WO2005088314A1 - Nanoparticules hybrides comprenant un coeur de ln2o3 porteuses de ligands biologiques et leur procede de preparation - Google Patents

Nanoparticules hybrides comprenant un coeur de ln2o3 porteuses de ligands biologiques et leur procede de preparation Download PDF

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Pascal Perriat
Cédric LOUIS
Christophe Marquette
Rana Bazzi
Stéphane Roux
Olivier Tillement
Gilles Ledoux
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Universite Claude Bernard Lyon I
Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.)
Institut National Des Sciences Appliquees De Lyon
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Definitions

  • the present invention relates to the technical field of probes for the detection, monitoring and quantitation in biological systems. More particularly, the subject of the invention is new hybrid probe particles, the core of which consists of a nanoparticle based on lanthanide sesquioxide, with an average diameter of less than 10 nm, on which probe molecules are immobilized, as well as their method of preparation.
  • probes associated with a marker in biological systems for the detection (recognition) or the monitoring of specific substances, called targets, is a common technique in the field of medical diagnosis and research in biology.
  • Such probes are particularly used for flow cytometry, histology, immunological tests or fluorescence microscopy, as well for the study of biological materials as of non-biological materials.
  • Usual labeling systems are, for example, radioactive isotopes of iodine, phosphorus and other elements such as the enzyme peroxidase or alkaline phosphatase, the detection of which requires a particular substrate.
  • the selective coupling between the marker and the substance to be detected is carried out by a single or an association of functional molecules. The selectivity of the binding is essential in order to unambiguously identify the target substance to be detected.
  • fluorescent organic dyes are degraded or even decomposed after a few million cycles of absorption and emission of light in the presence of acids or radicals. They also show, for most applications, insufficient stability with respect to incident light.
  • fluorescent organic dyes can exert phototoxic effects on the biological environment. Fluorescent organic dyes also have the disadvantage of emitting over a wide range of the spectrum and of being excited by radiation whose wavelength is within a very narrow window. Because of this, the simultaneous identification of several substances each marked with different fluorescent dyes, also called multiplexing, is made difficult by overlapping the emission bands, and the counting of differently marked substances is limited.
  • the effective excitation of the various dyes requires several light sources, generally lasers, or the use of a complex optical assembly comprising a series of filters when white light is used as an excitation source.
  • the prior art already offers alternatives to the use of fluorescent organic dyes.
  • metal complexes chelating ligands
  • US patents 4,637,988 and US 5,891,656 As a first alternative, it is possible to use metal complexes (chelating ligands) with a metal ion of the lanthanide class as fluorescent marker (US patents 4,637,988 and US 5,891,656).
  • the main advantage of these systems is that the excited objects have a long lifespan which can reach a few milliseconds which makes it possible to envisage experiments with temporal resolution.
  • the emission wavelength of a fluorescent semiconductor nanocrystal is imposed by its size.
  • a wide range of the spectrum can be covered, from visible light to near infrared.
  • Their use as a biological marker is described by Warren CW Chan, Shuming Nie, Science, 281, 2016-2018, 1998, and by Marcel Bruchez Jr, Mario Moronne, Peter Gin, Shimon Weiss, A. Paul Alivisatos, Science, 281, 2013 -2016, 1998.
  • the preparation of semiconductor nanocrystals with a well-defined emission wavelength, that is to say with a small dispersion in size, requires very high precision and requires perfect control of the operating conditions and the progress of the synthesis.
  • the present invention proposes to provide hybrid probe nanoparticles for biological labeling, of sufficiently small size and having improved stability, especially against attacks by the external aqueous medium.
  • the subject of the invention is therefore hybrid nanoparticles comprising: - a nanosphere, of average diameter included in the range from 2 to 9 nm, composed, at least 90% by weight, of Ln 2 O with Ln which represents a rare earth, optionally doped with a rare earth or an actinide, or a mixture of rare earths, or else a mixture of rare earth and actinide in which at least 50% of the metal ions are rare earth ions, - a coating around the nanosphere, consisting mainly of functionalized polysiloxane, and which has an average thickness in the range from 0.5 to 10 nm and, preferably, greater than 2 nm and less than or equal to 10 nm, and - at least a biological ligand grafted by covalent bond to the coating of polysiloxane.
  • the use of nanoparticles of sesquioxide Ln 2 O 3 doped with a rare earth is particularly advantageous, given the extreme fineness of their emission line and the possibility of obtaining different emission lines by doping with different cations.
  • the use of nanoparticles made luminescent by the presence of rare earth ions (excellent photostability, long lifetime of the excited state) in the nanosphere of the heart and luminescent molecules in and / or on the surface of l coating allows detections resolved in time, in particular by using a powerful tool for optical imaging such as luminescence microscopy in resolved time.
  • these nanoparticles contain lanthanides having interesting magnetic characteristics, such as gadolinium, they can be used as a contrast agent for MRI or also in therapeutic systems allowing the destruction of targeted cells following the interaction of nanoparticles. with an alternating magnetic field applied from the outside, for example causing hyperthermia.
  • these nanoparticles if they contain elements with a large neutron capture capacity coupled with a highly energetic reaction such as 157 Gd or 235 U, can be used in therapies (for example against cancer) based on capture of neutrons.
  • the colloidal suspensions of the nanoparticles defined above also form part of the invention.
  • the subject of the invention is also a process for preparing the hybrid nanoparticles as defined above, optionally in the form of colloidal suspension comprising the following successive steps: a) preparing a colloidal suspension of nanospheres, of average diameter included in the range ranging from 2 to 9 nm, composed, at least 90% by weight, of Ln O 3 with Ln which represents a rare earth, optionally doped with a rare earth or an actinide, or a mixture of rare earths, or else a mixture of rare earth and actinide in which at least 50% of the metal ions are rare earth ions, b) add to the colloidal suspension the necessary quantity of a mixture of organoalkoxysilane and of crosslinking agent to form on the surface of particles a coating, consisting mainly of polysiloxane functionalized with at least one reactive group, which has an average thickness in the range from 0.5 to 10 nm, and, preferably, greater than 2 nm and less than or equal to 10 nm, and c) chemically
  • Fig. 1 is a high resolution transmission electron microscopy image of an 8nm particle of Gd 2 O 3 : Tb, coated with a layer 3.5nm thick, obtained according to Example 4 below.
  • Fig. 2 is an EDX analysis spectrum (coupled to HRTEM), measured along the 8nm particle of Gd 2 O 3 : Tb, coated with a layer of polysiloxane
  • FIG. 3 shows the results of measuring the particle size of 8 nm after coating with a 3.5 nm polysiloxane layer (Example 4).
  • Fig. 4 presents, in a comparative manner, the results of measurement of the size of the initial particles (colloid dialysis, 5.7 min) and after coating with a layer of polysiloxane of 8.0 nm (Example 3).
  • Fig. 5 presents, in a comparative manner, the results of measurement of the size of the initial particles (colloid dialysis, 3.5 nm) and after coating with a layer of polysiloxane of 5.0 nm (Example 1).
  • Fig. 3 shows the results of measuring the particle size of 8 nm after coating with a 3.5 nm polysiloxane layer (Example 4).
  • Fig. 4 presents, in a comparative manner, the results of measurement of the size of the initial particles (colloid dialysis, 5.7 min) and after coating with a layer of
  • Fig. 6 presents, in a comparative manner, the results of measurement of the size of the initial particles (colloid dialysis, 3.5 nm) and after coating with a layer of polysiloxane functionalized with fluorescein of 8.0 nm (Example 6).
  • Fig. 7 shows the emission spectra of the colloid covered with polysiloxane functionalized with fluorescein from Example 6 excited at 230 nm as a function of the different fractions obtained during column chromatography.
  • Fig. 7 shows the emission spectra of the colloid covered with polysiloxane functionalized with fluorescein from Example 6 excited at 230 nm as a function of the different fractions obtained during column chromatography.
  • Fig. 9 represents the emission spectrum of the colloid corresponding to fraction 2 of the column chromatography presented in FIG. 7 and excited at 540nm after degradation of the fluorescein.
  • Fig. 10 presents, in a comparative manner, the luminescence measurement between the particles of the initial colloid and dialysis of 5.7 nm and those coated with a layer of polysiloxane of 8.0 nm (Example 3).
  • Fig. 11 presents, in a comparative manner, the luminescence measurement between the particles of the initial colloid and dialysis of 3.5 nm and those coated with a layer of polysiloxane of 5.0 nm (Example 1).
  • Fig. 12 presents, in a comparative manner, the luminescence measurement between the particles of the initial colloid and dialysis of 3.5 nm and those coated with a layer of polysiloxane of 8.0 nm (Example 2).
  • Fig. 11 presents, in a comparative manner, the luminescence measurement between the particles of the initial colloid and dialysis of 3.5 nm and those coated with a layer of polysiloxane of 8.0 nm (Example 2).
  • FIG. 13 shows the emission spectra of the colloid covered with polysiloxane of Example 5 excited at 230 nm as a function of the dialysis thereof in ethanol and of its dispersion in water acidified with 0.2 M HCl.
  • Fig. 14 presents the excitation spectrum of the particles of Gd 2 O 3 : Tb 3+ (5%) (diameter of 3.5 nm) and covered with a layer of polysiloxane of 5.0 nm (example
  • the rare earths include scandium and yttrium and the series of lanthanides which are Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu. Within the meaning of invention, by rare earth is preferably understood an element chosen from ryttrium and the series of lanthanides. Actinides are Ac, Th, Pa, U, Np, Pu, Am, Cm, Bk, Cf, Es, Fm, Md, No and Lw.
  • the mean diameter or median diameter of nanospheres is defined by the diameter below which 50% of the mass of the nanospheres is found and is determined by the laser scattering technique (photon correlation spectroscopy).
  • a sesquioxide Ln 2 O 3 is said to be doped with a rare earth or an actinide, if the latter is present in an amount of at most 25% of the metal cations. Beyond that, it will be a question of mixing.
  • the present invention relates to a probe for biological applications essentially comprising a core nanosphere surrounded by a coating, also called a crown, allowing grafting by covalent bond of at least one biological ligand and optionally other organic molecules.
  • the nanosphere is an essentially spherical luminescent inorganic core of nanometric size. More precisely, this spherical core consists of Ln 2 O where Ln represents a pure rare earth, or doped with a rare earth, an actinide or a combination of the latter, a mixture of rare earths, or even a mixture of rare earth with an actinide, in which at least 50% of the metal cations are rare earth cations.
  • This core nanosphere has an average diameter in the range of 2 to 9 nm. At least 90% of the weight of the nanosphere is made up of Ln O 3 defined above, the rest possibly being made up in particular of the corresponding hydroxide.
  • the coating is an intermediate layer surrounding the nanospheres, to which the biological ligands are linked by covalent bond.
  • the coating consists mainly of functionalized polysiloxane and has an average thickness in the range from 0.5 to 10 nm, and preferably greater than 2 nm.
  • the function of this coating is, without this list being limiting, at least threefold: it must ensure the protection (sealing) of the core with respect to the external environment; it must serve as grafting sites for the biological ligands attached to it; it must increase the optical performance of the mineral heart by transferring energy from the absorbing crown in the UV to the re-emitting heart in the visible.
  • the nature of the nanosphere constituting the spherical core of the nanoparticles according to the invention will be chosen, which is preferably made up at least 80% by weight, of rare earth sesquioxide possibly doped.
  • this nanosphere is doped or even codoped, that is to say doped with at least two elements of different nature.
  • the nanosphere consists, at least 80% by weight and, preferably, at least 90% by weight of Y 2 O 3 or Gd 2 O 3 , Gd 2 O being preferred.
