FR3116197A1 - Procédé de traitement de tumeurs par captation du cuivre et/ou du fer - Google Patents
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Abstract
La présente divulgation porte sur des nanoparticules et leurs utilisations dans le domaine de la médecine, en particulier pour le traitement de tumeurs.
Description
La présente divulgation porte sur des nanoparticules et leurs utilisations dans le domaine de la médecine, en particulier pour le traitement de tumeurs par captation du cuivre et/ou du fer.
La diminution du taux de cuivre et/ou du fer dans les organismes est une stratégie intéressante dans le traitement de cancers métastatiques. Si cette diminution peut être proposée par de simples régimes [Counter CM, Brady DC, Turski ML, & Thiele DJ (2015) Methods of treating and preventing cancer by disrupting the binding of copper in the map-kinase pathway 1(19) 0–4], l’idée est surtout d’administrer des médicaments capables de complexer le cuivre. Plusieurs agents chélatants du cuivre ont été testés à ce jour : pénicillamine, trientine, disulfiram, clioquinol et tétramolybdate ainsi que des agents chélatants du fer qui comme pour le cuivre étaient utilisés pour traiter les surcharges métalliques : deferoxamine (DFO), deferiprone (DFP) deferasirox (Gaur et al, Inorganics, 2018, 6, 126). Des résultats intéressants précliniques et cliniques ont été obtenus, mais souvent limités ou associés à des effets secondaires qui pourraient empêcher leur utilisation.
Le cuivre et/ou le fer sont des cations métalliques essentiels à la vie, cependant, de nombreux autres cations métalliques le sont également. Ainsi, l’utilisation de chélateurs trop puissants risque d’affaiblir le patient dans d’autres parties de l’organisme : il s’agit là d’une problématique courante dans l’utilisation de médicaments utilisés en chimiothérapie.
À l’inverse, l’utilisation d’un chélatant peu spécifique, qui possède alors une affinité plus forte pour d'autres métaux bio-essentiels comme le zinc, ou même le manganèse, peut également conduire à des effets secondaires gênants.
Dans les stratégies de traitements par déplétion du cuivre ou du fer, un objectif est donc d’augmenter de plus en plus la constante de chélation et la spécificité au cuivre et/ou au fer, pour limiter les effets secondaires tout en assurant une bonne efficacité. Un autre objectif est de cibler la localisation de cette extraction et capter bien précisément le cuivre et/ou le fer dans la zone tumorale.
Le tétrathiomolybdate, un chélateur du cuivre très efficace in vitro, a montré un effet en particulier sur la suppression de l’angiogenèse et de la croissance tumorale, en induisant une diminution du cuivre accessible [Alvarez HM, Xue Y, Robinson CD, Canalizo-Hernández MA, Marvin RG, Kelly RA, Mondragón A, Penner-Hahn JE, & O’Halloran T V. (2010) Tetrathiomolybdate inhibits copper trafficking proteins through metal cluster formation Science (80- ) 327(5963) 331–334, https://doi.org/10.1126/science.1179907].
Cependant cette utilisation est encore limitée et des effets secondaires indésirables comme des érythèmes, névrites optiques, vomissements et leucopénies, sont observés pendant les traitements, probablement reliés à une extraction non sélective du cuivre dans tout le corps.
Zhou et al ont proposé une association d’un chélateur au sein de polymères qui s’assemblent pour former une capsule permettant d’associer un autre médicament (le resiquimod – R848). Le chélateur utilisé est le TETA. Les particules formées sont de taille importante (plus de 400 kDa de poids moléculaire du RPTDH) et possèdent une capacité d’extraction assez limitée, le complexant étant assez spécifique du cuivre mais de faible stabilité. Ainsi, il a été montré une capacité d’extraction du cuivre pour des teneurs en ions cuivre supérieur à 50 µg/ml, soit 50 ppm (plus d’un ordre de grandeur de la concentration naturelle au sein de nos organismes). [Zhou P, Qin J, Zhou C, Wan G, Liu Y, Zhang M, Yang X, Zhang N, & Wang Y (2019) Multifunctional nanoparticles based on a polymeric copper chelator for combination treatment of metastatic breast cancer Biomaterials 195 86–99, https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2019.01.007]. En outre, dans des expériences précliniques, on a observé qu’après injection, malgré un bon ciblage de la tumeur par les particules, une part importante des nanoparticules s’est retrouvée à 6h dans le foie, la rate, les reins et les poumons et encore dans les poumons à 24h.
Récemment, Wu et al ont proposé l’utilisation de nanoparticules chargées en cuivre pour profiter des possibilités de relargage puis de captation du cuivre pour initier un effet antitumoral [Wu W, Yu L, Jiang Q, Huo M, Lin H, Wang L, Chen Y, & Shi J (2019) Enhanced Tumor-Specific Disulfiram Chemotherapy by in Situ Cu2+ Chelation-Initiated Nontoxicity-to-Toxicity TransitionJ Am Chem Soc 141(29)11531–11539, https://doi.org/10.1021/jacs.9b03503]. La taille de ces particules à base de silice mésoporeuse pégylé en surface est de l’ordre de 165 nm. Les études de biodistribution pour ces grosses particules ont cependant montré une très forte captation dans les poumons, rate, foie et cœur. Outre l’aspect original réversible de la captation du cuivre, les particules présentent une faible capacité de chélation des cations cuivre endogènes.
Feng et al ont proposé l’utilisation de particules mésoporeuses de sulfure de cuivre chargées avec un médicament connu pour sa capacité de complexation du cuivre (la bléomycine). Si cette approche est intéressante du fait des propriétés optiques du sulfure de cuivre pour initier une absorption dans le proche infra-rouge, il faut bien considérer que l’utilisation du sulfure de cuivre, même chargé par un complexant, risque d’entrainer un apport de cuivre excessif dans certaines zones. Pour cette utilisation également, les particules sont de taille importante (119,8 nm en moyenne), afin de pouvoir encapsuler suffisamment de molécules. Feng Q, Zhang W, Li Y, Yang X, Hao Y, Zhang H, Li W, Hou L, & Zhang Z (2017) An intelligent NIR-responsive chelate copper-based anticancer nanoplatform for synergistic tumor targeted chemo-phototherapyNanoscale 9(40)15685–15695, https://doi.org/10.1039/c7nr05003h.
Le déferoxamine (DFO) qui est également utilisé pour le traitement des surcharges métalliques en fer a été le premier chélatant à être utilisé en cancérologie pour un traitement par séquestration du fer. Le DFO a ainsi donné des résultats encourageants pour le traitement de la leucémie et du neuroblastome dans des essais cliniques préliminaires (Wanget al.,Iron and Leukemia, 2019, 38, 406).
Cependant l’utilisation de ces chélates moléculaires est limitée par leur élimination rapide, leur absence de ciblage de la tumeur, leur toxicité à haute dose et les effets secondaires qu’ils entrainent.
Pour pallier ces différents problèmes, plusieurs équipes ont proposés d’associer des chélateurs du fer à des nanoparticules ou d’user des nanoparticules intrinsèquement chélatantes pour le fer. Ainsi J. Perringet al (Journal of Materials Science : Materials in medicine 2018, 29, 181) ont proposé de former des nanoparticules de mélanine qui présente naturellement une chélation pour le fer. Ces particules présentent une taille proche de 220 nm et ont montré leur capacité à capter le fer et à entrainer la mort cellulaire de cellules cancéreuses (rhabdomyosarcome et glioblastome). La taille importante des nanoparticules risque néanmoins d’induire une biodistribution peu adaptée à une utilisation clinique.
Des dispositifs de drug delivery classique à base de liposomes ont également été proposés afin d’améliorer la biodistribution du DFO. C’est ce qu’ont proposé Langet al(ACS Nano, 2019, 13, 2176-2189).Ils ont également associé le DFO au sein de ce liposome à un inhibiteur HIF1α (hypoxia-inducible factor 1α) afin de limiter la surexpression d’HIF1α qui est habituellement observée avec le DFO. L’encapsulation au sein des liposomes a permis d’obtenir des nanoparticules d’une centaine de nanomètres environ. Les essais précliniques in vitro et in vivo sur des modèles rongeurs ont permis de montrer une action antitumorale. Néanmoins en raison de la taille des nanoparticules, une forte accumulation dans le foie et la rate est observée.
Suivant la même logique, M. Theerasilpet al.(RSC Advances, 2017, 7, 11158) ont proposé l’encapsulation d’un autre chélateur du fer à l’intérieur de micelles polymériques. Ces micelles sont formées à partir de polymères présentant une partie hydrophobe pour constituer le cœur de la micelle et une partie hydrophile pour assurer la stabilité colloïdale. Ces micelles ont montré une activité anticancéreuse sur différentes lignées cellulaires et présentent des tailles autour de 25 nm ainsi qu’un relargage en fonction du chélateur en fonction du pH.
De toutes ces études, force est de constater qu’il n’existe pas à l’heure actuelle de solutions permettant à la fois un ciblage efficace et spécifique des tumeurs et une chélation locale du cuivre et/ou du fer endogène suffisante pour une utilisation dans le traitement de tumeurs, notamment par l’administration de nanoparticules dans des concentrations efficaces de l’ordre du mg/l.
Un autre objectif de la présente divulgation est de fournir un composé permettant la captation du cuivre et/ou du fer non seulement lors de sa circulation sanguine générale, mais également plus spécifiquement au sein de zones tumorales. En particulier, un objectif de la présente divulgation est de fournir un composé permettant de capter dans la zone tumorale plus de 10 µmole de cuivre et/ou de fer par litre voire plus de 100 µmole de cuivre et/ou de fer par litre, c’est-à-dire capter localement de 100 à 10 000 ppb de cuivre ou de fer.
Un autre objectif de la présente divulgation est de fournir un composé permettant une chélation avec une grande spécificité vis-à-vis du cuivre et/ou du fer et un temps de résidence dans les zones tumorales suffisamment élevé, notamment de plusieurs jours, voire plusieurs semaines.
