CN115811991A - 用于癌症免疫治疗的智能肽和可转化纳米颗粒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供式(I)的化合物:A‑B‑C(I),其中A是疏水部分;B是肽,其中肽形成β‑折叠;C是亲水性靶向配体,其中亲水性靶向配体是LLP2A前药、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、叶酸、LHRH肽、HER2配体、EGFR配体或toll样受体激动剂CpG寡核苷酸。本发明还提供了包含本发明化合物的纳米载体、由纳米载体形成的纳米纤维、以及使用纳米载体治疗疾病和成像的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年8月14日提交的美国临时申请第62/886,698号和第62/886,718号的优先权,出于所有目的,每一个均以全文并入本文。
关于在联邦资助的研究和开发下作出的发明权利的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的基金号R01EB012569和U01CA198880的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
背景技术
近年来,癌症免疫治疗的临床成功,为我们的抗癌战争带来了极大的鼓励。免疫检查点受体通路阻断单克隆抗体,如抗PD-1、抗PD-L1和抗CTLA-4可以逆转T效应细胞(Teff)功能障碍和衰竭,使得肿瘤显著缩小,有时在某些患者中完全缓解,即使是晚期转移性疾病。然而,不同肿瘤类型的反应率差异很大:黑色素瘤高达40%,非小细胞肺癌为25%,但大多数其他肿瘤类型<10%。迄今为止,美国食品和药物管理局(FDA)已批准七种免疫检查点阻断单克隆抗体(ICB-Ab):一种CTLA-4抑制剂(伊匹单抗)、三种PD-1抑制剂(纳武单抗、派姆单抗和西米普利单抗)和三种PD-L1抑制剂(阿特珠单抗、度伐单抗和阿维单抗),单独使用或与其他化学疗法联合使用,可对抗一系列肿瘤类型。
由免疫和基质细胞、脉管系统、细胞外基质、细胞因子、趋化因子和生长因子组成的肿瘤微环境(TME)都可以影响肿瘤对免疫检查点阻断(ICB)疗法的反应。新出现的数据表明,Teff细胞归巢到肿瘤部位的缺陷是对ICB治疗产生耐药性的关键因素。ICB耐药的其他机制包括肿瘤部位存在免疫抑制调节性T细胞(Tregs)、髓源性抑制细胞(MDSCs)和M2巨噬细胞。CCL5、CCL17、CCL22、CXCL8和CXCL12水平升高有助于Treg和MDSC向TME募集,导致ICB反应减弱。相比之下,CXCL9和CXCL10促进细胞毒性T细胞(CTL)归巢至肿瘤部位,增强抗肿瘤免疫反应;转化生长因子β(TGF-)则相反,也会上调Treg。VEGF上调CTL上的抑制性受体,导致其衰竭。其他免疫检查点受体的上调,例如粘蛋白结构域3蛋白(TIM-3)、淋巴细胞激活基因3(LAG-3)、B和T淋巴细胞衰减器(BTLA)、T细胞免疫受体、基于酪氨酸的抑制基序结构域(TIGIT)和含有V域免疫球蛋白的T细胞活化抑制剂(VISTA)与ICB抗性有关。这些检查点受体的共表达可导致T细胞衰竭。致癌或肿瘤抑制途径,如癌细胞中的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和PI3K-γ,也可以通过改变免疫细胞组成和细胞因子谱来影响TME,从而导致ICB耐药。已发现针对这些途径的抑制剂可改善ICB反应。
为了克服ICB耐药性,已经在临床前和临床上尝试了许多联合治疗策略。其中包括在ICB-Ab中添加以下药物:一种其他ICB-Ab(针对CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3和TIM-3的抗体)、化疗药物(紫杉醇、吉西他滨和卡铂)、放射治疗、靶向治疗(针对PI3K、VEGF、BRAF/MEK、IDO、A2AR、FGFR、EGFR、PARP和mTOR的抑制剂)、巨噬细胞抑制剂(针对CSF1R和ARG1的抑制剂)、细胞因子/趋化因子抑制剂(针对CXCR4、CXCR2和TGF-β的抑制剂)、表观遗传调节剂(组蛋白去乙酰化酶抑制剂和去甲基化剂)、免疫调节剂(针对OX40、41BB、GITR、CD40和ICOS的抗体)、过继细胞转移疗法(car T、TIL和TCR)和调节肠道微生物组。
纳米免疫疗法的进步和优化在于创新方法的开发,以增强免疫治疗干预的特异性和可控性,从而靶向TME中的所需细胞类型。先进的生物纳米材料或更可控的方法,可以通过增加免疫调节剂和免疫细胞归巢剂在TME的积累和延长其保留时间来增强免疫治疗效力,同时保留正常组织和器官,从而减少脱靶副作用,如全身性细胞因子风暴。纳米材料的原位组装已被证明可以提高生物活性分子的性能。一种合理的解释是,结合到原位纤维状可转化纳米平台中的T细胞靶向配体和/或免疫调节剂,将在TME产生纳米纤维状网络,增强Teff细胞归巢到肿瘤部位并提高免疫治疗效果,无论是否有额外的ICB治疗。
人表皮生长因子受体2(HER2)在超过20%的乳腺癌中过表达,在胃癌、结直肠癌、卵巢癌和膀胱癌中的表达程度较低。与对单一疗法反应良好的突变或融合癌基因(例如肺癌中的EGFR和慢性粒细胞白血病中的Bcr-Abl)引起的癌症不同,HER2过度表达的癌症通常需要药物组合。这是因为后一组肿瘤是由基因扩增和HER2的大量过表达驱动的。HER2是一种受体酪氨酸激酶,通常通过与其自身或其家族成员EGFR、HER3或HER4诱导的二聚化而被激活。在HER2阳性肿瘤中,HER2大量过表达并组成二聚体,导致下游增殖和存活途径的持续激活以及恶性表型。
由于HER2的高表达水平,曲妥珠单抗和帕妥珠单抗,这两种抗HER2单克隆抗体作为针对这些肿瘤的单一疗法无效。它们需要与其他HER2靶向治疗、化学疗法或激素疗法联合使用。在此,一些实施方案描述了一种新型的HER2介导的、基于肽的、无毒的转化纳米剂,其作为单一疗法针对HER2+乳腺癌异种移植模型非常有效。这种受体介导的可转化纳米疗法(RMTN)由具有独特结构域的肽组成,这些结构域允许在水性条件下自组装形成胶束,并在遇到HER2的肿瘤部位转化为纳米纤维。由此产生的纳米纤维网络有效地抑制了HER2二聚化和下游信号传导,并促进了肿瘤细胞的死亡。
在此,构建了用于癌症免疫治疗的智能超分子材料。
发明概述
在一个实施方案中,本发明提供式(I)的化合物:A-B-C(I),其中A是疏水部分;B是肽,其中肽形成β-折叠;C是亲水性靶向配体,其中亲水性靶向配体是LLP2A前药、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、叶酸、LHRH肽、HER2配体、EGFR配体或toll样受体激动剂CpG寡核苷酸。
在另一个实施方案中,本发明提供式(I)的化合物:A-B-C(I),其中A是疏水部分;B是肽,其中肽形成β-折叠;C是亲水性靶向配体,其中亲水性靶向配体是LLP2A前药、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、LHRH肽、HER2配体、EGFR配体或toll样受体激动剂CpG寡核苷酸,并且其中当疏水部分是双芘,则C是LLP2A前药、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、LHRH肽、EGFR配体或toll样受体激动剂CpG寡核苷酸。