  • the nanosphere When conventional luminescence is sought, the nanosphere is doped with a lanthanide of the Eu, Tb, Er, Nd, Yb, Tm type representing from 0.1 to 25% of the metal cations of the nanosphere.
  • the nanosphere When luminescence in the infrared is sought, the nanosphere is doped with a lanthanide of the Nd or Yb type.
  • the nanosphere When an antistoke luminescence is sought, the nanosphere is doped with a lanthanide of Er type.
  • the nanosphere is doped with at least two different lanthanides representing from 0.1 to 25% of the metal cations of the nanosphere, at least one of these lanthanides being chosen from Eu and Tb.
  • the nanosphere to facilitate detection, and in particular for applications in the field of magnetic resonance imaging (MRI) or applications in therapy, it is advantageous for the nanosphere to exhibit, in addition to its luminescence properties, magnetic properties.
  • the nanosphere contains rare earth cations having a magnetic behavior chosen from Gd, Nd, representing at least 10% of all the metal cations present in the heart, if an application in medical imaging is envisaged, and at least 50%, if an application in hyperthermia is envisaged.
  • from 0.01% to 50%, and preferably from 0.1 to 10% of the metal cations of the nanosphere are chosen actinide cations among Ac, Th, Pa, Np, U, Pu.
  • the nanosphere with such radionuclides finds particular application in therapy linked to nuclear reactions.
  • Another advantageous variant relates to hybrid nanoparticles of which at least 0.1% of the metal cations of the nanosphere are radioactive isotopes with a half-life duration of less than 1000 years, or of which at least 1%, preferably at least 5%, metal cations of the nanosphere are isotopes with a large neutron capture capacity coupled with a strong reaction energy (for example 157 Gd, 235 U).
  • a strong reaction energy for example 157 Gd, 235 U.
  • the nanosphere is made up, at least 90% by weight, of lanthanide sesquioxide possibly doped.
  • Hybrid nanoparticles according to the invention are particularly preferred.
  • Gd 3+ is in fact a cation having both a strong paramagnetism and which can serve as a matrix for the luminescent cations Eu and Tb.
  • the nanospheres of rare earth sesquioxide, and in particular of gadolinium sesquioxide, are sensitive to hydrolysis in an aqueous medium. To avoid the conversion of sesquioxide into hydroxide, the latter is coated with a protective layer mainly consisting of functionalized polysiloxane.
  • the latter must be thick enough to ensure this protection: its average thickness is in the range from 0.5 to 10 nm, and preferably is greater than 1 nm.
  • the coating layer advantageously represents at least 20% of the total volume of the nanoparticle and preferably from 25 to 75% of the total volume of the nanoparticle.
  • the thickness is measured by laser granulometry (PCS technique). It is also possible to find, for an isolated nanoparticle, the diameter of the nanosphere and the thickness of the layer, by transmission electron microscopy.
  • this coating protects the luminescence properties of the oxide core and / or allows an energy transfer relative to the spherical core, that is to say that the excitation UN is absorbed by the polysiloxane ring and transferred to the spherical heart which increases its luminescence.
  • This function is particularly assured, if 5 to 75%, preferably 30 to 50% of the silicon atoms of the polysiloxane layer are each linked to four other silicon atoms by oxygen bridges, which therefore constitutes a preferred variant of the invention. Consequently, according to an advantageous variant of the invention, 25 to 95% and preferably 50 to 70% of the silicon atoms of the coating of functionalized polysiloxane are covalently bonded to a carbon atom and are therefore functionalized.
  • this layer of functionalized polysiloxane can be chosen as a function of the preferred effect which it is desired to attribute to it.
  • a layer having a density in the range from 1.6 to 2.4 and, preferably, in the range from 1.8 to 2.1 is preferred to further promote the protection of the spherical heart against hydroxylation and keep its luminescence.
  • a coating with a density of less than 2 is preferred for MRI or hyperthermia applications.
  • This layer of functionalized polysiloxane also allows grafting by covalent bond of at least one biological ligand and optionally other organic or polymer molecules.
  • luminescent organic molecules in particular chosen from rhodamine or fluorescein derivatives, are grafted to the surface and / or within the coating, in addition to the biological ligand (s), which allows detection resolved in time.
  • the lifetime of the excited state is a few nanoseconds for the luminescent organic molecules and of the order of a microsecond for the nanoparticles of lanthanide sesquioxide.
  • 1 to 1000 and preferably 1 to 100 molecules of biological ligand are grafted to the layer of polysiloxane functionalized by covalent bond.
  • less than 10% by weight of these nanoparticles comprise more than two molecules of biological ligand grafted on the intermediate layer.
  • biological ligand is meant a compound which has at least one recognition site enabling it to react with a target molecule of biological interest.
  • the grafted biological ligands are, for example, derived from nucleotides, sugars, vitamins, hormones, biotin, streptavidin, or any other organic molecule of interest for biological vectorization. It is also possible that luminescent molecules or complexing molecules, other than the biological ligand (s), are grafted onto the layer of functionalized polysiloxane.
  • Polar or charged molecules of the organophosphonate type, quaternary amines can also be grafted onto the intermediate layer.
  • Another possibility is to graft, onto the polysiloxane layer, water-soluble polymer molecules of molecular mass less than 5000 g / mol and preferably less than 1000, for example, such as polyethylene glycol or dextran.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of hybrid nanoparticles as defined above, optionally in the form of a colloidal suspension. This process comprises different successive stages detailed below.
  • the first step of the process lies in obtaining a large quantity of crystalline nanospheres of average diameter between 2 and 9 nm, obtained with low polydispersity and easily redispersible, that is to say without the formation of agglomerate.
  • the process according to the invention involves the direct preparation of an isodisperse colloidal dispersion.
  • isodisperse dispersion is meant a dispersion whose size distribution measured by photon correlation spectroscopy is very tight, that is to say, for example, that more than 90% of the particles have a diameter comprised between the mean diameter of the more or less 20% dispersion of d 50 .
  • the tighter the distribution in diameter the more the system is called isodisperse or monodisperse.
  • nanoparticles are prepared according to the polyol method.
  • This “polyol” method consists of direct precipitation of a solid within a polyalcohol brought to a temperature generally between 130 ° C. and 250 ° C.
  • a metal precursor is dissolved beforehand in the polyol (for example diethylene glycol), then after optional addition of a reagent, the solution is brought to a temperature above 150 ° C.
  • the polyol acts as a stabilizer, limits the growth of particles and minimizes the agglomeration of powders.
  • various submicron oxide powders have already been synthesized, one can thus quote CeO 2 , LaPO 4 doped Ce 3+ (C.
  • the nanospheres used in the present invention are, for example, obtained according to the “polyol” method described in Journal of Luminescence, 102-103 (2003) 445-450, and Journal of Colloid and Interface Science, doi: 10.1016 / j.jcis .2003.10.031. Without this list being exhaustive, the precursors used can be chlorides, nitrates or acetates. Concentrations higher than g / 1 can thus be obtained.
  • a colloidal suspension is obtained containing between 100 mg and 100 g of nanospheres per liter of solvent.
  • sesquioxide nanospheres are, for example, carried out at a temperature below 200 ° C. in a polar solvent such as a polyol, of the diethylene glycol (DEG) type, the high solvating power of which allows particle size control.
  • a polar solvent such as a polyol, of the diethylene glycol (DEG) type
  • DEG diethylene glycol
  • Precursors of the various metallic sesquioxides which will constitute the nanospheres for example, rare earth chlorides TRC1 3 (TR: Gd, Y) and lanthanide chlorides Ln'Cl 3 (Ln ': Eu, Tb, Er, Nd, Yb, Tm) or actinide nitrates (U) are dispersed in diethylene glycol.
  • the overall concentration of metal ions is advantageously between 0.1 and 0.5 M and the relative amount of rare earth chlorides TRC1 (TR: Gd, Y) and lanthanide chlorides Ln'Cl 3 (Ln ': Eu, Tb, Er, Nd, Yb, Tm) or actinide nitrates (U) depends on the doping rate or the nature of the desired mixture.
  • an aqueous sodium hydroxide solution advantageously 1 ml, is added and the mixture is heated in a silicone oil bath at 140 ° C for one hour. After complete dissolution of the compounds present, the solution is brought to 180 ° C for 4 hours with vigorous stirring.
  • the result is a colloidal solution, stable for several months, of nanospheres dispersed in the DEG.
  • the nanometric size particles are in the form of a solid solution consisting of a single phase.
  • the ion concentration and hydrolysis rate ratio of the amount of water added to the amount of metal ions
  • the concentration of OH " must be as low as possible to avoid the precipitation of hydroxides.
  • a colloidal suspension containing between 100 mg and 100 g of nanospheres per liter of solvent is prepared by dissolving rare earth precursors and / or actinides, in a polar solvent, in particular a polyol of the ethylene glycol type and heating to a temperature between 130 and 250 ° C., in the presence of the quantity of water at least necessary for the formation of the desired sesquioxide and optionally a base such as NaOH at a concentration between 0.01 and 1 mol / 1 of solvent.
  • the colloidal suspension of nanospheres obtained can, optionally, be purified and / or concentrated, by eliminating the residual soluble salts, a part of the polyol, for example by evaporation under reduced pressure, or by changing the solvent, for example by chromatography or dialysis, and control the amount of water present in the solution.
  • the Ln 2 O nanospheres are then coated with a layer of molecules capable of establishing strong and lasting interactions both with the surface of sesquioxides and with organic molecules (fluorophores, dispersants ... ) and / or biological ligands which will be attached thereto.
  • this layer provides protection for the nanospheres when they are dispersed in an aqueous medium.
  • network formers and not modifiers (which do not make it possible to form a crosslinked layer around the nanosphere) are used.
  • Network formers are compounds which, in addition to the link (s) they establish with the surface of its rare earth sesquioxide, are capable of reacting with one another (by condensation reaction between the nearest neighbors) to form a real imprisoning network. the nanosphere.
  • R x Si (OR ') is mixed with a crosslinking agent such as tetraethylorthosilicate (TEOS).
  • TEOS tetraethylorthosilicate
  • the layer of polysiloxane, also called coating or crown, can be, in particular, obtained by hydrolysis - condensation of a mixture of organotrialkoxysilane selected from Taminopropyltriéthoxysilane (APTES), glycidyloxypropyltriethoxysilane (GPTES), mercaptopropyltriethoxysilane (MPTES) and isocyanatopropyltriethoxysilane (IPTES)) with a crosslinking agent, such as TEOS in the presence of nanospheres sesquioxide Ln 2 O 3 as previously obtained.
  • APTES Taminopropyltriéthoxysilane
  • GPTES glycidyloxypropyltriethoxysilane
  • MPTES
  • the Si / C ratio is controlled by the amount of crosslinking agent, most often TEOS, introduced.
  • the amount of organoalkoxysilane / crosslinking agent added depends on the number of nanospheres dispersed in solution, their size (and therefore their surface) and the area occupied by an adsorbed molecule.
  • the presence of a trimethylamine type base is preferable, preferably between 0.01 and 0.1 mol / l.
  • organotrialcoxysilane makes it possible to introduce into the crown reactive groups which will allow the attachment of active molecules (biological ligand, fluorophores).
  • organoalkoxysilane type precursors of the polysiloxane layer carry reactive groups such as carboxylic, amino, aldehyde or epoxide groups.
  • the hydrolysis-condensation of these precursors provides a layer of functionalized polysiloxane capable of reacting with a biological ligand or any other organic molecule or polymer to be grafted.
  • TEOS ensures the crosslinking of the polysiloxane formed, in which the quantity of silicon atoms linked only to oxygen atoms (crosslinking nodes), that is to say which come only from TEOS, is between 5 and 75%, preferably between 30 and 50%.
