WO2005095981A1 - 抗robo1抗体を用いる癌の診断および治療 - Google Patents

抗robo1抗体を用いる癌の診断および治療 Download PDF

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Yoshitaka Hippo
Akira Watanabe
Masahisa Fukayama
Yukio Ito
Masahiro Arai
Hirotaka Ito
Toshihiko Ohtomo
Shin-Ichi Funahashi
Yasuko Kinoshita
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    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
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    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing and treating cancer, a method for monitoring the severity of hepatitis, and a cell growth inhibitor and an anticancer agent.
  • ROB01 was identified as a molecule controlling the median crossing of axons, and subsequent studies have reported that it acts as a receptor for the Slit protein (Kidd et al., Cell, 92, 205-215, 1998, Wang et al., Cell, 96, 771-784, 1999, Fig., Cell, 96, 785-794, 1999, Brose et al., 96, 795-806, 1999).
  • the expression of the human ROB01 gene chromosome region 3p12 which is highly defective in lung cancer and that the promoter region of ROB01 is methylated in breast cancer and kidney cancer, is expressed.
  • ROB01 is expressed in neovascular blood vessels of cancer, and that the expression of Slit2, a ligand of ROB01, is enhanced in cancer cells, thereby inducing cancer angiogenesis and conversely directing the growth of cancer (Wang Et al., Cancer Cell, 4, 19-29, 2003).
  • the expression of the Slit2 gene which is a ligand of ROB01, is suppressed in many cancer types by methylation, etc., or by forcibly expressing Slit2 or by adding Slit2, lung cancer cells, breast cancer cells, Slit2, a ligand of ROB01, is also thought to be a tumor suppressor gene because of its antiproliferative action and apoptosis-inducing action in colorectal cancer cells (Dallol et al., Cancer Research, 62, 5874-5880). , 2002, Dallol et al., Cancer Research, 63, 1054-1058, 2003). Only However, in this report, it is not clear which receptor the cytostatic effect of Slit2 is actually mediated, and the link between ROB01 and cancer is not always clear.
  • hepatocellular carcinoma biochemical analysis of serum GOP / GTP, alkaline phosphatase, albumin, etc., and the value of AFP (a-fetoprotein), which is a tumor marker, etc., and After comprehensive evaluation based on diagnostic imaging, if necessary, small biopsy specimens are taken by needle biopsy, and a definitive diagnosis is made based on pathological judgment.
  • tumor markers are used especially in the diagnosis of hepatocellular carcinoma, and alpha phytoprotein, the most used of them, is used.
  • the positive rate of (AFP) in hepatocellular carcinoma patients is about 60 to 70%, but may be positive in patients with chronic liver disease and pregnant women.
  • PIVKA-II a liver cancer tumor marker
  • PIVKA-II a liver cancer tumor marker
  • Diagnosis of liver disease Monitors currently diagnoses inflammation, fibrosis, and transition to cancer by testing with various types of markers and biopsy.
  • viral infections, hepatitis, chronic hepatitis, cirrhosis and Transform to liver cancer In many patients with liver cancer, viral infections, hepatitis, chronic hepatitis, cirrhosis and Transform to liver cancer. Therefore, the development of a method that can easily diagnose and monitor liver disease is useful not only in terms of medical economy, but also in reducing the burden on patients and obtaining accurate medical guidelines.
  • hepatocellular carcinoma there are no clinical applications for hepatocellular carcinoma, but in breast cancer or lymphoma, etc., targeted therapy with a monoclonal antibody against a tumor-specific tumor antigen, and a mechanism of action different from conventional chemotherapeutic treatment.
  • the response rate is raised.
  • the mechanism of action of the antibody drug includes antibody-dependent cytotoxicity (ADCC) through effector cells or complement-dependent cytotoxicity (CDC) by complement, and agonism by the function of the antibody itself. Some of them utilize the action or neutralizing activity of the antibody. Since molecular targeted therapy has now begun to be applied in clinical settings, antibody drug therapy targeting tumor-specific expressed molecules against hepatocellular carcinoma cells by applying these molecular targeted therapies is highly expected in the future Think of it as something.
  • An object of the present invention is to provide a novel method of diagnosing and treating cancer, and a novel cytostatic and anticancer agent, and a method of diagnosing and monitoring liver disease.
  • the present inventors have found that ROB01 is highly expressed in cancer cells such as hepatocellular carcinoma, lung cancer, breast cancer, uterine cancer, stomach queen, brain tumor, and colon cancer. Furthermore, the complement-dependent cytotoxicity (CDC) of the anti-ROB01 antibody was measured. The cells were found to have CDC activity against ROB01-expressing cells. On the other hand, we found that blood ROB01 levels increased due to severe liver disease. Based on the above findings, the present inventors conclude that the anti-ROB01 antibody is effective for the diagnosis, prevention and treatment of hepatocellular carcinoma and other cancers in which ROB01 expression is upregulated, and that the diagnosis and monitoring of liver diseases Thus, the present invention was completed.
  • the present invention provides a method for diagnosing cancer, characterized by detecting the ROB01 protein.
  • the extracellular region of the ROB01 protein is preferably detected.
  • the method of the present invention is performed using an antibody that recognizes the ROB01 protein.
  • ROB01 protein in blood, serum, or plasma, or ROB01 protein separated from cells is detected.
  • the invention provides the following step:
  • the present invention provides a kit for diagnosing cancer, comprising an antibody that binds to the ROB01 protein.
  • the cancer is hepatocellular carcinoma.
  • the antibody is an antibody that binds to the extracellular region of the ROB01 protein.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising an antibody that binds to ROB01 as an active ingredient.
  • the present invention also provides a cell growth inhibitor containing an antibody that binds to ROB01 as an active ingredient.
  • the present invention also provides an anticancer agent containing an antibody that binds to ROB01 as an active ingredient.
  • the antibody that binds to ROB01 is an antibody that has cytotoxic activity.
  • the cancer is hepatocellular carcinoma.
  • the present invention relates to a method for treating a disease caused by abnormal cell proliferation, which comprises administering to a patient in need of treatment a pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, an antibody that binds to ROB01. Providing a method comprising administering.
  • the present invention also provides a method of treating cancer, wherein the antibody binds to ROB01 in a patient in need of treatment. And administering a pharmaceutical composition containing as an active ingredient.
  • the cancer is hepatocellular carcinoma.
  • the present invention provides a method for causing cell damage to ROB01-expressing cells by contacting the ROB01-expressing cells with an antibody that binds to ROB01.
  • the present invention also provides a method for suppressing the growth of ROB01-expressing cells by contacting the ROB01-expressing cells with an antibody that binds to ROB01.
  • the antibody that binds to ROB01 is an antibody that has cytotoxic activity.
  • the ROB01-expressing cell is a cancer cell.
  • the present invention provides an antibody that binds to ROB01 and has cytotoxic activity against ROB01-expressing cells.
  • the present invention provides a kit for monitoring hepatitis severity, which comprises an anti-ROB01 antibody.
  • the anti-ROB01 antibody is
  • kits of the present invention predicts the transition from hepatitis or cirrhosis to liver cancer.
  • the kit of the present invention comprises a first anti-ROB01 antibody immobilized on a support and a second anti-ROB01 antibody labeled with a labeling substance.
  • the present invention provides a method for monitoring the severity of hepatitis, comprising measuring ROB01 in a test sample.
  • ROB01 in the test sample is measured using an anti-ROB01 antibody.
  • the anti-ROB01 antibody is an antibody that specifically recognizes ROB01.
  • the test sample is blood, serum or plasma.
  • the monitoring method of the present invention predicts the transition from hepatitis or cirrhosis to liver cancer.
  • the monitoring method of the present invention is performed using a first anti-ROB01 antibody immobilized on a support and a second anti-ROB01 antibody labeled with a labeling substance.
  • FIG. 1 shows the results of ROBO1 gene expression analysis using GeneChipU133.
  • Fig. 1a Expression analysis of ROB01 gene in normal tissues and non-cancerous sites
  • Fig. 1 b Analysis of ROB01 gene expression in clinical samples
  • Fig. 1c Expression of ROB01 gene in cancer cell lines Expression analysis.
  • FIG. 2 shows the results of analysis of ROB01 gene expression using GeneChipU95.
  • FIG. 3 shows the results of Western analysis in a lysate of COS7 cells and HEK293 cells by transient expression of the full-length ROB01 gene, and the results of pentane analysis in the culture supernatant.
  • FIG. 4 shows the results of Western analysis in a liver cancer cell line lysate using the anti-ROB01 monoclonal antibody A7241A.
  • FIG. 5 shows the results of immunohistochemical staining analysis of hepatocytes; @paraffin specimen using anti-ROB01 monoclonal antibody A7241A.
  • FIG. 6 shows the results of Western analysis of soluble ROB01 in patient serum using the anti-ROB01 monoclonal antibody A7241A.
  • FIG. 7 shows the results of Western analysis of HEK293 cells in which full-length ROB01 gene was forcibly expressed using SROB01-immunized egret serum.
  • FIG. 8 shows the results of FACS analysis of a lysate of HEK293 cells in which full-length ROB01 gene was forcibly expressed using SROB01-immunized egret serum.
  • FIG. 9 shows the results of FACS analysis of HepG2 cell lysates using SROB01-immunized egret serum.
  • FIG. 10 shows a standard curve of ROB01 measurement by Enzymimnoassay using a perch anti-SROB01 antibody.
  • FIG. 1 shows the correlation between the ROB01 concentration and the severity of liver disease.
  • FIG. 12 shows changes in ROB01 concentration in patients with liver disease.
  • FIG. 13 shows the results of measuring the CDC activity of anti-ROB01 antiserum on ROB01-expressing HEK293 cells.
  • FIG. 14 shows the CDC activity of the anti-ROB01 monoclonal antibody on ROB01-expressing HEK293 cells.
  • FIG. 15 shows the CDC activity of anti-ROB01 monoclonal antibody against ROB01-expressing Alexander cells.
  • FIG. 16 shows ADCC activity of anti-ROB01 monoclonal antibody against ROB01-expressing HEK293 cells. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • ROB01 (RoundaboutD is an axonal guidance receptor protein. Its amino acid sequence and the gene sequence encoding it are GenBank number for variant 1.
  • NM—002941 (SEQ ID NOS: 9 and 10) and Noriant 2 are disclosed in GenBank number NM-133631 (SEQ ID NOs: 11 and 12).
  • the ROB01 protein is meant to include both a full-length protein and a fragment thereof.
  • a fragment is a polypeptide that includes any region of the ROB01 protein and may not have the function of the native ROB01 protein. Examples of fragments include, but are not limited to, fragments that include the extracellular region of the ROB01 protein.
  • the extracellular region of ROB01 protein is 1-8 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • transmembrane region corresponds to 8 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • ROB01 in hepatocellular carcinoma, the expression of ROB01 is extremely frequently increased at the gene level and the protein level. Analysis of clinical specimens and cancer cell lines of other cancer types indicated that expression may be upregulated not only in hepatocellular carcinoma but also in lung, breast, uterine, stomach, brain and colon cancers. . In addition, it was shown that immunohistodiagnosis was possible by using a monoclonal antibody specific to ROB01. In addition, ROB01 was shed in vivo, and soluble ROB01 (SROB01) was found to be present in the blood of cancer patients. That is, SROB01 is useful as a serum diagnostic marker for cancer.
  • the ROB01 protein detected in the present invention is preferably a human ROB01 protein, but is not limited thereto, and may be any ROB01 such as a dog ROB01, a cat ROB01, a mouse ROB01, a hamster ROB01.
  • detection includes quantitative or non-quantitative detection.
  • non-quantitative detection includes simply measuring whether or not ROB01 protein is present, Examples include measuring whether or not ROB01 protein is present in a certain amount or more, and comparing the amount of ROB01 protein with another sample (for example, a control sample, etc.). Measurement of the concentration of
  • test sample is not particularly limited as long as it is a sample that may contain the ROB01 protein, but is preferably a sample collected from the body of an organism such as a mammal, and more preferably a sample collected from a human. is there.
  • test samples include, for example, blood, interstitial fluid, plasma, extravascular fluid, cerebrospinal fluid, synovial fluid, pleural fluid, serum, lymph fluid, saliva, urine, etc.
  • blood, serum, or plasma is preferred.
  • a sample obtained from a test sample such as a culture solution of cells collected from the body of an organism, is also included in the test sample of the present invention.
  • the cancer to be diagnosed is not particularly limited and may be any cancer. Specifically, liver cancer, kidney cancer, lung cancer, colon cancer, breast cancer, kidney cancer, brain tumor, uterine cancer, lung cancer, stomach cancer, prostate cancer, leukemia And lymphoma. Preferred is liver cancer, and particularly preferred is hepatocellular carcinoma.
  • a preferred embodiment of the diagnostic method of the present invention includes a diagnostic method characterized by detecting ROB01 protein released from cells and present in blood. Particularly preferably, a fragment containing the extracellular region of the ROB01 protein present in blood is detected.
  • the method for detecting the ROB01 protein contained in the test sample is not particularly limited, but detection by an immunological method using an anti-ROB01 antibody is preferred.
  • immunological methods include, but are not limited to, radioimmunoassay, enzymimmunoassay, fluorescence immunoassay, luminescence immunoassay, immunoprecipitation, immunoturbidimetry, and Wessmann Examples include immunoblotting, immunostaining, and immunodiffusion methods. Enzyme immunoassay is preferred, and enzyme-linked immunosorbent assay is particularly preferred.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • an anti-ROB01 antibody for example, immobilize on an anti-ROB01 antibody support, add a test sample to this, incubate, bind the anti-ROB01 antibody and ROB01 protein, and wash. Then, a method of detecting ROB01 protein in a test sample by detecting ROB01 protein bound to a support via an anti-ROB01 antibody can be mentioned.
  • Examples of the support used to immobilize the anti-ROB01 antibody in the present invention include, for example, agarose, insoluble polysaccharides such as cellulose, silicone resin, polystyrene resin, polyacrylamide resin, nylon resin, and polyforce.
  • examples include synthetic resins such as one-point resins, and insoluble supports such as glass.
  • These supports can be used in the form of beads or plates. In the case of beads, a column filled with these can be used. In the case of a plate, a multiwell plate (eg, a 96-well multiwell plate) or a biosensor chip can be used.
  • the binding between the anti-ROB01 antibody and the support can be achieved by a commonly used method such as chemical bonding or physical adsorption. All of these supports can be used commercially.
  • the binding between the anti-ROB01 antibody and the ROB01 protein is usually performed in a buffer.
  • a buffer for example, a phosphate buffer, a Tris buffer, a citrate buffer, a phosphate buffer, a carbonate buffer, and the like are used.
  • Incubation conditions include conditions that have already been used, for example, incubation at 4 ° C to room temperature for 1 hour to 24 hours. Wash after incubation.
  • Any substance that does not prevent the binding between the ROB01 protein and the anti-ROB01 antibody can be used.
  • a buffer containing a surfactant such as Tween20 is used.
  • a control sample may be provided in addition to the test sample from which the ROB01 protein is to be detected.
  • Control sample Examples include a negative control sample containing no ROB01 protein and a positive control sample containing ROB01 protein. In this case, by comparing the results obtained with the negative control sample without ROB01 protein with the results obtained with the positive control sample containing ROB01 protein,
  • a preferred embodiment of detection of the ROB01 protein bound to the support via the anti-ROB01 antibody includes a method using an anti-ROB01 antibody labeled with a labeling substance. For example, a test sample is brought into contact with an anti-ROB01 antibody immobilized on a support, washed, and then detected using a labeled antibody that specifically recognizes the ROB01 protein.
  • the labeling substance it is possible to use a labeling substance known to those skilled in the art, such as a fluorescent dye, an enzyme, a coenzyme, a chemiluminescent substance, and a radioactive substance.
  • a labeling substance known to those skilled in the art such as a fluorescent dye, an enzyme, a coenzyme, a chemiluminescent substance, and a radioactive substance.
  • radioisotopes 32p, W C , 125 then 3H , 131 !, etc.
  • biotin When using biotin as a labeling substance, it is preferable to add an avidin to which an enzyme such as alkaline phosphatase is added after the addition of the biotin-labeled antibody.
  • an avidin to which an enzyme such as alkaline phosphatase is added after the addition of the biotin-labeled antibody.
  • Known methods such as a taraldehyde method, a maleimide method, a pyridyl disulphide method, and a periodic acid method can be used.
  • a solution containing an anti-ROB01 antibody is added to a support such as a plate, and the anti-ROB01 antibody is immobilized on the support. After washing the plate, block it with, for example, BSA, gelatin, or albumin to prevent nonspecific binding of proteins. Wash again and add the test sample to the plate. -After incubation, wash and add labeled anti-ROB01 antibody. After a suitable incubation, wash the plate and detect any remaining labeled anti-ROB01 antibody on the plate. Detection can be performed by a method known to those skilled in the art. For example, in the case of labeling with a radioactive substance, detection can be performed by liquid scintillation or the RIA method.
  • a substrate can be added, and enzymatic change of the substrate, for example, color development can be detected by an absorptiometer.
  • the substrate include 2,2-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), 1,2-phenylenediamine (ortho-phenylenediamine), 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) and the like.
  • ABTS 2,2-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt
  • TMB 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine
  • a fluorescent substance it can be detected by a fluorometer.
  • a particularly preferred embodiment of the ROB01 protein detection method of the present invention includes a method using an anti-ROB01 antibody labeled with biotin and avidin.
  • a solution containing an anti-ROB01 antibody is added to a support such as a plate to fix the anti-ROB01 antibody. After washing the plate, block with, for example, BSA to prevent non-specific binding of proteins. Wash again and add the test sample to the plate. After incubation, wash and add anti-ROB01 antibody labeled with biotin. After a suitable incubation, wash the plate and add avidin conjugated to an enzyme such as alkaline phosphatase or peroxidase. After the incubation, the plate is washed, a substrate corresponding to the enzyme bound to avidin is added, and the ROB01 protein is detected based on the enzymatic change of the substrate.
  • ROB01 protein detection method of the present invention a method using one or more types of primary antibodies that specifically recognize the ROB01 protein and one or more types of secondary antibodies that specifically recognize the primary antibodies is mentioned. be able to.
  • a test sample is contacted with one or more types of anti-ROB01 antibodies immobilized on a support, incubated, washed, and after washing, the bound ROB01 protein is removed from the primary anti-ROB01 antibody and the primary antibody.
  • the secondary antibody is preferably labeled with a labeling substance.
  • Another embodiment of the method for detecting the ROB01 protein of the present invention includes a detection method utilizing an agglutination reaction.
  • ROB01 can be detected using a carrier sensitized with an anti-ROB01 antibody.
  • any carrier may be used as long as it is insoluble, does not cause nonspecific reaction, and is stable.
  • latex particles bentonite, collodion, kaolin, fixed sheep erythrocytes and the like can be used, but the use of latex particles is preferred.
  • latex particles for example, polystyrene latex particles, styrene-butene copolymer latex particles, polyvinyl toluene latex particles, and the like can be used, and it is preferable to use polystyrene latex particles.
  • Another embodiment of the method for detecting the ROB01 protein of the present invention includes, for example, a method using a biosensor utilizing the surface plasmon resonance phenomenon.
  • a biosensor using the surface plasmon resonance phenomenon can observe protein-protein interactions as surface plasmon resonance signals in real time using a small amount of protein and without labeling.
  • BIAcore manufactured by Amersham Bioscience.
  • a test sample is brought into contact with a sensor chip on which an anti-ROB01 antibody is immobilized, and the ROB01 protein that binds to the anti-ROB01 antibody can be detected as a change in resonance signal.
  • the detection method of the present invention can be automated using various automatic inspection devices, and it is possible to detect a large number of samples at once.
  • the present invention also aims to provide a diagnostic agent or kit for detecting ROB01 protein in a test sample for cancer diagnosis, wherein the diagnostic agent or kit contains at least an anti-ROB01 antibody.
  • the diagnostic agent or kit may contain a carrier for immobilizing the antibody, and the antibody may be loaded in advance. May be attached to the body.
  • the diagnostic agent or kit may contain a carrier to which an antibody is adsorbed. Further, the kit may appropriately contain a blocking solution, a reaction solution, a reaction stopping solution, a reagent for treating a sample, and the like. Preparation of anti-ROB01 antibody
  • the anti-ROB01 antibody used in the present invention only needs to specifically bind to ROB01 protein, regardless of its origin, type (monoclonal or polyclonal) and shape.
  • known antibodies such as a mouse antibody, a rat antibody, a human antibody, a chimeric antibody, and a humanized antibody can be used.
  • the antibody may be a polyclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • the anti-ROB01 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Mammal-derived monoclonal antibodies include those produced by hybridomas and those produced by hosts transformed with expression vectors containing antibody genes by genetic engineering techniques.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be basically produced using a known technique as follows. That is, ROB01 is used as a sensitizing antigen, and immunized with the usual immunization method, and the obtained immune cells are fused with a known parental cell by a normal cell fusion method. It can be produced by screening a single antibody-producing cell.
  • a monoclonal antibody may be prepared as follows. First, ROB01, which is used as a sensitizing antigen for obtaining antibodies, was assigned a GenBank accession number.
  • the target human ROB01 protein is isolated from the host cell or culture supernatant. Purify by a known method. In addition, natural ROB01 can be purified and used. Next, this purified ROB01 protein is used as a sensitizing antigen. Or
  • a partial peptide of ROB01 can also be used as a sensitizing antigen.
  • the partial peptide can be obtained by chemical synthesis from the amino acid sequence of human ROB01, or can be obtained by incorporating a part of the ROB01 gene into an expression vector and expressing it. It can also be obtained by decomposition with a decomposing enzyme.
  • the region and size of ROB01 used as a partial peptide are not limited.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion.
  • rodents Animals, for example, mice, rats, hamsters, or egrets, sals, and the like are used.
  • Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • the sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted and suspended in an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline, and then mixed with an appropriate amount of a normal adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if desired, and emulsified.
  • a suitable carrier can be used during immunization of the sensitizing antigen.
  • immunization is preferably performed by binding to a carrier protein such as albumin, keyhole phosphatase, and mosaicin.