在另一个实施方案中,本发明提供具有内部和外部的纳米载体,该纳米载体包含多个本发明的化合物,其中各化合物在水性溶剂中自组装以形成纳米载体,从而在纳米载体的内部形成疏水袋,并且亲水基团在纳米载体的外部自组装。
在另一个实施方案中,本发明提供具有内部和外部的纳米载体,所述纳米载体包含多个第一偶联物和第二偶联物,其中所述第一偶联物包含式(I):A-B-C(I);并且第二偶联物包含式(II):A'-B'-C'(II)其中:A和A'各自独立地是疏水部分;B和B'各自独立地是肽,其中每个肽独立地形成β-折叠;C和C'各自独立地是亲水性靶向配体,其中每个亲水性靶向配体独立地是LLP2A前药、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、叶酸、LHRH肽、HER2配体、EGFR配体或放射性金属螯合剂;并且其中A和A'是不同的疏水部分和/或C和C'是不同的亲水靶向配体。
在另一个实施方案中,本发明提供形成纳米原纤维的方法,包括使本发明的纳米载体与肿瘤微环境中的细胞表面或无细胞成分接触,其中纳米载体经历原位转化以形成原纤维结构,从而形成纳米原纤维。
在另一个实施方案中,本发明提供治疗疾病的方法,包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的纳米载体,其中所述纳米载体在结合到肿瘤微环境的细胞表面或无细胞成分后原位形成纳米原纤维,从而治疗疾病。
在另一个实施方案中,本发明提供成像方法,包括向待成像的对象施用有效量的本发明的纳米载体。
附图简述
图1A-1F显示了可转化肽单体1(TPM1')BP-FFVLK-YCDGFYACYMDV的组装和纤维状转化。图1A-1B显示在将水分别以H2O:DMSO为0:100、20:80、40:60、60:40、80:20、90:10、98:2和99.5:0.5的比例,逐渐添加到NPs1的DMSO溶液中后,NPs1的紫外-可见吸收光谱(图1A)和荧光(图1B)的变化。激发波长=380纳米。图1C显示了初始NPs1和由NPs1与HER2蛋白相互作用转化的纳米纤维(NFs1)在不同时间点(0.5,6,24h)的TEM图像(Mw≈72KDa)。d中的比例尺:100nm。图1D-1F显示了初始NPs1和在不同时间点的NFs1的粒度分布(图1D)、CD光谱(图1E)和荧光信号(图1F)的变化。HER2肽/HER2蛋白的摩尔比约为1000:1。
图2A-2H显示了纤维状可转化NPs1与HER2阳性癌细胞共培养的形态学特征。图2A-2C显示了NPs1与SKBR-3细胞(HER2+)(图2A)、BT474细胞(HER2+)(图2B)和MCF-7细胞(HER2-)(图2C)在6小时的时间点相互作用的细胞荧光分布图。图2A-2C中的比例尺:50μm。图2D显示了MCF-7细胞和MCF-7/C6细胞中相对HER2蛋白表达的蛋白印迹和定量分析。***P<0.001。图2E显示了NPs1与MCF-7/C6细胞(HER2+)在不同时间点(0.5、6、24小时)相互作用的细胞荧光分布图。e中的比例尺:50μm。图2F显示了NFs1和HER2抗体(29D8,兔,与NPs1的HER2肽的不同受体结合位点)的纳米纤丝网络在MCF-7/C6细胞的细胞膜上的荧光结合分布图。HER2抗体用于标记HER2受体。图2G显示了未经处理的MCF-7/C6细胞和经NPs1处理6小时和24小时的细胞的SEM图像。图2H显示未经处理的MCF-7/C6细胞和经NPs1处理24小时的细胞的TEM图像。红色箭头显示纤维状网络。NPs1的浓度为50μM。
图3A-3G显示了纤维状可转化NPs与MCF-7/C6乳腺癌细胞相互作用的细胞外和细胞内机制。图3A显示了分别结合MCF-7/C6细胞的HER2受体的NPs1、NPs2和HER2抗体(29D8,兔,与NPs1和NPs2的HER2肽的不同受体结合位点)的细胞荧光分布图。HER2抗体用于标记HER2受体。NPs1和NPs2的浓度为50μM。a中的比例尺:20μm。图3B显示了与不同浓度的NPs1-4一起孵育的MCF-7/C6细胞的活力(n=3)。*P<0.05,**P<0.01。图3C显示了用不同浓度的NPs1处理24小时的MCF-7/C6细胞中凋亡相关蛋白和HER2总蛋白的蛋白印迹分析。图3D-3E显示了不同浓度(图3D)和50μM在不同时间点(图3E)NPs1处理MCF-7/C6细胞中HER2蛋白二聚体的抑制和解聚机制的Western印迹分析。图3F为50μM,不同时间点和24小时不同浓度下的NPs1处理MCF-7/C6细胞的增殖蛋白的抑制机制的蛋白印迹分析。图3G显示了NPs1-4和赫赛汀(HP)处理36小时时MCF-7/C6细胞中增殖蛋白的抑制机制的蛋白印迹分析。NPs1-4浓度为50μM,赫赛汀浓度为15μg/mL作为阳性对照组。
图4A-4F显示纤维状可转化NPs的体内评价。图4A显示了时间相关的离体荧光图像,图4B显示了在注射NPs1后10、24、48、72和168小时收集的肿瘤组织和主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、肠、肌肉和皮肤)的定量分析。在图4B中,***P<0.001,与其他器官相比,肿瘤组织在72h和168h的荧光信号显示出纤维网络的肿瘤聚集和原位转化以及长保留时间;***P<0.001,与在72h和168h的相比,肝脏和肾脏在10h的荧光信号表明NPs1可以从肝脏和肾脏中快速去除。图4C显示注射后72小时NPs1在肿瘤组织和正常皮肤组织中的荧光分布图像和H&E图像(绿色:NPs1的BP;蓝色:DAPI;c中的比例尺:100μm)。图4D显示了在注射NPs2-4后72小时收集的肿瘤组织和主要器官的时间依赖性离体荧光图像。图4E显示在注射NPs1-4后72小时收集的肿瘤组织和肝脏的定量分析。在图4E***P<0.001,与其他对照组相比,NPs1组中肿瘤组织的荧光信号显示NPs1组的纤维状网络促进了其在肿瘤部位的长保留时间。图4F显示了注射组和未治疗组中,静脉注射后72小时,NPs1-4在肿瘤组织中的分布和原位纤维状转化的TEM图像。NPs1-4的剂量为每次注射8mg/kg。在图4F中,“C”是指MCF-7/C6细胞;“N”是指细胞核。
图5A-5K显示了NPs在携带HER2阳性乳腺肿瘤的Balb/c裸鼠中的抗肿瘤活性。图5A显示了小鼠的肿瘤接种和治疗方案的示意图。图5B-5C显示了治疗40天期间皮下肿瘤模型中小鼠的肿瘤抑制效果(图5B)和体重变化(图5C)的观察结果(n=8/组;NPs1-4的剂量为每次注射8mg/kg)。**P<0.01,***P<0.001。图5D显示了携带MCF-7/C6乳腺肿瘤的不同治疗组小鼠的累积存活率。图5E显示了用于肿瘤组织分析的小鼠三次治疗方案的示意图。图5F显示了3次注射NPs1后肿瘤组织中的荧光分布图像和H&E抗肿瘤图像(绿色:NPs1的BP;蓝色:DAPI;f中的比例尺:100μm)。图5G显示了3次注射NPs1后纳米纤维网络所致的晚期膜破裂和细胞死亡的代表性TEM图像。红色箭头显示纤维状网络。图5H为注射3次后不同组处理的肿瘤组织的Ki-67染色图像。h中的比例尺:25μm。图5I为注射3次后,不同组处理的MCF-7/C6肿瘤组织中HER2蛋白和增殖蛋白的抑制机制的蛋白印迹分析。图5J-5K显示在治疗40天期间,皮下肿瘤SKBR-3(图5J)和BT474HER2阳性乳腺癌(图5K)模型中的肿瘤抑制作用的观察结果(n=8/组;NPs1的剂量每次注射8mg/kg)。***与PBS对照组相比,P<0.001。