  • the non-adsorbed molecules and the secondary products are, generally, extracted from the colloidal solution by dialysis against ethanol, water or an equivolumic ethanol / water mixture.
  • a process for forming the polysiloxane coating advantageously taking place in four phases.
  • the first consists in adding to 5 ml of Ln 2 O 3 nanospheres dispersed in a DEG solution containing nAPTES (i) mol of APTES such as 4 ⁇ 100 x nAPTES (i) / (APTES (i + nAPTEs (2) + n ⁇ E ⁇ s) ⁇ 16.
  • the coating of functionalized polysiloxane can allow the covalent grafting of luminescent organic molecules, in particular derivatives of fluorescein and rhodamine.
  • Functionalization with these fluorophores can be carried out in at least two different ways. The first consists in modifying organoalkoxysilane molecules with these fluorophores before the hydrolysis reaction.
  • organoalkoxysilane in particular of APTES introduced during the first or the second phase mentioned above, are coupled, beforehand, to fluorescein isothiocyanate (FTIC) by reaction between the function amine of APTES and the isothiocyanate function of FTIC.
  • FTIC fluorescein isothiocyanate
  • the polysiloxane precursors thus modified are then added to a mixture of organoalkoxysilane and TEOS to form the crown.
  • the second method consists in grafting the fluorophores after formation of the polysiloxane layer by condensation between the reactive groups carried by the fluorophores and those present in the polysiloxane layer.
  • the biological ligands must be accessible for subsequent probe / target coupling reactions and are, for their part, chemically grafted onto the polysiloxane layer, by conventional coupling with reactive groups present, possibly preceded by an activation step. .
  • the reactions ensuring coupling are known and described, for example, in "Bioconjugatre Techniques", G T. Hermanson, Académie Press, 1996 or in "Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. A Practical Guide to Technology for Quantitative Real-Time Analysis ”, Second Edition, WT Mason, ed., Académie Press, 1999.
  • coupling is carried out by adding an aqueous solution of biological ligands, the quantity of which is at least greater than the number of grafting sites (corresponding to the reactive groups) on the coating.
  • biological ligands the quantity of which is at least greater than the number of grafting sites (corresponding to the reactive groups) on the coating.
  • biomolecules carrying at least one -COOH function can be grafted.
  • the excess secondary products are removed by dialysis or by column chromatography. The latter technique is used only when the nanoparticles are functionalized with derivatives of fluorescein.
  • the grafting of the biological ligands is preferably carried out last.
  • the nanoparticles according to the invention find different applications. Mention may in particular be made of their use for the detection of biomolecules (biochips), the targeting of biological substrates (MRI imaging), for the destruction of cells or solid tumors in therapy (hyperthermia, neutron capture).
  • biomolecules biochips
  • MRI imaging magnetic resonance imaging
  • hyperthermia, neutron capture for the destruction of cells or solid tumors in therapy.
  • the examples below are given purely by way of illustration and are not intended to be limiting.
  • Example 1 A colloid of Gd 2 O 3 doped with 5% of Tb 3+ is prepared by dissolving an amount of 50 g.! "1 of gadolinium and terbium chloride salts in a volume of 20 ml of diethylene glycol.
  • the final particle size confirmed by HRTEM and measured by laser granulometry, is 3.5 nm.
  • the colloid is dialyzed for 24 hrs, hot (40 ° C.), with stirring in diethylene glycol, the volume ratio of clean diethylene glycol / volume of colloid to be dialyzed is 20.
  • a layer of functionalized polysiloxane with a thickness of 5.0 nm is synthesized. sol-gel.
  • Example 2 A colloid of Gd 2 O 3 doped with 5% of Tb 3+ is prepared under the same conditions as those of Example 1. Around these particles, a layer of functionalized polysiloxane with a thickness of 8.0 nm is synthesized by the sol-gel route. In a solution containing
  • Example 3 A colloid of Gd 2 O doped with 5% Tb 3+ is prepared under the same conditions as those of Example 1, corresponding to a size of 3.5 nm. Particles with a size of 5.7 nm and of the same composition were obtained by adding, to the colloid obtained previously, an adequate amount of salts of gadolinium and terbium chlorides. Around these particles, a layer of functionalized polysiloxane with a thickness of 8 nm is synthesized by the sol-gel route. In a solution containing 5.0 ml of dialysis colloid (S ⁇ ⁇ .lO ⁇ particles.l "1 ), dissolve 58.1 g.! " 1 of APTS, 36.4 g.! "1 of TEOS and 28.4 ml per liter of an aqueous solution of 0.1 M of triethylamine. The covering reaction by sol-gel route was carried out under the same conditions as those of Example 1.
  • Example 4 A colloid of Gd 2 O 3 doped with 5% Tb is prepared under the same conditions as those of Example 3, corresponding to a size of 5.7 nm. Particles with a size of 8 nm and of the same composition were obtained by adding, in the colloid obtained previously, an adequate amount of salts of gadolinium and terbium chlorides. Around these particles, a layer of functionalized polysiloxane with a thickness of 3.5 nm is synthesized by the sol-gel route. In a solution containing 5.0 ml of dialysis colloid (S ⁇ S.lO ⁇ particles.l "1 ), dissolve 20.6 g.! " 1 of APTS, 13.0g.! "1 of TEOS and 10 ml per liter of an aqueous solution of 0.1 M of triethylamine. The covering reaction by sol-gel route was carried out under the same conditions as those of Example 1.
  • Example 5 A colloid of Gd 2 O 3 doped with 5% Tb 3+ is prepared under the same conditions as those of Example 1. Around these particles, a layer of functionalized polysiloxane with a thickness of 5.0 nm is made by sol-gel. In a solution containing 2.5 ml of colloid dialysis (4.53.10 19 particles.l "1 ) and 2.5 ml of clean diethylene glycol, dissolve 28.4 g.! " 1 of APTS, 17.6 g.! "1 of TEOS and 13.2 ml per liter of an 0.1M aqueous solution of triethylamine. The covering reaction by sol-gel route was carried out under the same conditions as those of Example 1.
  • EXAMPLE 6 A colloid of Gd 2 O 3 doped with 5% Tb 3+ is prepared under the same conditions as those of Example 1. Around these particles, a layer of functionalized polysiloxane with a thickness of 8 nm is developed by sol-gel. In a solution containing 2.5 ml of dialysis colloid (2.26.10 19 particles.l " ) and 2.5 ml of clean diethylene glycol, dissolve 9.4 g.! " 1 of APTS, 6.4 g.! "1 of TEOS and 4.4 ml per liter of an aqueous solution of 0.1 M of triethylamine. Six hours before the addition of the mass m of APTS, this is mixed with magnetic stirring, to 1.4 g !
  • Example 7 Grafting of the oligonucleotide To a solution of 100 ⁇ M of oligoni ⁇ ucleotides d (T) 22 terminated by a -COOH function, an aqueous solution of 0.2 M EDC and 0.2 M NHS is added.
  • Example 8 A colloid of Gd 2 O 3 doped with 1% of uranium is prepared by dissolving an amount of 50 g.! "1 of gadolinium chloride salts and uranium nitrate in a volume of 20 ml of diethylene glycol. The final size of the nanospheres, confirmed by HRTEM and measured by laser granulometry, is 3.5 nm. The colloid is dialyzed for 24 h , hot (40 ° C.), with stirring in diethylene glycol The volume ratio of clean diethylene glycol / volume of colloid to be dialyzed is 20.
  • a layer of functionalized polysiloxane with a thickness of 5, 0nm is synthesized by the sol-gel route, in a solution containing 5.0 ml of dialysis colloid (4.53.10 ⁇ particles.! “1 ), dissolution of 28.4 g.! “1 of aminopropyltriethoxysilane (APTS), 1.6 g! “ 1 of tetraethyl orthosilicate (TEOS) and
  • Example 9 A colloid of Gd 2 0 3 doped with 5% in Tb 3+ and 5% in Eu 3+ in moles is prepared by dissolving an amount of 50 g.l -1 of salts of gadolinium chloride, of terbium and europium in a volume of 50 ml of diethylene glycol (2.260 g of GdCl 3 , 6H 2 O, 0.1273 g of EuCl 3 , 6H 2 0 and 0.1250 g of TbCl 3 , 6H 2 O). After adding 3 ml of an aqueous 2N NaOH solution at 70 ° C., heating at 140 ° C.
  • the colloid is dialyzed for 24 hours, hot (40 ° C), with stirring in diethylene glycol.
  • the volume ratio of clean diethylene glycol / volume of colloid to be dialyzed is 20.
  • the coating reaction by sol-gel route is carried out under the same conditions as those of Example 1. In order to test the possibility of detection resolved by time (and incidentally facilitate the handling of these nanoparticles), 10% of the aminopropyltrialcoxysilane are functionalized with an organic dye (fluorescein) (Fig. 7).
  • the Tb doped Gd 2 O 3 nanospheres coated with a layer of polysiloxane, 10% of the amino functions of which are linked to a fluorescein derivative can be used as a marker for the detection of biological ligands (and in particular of oligonucleotides). Indeed, due to the luminescence properties of terbium and fluorescein, these nanoparticles, when they are functionalized by a probe molecule, make it possible to selectively mark biological molecules due to specific interaction with the probes grafted onto the nanoparticles and therefore to detect them.
  • the fluorescein emits a light signal making it possible to identify the places on the support where the nanoparticle is immobilized (Fig. 8).
  • the sequence of the oligonucleotide grafted onto the nanoparticle can then be deduced.
  • the emission of Tb 3+ ions is observed after destruction of the fluorescein by laser irradiation (Fig. 9).
  • the network of functionalized polysiloxane which coats the nanosphere with sesquioxide allows, in addition to the grafting of active molecules, to amplify the luminescence signal of the dopant present in the heart of sesquioxide.
  • the intensity of the luminescence of the Tb 3+ ions is much greater when the nanosphere of Ln 2 O 3 is coated with a layer of polysiloxane compared to uncoated nanospheres (Fig. 10-12).
  • the polysiloxane layer provides effective protection against an aqueous solution of dilute hydrochloric acid.
  • the spectra recorded from two samples containing the same amount of identical nanoparticles, but some dispersed in ethanol and others in 0.2 M HCl show that the nanospheres coated with the Functionalized polysiloxane are insensitive to the presence of water (unlike naked nanospheres) (Fig. 13).

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Abstract

L'invention concerne des nanoparticules hybrides comprenant: - une nanosphère, de diamètre moyen compris dans la gamme allant de 2 à 9 nm, composée, à au moins 90% en poids, de Ln2O3 avec Ln qui représente une terre rare, éventuellement dopée avec une terre rare ou un actinide, ou un mélange de terres rares, ou bien un mélange de terre rare et d'actinide dans lequel au moins 50% des ions métalliques sont des ions terre rare, - un enrobage autour de la nanosphère, constitué majoritairement de polysiloxane fonctionnalisé, et qui présente une épaisseur moyenne comprise dans la gamme allant de 0,5 à 10 nm et, de préférence, supérieure à 2 nm et inférieure ou égale à 10 nm, et - au moins un ligand biologique greffé par liaison covalente à l'enrobage de polysiloxane, ainsi que leur procédé de préparation.