Un autre objectif de la présente divulgation est de pouvoir libérer localement des ions qui viendraient se substituer au cuivre et/ou au fer dans l’organisme en neutralisant ainsi son effet.
Un autre objectif de la présente divulgation est de fournir un composé dont la taille est suffisamment faible et permettant un ciblage de nombreuses tumeurs solides, y compris les métastases, et en particulier les métastases osseuses.
Un autre objectif de la présente divulgation est de fournir un composé permettant à la fois la captation du cuivre et/ou du fer dans les tumeurs et de fournir un effet radiosensibilisant pour un traitement par radiothérapie. Ainsi, pendant l’irradiation, la captation localisée des biométaux devrait perturber les mécanismes de réparation cellulaire et amplifier les effets de la radiothérapie.
La présente divulgation vient améliorer la situation vis-à-vis d’un ou plusieurs de ces objectifs énoncés ci-dessus.
Il est en effet proposé d’utiliser des nanoparticules chélatantes présentant une biodistribution adaptée et des caractéristiques thermodynamiques et cinétiques appropriée à un traitement de tumeurs, notamment de tumeurs primaires et/ou métastatiques.
Selon un premier aspect, il est proposé une nanoparticule de formule suivante :
[Ch1]n-PS-[Ch2]mdans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Ch1 est un groupement chélatant non complexé ou complexé avec un cation métallique M1,
- M1 est absent ou choisi parmi les cations métalliques dont la constante de complexation avec Ch1 est inférieure à celle du cuivre et/ou du fer, en particulier au moins dix fois inférieure, par exemple M1 est choisi parmi le zinc ou les alcalino-terreux, notamment le calcium ou le magnésium,
- Ch2 est un groupement chélatant, identique ou différent du groupement chélatant Ch1, et complexé à un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50,
caractérisé en ce que
(i) les groupements chélatants Ch1 et Ch2 sont greffés sur la matrice de polymères PS,
(ii) le ratio n/(n+m) est compris entre 10% et 100%, de préférence entre 40% et 60%, et,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm.
[Ch1]n-PS-[Ch2]mdans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Ch1 est un groupement chélatant non complexé ou complexé avec un cation métallique M1,
- M1 est absent ou choisi parmi les cations métalliques dont la constante de complexation avec Ch1 est inférieure à celle du cuivre et/ou du fer, en particulier au moins dix fois inférieure, par exemple M1 est choisi parmi le zinc ou les alcalino-terreux, notamment le calcium ou le magnésium,
- Ch2 est un groupement chélatant, identique ou différent du groupement chélatant Ch1, et complexé à un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50,
caractérisé en ce que
(i) les groupements chélatants Ch1 et Ch2 sont greffés sur la matrice de polymères PS,
(ii) le ratio n/(n+m) est compris entre 10% et 100%, de préférence entre 40% et 60%, et,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm.
Selon un autre aspect, il est proposé une solution colloïdale de nanoparticules comme définies ci-dessus.
Selon un autre aspect, il est proposé une composition pharmaceutique comprenant ladite solution colloïdale de nanoparticules et un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
Les caractéristiques exposées dans les paragraphes suivants peuvent, optionnellement, être mises en œuvre. Elles peuvent être mises en œuvre indépendamment les unes des autres ou en combinaison les unes avec les autres :
Dans un mode de réalisation, le groupement chélatant Ch1 est choisi parmi ceux ayant une constante de complexation par rapport au cuivre (II) supérieure à 1015.
Dans un mode de réalisation, le groupement chélatant Ch1 est choisi parmi ceux ayant une constante de complexation avec le cuivre (II) au moins 10 fois supérieure à leur constante de complexation avec le zinc et au moins 106fois supérieure à leurs constantes de complexation avec le magnésium et le calcium.
Dans un autre mode de réalisation, le groupement chélatant Ch1 est choisi parmi ceux ayant une constante de complexation avec le fer (II) au moins 10 fois supérieure à leur constante de complexation avec le zinc et au moins 106fois supérieure à leurs constantes de complexation avec le magnésium et le calcium.
Dans un mode de réalisation, au moins 50% des Ch1 est complexé avec un cation métallique choisi parmi les alcalino-terreux.
Dans un mode de réalisation, au moins 50% des Ch1 est complexé avec le zinc, le calcium ou le magnésium.
Dans un mode de réalisation, le groupement chélatant Ch1, et le cas échéant Ch2, est choisi parmi les agents macrocycliques, de préférence parmi l’acide 1,4,7-triazacyclononanetriacétique (NOTA), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-l,4,7,10-tetraacétique (DOTA), l’acide 1,4,7-triazacyclononane-l-glutarique-4,7-acide diacetique (NODAGA), et l’acide 1,4,7,10-tetraazacyclododececane,1-(glutaric acid)-4,7,10-triacetique (DOTAGA), 2,2’,2’’,2’’’-(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrayl)tetraacetamide (DOTAM), et 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan (Cyclam), et 1,4,7,10-tetraazacyclododecane (Cyclen) et le déferoxamine (DFO) ou autre agent chélatant du fer.
Dans un mode de réalisation, le groupement chélatant Ch1 est le DOTAGA de formule (I) suivante [Chem. 1]
(I)
(I)
Dans un mode de réalisation, PS est une matrice de polysiloxane.
Dans un mode de réalisation, la nanoparticule est caractérisée en ce que
- le ratio poids en silicium sur le poids total de la nanoparticule est compris entre 5% et 25%,
- le nombre total n+m de groupements chélatants greffés sur le polymère est compris entre 5 et 50 par nanoparticule, de préférence entre 10 et 30, et,
- la nanoparticule a un diamètre moyen compris entre 2 et 8 nm.
- le ratio poids en silicium sur le poids total de la nanoparticule est compris entre 5% et 25%,
- le nombre total n+m de groupements chélatants greffés sur le polymère est compris entre 5 et 50 par nanoparticule, de préférence entre 10 et 30, et,
- la nanoparticule a un diamètre moyen compris entre 2 et 8 nm.
Dans un mode de réalisation, la nanoparticule est fonctionnalisée avec un agent de ciblage, en particulier un peptide, une immunoglobuline, un nanobody, un anticorps, un aptamère ou une protéine ciblante.
Dans un mode de réalisation, le cation métallique M2 est choisi parmi des agents radiosensibilisants et/ou des agents de contraste pour l’imagerie par résonance magnétique, en particulier le gadolinium ou le bismuth.
Dans un mode de réalisation, la nanoparticule est caractérisée en ce que
(i) PS est une matrice de polysiloxane,
(ii) Ch1 et Ch2 comprennent des groupements chélatants DOTAGA de formule (I) suivante [Chem. 1]
(I)
greffés à la matrice de polysiloxane par liaison covalente,
(iii) M1 est absent et M2 est le cation gadolinium Gd3+,
(iv) n+m est compris entre 5 et 50, de préférence entre 10 et 30, et
(v) le diamètre hydrodynamique moyen est compris entre 2 et 8 nm.
(i) PS est une matrice de polysiloxane,
(ii) Ch1 et Ch2 comprennent des groupements chélatants DOTAGA de formule (I) suivante [Chem. 1]
(I)
greffés à la matrice de polysiloxane par liaison covalente,
(iii) M1 est absent et M2 est le cation gadolinium Gd3+,
(iv) n+m est compris entre 5 et 50, de préférence entre 10 et 30, et
(v) le diamètre hydrodynamique moyen est compris entre 2 et 8 nm.
Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique est caractérisée en ce qu’il s’agit d’une composition injectable pour une administration intraveineuse, intratumorale ou intrapulmonaire chez un sujet, en particulier comprenant une quantité efficace de groupement chélatant Ch1 pour la captation in vivo du cuivre et/ou du fer dans une tumeur, le chélatant libre étant par exemple à une concentration d’au moins 10 mM dans la composition.
Dans un mode de réalisation, la présente divulgation fournit une composition pharmaceutique pour son utilisation dans le traitement du cancer chez un sujet, en particulier pour la captation in vivo du cuivre et/ou du fer dans une tumeur. En particulier, dans ce mode de réalisation, ladite composition pharmaceutique peut comprendre une quantité efficace de cation métallique M2, de préférence du gadolinium, pour une utilisation en tant qu’agent radiosensibilisant et le sujet est traité par radiothérapie après administration de ladite composition.
D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels :
Fig. 1
Fig. 2
Fig. 3
Fig. 4
Fig. 5
Fig. 6
Fig. 7
Fig. 8
Fig. 9
Fig. 10
Les dessins et la description ci-après contiennent, pour l’essentiel, des éléments de caractère certain. Ils pourront donc non seulement servir à mieux faire comprendre la présente divulgation, mais aussi contribuer à sa définition, le cas échéant.
Nanoparticules
La présente divulgation concerne ainsi des nanoparticules de formule suivante :
[Ch1]n-PS-[Ch2]mdans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Ch1 est un groupement chélateur non complexé ou complexé avec un cation métallique M1,
- M1 est absent ou choisi parmi les cations métalliques dont la constante de complexation avec Ch1 est inférieure à celle du cuivre et/ou du fer, en particulier au moins dix fois inférieure, par exemple M1 est choisi parmi le zinc ou les alcalino-terreux, notamment le calcium ou le magnésium,
- Ch2 est un groupement chélateur, identique ou différent du groupement chélateur Ch1, et complexé à un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50,
caractérisé en ce que
(i) les groupements chélateurs Ch1 et Ch2 sont greffés sur la matrice PS de polymères,
(ii) le ratio n/(n+m) est compris entre 10% et 100%, de préférence entre 40% et 60%, et,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm.