  • immune cells are collected from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Preferred immune cells include: In particular, splenocytes are mentioned.
  • a myeloma cell of a P mammal is used as the other parent cell to be fused with the above-mentioned immunocyte.
  • This myeloma cell is composed of various known cell lines, for example, P3
  • P3x63Ag8.653 ( ⁇ Immnol, (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbioloay and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler.G. And Milstein, C. Eur.J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies.DH et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2 / 0 (Shulman, M. et al.) ., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, SF et al., J.
  • the cell fusion between the immune cells and myeoma cells is basically performed by a known method, for example, the method of Kohler and G. MHstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73 , 3-46).
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) or the like is used, and if necessary, an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added to increase the fusion efficiency.
  • PEG polyethylene glycol
  • HVJ Sendai virus
  • an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added to increase the fusion efficiency.
  • the usage ratio of the immune cells and the myeloma cells can be arbitrarily set. For example, it is preferable that the number of immune cells be 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • the culture medium used for the cell fusion for example, RPMI1640 culture medium, MEM culture medium, and other ordinary culture mediums used for cell culture of this type, which are suitable for the proliferation of the Mie cell line, can be used.
  • a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture solution, and a PEG solution (for example, having an average molecular weight of about 1000 to 6000) which has been heated to about 37 ° C. in advance is usually used for 30 to 60 minutes. % (w / v) and mix to form the desired fused cells (eight hybridomas).
  • a PEG solution for example, having an average molecular weight of about 1000 to 6000
  • % (w / v) and mix to form the desired fused cells (eight hybridomas).
  • an appropriate culture solution is added successively, and the operation of removing the supernatant by centrifugation is repeated to remove a cell fusion agent or the like that is unfavorable for the growth of the hybridoma.
  • the hybridoma thus obtained is selected by culturing it in a normal selective culture medium, for example, a HAT culture medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine).
  • a HAT culture medium a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine.
  • the culturing in the HAT culture solution is continued for a time (usually several days to several weeks) sufficient for cells other than the target hybridoma (non-fused cells) to die.
  • screening and single cloning of hybridomas producing the desired antibody are performed by the usual limiting dilution method.
  • an antibody recognizing ROB01 may be prepared using a method described in International Publication WO03 / 104453.
  • the screening and single cloning of the target antibody may be performed by a screening method based on a known antigen-antibody reaction.
  • the antigen is bound to a carrier such as beads made of polystyrene or a commercially available 96-well microtiter plate, reacted with the hybridoma culture supernatant, washed with the carrier, and then reacted with an enzyme-labeled secondary antibody, etc.
  • a hybridoma producing the desired antibody can be cloned by a limiting dilution method or the like.
  • the antigen used for immunization may be used.
  • An anti-ROB01 antibody-producing cell is obtained by administering ROB01, and a cell antibody obtained by immortalizing the cell may be used to obtain a human antibody against ROB01 (International Publications WO 94/25585, WO 93/12227, WO 92 / 03918, WO 94/02602).
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture solution, and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • a method for obtaining ascites is used.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • a monoclonal antibody a recombinant antibody produced by cloning an antibody gene from a hybridoma, inserting it into an appropriate vector, introducing this into a host, and producing it using gene recombination technology is used.
  • Can be used for example, Vandamme, AM et al "Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990.
  • the variable (V) region of the anti-ROB01 antibody was removed from the hybridoma producing the anti-ROB01 antibody.
  • the encoding mRNA is isolated by known methods, for example, guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, ⁇ ⁇ ⁇ et al, Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski) , Ret al., Anal.Biochem. (1987) 162, 156-159) to prepare total RNA, and use the mRNA Purification Kit
  • mRNA can be directly prepared using the QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • cDNA for the antibody V region is synthesized using reverse transcriptase.
  • the target DNA fragment is purified from the obtained PCR product and ligated to the vector DNA. Further, a recombinant vector is prepared from this, introduced into E. coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector. Then, the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method, for example, a dideoxynucleotide chain-one-minute method. After obtaining DNA encoding the V region of the desired anti-ROB01 antibody, this is incorporated into an expression vector containing DNA encoding the desired antibody constant region (C region).
  • C region desired antibody constant region
  • the antibody gene is incorporated into an expression vector so that it is expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or a promoter.
  • an expression control region for example, an enhancer or a promoter.
  • a host cell is transformed with this expression vector to express the antibody.
  • Antibody gene expression encodes antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain)
  • Host cells may be co-transformed by incorporating the DNA separately into expression vectors Alternatively, host cells may be transformed by incorporating DNAs encoding the H chain and the strand into a single expression vector (see WO 94/11523).
  • an antibody gene When an antibody gene is once isolated and introduced into an appropriate host to produce an antibody, a combination of an appropriate host and an expression vector can be used.
  • an appropriate host When eukaryotic cells are used as hosts, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used.
  • Animal cells include (1) mammalian cells such as CHO, COS, myeloma, and BHK
  • Known plant cells include cells derived from the genus Nicotiana (Nkxrtiana), for example, from Nicotiana tabacum (Nicotians tabacum), which may be callus cultured.
  • Fungal cells include yeast, for example, Saccharomyces
  • the genus Saccharomyces serevisiae
  • filamentous fungi for example, the genus Aspergillus, for example, Aspergillus niger are known.
  • prokaryotic cells there are production systems using bacterial cells.
  • bacteria Escherichia coli (E. coli) and Bacillus subtilis are known.
  • An antibody can be obtained by introducing a desired antibody gene into these cells by transformation, and culturing the transformed cells in vitro.
  • transgenic animals For the production of recombinant antibodies, not only the above host cells but also transgenic animals can be used.
  • an antibody gene is inserted into a gene encoding a protein (eg, goat casein) that is specifically produced in milk to prepare a fusion gene.
  • a DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene has been inserted is injected into a goat embryo, and the embryo is introduced into a female goat.
  • a desired antibody is obtained from milk produced by a transgenic goat born from the goat that has received the embryo or a descendant thereof.
  • Hormones may be used in transgeneic goats as appropriate to increase the amount of milk containing the desired antibody produced from transgenic goats (Ebert, K.. Et al., BioAchnology (1994) 12, 699-702).
  • a recombinant antibody artificially modified for the purpose of, for example, reducing the antigenicity to humans such as a chimeric antibody, humanized (Humanized) antibodies and the like
  • modified antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody is an antibody composed of a heavy chain and light chain variable region of a mouse antibody and a heavy chain and light chain constant region of a human antibody, and encodes a mouse antibody variable region. It can be obtained by ligating DNA to DNA encoding the constant region of a human antibody, incorporating this into an expression vector, introducing it into a host, and producing it.
  • the C region of the chimeric antibody and the humanized antibody those of a human antibody are used.
  • C1, Cr2, CT3, and Ca4 are used, and for the L chain, C / c, C ⁇ can be used.
  • the human antibody C region may be modified to improve the stability of the antibody or its production.
  • a chimeric antibody comprises a variable region of an antibody derived from a mammal other than human and a constant region derived from a human antibody.
  • a humanized antibody is composed of a complementarity determining region of an antibody derived from a mammal other than human, a framework region and a C region derived from a human antibody.
  • Humanized antibodies are useful as an effective component of the therapeutic agent of the present invention because of their reduced antigenicity in the human body.
  • a humanized antibody is also called a reshaped human antibody, and is obtained by transplanting a complementarity determining region (CDR) of a non-human mammal, for example, a mouse antibody, into a complementarity determining region of a human antibody.
  • CDR complementarity determining region
  • the general method of gene recombination is also known. Specifically, a DNA sequence designed to link the CDR of a mouse antibody to the framework region (FR) of a human antibody was prepared by constructing a DNA sequence having an overlapping portion at the end. It is synthesized by PCR from individual oligonucleotides.
  • the obtained DNA is ligated to a DNA encoding the constant region of a human antibody, then incorporated into an expression vector, and introduced into a host to produce it (European Patent Publication EP 239400, International Publication WO 96/96). / 02576).
  • the framework region of the human antibody to be linked via CDR is selected so that the complementarity-determining region forms a favorable antigen-binding site. If necessary, amino acids in the framework region of the antibody variable region may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al. , Cancer Res, 1993, 53, 851 -856.).
  • human lymphocytes are sensitized in vitro with a desired antigen or cells expressing the desired antigen, and the sensitized lymphocytes are fused with human myeloma cells, for example, U266, to obtain the desired antigen-binding activity.
  • Human antibodies can also be obtained (see Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having the entire repertoire of human antibody genes with a desired antigen (WO 93/12227, WO
  • a technique for obtaining a human antibody by panning using a human antibody library is also known '.
  • a phage that binds to an antigen can be selected by expressing the variable region of a human antibody as a single-chain antibody (scFv) on the surface of a phage by the phage display method using a phage display method.
  • scFv single-chain antibody
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined.
  • a human antibody can be obtained by preparing an appropriate expression vector for the sequence.
  • These methods are already well-known and refer to International Publications WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388. be able to.
  • the antibody used in the present invention is not limited to the whole antibody molecule, and may be an antibody fragment or a modified product thereof as long as it binds to ROB01, and includes both bivalent antibodies and monovalent antibodies.
  • Fab fragments of antibody
  • Fv fragments of antibody
  • Fab / c fragments of antibody
  • Fv fragments of antibody
  • Fab / c fragments of antibody
  • Single chain Fv Single chain Fv
  • Antibody fragments can be obtained by treating the antibody with an enzyme, for example, papain or pepsin, to generate antibody fragments, or by constructing a gene encoding these antibody fragments and introducing them into an expression vector, and then transferring the antibody to an appropriate host cell.
  • an enzyme for example, papain or pepsin
  • Co MS et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, AH Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc. ., Plueckthun, A. & Skerra, A.
  • scFv can be obtained by linking the H chain V region and L chain V region of the antibody.
  • the H chain V region and L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, ⁇ S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988). , 85, 5879-5883.).
  • the H chain V region and L chain V region in the scFv may be from any of the antibodies described herein.
  • the peptide linker that connects the V regions for example, any single-chain peptide composed of about 3 to 25 residues is used.
  • the DNA encoding the scFv is selected from the group consisting of the DNA encoding the H chain or H chain V region and the DNA encoding the L chain or L chain V region of the antibody.
  • the DNA portion encoding the amino acid sequence is type III, amplified by the PCR method using a pair of primers defining the both ends, and then the DNA encoding the peptide linker portion, and both ends are H chain and L chain, respectively. It is obtained by amplifying a combination of primer pairs that are defined so as to be ligated.
  • an antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can be used. It is also possible to bind a radioactive isotope, a chemotherapeutic agent, a cytotoxic substance such as a bacterial toxin, etc. to the antibody.
  • PEG polyethylene glycol
  • a radioactive isotope e.g., a radioactive isotope
  • chemotherapeutic agent e.g., a chemotherapeutic agent
  • a cytotoxic substance such as a bacterial toxin, etc.
  • Such a modified antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Methods for modifying antibodies have been already established in this field.
  • the “antibody” in the present invention also includes these antibodies.
  • the antibody used in the present invention may be a bispecific antibody.
  • a bispecific antibody is a bispecific antibody having an antigen-binding site that recognizes a different epitope on the ROB01 molecule.
  • ROB01 and the other antigen-binding site is radioactive, chemotherapeutic, It may recognize cytotoxic substances such as toxins. In this case, it is possible to cause a cytotoxic substance to act directly on the cells expressing ROB01 to specifically damage tumor cells, thereby suppressing the growth of tumor cells.
  • Bispecific antibodies can be produced by combining the HL pairs of two types of antibodies, or by fusing hybridomas producing different monoclonal antibodies to produce bispecific antibody-producing fusion cells. You can also get it. Furthermore, bispecific antibodies can be produced by genetic engineering techniques. ' ⁇
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed and obtained by a known method.
  • a useful promoter commonly used, an antibody gene to be expressed, and a polyA signal operably linked to the 3 ′ downstream thereof can be expressed.
  • promoters such as human cytomegalow
  • viral promoters such as retrovirus, poliovirus, adenovirus, and simian virus 40 (SV40), or promoters derived from mammalian cells such as human cell type factor 1 ⁇ (HEF1). And the like.
  • a useful promoter commonly used, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed can be operably linked to express the gene.
  • promoters include the lacz promoter and the araB promoter. When using the lacz promoter, Ward et al.
  • the origin of replication those derived from SV40, poliovirus, adenovirus, dys-pipilloma virus (BPV), etc. can be used.
  • the expression vector must be used to amplify the gene copy number in the host cell system.
  • selection markers aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthinguanine phospholiposyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase (dhfr) gene and the like can be included.
  • Eukaryotic cells include, for example, established mammalian cell lines, insect cell lines, animal cells such as filamentous fungal cells and yeast cells, and prokaryotic cells include, for example, bacterial cells such as Escherichia coli cells.
  • Eukaryotic cells include, for example, established mammalian cell lines, insect cell lines, animal cells such as filamentous fungal cells and yeast cells, and prokaryotic cells include, for example, bacterial cells such as Escherichia coli cells.
  • the antibodies used in the present invention are expressed in mammalian cells such as CH0, COS, myeloma, BHK, Vero, HeLa cells.
  • the transformed host cells are cultured in vitro or in vivo to produce the desired antibody.
  • Culture of the host cell is performed according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM can be used as a culture solution
  • a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • the antibody expressed and produced as described above can be purified by a known method used for ordinary protein purification.
  • antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining affinity columns such as protein A columns, chromatography columns, filters, ultrafiltration, salting-out, and dialysis (Antibodies A). Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme-linked immunosorbent assay
  • a pharmaceutical composition that can use RIA (radioimmunoassay) or fluorescence immunoassay.
  • the present invention features a pharmaceutical composition comprising an antibody that binds to ROB01 as an active ingredient.
  • the present invention is characterized by a cell growth inhibitor, particularly an anticancer agent, containing an antibody that binds to ROB01 as an active ingredient.
  • containing an antibody that binds to ROB01 as an active ingredient means that an anti-ROB01 antibody is contained as a main active ingredient, and does not limit the content of the anti-ROB01 antibody.
  • the antibody contained in the cell growth inhibitor of the present invention is not particularly limited as long as it binds to ROB01.
  • it is an antibody that specifically binds to ROB01, and more preferably, it is an antibody having cytotoxic activity.
  • the antibody used in the present invention may be an antibody having a modified sugar chain. It is known that the cytotoxic activity of an antibody can be enhanced by modifying the sugar chain of the antibody.
  • the antibody having a modified sugar chain include an antibody having a modified glycosylation (eg, W099 / 54342), an antibody lacking fucose added to the sugar chain (eg, WO00 / 61739, WO02 / 31140), and bisexuality.
  • Antibodies having a sugar chain having GlcNAc such as WO02 / 79255 are known.
  • the cytotoxic activity in the present invention refers to, for example, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity.
  • ADCC activity means cytotoxicity by the complement system
  • ADCC activity means that when a specific antibody is attached to a cell surface antigen of a target cell, an Fc receptor-containing cell (immune Cells, etc.) via the Fcr receptor, and damages target cells.
  • Whether the anti-R0B01 antibody has ADCC activity or has CDC activity can be measured by a known method (for example, Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993)). Specifically, first, an effector cell, a complement solution, and a target cell are prepared.
  • the spleen is excised from a CBA / N mouse or the like, and spleen cells are separated in RPMI1640 medium (G former CO). After washing with the same medium containing 10% fetal calf serum (FBS, HyClone), adjust the cell concentration to 5 ⁇ 10 6 / ml, and prepare effector cells.
  • RPMI1640 medium G former CO.
  • Baby Rabbit Complement (manufactured by CEDARLANE) is diluted 10-fold with a 10% FBS-containing medium (manufactured by G CO) to prepare a complement solution.
  • ROB01-expressing cells (cells transformed with the gene encoding ROB01, liver cancer cells, lung cancer cells, breast cancer cells, uterine cancer cells, stomach cancer cells, colorectal cancer cells, etc.) 0.2 mCi of 51 Cr-chromic acid Radioactive labeling is performed by culturing together with sodium (Amersham Pharmacia Biotech) in DMEM medium containing 10% FBS at 37 ° C for 1 hour. After radiolabeling, the cells are washed three times with RPMI1640 medium containing 10% FBS, and the cell concentration is adjusted to 2 ⁇ 10 5 / ml to prepare target cells.
  • ADCC activity or CDC activity is measured.
  • target cells and 96-well U-bottom plate (Beckton Dickinson)
  • A is the radioactivity of each sample (cpm)
  • B is the radioactivity of a sample to which 1% NP-40 (manufactured by Hanoi) was added (cpm)
  • C is the radioactivity of a sample containing only target cells (cpm). Is shown.
  • target cells and anti-ROB01 antibody are added at 50 I each to a 96-well flat bottom plate (manufactured by Becton Dickinson) and allowed to react on ice for 15 minutes. Then add 100 I of complement solution and incubate for 4 hours in a carbon dioxide incubator. The final antibody concentration is 0 or 3 g / ml. After incubation, 100 I supernatant Collect radioactivity and measure radioactivity in the gamma count. The cytotoxic activity can be determined in the same manner as the measurement of ADCC activity.
  • the cell in which the ROB01 antibody suppresses proliferation is not particularly limited as long as it is a cell expressing ROB01, but is preferably a cancer cell, more preferably a liver cancer cell, a lung cancer cell, a breast cancer cell, a uterine cancer cell, or a stomach cancer. Cells, brain tumor cells, and colon cancer cells. Therefore, the anti-ROB01 antibody can be used for the treatment and prevention of diseases caused by cell proliferation, such as hepatocellular carcinoma, lung cancer, breast cancer, uterine cancer, stomach cancer, brain tumor, and colon cancer.
  • the cell growth inhibitor and the anticancer agent of the present invention can be administered either orally or parenterally, but are preferably parenterally administered.
  • injection, nasal administration, pulmonary administration Dosage forms, transdermal administration forms and the like can be mentioned.
  • the injection form include systemic or local administration by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection and the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dose can be selected, for example, in the range of 0.0001 mg to 1000 mg / kg body weight at a time. Alternatively, for example, the dose can be selected within the range of 0.001 to 100,000 mg / body per patient.
  • the therapeutic agent of the present invention is not limited to these doses.
  • the cell growth inhibitor and anticancer agent of the present invention can be formulated according to a conventional method (M, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, USA), a pharmaceutically acceptable carrier or It may contain additives.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or It may contain additives.
  • surfactants, excipients, coloring agents, flavors, preservatives, stabilizers, buffers, suspending agents, tonicity agents, binders, disintegrants, lubricants, fluidity enhancers, flavoring agents can be appropriately used.
  • light caffeic anhydride lactose, crystalline cellulose, mannitol, starch, carmellose calcium, carmellose sodium, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose, polyvinyl acetal getylamino acetate, polyvinyl pyrrolidone, gelatin And medium-chain fatty acid triglyceride, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, sucrose, carboxymethyl cellulose, corn starch, inorganic salts and the like.
  • the present invention provides a method for contacting a ROB01-expressing cell with an antibody that binds to ROB01. Thereby providing a method of causing damage to ROB01-expressing cells or a method of suppressing cell proliferation.
  • the antibody that binds to ROB01 is as described above as the antibody that binds to ROB01 contained in the cell growth inhibitor of the present invention.
  • the cell to which the anti-ROB01 antibody binds is not particularly limited as long as it is a cell expressing ROB01, but is preferably a cancer cell, more preferably a liver cancer cell, a lung cancer cell, a breast cancer cell, a ovarian cancer cell, a stomach cancer cell, These are brain tumor cells and colon cancer cells.
  • RNAs shown in Table 1 and total RNAs prepared from various excised tissues using ISOGEN (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) by a conventional method were examined.
  • Table 1 Tissues and cell lines used for ROB01 gene expression analysis Using 10 ng of each of the above total RNAs, each was used for GeneChip U-133 (manufactured by Affimetrix) and subjected to gene expression analysis according to Expression Analysis Technical Manual (manufactured by Affymetryx).
  • ROB01 mRNA probe ID:
  • ROB01 was also upregulated in colorectal cancer, and was more than 2-fold increased in 5 of 8 cases of primary colorectal cancer compared to normal colorectal cancer (21.4).
  • metastatic hepatic scarring of colorectal cancer was markedly enhanced in 3 out of 7 cases compared to normal liver and colon.
  • ROB01 was more than twice as high in small cell lung cancer as in normal lung (Fig. 1a, b).
  • ROB01 expression was detected in a human brain tumor-derived cell line.
  • U251, Alexander, HLE, HuH6, HuH7, HepG2 derived from human hepatoma cell line, Lu1320, H522 derived from human lung cancer cell line, and Hela derived from human cervical cancer showed a score of 100, and ROB01 was above.
  • the expression was likely to be upregulated in a wide range of cancers, including brain and cervical cancers (Fig. 1c).
  • Quantitative PCR was performed using RNA prepared from normal liver, hepatitis site, cirrhosis site, liver cancer extirpated tissue, and non-cancerous part of the same tissue. That is, using single-stranded cDNA synthesized from total RNA prepared from each tissue using reverse transcriptase Superscriptll (formerly G CO BRL) as type I DNA, an iCycleriQ real-time PCR analysis system (BIO-RAD) ) To perform a PCR reaction, and the mRNA expression level was quantified.
  • ROB01 The primer design of ROB01 was performed based on the GenBank number (NM-133631). Each 25 L PCR reaction solution contains 500 mM KCI, 100 mM Tris-HCI (pH 8.3), 20 mM MgCI 2 , 0.1% gelatin, 1.25 mM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) and 1 L each.
  • ROB01 sense primer SEQ ID NO: 1 with 5 pmole
  • ROB01 antisense primer SEQ ID NO: 2
  • SYBR Green I 1000-fold diluted solution, manufactured by Takara Shuzo
  • FG Pluthero Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase ⁇ Nucl. Acids.Res. 1993 21: 4850-4851.
  • FG Pluthero Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase ⁇ Nucl. Acids.Res. 1993 21: 4850-4851.
  • the expression level in each sample was calculated using the software attached to the iCycler iQ real-time analysis system.