Description

NANOPARTICULES HYBRIDES COMPRENANT UN CŒUR DE Ln2O3 PORTEUSES DE LIGANDS BIOLOGIQUES ET LEUR PROCEDE DE PREPARATION La présente invention concerne le domaine technique des sondes pour la détection, le suivi et la quantification dans les systèmes biologiques. Plus particulièrement, l'invention a pour objet de nouvelles particules sondes hybrides dont le cœur est constitué par une nanoparticule à base de sesquioxyde de lanthanide, de diamètre moyen inférieur à 10 nm, sur laquelle sont immobilisées des molécules sondes, ainsi que leur procédé de préparation. L'emploi de sondes associées à un marqueur, dans les systèmes biologiques pour la détection (reconnaissance) ou le suivi de substances spécifiques, appelées cibles, est une technique usuelle dans le domaine du diagnostic médical et de la recherche en biologie. De telles sondes sont particulièrement utilisées pour la cytométrie de flux, l'histologie, les tests immunologiques ou la microscopie de fluorescence, aussi bien pour l'étude de matériaux biologiques que de matériaux non biologiques. Des systèmes de marquage usuels sont, par exemple, des isotopes radioactifs de l'iode, du phosphore et d'autres éléments comme l'enzyme peroxydase ou la phosphatase alcaline dont la détection nécessite un substrat particulier. Dans la plupart des cas, le couplage sélectif entre le marqueur et la substance à détecter est effectué par une seule ou une association de molécules fonctionnelles. La sélectivité de la liaison est essentielle afin d'identifier sans ambiguïté la substance cible à détecter. Les réactions assurant le couplage sont connues et décrites par exemple dans « Bioconjugate Techniques », G. T. Hermanson, Académie Press, 1996 ou dans « Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. A Practical Guide to Technology for Quantitative Real-Time Analysis », Second Edition, W. T. Mason, éd., Académie Press, 1999. Les colorants organiques fluorescents sont très utilisés pour le marquage. Il s'agit de la fluorescéine, du Texas Red ou de Cy5, qui sont sélectivement liés à une substance biologique ou organique déterminée jouant le rôle de sonde. Après excitation de la sonde marquée par une source externe, le plus souvent électromagnétique, la présence des substances biologiques ou organiques cibles liées à la sonde est mise en évidence par l'émission de fluorescence de la part de cette dernière. Un des principaux inconvénients des colorants organiques fluorescents, à la base des techniques actuelles, réside dans leur faible stabilité chimique : ils sont dégradés, voire décomposés après quelques millions de cycles d'absorption et d'émission de lumière en présence d'acides ou de radicaux. Ils montrent également, pour la plupart des applications, une stabilité insuffisante vis-à-vis de la lumière incidente. De plus, les colorants organiques fluorescents peuvent exercer des effets phototoxiques pour l'environnement biologique. Les colorants organiques fluorescents présentent également l'inconvénient d'émettre sur une large gamme du spectre et d'être excités par un rayonnement dont la longueur d'onde se situe dans une fenêtre très étroite. A cause de cela, l'identification simultanée de plusieurs substances marquées chacune par des colorants fluorescents différents, appelée également multiplexing, est rendue difficile par le recouvrement des bandes d'émission, et le comptage des substances marquées différemment est limité. D'autre part, l'excitation efficace des différents colorants nécessite plusieurs sources de lumière, en général des lasers, ou l'utilisation d'un montage optique complexe comprenant une série de filtres lorsque la lumière blanche est utilisée comme source excitatrice. L'art antérieur propose déjà des alternatives à l'utilisation de colorants organiques fluorescents. Comme première alternative, il est possible d'utiliser des complexes métalliques (ligands chélatants) avec un ion métallique de la classe des lanthanides comme marqueur fluorescent (brevets US 4,637,988 et US 5,891,656). Le principal avantage de ces systèmes est que les objets excités présentent une longue durée de vie qui peut atteindre quelques millisecondes ce qui permet d'envisager des expériences avec résolution temporelle. Cependant l'utilisation de ces chélates de lanthanide est gênée par la très forte dilution de la luminescence (quenching) en milieu aqueux. Cela restreint considérablement le domaine d'application des chélates car les milieux biologiques sont généralement très riches en eau. Des tentatives de séparer la substance à détecter du milieu biologique pour la placer dans un environnement anhydre ont donc été réalisées (I. Hemmilâ, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 48,1988, pages 389-400) ; elles ne rendent cependant pas possibles les examens immunohistochimiques car l'information concernant l'endroit du marquage est perdue au cours de l'étape de séparation. Dans les brevets US 4,283,382 et US 4,259,313, il est indiqué que des particules de polymère (latex) dans lesquelles des chélates de lanthanides sont emprisonnés peuvent être employées comme marqueurs fluorescents. Une autre alternative proposée par l'art antérieur consiste à marquer la sonde destinée à se lier avec la cible à détecter, avec des particules intrinsèquement luminescentes. En particulier, des nanoparticules de matériau semi-conducteur ont donné lieu à d'intenses recherches. Le brevet US 5,990,479, et les demandes de brevet internationales publiées sous le numéro WO 00/17642 et WO 00/29617 montrent que les nanocristaux semiconducteurs fluorescents, qui appartiennent à la classe des éléments II-NI ou III-N et ceux qui , sous certaines conditions, sont composés des éléments du 4eme groupe principal du tableau périodique, peuvent être utilisés comme marqueur fluorescent pour les systèmes biologiques. En raison du phénomène connu sous le vocable « quantum size effect », la longueur d'onde d'émission d'un nanocristal semiconducteur fluorescent est imposée par sa taille. Ainsi, en faisant varier la taille de ces nanocristaux, une large gamme du spectre peut être couverte, de la lumière visible au proche infra-rouge. Leur utilisation comme marqueur biologique est décrite par Warren C.W. Chan, Shuming Nie, Science, 281, 2016-2018, 1998, et par Marcel Bruchez Jr, Mario Moronne, Peter Gin, Shimon Weiss, A. Paul Alivisatos, Science, 281, 2013-2016, 1998. La préparation de nanocristaux semiconducteurs avec une longueur d'onde d'émission bien définie, c'est-à-dire avec une faible dispersion en taille, exige une très grande précision et nécessite une parfaite maîtrise des conditions opératoires et du déroulement de la synthèse. Ils sont, par conséquent, très difficiles à produire. La palette étendue de couleurs qu'offrent ces cristaux semiconducteurs résulte d'une variation de taille de l'ordre de quelques Angstrôm (c'est-à-dire quelques couches atomiques). Les synthèses en solution permettent rarement d'atteindre un tel degré de précision. De plus, la recombinaison de paires électron-trou observée à la surface des nanocristaux limite le rendement quantique à une faible valeur. Pour contourner ce problème, une structure cœur / coquille (« core / shell ») a été proposée : il s'agit d'enrober individuellement les nanocristaux semiconducteurs fluorescents par une couche de matériau semi-conducteur avec un plus large gap (ZnS, CdS). De plus, le marquage sélectif de biomolécules par des nanocristaux semi-conducteurs fluorescents nécessite la formation d'une couche de polysiloxane fonctionnalisé par des groupes aminés (époxy et acide carboxylique). Ces derniers constitueront des points d'ancrage pour les biomolécules. La préparation de ces nanocristaux demande, donc, au moins trois étapes de synthèse dont les deux premières sont très délicates et est donc difficilement industrialisable. Le marquage par des nanoparticules d'oxyde rendues luminescentes grâce au dopage par des ions luminescents (terre rare) n'est pas, malgré des résultats prometteurs, encore très répandu. Son principal inconvénient réside dans le faible rendement quantique qui nécessite l'utilisation d'un laser pour exciter les ions luminescents présents dans la matrice cristalline. D'autre part, les propriétés de luminescence sont très nettement altérées, lorsque ces particules sont utilisées directement en milieu aqueux. Notamment, on pourra citer la demande de brevet publiée sous le numéro
US 2003/0180780 qui décrit des nanoparticules d'oxyde métallique enrobé de silane pouvant servir d'agent de marquage pour des molécules d'intérêt biologique. Le seul exemple donné concerne des nanoparticules de Eu2O3 enrobé d'une très fine couche de silane obtenue à partir de 3-aminopropyltriméthoxysilane (APTMS), ces nanoparticules présentant un diamètre moyen compris entre 100 et 200nm. Pour les applications biologiques, il est intéressant d'utiliser des nanoparticules de taille plus petite dont les suspensions colloïdales présentent une meilleure stabilité et dont les composants présentent une plus grande " furtivité " ou " molécularité ". L'utilisation, en tant que marqueur, de nanoparticules de taille plus petite permet un meilleur ciblage des fonctions biologiques. Dans ce contexte, la présente invention se propose de fournir des nanoparticules sondes hybrides pour le marquage biologique, de taille suffisamment petite et présentant une stabilité améliorée, face aux agressions du milieu aqueux extérieur notamment. L'invention a donc pour objet des nanoparticules hybrides comprenant : - une nanosphère, de diamètre moyen compris dans la gamme allant de 2 à 9 nm, composée, à au moins 90% en poids, de Ln2O avec Ln qui représente une terre rare, éventuellement dopée avec une terre rare ou un actinide, ou un mélange de terres rares, ou bien im mélange de terre rare et d'actinide dans lequel au moins 50% des ions métalliques sont des ions terre rare, - un enrobage autour de la nanosphère, constitué majoritairement de polysiloxane fonctionnalisé, et qui présente une épaisseur moyenne comprise dans la gamme allant de 0,5 à 10 nm et, de préférence, supérieure à 2 nm et inférieure ou égale à 10 nm, et - au moins un ligand biologique greffé par liaison covalente à l'enrobage de polysiloxane. En particulier, l'utilisation de nanoparticules de sesquioxyde Ln2O3 dopées avec une terre rare est particulièrement avantageuse, étant donnée l'extrême finesse de leur raie d'émission et la possibilité d'obtenir des raies d'émission différentes en dopant avec des cations différents. De plus, l'utilisation de nanoparticules rendues luminescentes par la présence d'ions terres rares (excellente photostabilité, long temps de vie de l'état excité) dans la nanosphère de cœur et de molécules luminescentes dans et/ou à la surface de l'enrobage permet des détections résolues en temps, en particulier en utilisant un outil performant pour l'imagerie optique comme la microscopie de luminescence en temps résolu. Par ailleurs, si ces nanoparticules contiennent des lanthanides présentant des caractéristiques magnétiques intéressantes, comme le gadolinium, elles peuvent être utilisées comme