图6显示了通过MALDI-TOF显示可转化肽单体1BP-FFVLK-YCDGFYACYMDV的化学结构和质谱。
图7显示了通过MALDI-TOF显示可转化肽单体2BP-GGAAK-YCDGFYACYMDV的化学结构和质谱。
图8显示了通过MALDI-TOF显示可转化肽单体3BP-FFVLK-PEG的化学结构和质谱。
图9显示了通过MALDI-TOF显示可转化肽单体4BP-GGAAK-PEG的化学结构和质谱。
图10显示了HER2蛋白质/肽配体比率对纤维转化的影响。在PBS溶液中与可溶性HER2蛋白孵育24小时后,获得NPs1的TEM图像和粒度测量。NPs1的浓度保持在20μM的恒定值。比例尺为200nm。HER2蛋白质/肽配体比率标记在每个显微照片上。实验重复了三次。
图11A显示了在40天的治疗期间,对皮下SKBR-3肿瘤的抗肿瘤效果(每组n=6;NPs1-4的剂量为每次注射8mg/kg,隔日一次;数据以平均值±s.d.表示)的观察。统计显著性通过带有Tukey事后检验的单因素方差分析计算。*P<0.05。11B-11C显示了在40天的治疗期间(每组n=6只;数据以平均值±标准差表示)携带有皮下BT474肿瘤(图11B)和SKBR-3肿瘤(图11C)的小鼠的体重。红色箭头表示每次静脉内注射。
图12显示了纳米纤维网络促进T细胞归巢并重新编程肿瘤微环境以增强免疫治疗。TPMs的自组装和纤维状转化的示意图,以及肿瘤组织中(I)、(II)、(III)的过程:NPs的原位纤维转化,从LLP2A前体转换至LLP2A,然后吸引和靶向T细胞,以及从M2到M1表型的TAMs再训练。TPMs、NPs、NFs、M1-TAM和M2-TAM分别代表可转化肽单体、纳米粒、纳米纤维、M1样肿瘤相关微图像和M2样肿瘤相关微图像。
图13A-13H显示了可转化肽TPM1(LXY30-KLVFFK(Pa))和TPM2(proLLP2A-KLVFFK(R848))的组装和纤维状转化。图13A显示了TPM1和TPM2的分子结构和功能的示意图。图13B显示了在以1:1的比例将水(从0%到99%)逐渐添加到由TPM1和TPM2组成的DMSO中的T-NPs溶液后,T-NPs荧光(FL)的变化;激发波长405nm。图13C显示了在与可溶性α3β1整合素蛋白相互作用24小时(H2O与DMSO的比例为99:1)后,初始T-NP和T-NP转化为纳米纤维(T-NFs)的TEM图像。实验中使用的T-NPs浓度为20μM。c中的比例尺为100nm。图13D显示了在T-NPs到T-NFs的纤维状转变过程中,Pa荧光信号随时间的变化。图13AE显示了与酯酶、可溶性α4β1整合素蛋白或α4β1整合素蛋白加酯酶作用24小时后(H2O与DMSO的比例为99:1),初始T-NP和T-NFs的TEM图像。实验中使用的T-NPs浓度为20μM。e中的比例尺为100nm。13F-3G显示了不同条件下初始T-NPs和T-NFs的粒度分布(图13F)和圆二色谱(图13G)的变化。图13H显示了R848在T-NFs中随时间的Tte体外释放曲线。α3β1或α4β1整合素蛋白与肽配体的摩尔比约为1:1000。a.u.,任意单位;mdeg,椭圆度。
图14显示了DLS实验,以确认T-NPs转化为T-NFs。溶液中20nm处的峰值逐渐下降,而700nm左右的峰值上升。
图15A-15H显示了与4T1小鼠乳腺癌细胞孵育后纤维状可转化纳米颗粒的形态特征。图15A显示了T-NPs和UT-NPs与4T1细胞相互作用6小时的细胞荧光分布图像。比例尺为10μm。实验重复三次。图15B显示了4T1细胞在暴露于T-NPs和UT-NPs 6小时,随后在不含NPs的新鲜培养基中培养18小时后的细胞荧光信号保留图像。比例尺为10μm。重复实验三次。图15C显示了经T-NPs和UT-NPs处理24小时的4T1细胞的代表性TEM图像,显示了经T-NPs处理的细胞周围丰富的纳米纤维。比例尺是200纳米。实验重复了三次。T-NPs的浓度为50μM。图15D显示了Jurkat T淋巴瘤细胞(GFP标记)与酯酶处理的T-NP孵育后的细胞荧光分布图像。Jurkat细胞被用来模拟T淋巴细胞,T淋巴细胞也表达α4β1整合素。比例尺为10μm。实验重复三次。图15E显示了未经处理的4T1和Jurkat细胞以及经T-NPs处理6小时的细胞的代表性SEM图像。比例尺为10m、实验重复了三次。图15F显示了与4T1和GFP标记的Jurkat细胞相互作用后,T-NPs(荧光红)的实验方案和细胞荧光分布图像。它显示出覆盖4T1细胞的纳米纤维网络,进而又可以吸引和结合Jurkat恶性T细胞。比例尺是10m、实验重复了三次。图5G显示了经T-NPs处理后的4T1和Jurkat细胞的代表性SEM图像(见图15F)。实验重复了三次。图15H显示了M2样小鼠巨噬细胞的代表性图像,以及随后在不同时间点通过T-NFs、T-NFs加酯酶或R848进行的再训练。比例尺是20μm。实验重复三次。统计显著性采用双侧非配对t检验计算;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
图16A-16M显示了纤维状可转化纳米颗粒的体内评估。图16A-16B显示了在注射T-NPs10、24、48、72、120和168h后采集的肿瘤组织和主要器官(心脏(H)、肝脏(Li)、脾脏(Sp)、肺(Lu)、肾(K)、肠(I)、肌肉(M)和皮肤(Sk))的时间依赖性离体荧光(FL)图像(图16A)和定量分析(图16B)。数据表示为平均值±标准差,n=3次独立实验。图16C显示了在注射UT-NPs10、24、48、72、120和168h后,采集的肿瘤组织的时间依赖性体外荧光(FL)图像。数据表示为平均值±标准差,n=3次独立实验。图16D显示了在注射T-NPs和UT-NPs10、24、48、72、120和168h后,采集的肿瘤组织的荧光(FL)定量。图16E显示了注射后72h,T-NPs、UT-NPs和未处理对照组在肿瘤组织中的分布和原位纤维转化的代表性TEM图像。“N”表示细胞核。图16F显示了注射后72h,肿瘤组织和正常皮肤组织中T-NPs的荧光(FL)分布图像(红色,T-NPs的Pa;蓝色,DAPI;比例尺,50μm)。图16G显示了注射T-NPs和UT-NPs后不同时间点,R484在肿瘤组织中的分布保留。R848的剂量:0.94mgkg-1;数据为平均值±标准差,每个时间点n=3。图16H显示了T-NPs、UT-NPs和生理盐水治疗3天后肿瘤组织中CXCL10趋化因子的表达(n=3;数据为平均值±标准差)。图16I-16K显示了从经T-NPs、UT-NPs或生理盐水对照治疗的小鼠切除的4T1肿瘤内CD45+CD3+(图16I)、CD8+/CD4+(图16J)和CD4+Foxp3+(图16K)T细胞的代表性流式细胞术分析图像。图16L显示了用T-NPs或UT-NPs治疗后从小鼠切除的肿瘤的免疫组织化学情况(IHC)。显示了T细胞(CD8+、CD4+、Foxp3+)和巨噬细胞标记物(CD68、CD163)的IHC染色的代表性图像。比例尺为100μm。图16M显示了用T-NPs或UT-NPs治疗15天后,从小鼠切除的4T1肿瘤中的IFN-γ、TGF-β、IL12、IL10、Nos2和Arg-1的表达水平(qPCR分析)(n=3;数据为平均值±标准差)。统计显著性采用双侧非配对t检验计算;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
