme oder andere Inhaltsstoffe vor anderen Bestandteilen, wie beispielsweise Bleichmitteln, zu schützen oder um eine kontrollierte Freisetzung (controlled release) zu ermöglichen. Je nach der Größe dieser Kapseln wird nach Milli-, Mikro- und Nanokapseln unterschieden, wobei Mikrokapseln für Enzyme besonders bevorzugt sind. Solche Kapseln werden beispielsweise mit den Patentanmeldungen WO 97/24177 und DE 19918267 offenbart. Eine mögliche Verkapselungsmethode besteht darin, daß die Proteine, ausgehend von einer Mischung der Proteinlösung mit einer Lösung oder Suspension von Stärke oder einem Stärkederivat, in dieser Substanz verkapselt werden. Ein solches Verkapselungs- verfahren wird mit der Anmeldung WO 01/38471 beschrieben.
Im Fall fester Mittel können die Proteine beispielsweise in getrockneter, granulierter und/oder verkapselter Form eingesetzt werden. Sie können separat, das heißt als eigene Phase, oder mit anderen Bestandteilen zusammen in derselben Phase, mit oder ohne Kompaktierung zugesetzt werden. Sollen mikroverkapselte Enzyme in fester Form verarbeitet werden, so kann das Wasser mit aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren aus den sich aus der Aufarbeitung ergebenden wäßrigen Lösungen entfernt werden, wie Sprühtrocknung, Abzentrifugieren oder durch Umsolubilisieren. Die auf diese Weise erhaltenen Teilchen haben üblicherweise eine Teilchengröße zwischen 50 und 200 μm. Flüssigen, gelförmigen oder pastösen erfindungsgemäßen Mitteln können die Enzyme, und auch das erfindungsgemäße Protein ausgehend von einer nach dem Stand der Technik durchgeführten Proteingewinnung und Präparation in konzentrierter wäßriger oder nichtwäßriger Lösung, Suspension oder Emulsion zugesetzt werden, aber auch in Gelform oder verkapselt oder als getrocknetes Pulver. Derartige erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel werden in der Regel durch einfaches Mischen der Inhaltsstoffe hergestellt, die in Substanz oder als Lösung in einen automatischen Mischer gegeben werden können.
Neben der primären Waschleistung können die in Waschmitteln enthaltenen Proteasen ferner die Funktion erfüllen, andere enzymatische Bestandteile durch proteolytische Spaltung zu aktivieren oder nach entsprechender Einwirkzeit zu inaktivieren, so wie beispielsweise in den Anmeldungen WO 94/29426 oder EP 747471 offenbart worden ist. Vergleichbare regulatorische Funktionen sind auch über das erfindungsgemäße Protein möglich. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind ferner solche Mittel mit Kapseln aus proteasesensitivem Material, welche beispielsweise von erfindungsgemäßen Proteinen zu einem beabsichtigten Zeitpunkt hydrolysiert werden und ihren Inhalt freisetzen. Ein vergleichbarer Effekt kann auch bei anderen mehrphasigen Mitteln erzielt werden.
Eine weitere Ausführungsform stellen Mittel zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar, die eine erfindungsgemäße Alkalische Protease enthalten.
Eine weitere Ausführungsform stellen Mittel zur Behandlung von Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen dar, insbesondere von solchen mit Wolle oder Seide.
Denn insbesondere natürliche Fasern, wie beispielsweise Wolle oder Seide, zeichnen sich durch eine charakteristische, mikroskopische Oberflächenstruktur aus. Diese kann, wie am Beispiel der Wolle im Artikel von R. Breier in Melliand Textilberichte vom 1.4.2000 (Seite 263) ausgeführt worden ist, langfristig zu unerwünschten Effekten, wie etwa Verfilzung führen. Zur Vermeidung solcher Effekte werden die natürlichen Rohstoffe mit erfindungsgemäßen Mitteln behandelt, welche beispielsweise dazu beitragen, die auf Proteinstrukturen beruhende geschuppte Oberflächenstruktur zu glätten und damit einem Verfilzen entgegenwirken. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel mit einer erfindungsgemäßen Protease so konzipiert, daß es regelmäßig als Pflegemittel verwendet werden kann, beispielsweise indem es dem Waschprozeß zugesetzt, nach dem Waschen angewendet oder unabhängig von dem Waschen appliziert wird. Der gewünschte Effekt besteht darin, eine glatte Oberflächenstruktur des Textils über einen langen Zeitraum zu erhalten und/oder Schädigungen des Gewebes vorzubeugen und/oder zu verringern.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur maschinellen Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar, bei denen wenigstens in einem der Verfahrensschritte eine erfindungsgemäße Alkalische Protease aktiv wird.
Darunter sind solche Verfahren bevorzugt, bei denen die erfindungsgemäße Alkalische Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt wird. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nicht- ganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Hierunter fallen sowohl manuelle als auch maschinelle Verfahren, wobei maschinelle Verfahren aufgrund ihrer präziseren Steuerbarkeit, was beispielsweise die eingesetzten Mengen und Einwirkzeiten angeht, bevorzugt sind.
Verfahren zur Reinigung von Textilien zeichnen sich im allgemeinen dadurch aus, daß in mehreren Verfahrensschritten verschiedene reinigungsaktive Substanzen auf das Reinigungsgut aufgebracht und nach der Einwirkzeit abgewaschen werden, oder daß das Reinigungsgut in sonstiger Weise mit einem Waschmittel oder einer Lösung dieses Mittels behandelt wird. Das gleiche gilt für Verfahren zur Reinigung von allen anderen Materialien als Textilien, welche unter dem Begriff harte Oberflächen zusammengefaßt werden. Alle denkbaren Wasch- oder Reinigungsverfahren können in wenigstens einem der Verfahrensschritte um erfindungsgemäße Proteine bereichert werden, und stellen dann Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar.
Da bevorzugte erfindungsgemäße Enzyme natürlicherweise bereits eine proteinauflösende Aktivität besitzen und diese auch in Medien entfalten, die sonst keine Reinigungskraft besitzen, wie beispielsweise in bloßem Puffer, kann ein einzelner Teilschritt eines solchen Verfahrens zur maschinellen Reinigung von Textilien darin bestehen, daß gewünschtenfalls neben stabilisierenden Verbindungen, Salzen oder Puffersubstanzen als einzige reinigungsaktive Komponente ein erfindungsgemäßes Enzym aufgebracht wird. Dies stellt eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform solcher Verfahren werden die betreffenden erfindungsgemäßen Alkalischen Protease im Rahmen einer der oben ausgeführten Rezepturen für erfindungsgemäße Mittel, vorzugsweise erfindungsgemäße Wasch-, beziehungsweise Reinigungsmittel bereitgestellt.
Bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands stellen Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar, bei denen in wenigstens einem der Verfahrensschritte eine erfindungsgemäße Alkalische Protease aktiv wird.
Hierunter sind Verfahren für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen bevorzugt, und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.