  • the expression level of the human j3-actin gene in each RNA was also analyzed in the same manner as above using a human) 3-actin-specific sense primer (SEQ ID NO: 3) and an antisense primer (SEQ ID NO: 4).
  • the value (R0B01 // 3-actin X 100) obtained by correcting the analysis result of R0B01 with the analysis result of human ⁇ -actin was defined as the ROBOI mRNA expression level.
  • an anti-ROB01 antibody was prepared.
  • cDNA for ROB01 was first isolated as follows. Prepare single-stranded cDNA from Hep3B cells according to the method described above, and use it as a template for amplification by PCR with primers RBV2F-TA (SEQ ID NO: 5) and RBR-TA (SEQ ID NO: 6). Went. Primer RBV2F-TA is ROB01 gene
  • PCR method is LA-PCR kit. Prepare a reaction solution according to the protocol of TAKARA, and first perform primary denaturation at 95 ° C for 2 minutes, then at 94 ° C for 15 seconds, at 63 ° C for 15 seconds, and at 72 ° C. After 30 cycles of 5 minutes, the last extension reaction was performed at 72 ° C for 10 minutes. As a result, a band around 5 kbp, which coincides with the predicted ROB01 sequence, was successfully detected.
  • the specific amplified fragment obtained by the PCR method was inserted into pcDNA3.1 / V5-His TOPO (manufactured by Invitrogen) by the TA cloning method, and the nucleotide sequence was confirmed by a standard method.
  • the isolated cDNA was ROB01. It became clear.
  • the first immunoglobulin region from the N-terminus of R0B01 (the region containing IgD was expressed as a fusion protein with the baculovirus membrane protein gp64. That is, the above-mentioned ROB01 cDNA was made into type II, and RB-BVF primer-1 (sequence) No .: 7) and RB-BVR primer (SEQ ID NO: 8) were used to amplify the gene encoding the first immunoglobulin region (Ig1) -containing region from the N-terminus of ROB01 by PCR.
  • R0B01 N / pBS was constructed. Subsequently, 4 g of ROB01 N / pBS was cleaved with a restriction enzyme Bpll (manufactured by Fermentas) and linearized, and then introduced into Sf9 cells together with Bac-N-Blue DNA according to the instructions of Invitrogen. Recombinant paculovirus expressing a fusion protein of ROB01-lg1 and gp64 was prepared.
  • Bpll restriction enzyme manufactured by Fermentas
  • the recombinant virus prepared as described above was added to Sf9 cells (2 ⁇ 10 6 cells / mL) at a MOI of 5 to infect, and then cultured at 27 ° C. for 3 days.
  • Budding paculovirus (BV) expressing a fusion protein of ROB01-lg1 and gp64 was recovered from the culture supernatant after culturing for 3 days. That is, the culture solution is centrifuged at 800 xg for 15 minutes to remove cells and cell debris, and the collected culture supernatant is centrifuged at 45,000 X g for 30 minutes.
  • a ROB01 monoclonal antibody was prepared using the ROB01-Ig1-expressing BV prepared as described above as an antigen. That is, the first immunization was performed by subcutaneous injection of gp64 transgenic mice (WO03 / 104453) with a mixture of ROB01-lg1-expressing BV corresponding to 1 mg of protein suspended in PBS and 200 ng of pertussis toxin. went. In the subsequent immunization, only ROB01-lg1-expressing BV equivalent to 500 mg protein was injected subcutaneously.
  • ROB01-lg1-expressing BV 250 / xg ROB01-lg1-expressing BV was intravenously injected, and three days later, spleen cells were isolated from the mouse, and the cells were fused with mouse P3U1 cells by a conventional method, and hybridoma cells were isolated. Established. Selection of the hybridoma cells producing the anti-ROB01 antibody was performed by ELISA in which the ROB01-lg1-expressing BV, the antigen used for immunization, was fixed.
  • ROB01-lg1-expressing BV was placed on a 96-well flat-bottom plate (Falcon) at a final concentration of 10 g / ml every day and night, followed by 40% Block Ace reagent (Dainippon Pharmaceutical). After blocking with TBS buffer containing), the hybridoma culture supernatant was added and reacted at room temperature for 1 hour. Then, an HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (manufactured by Jackson) was reacted at room temperature for 1 hour, washed four times, and then washed at room temperature for 1 hour with 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB).
  • TMB 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine
  • Reagent manufactured by Sigma was reacted. The reaction was stopped with 0.5N sulfuric acid, and the absorbance at 492 nm was measured using a microplate reader MultickanJX (manufactured by Labsystems).
  • ROB01 was detected using cell lysates of ROB01 forced expression cell lines and various cancer cell lines.
  • anti-ROB01 expression was performed by Western analysis using HEK293 cells The reactivity of the ROB01 antibody A7241A was confirmed.
  • the animal cell expression vector was obtained by introducing the full-length ROB01 gene expression vector (ROB01 / pcDNA3.1) obtained by inserting the cDNA encoding ROB01 into pcDNA3.1 / V5-His T ⁇ PO (manufactured by Invitrogen). used.
  • ROB01 / psDNA3.1 or pcDNA3.1 (Mock) as a negative control was treated with 5 x 10 4 COS7 cells or 2 x 10 5 HEK293 cells with FuGene6 reagent (Roche Diagnostics). And transiently expressed ROB01.
  • RIPA buffer 150 mM sodium chloride, 1% NP-40, 0.5% dexocholic acid, 0.1% SDS, 50 mM trishydroxyaminoaminohydrochloride ( Cell lysate was prepared by solubilization at pH 8.0)).
  • the anti-ROB01 antibody A7241A can specifically detect the full-length ROB01 protein.
  • several bands of low molecular weight were similarly detected in A7241A, but these bands were not detected by the ⁇ : His antibody, suggesting that these bands may be degradation products lacking the C-terminal site.
  • a band with a molecular weight of about 120 kd was specifically detected in the culture supernatant (Fig. 3).
  • the estimated molecular weight of the full-length ROB01 is 190 kd, but the position above the 250 kd of the prestin molecular weight marker (Bio-Rad) (about
  • Immunohistochemical staining analysis of clinical samples of hepatocellular carcinoma was performed using anti-ROB01 monoclonal antibody.
  • a fixed paraffin-embedded specimen of hepatocellular carcinoma-excluded tissue was sliced to a thickness of 4 m, attached to a slide glass, and placed at 37 ° C for about 16 hours to dry it sufficiently.
  • Deparaffinization was performed by soaking in 100% xylene for 5 minutes three times, followed by hydrophilization by soaking in 100% alcohol three times for 5 minutes and soaking in 70% ethanol for 5 minutes. Then, after washing 3 times for 5 minutes in 50 mM TBS buffer (50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCI), react in citrate buffer (10 mM, pH 7.0) at 120 ° C for 10 minutes. The antigen was activated.
  • the hepatocellular carcinoma was specifically stained with the anti-ROB01 antibody, which revealed that the expression of the ROB01 protein was specifically upregulated in hepatocellular carcinoma.
  • the anti-ROB01 antibody can be used for immunohistochemical diagnosis of ROB01-highly expressed cancer such as hepatocellular carcinoma.
  • Example 4 showed that the ROB01 protein fragment was released and was present as soluble ROB01, and was soluble in the serum of cancer patients with high expression of ROB01 such as hepatocellular carcinoma patients.
  • ROB01 type ROB01 protein
  • SROB01 was detected in the serum of patients with hepatocellular carcinoma in 23 of the patients, but not in the serum of patients with cirrhosis and hepatitis, indicating that SROB01 was also detected in the serum of ROB01-expressing cancer patients.
  • detection of SROB01 was shown to be very effective as a serum diagnostic marker for ROB01-expressing cancers such as hepatocellular carcinoma.
  • Soluble ROB01 with His tag added at C-terminal of extracellular region of ROB01 was prepared as follows.
  • the gene encoding the extracellular region was amplified by PCR using the primer RBV2F-TA (SEQ ID NO: 13) and the primer RB_SH_TA (SEQ ID NO: 14). After inserting the PCR product directly into the pBlueBack4.5-TOPO vector and performing sequence analysis, the transfer vector with the correct nucleotide sequence
  • sROBOI / pBB was prepared. Using 4 g of sROBOI / pBB, a recombinant baculovirus was produced in the same manner as in Example 3.
  • sROB01-His was prepared as follows. That is, 2 say yes 10 6 cells / in Sf9 cells 1111_ infected with sROB01-His-expressing recombinant baculovirus as MOI is 5, and cultured for 3 days at 27 ° and recovering the culture supernatant.
  • SROB01-His contained in the culture supernatant was purified using Ni-NTAsuperflow (QIAGEN) according to the attached protocol. The purified product was concentrated using Centircon-10 (manufactured by Amicon), and sROB01-His was prepared by performing buffer mono-substitution with PBS. '' Example 8
  • New Zealand White White Heron (10-week-old female, CLEA Japan) was mixed with 0.5 mL of SROB01 purified antigen lOO gZO mLZ suspended in PBS with 0.5 mL of Freund's complete adjuvant (DIFCO) to form an emulsion.
  • DIFCO Freund's complete adjuvant
  • Subsequent injections of 100 mg / 0.5 mL of SROB01-purified antigen suspended in PBS mixed with 0.5 mL of Freund's incomplete adjuvant were made by subcutaneous injection at two-week intervals for a total of four immunizations.
  • DIFCO Freund's complete adjuvant
  • SROB01 was immobilized on a polystyrene plate for EUSA, reacted with a dilution series of Egret antiserum, and then reacted with horseradish peroxidase-labeled anti-Egret IgG antibody (manufactured by Kapel) to obtain 3,3 ', 5 Antibody titer was determined by developing the color with 5'-tetramethylbenzidine reagent (TMB reagent; manufactured by Cytec). After confirming the increase in antibody titer, whole blood was collected, and anti-ROB01 Got.
  • TMB reagent 5'-tetramethylbenzidine reagent
  • full-length ROB01 molecules were detected by Western analysis.
  • 10 g protein equivalent of a cell lysate prepared using RIPA buffer from HEK293 cells in which full-length ROB01 was forcibly expressed was subjected to SDS-polyacrylamide gel, and proteins were separated. P (manufactured by Amersham Biosciences). Then, sROBOI-immunized egret serum was used at a 100-fold dilution as the primary antibody, and HRP-labeled anti-pea IgG antibody was used as the secondary antibody.
  • ROB01 molecule can be detected.
  • FACS analysis was performed to evaluate whether sROBOI-immunized heron serum can detect ROB01 on the cell surface using HEK293 cells with forced expression of ROB01. That is, HEB293 cells forcibly expressing ROB01 or HEK293 cells as a negative control were suspended in a FACS solution (PBS containing 1% albumin and 0.1% NaN3). To the cell suspension, add SROB01 immunized egret serum, react at 60 ° C for 60 minutes, wash twice with FACS solution, and add FfTC-labeled anti-Egret F (ab) 2 antibody (manufactured by DAKO). The reaction was carried out at 4 for 30 minutes.
  • FACS solution PBS containing 1% albumin and 0.1% NaN3
  • FACS analysis using a FACScalibur was performed according to the instruction manual.
  • An anti-V5 tag antibody (manufactured by Invtrogen) was used as a positive control in this experiment, and a FITC-labeled anti-mouse IgG antibody (manufactured by Jackson) was used as the secondary antibody. Since the V5 tag was added to the C-terminus of the ROB01 intracellular region, a FACS solution containing 0.1% saponin was used when the primary antibody was added so that the antibody could detect the intracellular V5 tag.
  • the anti-human R0B01 heron polyclonal antibody prepared from the above-mentioned sROBOl immunized heron serum was purified by affinity chromatography with R0B01 immobilized as follows.
  • Example 1 Using Sepharose 4B (Amasham Pharmacia Biotec # 17-0430-02), 0.7 mg of purified sROBO His antigen was immobilized per 1 mL of gel according to the package insert, and sROBO His affinity A column was made. Subsequently, an anti-R0B01 heron polyclonal antibody was purified from the heron serum obtained in Example 8 according to a conventional method.
  • Example 1 0
  • An ELISA detection system was constructed using the anti-R0B01 ⁇ sagi polyclonal antibody obtained in Example 9. That is, the anti-R0B01 ⁇ heron polyclonal antibody was diluted in PBS at a concentration of 5 g / mL, and dispensed at 50 L per 1 ⁇ 1 into a 96 ⁇ 1 Imno plate. After leaving overnight at 2 to 8, wash three times with PBS containing 0.05% Tween 20 and overnight for 1 hour with 150 Immunoassay Stabi lizer (ABI # 10-60 to 001) per 1 ⁇ ⁇ 1 well. One coat was done. Thereafter, the solution was discarded and dried at 37 ° C.
  • the biotin-labeled anti-R0B01 antibody used for detection was 50 mM carbonate buffer (pH 8.5), and the anti-R0B01 ⁇ sagipolik-oral antibody and Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce # 21335) were used. It was adjusted to 12 mg / mL and g / mL, and left at room temperature for 2 hours. Unreacted biotin reagent is removed using PD-10 (Pharmacia # 17-0851-01), and the biotin-labeled anti-R0B01 antibody is adjusted to 1 g / mL with PBS containing 30% calf serum.
  • Pio Tin-labeled anti-R0B01 antibody was detected using streptavidin-labeled peroxidase (Vector # SA-5004) diluted to 3 g / mL in Tris-buffered saline containing 30% calf serum.
  • a TMB reagent Sitec # TM490041 was used as a substrate for detection, and a TMB stopper (Sitec «SB999) was used as a terminator for the substrate reaction.
  • the R0B01 concentration in the serum of 72 healthy subjects, 79 liver cancer patients, 67 cirrhosis / chronic hepatitis patients, and 22 other cancer patients was measured.
  • purified sROBOl-His was used as a standard for measuring R0B01 concentration.
  • the serum or sR0B01-His was diluted 90-fold with a Tris buffer containing 20% egos serum and 1% BSA, respectively, and dispensed into each well of the above antibody-immobilized plate in a lOOiiL volume. After incubation for 2 hours at room temperature, 25 / L of biotin-labeled anti-R0B01 antibody was dispensed into each well.
  • the reaction solution in each well was removed, and 100 ⁇ L of a streptavidin-labeled peroxidase reagent was dispensed. After incubating at room temperature for 30 minutes, the plate was washed 5 times with PBS containing 0.05% Tween 20. Dispense the TMB reagent into each well, incubate at room temperature for 30 minutes, add IOOL TMB terminator, and use the EIA plate reader (Corona Electronics # MTP-120) to read 450 nm The wavelength absorption was measured. The wavelength of 630 nm was used as a control.
  • the mean and standard deviation were 36 ng / mL and 8 ng / mL in the R0B01 concentration measurement of 72 healthy sera, so the cutoff value was 81 ng / inL of the average + (6 x standard deviation). .
  • the serum samples for healthy subjects were all lower than this cutoff value, whereas the samples for liver cancer patients and cirrhosis were 46% (79%) for patients with chronic hepatitis and other cancer patients, respectively. Among these, 36%), 22% (15 of 67) and 9% (2 of 22) showed values above the cut-off value, and were considered R0B01-positive.
  • the positive rates of AFP which is commonly used as a diagnostic method for liver cancer, are 46% (27/59) and 15% (8/52) in liver cancer patients, cirrhosis, and chronic hepatitis patients, respectively. Therefore, the sensitivity and specificity in diagnosing liver cancer were almost the same between AFP and R0B01. However, out of 32 AFP-negative liver cancer patient samples, there were 10 R0B01-positive samples, and 5 of those 10 cases were also PIVKA-negative. It was considered that diagnosis would be possible even in cases where liver cancer could not be diagnosed. In fact, the positive rate from 46% for AFP alone was increased to 63% with R0B01.
  • the R0B01 measurement system has almost the same performance as the currently used AFP measurement system, and has high sensitivity and specificity when used in combination with existing cancer markers. A cancer diagnostic method was established.
  • Serum R0B01 levels in healthy subjects (NHS), chronic hepatitis (CH), cirrhosis (LC) and liver cancer (HCC) averaged 34.8, 39.3, 74.0 and 84.4 ng / h, respectively. mL.
  • the R0B01 concentration in blood samples collected before the onset of hepatocellular carcinoma was measured to determine whether the R0B01 concentration changed, even in the individual measurement over time. As a result, it was confirmed that the blood R0B01 concentration increased in proportion to the severity of the disease in 2 out of 3 cases (Fig. 12). In one case, no increase proportional to the severity of the disease was observed, but the maximum value was reached because the value was higher than 30 to 40 ng / mL in healthy subjects It is inferred.
  • PH7.43 was confirmed (recommended pH7.5). This is a 5X veronal buffer.
  • CaCI 2 -2H 2 0 (special grade, Junsei Chemical Co., Ltd.) and .2205 g was dissolved a 50 mL Milli Q water 0.03 mol / cytosine, was CACI 2 solution.
  • 1.0165 g of MgCI 2 '6H 20 (special grade, Junsei Chemical Co., Ltd.) was dissolved in 50 mL of Milli-Q water to make 0.1 mol / L to obtain an MgCI 2 solution.
  • ROB01 forced expression HEK293 cells are cultured in DMEM medium (SIGMA) supplemented with 10% FBS (Thermo Trace) and 0.5 mg / mL Geneticin (G old CO), and then dished using cell detachment buffer (G old CO). Then, the cells were dispensed at 1 ⁇ 10 4 cells / well into each well of a 96-well U-bottom plate (BECTON D KINSON) and cultured in the well. After incubation, add 5.55 MBq of Chromium-51 and incubate at 37 ° C for 1 hour in a 5% CO 2 incubator 5 006838
  • the cells were washed twice with HAVB, and 50 L of HAVB was added to prepare the young ⁇ egon complement as target cells.
  • CEDARLANE Chromium release test
  • Anti-ROB01 antiserum (anti-ROB01 ⁇ sagi polyclonal antibody) was diluted with HAVB to make a 50-fold or 500-fold antibody solution.
  • the antibody solution was added to target cells in 50 L portions, and left on ice for 15 minutes. Then add 100 g / mL of complement solution to each well.
  • the mixture was allowed to stand at 37 ° C for 90 minutes. After centrifuging the plate, 100 ⁇ L of the supernatant was collected from each well, and the radioactivity was measured with a gamma counter.
  • the specific chromium release rate was determined by the following equation.
  • A radioactivity (cpm) in each well; B: 2% ⁇ -40 ⁇ solution in target cells
  • Figure 13 shows the results. It was revealed that anti-ROB01 antiserum, ie, anti-ROB01 polyclonal antibody, showed CDC activity in a dose-dependent manner on ROB01-expressing HEK293 cells. In addition, in the case of using the egret pre-serum, no CDC activity was exhibited as in the case where no antibody was added.
  • Example 1 2
  • the fibronectin III domain (Fnll) present in the extracellular domain of ROB01 was expressed as a fusion protein with the baculovirus membrane protein gp64. That is, the above-mentioned ROB01 cDNA was transformed into type III, and the third fibronectin region of ROB01 was encoded by PCR using the gp4F primer (SEQ ID NO: 15) and the gp4R primer (SEQ ID NO: 16). The gene was amplified and subsequently introduced into pGEM-Te Vec Yuichi (Promega).
  • the gene fragment cut with the restriction enzyme Kpnl was inserted into pBucSurf vector-1 (Novagen) to construct a transfer vector ROB01 gp4 / pBS.
  • pBucSurf vector-1 Novagen
  • 4 ig of ROB01 gp4 / pBS was cleaved with a restriction enzyme Bpll (manufactured by Fermentas) and linearized, and then introduced into Sf9 cells together with Bac-N-Blue DNA according to the instructions of Invitrogen.
  • Bpll manufactured by Fermentas
  • SEQ ID NO: 15 GGTACCCGCACCCAGTGCCCCACCCCAAGG
  • SEQ ID NO: 16 GGTACCGCATCTGAAATCTGCTGAGCGAGG
  • the recombinant virus prepared as described above was added to Sf9 cells (2 ⁇ 10 6 cells / mL) at a MOI of 5 to infect the cells, and then cultured at 27 ° C. for 3 days.
  • Budding Pakyurowirusu expressing a fusion protein of ROBOI -Fnlll and g P 64 (BV) was recovered from the culture supernatant of the 3-day culture Yogo. That is, the culture is centrifuged at 800 X g for 15 minutes to remove cells and cell debris, and the collected culture supernatant is centrifuged at 45,000 X g for 30 minutes.
  • the precipitate is suspended in PBS, the cell components are removed by centrifugation at 800 X g, and the supernatant obtained by centrifuging the supernatant again at 45,000 X g. And used for immunization as an antigen.
  • An anti-ROB01 monoclonal antibody was prepared using the ROBOI-Fnlll-expressing BV prepared by the above method as an antigen. That is, primary immunization was performed by subcutaneous injection of gp64 transgenic mice (WO03 / 104453) in which a mixture of ROBOI-Fnlll-expressing BV corresponding to 1 mg of protein suspended in PBS and 200 ng of pertussis toxin was mixed. . In subsequent immunizations, only ROB01-FnHI-expressing BV equivalent to 500 ma protein was injected subcutaneously.
  • ROBOI-Fnlll-expressing BV As a final immunization, 250 ig of ROBOI-Fnlll-expressing BV was administered intravenously, and 3 days later, spleen cells were isolated from the mice, and cell fusion with mouse NS-1 cells was performed by a conventional method. Was established. The selection of the hybridoma cells producing the anti-ROB01 antibody was performed by ELISA in which the ROBOI-Fnlll-expressing BV, the antigen used for immunization, was immobilized.
  • ROB01-Fn river-expressed BV was placed on a 96 ⁇ l flat-bottom plate (Falcon) at 4 ° C all day and night to a final concentration of 10 ⁇ g / mL, followed by 40% Block Ace reagent (Dainippon). After blocking with TBS-buffer solution containing the product (manufactured by Pharmaceutical Co., Ltd.), the hybridoma culture supernatant was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • the B2318C antibody (anti-ROB01 monoclonal antibody) was diluted with HAVB, added to target cells in 50 L aliquots, and allowed to stand on ice for 15 minutes. Then add 100 g / mL of complement solution to each well (final concentration of antibody is adjusted to 1 Hg / mL and 10 g / mL), and in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C for 90 min. It was left still. After centrifuging the plate, 100 L of the supernatant was collected from each well, and the radioactivity was measured using a gamma counter. The specific chromium release rate was determined by the following equation.