agent de contraste pour l'IRM ou également dans des systèmes thérapeutiques permettant la destruction des cellules ciblées suite à l'interaction des nanoparticules avec un champs magnétique alternatif appliqué par l'extérieur, engendrant par exemple une hyperthermie. De plus, ces nanoparticules, si elles contiennent des éléments présentant une grande capacité de capture de neutrons couplée avec une réaction fortement énergétique comme le 157Gd ou 235U, peuvent être utilisées dans des thérapies (par exemple contre le cancer) basées sur la capture de neutrons. Les suspensions colloïdales des nanoparticules ci-dessus définies font également partie de l'invention. L'invention a également pour objet un procédé de préparation des nanoparticules hybrides telles que définies ci-dessus, éventuellement sous la forme de suspension colloïdale comprenant les étapes successives suivantes : a) préparer une suspension colloïdale de nanosphères, de diamètre moyen compris dans la gamme allant de 2 à 9 nm, composées, à au moins 90% en poids, de Ln O3 avec Ln qui représente une terre rare, éventuellement dopée avec une terre rare ou un actinide, ou un mélange de terres rares, ou bien un mélange de terre rare et d'actinide dans lequel au moins 50% des ions métalliques sont des ions terre rare, b) ajouter à la suspension colloïdale la quantité nécessaire d'un mélange d'organoalcoxysilane et d'agent réticulant pour former à la surface des particules un enrobage, constitué majoritairement de polysiloxane fonctionnalisé avec au moins un groupe réactif, qui présente une épaisseur moyenne comprise dans la gamme allant de 0,5 à 10 nm, et, de préférence, supérieure à 2 nm et inférieure ou égale à 10 nm, et c) greffer chimiquement à l'enrobage au moins un ligand biologique par couplage avec un groupe réactif présent en surface de l'enrobage, d) éventuellement séparation et séchage des nanoparticules hybrides obtenues. La description ci-après, en référence aux figures annexées, permet de mieux comprendre l'objet de l'invention. Les différentes variantes décrites ci-après, lorsqu'elles ne s'excluent pas l'une l'autre, peuvent être combinées. La Fig. 1 est une image de microscopie électronique à transmission à haute résolution d'une particule de 8nm de Gd2O3 :Tb , enrobée d'une couche de 3,5nm d'épaisseur, obtenue selon l'exemple 4 ci-après. La Fig. 2 est un spectre d'analyse EDX (couplée au HRTEM), mesuré le long de la particule de 8nm de Gd2O3 :Tb , enrobée d'une couche de polysiloxane de
3,5nm d'épaisseur, obtenue selon l'exemple 4 ci-après. La Fig. 3 présente les résultats de mesure de la taille des particules de 8nm après enrobage par une couche de polysiloxane de 3,5nm (exemple 4). La Fig. 4 présente, de façon comparée, les résultats de mesure de la taille des particules initiales (colloïde dialyse, 5,7mn) et après enrobage par une couche de polysiloxane de 8,0nm (exemple 3). La Fig. 5 présente, de façon comparée, les résultats de mesure de la taille des particules initiales (colloïde dialyse, 3,5nm) et après enrobage par une couche de polysiloxane de 5,0nm (exemple 1). La Fig. 6 présente, de façon comparée, les résultats de mesure de la taille des particules initiales (colloïde dialyse, 3,5nm) et après enrobage par une couche de polysiloxane fonctionnalisé par de la fluorescéine de 8,0nm (exemple 6). La Fig. 7 montre les spectres d'émission du colloïde recouvert de polysiloxane fonctionnalisé par de la fluorescéine de l'exemple 6 excité à 230nm en fonction des différentes fractions obtenues lors de la chromatographie sur colonne. La Fig. 8 montre la fluorescence de nanoparticules avec un cœur d'oxyde de gadolinium enrobé de polysiloxane fonctionnalisé par de la fluorescéine et par des brins d'oligonucléotide, ces nanoparticules étant immobilisées sur une biopuce par hybridation avec des brins d'oligonucléotides complémentaires, (exemple 9) La Fig. 9 représente le spectre d'émission du colloïde correspondant à la fraction 2 de la chromatographie sur colonne présentée Fig. 7 et excité à 540nm après dégradation de la fluorescéine. La Fig. 10 présente, de façon comparée, la mesure de luminescence entre les particules du colloïde initial et dialyse de 5,7nm et celles enrobées d'une couche de polysiloxane de 8,0nm (exemple 3). La Fig. 11 présente, de façon comparée, la mesure de luminescence entre les particules du colloïde initial et dialyse de 3,5nm et celles enrobées d'une couche de polysiloxane de 5,0nm (exemple 1). La Fig. 12 présente, de façon comparée, la mesure de luminescence entre les particules du colloïde initial et dialyse de 3,5nm et celles enrobées d'une couche de polysiloxane de 8,0nm (exemple 2). La Fig. 13 présente les spectres d'émission du colloïde recouvert de polysiloxane de l'exemple 5 excité à 230nm en fonction de la dialyse de celui-ci dans l'éthanol et de sa dispersion dans de l'eau acidifié par HC1 0,2M. La Fig. 14 présente le spectre d'excitation des particules de Gd2O3 : Tb3+ (5%) (diamètre de 3,5nm) et recouvertes d'une couche de polysiloxane de 5,0nm (exemple
D- En préambule à la description plus précise de l'invention, les définitions des termes utilisés dans la suite du mémoire descriptif sont données ci-après. Les terres rares comprennent le scandium et l'yttrium et la série des lanthanides qui sont Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu. Au sens de l'invention, par terre rare, on entend de préférence un élément choisi parmi ryttrium et la série des lanthanides. Les actinides sont Ac, Th, Pa, U, Np, Pu, Am, Cm, Bk, Cf, Es, Fm, Md, No et Lw. Le diamètre moyen ou diamètre médian de nanosphères, nommé d50, est défini par le diamètre en dessous duquel on trouve 50% de la masse des nanosphères et est déterminé par la technique de diffusion laser (spectroscopie de corrélation de photons). Un sesquioxyde Ln2O3 est dit dopé par une terre rare ou un actinide, si celui-ci est présent à raison d'au plus 25% des cations métalliques. Au-delà, il sera question de mélange. La présente invention concerne une sonde pour des applications biologiques comprenant essentiellement une nanosphère de cœur entourée d'un enrobage, également nommé couronne, autorisant le greffage par liaison covalente d'au moins un ligand biologique et éventuellement d'autres molécules organiques. La nanosphère est un cœur essentiellement sphérique inorganique luminescent de taille nanométrique. Plus précisément, ce cœur sphérique est constitué de Ln2O où Ln représente une terre rare pure, ou dopée avec une terre rare, un actinide ou une combinaison de ces derniers, un mélange de terres rares, ou encore un mélange de terre rare avec un actinide, dans lequel au moins 50 % des cations métalliques sont des cations terre rare. Cette nanosphère de cœur présente un diamètre moyen compris dans la gamme allant de 2 à 9 nm. Au moins 90 % du poids de la nanosphère est constitué de Ln O3 ci-dessus défini, le reste pouvant notamment être constitué par l'hydroxyde correspondant. L'enrobage est une couche intermédiaire entourant les nanosphères, à laquelle les ligands biologiques sont liés par liason covalente. L'enrobage est constitué majoritairement de polysiloxane fonctionnalisé et présente une épaisseur moyenne comprise dans la gamme allant de 0,5 à 10 nm, et de préférence supérieure à 2 nm. La fonction de cet enrobage est, sans que cette liste soit limitative, au moins triple : elle doit assurer la protection (étanchéité) du cœur vis à vis du milieu extérieur ; elle doit servir de sites de greffage pour les ligands biologiques fixés dessus ; elle doit augmenter les performances optiques du cœur minéral par transfert d'énergie de la couronne absorbant dans l'UV vers le cœur ré-émettant dans le visible. En fonction de l'application visée, on choisira la nature de la nanosphère constituant le cœur sphérique des nanoparticules selon l'invention qui est, de façon préférée, constitué à 80 % au moins en poids, de sesquioxyde de terre rare éventuellement dopé. De préférence, cette nanosphère est dopée ou voire même codopée, c'est à dire dopée avec au moins deux éléments de nature différente. De façon avantageuse, la nanosphère est constituée, à au moins 80 % en poids et, de préférence, à au moins 90 % en poids de Y2O3 ou Gd2O3, Gd2O étant préféré. Lorsqu'une luminescence classique est recherchée, la nanosphère est dopée par un lanthanide de type Eu, Tb, Er, Nd, Yb, Tm représentant de 0,1 à 25% des cations métalliques de la nanosphère. Lorsqu'une luminescence dans l'infra rouge est recherchée, la nanosphère est dopée par un lanthanide de type Nd ou Yb. Lorsqu'une luminescence antistokes est recherchée, la nanosphère est dopée par un lanthanide de type Er. Comme mentionné précédemment, pour la détection combinatoire (multiplexing), la nanosphère est dopée par au moins deux lanthanides différents représentant de 0,1 à 25 % des cations métalliques de la nanosphère, l'un au moins de ces lanthanides étant choisi parmi Eu et Tb. Par ailleurs, pour faciliter la détection, et en particulier pour les applications dans le domaine de l'imagerie par résonance magnétique (IRM) ou les applications en thérapie, il est avantageux que la nanosphère présente, en plus de ses propriétés de luminescence, des propriétés magnétiques. Aussi, de façon avantageuse, la nanosphère contient des cations de terre rare présentant un comportement magnétique choisis parmi Gd, Nd, représentant au moins 10 % de l'ensemble des cations métalliques présents dans le cœur, si une application en imagerie médicale est envisagée, et d'au moins 50 %, si une application en hyperthermie est envisagée. Selon une autre variante avantageuse, de 0,01 % à 50 %, et de préférence de 0,1 à 10% des cations métalliques de la nanosphère sont des cations actinide choisis parmi Ac, Th, Pa, Np, U, Pu. Un dopage de la nanosphère avec de tels radionucléides trouve notamment application en thérapie liée à des réactions nucléaires. Une autre variante avantageuse concerne des nanoparticules hybrides dont au moins 0,1% des cations métalliques de la nanosphère sont des isotopes radioactifs de durée de demi vie inférieure à 1000 ans, ou dont au moins 1 %, de préférence au moins 5 %, des cations métalliques de la nanosphère sont des isotopes présentant une grande capacité de capture de neutrons couplée à une forte énergie de réaction (par exemple 157Gd, 235U). De telles nanoparticules présentent un grand intérêt pour des systèmes de thérapie basée sur des réactions de décomposition nucléaire, par exemple pour la destruction de cellules cancéreuses. De préférence, la nanosphère est constituée, à au moins 90 % en poids, de sesquioxyde de lanthanide éventuellement dopé. Les nanoparticules hybrides, selon l'invention dont la nanosphère est constituée, à au moins 90 % en poids, de Gd2O3 dopé par Tb ou Eu, sont particulièrement préférées. Gd3+ est en effet un cation présentant à la fois un fort paramagnétisme et pouvant servir de matrice aux cations luminescents Eu et Tb. Les nanosphères de sesquioxyde de terre rare, et notamment de sesquioxyde de gadolinium, sont sensibles à l'hydrolyse en milieu aqueux. Pour éviter la transformation du