[Ch1]n-PS-[Ch2]mdans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Ch1 est un groupement chélateur non complexé ou complexé avec un cation métallique M1,
- M1 est absent ou choisi parmi les cations métalliques dont la constante de complexation avec Ch1 est inférieure à celle du cuivre et/ou du fer, en particulier au moins dix fois inférieure, par exemple M1 est choisi parmi le zinc ou les alcalino-terreux, notamment le calcium ou le magnésium,
- Ch2 est un groupement chélateur, identique ou différent du groupement chélateur Ch1, et complexé à un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50,
caractérisé en ce que
(i) les groupements chélateurs Ch1 et Ch2 sont greffés sur la matrice PS de polymères,
(ii) le ratio n/(n+m) est compris entre 10% et 100%, de préférence entre 40% et 60%, et,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm.
Les nanoparticules selon la présente divulgation sont avantageusement des particules de taille de l’ordre du nanomètre. En particulier, les nanoparticules sont suffisamment petites pour cibler les cellules tumorales par effet EPR via le système vasculaire et être éliminées rapidement par les reins, après leur administration par voie intraveineuse.
Selon la présente divulgation, on utilisera plus préférentiellement des nanoparticules de très faible diamètre par exemple, compris entre 1 et 10 nm, de préférence entre 2 et 8 nm.
La distribution de taille des nanoparticules est par exemple mesurée à l’aide d’un granulomètre commercial, tel qu’un granulomètre Malvern Zetasizer Nano-S basé sur la PCS (Photon Correlation spectroscopy). Cette distribution est caractérisée par un diamètre hydrodynamique moyen.
Au sens de l’invention, par « diamètre » des nanoparticules, on entend ainsi le diamètre hydrodynamique moyen, c’est-à-dire, la moyenne harmonique des diamètres des particules. Une méthode de mesure de ce paramètre est également décrite dans la norme ISO 13321:1996.
Les nanoparticules selon la présente divulgation sont des nanoparticules comprenant une matrice PS de polymère organique ou inorganique.
Dans certains modes de réalisation, le polymère de la matrice PS est choisi parmi les polymères biocompatibles tels que le polyéthylène glycol, le polyéthylèneoxide, polyacrylamide, biopolymères, polysaccharides ou les polysiloxane, ou leurs mélanges, de préférence le polymère PS est un polysiloxane.
Par « nanoparticules comprenant une matrice de polymères de polysiloxane », on entend en particulier des nanoparticules caractérisées par un pourcentage massique en silicium d’au moins 5%, par exemple entre 5 et 20% de la masse totale de la nanoparticule.
Par « polysiloxane », on désigne un polymère réticulé inorganique consistant en un enchainement de siloxanes. Les unités structurales du polysiloxane, identiques ou différentes, sont de formule suivante : Si(OSi)nR4-n dans laquelle
- R est une molécule organique liée au silicium par une liaison covalente Si-C
- n est un entier compris entre 1 et 4.
- R est une molécule organique liée au silicium par une liaison covalente Si-C
- n est un entier compris entre 1 et 4.
A titre d’exemple préféré, le terme « polysiloxane » englobe notamment les polymères issus de la condensation par procédé sol gel de tetraéthylorthosilicate (TEOS) et de aminopropyltriethoxysilane (APTES).
Par « groupement chélatant », au sens de la présente divulgation, on entend un groupement organique capable de complexer un cation métallique. De préférence, lesdits groupements chélatants ci-dessus sont liés directement ou indirectement par liaison covalente aux siliciums de polysiloxanes de la matrice PS des nanoparticules. Par liaison « indirecte », on entend la présence d’un « linker » moléculaire ou « espaceur » entre la nanoparticule et le groupement chélatant, ledit linker ou espaceur étant lié de manière covalente à l’un des constituants de la nanoparticule.
Le groupement chélatant Ch1 a en particulier pour fonction de capter le cuivre endogène ou le fer endogène. Dans un mode de réalisation, pour permettre la captation in vivo du cuivre, on choisira avantageusement un groupement chélatant Ch1 parmi ceux ayant une constante de complexation par rapport au cuivre (II) supérieure à 1015, par exemple supérieur à 1020.
Dans un mode de réalisation, pour permettre la captation in vivo du fer, on choisira avantageusement un groupement chélatant Ch1 parmi ceux ayant une constante de complexation par rapport au fer (II) supérieure à 1015, par exemple supérieur à 1020.
Dans un mode de réalisation, le groupement chélatant Ch1 est libre, ou complexé (en partie au moins) avec un cation métallique M1. Dans ce cas, le cation métallique M1 est complexé à un groupement chélateur choisi judicieusement pour permettre la transmétallation in vivo du cation métallique M1 avec le cuivre et/ou le fer. Ainsi, dans un mode de réalisation spécifique, le groupement chélatant Ch1 est avantageusement choisi parmi ceux ayant une constante de complexation avec le cuivre (II) ou le fer au moins 10 fois supérieure à leur constante de complexation avec le zinc et au moins 106fois supérieure à leurs constantes de complexation avec le magnésium et le calcium.
Le groupement chélatant Ch1 peut être obtenu par greffage (liaison covalente) sur la nanoparticule d’agents macrocycliques, de préférence choisis parmi DOTA (acide 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-N,N’,N’’,N’’’-téracétique), NOTA (acide 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacétique), NODAGA (acide 1,4,7-triazacyclononane-1-glutarique-4,7-acide diacétique), DOTAGA (acide 2-(4,7,10-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tétraazacyclododécan-1-yl)pentanedioïque), DOTAM (1,4,7,10-tetrakis(carbamoylméthyl)-1,4,7,10 tétraazacyclododécane) et 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan (Cyclam), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane (Cyclen), le déferoxamine. Le déferoxamine est plus particulièrement intéressant en vue de la captation du fer.
Dans un mode de réalisation, en particulier dans les modes de réalisation décrits aux deux paragraphes précédents, le cation métallique M1 complexé avec le groupement chélatant Ch1 est choisi parmi le zinc, ou les alcalino-terreux, en particulier le magnésium ou le calcium. De préférence, au moins 50%, 60%, 70%, 80%, voire au moins 90% des Ch1 est complexé avec le zinc, le calcium ou le magnésium ou un autre alcalino-terreux.
Dans un mode préféré, le groupement chélatant Ch1 est le DOTAGA de formule (I) suivante [Chem. 1]
(I)
(I)
Selon la présente divulgation, le groupement chélatant Ch2, identique ou différent de Ch1, est complexé à un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50. Ainsi une nanoparticule comprend, greffé sur la matrice de polymère PS, un ou plusieurs groupements Ch1 complexés ou non avec un cation métallique M1, par exemple du zinc, du magnésium, du calcium, ou autres alcalino-terreux, et un ou plusieurs groupements Ch2 complexés avec un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé, supérieur à 40.
Le groupement chélateur Ch2 est ainsi choisi de préférence parmi les groupements chélateurs dont la constante de complexation avec le cation métallique M2 est supérieure à 1015, voire supérieure à 1020. Dans un mode de réalisation particulier, les cations métalliques M2 sont choisis parmi ceux permettant d’utiliser ladite nanoparticule comme agent radiosensibilisant.
Au sens de la présente divulgation, on entend par « agent radiosensibilisant » un composé permettant de rendre les cellules cancéreuses plus sensibles aux rayons utilisés en radiothérapie.
Le groupement chélatant Ch2, identique ou différent de Ch1 peut être choisi également parmi les agents macrocycliques, et de préférence parmi DOTA (acide 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-N,N’,N’’,N’’’-téracétique), NOTA (acide 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacétique), NODAGA (acide 1,4,7-triazacyclononane-1-glutarique-4,7-acide diacétique), DOTAGA (acide 2-(4,7,10-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tétraazacyclododécan-1-yl)pentanedioïque), DOTAM (1,4,7,10-tetrakis(carbamoylméthyl)-1,4,7,10 tétraazacyclododécane) et 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan (Cyclam), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane (Cyclen), et le déferoxamine (DFO).
Plus particulièrement, les cations métalliques M2 sont choisis parmi les métaux lourds, de préférence parmi le groupe constitué de : Pt, Pd, Sn, Ta, Zr, Tb, Tm, Ce, Dy, Er, Eu, La, Nd, Pr, Lu, Yb, Bi, Hf, Ho, Sm, In et Gd, ou un mélange de ces derniers. De préférence, les cations métalliques M2 sont du Bi et/ou Gd.
Dans un mode de réalisation particulier, la nanoparticule pour l’utilisation selon l’invention comprend entre 3 et 100, de préférence entre 5 et 20 cations métalliques M2, en particulier de Bi et/ou Gd.
La nanoparticule selon l’invention permet à la fois la captation du cuivre et/ou du fer, par le groupement chélatant Ch1 et/ou l’imagerie ou le traitement de tumeurs, par le groupement chélatant Ch2 complexé avec un cation métallique M2 présentant des propriétés d’agent de contraste ou d’agent radiosensibilisant ou d’agent pour la curiethérapie.
A titre d’exemples de cation métallique M2 utilisable comme agent de contraste IRM, on citera Gd, Dy, Mn et Fe.
A titre d’exemples de cation métallique M2 utilisable comme agent radiosensibilisant, on citera le Gd, Lu, Yb et Bi, Hf et Ho, de préférence le gadolinium ou le bismuth.
L’homme du métier sélectionnera le ratio n/(n+m) en fonction de l’effet souhaité, et notamment en fonction du traitement souhaité, du type de patients, de la dose utilisée, et/ou du patient à traiter. Par exemple, le ratio n/(n+m) est supérieur ou égal à 20% ; notamment compris entre 20% et 100%, de préférence compris entre 40% et 60%. Dans un mode de réalisation, n/(n+m) est égal à 100%. C’est-à-dire, m, représentant le nombre d’agent chélatant Ch2 complexé avec un cation métallique M2 est égal à 0, et 100% des groupements chélatants Ch sont complexés à un cation métallique M1 ou non complexés.
Dans un mode plus particulier, le groupement chélateur Ch1 est identique au groupement chélatant Ch2 et correspond au DOTAGA de formule (I) suivante [Chem. 1]
(I)
greffé sur une matrice PS de la nanoparticule, par exemple une matrice de polysiloxane.
(I)
greffé sur une matrice PS de la nanoparticule, par exemple une matrice de polysiloxane.