  • A is radioactivity (cpm) in each well
  • B is 2% NP-40 aqueous solution in target cells (Nonidet P-40, Nacalai Tesque Co., Ltd.) 100 fis
  • C is the radioactivity (cpm) in the well to which 150 L of HAVB was added to the target cells.
  • Bone marrow cells were collected from femurs of SCID mice (Clear Japan, 10 weeks old) and suspended at 5 x 10 5 cells / mL in 10% FBS / RPMI 1640 medium.
  • Mouse GM-CSF (PeproTech) And human IL-2 (PeproTech) were added at 10 ng / m and 50 ng / mL, respectively, and cultured at 37 ° C. for 5 days in a 5% carbon dioxide incubator.
  • the cells were peeled off with a scraper, washed once with the medium, and suspended in a 10% FBS / RPMI 1640 medium to a concentration of 5 ⁇ 10 6 / mL to obtain a mouse bone marrow-derived effector cell solution.
  • ROB01 forced expression HEK293 cells are maintained and passaged in a DMEM medium (SIGMA) containing 10% FBS (ThermoTrace) and 500 ng / mL Geneticine (lnvitragen), and washed from the dish using Cell Dissociation Buffer (Invitrogen).
  • SIGMA DMEM medium
  • FBS ThermoTrace
  • Geneticine lnvitragen
  • the cells were detached, dispensed into each well of a 96-well U-shaped bottom plate (Falcon) at 1 ⁇ 10 4 cells / well, and cultured in a well. After the culture, add 5.55 MBq of Chromium-51, incubate at 37 ° C for 4 hours in a 5% CO 2 incubator, wash the cells three times with medium, and add 50 ⁇ L of 06838
  • Chromium release test (ADCC activity) Add 50 / L of B2318C antibody (anti-R0BO1 monoclonal antibody) solution to target cells, react on ice for 15 minutes, and use mouse bone marrow-derived effector cell solution.
  • B2318C antibody anti-R0BO1 monoclonal antibody
  • the specific chromium release rate was determined by the following equation.
  • A is the average value of radioactivity (cpm) in each well, and B is 100 fi 2 of 2% NP-40 aqueous solution (Nonidet P-40, Code No. 252-23, Nacalai Tesque, Inc.)
  • the test was performed in triplicate, and the average value and standard deviation were calculated for ADCC activity (%).
  • the present invention is useful for the diagnosis and treatment of cancer, and for monitoring the severity of hepatitis.

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Abstract

ROBO1タンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法が開示される。また、ROBO1に結合する抗体を投与することを含む、異常な細胞増殖に起因する疾患を治療する方法、ならびにROBO1に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物、細胞増殖抑制剤および抗癌剤が開示される。さらに、ROBO1発現細胞とROBO1に結合する抗体とを接触させることにより、ROBO1発現細胞に細胞障害を引き起こす方法およびROBO1発現細胞の増殖を抑制する方法が開示される。さらに、ROBO1タンパク質を検出することにより肝炎重篤化をモニターする方法が開示される。

Description

明細書
抗 ROB01抗体を用いる癌の診断および治療 技術分野
本発明は、 癌の診断および治療方法、 肝炎重篤化のモニター方法、 ならびに細 胞増殖抑制剤および抗癌剤に関する。 背景技術
ショウジヨウハエの遺伝的スクリーニング研究において、 ROB01は軸策の正 中交差を制御する分子として同定され、 その後の研究から、 Slitタンパク質の受 容体として働くことが報告されている （Kiddら、 Cell, 92, 205-215, 1998、 Wangら、 Cell, 96, 771-784, 1999、 圖ら、 Cell, 96, 785-794， 1999、 Broseら、 96, 795-806, 1999 ) 。 また、 ROB01と癌との関連に関しては、 ヒト ROB01 遺伝子が存在する染色体領域 3p12が肺癌において高度に欠損していることや、 乳癌ゃ腎癌において ROB01のプロモータ一領域がメチル化されることで発現 が抑制されていることなどから、 癌抑制遺伝子の可能性が示されている （Dallol ら、 Oncogene, 21 , 3020-3028, 2000) 。 実際に、 肺齊患者において認められた ROB01遺伝子における最小の欠損と同様に、 マウスにおいて ROB01の N末に 存在する最初のィムノグロプリン領域を欠損させることで、 気管上皮細胞の過形 成が認められている （Xian J ら、 PNAS, 98， 15062-15066， 2001 ) 。 また、
ROB01が癌の新生血管に発現し、 がつ癌細胞側に ROB01のリガンドである Slit2が発現亢進することで癌の血管新生を誘導し、 逆に癌の増殖を指示すると いう報告もある (Wang ら、 Cancer Cell, 4, 19-29, 2003) 。
一方、 ROB01のリガンドである Slit2遺伝子も多くの癌種でメチル化等によ り発現抑制されていることや、 Slit2を強制発現させること、 または Slit2を添加 することで、 肺癌細胞、 乳癌細胞、 および大腸癌細胞において、 増殖抑制作用、 アポト一シス誘導作用が認められることから、 ROB01のリガンドである Slit2 も同様に癌抑制遺伝子として考えられている （Dallolら、 Cancer Research, 62， 5874-5880, 2002、 Dallolら、 Cancer Research, 63, 1054-1058, 2003 ) 。 しか しながら、 この報告では、 Slit2による細胞増殖抑制作用が実際にどの受容体を 介しているのか明らかになっておらず、 ROB01 と癌との関連性は必ずしも明ら かになつていない。
原発性肝細胞癌は、 2001年において日本国内の死亡原因第一である癌死の中 において男性において第三位 (13%) 、 女性において第四位 （9.0%) を占める 予後の悪い癌種の一つである （厚生労働省大臣官房統計情報部 「人口動態統計」 抜粋） 。 ウィルス感染による慢性患者が年々増加し、 その多くは肝硬変、 そして 肝細胞癌に至るケースが多いことから、 肝硬変から肝細胞癌における段階の早期 診断法、 そして肝細胞癌の治療法は非常に強く要望されているものであり、 画期 的な解決のない場合は、 今後 10-15年間は死亡数の増加傾向をたどると考えら れている。
肝細胞癌の診断法に関しては、 血清中の GO P /G T P、 アルカリ性フォス ファタ—ゼ、 アルブミン等や腫瘍マーカ一である A F P ( a—フエトプロティ ン） の値等の生化学的デ一夕、 および画像診断に基づいて総合的に評価した後、 必要な場合は、 針生検により少量の組織片をとり、 病理学的判断に基づき確定診 断が行われている。 現在、 特に肝細胞癌の診断において使用されているのは腫瘍 マーカ一であり、 その中で最も使用されているアルファフエトプロテイン
(AFP) の肝細胞癌患者の陽性率は 6〜7割程度となっているが、 慢性肝疾患患 者や妊婦でも陽性となることもある。 また肝癌腫瘍マーカーである PIVKA-IIの 陽性率は 5割弱と低いが肝細胞癌への特異性は AFPよりも高いと考えられ、 現 在この 2検査が主に実施されている。 いずれにしても、 偽陽性もしくは両陰性 の症例が存在することから、 特異性の高い腫瘍マーカ一の存在が期待されている。 針生検により採取された検体の病理組織検査は、 肝疾患の確定診断において重 要な検査である。 特に採取量が限られることもあり、 より確実な診断技術が必要 とされている。 病理学的特徴のみではなく、 早期の肝細胞癌を非癌部組織から識 別できるような肝癌特異的発現抗原に対する抗体の開発が望まれている。
肝臓疾患の診断 ·モニタ一は、 多種類のマーカーによる検査およびバイオプシ 一による検査にて炎症、 線維化および癌化への移行を診断しているのが現状であ る。 多くの肝癌患者においては、 ウィルス感染、 肝炎、 慢性肝炎、 肝硬変そして 肝癌へと移行する。 従って、 肝臓疾患の診断'モニターを簡便に行うことができ る方法の開発は、 医療経済の上からだけでなく、 患者への負担の軽減および的確 な医療指針を得るために有用である。
肝細胞癌の治療法に関しては、 主に外科的切除、 肝動脈塞栓療法、 経皮的エタ ノール注入療法の 3療法が中心となる医療施設が多い。 いずれの方法も長所'短 所があり、 比較的応用範囲の広く、 延命効果のある肝動脈塞線療法を選択しても、 完全治癒率は現在 10%程度と考えられていることから、 新規の治療法が非常に 望まれている状況である。
肝細胞癌における臨床現場での応用例はまだないが、 乳癌あるいはリンフォー マなどにおいては癌特異的な腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体による標的療 法により、 従来の化学療法剤治療とは異なる作用機作により奏効率をあげている。 その抗体医薬品の作用機差として、 エフェクター細胞を介した抗体依存性細胞障 害活性 （ADCC) あるいは補体による補体依存性細胞障害活性 （CDC) 、'そし て抗体自身の機能によるァゴニスティック作用、 あるいは抗体の中和活性能を利 用したものが存在する。 分子標的療法は現在、 臨床現場において応用し始められ たことから、 これらの分子標的療法を応用し、 肝細胞癌細胞に対する腫瘍特異的 発現分子を標的とした抗体医薬品療法は今後非常に期待されるものであると考え る。
, 本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある：
WO99/20764； WO98/48051； WO01/46697； WO03/29488； WO01/00828； WO01/57207； WO01/92581； WO02/04514； WO02/14500； WO02/29103。 発明の開示
本発明は、 癌を診断および治療する新規方法、 ならびに新規な細胞増殖抑制剤 および抗癌剤を提供すること、 さらに肝臓疾患の診断およびモニタ一する方法を 提供することを目的とする。
本発明者らは ROB01 が肝細胞癌、 肺癌、 乳癌、 子宮癌、 胃瘟、 脳腫瘍、 大 腸癌などの癌細胞で高発現していることを見出した。 さらに、 抗 ROB01 抗体 の補体依存性細胞障害活性 （CDC) を測定したところ、 抗 ROB01 抗体は ROB01 発現細胞に対して CDC活性を有することを見出した。 一方、 肝臓疾患 の重篤化により血中 ROB01 濃度が上昇することを見出した。 以上の知見によ り、 本発明者らは、 抗 ROB01 抗体が肝細胞癌をはじめとした ROB01 が発現 亢進する癌の診断、 予防および治療に有効であること、 さらに肝臓疾患の診断お よびモニターする方法をを見出して、 本発明を完成させた。
本発明は、 ROB01タンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法を提 供する。 本発明の方法においては、 好ましくは、 ROB01タンパク質の細胞外領 域が検出される。 また好ましくは、 本発明の方法は ROB01タンパク質を認識 する抗体を用いて行われる。 好ましくは、 本発明の方法においては、 血液中、 血 清中、 または血漿中の ROB01タンパク質、 あるいは細胞から分離した ROB01 タンパク質が検出される。
別の態様においては、 本発明は、 以下の工程：
( a ) 被験者から試料を採取する工程； '
( b) 採取された試料に含まれる ROB01タンパク質を検出する工程
を含む癌の診断方法を提供する。
別の態様においては、 本発明は、 ROB01タンパク質と結合する抗体を含有す る、 癌を診断するためのキットを提供する。 好ましくは、 癌は肝細胞癌である。 また好ましくは、 本発明のキットにおいて、 抗体は ROB01タンパク質の細胞 外領域と結合する抗体である。
別の態様においては、 本発明は、 ROB01に結合する抗体を有効成分として含 有する医薬組成物を提供する。 本発明はまた、 ROB01に結合する抗体を有効成 分として含有する細胞増殖抑制剤を提供する。 本発明はまた、 ROB01に結合す る抗体を有効成分として含有する抗癌剤を提供する。 好ましくは、 ROB01に結 合する抗体は細胞障害活性を有する抗体である。 また好ましくは、 癌は肝細胞癌 である。
また別の態様においては、 本発明は、 異常な細胞増殖に起因する疾患を治療す る方法であって、 治療を必要とする患者に ROB01に結合する抗体を有効成分 として含有する医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。 本発明はまた、 癌を治療する方法であって、 治療を必要とする患者に ROB01に結合する抗体 を有効成分として含有する医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。 好 ましくは、 癌は肝細胞癌である。
別の態様においては、 本発明は、 ROB01発現細胞と ROB01に結合する抗体 とを接触させることにより ROB01発現細胞に細胞障害を引き起こす方法を提 供する。 本発明はまた、 ROB01発現細胞と ROB01に結合する抗体とを接触さ せることにより ROB01発現細胞の増殖を抑制する方法を提供する。 好ましく は、 ROB01に結合する抗体は細胞障害活性を有する抗体である。 また好ましく は、 ROB01発現細胞は癌細胞である。
さらに別の態様においては、 本発明は、 ROB01に結合し、 かつ ROB01発現 細胞に対して細胞障害活性を有する抗体を提供する。
また別の態様においては、 本発明は、 抗 ROB01抗体を含有する肝炎重篤化 をモニターするためのキットを提供する。 好ましくは、 抗 ROB01抗体は
ROB01を特異的に認識する抗体である。 好ましくは、 本発明のキットは'、 肝炎 または肝硬変から肝癌への移行を予測するものである。 好ましい態様においては、 本発明のキットは、 支持体に固定した第 1の抗 ROB01抗体と標識物質で標識 された第 2の抗 ROB01抗体を含む。
さらに別の態様においては、 本発明は、 被検試料中の ROB01を測定するこ とを特徴とする肝炎重篤化のモニター方法を提供する。 好ましくは、 被検試料中 の ROB01は抗 ROB01抗体を用いて測定する。 好ましくは、 抗 ROB01抗体 は ROB01を特異的に認識する抗体である。 また好ましくは、 被検試料は、 血 液、 血清または血漿である。 好ましくは、 本発明のモニター方法は、 肝炎または 肝硬変から肝癌への移行を予測するものである。 好ましい態様においては、 本発 明のモニター方法は、 支持体に固定した第 1の抗 ROB01抗体と標識物質で標 識された第 2の抗 ROB01抗体とを用いて行われる。 図面の簡単な説明
図 1は、 GeneChipU133を用いた ROBO 1遺伝子発現解析の結果を示す。 図 1a：正常組織 ·非癌部における ROB01遺伝子の発現解析、 図 1 b：臨床検体に おける ROB01遺伝子の発現解析、 図 1c：癌細胞株における ROB01遺伝子の 発現解析。
図 2は、 GeneChipU95を用いた ROB01遺伝子発現の解析の結果を示す。 図 3は、 全長 ROB01遺伝子の一過性発現による COS7細胞および HEK293 細胞のライゼ一トにおけるウエスタン解析結果、 およびその培養上清におけるゥ エスタン解析結果を示す。
図 4は、 抗 ROB01モノクローナル抗体 A7241 Aを用いた肝癌細胞株ライゼ ートにおけるウェスタン解析結果を示す。
図 5は、 抗 ROB01モノク口一ナル抗体 A7241Aを用いた肝細胞; @パラフィ ン標本の免疫組織染色解析結果を示す。
図 6は、 抗 ROB01モノク口一ナル抗体 A7241Aを用いた患者血清中の可溶 型 ROB01のウェスタン解析結果を示す。
図 7は、 SROB01免疫ゥサギ血清を用いた、 全長 ROB01遺伝子強制発現 HEK293細胞のライゼ一トにおけるウェスタン解析結果を示す。 ' 図 8は、 SROB01免疫ゥサギ血清を用いた、 全長 ROB01遺伝子強制発現 HEK293細胞のライゼートにおける FACS解析結果を示す。
図 9は、 SROB01免疫ゥサギ血清を用いた、 HepG2細胞のライゼ一トにおけ る FACS解析結果を示す。
図 1 0は、 ゥサギ抗 SROB01抗体を用いたェンザィムィムノアッセィによる ROB01測定のスタンダ一ドカーブを示す。
図 Γ 1は、 ROB01濃度と肝疾患の重篤度との相関関係を示す。
図 1 2は、 肝疾患患者の ROB01濃度の変化を示す。
図 1 3は、 抗 ROB01抗血清の ROB01発現 HEK293細胞に対する CDC活性 の測定結果を示す。
図 1 4は、 抗 ROB01 モノクローナル抗体の ROB01発現 HEK293細胞に対 する CDC活性を示す。
図 1 5は、 抗 ROB01 モノク口一ナル抗体の ROB01発現 Alexander細胞に 対する CDC活性を示す。
図 1 6は、 抗 ROB01 モノクロ一ナル抗体の ROB01発現 HEK293細胞に対 する ADCC活性を示す。 発明の詳細な説明
本発明の方法は、 ROB01タンパク質を検出することを特徴とする。 ROB01 (RoundaboutD は、 軸索誘導受容体蛋白質であり.、 そのアミノ酸配列および これをコードする遺伝子配列は、 バリアント 1については GenBank番号
NM— 002941 (配列番号 9および 1 0 ) 、 ノ リアント 2については GenBank番 号 NM— 133631 (配列番号 1 1および 1 2 ) に開示されている。 本発明において、 ROB01タンパク質とは、 全長タンパク質およびその断片の両方を含むことを意 味する。 断片とは、 ROB01 タンパク質の任意の領域を含むポリペプチドであり、 天然の ROB01 タンパク質の機能を有していなくてもよい。 断片の例としては、 限定されないが、 ROB01タンパク質の細胞外領域を含む断片が挙げられる。
ROB01タンパク質の細胞外領域は配列番号 1 1のアミノ酸配列において 1― 8
5 9番目が相当する。 又、 膜貫通領域は配列番号 1 1のアミノ酸配列において 8
6 0— 8 8 0番目が相当する （Sundaresan, et al., Molecular and Cellular
Neuroscience 11 , 29-35, 1998) 。
本発明においては、 肝細胞癌において、 非常に高頻度で ROB01が遺伝子レ ベルおよびタンパク質レベルで発現亢進していることが見いだされた。 また他癌 種の臨床検体および癌細胞株の解析から、 肝細胞癌のみならず、 肺癌、 乳癌、 子 宮癌、 胃癌、 脳腫瘍、 大腸癌などにおいても発現亢進している可能性が示された。 また、 ROB01に特異的なモノクローナル抗体を用いることにより、 免疫組織診 断が可能であることが示された。 さらに、 ROB01が生体内においてシェディン グされ、 可溶型 ROB01 (SROB01) が癌患者血中に存在することが見いだされ た。 すなわち、 SROB01は癌の血清診断マーカーとして有用である。
ROB01の検出
本発明で検出する ROB01タンパク質はヒト ROB01タンパク質が好ましい が、 それに限定されず、 ィヌ ROB01、 ネコ ROB01、 マウス ROB01、 ハムス ター ROB01などいかなる ROB01でもよい。
本発明において検出とは、 定量的または非定量的な検出を含み、 例えば、 非定 量的な検出としては、 単に ROB01タンパク質が存在するか否かの測定、 ROB01タンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定、 ROB01タンパク質 の量を他の試料 （例えば、 コントロール試料など） と比較する測定などを挙げる ことができ、 定量的な検出としては、 ROB01タンパク質の濃度の測定、
ROB01夕ンパク質の量の測定などを挙げることができる。
被検試料としては、 ROB01タンパク質が含まれる可能性のある試料であれば 特に制限されないが、 哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、 さ らに好ましくはヒトから採取された試料である。 被検試料の具体的な例としては、 例えば、 血液、 間質液、 血漿、 血管外液、 脳脊髄液、 滑液、 胸膜液、 血清、 リン パ液、 唾液、 尿などを挙げることができるが、 好ましいのは血液、 血清、 または 血漿である。 又、 生物の体から採取された細胞の培養液などの、 被検試料から得 られる試料も本発明の被検試料に含まれる。
診断される癌は、 特に制限されず如何なる癌でもよいが、 具体的には、 肝癌、 塍臓癌、 肺癌、 大腸癌、 乳癌、 腎癌、 脳腫瘍、 子宮癌、 肺癌、 胃癌、 前立腺癌、 白血病、 リンパ腫などを挙げることができる。 好ましいものは肝癌であり、 特に 好ましいものは肝細胞癌である。
本発明において'は、 被験試料中に ROB01タンパク質が検出された場合、 陰 性コントロールまたは健常者と比較して被験試料中に検出される ROB01タン パク質の量が多いと判断される場合に、 被験者が癌であるまたは癌になる可能性 が高いと判定される。
さらに、 肝疾患を有する患者の ROB01タンパク質濃度を測定することによ り、 肝疾患の重篤化をモニタ一することができる。
本発明の診断方法の好ましい態様としては、 細胞から遊離し、 血中に存在する ROB01 夕ンパク質を検出することを特徴とする診断方法を挙げることができる。 特に好ましくは、 血中に存在する ROB01タンパク質の細胞外領域を含む断片 を検出する。
被検試料に含まれる ROB01タンパク質の検出方法は特に限定されないが、 抗 ROB01抗体を用いた免疫学的方法により検出することが好ましい。 免疫学 的方法としては、 例えば、 ラジオィムノアツセィ、 ェンザィムィムノアツセィ、 蛍光ィムノアツセィ、 発光ィムノアツセィ、 免疫沈降法、 免疫比濁法、 ウェス夕 ンブロット、 免疫染色、 免疫拡散法などを挙げることができるが、 好ましくはェ ンザィムィムノアッセィであり、 特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法
(enzyme-linked immunosorbent assay： ELISA) (例んぱ、、 sandwich ELISA で ある。 ELISAなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うこ どが可能である。
抗 ROB01抗体を用いた一般的な検出方法としては、 例えば、 抗 ROB01抗 体 支持体に固定し、 ここに被検試料を加え、 インキュベートを行い抗 ROB01 抗体と ROB01タンパク質を結合させた後に洗浄して、 抗 ROB01抗体を介し て支持体に結合した ROB01タンパク質を検出することにより、 被検試料中の ROB01タンパク質の検出を行う方法を挙げることができる。