Es kann sich dabei beispielsweise um Verfahren handeln, in denen Materialien zur Verarbeitung in Textilien vorbereitet werden, etwa zur Antifilzausrüstung, oder beispielsweise um Verfahren, welche die Reinigung getragener Textilien um eine pflegende Komponente bereichern. Wegen der oben beschriebenen Wirkung von Proteasen auf natürliche, proteinhaltige Rohstoffe handelt es sich in bevorzugten Ausführungsformen um Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen, insbesondere mit Wolle oder Seide.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung einer oben beschriebenen erfindungsgemäßen Alkalische Protease zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar.
Entsprechend bevorzugt gelten für diese Verwendungen die oben ausgeführten Konzentrationsbereiche.
Denn erfindungsgemäße Proteasen können, insbesondere entsprechend den oben beschriebenen Eigenschaften und den oben beschriebenen Verfahren dazu verwendet werden, um von Textilien oder von harten Oberflächen proteinhaltige Verunreinigungen zu beseitigen. Ausführungsformen stellen beispielsweise die Handwäsche, die manuelle Entfernung von Flecken von Textilien oder von harten Oberflächen oder die Verwendung im Zusammenhang mit einem maschinellen Verfahren dar.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Verwendung werden die betreffenden erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen im Rahmen einer der oben ausgeführten Rezepturen für erfindungsgemäße Mittel, vorzugsweise Wasch-, beziehungsweise Reinigungsmittel bereitgestellt.
Eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellt die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Protease zur Aktivierung oder Deaktivierung von Inhaltsstoffen von Wasch- oder Reinigungsmitteln dar.
Denn wie bekannt ist, können Protein-Bestandteile von Wasch- oder Reinigungsmitteln durch das Einwirken einer Protease inaktiviert werden. Diesen ansonsten eher unerwünschten Effekt gezielt einzusetzen, ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ebenso ist es wie oben beschrieben möglich, daß durch Proteolyse eine andere Komponente erst aktiviert wird, etwa, wenn sie ein Hybridprotein aus dem eigentlichen Enzym und dem dazu passenden Inhibitor darstellt, wie dies beispielsweise in der Anmeldung WO 00/01831 A2 offenbart worden ist. Ein anderes Beispiel für eine solche Regulation ist die, bei der eine aktive Komponente zum Schutz oder zur Kontrolle seiner Aktivität in einem Material verkapselt vorliegt, das durch Proteolyse angegriffen wird. Erfindungsgemäße Proteine können somit zu Inaktivierungs-, Aktivierungs- oder Freisetzungsreaktionen verwendet werden, insbesondere in mehrphasigen Mitteln.
Entsprechend dem oben Gesagten stellen auch folgende Verwendungen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar:
- Die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Protease zur Gewinnung oder Behandlung von Rohmaterialien oder Zwischenprodukten in der Textilherstellung, insbesondere zum Entfernen von Schutzschichten auf Geweben;
- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Protease zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege und hierunter bevorzugt
- die entsprechende Verwendung für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide. Die vorliegende Erfindung wird auch in Form von solchen eine erfindungsgemäße Alkalische Protease enthaltenden Mitteln verwirklicht, bei denen es sich um Kosmetika handelt. Hierunter werden alle Arten von reinigenden und pflegenden Mitteln für menschliche Haut oder Haar verstanden, insbesondere reinigende Mittel.
Denn Proteasen spielen auch im Zellerneuerungsprozeß der menschlichen Haut (Desquamation) eine entscheidende Rolle (T. Egelrud et al., Acta Derm. Venerol., Band 71 (1991), Seiten 471-474). Dementsprechend werden Proteasen auch als bioaktive Komponenten in Hautpflegemitteln verwendet, um den Abbau der in trockener Haut vermehrten Desmosomenstrukturen zu unterstützen. Der Einsatz von Subtilisin- Proteasen mit Aminosäureaustauschen in den Positionen R99G/A/S, S154D/E und/oder L211D/E für kosmetische Zwecke wird beispielsweise in WO 97/07770 A1 beschrieben. Entsprechend dem oben Gesagten können erfindungsgemäße Proteasen über die entsprechenden Punktmutationen weiterentwickelt werden. Somit eignen sich auch erfindungsgemäße Proteasen, insbesondere solche, die etwa nach Mutagenese oder durch Zugabe entsprechender, mit ihnen wechselwirkender Stoffe in ihrer Aktivität kontrolliert sind, als aktive Komponenten in Haut- oder Haar-Reinigungs- oder Pflegemitteln. Besonders bevorzugt sind solche Präparationen dieser Enzyme, die wie oben beschrieben, beispielsweise durch Kopplung an makromolekulare Träger (vergleiche US 5230891) stabilisiert und/oder durch Punktmutationen an hochallergenen Positionen derivatisiert sind, so daß sie für den Menschen eine höhere Hautverträglichkeit aufweisen.
Dementsprechend werden auch entsprechende kosmetische Reinig ungs- und Pflegeverfahren und die Verwendung derartiger proteolytischer Enzyme zu kosmetischen Zwecken in diesen Erfindungsgegenstand einbezogen, insbesondere in entsprechenden Mitteln, wie beispielsweise Shampoos, Seifen oder Waschlotionen, oder in Pflegemitteln, die beispielsweise in Form von Cremes angeboten werden. Auch die Verwendung in einem schälenden Arzneimittel, beziehungsweise zu dessen Herstellung ist in diesen Anspruch eingeschlossen.
Neben dem Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln und Kosmetika sind im Stand der Technik zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten von Proteasaen, insbesondere Subtilasen etabliert. Einen Überblick hierüber bietet beispielsweise das Handbuch „Industrial enyzmes and their applications" von H. Uhlig, Wiley-Verlag, New York, 1998. All diese Techniken können erfindungsgemäße Alkalischen Proteasen bereichert werden. Sollte sich herausstellen, daß sie durch den Einsatz erfindungsgemäßer Proteasen weiterentwickelt werden können, so sind diese in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Hierzu gehören insbesondere folgende Einsatzgebiete:
- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen zur biochemischen Analyse oder zur Synthese von niedermolekularen Verbindungen oder von Proteinen;
- darunter bevorzugt die Verwendung zur Endgruppenbestimmung im Rahmen einer Peptid-Sequenzanalyse;
- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen zur Präparation, Reinigung oder Synthese von Naturstoffen oder biologischen Wertstoffen, vorzugsweise im Rahmen entsprechender Mittel oder Verfahren;
- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen zur Synthese von Proteinen oder anderen niedermolekularen chemischen Verbindungen;
- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen zur Behandlung von natürlichen Rohstoffen, insbesondere zur Oberflächenbehandlung, ganz besonders in einem Verfahren zur Behandlung von Leder, vorzugsweise im Rahmen entsprechender Mittel oder Verfahren;
- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen zur Behandlung von photographischen Filmen, insbesondere zur Entfernung von gelatinhaltigen oder ähnlichen Schutzschichten; und
- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen zur Herstellung von Lebensmitteln oder von Futtermitteln.