图17A-17G显示了纤维状可转化纳米颗粒在携带4T1乳腺肿瘤的Balb/c小鼠中的抗肿瘤效果。图17A显示了实验设计:原位肿瘤接种和治疗方案;方案6是含有所有4种关键成分的T-NPs。图17B-17C显示了治疗开始后21天内对携带原位4T1肿瘤的小鼠的抑瘤效果(图17B)和体重变化(图17C)的观察结果(n=每组8个)。数据表示为平均值±标准差。图17D显示了携带4T1乳腺肿瘤的不同治疗组小鼠的累积存活率。图17E显示了第21天,从治疗小鼠切除的4T1肿瘤内CD3+CD8+T细胞的代表性流式细胞术分析图像。图17F显示了切除肿瘤的H&E和IHC图像。显示了Ki67、T细胞(CD8、Foxp3)和巨噬细胞标记物(CD68、CD163)的IHC染色代表性图像。比例尺为100μm。图17G显示了第21天,从小鼠切除的4T1肿瘤中IFN-γ,TNF-α,IL12,IL6,TGF-β,IL10,Nos2和Arg-1的表达水平(通过qPCR分析)(数据为平均值±标准差)。统计显著性采用双侧非配对t检验计算;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
图18A-18L显示了纤维状可转化纳米颗粒加上抗PD-1疗法对携带有4T1乳腺肿瘤或Lewis肺肿瘤的小鼠的抗肿瘤疗效。图18A显示了实验设计:原位肿瘤接种和治疗方案(4个治疗组;方案4、5和6与图4a所示相同)。图18B显示了携带原位4T1肿瘤小鼠治疗21天后的肿瘤反应(n=每组8个)。数据表示为平均值±标准差。***P<0.001。图18C显示了四个治疗组的累积存活率。图18D显示了实验设计:在第90天,之前用T-NPs(方案6)加抗PD-1抗体治疗的小鼠再次接种癌细胞,然后进行每隔一日的腹腔注射,一共三次剂量的抗PD-1抗体。图18E显示在相同年龄的空白小鼠中未观察到抗肿瘤免疫记忆效应。图18F显示了在之前使用T-NPs和抗PD-1抗体治疗的小鼠中观察到的抗肿瘤免疫记忆效应。图18G显示了空白小鼠和之前使用T-NPs和抗PD-1治疗的小鼠的累积存活率。图18H-18I显示了在小鼠用4T1肿瘤细胞再次激发后6天和最后一剂抗PD-1抗体后一天,小鼠血清中IFN-γ(图18H)和TNF-α(图18I)的水平。图18J-18K显示了在开始治疗后21天,携带小鼠皮下路易斯肺肿瘤的小鼠的肿瘤抑制效果(图18J)和体重变化(图18K)的观察结果(n=每组8个);治疗方案遵循图18A中的实验设计,5个周期(静脉内注射方案4-6和腹膜内注射PD-1抗体)。数据表示为平均值±标准差。图18L显示了不同治疗组携带小鼠路易斯肺肿瘤小鼠的累积存活率。统计显著性采用双侧非配对t检验计算;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
图19A显示了CPTNPs(BP-k-l-v-f-f-k-(r)8)的结构,其中绿色-双芘,蓝色-疏水键合基序,红色-细胞穿透肽。图19B显示了GG-CPTNP(BP-k-l-v-g-g-k-(r)8),颜色与A相似,其中双苯丙氨酸基序被双甘氨酸基序取代。图19C显示了CPTNP(FF)和GG CPTNP(GG)在不同pH下的DLS。图19D显示了CPTNP纳米颗粒和CPTNP单体的荧光,其中可以观察到BP的AIEE效应。图19E显示了在50μM下测量的FF和GG CPTNP的Zeta电位(a:b,p<0.0005)。图19F显示了各种特定环境下CPTNP的TEM图像。每个图像中的比例尺为100μm。
图20显示了可转化肽单体(TPM)1LXY30-KLVFFK(Pa)、2ProlP2A-KLVFFK(R848)、3LXY30-KAAGKK(Pa)、4ProlP2A-KAAGKK(R848)的化学结构和通过MALDI-TOF分析的质谱。实验重复了三次。
图21A显示了H2O和DMSO比例为99:1时NPsTPM1、NPsTPM1和T-NPs的TEM图像和粒度分布。实验重复了三次。图21B显示了使用芘作为探针测量的T-NPs的临界聚集浓度(CAC)。实验重复了三次。图21C显示了T-NPs在血清和蛋白酶(pH 7.4的PBS溶液,含/不含10%FBS和蛋白酶)中的纳米粒子稳定性,该稳定性在37℃下通过动态光散射进行测量。数据以平均值±标准差表示,n=3个独立实验。图21D显示了新制备的T-NPs和在PBS溶液中24小时后的T-NPs的TEM图像。实验重复了三次。图21E显示了使用芘作为探针测量T-NFs的TteCAC。实验重复了三次。所有TEM图像中的比例尺均为100nm。图21A、21C和21D中使用的T-NPs浓度为20μM。
图22显示了初始UT-NPs和UT-NPs与α3β1整合素蛋白相互作用24小时的TEM图像。α3β1整合素蛋白/肽配体的摩尔比约为1:1000。比例尺为100纳米。实验中使用的浓度为20μM。实验重复三次。
图23显示了用流式细胞术分析生物素化LXY30肽(蓝色曲线)和阴性对照(红色曲线)与4T1细胞的孵育。实验重复了三次。3x105细胞在冰上用1μM生物素化LXY30孵育30分钟,用PBS洗涤,然后用1:500链霉亲和素PE(1mg/mL)孵育30分钟,然后用流式细胞仪检测。
图24显示了4T1细胞与不同浓度的T-NPs和UT-NPs孵育48小时后的活力。数据以平均值±标准偏差表示,n=3个独立实验。
图25显示了在隔日一次共计8次的静脉内注射T-NP和UT-NP(每次注射13mg/kg)后,健康Balb/c小鼠的红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板、血红蛋白、淋巴细胞和总蛋白方面的血液测试参数。数据以平均值±标准差表示,n=3个独立实验。
图26显示了在隔日一次共计8次的静脉内注射T-NPs和UT-NPs(每次注射13mg/kg)后,健康Balb/c小鼠的肝功能肌酐、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、白蛋白、碱性磷酸酶、总胆红素方面的血液测试参数。数据以平均值±标准差表示,n=3个独立实验。
图27显示了T-NPs和UT-NPs的体内血液药代动力学和参数(数据以平均值±标准偏差表示,n=3个独立实验)。通过Kinetica 5.0计算C-max、AUC和T1/2(小时)。
发明的详细说明
I总则
本发明提供包含疏水部分、β-折叠肽和亲水性靶向配体的化合物,其可形成纳米载体。该纳米载体可以包括多个一种偶联物或两个不同的偶联物。纳米载体可以原位转化成纳米纤维,用于治疗疾病和成像。
II定义
除非另有明确说明,否则本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。此外,在本发明的实践中,可以使用与本文所述的方法或材料类似或等效的任何方法或材料。为了本发明的目的,定义了以下术语。
本文中使用的“一”、“一个”或“该”不仅包括具有一个成员的方面,还包括具有多个成员的诸方面。例如,单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代,除非上下文另有明确规定。因此,例如,对“细胞”的引用包括多个这样的细胞,对“试剂”的引用包括对本领域技术人员已知的一个或多个试剂的引用,等等。