Dans un autre mode plus particulier, le groupement chélatant Ch1 est identique au groupement chélatant Ch2 et correspond au DOTA de formule suivante [Chem. 2]
(II)
greffé sur une matrice PS de la nanoparticule, par exemple une matrice de polysiloxane.
(II)
greffé sur une matrice PS de la nanoparticule, par exemple une matrice de polysiloxane.
Ainsi ; dans un mode de réalisation, la présente divulgation concerne une nanoparticule [Ch1]n-PS-[Ch2]mdans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Ch1 est le DOTA ou DOTAGA non complexé ou complexé avec un cation métallique M1,
- M1 est absent ou choisi parmi les cations métalliques dont la constante de complexation avec Ch1 est inférieure à celle du cuivre et/ou du fer, en particulier au moins dix fois inférieure, par exemple M1 est choisi parmi le zinc ou les alcalino-terreux, notamment le calcium ou le magnésium,
- Ch2, identique à Ch1, est le DOTA ou DOTAGA et complexé à un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50, de préférence Gd,
caractérisé en ce que
(i) les groupements chélatants Ch1 et Ch2 sont greffés sur la matrice de polymères,
(ii) le ratio n/(n+m) est compris entre 10% et 100%, de préférence entre 40% et 60%,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm.
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Ch1 est le DOTA ou DOTAGA non complexé ou complexé avec un cation métallique M1,
- M1 est absent ou choisi parmi les cations métalliques dont la constante de complexation avec Ch1 est inférieure à celle du cuivre et/ou du fer, en particulier au moins dix fois inférieure, par exemple M1 est choisi parmi le zinc ou les alcalino-terreux, notamment le calcium ou le magnésium,
- Ch2, identique à Ch1, est le DOTA ou DOTAGA et complexé à un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50, de préférence Gd,
caractérisé en ce que
(i) les groupements chélatants Ch1 et Ch2 sont greffés sur la matrice de polymères,
(ii) le ratio n/(n+m) est compris entre 10% et 100%, de préférence entre 40% et 60%,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm.
Dans un mode particulier et préféré, (n+m) correspondant au nombre de groupements chélatants Ch1 et Ch2 greffés par nanoparticule (optionnellement Ch1 et Ch2 étant le DOTA ou DOTAGA) est compris entre 3 et 100, de préférence entre 5 à 50, et par exemple entre 10 et 30.
Outre la fonctionnalisation chélatante, les nanoparticules selon la présente divulgation peuvent être modifiées (fonctionnalisation) en surface par des composés hydrophiles (PEG) et/ou chargées différemment pour adapter leur bio-distribution au sein de l'organisme et/ou des molécules ciblantes pour permettre un ciblage cellulaire spécifique, en particulier pour le ciblage de tissus ou cellules tumorales spécifiques. Les agents de ciblage sont greffés à la matrice de polymères et sont présents préférentiellement dans une proportion comprise entre 1 et 20 agents de ciblages par nanoparticule et de préférence entre 1 et 5 agents de ciblages.
Pour le greffage en surface des molécules ciblantes, on pourra utiliser un couplage classique avec des groupes réactifs présents, éventuellement précédé d’une étape d’activation. Les réactions de couplage sont connues de l’homme du métier et seront choisies en fonction de la structure de la couche superficielle de la nanoparticule et des groupements fonctionnels de la molécule ciblante. Voir par exemple, « Bioconjugate Techniques », G.T Hermanson, Academic Press, 1996, dans « Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity », Second Edition, W.T. Mason, ed. Academic Press, 1999. Des méthodes de couplage préférées sont décrites plus loin. De préférence, ces molécules ciblantes sont greffées aux liaisons amines des nanoparticules selon la variante des nanoparticules ultrafines ou AGuIX telle que décrite au paragraphe suivant. On choisira les molécules ciblantes en fonction de l’application envisagée.
Dans un mode de réalisation spécifique, les nanoparticules sont fonctionnalisées avec un agent de ciblage, tel qu’un peptide, une immunoglobuline, un nanobody, fragment VHH ou « single domain », un anticorps, un aptamère ou tout autre protéine ciblante, par exemple des zones tumorales, typiquement un anticorps, immunoglobuline ou nanobody ciblant des antigènes associés à des tumeurs (« tumor-associated antigens ») ou certains marqueurs cancéreux connus de l’homme du métier.
Nanoparticules ultrafines et nanoparticules AGuIX
Dans un mode de réalisation plus particulièrement préféré, en raison notamment de leur très faible dimension et leur stabilité, les nanoparticules utilisables sont des nanoparticules comprenant une matrice PS de polysiloxane et qui ne comprennent pas de cœur à base d’oxyde métallique, à la différence des nanoparticules de type cœur-coquille comprenant un cœur à base d’oxyde métalliques et un enrobage de polysiloxane (qui sont décrites notamment dans WO2005/088314 et WO2009/053644).
Aussi, dans un mode de réalisation spécifique, les nanoparticules selon la présente divulgation sont des nanoparticules à base de polysiloxane chélaté au gadolinium, de formule [Ch1]n-PS-[Ch2]m, dans laquelle
(i) PS est une matrice de polysiloxane,
(ii) Ch1 et Ch2 sont des groupements chélatants DOTAGA de formule (I) suivante [Chem. 1]
(I)
(i) PS est une matrice de polysiloxane,
(ii) Ch1 et Ch2 sont des groupements chélatants DOTAGA de formule (I) suivante [Chem. 1]
(I)
et greffés a la matrice de polysiloxane par liaison covalente,
(iii) M1 est absent et M2 est le cation gadolinium Gd3+,
(iv) n+m est compris entre 5 et 50, de préférence entre 10 et 30, et
(iv) le diamètre hydrodynamique moyen est compris entre 2 et 8 nm.
(iii) M1 est absent et M2 est le cation gadolinium Gd3+,
(iv) n+m est compris entre 5 et 50, de préférence entre 10 et 30, et
(iv) le diamètre hydrodynamique moyen est compris entre 2 et 8 nm.
Plus spécifiquement, ces nanoparticules à base de polysiloxane chélaté au gadolinium sont des nanoparticules ultrafines obtenues à partir de nanoparticules AGuIX comme matériel de départ.
De telles nanoparticules ultrafines AGuIX peuvent être obtenues par une méthode de synthèse top-down décrites notamment dans Mignot et al Chem Eur J 2013 « A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica nanoparticles for theranostic applications » DOI: 10.1002/chem.201203003.
D’autres procédés de synthèse des nanoparticules ultrafines sont également décrits dans WO2011/135101, WO2018/224684 et WO2019/008040.
Les nanoparticules AGuIX, qui peuvent servir de matériel de départ pour obtenir les nanoparticules selon la présente divulgation ont en particulier la formule (III) suivante [Chem. 3]
(III)
dans laquelle PS est une matrice de polysiloxane, et n est en moyenne, entre 10 et 50, et les nanoparticules présentent un diamètre hydrodynamique moyen de 4 ±2 nm et une masse d’environ 10 kDa.
(III)
dans laquelle PS est une matrice de polysiloxane, et n est en moyenne, entre 10 et 50, et les nanoparticules présentent un diamètre hydrodynamique moyen de 4 ±2 nm et une masse d’environ 10 kDa.
Les nanoparticules AGuIX peuvent également être caractérisées par la formule (IV) suivante [Chem. 4]
(GdSi4-7C24-30N5-8O15-25H40-60, 5-10 H2O)x
(IV)
Procédé de synthèse des nanoparticules selon la présente divulgation
(GdSi4-7C24-30N5-8O15-25H40-60, 5-10 H2O)x
(IV)
Procédé de synthèse des nanoparticules selon la présente divulgation
Les nanoparticules selon la présente divulgation peuvent être obtenues par le procédé de préparation d’une solution colloïdale de nanoparticules comprenant des groupements chélatants greffés sur une matrice de polymère, une partie seulement des groupements chélatants étant complexés à un cation métallique, l’autre partie étant non complexée, ledit procédé comprenant
(1) la synthèse ou la fourniture, à titre de matériel de départ, d’une solution colloïdale de nanoparticules NP1 de formule suivante [Ch2]n-PS dans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Ch2 est un groupement chélatant complexé à un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50,
caractérisé en ce que
(i) Ch2 est greffé sur la matrice de polymères,
(ii) n est compris entre 5 et 100, et,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule NP1 est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm
(2) une étape de traitement de la solution colloïdale de nanoparticules NP1 dans un milieu acide, par exemple en ajoutant une solution d’acide chlorhydrique, afin d’obtenir un pH inférieur à 2,0, de préférence inférieur à 1,0 pendant une durée suffisante pour obtenir un relargage partiel ou complet des cations métalliques M2,
(3) le cas échéant, une étape de dilution de la solution, par exemple avec de l’eau,
(4) une étape de purification pour séparer les nanoparticules obtenues à l’étape (2) des cations métalliques M2 libres,
(5) le cas échéant une étape de concentration de la solution des nanoparticules obtenues à l’étape (4),
(6) le cas échéant la répétition des étapes (3), (4) et (5),
(7) le cas échéant, la congélation et/ou la lyophilisation de la solution de nanoparticules obtenues à l’une des étapes (4), (5) ou (6).
(1) la synthèse ou la fourniture, à titre de matériel de départ, d’une solution colloïdale de nanoparticules NP1 de formule suivante [Ch2]n-PS dans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Ch2 est un groupement chélatant complexé à un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50,
caractérisé en ce que
(i) Ch2 est greffé sur la matrice de polymères,
(ii) n est compris entre 5 et 100, et,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule NP1 est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm
(2) une étape de traitement de la solution colloïdale de nanoparticules NP1 dans un milieu acide, par exemple en ajoutant une solution d’acide chlorhydrique, afin d’obtenir un pH inférieur à 2,0, de préférence inférieur à 1,0 pendant une durée suffisante pour obtenir un relargage partiel ou complet des cations métalliques M2,
(3) le cas échéant, une étape de dilution de la solution, par exemple avec de l’eau,
(4) une étape de purification pour séparer les nanoparticules obtenues à l’étape (2) des cations métalliques M2 libres,
(5) le cas échéant une étape de concentration de la solution des nanoparticules obtenues à l’étape (4),
(6) le cas échéant la répétition des étapes (3), (4) et (5),
(7) le cas échéant, la congélation et/ou la lyophilisation de la solution de nanoparticules obtenues à l’une des étapes (4), (5) ou (6).