Prinzipiell wird umfaßt die vorliegende Anmeldung jedes Technikgebiet, das durch die hiermit vorgelegten neuen alkalischen Proteasen beziehungsweise hierauf aufbauenden Verfahren oder Verwendungen bereichert wird.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne sie darauf einzuschränken. Beispiele
Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme und Baukästen (Kits) wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.
Beispiel 1
Gewinnung von Zellmaterial aus Bodenhabitaten
Bodenproben wurden von verschiedenen Standorten in Deutschland genommen, in Wasser aufgenommen und Schwebstoffe durch 30minütiges Stehenlassen sedimentiert. Der Überstand wurde auf 5%igen Agarplatten mit HSP10-Festmedium (0,1 g Hefeextrakt, Fa. Difco, Heidelberg; 0,1 g Casein-Pepton, tryptisch verdaut, Fa. Difco; 0,1 g lösliche Stärke (Fa. Merck, Best.-Nr. 1.01251); 2 g Na2CO3; ad 1000 ml destilliertes Wasser; pH 10) ausplattiert und für ca. 2 Wochen bei 30°C kultiviert. Der erhaltene Bakterien-Rasen wurde mechanisch von der Agaroberfläche gewonnen.
Beispiel 2
Anlage einer Expressions-Genbank
Als Expressionssystem wurde der Vektor pUC18 (GenBank, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; Zugangsnummer L08752; Fig. 3) in Escherichia coli DH12S gewählt. Dieser Vektor trägt den durch Zugabe von IPTG induzierbaren ß-Galactosidase Promotor des lac-Operons, so daß in diesen Zellen eine hierüber kontrollierte Expression der in die multiple Klonierungsstelle integrierten DNA möglich ist. Der Stamm DH12S ist wegen seines laclq-Genotyps für die IPTG-Induktion geeignet und vorteilhaft für ein Protease-Aktivitätsscreening, weil er eine hinreichend niedrige endogene proteolytische Aktivität aufweist. Vorversuche hatten gezeigt, daß auch E. coli JM109 dieselben Voraussetzungen erfüllt.
Die Aufarbeitung der DNA aus der nach Beispiel 1 erhaltenen Probe erfolgte nach Zhou et al. (1996), Appl. Environ. Microbiol., Band 62, Seiten 316-322. Diese gereinigte Metagenom-DNA (siehe unten) wurde einer präparativen Partialrestriktion mit dem Restriktionsenzym Alu I zur Darstellung von Fragmentgrößen im Bereich von 2 bis 10 kb unterworfen.
Dafür wurde zunächst die optimale Restriktions-Inkubationsdauer durch Aufnahme einer Enzymkinetik bestimmt. Hierzu wurden 2,8 μg der DNA-Präparation in dem von dem Hersteller von Alu I (Fa. New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland; Katalog-Nr. R0137S) angebotenen entsprechenden Reaktionspuffer bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von 0,2 U Alu I pro μg DNA wurde die Reaktion in einem Gesamtvolumen von 21 μl gestartet und danach in zweiminütigen Intervallen jeweils 1 ,5 μl aus dem Ansatz entnommen, worin sofort jeweils die Reaktion durch Zugabe von 10 mM Tris/HCI, pH 7,0; 20% Glycerin; 0,1% SDS und Kühlen auf 0°C beendet wurde. Durch anschließende Analyse auf einem 0,7%igen Agarosegel wurde die optimale Restriktionsdauer für einen partiellen Verdau ermittelt. Sie beträgt für die Isolierung der nach Beispiel 1 isolierten DNA bei ca. 6 bis 7 min, um Fragmente im Größenbereich von 2 bis 10 kb zu erhalten.
Der präparative Partialverdau erfolgte dementsprechend in 30 parallelen Ansätzen. Nach entsprechendem Abstoppen der Reaktion wurde der Ansatz auf einem präparativen 0,7%oigen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt, der Gelbereich mit DNA der Größen 2 bis 10 kb ausgeschnitten und dieser mittels Elektroelution in Dialyseschläuchen bei 4°C isoliert. Die DNA wurde abschließend mit 1/10 Volumen 3 M Na-Acetat und dem 2,5- fachen Volumen Ethanol gefällt und in einem adäquaten Volumen aufgenommen. Zur weiteren Abtrennung von etwaig vorhandenen kleineren DNA-Bruchstücken wurden die Gelelektrophorese, Elektroporation und Fällung wiederholt.
440 ng der so erhaltenen fragmentierten Metagenom-DNA wurden über Nacht bei 16°C in einem Gesamtvolumen von 15 μl mit 150 ng des Vektors pUC18 unter Zugabe von 400 NEB-Units T4-DNA-Ligase in IxLigase-Puffer ligiert. Dieser Vektor war zuvor mit Sma I linearisiert und mit Alkalischer Phosphatase aus Kalbsthymus dephosphoryliert worden.
Die Transformation kompetenter E. coli DH12S-Zellen (Fa. Gibco Life Technologies, Karlsruhe, Katalog-Nummer 18312017) erfolgte über Elektro-Transformation. Hierfür wurden 1 μl Ligationsansatz und 25 μl Zellen gemischt, in einer Elektroporationsküvette 1 min lang auf Eis inkubiert und im Elektroporator (BTX® ECM630, Genetronics Inc. San Diego, USA) nach Herstellerangaben behandelt. Nach sofortiger Überführung in 1 ml SOC-Medium (2% Bacto-Trypton; 0,5% Hefeextrakt; 10 mM NaCI; 2,5 mM KCI; pH 7,0, eingestellt mit NaOH; autoklaviert; supplementiert mit 10 mM MgSO4 und MgCI2 sowie 20 mM D(+)Glucose) folgten eine Erholungsphase von 1 h bei 37°C und wie in Beispiel 1 eine Plattierung auf Agarplatten mit HSP10-Festmedium.
Beispiel 3
Screening auf proteolytische Aktivität
Zur Untersuchung der Qualität der nach Beispiel 2 hergestellten Genbank in E. coli DH12S wurde die Anzahl der insgesamt erzeugten Primärtransformanten und die Anzahl Insert-tragender Klone über Blau/Weiß-Selektion in einer Testplattierung bestimmt. Hierfür wurden je 1 und 10 μl des Transformationsansatzes auf 5%igen Agarplatten mit LB-Medium (10 g Trypton, 5 g Hefe-Extrakt, 5 g NaCI, 1 ml 1 N NaOH pro I), welches zusätzlich mit 100 μg/ml Ampicillin, 0,2 mM (oder 4 μg/ml) IPTG und 0,2 mM (oder 1 μg/ml) X-Gal versetzt war, ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Aus 10 weißen Kolonien, das heißt Transformanten, wurden die Plasmide über Minipräparation (Kit der Fa. Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert, ein Restriktionsverdau mit den Restriktionsenzymen Sac I und Hind III zur Excision des Inserts (vergleiche Figur 3) durchgeführt und die Fragmente auf einem 0,7%igen Agarosegel aufgetrennt. Tatsächlich enthielten alle Vektoren Inserts von ca. 2 bis 10 kb Größe.