“疏水部分”指化合物中基本不溶于水的部分。例如,当存在包含疏水和亲水部分的多个化合物时,疏水部分将以避免和最大程度降低与水分子的相互作用的方式来定向自身。本领域普通技术人员可以通过使用辛醇-水参考系来测量分配系数(logP值)的对数来确定部分的疏水性。LogP值大于0表示该化合物具有疏水性,而LogP值越大表示疏水性越强。
“肽”指由肽键共价连接的两个或两个以上氨基酸组成的化合物。如本文所用,该术语包括任何长度的氨基酸链,包括全长蛋白质。
“β-折叠”,也称为β折叠片,指蛋白质中的二级结构,由氢键稳定的β链组成。β链可以彼此平行或反平行堆叠,形成β-折叠。
“β-折叠肽结构域”指包含β-折叠的蛋白质结构内的结构域。
“β淀粉样肽”是指在大脑中形成淀粉样斑块的肽。在阿尔茨海默病患者的大脑中发现淀粉样斑块的形成。
“亲水性靶向配体”指化合物中可靶向细胞表面受体、细胞表面蛋白质或细胞外成分且亲水的部分。亲水性可以通过测量化合物的logP值来确定,其中小于0的值表示亲水性。值越低表示亲水性越高。靶向配体可用于靶向跨膜受体,例如但不限于整合素和表皮生长因子受体,以向细胞或细胞外环境递送化合物、药物或感兴趣的成分。亲水性靶向配体可包括但不限于肽。
“前药”是指一种生物活性不高的化合物,在原位代谢后具有生物活性。前药可通过哺乳动物体内的自发反应或酶进行代谢,产生活性化合物。前药中有用的官能团包括但不限于酯、酰胺、氨基甲酸酯、肟、亚胺、醚、磷酸盐或β-氨基酮。
“LLP2A”、“LXY30”和“LXW64”指的是能与整合素蛋白结合的化合物。本领域技术人员已知三种单独化合物的结构。
“DUPA”指谷氨酸-脲化合物,可用于向前列腺癌细胞输送细胞毒性药物。DUPA,2-[3-(1,3-二羧丙基)脲基]戊二酸,具有以下结构:
“LHRH肽”指促黄体激素释放激素肽,并且是可商购的。LHRH肽可用于靶向卵巢癌和前列腺癌细胞。
“HER2配体”指能与HER2蛋白结合的配体。示例包括但不限于抗HER2单克隆抗体,例如但不限于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗以及下面列出的EGFR配体。
“EGFR配体”指能与EGFR蛋白结合的配体。示例包括但不限于EGF、TGF-α、HB-EGF、氨水调节蛋白、β细胞素、表观基因(epigen)、上皮调节蛋白、神经调节蛋白1、神经调节蛋白2、神经调节蛋白3和神经调节蛋白4。
“Toll样受体激动剂”是指与细胞上的toll样受体结合的化合物,在免疫系统中起关键作用。与受体结合可以激活受体产生生物反应。Toll样受体激动剂的例子包括但不限于CpG寡核苷酸。
“CpG寡核苷酸”,也称为CpG ODN,是指胞嘧啶-鸟苷二核苷酸基序。这两个核苷酸可以通过磷酸二酯接头或修饰的硫代磷酸酯接头连接。
“染料”或“荧光染料”是指在这样的化学分子,该化学分子在激发后发光,通常在300-700nm范围内。在吸收转移的光能(例如光子)后,染料分子进入激发态。当分子退出激发态时,它会以较低能量光子的形式发射光能(例如,发射荧光)并将染料分子返回到其基态。染料可以是天然化合物或合成化合物。染料包括但不限于花青、卟啉和双芘。
“卟啉”是指任何具有以下卟啉核心的化合物:
其中卟啉核心可以被取代或未被取代。
“双芘”是指包含两个相互共价连接的芘亚基的化合物。两个芘亚基可以直接连接或通过接头连接。接头可以是本领域技术人员已知的任何接头,例如但不限于亚烷基、亚烯基、亚炔基、芳基、杂芳基、芳基酮、酮、胺、酰胺和脲,其中接头可以被取代。
“放射性金属螯合剂”是指与单个中心金属原子或离子结合的多齿配体。金属原子或离子可以是金属的放射性同位素。放射性金属螯合剂包括但不限于Gd(III)螯合剂、DOTA螯合剂和NOTA螯合剂。Gd(III)螯合剂包括但不限于钆喷酸、钆特酸、钆二胺、钆苯酸、钆特醇、钆维西胺和钆布醇。
“花青”或“花青染料”是指属于聚甲炔基团的合成染料家族。花青可用作生物医学成像的荧光染料。花青可以是链花青(也称为开链花青)、半花青和闭链花青。闭链花青含有氮,每个氮都是杂芳基部分的独立部分。
“药物”是指能够治疗和/或改善病症或疾病的药剂。药物可以是疏水性药物,即任何排斥水的药物。可用于本发明的疏水性药物包括但不限于脱氧胆酸、紫杉烷类、多柔比星、依托泊苷、伊立替康、SN-38、环孢菌素A、鬼臼毒素、卡莫司汀、两性霉素、伊沙匹隆、帕图匹隆(埃坡霉素类)、雷帕霉素和铂类药物。其他药物包括非甾体类抗炎药和长春花生物碱,如长春花碱等长春新碱。本发明的药物还包括前药形式。本领域技术人员将理解其他药物可用于本发明。
“化疗剂”是指可用于治疗但不限于癌症、肿瘤、瘤等疾病的化学药物。在一些实施方案中,化疗剂可以是可以被活化成细胞毒性形式的前药形式。本领域普通技术人员公知的化学治疗剂可用于本发明。化疗剂包括但不限于瑞喹莫特、加地喹莫特和咪喹莫特。
“免疫调节剂”是指通过刺激或抑制免疫系统来改变免疫反应的一类药物。免疫调节剂包括但不限于瑞喹莫特、加地喹莫特和咪喹莫特。
“抗HER2重组人抗体4D5”是指一种HER2抗体,也称为曲妥珠单抗。曲妥珠单抗通常用于治疗乳腺癌和胃癌,并且是可商购的。曲妥珠单抗包含与SEQID NO:4至少50%的肽序列同一性。曲妥珠单抗的肽序列在“合理设计的抗HER2/neu肽模拟物在体外和体内禁用P185HER2/neu酪氨酸激酶”中描述(Park等人.,Nat Biotechnol.2000年2月;18(2):194-8。)
“CDR-H3环”是指HER2抗体内部与抗原结合有关的区域。
“纳米载体”或“纳米颗粒”是指由本发明化合物的聚集产生的胶束。本发明的纳米载体可以具有疏水核心和亲水外部。
“纳米纤维”是指管状、棒状原纤维,其直径从几十到几百纳米不等。纳米纤丝可以具有高的长径比。本发明的纳米纤丝可以通过纳米颗粒在目标位点结合后的原位转化形成。
“纤维结构”是指直径在纳米到微米量级并且具有高长径比的线性、棒状纤维。纤维结构可以包括生物聚合物。纤丝结构包括但不限于纳米纤丝和微纤丝。
“细胞表面”是指将细胞外空间与细胞内部隔开的质膜。细胞表面包含脂质双层、蛋白质和碳水化合物。
“非细胞成分”是指细胞的细胞外环境,包括但不限于细胞外基质、细胞外囊泡和细胞周围的细胞因子。细胞外基质包括胶原蛋白、纤连蛋白和其他基质蛋白。配体和化合物可以与癌细胞的无细胞成分相互作用,从而影响癌细胞的生长。
“肿瘤微环境”是指肿瘤细胞及其周围的非细胞环境,包括但不限于细胞外基质、信号分子、免疫细胞、基质细胞、脉管系统、血管、细胞因子、趋化因子、生长因子和成纤维细胞。肿瘤可以通过淋巴和循环系统与微环境中的周围细胞相互作用,从而影响癌细胞的生长和进化。
“治疗”、“治疗的”和“治疗方法”是指成功治疗或改善损伤、病理、状况或症状(例如疼痛)的任何标志,包括任何客观或主观参数,例如减轻;缓解;减轻症状或使症状、损伤、病理或状况对患者更能耐受;减少症状或病症的频率或持续时间;或者,在某些情况下,防止症状发作。症状的治疗或改善可以基于任何客观或主观参数;包括,例如,体格检查的结果。
“施用”是指口服施用、作为栓剂施用、局部接触、肠胃外、静脉内、腹膜内、肌肉内、病灶内、鼻内或皮下施用、鞘内施用或向受试者植入缓释装置例如微型渗透泵。
“受试者”是指动物,如哺乳动物,包括但不限于灵长类动物(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在某些实施方案中,受试者是人。