本発明において抗 ROB01 抗体を固定するために用いられる支持体としては、 例えば、 ァガ口一ス、 セルロースなどの不溶性の多糖類、 シリコン樹脂、 ポリス チレン樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 ナイロン樹脂、 ポリ力一ポネィ卜樹脂な どの合成樹脂や、 ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。 これらの 支持体は、 ビーズやプレートなどの形状で用いることが可能である。 ビーズの場 合、 これらが充填されたカラムなどを用いることができる。 プレートの場合、 マ ルチウエルプレート （96穴マルチウエルプレート等） 、 やバイオセンサーチッ プなどを用いることができる。 抗 ROB01抗体と支持体との結合は、 化学結合 や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。 これら の支持体はすべて市販のものを用いることができる。
抗 ROB01抗体と ROB01タンパク質との結合は、 通常、 緩衝液中で行われ る。 緩衝液としては、 例えば、 リン酸緩衝液、 Tris緩衝液、 クェン酸緩衝液、 ホ ゥ酸塩緩衝液、 炭酸塩緩衝液、 などが使用される。 また、 インキュべ一シ 3ンの 条件としては、 すでによく用いられている条件、 例えば、 4 °C〜室温にて 1時間 〜24時間のインキュベーションが行われる。 インキュベート後の洗浄は、 。
ROB01タンパク質と抗 ROB01抗体の結合を妨げないものであれば何でもよぐ 例えば、 Tween20等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。
本発明の ROB01タンパク質検出方法においては、 ROB01タンパク質を検出 したい被検試料の他に、 コントロール試料を設置してもよい。 コントロール試料 としては、 ROB01タンパク質を含まない陰性コントロール試料や ROB01夕ン パク質を含む陽性コント口一ル試料などがある。 この場合、 ROB01タンパク質 を含まない陰性コントロール試料で得られた結果、 ROB01タンパク質を含む陽 性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、 被検試料中の
ROB01タンパク質を検出することが可能である。 また、 濃度を段階的に変化さ せた一連のコントロール試料を調製し、 各コントロール試料に対する検出結果を 数値として得て、 標準曲線を作成し、 被検試料の数値から標準曲線に基づいて、 被検試料に まれる ROB01 タンパク質を定量的に検出することも可能である。 抗 ROB01抗体を介して支持体に結合した ROB01タンパク質の検出の好ま しい態様として、 標識物質で標識された抗 ROB01抗体を用いる方法を挙げる ことができる。 例えば、 支持体に固定された抗 ROB01抗体に被検試料を接触 させ、 洗浄後に、 ROB01タンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて検出 する。 - 抗 ROB01 抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。 標識物質としては、 蛍光色素、 酵素、 補酵素、 化学発光物質、 放射性物質などの 当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、 具体的な例としては、 ラジ ォアイソトープ (32p、 WC、 125し 3H、 131 !など)、 フルォレセイン、 ローダミン、 ダンシルクロリド、 ゥンベリフエロン、 ルシフェラーゼ、 ペルォキシダーゼ、 ァ ルカリホスファタ一ゼ、 ]6 -ガラクトシダーゼ、 /3 -ダルコシダーゼ、 ホースラデ イツシュパーォキシダーゼ、 ダルコアミラーゼ、 リゾチーム、 サッカリドォキシ ダーゼ、 マイクロペルォキシダーゼ、 ピオチンなどを挙げることができる。 標識 物質としてピオチンを用いる場合には、 ピオチン標識抗体を添加後に、 アルカリ ホスファターゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加することが好まし レ^ 標識物質と抗 ROB01抗体との結合には、 ダルタルアルデヒド法、 マレイ ミド法、 ピリジルジスルフイド法、 過ヨウ素酸法、 などの公知の方法を用いるこ とができる。
具体的には、 抗 ROB01抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、 抗 ROB01抗体を支持体に固定する。 プレートを洗浄後、 タンパク質の非特異的な 結合を防ぐため、 例えば BSA、 ゼラチン、 アルブミンなどでブロッキングする。 再び洗浄し、 被検試料をプレートに加える。 -インキュベートの後、 洗浄し、 標識 抗 ROB01 抗体を加える。 適度なインキュベーションの後、 プレートを洗浄し、 プレートに残った標識抗 ROB01抗体を検出する。 検出は当業者に公知の方法 により行うことができ、 例えば、 放射性物質による標識の場合には液体シンチレ ーシヨンや RIA法により検出することができる。 酵素による標識の場合には基 質を加え、 基質の酵素的変化、 例えば発色を吸光度計により検出することができ る。 基質の具体的な例としては、 2，2-アジノビス （3-ェチルベンゾチアゾリン -6- スルホン酸） ジアンモニゥム塩 （ABTS) 、 1 ,2-フエ二レンジァミン （オルソ-フ ェニレンジァミン） 、 3,3',5，5'-テトラメチルベンジジン （TMB) などを挙げるこ とができる。 蛍光物質の場合には蛍光光度計により検出することができる。
本発明の ROB01タンパク質検出方法の特に好ましい態様として、 ピオチン で標識された抗 ROB01抗体およびアビジンを用いる方法を挙げることができ る。 · 具体的には、 抗 ROB01抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、 抗 ROB01抗体を固定する。 プレートを洗浄後、 タンパク質の非特異的な結合を防 ぐため、 例えば BSAなどでブロッキングする。 再び洗浄し、 被検試料をプレー トに加える。 インキュベートの後、 洗浄し、 ピオチン標識抗 ROB01抗体を加 える。 適度なインキュベーションの後、 プレートを洗浄し、 アルカリホスファタ ーゼ、 ペルォキシダーゼなどの酵素と結合したアビジンを加える。 インキュベー シヨン後、 プレートを洗浄し、 アビジンに結合している酵素に対応した基質を加 え、 基質の酵素的変化などを指標に ROB01タンパク質を検出する。
本発明の ROB01タンパク質検出方法の他の態様として、 ROB01タンパク質 を特異的に認識する一次抗体を一種類以上、 および該一次抗体を特異的に認識す る二次抗体を一種類以上用いる方法を挙げることができる。
例えば、 支持体に固定された一種類以上の抗 ROB01抗体に被検試料を接触 させ、 インキュベーションした後、 洗浄し、 洗浄後に結合している ROB01夕 ンパク質を、 一次抗 ROB01抗体および該一次抗体を特異的に認識する一種類 以上の二次抗体により検出する。 この場合、 二次抗体は好ましくは標識物質によ り標識されている。 本発明の ROB01タンパク質の検出方法の他の態様としては、 凝集反応を利 用した検出方法を挙げることができる。 該方法においては、 抗 ROB01抗体を 感作した担体を用いて ROB01を検出することができる。 抗体を感作する担体 としては、 不溶性で、 非特異的な反応を起こさず、 かつ安定である限り、 いかな る担体を使用してもよい。 例えば、 ラテックス粒子、 ベントナイト、 コロジオン、 カオリン、 固定羊赤血球等を使用することができるが、 ラテックス粒子を使用す るのが好ましい。 ラテックス粒子としては、 例えば、 ポリスチレンラテックス粒 子、 スチレン-ブ夕ジェン共重合体ラテックス粒子、 ポリビエルトルエンラテツ クス粒子等を使用することができるが、 ポリスチレンラテックス粒子を使用する のが好ましい。 感作した粒子を試料と混合し、 一走時間攪拌する。 試料中に抗 ROB01抗体が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、 凝集を肉 眼でみることにより ROB01を検出することができる。 また、 凝集による濁度 を分光光度計等により測定することによつても検出することが可能である。
本発明の ROB01タンパク質の検出方法の他の態様としては、 例えば、 表面 プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法を挙げることができ る。 表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質—タンパク 質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、 表面ブラズ モン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である。 例えば、 BIAcore (アマ一シャムバイオサイエンス社製） 等のバイオセンサーを用いるこ とにより ROB01タンパク質と抗 ROB01抗体の結合を検出することが可能で ある。 具体的には、 抗 ROB01抗体を固定化したセンサ一チップに、 被検試料 を接触させ、 抗 ROB01抗体に結合する ROB01タンパク質を共鳴シグナルの 変化として検出することができる。
本発明の検出方法は、 種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、 一 度に大量の試料について検查を行うことも可能である。
本発明は、 癌の診断のための被検試料中の ROB01タンパク質を検出するた めの診断薬またはキットの提供をも目的とするが、 該診断薬またはキットは少な くとも抗 ROB01抗体を含む。 該診断薬またはキッ卜が ELISA法等の EIA法に 基づく場合は、 抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、 抗体があらかじめ担 体に結合していてもよい。 該診断薬またはキットがラテックス等の担体を用いた 凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。 また、 該キット は、 適宜、 ブロッキング溶液、 反応溶液、 反応停止液、 試料を処理するための試 薬等を含んでいてもよい。 抗 ROB01抗体の作製
本発明で用いられる抗 ROB01抗体は ROB01夕ンパク質に特異的に結合す ればよく、 その由来、 種類 （モノクローナル、 ポリクローナル) および形状を問 わない。 具体的には、 マウス抗体、 ラット抗体、 ヒト抗体、 キメラ抗体、 ヒト化 抗体などの公知の抗体を用いることができる。 抗体はポリクロ一ナル抗体でもよ いが、 モノクローナル抗体であることが好ましい。
本発明で使用される抗 ROB01抗体は、 公知の手段を用いてポリクローナル またはモノクロ一ナル抗体として得ることができる。 本発明で使用される抗
ROB01抗体として、 特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。 哺乳 動物由来のモノクローナル抗体は、 ハイプリドーマにより産生されるもの、 およ び遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現べクタ一で形質転換した宿主に より産生されるもの等を含む。
モノクローナル抗体産生ハイプリドーマは、 基本的には公知技術を使用し、 以 下のようにして作製できる。 すなわち、 ROB01を感作抗原として使用して、 こ れを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法 によって公知の親細胞と融合させ、 通常のスクリーニング法により、 モノクロ一 ナルな抗体産生細胞をスクリ一二ングすることによつて作製できる。
具体的には、 モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。 まず、 抗体取得の感作抗原として使用される ROB01を、 GenBank受託番号
BF059159 (NM一 133631) に開示された ROB01遺伝子/アミノ酸配列を発現 することによって得る。 すなわち、 ROB01をコードする遺伝子配列を公知の発 現べクタ一系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中ま たは培養上清中から目的のヒト ROB01タンパク質を公知の方法で精製する。 また、 天然の ROB01を精製して用いることもできる。 次に、 この精製 ROB01タンパク質を感作抗原として用いる。 あるいは、
ROB01の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。 この際、 部分 ペプチドはヒト ROB01のアミノ酸配列より化学合成により得ることもできる し、 ROB01遺伝子の一部を発現べクタ一に組込んで発現させることにより得る こともでき、 さらに天然の ROB01をタンパク質分解酵素により分解すること によっても得ることができる。 部分ペプチドとして用いる ROB01の領域およ び大きさは限定されない。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、 特に限定されるものではないが、 細 胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、 一般的に はげつ歯類の動物、 例えば、 マウス、 ラット、 ハムスター、 あるいはゥサギ、 サ ル等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われる。 例えば、 一般的方法として、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射するこ'とによ り行われる。 具体的には、 感作抗原を PBS (Phosphate-Buffered Saline) や生 理食塩水等で適当量に希釈、 懸濁したものに所望により通常のアジュバント、 例 えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に 4〜21 日 毎に数回投与する。 また、 感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。 特に分子量の小さい部分べプチドを感作抗原として用いる場合には、 アルブミン、 キ一ホ一ルリンぺットへモシァニン等の担体タンパク質と結合させて免疫するこ とが望ましい。
このように哺乳動物を免疫し、，血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認 した後に、 哺乳動物から免疫細胞を採取し、 細胞融合に付されるが、 好ましい免 疫細胞としては、 特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、 P甫乳動物のミエローマ細胞を 用いる。 このミエローマ細胞は、 公知の種々の細胞株、 例えば、 P3
(P3x63Ag8.653) (丄 Immnol, (1979) 123, 1548-1550) 、 P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbioloay and Immunology (1978) 81 , 1-7) 、 NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519) 、 MPC-11 (Margulies. D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415) 、 SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270) 、 FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21 ) 、 S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) 、 R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133) 等が好 適に使用される。
前記免疫細胞とミエ口一マ細胞との細胞融合は、 基本的には公知の方法、 たと えば、 ケーラ一とミルスティンらの方法 （Kohler. G and MHstein, C,、 Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 等に準じて行うことができる。
より具体的には、 前記細胞融合は、 例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄 養培養液中で実施される。 融合促進剤としては、 例えばポリエチレングリコール (PEG) 、 センダイウィルス （HVJ) 等が使用され、 更に所望により融合効率 を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。 免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。 例え ば、 ミエローマ細胞に対して免疫細胞を 1〜10倍とするのが好ましい。 前記細 胞融合に用いる培養液としては、 例えば、 前記ミエ口一マ細胞株の増殖に好適な RPMI1640培養液、 MEM培養液、 その他、 この種の細胞培養に用いられる通常 の培養液が使用可能であり、 さらに、 牛胎児血清 (FCS) 等の血清補液を併用 することもできる。
細胞融合は、 前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく 混合し、 予め 37°C程度に加温した PEG溶液 （例えば平均分子量 1000〜6000程 度） を通常 30〜60% (w/v) の濃度で添加し、 混合することによって目的とする 融合細胞 （八イブリドーマ） を形成する。 続いて、 適当な培養液を逐次添加し、 遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイプリドーマの生育に好ま しくない細胞融合剤等を除去する。
このようにして得られたハイプリドーマは、 通常の選択培養液、 例えば HAT 培養液 （ヒポキサンチン、 アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液） で培養 することにより選択される。 上記 HAT培養液での培養は、 目的とするハイプリ ドーマ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに十分な時間 （通常、 数日〜数週 間） 継続する。 ついで、 通常の限界希釈法を実施し、 目的とする抗体を産生する ハイプリドーマのスクリ一ニングおよび単一クローニングを行う。 又、 ROB01を認識する抗体の作製は国際公開 WO03/104453に記載された方 法を用いて作製してもよい。
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、 公知の抗原抗体 反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。 例えば、 ポリスチレン等ででき たビーズや市販の 96ゥエルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合 させ、 ハイプリドーマの培養上清と反応させ、 担体を洗浄した後に酵素標識第 2 次抗体等を反応させることにより、 培養上清中に感作抗原と反応する目的とする 抗体が含まれるかどうかを決定できる。 目的とする抗体を産生するハイプリドー マを限界希釈法等によりクローニングすることができる。 この際、 抗原としては 免疫に用いたものを用いればよい。
また、 ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリドーマを得る他に、 ヒト リンパ球を in vitroで ROB01に感作し、 感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能 を有するミエ口一マ細胞と 合させ、 ROB01への結合活性を有する所望のヒト 抗体を得ることもできる （特公平 1-59878号公報参照） 。 さらに、 ヒト抗体遺 伝子の全てのレバートリーを有するトランスジエニック動物に抗原となる
ROB01を投与して抗 ROB01抗体産生細胞を取得し、 これを不死化させた細胞 力、ら ROB01に対するヒト抗体を取得してもよい （国際公開 WO 94/25585、 WO 93/12227、 WO 92/03918、 WO 94/02602参照） 。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、 通常の培養液中で継代培養することが可能であり、 また、 液体窒素中で長期保存 することが可能である。
当該ハイプリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、 当該ハイプリド 一マを通常の方法に従い培養し、 その培養上清として得る方法、 あるいはハイブ リドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、 その腹水として得 る方法などが採用される。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適しており、 一方、 後者の方法は、 抗体の大量生産に適している。
本発明では、 モノクローナル抗体として、 抗体遺伝子をハイブリド一マからク ローニングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを宿主に導入し、 遺伝子組換 え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる （例えば、 Vandamme, A. M. et al" Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775， 1990参照） 。 具体的には、 抗 ROB01抗体を産生するハイプリドーマから、 抗 ROB01抗体 の可変 （V) 領域をコードする mRNAを単離する。 mRNAの単離は、 公知の方 法、 例えば、 グァニジン超遠心法 （Chirgwin,丄 Μ· et al,， Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) 、 AGPC法 (Chomczynski, Ret al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) 等により行って全 RNAを調製し、 mRNA Purification Kit
(Pharmacia製） 等を使用して目的の mRNAを調製する。 また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia製） を用いることにより mRNAを直接調製 することもできる。
得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V領域の cDNAを合成する。 cDNAの合成ま、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit
(生化学工業社製） 等を用いて行う。 また、 cDNAの合成および増幅を行うには、 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製） および PCRを用いた 5'-RACE法
(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002、 Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) 等を使用するこ とができる。
得られた PCR産物から目的とする DNA断片を精 し、 ベクタ一 DNAと連結 する。 さらに、 これより組換えベクターを作製し、 大腸菌等に導入してコロニー を選択して所望の組換えベクターを調製する。 そして、 目的とする DNAの塩基 配列を公知の方法、 例えば、 ジデォキシヌクレオチドチェイン夕一ミネ一シヨン 法等により確認する。 目的とする抗 ROB01抗体の V領域をコ一ドする DNAを 得たのち、 これを、 所望の抗体定常領域 （C領域） をコードする DNAを含有す る発現べクターへ組み込む。
本発明で使用される抗 ROB01抗体を製造するには、 抗体遺伝子を発現制御 領域、 例えば、 ェンハンサ一、 プロモーターの制御のもとで発現するよう発現べ クタ一に組み込む。 次に、 この発現ベクターにより、 宿主細胞を形質転換し、 抗 体を発現させる。
抗体遺伝子の発現は、 抗体重鎖 （H鎖） または軽鎖 （L鎖） をコードする
DNAを別々に発現べクタ一に組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよい し、 あるいは H鎖およびし鎖をコードする DNAを単一の発現ベクターに組み込 んで宿主細胞を形質転換させてもよい （国際公開 WO 94/11523参照） 。
抗体遺伝子を一旦単離し、 適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、 適 当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。 真核細胞を宿主 として使用する場合、 動物細胞、'植物細胞、 真菌細胞を用いることができる。 動 物細胞としては、 （1) 哺乳類細胞、 例えば、 CHO, COS, ミエローマ、 BHK
(baby hamster kidney ) ， HeLa, Vero, (2)両生類細胞、 例えば、 アフリカッ メガエル卵母細胞、 あるいは (3) 昆虫細胞、 例えば、 sf9，sf21，Tn5などが知られ ている。 植物細胞としては、 ニコティアナ （Nkxrtiana) 属、 例えばニコティア ナ'夕バカム （Nicotians tabacum) 由来の細胞が知られており、 これをカルス 培養すればよい。 真菌細胞としては、 酵母、 例えば、 サッカロミセス