Das Screening der nach Beispiel 2 erzeugten Genbank erfolgte auf 5%>igen Agarplatten mit 14 cm Durchmesser mit LB-Medium Ampicillin/IPTG/X-Gal (siehe oben) und zusätzlich 2% Magermilchpulver (Skim Milk, Fa. Difco, Best.-Nr. 232100). Auf 10 dieser Selektionsagar-Platten wurden dem Titer der Bank entsprechend Volumina des Transformationsansatzes von jeweils ca. 10.000 cfu mittels Glaskugeln gleichmäßig ausplattiert (primäre Plattierung).
Nach 16stündiger Inkubation bei 37°C wurden die Platten bis zu zwei Wochen bei 28°C inkubiert. Während dieser Zeit gaben sich proteasebildende Klone durch Klärungshöfe in dem trüben Substrat zu erkennen. Eine gesonderte Zell-Lyse zum Nachweis nicht exportierter Proteasen war nicht notwendig. Die Validierung der Plasmid-vermittelten Proteasebildung erfolgte durch erneute Vereinzelung der Primärklone und anschließend durch Isolierung der betreffenden inserthaltigen pUC18-Vektoren, Retransformation und erneutes Screening (wie oben; sekundäre Plattierung). Die hieraus hervorgegangenen Tansformanten zeigten ebenfalls Hofbildung auf Magermilch-Medium und bestätigten somit die Lokalisation eines Proteasegens auf dem jeweils klonierten DNA-Fragment.
Beispiel 4
Sequenzanalyse eines proteolytisch aktiven Klons (HP70Pa_2)
Aus einem nach Beispiel 3 erhaltenen, Protease-positiven Klon mit der Bezeichnung HP70Pa_2 wurde die Plasmid-DNA nach Standardmethoden isoliert, das Insert über Sac I/Hind Ill-Verdau präpariert (siehe oben) und nach Standardmethoden sequenziert. Hierbei kamen zunächst die für den Vektor spezifischen, das Insert flankierenden Primer gemäß SEQ ID NO. 1 und 2 mit den Bezeichnungen M13f beziehungsweise M13r zum Einsatz, gefolgt von dem sogenannten Primer-Walking, wie es aus dem Stand der Technik (R.J.Kaiser et al. (1989): „Specific primer-directed DNA sequencing using automated fluorescence detection"; Nucl. Acids Res., 17 (15), S. 6087-6102) bekannt ist.
Die Sequenzierung dieses Klons ergab einen Bereich mit einem offenen Leserahmen, dessen DNA-Sequenz in SEQ ID NO. 3 angegeben ist. Aufgrund seiner Herkunft wird dort als Organismus „unbekannt" vermerkt und zusätzlich angegeben, daß diese Sequenz auf ein DNA-Isolat zurückzuführen ist. Ferner muß aufgrund der vorliegenden Daten (insbesondere über Sequenzvergleiche, siehe unten) davon ausgegangen werden, daß die Nukleotidpositionen 1 bis 96 für das Signalpeptid codieren und sich insgesamt der codierende Bereich von 1 bis 1746 erstreckt. Die hiervon abgeleitete Aminosäuresequenz offenbart SEQ ID NO. 4, mit den gleichen Angaben bezüglich der Herkunft.
Als nächstähnliches beschriebenes Enzym wurde eine extrazelluläre Serin-Protease (E.C. 3.4.21.-) aus Xanthomonas campestris pv. campestris (ATCC 33913) gefunden, die bei GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) die Zugangsnummer NP_636242 trägt. Die über das Computer-Programm Vector NTI® Suite 7.0, erhältlich von der Firma InforMax, Inc., Bethesda, USA, mit den vorgegebenen Default-Parametem ermittelte Homologie auf Aminosäureebene beträgt zu HP70 75,0% Identität. Weitere bei dieser Suche gefundene Proteine, die auf Aminosäure-Ebene noch am ähnlichsten erscheinen, sind in folgender Tabelle 1 zusammengestellt. Tabelle 1 : Auf Aminosäure-Ebene zu HP70 nächstähnliche gefundene Sequenzen
Figure imgf000086_0001
Auf DNA-Ebene ergibt sich zu dem Gen der extrazellulären Serin-Protease (E.C. 3.4.21.-) aus Xanthomonas campestris pv. campestris (Gen ID XCC0851) eine Identität von 74,4%.
Somit handelt es sich bei der gefundenen Protease höchstwahrscheinlich ebenfalls um eine Serin-Protease. Zu der etablierten ß. /er/fr/s-Alkalischen Protease (WO 92/21760 A1) ergeben sich auf Aminosäureebene eine Homologie von 26,2% Identität und auf Nukleinsäureebene eine Identität von 33,6%>.
Der zugehörige Vektor mit der Bezeichnung 70-pUC(AWB403) wurde am 2.10.2003 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) hinterlegt und trägt dort die Hinterlegungsnummer DSM 15977. Die hiervon codierte Protease wird als HP70 bezeichnet.
Beispiel 5 Sequenzanalyse eines proteolytisch aktiven Klons (HP53Pa_2)
Aus einem weiteren nach Beispiel 3 erhaltenen Protease-positiven Klon mit der Bezeichnung HP53Pa_2 wurde wie in Beispiel 4 das Insert präpariert und sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen sind in SEQ ID NO. 6 und 7 dargestellt. Aufgrund seiner Herkunft wird dort als Organismus „unbekannt" vermerkt und zusätzlich angegeben, daß diese Sequenzen auf ein DNA-Isolat zurückzuführen sind. Ferner muß aufgrund der vorliegenden Daten (insbesondere über Sequenzvergleiche, siehe unten) davon ausgegangen werden, daß die Nukleotidpositionen 1 bis 114 für das Signalpeptid codieren und sich insgesamt der codierende Bereich von 1 bis 1761 erstreckt.
Es handelt sich wiederum um eine Subtilisin-Protease, die auf Aminosäure-Ebene zu der auch in diesem Fall als nächstähnlichen ermittelten extrazellulären Serin-Protease (E.C. 3.4.21.-) aus Xanthomonas campestris pv. campestris (ATCC 33913; siehe oben) eine Homologie von 75,4% Identität aufweist. Weitere bei dieser Suche gefundene Proteine, die auf Aminosäure-Ebene noch am ähnlichsten erscheinen, sind in folgender Tabelle 2 zusammengestellt.
Tabelle 2: Auf Aminosäure-Ebene zu HP53 nächstähnliche gefundene Sequenzen
Figure imgf000087_0001
Auf DNA-Ebene ergibt sich zu dem Gen der extrazellulären Serin-Protease (E.C. 3.4.21.-) aus Xanthomonas campestris pv. campestris eine Identität von 75,0%.
Zu der etablierten ß. /er/ us-Alkalischen Protease (WO 92/21760 A1) ergeben sich auf Aminosäureebene eine Homologie von 25,9% Identität und auf Nukleinsäureebene eine Identität von 33,5%. Der zugehörige Vektor mit der Bezeichnung 53-pUC(AWB403) wurde am 2.10.2003 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) hinterlegt und trägt dort die Hinterlegungsnummer DSM 15976. Die hiervon codierte Protease wird als HP53 bezeichnet.