Un tel procédé permet d’obtenir les nanoparticules [Ch1]n-PS-[Ch2]mdans lesquelles Ch1 et Ch2 sont identiques. Le procédé permet ainsi avantageusement d’obtenir un relargage partiel ou complet des cations métalliques M2, initialement complexé au groupement chélatant Ch2 sur la nanoparticule NP1. L’homme du métier pourra moduler le degré de relargage des cations métalliques M2, et donc le ratio n/(n+m) moyen dans la solution finale, en jouant notamment sur le pH et la durée de l’étape (2) de traitement.
Dans un mode de réalisation préféré, les nanoparticules NP1 sont des nanoparticules ultrafines ou AGuIX comme définies à la section précédente et complexées avec le cation gadolinium. Des modes de réalisation spécifiques sont donnés dans les Exemples. Typiquement, la durée du traitement de l’étape (2) peut être comprise entre 0,5 et 8 heures, par exemple entre 2 et 6 heures à pH inférieur à 1,0.
Les nanoparticules obtenues selon le procédé ci-dessus peuvent le cas échéant être ensuite fonctionnalisées par d’autres groupements chélatants, différent de Ch2 et/ou des agents de ciblage ou molécules hydrophiles.
Dans un mode de réalisation, les nanoparticules obtenues selon le procédé ci-dessus sont mis en présence de cation métallique M1, afin d’obtenir la complexation d’une partie au moins des groupements chélatants libres avec le cation métallique M1, de sorte à obtenir les nanoparticules de formule suivante :
[Ch1]n-PS-[Ch2]mdans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Ch1 est un groupement chélatant en partie complexé avec un cation métallique M1,
- M1 est choisi parmi les cations métalliques dont la constante de complexation avec Ch1 est inférieure à celle du cuivre et/ou du fer, en particulier au moins dix fois inférieure, par exemple M1 est choisi parmi le zinc, le calcium ou la magnésium ou autres alcalino-terreux,
- Ch2 est un groupement chélatant, identique à Ch1, et complexé à un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50,
caractérisé en ce que
(i) les groupements chélatants Ch1 et Ch2 sont greffés sur la matrice de polymères,
(ii) le ratio n/(n+m) est compris entre 10% et 100%, de préférence entre 40% et 60%, et,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm.
Formulations pharmaceutiques des nanoparticules selon la présente divulgation
[Ch1]n-PS-[Ch2]mdans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Ch1 est un groupement chélatant en partie complexé avec un cation métallique M1,
- M1 est choisi parmi les cations métalliques dont la constante de complexation avec Ch1 est inférieure à celle du cuivre et/ou du fer, en particulier au moins dix fois inférieure, par exemple M1 est choisi parmi le zinc, le calcium ou la magnésium ou autres alcalino-terreux,
- Ch2 est un groupement chélatant, identique à Ch1, et complexé à un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50,
caractérisé en ce que
(i) les groupements chélatants Ch1 et Ch2 sont greffés sur la matrice de polymères,
(ii) le ratio n/(n+m) est compris entre 10% et 100%, de préférence entre 40% et 60%, et,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm.
Formulations pharmaceutiques des nanoparticules selon la présente divulgation
Les compositions comprenant les nanoparticules selon la présente divulgation sont administrées sous la forme de suspensions colloïdales de nanoparticules. Elles peuvent être préparées comme décrits ici ou selon d’autres méthodes connues de l’homme du métier et administrées via différentes voies, locale ou systémique, selon le traitement et la zone à traiter.
Aussi, la présente divulgation porte sur une suspension colloïdale de nanoparticules de formule [Ch1]n-PS-[Ch2]mtelles que décrites aux sections précédentes et les compositions pharmaceutiques comprenant ces suspensions colloïdales, le cas échéant, en association avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
Les compositions pharmaceutiques peuvent être en particulier formulées sous la forme de poudres lyophilisées, ou de solutions aqueuses pour une injection intraveineuse. Dans un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique comprend une solution colloïdale avec une quantité thérapeutiquement efficace de nanoparticules de formule [Ch1]n-PS-[Ch2]mtelles que décrites aux sections précédentes, en particulier des nanoparticules à base de polysiloxane chélaté au gadolinium, et plus précisément, telles qu’obtenues à partir de nanoparticules AGuIX comme décrit plus haut.
Dans certains modes de réalisations, il s’agit de poudre lyophilisée, comprenant entre 200 mg et 15 g par flacon, de préférence entre 250 et 1250 mg de nanoparticules. La poudre peut comprendre en outre d’autres excipients, et notamment du CaCl2.
Les poudres lyophilisées peuvent être reconstituées dans une solution aqueuse, typiquement de l’eau stérile pour injection. Ainsi, la présente divulgation porte sur une composition pharmaceutique pour son utilisation comme solution pour injection, comprenant à titre de principe actif, les nanoparticules de formule [Ch1]n-PS-[Ch2]mtelles que décrites aux sections précédentes, en particulier des nanoparticules à base de polysiloxane chélaté au gadolinium, et plus précisément, telles qu’obtenues à partir de nanoparticules AGuIX comme décrit plus haut.
Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique est caractérisée en ce qu’il s’agit d’une composition injectable pour une administration intraveineuse ou intratumorale ou un aérosol pour un administration intrapulmonaire, en particulier comprenant une quantité efficace de groupement chélatant Ch1 pour la captation in vivo du cuivre et/ou du fer dans la tumeur, le chélatant Ch1 étant par exemple à une concentration d’au moins 10 mM dans la composition.
Par exemple, pour ses utilisations comme décrites ci-après, en particulier pour le traitement de tumeur par la captation in vivo de cuivre et/ou du fer, la composition est une solution injectable comprenant des nanoparticules à base de polysiloxane chélaté au gadolinium dans une concentration comprise entre 50 et 200 mg/ml, par exemple entre 80 et 120 mg/mL.
Utilisations des nanoparticules
Du fait de la présence de groupements chélatants Ch1 libres ou complexés avec des cations métalliques M1, les nanoparticules selon la présente invention permettent la captation du cuivre et/ou du fer endogène après leur administration chez un sujet qui en a besoin. Par captation endogène du cuivre, on entend de préférence la captation locale d’une quantité comprise entre 100 ppb (0.1 mg de cuivre par litre) et 10 000 ppb (10 mg de cuivre par litre) du cuivre endogène. Ainsi, la présente divulgation vise plus particulièrement un procédé de captation du cuivre endogène chez un sujet, en particulier un sujet souffrant de cancer.
Par captation endogène du fer, on entend de préférence la captation locale d’une quantité comprise entre 100 ppb (0.1 mg de fer par litre) et 10 000 ppb (10 mg de fer par litre) du fer endogène. Ainsi, la présente divulgation vise plus particulièrement un procédé de captation du fer endogène chez un sujet, en particulier un sujet souffrant de cancer.
Dans le cas d’une administration des nanoparticules par voie intraveineuse, ou pulmonaire, la captation du cuivre et/ou du fer peut se faire faire au sein de la circulation sanguine générale puis après au sein des tumeurs, après accumulation des nanoparticules dans les tumeurs, notamment par ciblage passif lié à l’effet EPR. Cet effet de ciblage passif des tumeurs et d’accumulation a été bien mis en évidence en particulier par les nanoparticules ultrafines de type AGuIX.
La divulgation porte donc également sur un procédé de traitement de tumeurs chez un sujet, ledit procédé comprenant l’administration chez ledit sujet, d’une quantité efficace d’une composition pharmaceutique de nanoparticules de formules [Ch1]n-PS-[Ch2]mtelles que décrites aux sections précédentes, en particulier des nanoparticules à base de polysiloxane chélaté au gadolinium, et plus précisément, telles qu’obtenues à partir de nanoparticules AGuIX comme décrit plus haut, et caractérisé en ce que les nanoparticules permettent le traitement de la tumeur en partie par la captation du cuivre et/ou du fer endogène.
Dans un mode particulier dudit procédé, la composition comprend également une quantité efficace de cation métallique M2, de préférence du gadolinium ou du bismuth, pour une utilisation en tant qu’agent radiosensibilisant et le procédé comprend, après administration de la composition, une étape d’irradiation du sujet par une dose efficace pour le traitement de la tumeur par radiothérapie.
Par « patient » ou « sujet », on entend de préférence un mammifère ou un être humain incluant par exemple un sujet ayant une tumeur.
Les termes « traitement », « thérapie », se réfèrent à n’importe quel acte qui a pour but d’améliorer l’état de santé d’un patient, tel que la thérapie, la prévention, la prophylaxie, et le retardement d’une maladie. Dans certains cas, ces termes se réfèrent à l’amélioration ou l’éradication d’une maladie ou des symptômes associés à la maladie. Dans d’autres modes de réalisation, ces termes se réfèrent à la réduction de la propagation ou l’aggravation de la maladie résultant de l’administration d’un ou plusieurs agents thérapeutiques à un sujet atteint d’une telle maladie. Dans le cadre du traitement de tumeurs, le terme « traitement » peut englober typiquement un traitement permettant l’arrêt de la croissance d’une tumeur, la réduction de la taille de la tumeur et/ou l’élimination de la tumeur.
En particulier, les nanoparticules sont utilisées pour le traitement des tumeurs solides, par exemple le cancer du cerveau (primaires et secondaires, le glioblastome…), les cancers hépatiques (primaires et secondaires), les tumeurs pelviennes (cancer du col de l’utérus, cancer de la prostate, cancer anorectal, cancer colorectal), les cancers des voies aérodigestives supérieures, le cancer des poumons, le cancer de l’œsophage, le cancer du sein, le cancer du pancréas.