“治疗有效量”或“治疗足够量”或“有效或足够量”是指产生对其施用的治疗效果的剂量。确切的剂量将取决于治疗的目的,并且可以由本领域技术人员使用已知技术确定(参见例如Lieberman,药物剂型(卷1-3,1992);Lloyd,药物配制的艺术、科学和技术(1999);Pickar,剂量计算(1999);和《雷明顿:药学的科学与实践》,第20版,2003,Gennaro,编辑,Lippincott,Williams和Wilkins)。在致敏细胞中,治疗有效剂量通常可以低于非致敏细胞的常规治疗有效剂量。
“癌症”是指细胞生长异常、不受控制地分裂的疾病。癌细胞可以在局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。该术语还旨在包括器官或组织的任何疾病,其特征在于该组织中正常或异常细胞的控制不佳或不受控制的增殖及其对整个身体的影响。
“成像”是指使用受试者外部的装置来确定成像剂的位置,例如本发明的化合物。成像工具的示例包括但不限于荧光显微术、正电子发射断层摄影术(PET)、磁共振成像(MRI)、超声、单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)和X射线计算机断层摄影术(CT)。正电子发射断层摄影术检测来自成像剂发射的正电子的辐射。
III.化合物
在一些实施方案中,本发明提供式(I)的化合物:A-B-C(I),其中A是疏水部分;B是肽,其中该肽形成β-折叠;C是亲水性靶向配体。亲水性靶向配体可以包括HER2配体和任何其他合适的靶向配体。
在一些实施方案中,本发明提供式(I)的化合物:A-B-C(I),其中A是疏水部分;B是肽,其中该肽形成β-折叠;C是亲水性靶向配体,其中该亲水性靶向配体是LLP2A前药、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、叶酸、LHRH肽、HER2配体、EGFR配体或toll样受体激动剂CpG寡核苷酸。
在一些实施方案中,本发明提供式(I)化合物,其中A是双芘;B是肽,其中该肽形成β-折叠;C是HER2配体。
在一些实施方案中,本发明提供式(I)的化合物:A-B-C(I),其中A是疏水部分;B是肽,其中该肽形成β-折叠;C是亲水性靶向配体,其中当疏水部分是双芘时,C不是HER2配体。
在一些实施方案中,本发明提供式(I)的化合物:A-B-C(I),其中A是疏水部分;B是肽,其中肽形成β-折叠;C是亲水性靶向配体,其中该亲水性靶向配体是LLP2A前药、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、LHRH肽、HER2配体、EGFR配体或toll样受体激动剂CpG寡核苷酸,并且其中当疏水部分是双芘,则C是LLP2A前药、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、LHRH肽、EGFR配体或toll样受体激动剂CpG寡核苷酸。
在一些实施方案中,本发明提供式(I)的化合物:A-B-C(I),其中A是疏水部分;B是肽,其中该肽形成β-折叠;C是亲水性靶向配体,其中该亲水性靶向配体是LLP2A前药、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、叶酸、LHRH肽、HER2配体、EGFR配体或toll样受体激动剂CpG寡核苷酸,当疏水部分是双芘时,C是LLP2A前药、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、叶酸、LHRH肽、EGFR配体或toll样受体激动剂CpG寡核苷酸。
可用于本发明的疏水部分包括本领域技术人员已知的任何合适的疏水部分。疏水性和亲水性通常使用辛烷-水参考系统通过化合物的logP值来测量。低于0的值表示亲水性,而高于0的值表示疏水性。可用于本发明的疏水部分包括logP值至少为1的部分。在一些实施方案中,可用于本发明的疏水部分的logP值至少为1.5。在一些实施方案中,可用于本发明的疏水部分具有1.5-15的logP值。疏水部分包括但不限于胆固醇、维生素D、维生素D衍生物、维生素E、维生素E衍生物、染料、药物和放射性金属螯合剂。在一些实施方案中,疏水部分是胆固醇、维生素D、维生素D衍生物、维生素E、维生素E衍生物、染料或药物。在一些实施方案中,疏水部分是胆固醇、维生素D、维生素E、染料或药物。在一些实施方案中,疏水部分是胆固醇、维生素D或维生素E。在一些实施方案中,疏水部分是染料或药物。
可用于本发明的染料包括但不限于Johnson,I.,组织化学杂志,20:123-140(1998)和《手册》,第11版,Johnson和Spence编辑,生命科技,加利福尼亚州卡尔斯巴德,2010中描述的任何染料。染料可以是荧光染料、三芳基甲烷染料、花青染料、亚苄基咪唑啉酮染料、靛蓝染料、双芘和卟啉。在一些实施方案中,疏水部分是染料。在一些实施方案中,疏水部分是荧光染料、卟啉或双芘。在一些实施方案中,疏水部分是花青染料、卟啉或双芘。
可用于本发明的药物包括化疗剂和免疫调节剂。例如,药物可以是但不限于脱氧胆酸或盐形式脱氧胆酸盐、派姆单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、紫杉烷(例如,紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛、浆果赤霉素III、10-去乙酰基浆果赤霉素、红豆杉A、红豆杉B或红豆杉C)、阿霉素、依托泊苷、伊立替康、SN-38、环孢菌素A、鬼臼毒素、卡莫司汀、两性霉素、伊沙匹隆、帕图匹隆(埃坡霉素类)、雷帕霉素和铂类药物。其他药物包括非甾体抗炎药和长春花生物碱,如长春花碱和长春新碱。在一些实施方案中,药物是紫杉醇、雷西莫特、加地喹莫特或脱氧胆酸盐。
在一些实施方案中,疏水部分是化疗剂、荧光染料、免疫调节剂、toll样受体激动剂、干扰素基因刺激蛋白(STING)小分子激动剂、卟啉、脱氧胆酸盐、胆固醇、维生素D、或维生素E。在一些实施方案中,疏水部分是化疗剂、荧光染料、免疫调节剂、干扰素基因刺激蛋白(STING)小分子激动剂、卟啉、胆固醇、维生素D、或维生素E。在一些实施方案中,疏水部分是化疗剂、荧光染料、免疫调节剂、干扰素基因刺激蛋白(STING)小分子激动剂、卟啉或脱氧胆酸盐。在一些实施方案中,疏水部分是化疗剂、荧光染料、免疫调节剂、卟啉或脱氧胆酸盐。在一些实施方案中,疏水部分是紫杉醇、双芘、花青染料、雷西莫特、加地喹莫特、氨基苯并咪唑、卟啉或脱氧胆酸盐。在一些实施方案中,疏水部分是紫杉醇、双芘、花青染料、雷西莫特、加地喹莫特、卟啉或脱氧胆酸盐。在一些实施方案中,疏水部分是雷西莫特或卟啉。
可用于本发明的卟啉包括本领域技术人员已知的任何卟啉。在一些实施方案中,卟啉是取代或未取代的卟啉、原卟啉IX、八乙基卟啉、四苯基卟啉、焦脱镁叶绿酸-a、脱镁叶绿酸、二氢卟吩e6、红紫素或紫嘌呤酰亚胺。在一些实施方案中,卟啉是焦脱镁叶绿酸-a、脱镁叶绿酸、二氢卟吩e6、红紫素或红紫酰亚胺。在一些实施方案中,卟啉是脱镁叶绿酸-a。在一些实施方案中,卟啉具有以下结构:
在一些实施方案中,疏水部分是双芘。可用于本发明的双芘包括本领域技术人员已知的任何双芘。在一些实施方案中,双芘包含以下部分:
在一些实施方案中,双芘包含以下:
在一些实施方案中,双芘具有以下结构:
可用于本发明的肽可以是任何合适的肽,并且具有本领域技术人员已知的任何合适的肽序列长度。在一些实施方案中,肽是长度为5-50个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中,肽是长度为5-40个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中,肽是长度为5-30个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中,肽是长度为5-25个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中,肽是长度为5-20个氨基酸的肽序列。
在一些实施方案中,肽是长度为5-15个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中,肽是长度约5-10个氨基酸的肽序列。
相邻的β链肽在每条链之间形成氢键,从而产生β折叠肽。可用于本发明的β-折叠肽序列可以是本领域技术人员已知的任何合适的肽序列。例如,众所周知的β-折叠肽在“支链KLVFF四聚体β-淀粉样蛋白聚集的强效抑制剂”
(Chafekar等人,生物化学。2007年10月15日;8(15):1857-64)中有所描述。在一些实施方案中,肽包含来自绿色荧光蛋白、白细胞介素、免疫球蛋白或β-淀粉样肽的β-折叠肽结构域的肽序列。在一些实施方案中,肽包含来自β-淀粉样肽的β-折叠肽结构域的肽序列。在一些实施方案中,β-淀粉样肽是β-淀粉样蛋白40或β-淀粉样蛋白42。在一些实施方案中,β-淀粉样蛋白肽是β-淀粉样蛋白40。
在一些实施方案中,肽包含与SEQ ID NO:1至少40%的序列同一性。在一些实施方案中,肽包含与SEQ ID NO:1至少50%的序列同一性。在一些实施方案中,肽包含与SEQ IDNO:1至少60%的序列同一性。在一些实施方案中,肽包含与SEQ ID NO:1至少80%的序列同一性。在一些实施方案中,肽包含SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中,肽包含与SEQ ID NO:2至少40%的序列同一性。在一些实施方案中,肽包含与SEQ ID NO:2至少50%的序列同一性。在一些实施方案中,肽包含与SEQ IDNO:2至少60%的序列同一性。在一些实施方案中,肽包含与SEQ ID NO:2至少80%的序列同一性。在一些实施方案中,肽包含SEQ ID NO:2。
在一些实施方案中,肽包含与SEQ ID NO:3至少40%的序列同一性。在一些实施方案中,肽包含与SEQ ID NO:3至少50%的序列同一性。在一些实施方案中,肽包含与SEQ IDNO:3至少60%的序列同一性。在一些实施方案中,肽包含与SEQ ID NO:3至少80%的序列同一性。在一些实施方案中,肽包含SEQ ID NO:3。
可用于本发明的亲水性靶向配体可以靶向细胞表面上的受体,或肿瘤微环境的无细胞成分。亲水性和疏水性通常使用辛烷-水参考系统通过化合物的log P值来测量。低于0的值表示亲水性,而高于0的值表示疏水性。在一些实施方案中,亲水性靶向配体包括靶向肿瘤微环境中的细胞表面受体或无细胞成分的肽,其包括但不限于免疫细胞,例如巨噬细胞、T细胞和B细胞。在一些实施方案中,亲水性靶向配体靶向细胞表面受体,例如但不限于整联蛋白和表皮生长因子受体。在一些实施方案中,亲水性靶向配体靶向整合素、表皮生长因子和toll样受体。
在一些实施方案中,亲水性靶向配体是HER2配体、HER2配体的前药、受体酪氨酸蛋白激酶靶向配体、整联蛋白靶向配体、表皮生长因子受体靶向配体、卵巢癌细胞靶向配体,或前列腺癌细胞靶向配体。在一些实施方案中,亲水性靶向配体是HER2配体、HER2配体的前药、整联蛋白靶向配体、表皮生长因子受体靶向配体、卵巢癌细胞靶向配体或前列腺癌细胞靶向配体。
在一些实施方案中,亲水性靶向配体是HER2配体。在一些实施方案中,HER2配体是抗HER2抗体肽。在一些实施方案中,亲水性靶向配体是HER2配体,其中HER2配体是衍生自抗HER2重组人抗体4D5的CDR-H3环一级序列的抗HER2抗体肽模拟物。在一些实施方案中,HER2配体如“合理设计的抗HER2/neu肽模拟物在体外和体内使P185HER2/neu酪氨酸激酶失效”(Park等人。纳特生物技术。2000年2月;18(2):194-8。)中所述。
在一些实施方案中,HER2配体与SEQ ID NO:4具有至少40%的序列同一性。在一些实施方案中,HER2配体与SEQ ID NO:4具有至少50%的序列同一性。在一些实施方案中,HER2配体与SEQ ID NO:4具有至少60%的序列同一性。在一些实施方案中,HER2配体与SEQID NO:4具有至少80%的序列同一性。在一些实施方案中,HER2配体是SEQ ID NO:4。
在一些实施方案中,亲水性靶向配体是整联蛋白靶向配体、表皮生长因子受体靶向配体、卵巢癌细胞靶向配体或前列腺癌细胞靶向配体。在一些实施方案中,亲水性靶向配体是整联蛋白靶向配体、表皮生长因子受体靶向配体、卵巢癌细胞靶向配体或前列腺癌细胞靶向配体的前药。
在一些实施方案中,亲水性靶向配体是LLP2A前药、LLP2A、LXY30、DUPA、叶酸、LHRH肽或EGFR配体。DUPA结构中的任何一个羧酸基团都可用于连接到β-折叠肽。LHRH类似物肽包含以下肽序列:
H-Glp-His-Trp-Ser-Thr-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2或
H-Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2。LHRH肽的Lys侧链NH2基团可用于连接至β-肽折叠。在一些实施方案中,NH2基团用于与β-肽折叠共价连接。
可用于本发明的EGFR配体包括本领域技术人员已知的任何EGFR配体。
在一些实施方案中,EGFR配体可以是EGF、TGF-a、HB-EGF、氨水调节蛋白、β细胞素、表观基因、上皮调节蛋白、神经调节蛋白1、神经调节蛋白2、神经调节蛋白3和神经调节蛋白4。
在一些实施方案中,亲水性靶向配体是LLP2A前药、LLP2A或LXY30。LLP2A前药可包括本领域技术人员已知的待原位代谢的任何可切割官能团。在一些实施方案中,LLP2A前药包含酯、酰胺、氨基甲酸酯、肟、亚胺、醚、磷酸酯或β-氨基-酮官能团。在一些实施方案中,LLP2A前药包含酯、酰胺、氨基甲酸酯、醚或磷酸酯官能团。在一些实施方案中,LLP2A前药包含酯、酰胺、氨基甲酸酯或磷酸酯官能团。在一些实施方案中,LLP2A前药包含酯基团。
在一些实施方案中,亲水性靶向配体是LLP2A前药,具有以下结构:
在一些实施方案中,亲水性靶向配体是LLP2A,具有以下结构:
在一些实施方案中,亲水性靶向配体是LXY30,具有以下结构:
在一些实施方案中,本发明的化合物具有以下结构:
在一些实施方案中,本发明的化合物具有以下结构:
在一些实施方案中,本发明的化合物具有以下结构:
在一些实施方案中,本发明的化合物具有以下结构:
在一些实施方案中,本发明的化合物具有以下结构:
在一些实施方案中,本发明的化合物具有以下结构:
IV.纳米载体
在一些实施方案中,本发明提供具有内部和外部的纳米载体,所述纳米载体包含多个本发明的化合物,其中各化合物在水性溶剂中自组装以形成纳米载体,从而在纳米载体的内部形成疏水袋,并且亲水基团在纳米载体的外部自组装。