Beispiel 6
Erzeugung C-terminaler Deletions-Mutanten von HP70 und HP53
HP70dc
Von der nach Beispiel 3 erhaltenen und in Beispiel 4 beschriebenen Protease des Klons mit der Bezeichnung HP70Pa_2 wurden C'-terminal 332 bp deletiert. Diese Aminosäresequenz HP70_deltaC ist in SEQ ID NO. 5 dargestellt. Aufgrund seiner Konstruktion wird dort vermerkt, daß es sich um eine künstliche Sequenz handelt, konkretisiert mit der Angabe „DNA-Isolat, Delta C". Gemäß SEQ ID NO. 3 und 4 kann der Abschnitt der Positionen 1 bis 32 wiederum als Signalpeptid betrachtet werden.
Hierfür wird von der in SEQ ID NO. 3 angegebenen DNA mit den Oligonukleotiden HP70f (SEQ ID NO. 10) und HP70r (SEQ ID NO. 11) als Primern unter Standard-PCR- Bedingungen ein 1413 bp großes DNA-Stück generiert. Nach Bearbeitung des erhaltenen Fragments mit den Endonukleasen EcoRI und BamHI wird das Fragment in die entsprechenden Schnittstellen des E. co//'-Expressionsvektors pUC18 kloniert und in einem geeigneten Stamm (zum Beispiel E. coli DH12S) transformiert. Aus den erhaltenen Transformanden kann durch Blau/weiß-Selektion der gewünschte Kandidat idienti- fiziert, aktiv exprimiert und so in ausreichender Menge für weitere Untersuchungen erhalten werden.
HP53dc
Von der nach Beispiel 3 erhaltenen und in Beispiel 5 beschriebenen Protease des Klons mit der Bezeichnung HP53Pa_2 wurden C'-terminal 330 bp deletiert. Diese Aminosäresequenz HP53_deltaC ist in SEQ ID NO. 8 dargestellt.
Hierfür wird von der in SEQ ID NO. 6 angegebenen DNA mit den Oligonukleotiden HP53f (SEQ ID NO. 12) und HP53r (SEQ ID NO. 13) als Primern unter Standard-PCR- Bedingungen ein 1303 bp großes DNA-Stück generiert. Nach Bearbeitung des erhaltenen Fragments mit den Endonukleasen Blpl und BamHI wird das Fragment in die entsprechenden Schnittstellen des oben im ersten Teil des Beispiels gewonnenen E. co//-Expressionsvektors pUC18_HP70_dc kloniert, der zuvor mit denselben Endonukleasen bearbeitet worden ist.
Nach Transformation in einem geeigneten Stamm (zum Beispiel E. coli DH12S) kann aus den erhaltenen Transformanden durch Restriktionsanalyse mit Sacll (pUC_HP53_dc enthält eine solche Schnittstelle) der gewünschte Kandidat identifiziert, aktiv exprimiert und so in ausreichender Menge für weitere Untersuchungen erhalten werden.
Aufgrund dieser Konstruktion wird in SEQ ID NO. 8 vermerkt, daß es sich wie bei SEQ ID NO. 5 um eine künstliche Sequenz handelt, konkretisiert mit der Angabe „DNA-Isolat, Delta C". Ferner wurde dabei der Abschnitt der Positionen 1 bis 32 gemäß SEQ ID NO. 5 eingeführt, so daß dieser als Signalpeptid von HP70 betrachtet werden muß.
Beispiel 7
Quantitative Gewinnung der erfindungsgemäßen Proteasen und deren biochemische Charakterisierung
Die nach den Beispielen 3 bis 6 erhaltenen Expressionsklone wurden in 100 ml LB- Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l, Hefeextrakt, 10 g/l NaCI) aufgenommen und in 500 ml- Erlenmeyer-Kolben bei 37°C und unter Schütteln bei 200 rpm kultiviert.
Anschließend wurden sie biochemisch charakterisiert. Hierbei wurde die proteolytische Aktivität über einen sogenannten MTP-Assay ermittelt, der auf einem Fluoreszenzgekoppelten Caseinsubstrat (BODIPY®FL Conjugate, Fa. Molecular Probes, Göttingen, Deutschland; Best.-Nr. #6638) basiert, an welches Fluorophore (Emitter) und Dämpfer (Quencher) gekoppelt sind. Im intakten Substrat wird eine Fluoreszenz der Emitter durch die Quencher unterdrückt. Bei Hydrolyse des Caseins entfernen sich jedoch die Oligopeptide mit den an sie gekoppelten Gruppen voneinander und es kommt bei entsprechender Anregung zur Fluoreszenzemission, deren Intensität somit ein Maß für die Proteolyse darstellt.
Zur Aktivitätsbestimmung werden jeweils 5 μl einer Proteaseprobe gemäß Beispiel 5 in 100 mM Tris/HCI mit dem gewünschten pH-Wert und 4,5 μg/ml BODIPY® FL Conjugate in einem Gesamtvolumen von 100 μl für 1h bei der interessierenden Temperatur inkubiert. Alle nachfolgend angegebenen Messungen erfolgten in 96well-Mikrotiterplatten (Opaque® Plates, black; Fa. Corning BV Life Sciences, Schiphol-Rijk, Niederlande; Bestell.-Nr. #3915) mit Hilfe eines FLUOstar®-Fluorezenz-Meßgeräts (Fa. BMG Lab Technologies, Offenburg, Deutschland).
pH- und Temperaturoptimum
Für die in SEQ ID NO. 7 dargestellte Protease HP53 ergeben sich folgende biochemische Parameter: pH-Optimum bei 37°C: 8,6 und Temperaturoptimum bei pH 8,6: 37°C.
Einfluß von Komplexbildnern
Der Einfluß von Komplexbildnern wurde durch Zugabe von 1mM EDTA bei pH 8,6 im oben angegebenen Assay untersucht, und zwar bei 37°C und 50°C. Der Meßwert ohne Zugabe von EDTA wurde auf 100% gesetzt. Demgegenüber lag die relative proteolytische Aktivität bei 50°C bei 27% und bei 37°C bei 10%.
Stabilitätsmessung
Zur Messung der Stabilität wurde die eingesetzte Proteaseprobe zunächst für 15 min bei 50°C in 50 mM NaHCO3-Puffer, pH 10,9 vorinkubiert und danach die Restaktivität im o.g. Assay bei 37°C und 50°C, bei jeweils pH 8,6 gemessen. Hierbei wurde die Aktivität desselben Extrakts ohne Vorinkubation aber ansonsten gleicher Behandlung jeweils auf 100% gesetzt. Auf diese Weise wurde für 37°C eine Restaktivität von 11% und für 50°C von 13% ermittelt.
Es handelt sich somit um Moleküle, welche gegenüber hohen pH-Werten relativ stabil sind, und dies sogar nahezu unabhängig von der Temperatur.