sesquioxyde en hydroxyde, ce dernier est enrobé d'une couche protectrice constituée majoritairement de polysiloxane fonctionnalisé. Cette dernière doit être suffisamment épaisse pour assurer cette protection : son épaisseur moyenne est comprise dans la gamme allant de 0,5 à 10 nm, et de préférence est supérieure à 1 nm. La couche d'enrobage représente avantageusement au moins 20 % du volume total de la nanoparticule et de préférence de 25 à 75 % du volume total de la nanoparticule. L'épaisseur est mesurée par granulométrie laser (technique PCS). Il est également possible de retrouver, pour une nanoparticule isolée, le diamètre de la nanosphère et l'épaisseur de la couche, par microscopie électronique à transmission. De façon avantageuse, cet enrobage protège les propriétés de luminescence du cœur d'oxyde et/ou autorise un transfert d'énergie par rapport au cœur sphérique, c'est à dire que l'excitation UN est absorbée par la couronne de polysiloxane et transférée au cœur sphérique ce qui augmente sa luminescence. Cette fonction est particulièrement assurée, si 5 à 75 %, de préférence 30 à 50 % des atomes de silicium de la couche de polysiloxane sont liés chacun à quatre autres atomes de silicium par des ponts oxygène, ce qui constitue donc une variante préférée de l'invention. Par conséquent, selon une variante avantageuse de l'invention, 25 à 95 % et, de préférence, de 50 à 70% des atomes de silicium de l'enrobage de polysiloxane fonctionnalisé sont liés de façon covalente à un atome de carbone et sont donc fonctionnalisés. Par ailleurs, la densité de cette couche de polysiloxane fonctionnalisé peut être choisie en fonction de l'effet privilégié que l'on souhaite lui attribuer. Notamment, une couche présentant une densité comprise dans la gamme allant de 1,6 à 2,4 et, de préférence, comprise dans la gamme allant de 1,8 à 2,1 est préférée pour favoriser encore la protection du cœur sphérique contre Thydroxylation et conserver sa luminescence. Un enrobage présentant une densité inférieure à 2 est préférée pour les applications en IRM ou en hyperthermie. Cette couche de polysiloxane fonctionnalisé permet également le greffage par liaison covalente d'au moins un ligand biologique et éventuellement d'autres molécules organiques ou polymères. En particulier, entre 10 et 100 000 molécules organiques luminescentes, notamment choisies parmi les dérivés de la rhodamine ou de la fluorescéine, sont greffées à la surface et/ou au sein de l'enrobage, en plus du ou des ligands biologiques, ce qui permet une détection résolue en temps. En effet, le temps de vie de l'état excité est de quelques nanosecondes pour les molécules organiques luminescentes et de l'ordre de la microseconde pour les nanoparticules de sesquioxyde de lanthanide. Selon une variante de l'invention, 1 à 1000 et, de préférence, 1 à 100 molécules de ligand biologique sont greffées à la couche de polysiloxane fonctionnalisé par liaison covalente. Selon une autre variante de l'invention, moins de 10% en poids de ces nanoparticules comprennent plus de deux molécules de ligand biologique greffées sur la couche intermédiaire. Par ligand biologique, on entend un composé qui possède au moins un site de reconnaissance lui permettant de réagir avec une molécule cible d'intérêt biologique. Les ligands biologiques greffés sont, par exemple, dérivés de nucléotides, sucres, vitamines, hormones, biotine, streptavidine, ou toute autre molécule organique présentant un intérêt pour la vectorisation biologique. Il est également possibles que des molécules luminescentes ou molécules complexantes, autres que le(s) ligands biologiques, soient greffées sur la couche de polysiloxane fonctionnalisé. Des molécules polaires ou chargées du type organophosphonates, aminés quaternaires, peuvent également être greffées sur la couche intermédiaire. Une autre possibilité est de greffer, sur la couche de polysiloxane, des molécules de polymère solubles dans l'eau de masse moléculaire inférieure à 5000 g/mol et de préférence inférieure à 1000, par exemple, tel que le polyéthylène glycol ou le dextran. La présente invention vise également un procédé de préparation de nanoparticules hybrides telles que définies ci-dessus, éventuellement sous la forme de suspension colloïdale. Ce procédé comprend différentes étapes successives détaillées ci-après. La première étape du procédé réside dans l'obtention en grande quantité de nanosphères cristallines de diamètre moyen compris entre 2 et 9 nm, obtenues avec une faible polydispersité et facilement redispersables, c'est à dire sans la formation d'agglomérat. Le procédé selon l'invention passe par la préparation directe d'une dispersion colloïdale isodisperse. Par dispersion isodisperse, on entend une dispersion dont la distribution en taille mesurée par spectroscopie de corrélation de photons est très resserrée, c'est à dire, par exemple, que plus de 90% des particules ont un diamètre compris entre le diamètre moyen de la dispersion plus ou moins 20% du d50. Plus la distribution en diamètre est resserrée, plus le système est appelé isodisperse ou monodisperse. Ces nanoparticules sont préparées selon la méthode polyol. Cette méthode « polyol » consiste en une précipitation directe d'un solide au sein d'un polyalcool porté à une température comprise généralement entre 130°C et 250°C. Un précurseur métallique est préalablement dissous dans le polyol (par exemple du diéthylène glycol), puis après ajout éventuel d'un réactif, la solution est portée à une température supérieure à 150°C. Le polyol agit comme un stabilisant, limite la croissance des particules et minimise l'agglomération des poudres. Avec cette méthode, différentes poudres submicroniques d'oxydes ont déjà été synthétisées, on peut ainsi citer CeO2, LaPO4 dopé Ce3+ (C. Feldmann, Advanced Materials, 13 (2003) 101), et Y2O3 dopé Eu3+ (C. Feldmann, J. Merikhi, Journal of Materials Science, 38 (2003) 1731-1735). Les nanosphères utilisées dans la présente invention sont, par exemple, obtenues selon la méthode « polyol » décrite dans Journal of Luminescence, 102-103 (2003) 445-450, et Journal of Colloid and Interface Science, doi :10.1016/j.jcis.2003.10.031. Sans que cette liste soit limitative, les précurseurs utilisés peuvent être des chlorures, des nitrates ou des acétates. Des concentrations supérieures au g/1 peuvent ainsi être obtenues. De façon avantageuse, on obtient une suspension colloïdale contenant entre 100 mg et 100 g de nanosphères par litre de solvant. La synthèse des nanosphères de sesquioxyde est, par exemple, réalisée à une température inférieure à 200°C dans un solvant polaire tel qu'un polyol, du type diéthylène glycol (DEG) dont le fort pouvoir solvatant permet un contrôle de la taille des particules. Des précurseurs des différents sesquioxydes métalliques qui vont constituer les nanosphères, par exemple, des chlorures de terre rare TRC13 (TR : Gd, Y) et des chlorures de lanthanide Ln'Cl3 (Ln' : Eu, Tb, Er, Nd, Yb, Tm) ou des nitrates d'actinides (U) sont dispersés dans le diéthylène glycol. La concentration globale en ions métalliques est, avantageusement, comprise entre 0,1 et 0,5 M et la quantité relative de chlorures de terre rare TRC1 (TR : Gd, Y) et de chlorures de lanthanide Ln'Cl3 (Ln' : Eu, Tb, Er, Nd, Yb, Tm) ou de nitrates d'actinides (U) dépend du taux de dopage ou de la nature du mélange désiré. Après agitation, une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium, avantageusement 1ml, est ajouté et le mélange est chauffé dans un bain d'huile silicone à 140°C pendant une heure. Après dissolution complète des composés présents, la solution est portée à 180°C pendant 4 heures sous agitation vigoureuse. Il en résulte une solution colloïdale, stable pendant plusieurs mois, de nanosphères dispersées dans le DEG. Quelle que soit la quantité de dopant (terre rare ou actinide), les particules de taille nanométrique se présentent sous forme de solution solide constituée d'une seule phase. La concentration des ions et le taux d'hydrolyse (rapport de la quantité d'eau ajoutée et de la quantité d'ions métalliques) peut être ajustée, afin de contrôler la taille. Il s'avère que la concentration en OH" doit être la plus faible possible pour éviter la précipitation d'hydroxydes. L'addition d'un équivalent de NaOH par rapport au nombre de moles de cations terre rare semble un bon compromis : une plus faible quantité est caractérisée par un faible rendement (moins de 30 % d'oxyde de lanthanide) et une plus importante aboutit à une précipitation irréversible d'hydroxydes. Par conséquent, de façon particulièrement préférée, à l'étape a) du procédé, une suspension colloïdale contenant entre 100 mg et 100 g de nanosphères par litre de solvant est préparée par dissolution de précurseurs de terre rare et/ou d'actinides, dans un solvant polaire, en particulier un polyol du type éthylèneglycol et chauffage à une température comprise entre 130 et 250°C, en présence de la quantité d'eau au moins nécessaire pour la formation du sesquioxyde désiré et éventuellement d'une base telle que NaOH à une concentration comprise entre 0,01 et 1 mol/1 de solvant. La suspension colloïdale de nanosphères obtenue peut, éventuellement, être purifiée et/ou concentrée, en éliminant les sels solubles résiduels, une partie du polyol, par exemple par évaporation sous pression réduite, ou en changeant de solvant, par exemple par chromatographie ou dialyse, et contrôler la quantité d'eau présente dans la solution. Au sens de l'invention, les nanosphères de Ln2O sont ensuite enrobées par une couche de molécules capables d'établir des interactions fortes et durables à la fois avec la surface de sesquioxydes et avec des molécules organiques (fluorophores, dispersants...) et/ou des ligands biologiques qui vont y être fixés. D'autre part, cette couche assure une protection des nanosphères lorsqu'elles sont dispersées en milieu aqueux. En effet, une dissolution des nanosphères et/ou une chute de l'intensité de luminescence est généralement observée lorsque ces nanosphères sont dispersées dans l'eau. Pour cela, des formateurs de réseaux, et non des modificateurs (qui ne permettent pas de former une couche réticulée autour de la nanosphère) sont utilisés. Les formateurs de réseaux sont des composés qui, outre le ou les liens qu'ils établissent avec la surface de sesquioxyde de terre rare, sont capables de réagir entre eux (par réaction de condensation entre les plus proches voisins) pour constituer un véritable réseau emprisonnant la nanosphère. Ces composés sont en général des organoalcoxysilanes de formule RxSi(OR')y avec y=2, 3 ; x = 4-y et R choisi de façon à pouvoir immobiliser une molécule organique active. Afin d'obtenir un réseau dense et robuste, RxSi(OR')y est mélangé avec un agent réticulant tel que le tétraéthylorthosilicate (TEOS). La couche de polysiloxane, également nommée enrobage ou couronne, peut être, en particulier, obtenue par hydrolyse - condensation d'un mélange d'organotrialcoxysilane choisi parmi Taminopropyltriéthoxysilane (APTES), glycidyloxypropyltriéthoxysilane (GPTES), mercaptopropyltriéthoxysilane (MPTES) et