Par « quantité efficace » de nanoparticules, il est fait référence à la quantité de nanoparticules telles que décrites précédemment qui administrée à un patient est suffisante pour être localisées dans la tumeur et permettre un traitement de la tumeur par la captation du cuivre et/ou du fer endogène, le cas échéant en combinaison avec un effet radiosensibilisant et un traitement de radiothérapie.
Cette quantité est déterminée et ajustée en fonction de facteurs tels que l’âge, le sexe et le poids du sujet.
L'administration des nanoparticules telles que décrites précédemment peut être réalisée par voie intratumorale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intradermique, intrapéritonéale, orale, sublinguale, rectale, vaginale, intranasale, par inhalation ou par application transdermique. De préférence, elle se fait par voie intratumorale et/ou intraveineuse.
Les méthodes d’irradiation pour le traitement de tumeurs après administration de nanoparticules en tant qu’agent radiosensibilisant sont bien connues de l’homme du métier et ont été décrites en particulier dans les publications suivantes : WO2018/224684, WO2019/008040 et C. Verry, et al, Science Advances, 2020, 6, eaay5279 ; et, C. Verry, et al, NANO-RAD, a phase I study protocol », BMJ Open, 2019, 9, e023591.
La dose totale d’irradiation lors d’une radiothérapie sera ajustée selon le type de cancer, le stade et le sujet à traiter. Pour une dose curative, une dose totale typique pour une tumeur solide est de l’ordre de 20 à 120 Gy. D’autres facteurs peuvent être pris en compte tel qu’un traitement par chimiothérapie, une co-morbidité, et/ou le fait que la radiothérapie a lieu avant ou après une intervention chirurgicale. La dose totale est en général fractionnée. L’étape de radiothérapie dans le procédé selon la présente divulgation peut comprendre par exemple plusieurs fractions entre 2 et 6 Gy par jour, par exemple 5 jours par semaines, et notamment sur 2 à 8 semaines consécutives, la dose totale pouvant être entre 20 et 40 Gy, par exemple 30 Gy.
Les nanoparticules selon la présente divulgation peuvent être administrées seules, ou en combinaison avec un ou plusieurs autres principes actifs, et notamment d’autres médicaments tels que des agents cytotoxiques ou anti-prolifératifs ou d’autres agents anti-cancéreux et notamment des inhibiteurs de checkpoint immunitaires. Par administration combinée, on entend une administration simultanée ou séquentielle (à des temps différents).
Exemples
Matériel et méthodes
Les produits CuPRiXxsont obtenus en introduisant le produit de départ AGuIX®, fourni par la société Nh TherAguix (France), dans un milieu fortement acide obtenu à partir d’acide chloridrique 37% extra-pur provenant de chez CarlRoth.
Les étapes de filtration sont réalisées grâce à une pompe péristaltique et une cassette Vivaflow 200® – 5kDa de chez Sartorius Stedim Biotech (France) utilisé comme dans les conditions décrites dans la notice reliée au produit Vivaflow 200®.
La mesure du diamètre hydrodynamique ainsi que la titration du point isoélectrique sont effectuées avec un Zetasizer Nano-S (633 nmHe-Ne laser) de chez Malvern Instruments (USA). Pour la mesure du point isoélectrique, cet appareil est couplé à un titrateur automatique MPT-2 de chez Malvern Instruments (USA).
L’HPLC-UV est réalisée avec une Agilent 1200 avec un détecteur DAD. La colonne phase inverse utilisée est une C4, 5 µm, 300 Å, 150 x 4,6 mm de chez Jupiter. La détection est opérée par un détecteur UV à une longueur d’onde de 295 nm. Le gradient des phases A (H20/ACN/TFA : 98,9/1/0,1) et B (H20/ACN/TFA : 10/89,9/0,1) est le suivant : 5 minutes à 95/5 suivi d’un gradient linéaire sur 10 min qui permet d’atteindre le ratio 10/90 qui est maintenu pendant 15 minutes. Au bout de ces 15 minutes le taux de A est repassé à 95% en 1 minute et est suivi d’un plateau 7 minute à 95/5. Les produits utilisés dans la composition des phases éluantes sont tous certifiés HPLC grade.
L’analyse élémentaire a été faite à l’Institut des Sciences Analytiques, UMR 5280, Pole Isotopes & Organique, 5 rue de la Doua 69100 Villeurbanne.
L’HPLC-ICP/MS est réalisée avec Nexion 2000 de chez Perkin-Elmer (USA). La mesure des éléments libres dans le milieu est effectuée en mode isocratique avec une phase d’élution de la composition suivante : 95% A et 5% B. La composition des phases A et B est identique à la méthode HPL-UV. La colonne phase inverse utilisée est une C4, 5 µm, 300 Å, 150x4,6 mm de chez Jupiter. Les produits utilisés dans la composition des phases éluantes sont tous certifiés HPLC grade.
La lyophilisation des particules est réalisée par l’intermédiaire d’un lyophilisateur Alpha 2-4 LSC de chez Christ (Allemagne) en suivant le programme “dessiccation primaire”.
Les cellules A549 (ECACC 86012804) sont cultivées dans du milieu F12-K (GibcoTM, Thermofischer) supplémenté avec 10% de Sérum de Veau Fœtal (Dutscher) et 1% de pénicilline-streptomycine (GibcoTM, Thermofischer). Pour chaque expérience, les cellules sont rincées 2 fois au PBS 1X (GibcoTM, Thermofischer), incubées 5 minutes dans un incubateur à 37°C, 5% CO2avec de la trypsine-EDTA, puis reprises dans du milieu complet.
Au minimum 1h avant le test, le produit CuPRiX20est repris dans de l’eau distillée stérile à une concentration en DOTA libre égale à 10 mM (30 mM de gadolinium) et conservé à 4°C.
Pour le test de migration, les cellules A549 sont ensemencées (50,000 cellules/puits) dans des plaques 96-puits ImageLock (Essen BioScience) et incubées pendant 16h à 37°C et 5% de CO2jusqu’à atteindre 90-100% de confluence. Le WoundMakerTM(Essen BioScience) est utilisé pour créer les blessures dans la monocouche cellulaire de chaque puits. Ensuite, chaque puit est rincé 2 fois au PBS 1X puis 100 µl de milieu contenant des concentrations croissantes de CuPRiX20est ajouté dans chaque puits. La plaque est placée dans l’Incucyte (objectif 10x) et les images du comblement des blessures sont acquises automatiquement toutes les 2h par le logiciel Zoom Incucyte (Essen BioScience) dans l’incubateur à CO2. Les données sont analysées par le logiciel et les résultats exprimés en pourcentage de confluence de plaies.
Exemple 1 : Acidification du milieu et relargage d’ion Gd 3+
Exemple 1 : Acidification du milieu et relargage d’ion Gd 3+
Afin d’obtenir une nanoparticule capable de complexer des ions cuivres tout en conservant ses propriétés d’agent radiosensibilisant, le produit AGuIX® a été placé dans un milieu acide dans le but de protoner les groupements DOTA et ainsi libérer une partie des ions Gd3+initialement complexé.
Premièrement, une solution d’AGuIX® à 200 g/L a été préparée en dissolvant 10 g de produit dans 50 ml d’eau UltraPure. La solution a été laissée sous agitations à température ambiante pendant 1h. En parallèle, une solution d’acide chlorhydrique 2M a été préparée en ajoutant 10 ml d’acide chlorhydrique 37% (Acide chlorhydrique 37%, extra-pur, 2,5 L, plastique, CarlRoth) à 50 ml d’eau UltraPure.
Après une heure d’agitation, 50 ml de la solution d’acide chlorhydrique 2M sont ajoutés aux 50 ml d’AGuIX®. Le pH a été alors mesuré et est inférieur à 0,5. La solution obtenue est de couleur marron-orangé. L’ensemble est laissé dans une étuve préalablement chauffée à 50°C pendant 4 heures. Un prélèvement d’échantillon chaque heure a été effectué afin d’observer par HPLC-ICP/MS le relargage des ions gadolinium ( ). On constate que le pic de Gd3+ libre dans le milieu au temps de rétention Tr = 2,3 min augmente avec le temps de réaction.
Exemple 2 : CuPRiX 20 : 4h de réaction
Exemple 2 : CuPRiX 20 : 4h de réaction
Après 4h, la solution a été diluée par 10 avec de l’eau UltraPure. Le pH est alors mesuré et remonté à 1 ± 0,2 si nécessaire avec de la soude 1M afin de ne pas détruire la membrane de filtration. Les 500 ml de solution ainsi obtenus ont été purifiés au moyen d’une pompe péristaltique et d’une cassette Sartorius Vivaflow 200 - 5kDa afin de séparer les particules des ions Gd3+libérés pour éviter la recomplexation de ces ions.
Le volume initial de 500 ml est concentré à 50 ml et l’opération est répétée. Au total, l’opération dilution/concentration a été répétée 4 fois et le volume final est de 50 ml. A la suite de la purification, les 50 ml de solution ont été répartis dans des flacons contenant chacun 2 ml de solution. Les flacons sont placés à -80°C afin de congeler la solution puis lyophilisés pour obtenir notre produit final sous forme d’une poudre de couleur marron.
Une fois le produit obtenu, un flacon est retiré du lot pour faire les caractérisations du produit. Une solution de 1 ml à 100 g/L du nouveau produit est préparée en ajoutant de l’eau UltraPure. Après 1 heure en solution, le diamètre a été mesuré par notre appareil de DLS indiquant un diamètre de 4,4 nm ± 1,2 nm. Le chromatogramme HPLC-UV/Vis a été effectué et indique un temps de rétention de 11 min ± 0,1 min, identique aux particules d’origines. Le point isoélectrique du CuPRiX20a aussi été mesuré et est égale à 6,29, supérieur au point isoélectrique de AGuIX® égal à 7,15. Le gadolinium ayant des propriétés magnétiques la constante de relaxivité r1de CuPRiX20a été mesurée, et est égale à 18,9 mM-1.s-1par atome de gadolinium.