Beispiel 8
Beitrag der erfindungsgemäßen Protease HP70 zur Waschleistung bei niedrigerer
Temperatur
Für dieses Beispiel wurden standardisiert mit Anschmutzungen versehene Textilien eingesetzt, die von der Eidgenössischen Material-Prüfungs- und -Versuchsanstalt, St. Gallen, Schweiz (EMPA), bezogen worden waren. Dabei wurden folgende Anschmutzungen und Textilien verwendet: A (Blut/Milch/Tusche auf Baumwolle), B (Blut/Milch/Tusche auf einem Polyester-Baumwolle-Mischgewebe) und C (Ei/Ruß auf Baumwolle).
Mit diesem Testmaterial wurden verschiedene Waschmittelrezepturen launderometrisch auf ihre Waschleistung hin untersucht. Dafür wurde jeweils ein Flottenverhältnis von 1:12 eingestellt und für 30 min bei einer Temperatur von 40°C gewaschen. Die Dosierung lag bei 5,9 g des jeweiligen Mittels pro I Waschflotte. Die Wasserhärte betrug 16° deutscher Härte.
Als Kontroll-Waschmittel diente eine Waschmittel-Basis-Rezeptur folgender Zusammensetzung (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 4 % lineares Alkylbenzolsulfonat (Natrium-Salz), 4 % Cι2-C18-Fettalkoholsulfat (Natrium-Salz), 5,5 % C12-C18-Fettalkohol mit 7 EO, 1 % Natrium-Seife, 11 % Natriumcarbonat, 2,5 % amorphes Natriumdisilikat, 20 % Natriumperborat-Tetrahydrat, 5,5 % TAED, 25 % Zeolith A, 4,5 % Polycarboxylat, 0,5 %> Phosphonat, 2,5 % Schauminhibitorgranulat, 5 % Natriumsulfat, Rest: Wasser, optischer Aufheller, Salze.
Sie wurde in parallelen Ansätzen jeweils aktivitätsgleich mit der erfindungsgemäßen und einer Kontroll-Protease versetzt. Zur Kontrolle diente die B. /eπ us-Alkalische Protease F49 (WO 95/23221 A1; Hersteller: Firma Biozym, Kundl, Österreich). Diese besaß eine (nach der in der Beschreibung angegebenen Methode bestimmbare) spezifische Aktivität von ca. 200.000 PE/g, wodurch sich mit 0,2 Gew.-%> eine F49- Konzentration von ca. 40.000 PE pro 100 g des Mittels und eine Aktivität von ca. 2.400 PE pro I Waschflotte ergaben. Zusätzlich wurden Rezepturen hergestellt, die unter Verzicht auf eine entsprechende Menge an Salzen jeweils 0,5 %, also die zweieinhalbfache Protease-Menge enthielten. Die erfindungsgemäße Protease wurde derselben Basisrezeptur in denselben Aktivitäts-Konzentrationen zugesetzt. Insofern sind die in der nachfolgenden Tabelle angegebenen Gew.-%-Werte für F49 korrekt und gelten für HP70 näherungsweise.
Nach dem Waschen wurde der Weißheitsgrad der gewaschenen Textilien im Vergleich zu dem von Bariumsulfat gemessen, der auf 100 % normiert worden war. Die Messung erfolgte an einem Spektrometer Datacolor SF500-2 bei 460 nm (UV-Sperrfilter 3), 30 mm Blende, ohne Glanz, Lichtart D65, 10°, d/8°. Die erhaltenen Ergebnisse werden als Prozent Remission, das heißt als Prozentangaben im Vergleich zu Bariumsulfat zusammen mit den jeweiligen Anfangswerten in folgender Tabelle 3 zusammengestellt. Angegeben sind die Mittelwerte aus jeweils drei Messungen. Sie erlauben einen unmittelbaren Rückschluß auf den Beitrag des enthaltenen Enzyms zur Waschleistung des verwendeten Mittels.
Tabelle 3: Beitrag der erfindungsgemäßen Protease HP70 zur Waschleistung bei einer Temperatur von 40°C
Figure imgf000092_0001
Alle drei Meßreihen belegen, daß die erfindungsgemäße Protease HP70 gegenüber proteasefreien Waschmitteln eine Verbesserung der Waschleistung an proteinhaltigen Anschmutzungen erbringt. Das heißt, sie entfaltet auch in Gegenwart denaturierender Agentien wie etwa Tensiden eine proteolytische Aktivität. Die ermittelten Werte für die ß. /et?ft/s-Alkalische Protease F49, einem für dieses Einsatzgebiet über Punktmutagenese optimiertes Molekül (vergleiche WO 95/23221 A1) belegen die Korrektheit der Versuchsdurchführung. In der Meßreihe A und bei der niedrigeren Konzentration in Meßreihe B übertraf HP70 sogar das Ergebnis für F49; die übrigen Werte sind denen für F49 vergleichbar.
Beispiel 9 Beitrag der erfindungsgemäßen Protease HP53 zur Waschleistung bei niedrigerer Temperatur
Der vorangegangene Versuch wurde mit der erfindungsgemäßen Protease HP53 wiederholt. Die Bedingungen waren dieselben. Allerdings wurde die Leistung statt an der Anschmutzung C an der Anschmutzung D (Blut auf Baumwolle) ermittelt. Das Ergebnis ist in folgender Tabelle 4 zusammengestellt.
Tabelle 4: Beitrag der erfindungsgemäßen Protease HP53 zur Waschleistung bei einer Temperatur von 40°C
Figure imgf000093_0001
Diese Meßreihen belegen, daß auch die erfindungsgemäße Protease HP53 gegenüber proteasefreien Waschmitteln eine Verbesserung der Waschleistung an proteinhaltigen Anschmutzungen erbringt. Das heißt, sie entfaltet auch in Gegenwart denaturierender Agentien wie etwa Tensiden oder Bleiche eine proteolytische Aktivität. Die ermittelten Werte sind denen für die ß. tenft/s-Alkalische Protease F49 zumindest vergleichbar, in den Meßreihen A und B sogar deutlich überlegen.
Beispiel 10 Beitrag der erfindungsgemäßen Protease HP53dc zur Waschleistung bei niedrigerer Temperatur
Wie in den vorangegangenen beiden Beispielen wurde auch die Variante HP53dc hinsichtlich ihres Leistungsbeitrags bezüglich der Anschmutzungen A, B und C untersucht. Die Bedingungen waren wiederum dieselben. Das Ergebnis ist in folgender Tabelle 5 zusammengestellt. Tabelle 5: Beitrag der erfindungsgemäßen Protease HP53dc zur Waschleistung bei einer Temperatur von 40°C
Figure imgf000094_0001
Diese Meßreihen belegen, daß auch die erfindungsgemäße Protease HP53dc gegenüber proteasefreien Waschmitteln eine Verbesserung der Waschleistung an proteinhaltigen Anschmutzungen erbringt. Das heißt, sie entfaltet auch in Gegenwart denaturierender Agentien wie etwa Tensiden oder Bleiche eine proteolytische Aktivität. Die ermittelten Werte sind in den Meßreihen A und B denen für die ß. /errfus-Alkalische Protease F49 deutlich überlegen und in Reihe C zumindest vergleichbar.