isocyanatopropyltriéthoxysilane (IPTES)) avec un agent réticulant, tel que le TEOS, en présence des nanosphères de sesquioxyde Ln2O3 telles que précédemment obtenues. Le rapport Si/C est contrôlé par la quantité d'agent réticulant, le plus souvent de TEOS, introduite. La quantité d'organoalcoxysilane/agent réticulant ajoutée dépend du nombre de nanosphères dispersées en solution, de leur taille (et donc de leur surface) et de l'aire qu'occupe une molécule adsorbée. La présence d'une base de type triméthylamine est préférable, de préférence entre 0,01 et 0,1 mol/1. L'utilisation d'organotrialcoxysilane permet d'introduire dans la couronne des groupes réactifs qui permettront l'accrochage de molécules actives (ligand biologique, fluorophores). Aussi, pour permettre ce couplage, certains des précurseurs de type organoalcoxysilane de la couche de polysiloxane portent des groupements réactifs tels que des groupements carboxylique, aminé, aldéhyde, ou époxyde. L'hydrolyse-condensation de ces précurseurs fournit une couche de polysiloxane fonctionalisé capable de réagir avec un ligand biologique ou toute autre molécule organique ou polymère à greffer. Le TEOS assure la réticulation du polysiloxane formé, dans lequel la quantité d'atomes de silicium liés uniquement à des atomes d'oxygène (nœuds de réticulation), c'est-à- dire qui ne proviennent que de TEOS, est compris entre 5 et 75 %, de préférence entre 30 et 50 %. Les molécules non adsorbées et les produits secondaires sont, généralement, extraits de la solution colloïdale par dialyse contre l'éthanol, de l'eau ou un mélange équivolumique éthanol/eau. On peut détailler, sans caractère limitatif, un procédé de formation de l'enrobage de polysiloxane se déroulant, avantageusement, en quatre phases. La première consiste à additionner à 5 ml de nanosphères de Ln2O3 dispersées dans une solution de DEG contenant nAPTES(i) mol d' APTES tel que 4 < 100 x nAPTES(i)/( APTES(i + nAPTEs(2)+nτEθs) < 16. Après au moins 20 minutes d'agitation, 3nAPTES(i) mol d'eau diluée dans le DEG contenant 0,1 M de triéthylamine (Et3N) sont ajoutés (2βme phase). La solution est agitée pendant une heure avant d'ajouter au mélange précédent (3ème phase)
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mol d'APTES et rEos mol de TEOS tel que 5 < 100 X nTEθs (nAPTES(i)+ riAPTES(2)+nτEθs) 75. Enfin, après 20 minutes, (15nAPTES(i) + UTEOS) mol d'eau diluée dans le DEG contenant 0,1 M de triéthylamine (Et3N) sont ajoutés au mélange. Le mélange est alors agité pendant 48 heures à 20°C < T < 40°C. En plus des ligands biologiques, l'enrobage de polysiloxane fonctionnalisé peut permettre le greffage covalent de molécules organiques luminescentes, dérivés de la fluorescéine et de la rhodamine notamment. La fonctionnalisation par ces fluorophores peut être réalisée selon au moins deux manières différentes. La première consiste à modifier des molécules d'organoalcoxysilane par ces fluorophores avant la réaction d'hydrolyse. Par exemple, 5 à 30 % des molécules d'organoalcoxysilane, notamment d' APTES introduites lors de la première ou de la deuxième phase ci-dessus mentionnées, sont couplées, au préalable, à la fluorescéine isothiocyanate (FTIC) par réaction entre la fonction aminé d'APTES et la fonction isothiocyanate de FTIC. Les précurseurs de polysiloxane ainsi modifiés sont alors ajoutés à un mélange d'organoalcoxysilane et de TEOS pour former la couronne. La seconde méthode consiste à greffer les fluorophores après formation de la couche de polysiloxane par condensation entre les groupes réactifs portés par les fluorophores et ceux présents dans la couche de polysiloxane. Les ligands biologiques doivent être accessibles pour des réactions ultérieures de couplage sonde/cible et sont, donc, quant à eux, greffés chimiquement sur la couche de polysiloxane, par couplage classique avec des groupes réactifs présents, éventuellement précédé d'une étape d'activation. Les réactions assurant le couplage sont connues et décrites, par exemple, dans « Bioconjugatre Techniques », G T. Hermanson, Académie Press, 1996 ou dans « Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. A Practical Guide to Technology for Quantitative Real-Time Analysis », Second Edition, W. T. Mason, éd., Académie Press, 1999. Par exemple, le couplage est effectué par addition d'une solution aqueuse de ligands biologiques dont la quantité est au moins supérieure au nombre de sites de greffage (correspondant aux groupes réactifs) sur l'enrobage. Dans le cas où la couche de polysiloxane est fonctionnalisée avec des groupes aminé, des biomolécules portant au moins une fonction -COOH peuvent être greffées. Cependant il est nécessaire d'activer au préalable la fonction -COOH de la biomolécule par un mélange d'EDC e de NHS. Après greffage des ligands biologiques, les produits secondaires en excès sont éliminés par dialyse ou par chromatographie sur colonne. Cette dernière technique est utilisée seulement lorsque les nanoparticules sont fonctionnalisées par des dérivés de la fluorescéine. Afin d'éviter la dénaturation par la répétition des étapes de greffage et de purification, le greffage des ligands biologiques est, de préférence, réalisé en dernier. Les nanoparticules selon l'invention trouvent différentes applications. On peut notamment citer leur utilisation pour la détection de biomolécules (biopuces), le ciblage de substrats biologiques (imagerie IRM), pour la destruction de cellules ou de tumeurs solides en thérapie (hypertthermie, capture de neutrons). Les exemples ci-après sont donnés à titre purement illustratif et n'ont pas de caractère limitatif. Exemple 1 : Un colloïde de Gd2O3 dopé à 5% en Tb3+ est préparé par dissolution d'une quantité de 50g.!"1 de sels de chlorures de gadolinium et de terbium dans un volume de 20ml de diéthylène glycol. La taille finale des particules, confirmée par HRTEM et mesurée par granulométrie laser, est de 3,5nm. Le colloïde est dialyse pendant 24h, à chaud (40°C), sous agitation dans du diéthylène glycol. Le rapport volume de diéthylène glycol propre / volume de colloïde à dialyser est de 20. Autour de ces particules, une couche de polysiloxane fonctionnalisé d'une épaisseur de 5,0nm est synthétisée par voie sol-gel. Dans une solution contenant
5,0ml de colloïde dialyse (4,53.1019particules.l"1), dissolution de 28,4g.!"1 d'aminopropyltriethoxysilane (APTS), 17,6g.!"1 de tétraéthyl orthosilicate (TEOS) et
13,2ml par litre d'une solution aqueuse de 0,1M de triéthylamine. La réaction s'effectue à 40°C dans un bain d'huile et sous agitation. Elle comporte plusieurs étapes : à t = 0 h ajout de ^ correspondant à 16% de la masse totale d'APTS à t ≈ 0,33 h hydrolyse de l' APTS par ajout de 10% du volume d'eau total à t = 1,33 h ajout de m correspondant à la masse d'APTS restant et de la totalité du TEOS à t = 2,33 h ajout des 90% du volume d'eau restante à t = 50,33 h, fin de la synthèse.
Exemple 2 : Un colloïde de Gd2O3 dopé à 5% en Tb3+ est préparé dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 1. Autour de ces particules, une couche de polysiloxane fonctionnalisé d'une épaisseur de 8,0nm est synthétisée par voie sol-gel. Dans une solution contenant
5,0ml de colloïde dialyse (4,53.1019particules.l"1), on dissout 86,4g.!"1 d'APTS, 54,2g.!"1 de TEOS et 40ml par litre d'une solution aqueuse de 0,1M de triéthylamine. La réaction de recouvrement par voie sol-gel a été réalisée dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 1.
Exemple 3 : Un colloïde de Gd2O dopé à 5% en Tb3+ est préparé dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 1, correspondant à une taille de 3,5nm. Des particules d'une taille de 5,7nm et de même composition ont été obtenues par ajout, dans le colloïde obtenu précédemment, d'une quantité adéquate de sels de chlorures de gadolinium et de terbium. Autour de ces particules, une couche de polysiloxane fonctionnalisé d'une épaisseur de 8nm est synthétisée par voie sol-gel. Dans une solution contenant 5,0ml de colloïde dialyse (S^ό.lO^particules.l"1), on dissout 58,1g.!"1 d'APTS, 36,4g.!"1 de TEOS et 28,4ml par litre d'une solution aqueuse de 0,1 M de triéthylamine. La réaction de recouvrement par voie sol-gel a été réalisée dans les mêmes conditions que celles de l' exemple 1.
Exemple 4 : Un colloïde de Gd2O3 dopé à 5% en Tb est préparé dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 3, correspondant à une taille de 5,7nm. Des particules d'une taille de 8nm et de même composition ont été obtenues par ajout, dans le colloïde obtenu précédemment, d'une quantité adéquate de sels de chlorures de gadolinium et de terbium. Autour de ces particules, une couche de polysiloxane fonctionnalisé d'une épaisseur de 3,5nm est synthétisée par voie sol-gel. Dans une solution contenant 5,0ml de colloïde dialyse (S^S.lO^particules.l"1), on dissout 20,6g.!"1 d'APTS, 13,0g.!"1 de TEOS et 10ml par litre d'une solution aqueuse de 0,1 M de triéthylamine. La réaction de recouvrement par voie sol-gel a été réalisée dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 1.
Exemple 5 : Un colloïde de Gd2O3 dopé à 5% en Tb3+ est préparé dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 1. Autour de ces particules, une couche de polysiloxane fonctionnalisé d'une épaisseur de 5,0nm est élaborée par voie sol-gel. Dans une solution contenant 2,5ml de colloïde dialyse (4,53.1019particules.l"1) et 2,5ml de diéthylène glycol propre, on dissout 28,4g.!"1 d'APTS, 17,6g.!"1 de TEOS et 13,2ml par litre d'une solution aqueuse de 0,1M de triéthylamine. La réaction de recouvrement par voie sol-gel a été réalisée dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 1.
Exemple 6 : Un colloïde de Gd2O3 dopé à 5% en Tb3+ est préparé dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 1. Autour de ces particules, une couche de polysiloxane fonctionnalisé d'une épaisseur de 8 nm est élaborée par voie sol-gel. Dans une solution contenant 2,5ml de colloïde dialyse (2,26.1019particules.l" ) et 2,5ml de diéthylène glycol propre, on dissout 9,4g.!"1 d'APTS, 6,4g.!"1 de TEOS et 4,4ml par litre d'une solution aqueuse de 0,1 M de triéthylamine. Six heures avant l'ajout de la masse m d'APTS, celle-ci est mélangée sous agitation magnétique, à 1,4g!"1 de fluorescéine isothiocyanate (FTIC), molécule fluoresecente. Par la suite, la réaction de recouvrement a été réalisée dans les même conditions que celles de l'exemple 1, mis à part que la masse m2 d'APTS est combiné avec la FTIC. Exemple 7 : greffage de l'oligonucléotide A une solution de 100 μM d'oligoniαcléotides d(T)22 terminée par une fonction -COOH, est ajoutée une solution aqueuse d'EDC 0,2 M et de NHS 0,2 M. Après une heure d'agitation, 500 μl de solution aqueuse de nanoparticules d'oxyde de gadolinium enrobées d'une couche de polysiloxane fonctionnalisé (préparées selon l'exemple 1 et purifiées par dialyse) et 100 μl d'une solution tampon carbonate (0,1M ; pH 11) sont ajoutés à la solution renfermant les brins d'oligonucléotide. Au bout de deux heures d'agitation, la solution gélifie. Après filtration sur membrane, le gel est redispersé dans 200 μl d'eau milli-Q.