Exemple 3 : Dosage du nombre de DOTAGA libres par chélation et fluorescence de l’europium
Exemple 3 : Dosage du nombre de DOTAGA libres par chélation et fluorescence de l’europium
La quantité de chélates libres présente dans le CuPRiX20 peut être déterminée par chélation de l’europium suivie d’une étude de luminescence. L’europium présente en effet une luminescence principalement centrée autour de 590 (5D0 -> 7F1) et 615 nm (5D0 -> 7F2). Cette luminescence est éteinte en présence de molécules d’eau. Le principe du dosage est d’ajouter des quantités croissantes d’europium, tant que celui-ci est chélaté, la luminescence augmente, puis lorsque tous les sites de chélation sont remplis la luminescence atteint un plateau comme montré en .
Pour réaliser le dosage, le CuPRiX20a été placé dans un tampon acétate à pH 5, un sel de chlorure d’europium dissous dans le tampon acétate est ajouté. Une courbe de dosage est ensuite tracée en excitant à 396 nm et en relevant l’émission à 590 nm. Ce dosage permet de remonter à une quantité de chélate de 0.16 µmol par mg de CuPRiX20. Sachant qu’il y a une quantité nulle ou alors négligeable de gadolinium dans le produit initial AGuIX® alors la quantité de gadolinium initiale est égale à la quantité de DOTA. La teneur initiale en gadolinium du produit de départ, mesurée par analyse élémentaire, était de 0,81 µmol par mg d’AGuIX®.
Le produit CuPRiX20présente donc 20% de ses groupements DOTA qui sont libres.
Exemple 4 : Chélation du cuivre
Exemple 4 : Chélation du cuivre
La présence de DOTA libres indique donc un potentiel d’application du CuPRiX20comme possible agent chélateur dans le cadre d’une thérapie par chélation. Le potentiel complexant du CuPRiX20a été déterminé par chélation du cuivre suivie d’une étude d’absorbance à l’aide de l’HPLC-UV/Vis. Le complexe DOTA@Cu présente une absorbance à 295 nm bien supérieur à celles du complexe DOTA@Gd, DOTA et des ions cuivre en solution.
L’absorbance du CuPRiX20 augmentera à mesure que les groupements DOTA libres complexeront les ions cuivre disponibles, jusqu’à atteindre un plateau où l’ajout de cuivre supplémentaire n’entrainera pas d’augmentation de l’absorbance. Pour réaliser cette expérience une série d’échantillon a donc été préparée avec une quantité croissante de solution de chlorure de cuivre et une quantité constante de CuPRiX20. Les volumes de tous les échantillons sont égalisés. Cette expérience permet de remonter à une quantité de cuivre complexable de 0.18 µmol par mg de CuPRiX20. Une expérience identique menée sur le produit de départ AGuIX® indique la forte augmentation du potentiel chélateur de CuPRiX20 ( ).
Exemple 5 : CuPRiX 30 : 5h de réaction
Exemple 5 : CuPRiX 30 : 5h de réaction
Le taux de DOTA libre est modulable en fonction du temps de réaction d’AGuIX en milieu acide. Après 5h, la solution a été diluée par 10 avec de l’eau UltraPure. Le pH est alors mesuré et remonté à 1 ± 0,2 si nécessaire avec de la soude 1M afin de ne pas détruire la membrane de filtration. Les 500 ml de solution ainsi obtenus sont purifiés au moyen d’une pompe péristaltique et d’une cassette Sartorius Vivaflow 200 - 5kDa afin de séparer les particules des ion Gd3+libérés pour éviter la recomplexation de ces ions Le volume initial de 500 ml est concentré à 50 et l’opération est répété.
Au total, l’opération dilution/concentration a été répétée 4 fois et le volume final est de 50 ml. A la suite de la purification, les 50 ml de solution sont répartis dans des flacons contenant chacun 2 ml de solution. Les flacons sont placés à -80°C afin de congeler la solution puis lyophilisé pour obtenir notre produit final CuPRiX30sous forme d’une poudre de couleur marron. Une fois le produit obtenu, un flacon a été retiré du lot pour faire les caractérisations du produit.
Une solution de 1 ml à 100 g/L du nouveau produit a été préparé en ajoutant de l’eau UltraPure. Après 1 heure en solution le diamètre a été mesuré par notre appareil de DLS indiquant un diamètre de 5,7 nm ± 1 nm. Le chromatogramme HPLC-UV/Vis a été effectué et indique un temps de rétention de 10,8 min ± 0,1 min, identique aux particules d’origines.
Exemple 6 : CuPRiX 30 : amélioration du potentiel complexant par rapport à CuPRiX 20
Exemple 6 : CuPRiX 30 : amélioration du potentiel complexant par rapport à CuPRiX 20
La présence de Dota libre indique donc un potentiel d’application du CuPRiX30comme possible agent chélateur dans le cadre d’une thérapie par chélation. Le potentiel complexant du CuPRiX20a été déterminé par chélation du cuivre suivie d’une étude d’absorbance à l’aide de l’HPLC-UV/Vis. Le complexe DOTA@Cu présente une absorbance à 295 nm bien supérieur à celles de du complexe DOTA@Gd, DOTA et des ions cuivre en solution. L’absorbance du produit augmentera à mesure que les groupements DOTA libres complexeront les ions cuivre disponibles, jusqu’à atteindre un plateau ou l’ajout de cuivre supplémentaire n’entrainera pas d’augmentation de l’absorbance.
Pour réaliser cette expérience une série d’échantillon a donc été préparée avec une quantité croissante de solution de chlorure de cuivre et une quantité constante de CuPRiX20. Les volumes de tous les échantillons sont égalisés. Cette expérience permet de remonter à une quantité de cuivre complexable de 0.24 µmol par mg de CuPRiX30. Le produit CuPRiX30présente donc 30% de ses groupements DOTA qui sont libres.
Exemple 7 : Analyse de l’effet du CuPRiX20 sur la motilité de cellules A549
Exemple 7 : Analyse de l’effet du CuPRiX20 sur la motilité de cellules A549
La migration cellulaire est un processus en plusieurs étapes qui est une composante fondamentale de nombreux processus biologiques et pathologiques parmi lesquelles les métastases tumorales. In vitro, le test de blessure est basé sur la formation d’une blessure sur un tapis cellulaire et de l’étude de la motilité cellulaire, c’est-à-dire la capacité des cellules à se déplacer sur une surface en réponse à un changement de densité, pour refermer la blessure. C’est une mesure directe de la motilité des cellules sur un substrat solide en 2D.
L’objectif de cet exemple a été de montrer la capacité du CuPRiX20 à réduire la motilité cellulaire. Les cellules A549 ont été cultivées dans du milieu F12-K (Gibco) contenant 8 nM de CuSO4-5H2O. Après avoir été cultivées pendant 72 h avec ou sans CuPRiX20 (500 µM de chélate libre), les cellules ont été trypsinées puis ensemencées à 40 000 cellules par puit dans une plaque de culture 96 puits ImageLock® (Essen BioScience). La plaque a été placée pendant une nuit à 37°C, 5% CO2. La blessure a ensuite été réalisée avec l’IncuCyte® WoundMaker (Essen BioScience). Les cellules ont été rincées 2 fois avec du PBS pour ôter les cellules flottantes puis traitées avec 100 µl de milieu contenant des concentrations croissantes de CuPRiX20 (0, 50, 100, 200, 300, 400, 500 et 1000 µM de chélate libre équivalent à environ 0, 150, 300, 600, 900, 1200, 1500 et 3000 µM de gadolinium).
Les images du comblement des blessures ont été acquises automatiquement toutes les 2 h pendant 72 h par le logiciel Zoom Incucyte (Essen BioScience) dans l’incubateur à CO2. Les données ont été analysées par le logiciel et les résultats exprimés en pourcentage de confluence de la blessure. Les résultats obtenus ont permis de mettre en évidence un ralentissement de la motilité cellulaire des A549 dû au traitement par le CuPRiX20 à des concentrations différentes ( , et ))
Exemple 8 : Comparaison de l’effet du CuPRiX20 et du CuPRiX30 sur la motilité de cellules A549
Exemple 8 : Comparaison de l’effet du CuPRiX20 et du CuPRiX30 sur la motilité de cellules A549
L’objectif de cet exemple est de montrer la capacité des CuPRiX20 et CuPRiX30 à réduire la motilité cellulaire et de comparer leurs effets. Les cellules A549 ont été cultivées dans des plaques de culture 96 puits ImageLock® (Essen BioScience) à 40 000 cellules par puits pendant une nuit à 37°C, 5% CO2. Le test de blessure a été réalisé avec le 96-puits IncuCyte® WoundMaker (Essen BioScience). Les cellules ont été rincées 2 fois avec du PBS pour ôter les cellules flottantes et ont ensuite été traitées avec 100 µl de milieu contenant du CuPRiX20 (0, 125, 250 et 500 µM de chélate libre équivalent à environ 0, 375, 750 et 1500 µM de gadolinium) ou du CuPRiX30 (0, 125, 250 et 500 µM de chélate libre équivalent à environ 0, 200, 400 et 800 µM de gadolinium.
Les images du comblement des blessures ont été acquises automatiquement toutes les 2h par le logiciel Zoom Incucyte (Essen BioScience) dans l’incubateur à CO2. Les données ont été analysées par le logiciel et les résultats exprimés en pourcentage de confluence de blessures.
Les résultats obtenus ont permis de montrer qu’à concentration de chélate libre constante, l’effet des deux types de CuPRiX est équivalent.