Beispiel 11 Beitrag der erfindungsgemäßen Protease HP53dc zur Waschleistung bei höherer Temperatur
Der vorangegangene Versuch wurde mit HP53 an den beiden Anschmutzungen A und B bei einer Waschtemperatur von 60°C unter ansonsten identischen Bedingungen wiederholt. Das Ergebnis ist in folgender Tabelle 6 zusammengestellt.
Tabelle 6: Beitrag der erfindungsgemäßen Protease HP53dc zur Waschleistung bei einer Temperatur von 60°C
Figure imgf000094_0002
Figure imgf000095_0001
Auch bei der Temperatur von 60°C zeigt sich in den Meßreihen A und B die Überlegenheit der erfindungsgemäßen Protease HP53dc gegenüber der ß. lentus- Alkalischen Protease F49. Erfreulicherweise wird die erfindungsgemäße Protease HP53dc bei 60°C nicht nennenswert denaturiert, so daß sie insbesondere als Waschmittelprotease in Frage kommt.
Beschreibung der Figuren
Figur 1 : Alignment der erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen HP70 und HP53 (SEQ ID NO. 4 beziehungsweise 7) mit Alkalischen Proteasen aus dem Stand der Technik. Darin bedeuten:
HP70: Erfindungsgemäße Alkalische Protease gemäß SEQ ID NO. 4;
HP53: Erfindungsgemäße Alkalische Protease gemäß SEQ ID NO. 7;
SP: Extrazelluläre Serin-Protease (E.C. 3.4.21.-) aus Xanthomonas campestris pv. campestris (ATCC 33913) (Zugangs-Nr. NP_636242 bei GenBank); BLAP: Alkalische Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 (WO 92/21760 A1 ).
Figur 2: Alignment der Gene der erfindungsgemäßen Alkalische Proteasen HP70 und HP53 (SEQ ID NO. 3 beziehungsweise 6) mit denen von Alkalischen Proteasen aus dem Stand der Technik. Darin bedeuten: HP70: Gen der erfindungsgemäße Alkalischen Protease HP70 gemäß SEQ ID NO. 3; HP53: Gen der erfindungsgemäßen Alkalischen Protease HP53 gemäß SEQ ID NO. 6; SP: Gen der extrazellulären Serin-Protease (E.C. 3.4.21.-) aus Xanthomonas campestris pv. campestris (ATCC 33913) (Zugangs-Nr. NP_636242 bei GenBank); BLAP: Gen der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 (WO 92/21760 A1).
Figur 3: Schematische Darstellung des zur Anlage einer Expressions-Genbank gemäß Beispiel 2 verwendeten Plasmidvektors pUC18. Der Vektor wurde zur Aufnahme der mit Alu I verdauten Metagenom-DNA mit Sma I linearisiert. Darin bedeuten: ORI: Replikationsursprung
Plac: lac-Promotor lacZ-alpha: Gen für das Alpha-Peptid der Beta-Glactosidase ampR: Ampicillinresistenz-vermittelnde Beta-Lactamase
Figur 4: Alignment der Aminosäuresequenzen der beiden erfindungsgemäßen Proteasen HP70 (SEQ ID NO. 4) und HP53 (SEQ ID NO. 7) zur Entwicklung der Consensus-Sequenz von SEQ ID NO. 9. Die darin als Variablen X bezeichneten Aminosäure-Positionen lassen sich dieser Abbildung zufolge entweder auf HP70 oder auf HP53 zurückführen.

Claims

Patentansprüche
1. Alkalische Protease, deren Aminosäuresequenz zu der in SEQ ID NO. 4 angebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 90% oder zu der in SEQ ID NO. 7 angebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 87,5% identisch ist.
2. Alkalische Protease nach Anspruch 1 , deren Aminosäuresequenz zu der in SEQ ID NO. 4 angegebenen Aminosäuresequenz zunehmend bevorzugt zu mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist oder zu der in SEQ ID NO. 7 angegebenen Aminosäuresequenz zunehmend bevorzugt zu mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.
3. Alkalische Protease nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Homologiewerte jeweils für den Bereich gelten, der den Aminosäurepositionen 33 bis 581 gemäß SEQ ID NO. 4 oder 39 bis 586 gemäß SEQ ID NO. 7 entspricht.
4. Alkalische Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Homologiewerte ab mindestens 90% Identität jeweils für den Bereich gelten, der den Aminosäurepositionen 33 bis 470 gemäß SEQ ID NO. 5 oder 33 bis 470 gemäß SEQ ID NO. 8 entspricht.
5. Alkalische Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 4, mit einer Aminosäuresequenz gemäß der Consensus-Sequenz von SEQ ID NO. 9, vorzugsweise im Bereich der Aminosäurepositionen 39 bis 587, besonders bevorzugt im Bereich der Aminosäurepositionen 39 bis 476.
6. Alkalische Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die von einer Nukleotidsequenz codiert wird, die zu der in SEQ ID NO. 3 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist, insbesondere für den Bereich, der den Nukleotidpositionen 97 bis 1746 gemäß SEQ ID NO. 3 entspricht, ganz besonders für den Bereich, der den Nukleotidpositionen 97 bis 1410 gemäß SEQ ID NO. 3 entspricht, oder die von einer Nukleotidsequenz codiert wird, die zu der in SEQ ID NO. 6 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 90%., 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist, insbesondere für den Bereich, der den Nukleotidpositionen 115 bis 1761 gemäß SEQ ID NO. 6 entspricht, ganz besonders für den Bereich, der den Nukleotidpositionen 115 bis 1428 gemäß SEQ ID NO. 6 entspricht.
7. Alkalische Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die aus einem natürlichen Habitat isolierbar ist oder die sich von einer aus einem natürlichen Habitat isolierbaren Nukleinsäure ableitet.
8. Alkalische Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die oder deren zugehörige Nukleinsäure aus einem Organismus stammt, der aus einem natürlichen Habitat isolierbar ist.
9. Alkalische Protease nach Anspruch 8, wobei es sich um einen Mikroorganismus handelt, vorzugsweise um einen Pilz oder ein Bakterium, hierunter bevorzugt um ein grampositives Bakterium und besonders bevorzugt um eines der Gattung Bacillus.
10. Von einer Alkalischen Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 9 durch Fragmentierung oder Deletionsmutagenese abgeleitete Alkalische Protease oder Protein mit mindestens 100 und zunehmend bevorzugt mindestens 150, 200, 250 und ganz besonders bevorzugt mindestens 300 bereits im Ausgangsmolekül zusammenhängenden Aminosäuren.
11. Alkalische Protease oder Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 10, abgeleitet von einer Alkalischen Protease oder einem Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 10 durch Insertionsmutagenese, durch Substitutionsmutagenese und/oder durch Fusion mit mindestens einem anderen Protein.