Exemple 8 : Un colloïde de Gd2O3 dopé à 1% en uranium est préparé par dissolution d'une quantité de 50g.!"1 de sels de chlorure de gadolinium et de nitrate d'uranium dans un volume de 20ml de diéthylène glycol. La taille finale des nanosphères, confirmée par HRTEM et mesurée par granulométrie laser, est de 3,5nm. Le colloïde est dialyse pendant 24h, à chaud (40°C), sous agitation dans du diéthylène glycol. Le rapport volume de diéthylène glycol propre / volume de colloïde à dialyser est de 20. Autour de ces nanosphères, une couche de polysiloxane fonctionnalisé d'une épaisseur de 5,0nm est synthétisée par voie sol-gel. Dans une solution contenant 5,0ml de colloïde dialyse (4,53.10 ^particules.!"1), dissolution de 28,4g.!"1 d'aminopropyltriéthoxysilane (APTS), 1 ,6g.!"1 de tétraéthyl orthosilicate (TEOS) et
13,2ml par litre d'une solution aqueuse de 0,1M de triéthylamine. La réaction s'effectue à 40°C dans un bain d'huile et sous agitation. Elle comporte plusieurs étapes : à t = 0 h ajout de mi correspondant à 16% de la masse totale d'APTS à t = 0,33 h hydrolyse de l'APTS par ajout de 10% du volume d'eau total à t = 1,33 h ajout de m2 correspondant à la masse d'APTS restant et de la totalité du TEOS à t = 2,33 h ajout des 90% du volume d'eau restante à t = 50,33 h, fin de la synthèse. Exemple 9 : Un colloïde de Gd203 dopé à 5% en Tb3+ et 5% en Eu3+ en moles est préparé par dissolution d'une quantité de 50g.l-1 de sels de chlorure de gadolinium, de terbium et d'europium dans un volume de 50ml de diéthylène glycol (2,260g de GdCl3,6H2O, 0,1273g de EuCl3,6H20 et 0,1250g de TbCl3,6H2O). Après ajout de 3ml d'une solution aqueuse de NaOH 2N à 70°C, chauffage à 140°C pendant lh, puis pendant 4h à 180°C, la taille finale des particules, confirmée par HRTEM et mesurée par granulométrie laser, est de 3,5nm. Le colloïde est dialyse pendant 24h, à chaud (40°C), sous agitation dans du diéthylène glycol. Le rapport volume de diéthylène glycol propre / volume de colloïde à dialyser est de 20. La réaction d'enrobage par voie sol-gel est réalisée dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 1. Afin de tester la possibilité de détection résolue en temps (et accessoirement faciliter la manipulation de ces nanoparticules), 10 % de l'aminopropyltrialcoxysilane sont fonctionnalisés par un colorant organique (fluorescéine) (Fig. 7). En outre, sa présence facilite la purification des nanoparticules hybrides par chromatographie car son avancement peut aisément être suivi à l'œil nu. L'analyse des fractions recueillies par spectrophotométrie UN- visible et par spectroscopie de corrélation de photons confirme l'impression visuelle et permet d'identifier les fractions (2 et 3 de la Fig. 7) contenant les nanoparticules hybrides. La chromatographie est réalisée à l'aide d'une colonne remplie d'un gel de silice. Le volume de l'échantillon à purifier est fixé à 2,5 ml et il est élue par une solution aqueuse tamponnée, par de l'éthanol ou un mélange équivolumique eau - éthanol. Les nanosphères de Gd2O3 dopé Tb enrobées d'une couche de polysiloxane dont 10% des fonctions aminés sont liées à un dérivé de la fluorescéine peuvent être utilisées comme marqueur pour la détection de ligands biologiques (et en particulier d'oligonucléotides). En effet, en raison, des propriétés de luminescence du terbium et de la fluorescéine, ces nanoparticules, lorsqu'elles sont fonctionnalisées par une molécule sonde, permettent de marquer sélectivement des molécules biologiques en raison d'interaction spécifiques avec les sondes greffées sur les nanoparticules et donc de les détecter. En l'occurrence, le greffage d'un oligonucléotide modifié par une fonction acide carboxylique sur la nanoparticule grâce à la condensation du - COOH activé avec une des fonctions aminés présentes dans le réseau de polysiloxane peπnet l' immobilisation de la nanoparticule sur un support solide s'il est recouvert en certains points par l'oligonucléotide complémentaire (hybridation). A la suite d'une excitation électromagnétique adaptée, la fluorescéine émet un signal lumineux permettant de repérer les endroits du support où la nanoparticule est immobilisée (Fig. 8). Connaissant la séquence de l'oligonucléotide sur le support et en vertu du principe de la complémentarité des bases qui préside à l'hybridation des brins d'oligonucléotides, la séquence de l'oligonucléotide greffé sur la nanoparticule peut alors être déduite. L'émission des ions Tb3+ est observée après destruction par irradiation laser de la fluorescéine (Fig. 9). Le réseau de polysiloxane fonctionnalisé qui enrobe la nanosphère de sesquioxyde permet, parallèlement au greffage de molécules actives, d'amplifier le signal de luminescence du dopant présent dans le cœur de sesquioxyde. En effet, pour un même nombre de nanoparticules dont le cœur de sesquioxyde est identique, l'intensité de la luminescence des ions Tb3+ est beaucoup plus importante lorsque la nanosphère de Ln2O3 est enrobée par une couche de polysiloxane comparée à des nanosphères non enrobées (Fig. 10-12). De plus, la couche de polysiloxane assure une protection efficace vis-à-vis d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique diluée. En effet, les spectres enregistrés à partir de deux échantillons contenant la même quantité de nanoparticules identiques, mais dispersées pour les uns dans de l'éthanol et pour les autres dans de l'HCl 0,2 M, montrent que les nanosphères enrobées par le polysiloxane fonctionnalisé sont insensibles à la présence d'eau (contrairement aux nanosphères nues) (Fig. 13). La stabilité en milieu aqueux de la nanopshère et de ses propriétés de luminescence est indispensable dans l'optique du marquage biologique. Ces résultats confirment le potentiel des nanoparticules selon l'invention et en particulier de celles de sesquioxyde de gadolinium pour le marquage et la détection de ligands biologiques dont la présence peut être révélée par : - la fluorescence de molécules de colorant organique greffées sur la couche de polysiloxane qui enrobe la nanosphère de Ln O3 - la radiation électromagnétique émise par les dopants incorporés dans la nanosphère et dont la nature peut varier au sein d'une même nanosphère (multidopage). - des mesures magnétiques, dans la cas de nanosphère à base de sesquioxyde de gadolinium, notamment, qui est paramagnetique.

Claims

REVENDICATIONS 1 - Nanoparticules hybrides comprenant : - une nanosphère, de diamètre moyen compris dans la gamme allant de 2 à 9 nm, composée, à au moins 90% en poids, de Ln O3 avec Ln qui représente une terre rare, éventuellement dopée avec une terre rare ou un actinide, ou un mélange de terres rares, ou bien un mélange de terre rare et d'actinide dans lequel au moins 50% des ions métalliques sont des ions terre rare, - un enrobage autour de la nanosphère, constitué majoritairement de polysiloxane fonctionnalisé, et qui présente une épaisseur moyenne comprise dans la gamme allant de 0,5 à 10 nm et, de préférence, supérieure à 2 nm et inférieure ou égale à 10 nm, et - au moins un ligand biologique greffé par liaison covalente à l'enrobage de polysiloxane. 2 - Nanoparticules selon la revendication 1 caractérisées en ce que dans l'enrobage, de 5 à 75 % et, de préférence de 30 à 50 % des atomes de silicium sont liés à quatre autres atomes de silicium par des ponts oxygène. 3 - Nanoparticules selon la revendication 1 ou 2 caractérisées en ce que l'enrobage présente une densité comprise dans la gamme allant de 1,6 à 2,4 et, de préférence, comprise dans la gamme allant de 1,8 à 2,1. 4 - Nanoparticules selon la revendication 1 ou 2 caractérisées en ce que l'enrobage présente une densité inférieure à 2. 5 - Nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisées en ce que entre 10 et 100 000 molécules organiques luminescentes sont greffées, par liaison covalente, à l'enrobage. 6 - Nanoparticules selon la revendication 5 caractérisées en ce que les molécules organiques fluorescentes sont choisies parmi les dérivés de la rhodamine, ou de la fluorescéine. 7 - Nanoparticules selon Tune des revendications 1 à 6 caractérisées en ce que la nanosphère est constituée, à au moins 80 % en poids, de sesquioxyde de terre rare éventuellement dopé. 8 - Nanoparticules selon la revendication 7 caractérisées en ce que la nanosphère est constituée, à au moins 80 % en poids, de Gd2O3, et de préférence à au moins 90 % en poids. 9 - Nanoparticules selon la revendication 7 caractérisées en ce que la nanosphère est constituée, à au moins 80 % en poids, de Y2O3, et de préférence à au moins 90 % en poids. 10 - Nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisées en ce que la nanosphère est dopée par un lanthanide de type Eu, Tb, Er, Nd, Yb, Tm représentant de 0,1 à 25% des cations métalliques. 11 - Nanoparticules selon la revendication 10 caractérisées en ce que la nanosphère est dopée par un lanthanide de type Nd ou Yb. 12 - Nanoparticules selon la revendication 10 caractérisées en ce que la nanosphère est dopée par un lanthanide de type Er. 13 - Nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisées en ce que la nanosphère est dopée par au moins deux lanthanides différents représentant de 0,1 à
25% des cations métalliques, l'un au moins de ces lanthanides étant choisi parmi Eu et Tb. 14 - Nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisées en ce que plus de 10% des cations métalliques de la nanosphère sont des cations de lanthanide présentant un comportement magnétique, choisie parmi Gd, Nd. 15 - Nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisées en ce que plus de 50% des cations métalliques de la nanosphère sont des cations de lanthanide présentant un comportement magnétique, choisie parmi Gd, Nd. 16 - Nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisées en ce que de 0,01%o à 50%>, et de préférence de 0,1 à 10%, des cations métalliques de la nanosphère sont des cations d'uranide choisi parmi Ac, Th, Pa, Np, U, TNTp, Pu. 17 - Nanoparticules selon Tune des revendications 1 à 16 caractérisées en ce que au moins 1 %, de préférence au moins 5 %, des cations métalliques de la nanosphère présentent une grande capacité de capture de neutron, choisis, par exemple, parmi les isotopes 157 Gd et 235U. 18 - Nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 17 caractérisées en ce que de 1 à 1000 et, de préférence, de 1 à 100 de molécules de ligand biologique sont greffées à l'enrobage par liaison covalente. 19 - Nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 17 caractérisées en ce que moins de 10% en poids de ces nanoparticules comprennent plus de deux molécules de ligand biologique greffées à l'enrobage. 20 - Nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 19 caractérisées en ce que le ou les ligands biologiques greffés sont dérivés de nucléotides, sucres, vitamines, hormones, biotine, streptavidine, ou toute autre molécule organique présentant un intérêt pour la vectorisation biologique. 21 - Nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 20 caractérisées en ce que des molécules luminescentes ou molécules complexantes, autres que le(s) ligands biologiques, sont greffées à l'enrobage. 22 - Nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 21 caractérisées en ce que des molécules polaires ou chargées du type organophosphonates, aminés quaternaires, sont greffées à l'enrobage. 23 - Nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 21 caractérisées en ce que des molécules de polymère solubles dans l'eau de masse moléculaire inférieure à 5000 g/mol et de préférence inférieure à 1000, par exemple, tel que le polyéthylène glycol ou le dextran, sont greffées à l'enrobage. 24 - Suspension colloïdale de nanoparticules hybrides selon Tune des revendications 1 à 23. 25 - Procédé de préparation de nanoparticules hybrides selon l'une des revendications 1 à 23, éventuellement sous la forme de suspension colloïdale selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes : a) préparer une suspension colloïdale de nanosphères, de diamètre moyen compris dans la gamme allant de 2 à 9 nm, composées, à au moins 90% en poids, de Ln2O3 avec Ln qui représente une terre rare, éventuellement dopée avec une terre rare ou un actinide, ou un mélange de terres rares, ou bien un mélange de terre rare et d'actinide dans lequel au moins 50% des ions métalliques sont des ions terre rare, b) ajouter à la suspension colloïdale la quantité nécessaire d'un mélange d'organoalcoxysilane et d'agent réticulant pour former à la surface des particules un enrobage, constitué majoritairement de polysiloxane fonctionnalisé avec au moins un groupe réactif, qui présente une é aisseur moyenne comprise dans la gamme allant de 0,5 à 10 nm, et, de préférence, supérieure à 2 nm et inférieure ou égale à 10 nm, et c) greffer chimiquement à l'enrobage au moins un ligand biologique par couplage avec un groupe réactif présent en surface de l'enrobage, d) éventuellement séparation et séchage des nanoparticules hybrides obtenues. 26 - Procédé de préparation selon la revendication 25, caractérisé en ce que à l'étape a) une suspension colloïdale contenant entre 100 mg et 10O g de nanosphères par litre de solvant est préparée par dissolution de précurseurs de terre rare et/ou d'actinides, dans un solvant polaire, en particulier un polyol du type éthylèneglycol et chauffage à une température comprise entre 130 et 250°C, en présence de la quantité d'eau au moins nécessaire pour la formation du sesquioxyde désiré et éventuellement d'une base telle que NaOH à une concentration comprise entre 0,01 et 1 mol/1 de solvant. 27 - Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que les précurseurs de terre rare et ou d'actinides sont du type chlorure, acétate ou nitrate. 28 - Procédé selon l'une des revendications 25 à 27, caractérisé en ce que à l'étape b), le tétraéthyl orthosilicate (TEOS) est utilisé comme agent réticulant. 29 - Procédé selon l'une des revendications 25 à 28 caractérisé en ce qu'une partie des molécules d'organoalcoxysilane utilisées sont liées de façon covalente à une molécule luminescente. 30 - Procédé selon l'une des revendications 25 à 29, caractérisé en ce que l'étape c) est précédée d'une étape de greffage de molécules luminescentes et/ou de molécules complexantes et/ou de molécules polaires ou chargées et/ou de molécules de polymères solubles dans l'eau, par couplage avec un groupe réactif présent en surface de l'enrobage.
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