Exemple 9 : Analyse de l’effet du CuPRiX20 sur l’invasion de cellules A549
Exemple 9 : Analyse de l’effet du CuPRiX20 sur l’invasion de cellules A549
L’invasion cellulaire est l’une des caractéristiques du cancer. Elle est liée à la migration cellulaire et joue un rôle clé dans le développement de métastases. La capacité des cellules tumorales à former des métastases est principalement déterminée par la capacité de la cellule à changer et à réorganiser sa morphologie cellulaire ainsi qu’à dégrader la matrice extracellulaire (MEC).In vitro, les tests d’invasion sont basés sur l’approche du test de blessure mais comprennent l’ajout d’une matrice de gel mimant la MEC. L’ajout de la matrice 3D exige que les cellules dégradent cette matrice pour se déplacer.
L’objectif de cet exemple est de montrer la capacité du CuPRiX20à réduire l’invasion cellulaire –i.e.la capacité des cellules à décomposer une matrice extra-cellulaire et à se déplacer. Les cellules A549 ont été cultivées dans des plaques de culture 96 puits ImageLock® à 40 000 cellules par puit pendant une nuit à 37°C, 5% CO2. La blessure a ensuite été réalisée avec l’IncuCyte® WoundMaker (Essen BioScience) puis les cellules ont été rincées 2 fois avec du PBS. 50 µl de Matrigel (corning) – préalablement dilué dans du milieu F12-K contenant ou non du CuPRiX20– à une concentration finale de 1 mg/ml, ont été ajouté à chaque puits. La plaque a été incubée 30 minutes à 37°C, pour permettre la polymérisation du Matrigel. Enfin, 100 µl de milieu contenant ou non du CuPRiX20(0 et 500 µM de chélate libre) ont été ajouté. Les images du comblement des blessures ont été acquises automatiquement toutes les 2 h pendant 72 h par le logiciel Zoom Incucyte (Essen BioScience) dans l’incubateur à CO2.Les données ont été analysées par le logiciel Zoom Incucyte (Essen BioScience) et les résultats exprimés en pourcentage de confluence de la blessure. Les résultats obtenus ont permis de mettre en évidence un ralentissement de l’invasion cellulaire des A549 dû au traitement par CuPRiX20( ).
Exemple 10 : Effet du CuPRiX20 sur la migration par chimiotactisme des cellules A549
Exemple 10 : Effet du CuPRiX20 sur la migration par chimiotactisme des cellules A549
La migration par chimiotactisme est le mouvement directionnel des cellules en réponse à un stimulus. Ce test consiste en un insert de culture placé au sein d’un puits de plaque de culture cellulaire. Les cellules sont ensemencées dans l’insert – qui contient une membrane avec une taille de pores définie – avec du milieu sans sérum pour les affamer. Le milieu chimio-attractant est placé dans le puits en dessous. Dû à ce gradient chimique, les cellules capables de migrer sont attirées par le milieu chimio-attractant et passent à travers les pores. L’objectif de cet exemple est de montrer la capacité du CuPRiX20 à réduire la mobilité cellulaire par un test de chimiotactisme. Pour cela, le module de chimiotaxie IncuCyte ZOOM a été utilisé. Les cellules A549 (1 000 cellules/puits) ont été remises en suspension dans du milieu F-12K contenant 0% de SVF et ont été ensemencées dans le compartiment supérieur d’une plaque 96-puits Cell Migration Incucyte ClearView avec des pores de 8 µm (40 µl/puits). Dans les puits adéquats, 20 µl de milieu F12-K sans SVF contenant ou non du CuPRiX20 (500 µM de chélate libre final) ont été ajouté. Enfin, 200 µl de milieu F-12K à 10 % de SVF contenant ou non du CuPRiX20 (500 µM de chélate libre) ont été ajoutés dans le compartiment inférieur de la chambre de chimiotaxie. Des images de chaque insert ont été prises toutes les heures. La migration chimiotactique du réservoir supérieur vers le réservoir inférieur a été quantifié en tant que confluence de cellules sur le dessous de la membrane par rapport à la confluence initiale des cellules ensemencées sur le dessus de la membrane. Le calcul a été effectué automatiquement avec le logiciel de microscopie IncuCyte ZOOM 2015A.
Les résultats obtenus ont permis de mettre en évidence une forte diminution de la migration par chimiotactisme des cellules par CuPRiX20 ( ).
Exemple 11 : Effet de l’association du CuPRiX30 à une irradiation photonique sur la motilité de cellules A549
Exemple 11 : Effet de l’association du CuPRiX30 à une irradiation photonique sur la motilité de cellules A549
L’objectif de cet exemple est de montrer la capacité du CuPRiX30 à réduire la motilité cellulaire après une irradiation photonique. Les cellules A549 ont été cultivées dans des plaques de culture 96 puits ImageLock® à 20 000 cellules par puits pendant une nuit à 37°C, 5% CO2. Les cellules ont été incubées avec du milieu F-12K sans SVF contenant ou non du CuPRiX30 (500 µM de chélate libre équivalent à 800 µM de gadolinium) pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été irradiées à 8 Gy (irradiateur X-Rad320, 250 kV) puis la blessure a été réalisée. Les cellules ont été rincées 2 fois avec du PBS pour ôter les cellules flottantes et 100 µl de milieu contenant du CuPRiX30 (0 et 500 µM de chélate libre équivalent à environ 0 et 800 µM de gadolinium) ont été ajoutés dans chaque puit correspondant.
Les images du comblement des blessures ont été acquises automatiquement toutes les 2h par le logiciel Zoom Incucyte dans l’incubateur à CO2. Les données ont été analysées par le logiciel et les résultats exprimés en pourcentage de confluence de blessures. Les résultats obtenus ont permis de montrer une efficacité supérieure (effet additif) de l’association CuPRiX30/irradiation pour limiter la motilité en comparaison d’un traitement par irradiation seul ou par CuPRiX30 seul ( ).
Exemple 12 : Effet de l’association du CuPRiX30 à une irradiation photonique sur la survie cellulaire de cellules A549
Exemple 12 : Effet de l’association du CuPRiX30 à une irradiation photonique sur la survie cellulaire de cellules A549
Les cellules A549 ont été ensemencées à 40 000 cellules/cm2, soit 1 millions de cellules dans une flasque T25cm2 et incubées sur la nuit à 37°C, 5 % de CO2. Les cellules ont été traitées avec du milieu F-12K sans SVF contenant ou non du CuPRiX30 (500 µM de chélate libre équivalent à 800 µM de gadolinium) pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été irradiées à différentes doses (0, 2, 3, 4, 6 et 8 Gy). Après l’irradiation, les cellules ont été lavées au PBS, trypsinées et comptées. Les cellules ont ensuite été réensemencées dans des flasques de 25 cm2 et ont pu se développer pendant six divisions (7 jours) avant d'être fixées et colorées. Les colonies contenant 64 cellules ou plus ont été comptées numériquement. La survie clonogénique a été déterminée selon un modèle quadratique linéaire de la forme , où SF est la fraction survivante, et α et β représentent les probabilités de dommages létaux et sublétaux, respectivement. Les résultats obtenus montrent une diminution de la survie cellulaire après irradiation en présence de CuPRiX30 ( ).
Les présentes solutions techniques peuvent trouver à s’appliquer notamment dans le domaine de la médecine, en particulier pour le traitement de tumeurs.
La présente divulgation ne se limite pas aux exemples décrits ci-avant, seulement à titre d’exemple, mais elle englobe toutes les variantes que pourra envisager l’homme de l’art dans le cadre de la protection recherchée.
Claims (8)
- Nanoparticule de formule suivante :
[Ch1]n-PS-[Ch2]mdans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Ch1 est un groupement chélatant non complexé ou complexé avec un cation métallique M1,
- M1 est absent ou choisi parmi les cations métalliques dont la constante de complexation avec Ch1 est inférieure à celle du cuivre, en particulier au moins dix fois inférieure, par exemple M1 est choisi parmi le zinc ou les alcalino-terreux, notamment le calcium ou le magnésium,
- Ch2 est un groupement chélatant, identique ou différent du groupement chélatant Ch1, et complexé à un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50,
caractérisée en ce que
(i) les agents chélateurs Ch1 et Ch2 sont greffés sur la matrice de polymères,
(ii) le ratio n/(n+m) est compris entre 10% et 100% et,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm. - Nanoparticule selon la revendication 1, caractérisée en ce que au moins 50% des Ch1 est complexé avec le zinc, le calcium ou le magnésium.
- Nanoparticule selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le groupement chélatant Ch1, et le cas échéant Ch2, est choisi parmi les agents macrocycliques, de préférence parmi l’acide 1,4,7-triazacyclononanetriacétique (NOTA), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacétique (DOTA), l’acide 1,4,7-triazacyclononane-1-glutarique-4,7-acide diacetique (NODAGA), et l’acide 1,4,7,10-tetraazacyclododececane,1-(glutaric acid)-4,7,10- acide triacetique (DOTAGA), 2,2’,2’’,2’’’-(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrayl)tetraacetamide (DOTAM), et 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan (Cyclam), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane (Cyclen), le déferoxamine (DFO).
- Nanoparticule selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le cation métallique M2 est choisi parmi des agents de radiosensibilisant et/ou des agents de contraste pour l’imagerie par résonnance magnétique, en particulier le gadolinium ou le bismuth.
- Nanoparticule selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que
(i) PS est une matrice de polysiloxane,
(ii) Ch1 et Ch2 sont des groupements chélatants DOTAGA de formule (I) suivante
(I)
et greffés a la matrice de polysiloxane par liaison Si-C,
(iii) M1 est absent et M2 est le cation gadolinium Gd3+,
(iv) n+m est compris entre 5 et 50, de préférence entre 10 et 30, et
(iv) le diamètre hydrodynamique moyen est compris entre 2 et 8 nm. - Solution colloïdale de nanoparticules selon l’une quelconque des revendications 1 à 5.
- Composition pharmaceutique comprenant une solution colloïdale de nanoparticules selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, et un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
- Composition pharmaceutique selon la revendication 7, pour son utilisation dans le traitement du cancer chez un sujet, en particulier pour la captation in vivo du cuivre et/ou du fer dans une tumeur.
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