(Saccharomyces ) 属、 例えばサッカロミセス ·セレビシェ (Saccharomyces serevisiae) 、 糸状菌、 例えば、 ァスペルギルス （Aspergillus ) 属、 例えばァス ぺスギルス ·二ガー （Aspergillus niger ) などが知られている。 原核細胞を使用 する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌細胞としては、 大腸菌 (E. coli ) 、 枯草菌が知られている。 これらの細胞に、 目的とする抗体遺伝子を形質 転換により導入し、 形質転換された細胞を in vitroで培養することにより抗体が 得られる。
また、 組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、 トランスジェニッ ク動物を使用することができる。 例えば、 抗体遺伝子を、 乳汁中に固有に産生さ れるタンパク質 （ャギ カゼインなど） をコ一ドする遺伝子の途中に挿入して融 合遺伝子として調製する。 抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含む DNA断片 をャギの胚へ注入し、 この胚を雌のャギへ導入する。 胚を受容したャギから生ま れるトランスジエニックャギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得 る。 また、 トランスジエニックャギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増 加させるために、 適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使用してもよい (Ebert, K. . et al., BioAechnology (1994) 12, 699-702) 。
本発明では、 ヒ卜に対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的 に改変した遺伝子組換え型抗体、 例えば、 キメラ （Chimeric) 抗体、 ヒト化 (Humanized ) 抗体などを使用できる。 これらの改変抗体は、 既知の方法を用 いて製造することができる。 キメラ抗体は、 ヒト以外の哺乳動物、 例えば、 マウ ス抗体の重鎖、 軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、 軽鎖の定常領域からなる抗体 であり、 マウス抗体の可変領域をコードする DNAをヒト抗体の定常領域をコ一 ドする DNAと連結し、 これを発現べクタ一に組み込んで宿主に導入し産生させ ることにより得ることができる。
キメラ抗体およびヒト化抗体の C領域には、 ヒト抗体のものが使用され、 例え ば H鎖では、 Cァ 1、 C r 2 , C T 3、 Cァ 4を、 L鎖では C /c、 C λを使用す ることができる。 また、 抗体またはその産生の安定性を改善するために、 ヒト抗 体 C領域を修飾してもよい。
キメラ抗体は、 ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常 領域とからなる。 一方、 ヒト化抗体は、 ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決 定領域と、 ヒト抗体由来のフレームワーク領域および C領域とからなる。 ·ヒト化 抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、 本発明の治療剤の有効成 分として有用である。
ヒト化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒト抗体とも称され、 ヒト以外の哺乳動 物、 たとえばマウス抗体の相補性決定領域 （CDR; complementarity determining region) をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、 その一般的な遺伝 子組換え手法も知られている。 具体的には、 マウス抗体の CDRとヒト抗体のフ レ一ムワーク領域 （framework region； FR) を連結するように設計した DNA配 列を、 末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌ クレオチドから PCR法により合成する。 得られた DNAをヒト抗体定常領域を コ一ドする DNAと連結し、 次いで発現ベクターに組み込んで、 これを宿主に導 入し産生させることにより得られる （欧州特許公開 EP 239400、 国際公開 WO 96/02576参照） 。
CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、 相補性決定領域 が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成ヒト抗 体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフ レームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい （Sato, K.et al., Cancer Res, 1993, 53, 851 -856.) 。
また、 ヒト抗体の取得方法も知られている。 例えば、 ヒトリンパ球を in vitro で所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、 感作リンパ球をヒトミ エロ一マ細胞、 例えば U266と融合させ、 抗原への結合活性を有する所望のヒト 抗体を得ることもできる (特公平 1 -59878參照） 。 また、 ヒト抗体遺伝子の全 てのレパートリーを有するトランスジエニック動物を所望の抗原で免疫すること で所望のヒト抗体を取得することができる （国際公開 WO 93/12227, WO
92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096， WO 96/33735参照） 。 さらに、 ヒト抗体ライブラリーを用いて、 パンニングによりヒト抗体を取得する 技術も知られている'。 例えば、 ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体 (scFv) とし てファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、 抗原に結合するフ ァージを選択することができる。 選択されたファージの遺伝子を解析すれば、 抗ヘ 原に結合するヒト抗体の可変領域をコードする DNA配列を決定することができ る。 抗原に結合する scFvの DNA配列が明らかになれば、 当該配列を適当な発 現ベクターを作製し、 ヒト抗体を取得することができる。 これらの方法は既に衆 知であり、 国際公開 WO 92/01047, WO 92/20791， WO 93/06213， WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。
本発明で使用される抗体は、 抗体の全体分子に限られず、 ROB01に結合する 限り、 抗体の断片またはその修飾物であってもよく、 二価抗体も一価抗体も含ま れる。 例えば、 抗体の断片としては、 Fab、 F (ab1) 2、 Fv、 1個の Fabと完全 な Fcを有する Fab/c、 または H鎖若しくは L鎖の Fvを適当なリンカーで連結さ せたシングルチェイン Fv (scFv) が挙げられる。
抗体の断片は、 抗体を酵素、 例えばパパイン、 ペプシンで処理し抗体断片を生 成させるか、 または、 これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、 これを発現 ベクターに導入した後、 適当な宿主細胞で発現させる （例えば、 Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976、 Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496， Academic Press, Inc.、 Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc., Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121 , 652-663、 Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121 , 663-669、 Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137参照） 。
scFvは、 抗体の H鎖 V領域と L鎖 V領域とを連結することにより得られる。 この scFvにおいて、 H鎖 V領域と L鎖 V領域は、 .リンカー、 好ましくはぺプチ ドリンカーを介して連結される (Huston,丄 S. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1988, 85， 5879-5883.)。 scFvにおける H鎖 V領域および L鎖 V領域は、 本明細 書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。 V領域を連結す るペプチドリンカ一としては、 例えば 3-25残基程度からなる任意の一本鎖ぺプ チドが用いられる。 scFvをコ一ドする DNAは、 前記抗体の H鎖または H鎖 V 領域をコードする DNA、 および L鎖または L鎖 V領域をコードする DNAのう ち、 それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードする DNA部分 . を錶型とし、 その両端を規定するプライマー対を用いて PCR法により増幅し、 次いで、 さらにべプチドリンカ一部分をコードする DNA、 およびその両端が 各々 H鎖、 L鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅す ることにより得られる。 また、 一旦 scFvをコードする DNAが作製されると、 それらを含有する発現べクタ一、 および該発現べクタ一により形質転換された宿 主を常法に従って得ることができ、 また、 その宿主を用いることにより、 常法に 従って scFvを得ることができる。 これらの抗体断片は、 前記と同様にして遺伝 子を取得し発現させ、 宿主により産生させることができる。
抗体の修飾物として、 ポリエチレングリコール （PEG) 等の各種分子と結合 した抗体を使用することもできる。 又、 抗体に放射性同位元素、 化学療法剤、 細 菌由来トキシン等の細胞傷害性物質などを結合することも可能である。 このよう な抗体修飾物は、 得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることがで きる。 なお、 抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。 本発明 における 「抗体」 にはこれらの抗体も包含される。
さらに、 本発明で使用される抗体は二重特異性抗体 (bispecific antibody)であつ てもよい。 二重特異性抗体は ROB01分子上の異なるェピト一プを認識する抗 原結合部位を有する二重特性抗体であっても Jいし、 一方の抗原結合部位が
ROB01を認識し、 他方の抗原結合部位が放射性物質、 化学療法剤、 細胞由来ト キシン等の細胞障害性物質を認識してもよい。 この場合、 ROB01を発現してい る細胞に直接細胞障害性物質を作用させ腫瘍細胞に特異的に障害を与え、 腫瘍細 胞の増殖を抑制することが可能である。 二重特異性抗体は 2種類の抗体の HL対 を結合させて作製することもできるし、 異なるモノクローナル抗体を産生するハ イブリドーマを融合させて、 二重特處性抗体産生融合細胞を作製し、 得ることも できる。 さらに、 遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能 である。 ' ―
前記のように構築した抗体遺伝子は、 公知の方法により発現させ、 取得するこ とができる。 哺乳類細胞の場合、 常用される有用なプロモーター、 発現させる抗 体遺伝子、 その 3'側下流にポリ Aシグナルを機能的に結合させて発現させるこ とができる。 例えばプロモータ一 zェンハンサ一としては、 ヒトサイトメガロウ
1 レス刖期プロモ一夕一 z ンノ、ンサ一 (human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer; を挙げることができる。 · また、 その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター/ェン 八ンサ一として、 レトロウイルス、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 シミ アンウィルス 40 (SV40) 等のウィルスプロモーターノエンハンサ一、 あるいは ヒトェロンゲ一シヨンファクター 1 α (HEF1 ) などの哺乳類細胞由来のプロ モー夕—ノエンハンサ一等が挙げられる。
SV40プロモーター Zェンハンサーを使用する場合は Mulliganらの方法
(Nature (1979) 277, 108) により、 また、 HEF1ひプロモータ一ノエンハンサ —を使用する場合は Mizushimaらの方法 （Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) により、 容易に遺伝子発現を行うことができる。
大腸菌の場合、 常用される有用なプロモータ一、 抗体分泌のためのシグナル配 列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させるこ とができる。 プロモー夕一としては、 例えば laczプロモーター、 araBプロモー ターを挙げることができる。 laczプロモーターを使用する場合は Wardらの方法
(Nature (1098) 341 , 544-546； FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) により、 あ るいは araBプロモ一夕一を使用する場合は Betterらの方法 （Science (1988) 240, 1041 -1043) により発現することができる。 抗体分泌のためのシグナル配列としては、 大腸菌のペリブラズムに産生させる 場合、 pe旧シグナル配列 (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) を使 用すればよい。 そして、 ペリブラズムに産生された抗体を分離した後、 抗体の構 造を適切に組み直して （refold) 使用する。
複製起源としては、 SV40、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 ゥシパピ ローマウィルス （BPV) 等の由来のものを用いることができ、 さらに、 宿主細 胞系で遺伝子コピー数増幅のため、 発現べクタ一は、 選択マ一カーとしてアミノ グリコシドトランスフェラーゼ (APH) 遺伝子、 チミジンキナーゼ （TK) 遺伝 子、 大腸菌キサンチングァニンホスホリポシルトランスフェラーゼ （Ecogpt) 遺伝子、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、 任意の発現系、 例えば真核細胞また は原核細胞系を使用することができる。 真核細胞としては、 例えば樹立された哺 乳類細胞系、 昆虫細胞系、 真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げ られ、 原核細胞としては、 例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
好ましくは、 本発明で使用される抗体は、 哺乳類細胞、 例えば CH0、 COS, ミエローマ、 BHK、 Vero、 HeLa細胞中で発現される。
次に、 形質転換された宿主細胞を in vitroまたは in vivoで培養して目的とする 抗体を産生させる。 宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。 例えば、 培養液と して、 DMEM、 MEM、 RPMI1640、 IMDMを使用することができ、 牛胎児血清 (FCS) 等の血清補液を併用することもできる。
前記のように発現、 産生された抗体は、 通常のタンパク質の精製で使用されて いる公知の方法により精製することができる。 例えば、 プロテイン Aカラムな どのァフィ二ティ一カラム、 クロマトグラフィーカラム、 フィルタ一、 限外濾過、 塩析、 透析等を適宜選択、 組み合わせることにより、 抗体を分離、 精製すること がでざる (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。
抗体の钪原結合活性 (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)の測定には公知の手段を使用することがで きる。 例えば、 ELISA (酵素結合免疫吸着検定法） 、 EIA (酵素免疫測定法） 、 RIA (放射免疫測定法） あるいは蛍光免疫法などを用いることができる 医薬組成物 .
別の観点においては、 本発明は、 ROB01に結合する抗体を有効成分として含 有する医薬組成物を特徴とする。 又、 本発明は ROB01に結合する抗体を有効 成分として含有する細胞増殖抑制剤、 特に抗癌剤を特徴とする。
本発明において、 「ROB01 に結合する抗体を有効成分として含有する」 とは、 抗 ROB01抗体を主要な活性成分として含むという意味であり、 抗 ROB01抗 体の含有率を制限するものではない。
本発明の細胞増殖抑制剤に含有される抗体は ROB01と結合する限り特に制 限はない。 好ましくは ROB01 と特異的に結合する抗体であり、 さらに好まし くは細胞障害活性を有する抗体である。 さらに、 本発明で使用される抗体は糖鎖 が改変された抗体であつてもよい。 抗体の糖鎖を改変することにより抗体の細胞 障害活性を増強できることが知られている。 糖鎖が改変された抗体としては、 例 えば、 グリコシル化が修飾された抗体 （W099/54342など） 、 糖鎖に付加する フコースが欠損した抗体 （WO00/61739、 WO02/31140など） ） 、 バイセクティ ング GlcNAcを有する糖鎖を有する抗体 (WO02/79255など） などが知られて いる。
本発明における細胞障害活性とは、 例えば抗体依存性細胞介在性細胞障害
(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity： ADCC)活性、 補体依存性細胞障 害 （complement-dependent cytotoxicity： CDC) 活性などを挙げることができる。 本発明において、 CDC活性とは補体系による細胞障害活性を意味し、 ADCC活 性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、 その Fc部分に Fcァ 受容体保有細胞 （免疫細胞等） が Fcr受容体を介して結合し、 標的細胞に障害 を与える活性を意味する。
抗 R0B01抗体が ADCC活性を有するか否か、 又は CDC活性を有するか否 かは公知の方法により測定することができる （例えば、 Current protocols in Immunology, Chapter7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al.， John Wiley & Sons, Inc.，(1993)等） 。 具体的には、 まず、 エフェクター細胞、 補体溶液、 標的細胞の調製を行う。
( 1 ) エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、 RPMI1640培地 (G旧 CO社製)中で脾臓 細胞を分離する。 10%ゥシ胎児血清 (FBS、 HyClone社製)を含む同培地で洗浄後、 細胞濃度を 5x106/mlに調製し、 エフェクター細胞を調製する。
( 2 ) 補体溶液の調製
Baby Rabbit Complement(CEDARLANE社製)を 10% FBS含有培地 (G旧 CO 社製)にて 10倍希釈し、 補体溶液を調製する。
( 3 ) 標的細胞の調製
ROB01を発現する細胞 （ROB01をコードする遺伝子で形質転換された細胞、 肝癌細胞、 肺癌細胞、 乳癌細胞、 子宮癌細胞、 胃癌細胞、 大腸癌細胞、 等） を 0,2mCiの 51Cr-クロム酸ナトリゥム (Amersham Pharmacia Biotech社製）ととも に、 10% FBS含有 DMEM培地中で 37°Cにて 1時間培養することにより放射性 標識する。 放射性標識後、 細胞を 10% FBS含有 RPMI1640培地にて 3回洗浄 し、 細胞濃度を 2x105/mlに調製して、 標的細胞を調製する。
次いで、 ADCC活性、 又は CDC活性の測定を行う。 ADCC活性の測定の場合 は、 96ゥエル U底プレート (Beckton Dickinson社製)に、 標的細胞と、 抗
ROB01抗体を ずつ加え、 氷上にて 15分間反応させる。 その後、 ェフエ クタ一細胞 100 Iを加え、 炭酸ガスインキュベーター内で 4時間培養する。 抗 体の終濃度は 0または 10 g/mlとする。 培養後、 100 lの上清を回収し、 ガン マカウンター (COBRAIIAUTO-GMMA、 MODEL D5005、 Packard Instrument Company社製)で放射活性を測定する。 細胞障害活性 (％)は (A-C)/(B-C)x100によ り求めることができる。 Aは各試料における放射活性 (cpm)、 Bは 1 % NP-40(半 井社製)を加えた試料における放射活性 (cpm)、 Cは標的細胞のみを含む試料の放 射活性 (cpm)を示す。
一方、 CDC活性の測定の場合は、 96ゥエル平底プレート (Becton Dickinson 社製)に、 標的細胞と、 抗 ROB01抗体を 50 Iずつ加え、 氷上にて 15分間反応 させる。 その後、 補体溶液 100 Iを加え、 炭酸ガスインキュベーター内で 4時 間培養する。 抗体の終濃度は 0または 3 g/mlとする。 培養後、 100 Iの上清 を回収し、 ガンマカウン夕一で放射活性を測定する。 細胞障害活性は ADCC活 性の測定と同様にして求めることができる。
钪 ROB01抗体が増殖を抑制する細胞は、 ROB01が発現している細胞であれ ば特に限定されないが、 好ましくは癌細胞であり、 さらに好ましくは肝癌細胞、 肺癌細胞、 乳癌細胞、 子宮癌細胞、 胃癌細胞、 脳腫瘍細胞、 大腸癌細胞である。 従って、 抗 ROB01 抗体は、 細胞増殖に起因する疾患、 例えば肝細胞癌、 肺癌、 乳癌、 子宮癌、 胃癌、 脳腫瘍、 大腸癌などの治療、 予防を目的として使用できる。 本発明の細胞増殖阻害剤および抗癌剤は、 経口、 非経口投与のいずれでも可能 であるが、 好ましくは非経口投与であり、 具体的には、 注射剤型、 経鼻投与剤型、 経肺投与剤型、 経皮投与型などが挙げられる。 注射剤型の例としては、 例えば、 静脈内注射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射などにより全身または局部的に 投与することができる。 また、 患者の年齢、 症状により適宜投与方法を選択する ことができる。 投与量としては、 例えば、 一回につき体重 1 kgあたり 0.0001 mg から 1000mgの範囲で選ぶことが可能である。 あるいは、 例えば、 患者あたり 0.001〜100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができる。 しかしながら、 本 発明の治療薬はこれらの投与量に制限されるものではない。
本発明の細胞増殖抑制剤および抗癌剤は、 常法に従つて製剤化することができ (Mん 、 Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A) 、 医薬的に許容される担体や添加物を供に含むもの であってもよい。 例えば界面活性剤、 賦形剤、 着色料、 着香料、 保存料、 安定剤、 緩衝剤、 懸濁剤、 等張化剤、 結合剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 流動性促進剤、 矯味剤等 が挙げられるが、 これらに制限されず、 その他常用の担体を適宜使用することが できる。 具体的には、 軽質無水ケィ酸、 乳糖、 結晶セルロース、 マンニトール、 デンプン、 カルメロ一スカルシウム、 カルメロースナトリウム、 ヒドロキシプロ ピルセルロース、 ヒドロキシプロピルメチルセルロース、 ポリビニルァセタール ジェチルァミノアセテート、 ポリビニルピロリドン、 ゼラチン、 中鎖脂肪酸トリ グリセライド、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 60、 白糖、 カルポキシメチル セルロース、 コーンスターチ、 無機塩類等を挙げることができる。