12. Alkalische Protease oder Protein nach Anspruch 11 mit einem oder mehreren Aminosäureaustauschen in den Positionen 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61 , 69, 87, 96, 99, 101 , 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141 , 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211 , 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268 in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus, zuzuordnen über das Alignment in Figur 1.
13. Alkalische Protease oder Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 12, die beziehungsweise das zusätzlich stabilisiert ist.
14. Alkalische Protease oder Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 13, die beziehungsweise das zusätzlich derivatisiert ist.
15. Alkalische Protease oder Protein, die beziehungsweise das wenigstens eine antigene Determinante mit einem der in den Ansprüchen 1 bis 14 bezeichneten Alkalischen Proteasen oder Proteinen gemeinsam hat, insbesondere über mindestens eine der Epitop-Regionen, innerhalb derer die Positionen 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61 , 69, 87, 96, 99, 101 , 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141 , 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211 , 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268 in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus liegen, zuzuordnen über das Alignment in Figur 1.
16. Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 3 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% oder zu der in SEQ ID NO. 6 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% identisch ist.
17. Nukleinsäure nach Anspruch 16, deren Sequenz zu einer der angegebenen Nukleotidsequenzen zunehmend bevorzugt zu mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.
18. Nukleinsäure nach Anspruch 16 oder 17, wobei die Homologiewerte jeweils für den Bereich gelten, der den Nukleotidpositionen 97 bis 1746 gemäß SEQ ID NO. 3 beziehungsweise den Nukleotidpositionen 115 bis 1761 gemäß SEQ ID NO. 6 entspricht.
19. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei die Homologiewerte jeweils für den Bereich gelten, der den Nukleotidpositionen 97 bis 1410 gemäß SEQ ID NO. 3 beziehungsweise den Nukleotidpositionen 115 bis 1428 gemäß SEQ ID NO. 6 entspricht.
20. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 16 bis 19, die für eine Alkalische Protease oder ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 16 codiert.
21. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 16 bis 20, von der eines oder vorzugsweise mehrere Codons durch synonyme Codons ersetzt sind.
22. Zelle eines Organismus, der natürlicherweise eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 16 bis 21 enthält.
23. Zelle nach Anspruch 22, die natürlicherweise eine Protease oder ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 15 exprimiert, vorzugsweise sekretiert.
24. Zelle nach Anspruch 22 oder 23, wobei es sich um einen Mikroorganismus handelt, vorzugsweise um einen Pilz oder ein Bakterium, hierunter bevorzugt um ein grampositives Bakterium und besonders bevorzugt um eines der Gattung Bacillus oder ein gramnegatives Bakterium der Gattung Xanthomonas.
25. Verfahren zur Identifizierung einer Alkalischen Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 15, welches auf der Isolierung einer Nukleinsäure aus einem natürlich besiedelten Habitat beruht.
26. Verfahren nach Anspruch 25, unter Einsatz eines, vorzugsweise zwei einander entsprechenden Oligonukleotiden, die als PCR-Primer dienen können und von einer der beiden Sequenzen SEQ ID NO. 3 oder 6 abgeleitet sind.
27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, wobei die isolierte Nukleinsäure kloniert, vorzugsweise exprimiert und besonders bevorzugt über die Protease-Aktivität des Expressionsprodukts als Protease identifiziert wird.
28. Vektor, der einen in den Ansprüchen 16 bis 21 bezeichneten Nukleinsäurebereich enthält.
29. Klonierungsvektor nach Anspruch 28.
30. Expressionsvektor nach Anspruch 28.
31. Zelle, die nach gentechnischer Modifizierung einen in den Ansprüchen 16 bis 21 bezeichneten Nukleinsäurebereich enthält.
32. Zelle nach Anspruch 31 , wobei der genannte Nukleinsäurebereich auf einem Vektor liegt, insbesondere auf einem Vektor nach einem der Ansprüche 28 bis 30.
33. Zelle nach Anspruch 31 oder 32, die eine der in einem der Ansprüche 1 bis 15 bezeichneten Alkalischen Proteasen oder Proteine exprimiert, vorzugsweise sekretiert.
34. Zelle nach einem der Ansprüche 31 bis 33, bei der es sich um ein Bakterium handelt.
35. Zelle nach Anspruch 34, wobei es sich um ein gramnegatives Bakterium handelt, insbesondere eines der Gattungen Escherichia coli, Klebsieila, Pseudomonas oder Xanthomonas, insbesondere um Stämme von E. coli K12, E. coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. co// DH5α, E.coli JM109, E coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
36. Zelle nach Anspruch 34, wobei es sich um ein grampositives Bakterium handelt, insbesondere eines der Gattungen Bacillus, Staphylococcus oder Corynebacterium, ganz besonders der Species Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii oder B. alcalophilus, Staphylococcus carnosus oder Corynebacterium glutamicum.
37. Zelle nach einem der Ansprüche 31 bis 33, wobei es sich um eine eukaryontische Zelle handelt, vorzugsweise eine der Gattung Saccharomyces.
38. Verfahren zur Herstellung einer Alkalischen Proteasen oder eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 15.
39. Verfahren nach Anspruch 38 unter Einsatz einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 16 bis 21, vorzugsweise unter Einsatz eines Vektors nach einem der Ansprüche 28 bis 30, besonders bevorzugt unter Einsatz einer Zelle nach einem der Ansprüche 31 bis 37.
40. Verfahren nach Anspruch 38 oder 39, wobei die Nukleotidsequenz in einem oder vorzugsweise mehreren Codons an die Codon-Usage des Wirtsstamms angepaßt worden ist.
41. Mittel, enthaltend eine Alkalische Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 15.
42. Mittel nach Anspruch 41, wobei es sich um ein Wasch- oder Reinigungsmittel handelt.
43. Mittel nach Anspruch 42, welches die Alkalische Protease in einer Menge von 2 μg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg, ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 mg pro g des Mittels enthält.
44. Mittel nach Anspruch 42 oder 43, welches zusätzlich weitere Enzyme, insbesondere andere Proteasen, Amylasen, Cellulasen, Hemicellulasen, Oxidoreduktasen und/oder Lipasen enthält.
45. Mittel nach Anspruch 41, wobei es sich um ein Mittel zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege handelt.
46. Mittel nach Anspruch 41 zur Behandlung von Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen, insbesondere von solchen mit Wolle oder Seide.
47. Verfahren zur maschinellen Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, wobei in wenigstens einem der Verfahrensschritte eine Alkalische Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 15 aktiv wird.
48. Verfahren nach Anspruch 47, wobei die Alkalische Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt wird.
49. Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege, wobei in wenigstens einem der Verfahrensschritte eine Alkalische Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 15 aktiv wird.
50. Verfahren nach Anspruch 49 für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.
51. Verwendung einer Alkalischen Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen.
52. Verwendung nach Anspruch 51, wobei die Alkalische Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt wird.
53. Mittel nach Anspruch 41 , wobei es sich um ein Kosmetikum handelt.
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