また、 本発明は、 ROB01発現細胞と ROB01に結合する抗体とを接触させる ことにより ROB01発現細胞に障害を引き起こす方法又は細胞の増殖を抑制す る方法を提供する。 ROB01に結合する抗体は、 本発明の細胞増殖抑制剤に含有 される ROB01に結合する抗体として上述したとおりである。 抗 ROB01抗体 が結合する細胞は ROB01が発現している細胞であれば特に限定されないが、 好ましくは癌細胞であり、 さらに好ましくは肝癌細胞、 肺癌細胞、 乳癌細胞、 子 宮癌細胞、 胃癌細胞、 脳腫瘍細胞、 大腸癌細胞である。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て 本明細書の一部としてここに引用する。 また， 本出願が有する優先権主張の基礎 となる出願である日本特許出願 2004- 102862号、 2004— 2278 99号および 2005-004024号の明細書および図面に記載の内容は全て 本明細書の一部としてここに引用する。 実施例 ' 以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが， これらの実施例は本発明 の範囲を制限するものではない。 実施例 1
各癌種における ROB01の mRNA発現解析
1-1. Gene chip を用いた ROB01遺伝子発現解析
癌細胞において発現が亢進する遺伝子を探索するために、 表 1に示す各種 RNAならびに各種摘出組織より ISOGEN (日本ジーン社製） を用い常法により 調製した全 RNAを用い検討した。 表 1. ROB01遺伝子発現解析に用いた組織および細胞株
Figure imgf000030_0001
上記全 RNAを各 10 ngずつ用い、 GeneChip U-133 (Affimetrix社製） に供し Expression Analysis Technical Manual (Affymetryx社製） に準じて遺伝子発現解 析を行った。 全遺伝子の発現スコアの平均値を 100とし、 癌細胞において発現 が宂進する遺伝子を探索したところ、 ROB01 mRNA (プロ一ブ ID :
213194_at HG-U133A) が正常月干 （9.1) と比較して、 中分化型肝細胞癌
(236.4) で 26倍、 低分化型肝細胞癌 (563) で 62倍と顕著に発現亢進してい ることが明らかになった。 また ROB01 mRNAは大腸癌においても発現亢進し ており、 正常大腸 （21.4) と比較して原発性大腸癌において 8例中 5例におい て 2倍以上亢進していた。 さらに、 大腸癌の転移性肝癧においては、 7例中 3例 において正常肝臓および大腸と比較しても顕著に亢進していた。 また、 ROB01 は肺小細胞癌においても正常肺と比較し 2倍以上亢進している例が 1例存在し た （図 1a，b)。
癌細胞株における解析においては、 ROB01の発現は、 ヒト脳腫瘍由来細胞株 である U251、 ヒト肝癌細胞株由来の Alexander, HLE、 HuH6、 HuH7、 HepG2、 ヒト肺癌細胞株由来の Lu1320、 H522、 そしてヒト子宮頸部癌由来の Helaなど でスコア 100を示し、 ROB01が上記で示した肝細胞癌、 大腸癌、 そして肺癌の みならず、 脳腫瘍や子宮頸部癌など広範な癌において発現亢進している可能性が 示された （図 1 c) 。
さらに、 肝細胞癌に関して高分化型、 中分化型 （HBV、 もしくは HCVウィル ス感染に起因するもの） 、 低分化型肝細胞癌、 ならびに非癌部である肝炎部位、 肝硬変部位、 ならびに正常肝に関して、 前述と同様に GeneChip™ HG-U95B Target (Affymetryx社製） を用いて解析した。 それぞれ各 3例分の摘出組織より 全 RNAを調製し、 5 gずつの全 RNAを 3例分混合したものを GeneChip解析 に供した。 全チップスコアの平均値を 100として標準化した値を示す。
その結果、 ROB01遺伝子 （プローブ ID： 55461_at— HG-U95B) は正常肝、 非癌部で発現量が非常に低いのに対し、 高分化型肝細胞癌から低分化型肝細胞癌 において顕著な発現上昇が確認され、 肝細胞癌で発現が亢進していることが明ら かとなつた （図 2) 。 実施例 2
1 -2. 定量的 PCRによる ROB01 mRNA発現解析
正常肝、 肝炎部位、 肝硬変部位、 ならびに肝癌摘出組織、 および同一組織の非 癌部より調製した RNAを用い定量的 PCRを実施した。 すなわち、 各組織より 調製した全 RNAより逆転写酵素 Superscriptll (G旧 CO BRL社製） を用いて合 成した 1本鎖 cDNAを铸型 DNAとして用い、 iCycleriQリアルタイム PCR解析 システム （BIO-RAD社製） により PCR反応を行い、 mRNA発現量を定量した。
ROB01のプライマーデザインは GenBank番号 （NM— 133631 ) より行った。 各 25 Lの PCR反応液は、 500mM KCI, 100 mM Tris-HCI(pH8.3), 20mM MgCI2， 0.1 %ゼラチン、 各 1.25 mM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 、 1 Lの各 1 本鎖 cDNA、 5 pmoleずつの ROB01センスプライマ一 （配列番号 1 ) 、
ROB01アンチセンスプライマー （配列番号 2) 、 0.75 Lの SYBR Green I (1000倍希釈溶液， 宝酒造社製)、 0.25 しの recombinant Taq polvmerase Mix (FG Pluthero, Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase^ Nucl. Acids. Res. 1993 21 : 4850-4851.) を含むように調製した後、 初めに 94 °Cで 3 分間一次変性を行い、 94 °Cで 15秒、 63 °Cで 15秒、 72 °Cで 30秒からなるサ イクルを 40回行なった。 各標品中の発現量は iCycler iQ リアルタイム解析シス テム付属ソフトを用いて計算した。 また、 個々の RNA中のヒト j3 -ァクチン遺伝 子発現量もヒト )3 -ァクチンに特異的なセンスプライマー （配列番号 3) ならび にアンチセンスプライマー （配列番号 4) を用い上記と同様に解析を行い、 R0B01の解析結果をヒト^ -ァクチンの解析結果で補正した値 （R0B01/ /3 -ァ クチン X 100) を ROBOI mRNA発現量とした。
その結果、 GeneChip解析の結果と同様に、 正常肝や肝炎部位、 ならびに肝硬 変部位における R0B01 mRNAの発現はほとんど認められないのに対し、 多く の肝細胞癌部位においては R0B01 mRNAの発現の亢進が確認された。 特に、 同一組織内での瘦部と非癌部との比較においては 9例解析したうち 8例におい ては 2倍以上の発現宂進が認められた （表 2) 。
表 2 . 定量的 PCR解析による ROB01遺伝子の発現亢進率 定量的 PCR解析 (対ベータァクチン (お)) 患者 No. ステージ 非癌部 ^Su。β 発 上升卓
#1 中分化型 16 712 44.5
#12 中分化型 62 488 7.9
#15 中分化型 19 40 2.1
#21 中分化型 19 64 3.4
#30 中分化型 46 118 2.6
#22 低分化型 16 304 19.0
#104 低分化型 N/A 826
#108 低分化型 15 32 2.1
#111 低分化型 161 43 0.3
#115 低分化型 154 685 4.4
2倍以上の差があるペア： 8例
実施例 3
抗 ROB01抗体の作製
抗 ROB01抗体を用いた癌の検出が可能かどうかを明らかにするために、 抗 ROB01抗体の作製を行った。
3-1. 抗原の調製
3-1 -1. ROB01 CDNAの単離
ROB01の発現を行うために、 まず ROB01の cDNAを以下のようにして単離 した。 Hep3B細胞より前述の方法に従い一本鎖 cDNAを調製し、 それを铸型と してプライマ一 RBV2F-TA (配列番号: 5) と RBR-TA (配列番号: 6) を用いて PCR法による増幅を行つた。 プライマ一 RBV2F-TAは ROB01遺伝子
(GenBank: NM— 133631 ) の 5'-端にハイブリダィズするように、 そして RBR- TAは 3'-端にハイブリダイズするようにデザィンした。 PCR法は LA-PCRキッ ト （TAKARA社製） のプロトコ一ルに準じて反応液を調製し、 初めに 95 °Cで 2 分間一次変性を行い、 94 °Cで 15秒、 63 °Cで 15秒、 72 °Cで 5分からなるサ イクルを 30回行なった後、 最後の伸長反応を 72 °Cで 10分間からなる条件で 実施した。 その結果、 ROB01予測配列と一致する約 5 kbp付近のバンドの検出 に成功した。 PCR法で得られた特異的増幅断片を TAクローニング法により pcDNA3.1/V5-His TOPO (Invitrogen社製） に挿入し、 塩基配列を定法により確 認したところ、 単離した cDNAが ROB01であることが明らかとなった。
3-1-2. ROB01の N末部位を発現する組換えバキュロウィルスの作製
R0B01の N末から最初のィムノグロブリン領域 (IgD を含む領域に関して バキュロウィルスの膜タンパク質 gp64との融合タンパク質として発現させた。 すなわち、 上記の ROB01 cDNAを铸型とし、 RB— BVFプライマ一 （配列番 号: 7) 、 および RB— BVRプライマ一 （配列番号: 8) を用い PCR法にて ROB01 の N末から最初のィムノグロブリン領域 （Ig1 ) を含む領域をコ一ドする遺伝子 を増幅し、 続いて pGEM-Teベクター （プロメガ社製） への挿入を行った。 塩基 配列を定法にて確認した後、 制限酵素 Kpnlを用いて切断した遺伝子断片を pBucSurfベクタ一 （Novagen社製） に揷入し、 トランスファーベクタ一
R0B01 N/pBSを構築した。 続いて、 4 gの ROB01 N/pBSを制限酵素 Bpll (Fermentas社製） を用い切断し直鎖化した後、 Invitrogen社の指示書に準じて Bac-N-Blue DNAと共に Sf9細胞に導入し、 ROB01 -lg1と gp64との融合タンパ ク質発現組み換えパキュロウィルスを調製した。
上記により調製した組換えウィルスを Sf9細胞 （2 x 106個細胞/ mL) に MOI が 5となるように加え感染させた後、 27°Cで 3日間培養した。 ROB01-lg1と gp64との融合タンパク質を発現する発芽型パキュロウィルス （BV) は 3日間培 養後の培養上清より回収した。 すなわち、 培養液を 800 x gで 15分間遠心し、 細胞ならびに細胞破碎物を除去した後、 回収した培養上清を 45,000 X gで 30分 間遠心する。 沈殿物を PBSに懸濁し、 さらに 800 x gで遠心することで細胞成 分を除去し、 上清を再度 45,000 x gで遠心することで得られる沈殿物を PBSで 懸濁したものを BV画分とし、 抗原として免疫に用いた。 3-2. 抗 ROB01モノクローナル抗体の作製
上記の方法により調製した ROB01 -Ig1発現 BVを抗原として用い钪 ROB01 モノクローナル抗体を作製した。 すなわち、 PBSに懸濁した 1 mgのタンパク量 に相当する ROB01-lg1発現 BVを 200 ngの百日咳毒素とを混合したものを gp64卜ランスジエニックマウス (WO03/104453) に皮下注射により初回免疫を 行った。 以後の免疫では 500 mgタンパク量相当の ROB01-lg1発現 BVのみ を皮下注射した。 最終免疫として 250 /x gの ROB01-lg1発現 BVを静脈内に投 与し、 その 3日後にマウスから脾臓細胞を単離し、 常法によりマウス P3U1細 胞との細胞融合を行い、 ハイプリドーマ細胞を樹立した。 抗 ROB01抗体を産 生するハイプリドーマ細胞の選択は免疫に用いた抗原である ROB01-lg1発現 BVを固層した ELISAにて実施した。 ELISA法は、 ROB01-lg1発現 BVを終濃 度 10 g/mlになるように 96ゥエル平底プレート （ファルコン社製） に 4· で 一昼夜おき、 その後、 40%ブロックエース試薬 （大日本製薬社製） を含む TBS 緩衝液を用いてブロッキングした後、 ハイプリドーマ培養上清を加え、 室温で 1 時間反応させた。 次いで、 室温にて 1時間 HRP標識抗マウス IgG抗体 （ジャク ソン社製） を反応させ、 4回洗浄した後、 室温にて 1時間、 3，3', 5，5' -テトラメ チルベンジジン (TMB)試薬 （Sigma製） を反応させた。 0.5N硫酸で反応を停止 させ、 マイクロプレ一ト ·リ一ダー MultickanJX (Labsystems社製） で 492nm における吸光度を測定した。
その結果、 ROB01に結合するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ 細胞 A7241 Aならびに A7225Aの樹立に成功した。 各モノクロ一ナル坊体は産 生ハイプリドーマ細胞の培養上清より硫安沈殿法により調製した。 実施例 4
抗 ROB01抗体を用いた ROB01タンパク質分子の検出
上記により調製した抗 ROB01抗体の反応性を確認するために、 ROB01強制 発現細胞株ならびに各種癌細胞株の細胞ライゼ一トを用い ROB01の検出を行 つた。 初めに、 ROB01強制発現 HEK293細胞を用いウェスタン解析により抗 ROB01抗体 A7241Aの反応性を確認した。 動物細胞発現べクタ一は、 前述の ROB01をコードする cDNAを pcDNA3.1/V5-His T〇PO (Invitrogen社製） に揷 入した全長 ROB01遺伝子発現べクタ一 （ROB01/pcDNA3.1) を使用した。 続 いて、 1 の ROB01/psDNA3.1もしくは陰性対照として pcDNA3.1 (Mock) を 5 x 104個の COS7細胞あるいは 2 x 105個 HEK293細胞に FuGene6試薬 (ロシュダイダイァグノスティック社製） を用いて導入し、 ROB01を一過性発 現させた。 発現べクタ一導入 3日後の細胞を回収し、 培養細胞を RIPA緩衝液 (150 mM塩化ナトリウム、 1% NP-40、 0.5% デォキシコール酸、 0.1% S D S、 50 mMトリスヒドロキシァミノメタン塩酸塩 (pH8.0) ) にて可溶化するこ とで細胞ライゼートを調製した。
それぞれ 3 gタンパク質相当量のライゼ一トを SDS-ポリアクリルアミドゲ ルに供し、 SDS-PAGEによりタンパク質を分離した後、 Hybond-P (アマシャム バイオサイエンス社製） に転写した。 そして一次抗体として抗 His抗体 (Sigma 社製） もしくは A7241A抗体 （1 g/mL) を使用し、 二次抗体に HRP標識抗マ ウス IgG抗体 (ジャクソン社製) を用い、 ECLプラス (アマシャムバイオサイ エンス社製） による検出を行ったところ、 抗 His抗体と特異的に反応する分子量 約 260kdのバンドが検出された。 これは全長の ROB01 であると考えられるが、 抗 ROB01抗体 A7241Aにおいても同様の分子量のバンドが細胞ライゼート中 に確認された。 以上の結果より、 抗 ROB01抗体 A7241Aは全長の ROB01夕 ンパク質を特異的に検出可能であることが示された。 さらに、 A724 1 Aにおい て分子量の小さいいくつかのパンドも同様に検出されたが、 これらのバンドは^: His抗体では検出されないことから、 C末部位が欠損した分解物である可能性が 考えられ、 実際に培養上清中に分子量約 120kdのバンドが特異的に検出された (図 3) 。 全長 ROB01の推定分子量は 190kdであるが、 糖鎖等の修飾により プレスティン分子量マーカー （Bio-Rad社製） の 250kdより上部の位置 （約
260kd) で検出されると考える。 また HEK293細胞の pcDNA3.1を用いた Mock 試験で.も ROB01と考えられるパンドが検出されているが、 これは ROB01が 胎児期に発現することから、 ヒト胎児腎臓由来の HKE293細胞が ROB01を発 現しているためと考える。 続いて、 各種癌細胞株の細胞ライゼートに関して同様にウエスタン解析を行つ た。 その結果、 GeneChipU133の解析結果と一致し、 mRNA発現スコアが高い 細胞株においてのみ分子量約 260kdの全長の ROB01 と考えられるバンドを検 出することに成功した （図 4) 。 また、 分子量の小さい複数のバンドも同様に検 出されたことより、 細胞株により糖鎖の結合量が異なる、 もしくは分解物ゃスプ ライシングに違いにより分子量が異なった ROB01の存在が示唆された。
さらに、 ROB01を発現する癌細胞株においても可溶型の ROB01断片が培養 上清中に検出できるか確認したところ、 ROB01を高発現する肝癌細胞株の培養 上清中にも強制発現細胞の培養上清と同じ分子量のバンドが抗 ROB01抗体に より検出された （図 3) 。
以上の結果より、 ROB01モノクローナル抗体 A7241Aは ROB01を特異的に 検出できること、 ならびに GeneChip解析による mRNA発現の程度と ROB01 タンパク質の発現の程度が一致することが明らかとなった。 さらに、 抗 ROB01 抗体を用いた検討から ROB01発現細胞の培養上清中に可溶型の ROB01断片 が存在することが明らかとなったことより、 可溶型 ROB01を検出することで 癌細胞の有無を判断できる可能性が強く示唆された。 実施例 5
肝細胞癌の免疫組織染色
抗 ROB01モノクローナル抗体を用い、 肝細胞癌の臨床検体の免疫組織染色 解析を実施した。
肝細胞癌摘出組織の固定パラフィン包埋標本を 4 mに薄切した切片をスライ ドガラスに張り付け、 37°Cで 16時間程度置くことで十分乾燥させた。 100%キ シレンに 5分間ずつ 3回漬けることで脱パラフィンし、 続いて 100%アルコール に 5分間を 3回、 70%エタノールで 5分間漬けることで親水化を行った。 その 後、 50 mM TBS緩衝液 （50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCI) で 5分間、 3回洗 浄した後、 クェン酸バッファー （10mM，pH7.0) 中で 120°C、 10分間反応させ 抗原の賦活化を行った。 抗原の賦活化後、 TBS緩衝液を用い 5分間ずつ 3回の 洗浄を行った後、 1 0 g/mLに希釈した A7241A抗体を室温で 1時間反応させ た。 続いて、 0.3%の過酸ィ匕水素で 15分間、 室温で作用させることで内在性の ペルォキシダーゼを失活させた。 さらに TBS緩衝液で 3回洗浄した後、 二次抗 体として ENVISION+キット /HRP (DAKO社製） を 1時間作用させた。 TBS緩 衝液で 5分間ずつ 3回の洗浄後、 DAB (3,3'-ジァミノべンジジン四塩酸塩） を 用い発色させた。 また、 核の対比染色にはへマトキシリンを用いた。
その結果、 図 5に示すように肝細胞癌が特異的に抗 ROB01抗体により染色 されたことより、 ROB01タンパク質が肝細胞癌で特異的に発現亢進することが 明らかになった。 また、 抗 ROB01抗体が肝細胞癌などの ROB01高発現癌の 免疫組織化学診断に利用可能であることが明らかとなつた。 実施例 6
肝細胞癌患者血清中の可溶型 ROB01タンパク質 （SROB01 ) の検出
実施例 4の結果より ROB01タンパク質の断片が遊離し、 可溶型 ROB01と して存在することが示されたことより、 肝細胞癌患者などの ROB01を高発現 する癌患者血清中にも可溶型 ROB01タンパク質 （SROB01) が存在する可能 性が考えられ診断マ一カーとして有用であると考えられる。 そこで、 肝細胞癌 患者 24例および肝硬変患者 6例、 そして肝炎患者 6例の各血清中における可溶 型 ROB01の存在を、 A7241A抗体を用いたウエスタン解析により検討した。
SDS-PAGEならびにウエスタン解析は上記と同様に行い、 患者血清はそれぞれ 5 1ずつ用い、 陽性対照として肝癌細胞株 Alexander (ADO の培養上清を用い た。 その結果、 図 6に示すように 24例中 23例の肝細胞癌患者血清において SROB01が検出されたのに対し、 肝硬変および肝炎患者血清においては検出さ れなかった。 以上のことにより、 SROB01は ROB01発現癌患者の血清中にお いても存在することが示されたと共に、 SROB01の検出が肝細胞癌などの ROB01発現癌の血清診断マ一カーとして非常に有効であることが示された。 実施例 7
可溶型 ROB01 (sROB01-His) の調製
ROB01の細胞外領域の C末に Hisタグを付加した可溶型 ROB01 (sROB01-His) は以下のようにして調製した。
ROB01 cDNAを錶型としプライマ一 RBV2F-TA (配列番号: 13) とプライマ一 RB_SH_TA (配列番号: 14) を用いて PCR法により細胞外領域をコードする遺 伝子を増幅した。 PCR産物を pBlueBack4.5-TOPOベクターに直接挿入し、 配 列解析を行った後、 正しい塩基配列を有するトランスファ一ベクター
sROBOI/pBBを作製した。 4 gの sROBOI/pBBを用い、 実施例 3の方法と同 様に組み換えバキュロウィルスを作製した。
続いて、 sROB01-Hisは以下のようにして調製した。 すなわち、 2乂106個/1111_ の Sf9細胞に MOIが 5となるように sROB01-His発現組換えバキュロウィルス を感染させ、 27度で 3日間培養し、 その培養上清を回収した。 培養上清中に含 まれる sROB01-Hisは Ni-NTAsuperflow (QIAGEN社） を用い添付プロトコ一 ルに従い精製した。 精製品を Centircon-10 (Amicon社製） を用い濃縮、 ならび に PBSへのバッファ一置換を行うことで sROB01-Hisを調製した。 ' 実施例 8
SROB01免疫ゥサギ血清の評価
8-1.ウエスタン解析による ROB01タンパク質分子の検出
ニュージ一ランドホワイト種ゥサギ （10週齢雌、 日本クレア社製） に、 PBS に縣濁した SROB01精製抗原 lOO gZO mLZ匹をフロイント完全アジュパン ト （DIFCO社製） 0.5mLと混合してェマルジヨンにしたものを、 皮下注射によ り投与して初回免疫を行った。 以後 2週間間隔で、 PBSに縣濁した SROB01精 製抗原 100^g/0.5mLをフロイント不完全アジュバント 0.5mLと混合してエマ ルジョンにしたものを、 皮下注射により投与して、 合計 4回免疫を行った。 免 疫前および 3回, 4回目免疫後に各々採血を行い、 SROB01に対する抗体価上昇 を ELISA法で確認した。 すなわち、 SROB01を EUSA用ポリスチレンプレート に固相化し、 ゥサギ抗血清の希釈列を反応させた後、 ホースラディッシュパーォ キシダーゼ標識抗ゥサギ IgG抗体 （カペル社製） と反応させ、 3,3'，5，5'-テトラメ チルベンチジン試薬 （TMB試薬；サイテック社製） で発色させて抗体力価を検 定した。 抗体価の上昇を確認した後、 全採血を行い、 抗 ROB01ゥサギ抗血清 を得た。
SROB01免疫ゥサギ血清を用いて、 ウエスタン解析による全長 ROB01分子 の検出を行った。 前述の通り全長の ROB01を強制発現させた HEK293細胞よ り RIPA緩衝液を用いて調製した細胞ライゼ一トの 10 gタンパク質相当量を SDS-ポリアクリルアミドゲルに供し、 タンパク質を分離した後、 Hybond-P (ァ マシャムバイオサイエンス社製） に転写した。 そして一次抗体として sROBOI 免疫ゥサギ血清を 100倍希釈で使用し、 二次抗体に HRP標識抗ゥサギ IgG抗体
(アマシャムバイオサイエンス社製） を用い、 ECLプラス （アマシャムバイオ サイエンス社製） による検出を行ったところ、 陽性対照である A7241A抗体と 同様に全長 ROB01分子と考える分子量約 260kdのバンドを検出できた （図 7 ) 。 以上の結果より、 SROB01免疫ゥサギ血清はウェスタン解析で全長
ROB01分子を検出できることが明らかとなった。
8-2.FACS解析による ROB01タンパク質の検出
ROB01強制発現 HEK293細胞を用いて sROBOI免疫ゥサギ血清が細胞表面 の ROB01を検出できるかどうか評価するため、 FACS解析を実施した。 すなわ ち、 ROB01強制発現 HEK293細胞あるいは陰性対照である HEK293細胞を FACS溶液 （1%アルブミン、 0.1% NaN3入り PBS) に懸濁した。 細胞懸濁液に SROB01免疫ゥサギ血清を加えて、 4°Cで 60分間反応させ、 FACS溶液で 2回 洗浄した後、 FfTC標識抗ゥサギ F(ab)2抗体 （DAKO社製） を加えて、 4 で 30 分間反応させた。 そして FACS溶液で 2回洗浄した後、 使用説明書に準じて FACScalibur (べクトンディッキンソン社製)による FACS解析を実施した。 今回 の実験の陽性対照として抗 V5タグ抗体 （Invtrogen社製） を用い、 その二次抗 体には FITC標識抗マウス IgG抗体 （ジャクソン社製） を使用した。 V5タグは ROB01 細胞内領域の C末端に付加したため、 抗体が細胞内の V5タグを検出で きるよう一次抗体添加時に 0.1%サポニンを含む FACS溶液を用いた。
その結果、 図 8に示すように、 陽性対照の抗 V5抗体でのピークのシフトと同 様に、 SROB01免疫ゥサギ血においても ROB01強制発現 HEK293細胞におい てのみ特異的なピークのシフトが検出された。 また、 ROB01を元々発現している肝癌細胞株 HepG2細胞においても上記と 同法にて FACS解析をした結果、 図 9に示すように、 SROB01免疫ゥサギ血清 において特異的なピークのシフ卜が認められたことより、 細胞表面上の本来の構 造を有する ROB01分子をも検出できることが明らかとなった。 実施例 9
抗ヒ卜 R0B01ゥサギポリクローナル抗体の精製
上記の sROBOl免疫ゥサギ血清より作製した抗ヒト R0B01ゥサギ ·ポリクロー ナル抗体を、 以下のようにして R0B01を固相化したァフィ二ティ一クロマトダラ フィ一により精製を行った。 すなわち、 添付文章に従い CNBr- Ac t ivated
Sepharose 4B (Amasham Pharmac i a Biotec #17- 0430-02)を用いて、 添付文書に 従いゲル 1 mL当りに対し、 0. 7 mgの精製 sROBO卜 His抗原を固定化し、 sROBO卜 Hi sァフィ二ティーカラムを作製した。 続いて、 常法に従い実施例 8で得'たゥサ ギ血清から抗 R0B01ゥサギ ·ポリクロ一ナル抗体を精製した。 実施例 1 0
ELISA系による R0B01測定系の確立ならびに血中 R0B01の検出
実施例 9で得られた抗 R0B01ゥサギポリクロ一ナル抗体を用いて EL ISA検出系 を構築した。 すなわち、 抗 R0B01ゥサギポリクローナル抗体を PBS中に 5 g/mL の濃度で希釈し、 96ゥエルのィムノプレートに 1ゥエル当たり 50 Lずつ分注 した。 2〜8でで一夜放置後、 0. 05%の Tween 20を含む PBSで 3回洗浄し、 1ゥ エル当たり 150 の Immunoassay Stabi l i zer (ABI #10- 60卜 001)で 1時間ォ一 バ一コートを行った。 その後、 溶液を捨てて、 37°Cで 2時間乾燥を行い、 抗 R0B01抗体固相化プレートとした。 検出に用いるピオチン標識抗 R0B01抗体は、 pH8. 5の 50mM炭酸緩衝液を用いて、 抗 R0B01ゥサギポリク口一ナル抗体および Sul fo-NHS-LC-Bi o t in (Pierce #21335) が、 それぞれ 0. 12mg/mLおよび g/mLとなるよう調製し、 室温で 2時間放置した。 未反応のピオチン試薬は PD- 10 (Pharmac i a #17- 0851- 01)を用いて除き、 ピオチン標識抗 R0B01抗体は、 1 g/mLとなるように、 30%の子牛血清を含む PBSで希釈し調製した。 更に、 ピオ チン標識抗 R0B01抗体は 30%の子牛血清を含むトリス緩衝生理食塩水中に 3 g/mLとなるよう希釈したストレプトアビジン標識ペルォキシダーゼ (Vector #SA-5004)を用いて検出し、 ペルォキシダ一ゼの検出の基質として TMB試薬 （サ ィテック #TM490041) および基質反応の停止剤として TMB停止剤 (サイテック «SB999)を用いた。
続いて健常者 72例、 肝癌患者 79例、 肝硬変/慢性肝炎患者 67例およびその 他癌患 22例の血清中の R0B01濃度を測定した。 R0B01濃度測定の際のスタンダ ードとしては、 精製 sROBOl- Hisを用いた。 血清または sR0B01-Hi sをそれぞれ 20%ゥサギ血清、 1¾ BSAを含むトリス緩衝液で 90倍に希釈し、 上記の抗体固相 化プレートの各ゥエルに lOO iiLずつ分注した。 室温で 2 間インキュベーショ ンした後、 各ゥエルに 25 / Lずつのビォチン標識抗 R0B01抗体を分注した。 更に、 室温で 2時間インキュベーションした後、 各ゥエルの反応液を除去し、 I OO L ずつのストレブトァビジン標識ペルォキシダーゼ試薬を分注した。 室温で · 30分 ィンキュベーションした後、 0. 05 %Tween 20を含む PBSで 5回洗浄した。 各ゥ エルに の TMB試薬を分注し、 室温で 30分インキユーべ一シヨンした後、 I OO Lの TMB停止剤を加え、 EIAプレートリーダー（コロナ電子 #MTP- 120)によ り、 450nmの波長の吸収を測定した。 なお、 630nmの波長を対照として用いた。 その結果、 sROBOl- Hi s を用いた場合に濃度依^?的な吸収値の増加が認められ、 さらにスタンダード各濃度の吸収値から回帰により（図 1 0 )、 各血清中の濃度を 求めた。 結果を表 3、 4、 5および 6に示す。
表 3 . 健常者の血中 ROB01濃度
Figure imgf000043_0002
Figure imgf000043_0001
. 肝癌患者の血中 ROB01濃度
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000044_0002
注：表中のプランクは未測定。 5 . 肝硬変および慢性肝炎患者の血中 ROB01濃度
Figure imgf000045_0001
注：表中のブランクは未測定。
肝癌以外の癌患者の ROB01血中濃度
ID ROB01
診断 、ng/ ml)
43 白血病 27
58 白血炳 61
84 白血炳 56
182 白血病 64
204 白血病. 52
159 肺癌 128
161 唐 57
76 脳腫瘍 15
29 胆嚢癌 41
175 胆管癌 53
168 大 ¾5 50
68 滕癌 54
71 食道癌 10
106 骨髄腫 31
49 ¾3 1
50 80
69 4^* 43
70 67
105 胃癌 18
1 13 胃癌 39
147 1癌 128
48 顎下腺癌 30 陽性 η 2
% 9.1
健常者血清 72 例の R0B01 濃度測定において、 平均値および標準偏差は 36ng/mL および 8ng/mL であったことより、 平均値 + ( 6 x標準偏差） の 81 ng/inL をカットオフ値とした。 その結果、 健常者血清検体は全例がこのカツ卜ォ フ値以下であつたのに対し、 肝癌患者検体、 肝硬変. Z慢性肝炎患者検体およびそ の他癌患者検体においてはそれぞれ 46% (79 例中 36例） 、 22 % (67例中 15 例） および 9 % (22例中 2例） でカットオフ値以上の値を示し、 R0B01陽性であ ると考えられた。 一方、 肝癌の診断法として一般的に用いられている AFPの陽性 率は、 肝癌患者検体および肝硬変,慢性肝炎患者検体でそれぞれ 46 % (59例中 27例） および 15 % (52例中 8例） であったことから、 肝癌診断における感度お よび特異性は AFPと R0B01とでほぼ同等であった。 しかしながら、 AFP陰性の肝 癌患者検体 32例中において、 R0B01陽性検体が 10例あり、 さらにそれら 10例 のうち 5例は PIVKAも陰性であったことから、 R0B01を用いることで既存の診断 法で肝癌と診断できなかった症例においても診断可能となると考えられた。 実際 に、 AFP単独での検出では 46 %であった陽性率が、 R0B01 を併用することにより 63 %に上がった。
以上より、 肝癌の診断において、 R0B01測定系は現行で用いられている AFP測 定系とほぼ同等の性能があり、 更に既存の癌マ一カーとの併用により、 感度およ び特異性が高い癌診断法を確立できた。
さらに、 表 3、 4、 5および 6に示される値を疾患別にプロットした結果を図 1 1に示す。 健常者 （NHS) 、 慢性肝炎 (CH) 、 肝硬変 （LC) および肝癌 (HCC) における血清中 R0B01濃度は、 平均値でそれぞれが 34. 8、 39. 3、 74. 0および 84. 4 ng/mLであった。 この結果から、 健常者、 慢性肝炎、 肝硬変および肝癌患 者各群における血清中 R0B01濃度が肝疾患の重篤化に比例して上昇することが明 らかとなつた。
次に、 各個人の経時的な測定においても、 R0B01濃度が変化するか否かを確認 するため、 肝癌発症前の採血検体における R0B01濃度の測定を実施した。 その結 果、 3例中 2例において重篤化に比例し血中 R0B01濃度が上昇していることが認 められた （図 1 2 ) 。 1例においては、 重篤化に比例した上昇は認められなかつ たが、 健常者 3 0〜4 0 ng/mLより高値であることから、 最大値に達したもの と推察される。
これらの結果は、 肝疾患血清中 R0B01濃度を経時的に測定することにより、 す なわちモニターすることにより、 肝癌の診断のみならず患者の肝疾患の程度を管 理することが可能であることを示している。 実施例 1 1
補体依存性細胞障害活性 (CDC活性)の測定
ヒトアルブミン ·ベロナール ·バッファ （HAVB) の作製
NaCI (特級、 和光純薬工業株式会社） 12.75 g Na-バルピタール （特級、 和 光純薬工業株式会社） 0.5625 g、 バルピタール （特級、 和光純薬工業株式会社） 0.8625 gをミリ Q水に溶解し 200 mLとした後、 ォ一トクレーブ処理 （121°C、 20分間） を行った。 オートグレーブ処理した 100 mLの温ミリ Q水を加え、
PH7.43を確認した （推奨 pH7.5) 。 これを 5Xベロナ一ルバッファとした。
CaCI2-2H20 (特級、 純正化学株式会社） 0.2205 gを 50 mLミリ Q水に溶解し 0.03 mol /しとし、 CaCI2溶液とした。 MgCI2'6H20 (特級、 純正化学株式会社） 1.0165 gを 50 mLミリ Q水に溶解し 0.1 mol/Lとし、 MgCI2溶液とした。 5Xベ ロナールバッファ 100 mし ヒト血清アルブミン （ブミネート （登録商標） 25%、 ヒト血清アルブミン濃度 250 mg/mし バクス夕一株式会社） 4 mし、 CaCI2溶液 2.5 mし MgCI2溶液 2.5 mし KCI (特級、 純正化学株式会社） 0,1 g、 ダルコ一 ス （D(+)-グルコース、 ブドウ糖無水、 特級、 和光純薬工業株式会社） 0.5 gをミ リ Q水に溶解し 500 mLとした。 これを HAVBとした。 ろ過滅菌後、 設定温度 5°Cにて保存した。 . 標的細胞の調製
ROB01強制発現 HEK293細胞は、 10%FBS (Thermo Trace) と 0.5 mg/mL Geneticin(G旧 CO)を添加した DMEM培地 （SIGMA) で培養し、 細胞剥離緩衝液 (G旧 CO)を用いてディッシュから剥離して、 96ゥエル U底プレート (BECTON D KINSON)の各ゥエルに 1 X 104細胞/ゥエルで分注し、 ー晚培養した。 培養後、 5.55MBqのクロム- 51を加え、 5%炭酸ガスインキュベータ中 37°C 1時間培養 5 006838
47 し、 この細胞を HAVBで 2回洗浄し、 50 Lの HAVBを加え標的細胞とした 幼令ゥサギ補体の調製
試験時に用時調製した幼令ゥサギ補体 (BABY RABBIT COMPLEMENT,
CEDARLANE)を、 1バイアルあたり 1 mLの注射用蒸留水 (扶桑薬品工業株式会 社)に溶解し、 補体溶液とした。 クロム遊離試験 （CDC活性）
抗 ROB01抗血清 （抗 ROB01ゥサギポリクローナル抗体） を HAVBで希釈 して 50倍， 500倍の抗体溶液とした。 標的細胞に抗体溶液を 50 Lずつ添加し、 氷上で 15分静置した。 続いて各ゥエルに補体溶液を 100 g/mLずつ添加し
(抗体の最終希釈率 200倍， 2000倍） 、 5%炭酸ガスインキュベータ一中に
37°Cで 90分間静置した。 プレートを遠心分離後、 各ゥエルより上清を 100〃L ずつ回収し、 ガンマカウンタ一にて放射活性を測定した。 下式により特異的クロ ム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率 (%) = (A-C)/(B-C) X 100
Aは各ゥエルにおける放射活性 （cpm) 、 Bは標的細胞に 2% ΝΡ-40 Τ溶液
(Nonidet P-40、 ナカライテスク株式会社） を 100 ^し HAVBを 50 添 加したゥエルにおける放射活性 （cpm) の平均値、 Cは標的細胞に HAVBを 150 し添加したゥエルにおける放射活性 （cpm) の平均値を示す。 試験は三重に行 い、 CDC活性 （％) について平均値および標準偏差を算出した。
その結果を図 1 3に示す。 抗 ROB01抗血清、 すなわち抗 ROB01ポリクロ ーナル抗体が ROB01発現 HEK293細胞に対し用量依存的に CDC活性を示すこ とが明らかとなった。 なお、 ゥサギ pre血清を用いた場合は抗体非添加と同様に CDC活性を示さなかつた。 実施例 1 2
ROB01の細胞外領域と結合するモノクローナル抗体の作製
12-1. ROB01の N末部位を発現する組換えバキュロウィルスの作製 P2005/006838
48
ROB01 の細胞外領域に存在するファイブロネクチン III領域 （Fnlll) を、 バ キュロウィルスの膜タンパク質 gp64との融合タンパク質として発現させた。 す なわち、 上記の ROB01 cDNAを铸型とし、 gp4Fプライマー （配列番号: 1 5 ) 、 および gp4Rプライマー （配列番号: 1 6 ) を用い PCR法にて ROB01の 3番目 のファイブロネクチン領域をコードする遺伝子を増幅し、 続いて pGEM-Teべク 夕一 （プロメガ社製） への揷入を行った。 塩基配列を定法にて確認した後、 制限 酵素 Kpnlを用いて切断した遺伝子断片を pBucSurf ベクタ一 （Novagen社製） に挿入し、 トランスファーベクタ一 ROB01 gp4/pBS を構築した。 続いて、 4 i g の ROB01 gp4/pBSを制限酵素 Bpll (Fermentas社製） を用い切断し直鎖化した 後、 Invitrogen社の指示書に準じて Bac-N-Blue DNAと共に Sf9細胞に導入し、 ROB01の Fnlllと gp64との融合タンパク質発現組み換えバキュロウィルスを調 製した。
配列番号 1 5 ： GGTACCCGCACCCAGTGCCCCACCCCAAGG
配列番号 1 6 ： GGTACCGCATCTGAAATCTGCTGAGCGAGG
上記により調製した組換えウィルスを Sf9細胞 （2 X 106個細胞/ mL) に MOI が 5となるように加え感染させた後、 27°Cで 3 日間培養した。 ROBOI -Fnlll と gP64との融合タンパク質を発現する発芽型パキュロウィルス （BV) は 3日間培 養後の培養上清より回収した。 すなわち、 培養液を 800 X gで 15分間遠心し、 細胞ならびに細胞破砕物を除去した後、 回収した培養上清を 45,000 X gで 30分 間遠心する。 沈殿物を PBSに懸濁し、 さらに 800 X gで遠心することで細胞成 分を除去し、 上清を再度 45,000 X gで遠心することで得られる沈殿物を PBSで 懸濁したものを BV画分とし、 抗原として免疫に用いた。
12-2. 抗 ROB01モノクローナル抗体の作製
上記の方法により調製した ROBOI -Fnlll発現 BVを抗原として用い抗 ROB01 モノクローナル抗体を作製した。 すなわち、 PBSに懸濁した 1 mgのタンパク量 に相当する ROBOI -Fnlll発現 BVを 200 n gの百日咳毒素と混合したものを gp64トランスジエニックマウス （WO03/104453) に皮下注射により初回免疫を 行った。 以後の免疫では 500 maタンパク量相当の ROB01 -FnHI発現 BVのみ を皮下注射した。 最終免疫として 250 i gの ROBOI-Fnlll発現 BVを静脈内に 投与し、 その 3日後にマウスから脾臓細胞を単離し、 常法により.マウス NS-1細 胞との細胞融合を行い、 ハイプリドーマ細胞を樹立した。 抗 ROB01 抗体を産 生するハイプリドーマ細胞の選択は免疫に用いた抗原である ROBOI-Fnlll発現 BVを固層した ELISAにて実施した。 ELISA法は、 ROB01-Fn川発現 BVを終濃 度 10^ g/mLになるように 96ゥエル平底プレート （ファルコン社製） に 4 °C で一昼夜おき、 その後、 40%ブロックエース試薬 （大日本製薬社製） を含む TBS—緩衝液を用いてブロッキングした後、 ハイプリドーマ培養上清を加え、 室 温で 1時間反応させた。 次いで、 室温にて 1時間 HRP標識抗マウス IgG抗体 (ジャクソン社製） を反応させ、 4回洗浄した後、 室温にて 1時間、 3, 3'， 5， 5' - テトラメチルベンジジン (TMB)試薬 （Sigma製） を反応させた。 0.5N硫酸で反 応を停止させ、 マイクロプレート ·リ一ダ一 MultickanJX (Labsystems社製） で 492nmにおける吸光度を測定した。
その結果、 ROB01 に結合するモノクロ一ナル抗体を産生するハイプリドーマ 細胞 B2318Cの樹立に成功した。 モノクローナル抗体は産生ハイプリド一マ細 胞の培養上清より硫安沈殿法により調製した。 実施例 1 3
補体依存性細胞障害活性 (CDC活性)の測定
ヒトアルブミン 'ベロナ一ル ·バッファ (HAVB) の作製、 標的細胞の調製、 ならびに幼令ゥサギ補体の調製は、 実施例 1 1と同様にして行った。
B2318C抗体 （抗 ROB01 モノクローナル抗体） を HAVBで希釈し、 標的細 胞に 50 Lずつ添加して、 氷上で 15分静置した。 続いて各ゥエルに補体溶液 を 100 g/mLずつ添加し （抗体の最終濃度は 1 H g /mL, 10 g/mLに調製） 、 5%炭酸ガスインキュベータ一中に 37°Cで 90分間静置した。 プレートを遠心分 離後、 各ゥエルより上清を 100 Lずつ回収し、 ガンマカウンタ一にて放射活性 を測定した。 下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率 （％) = (A-C)/(B-C) X 100
A は各ゥエルにおける放射活性 （cpm) 、 B は標的細胞に 2% NP-40水溶液 (Nonidet P-40、 ナカライテスク株式会社） を 100 fiし HAVB を 50 L添 加したゥエルにおける放射活性 （cpm) の平均値、 Cは標的細胞に HAVBを 150 L添加したゥエルにおける放射活性 （cpm) の平均値を示す。 試験は三重に行 い、 CDC活性 （％) について平均値および標準偏差を算出した。
その結果を図 1 4に示した。 B2318C抗体、 すなわち、 抗 ROB01モノクロ一 ナル抗体が ROB01発現 HEK293細胞に対し、 容量依存的に CDC活性を示すこ とが明らかとなった。
また同様に肝癌細胞株である Alexander (PLC/PRF/5) 細胞に対する CDC活 性試験を試みたところ、 ROB01 発現 HEK293細胞に対する効果と同様に、 B2318C抗体、 すなわち、 抗 ROB01 モノクローナル抗体が容量依存的に CDC 活性を示すことが明らかとなった （図 1 5 ) 。 実施例 1 4
マウス骨髄由来エフェクター細胞を用いた ADCC活性の測定
14-1. マウス骨髄由来エフェクター細胞溶液の調製
SCID マウス （日本クレア ·ォス · 1 0週齢） の大腿骨から骨髄細胞を採取し、 10% FBS/RPMI 1640 培地中 5x105個/ mL となるよう懸濁し、 マウス GM- CSF(PeproTech) およびヒト IL-2 (PeproTech)をそれぞれ 10ng/mし 50ng/mL となるよう添加し、 5%炭酸ガスインキュベータ中 37°Cで 5日培養した。 培養後 スクレーパーではがして培地で 1 回洗浄し、 10% FBS/RPMI 1640 培地中 5x106/mLとなるよう懸濁し、 マウス骨髄由来エフェクター細胞溶液とした。
14-2.標的細胞の調製
ROB01強制発現 HEK293細胞は 10%FBS (ThermoTrace社製） および 500 ng/mLGeneticine(lnvitragen)を含む DMEM培地 （SIGMA社製） にて維持継代し、 Cell Dissociation Buffer (Invitrogen社)を用いてディッシュから剥離し、 96ゥェ ル U字底プレート (Falcon)の各ゥエルに 1 X 104細胞/ゥエルで分注し、 ー晚培養 した。 培養後、 5.55MBq のクロム- 51 を加え、 5%炭酸ガスインキュベータ中 37 °Cで 4時間培養し、 この細胞を培地で 3 回洗浄し、 50 ^ L の 06838
51
10%FBS/RPMI1640培地を加え標的細胞とした
14-3.クロム遊離試験 （ADCC活 f生） ' B2318C抗体 （抗 R0BO1 モノクローナル抗体) 溶液を標的細胞に 50 / Lを 添加し、 氷上で 15分反応させた後に、 マウス骨髄由来エフェクター細胞溶液
( 5 X 105細胞/ゥエル） を加え、 5%炭酸ガスインキュベータ中 37°Cで 4時間培養した （抗体の最終濃度は l g/mL, 10 g/mLに調製） 。 その後、 プレートを遠心分離し、 培養上清 100 L中の放射活性をガンマカウンターで測 定した。 下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率(％)=(八 )ズ100/(8-〇）
Aは各ゥエルにおける放射活性 (cpm)の平均値、 Bは標的細胞に 2% NP-40水溶 液 (Nonidet P-40、 Code No.252-23、 ナカライテスク株式会社)を 100 fiし、 10%FBS/RPMI培地を 50 し添加したゥエルにおける放射活性 (cpm)の平均値、 Cは標的細胞に 10%FBS/RPMI培地を 150 添加したゥエルにおける放射活 性 (cpm)の平均値を示す。 試験は三重に行い、 ADCC活性 （％) について平均値 および標準偏差を算出した。
その結果を図 1 6に示した。 B2318C抗体、 すなわち、 抗 ROB01モノクロ一 ナル抗体が ROB01発現 HEK293細胞に対し、 容量依存的に ADCC活性を示す ことが明らかとなった。
以上より、 抗 ROB01 モノクローナル抗体を用いた ROB01 発現癌細胞に対 する治療の有効性が示された。 産業上の利用性
本発明は、 癌の診断および治療、 ならびに肝炎重篤化のモニターに有用である。

Claims

請求の範囲
1. ROB01タンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法。
2. ROB01タンパク質細胞外領域を検出することを特徴とする請求項 1記載の 診断方法。
3. ROB01タンパク質を認識する坊体を用いることを特徴とする請求項 1記載 の診断方法。
4. 血液中、 血清中、 または血漿中の ROB01タンパク質を検出することを特 徴とする請求項 1記載の診断方法。
5. 細胞から分離した ROB01タンパク質を検出することを特徴とする請求項 1記載の診断方法。
6. 以下の工程：
(a) 被験者から試料を採取する工程.； '
(b) 採取された試料に含まれる ROB01タンパク質を検出する工程 を含む癌の診断方法。
7. 被験者から採取される試料が血液、 血清、 または血漿である請求項 6記載の 診断方法。 .
8. ROB01タンパク質細胞外領域を検出することを特徴とする請求項 6記載の 診断方法。 '
9. ROB01タンパク質を認識する抗体を用いることを特徴とする請求項 6記載 の診断方法。
10. ROB01タンパク質と結合する抗体を含有する、 癌を診断するためのキッ K
11. 癌が肝細胞癌である、 請求項 10記載のキット。
12. 抗体が ROB01タンパク質の細胞外領域と結合する抗体である、 請求項 10または 11に記載のキット。
13. ROB01に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
14. ROB01に結合する抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤。
15. ROB01に結合する抗体を有効成分として含有する抗癌剤。
1 6 . ROB01に結合する抗体が細胞障害活性を有する抗体である、 請求項 1 5 記載の抗癌剤。
1 7. 癌が肝細胞癌である請求項 1 5または 1 6に記載の抗癌剤。
1 8 . 異常な細胞増殖に起因する疾患を治療する方法であって、 治療を必要とす る患者に ROB01に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物を投与 することを含む方法。
1 9. 癌を治療する方法であって、 治療を必要とする患者に ROB01に結合す る抗体を有効成分として含有する医薬組成物を投与することを含む方法。
2 0 . 癌が肝細胞癌である請求項 1 9に記載の方法。
2 1 . ROB01発現細胞と ROB01に結合する抗体とを接触させることにより ROB01発現細胞に細胞障害を引き起こす方法。
2 2 . ROB01発現細胞と ROB01に結合する抗体とを接^ ίさせることにより ROB01発現細胞の増殖を抑制する方法。
2 3 . ROB01に結合する抗体が細胞障害活性を有する抗体である、 請求項 2 1 または 2 2に記載の方法。
2 4. ROB01発現細胞が癌細胞である、 請求項 2 1 - 2 3のいずれかに記載の 方法。
2 5 . ROB01に結合し、 かつ ROB01発現細胞に対して細胞障害活性を有する 几体。
2 6 . 抗 ROB01抗体を含有する肝炎重篤化をモニタ一するためのキット。
2 7 . 抗 ROB01抗体が、 ROB01を特異的に認識する抗体である、 請求項 2 6 記載のキット。
2 8 . 肝炎または肝硬変から肝癌への移行を予測するものである、 請求項 2 6ま たは 2 7記載のキット。
2 9 . 支持体に固定した第 1の抗 ROB01抗体と標識物質で標識された第 2の 抗 ROB01抗体を含む、 請求項 2 6— 2 8のいずれか 1項記載のキット。
3 0. 被検試料中の ROB01を測定することを特徴とする肝炎重篤化のモニタ —方法。
3 1 . 抗 ROB01抗体を用いて被検試料中の ROB01を測定する、 請求項 3 0
訂正された用紙 (細 (J91) 記載のモニタ一方法。
3 2. 抗 ROB01抗体が、 ROB01を特異的に認識する抗体である、 請求項 3 1 記載のモニタ一方法。
3 3. 被検試料が、 血液、 血清または血漿である、 請求項 3 0 - 3 2のいずれか 1項記載のモニタ一方法。
3 4. 肝炎または肝硬変から肝癌への移行を予測するものである、 請求項 3 0— 3 3のいずれか 1項記載のモニター方法。
3 5. 支持体に固定した第 1の钪 ROB01钪体と標識物質で標識された第 2の 抗 ROB01抗体とを用いる、 請求項 3 1— 3 4のいずれか 1項記載のモニター 方法。
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