本发明的纳米载体的直径可以是本领域技术人员已知的任何合适的尺寸。在一些实施方案中,纳米载体可以具有5至100nm的直径。在一些实施方案中,纳米载体可以具有10至100nm的直径。在一些实施方案中,纳米载体可以具有15至80nm的直径。在一些实施方案中,纳米载体可以具有25至60nm的直径。在一些实施方案中,纳米载体可以具有约20nm、30nm、40nm、50nm、60nm或约70nm的直径。在一些实施方案中,纳米载体可以具有约20nm或约30nm的直径。在一些实施方案中,纳米载体可以具有约20nm的直径。在一些实施方案中,纳米载体可以具有约30nm的直径。
纳米载体的外部可用于细胞靶向。本发明的纳米载体可以靶向细胞表面受体和蛋白质,例如但不限于整联蛋白、人表皮生长因子受体2(HER2)、表皮生长因子受体和G蛋白偶联受体。在一些实施方案中,纳米载体可以靶向整联蛋白和HER2。
纳米载体与细胞表面的受体或蛋白质结合后可原位转化,形成纳米纤丝结构。在一些实施方案中,纳米载体可以在与细胞表面上的HER2结合后原位转化。
在一些实施方案中,纳米载体还包含隔离在纳米载体的疏水袋中的疏水药物或成像剂。
可用于本发明的疏水性药物可以是本领域技术人员已知的任何疏水性药物。可用于本发明的疏水性药物包括但不限于脱氧胆酸、脱氧胆酸盐、雷西莫特、加地喹莫特、咪喹莫特、紫杉烷(例如,紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛、浆果赤霉素III、10-脱乙酰浆果赤霉素、红豆杉A、红豆杉B、或红豆杉C)、阿霉素、依托泊苷、伊立替康、SN-38、环孢菌素A、鬼臼毒素、卡莫司汀、两性霉素、伊沙匹隆、帕图匹隆(埃坡霉素类)、雷帕霉素和铂类药物。其他药物包括非甾体类抗炎药和长春花生物碱、如长春花碱和长春新碱。
可用于本发明的成像剂可以是本领域技术人员已知的任何成像剂。成像剂包括但不限于顺磁剂、光学探针和放射性核素。顺磁剂是在外加场下具有磁性的成像剂。顺磁剂的例子包括但不限于铁颗粒,包括纳米颗粒。光学探针是荧光化合物,可以通过在一个辐射波长下激发和在第二个不同波长的辐射下进行检测来检测。可用于本发明的光学探针包括但不限于Cy5.5、亚历克斯680、Cy5、DiD(1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二羰花青高氯酸盐)和DiR(1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三羰花青碘化物)。其他光学探针包括量子点。放射性核素是经历放射性衰变的元素。可用于本发明的放射性核素包括但不限于3H、11C、13N、18F、19F、60Co、64Cu、67Cu、68Ga、82Rb、90Sr、90Y、99Tc、99mTc、111In、123I、124I、125I、129I、131I、137Cs、177Lu、186Re、188Re、211At、Rn、Ra、Th、U、Pu和241Am。
纳米载体可以包括多个偶联物。例如,纳米载体可以包括两种、三种、四种、五种、六种或更多种不同的多个偶联物。在一些实施方案中,纳米载体包含两种不同的多个偶联物。在一些实施方案中,纳米载体包含三种不同的多个偶联物。在一些实施方案中,纳米载体包含四种不同的多个偶联物。
在一些实施方案中,本发明提供具有内部和外部的纳米载体,所述纳米载体包含多个第一偶联物和第二偶联物,其中所述第一偶联物包含式(I):A-B-C(I);并且第二偶联物包含式(II):A'-B'-C'(II);其中:A和A'各自独立地是疏水部分;B和B'各自独立地是肽,其中每个肽独立地形成β-折叠;C和C'各自独立地是亲水性靶向配体,其中每个亲水性靶向配体独立地是LLP2A前药、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、叶酸、LHRH肽、HER2配体、EGFR配体或放射性金属螯合剂;并且其中A和A'是不同的疏水部分和/或C和C'是不同的亲水靶向配体。
在一些实施方案中,纳米载体包含多个如上所述的第一偶联物和第二偶联物,并且进一步包含含有式(III)的第三偶联物:A”-B”-C”(III);其中A”是疏水部分,B”是肽,其中该肽形成β-折叠,并且C”是亲水性靶向配体,并且其中A、A'和A”是不同的疏水部分和/或C、C'和C”是不同的亲水性靶向配体。在一些实施方案中,纳米载体还包含第四、第五或第六偶联物,其中每个另外的偶联物独立于式III。
本发明的纳米载体可以包含两种不同的多个偶联物。包含两种不同的多个偶联物的纳米载体可以具有如上所述的直径。包含两种不同的多个偶联物的纳米载体可以具有如上所述的类似靶向和转化特性。
上文描述了用于本发明的纳米载体的合适疏水部分。在一些实施方案中,每个疏水部分独立地是染料、药物或放射性金属螯合剂。在一些实施方案中,每个疏水部分独立地是双芘、卟啉、雷西莫特或加地喹莫特。
在一些实施方案中,每个疏水部分独立地是卟啉或雷西莫特。在一些实施方案中,卟啉是焦脱镁叶绿酸-a、脱镁叶绿酸、二氢卟吩e6、红紫素或红紫酰亚胺。在一些实施方案中,卟啉是脱镁叶绿酸-a。在一些实施方案中,卟啉具有以下结构:
在一些实施方案中,雷西莫特具有以下结构:
可用于本发明的放射性金属螯合剂包括本领域技术人员已知的任何放射性金属螯合剂。在一些实施方案中,放射性金属螯合剂是Gd(III)螯合剂、二乙烯三胺五酸酐(DTPA)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)。在一些实施方案中,放射性金属螯合剂是Gd(III)螯合剂、DOTA螯合剂或NOTA螯合剂。
上文描述了本发明的纳米载体的合适肽序列长度。在一些实施方案中,每个肽独立地是长度为5-30个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中,每个肽独立地是长度为5-25个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中,每个肽独立地是长度为5-20个氨基酸的肽序列。
上文描述了本发明的纳米载体的合适肽序列。在一些实施方案中,每个肽独立地包含来自β-淀粉样蛋白肽的β-折叠肽结构域的肽序列。在一些实施方案中,β-淀粉样肽是β-淀粉样蛋白40或β-淀粉样蛋白42。在一些实施方案中,β-淀粉样蛋白肽是β-淀粉样蛋白40。
在一些实施方案中,每个肽独立地包含与SEQ ID NO:1至少40%的序列同一性。在一些实施方案中,每个肽独立地包含与SEQ ID NO:1至少50%的序列同一性。在一些实施方案中,每个肽独立地包含与SEQ ID NO:1至少60%的序列同一性。在一些实施方案中,每个肽独立地包含与SEQ ID NO:1至少80%的序列同一性。在一些实施方案中,每个肽独立地包含SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中,每个肽独立地包含与SEQ ID NO:2至少40%的序列同一性。在一些实施方案中,每个肽独立地包含与SEQ ID NO:2至少50%的序列同一性。在一些实施方案中,每个肽独立地包含与SEQ ID NO:2至少60%的序列同一性。在一些实施方案中,每个肽独立地包含与SEQ ID NO:2至少80%的序列同一性。
上文描述了用于本发明的纳米载体的合适的亲水性靶向配体。在一些实施方案中,每个亲水性靶向配体独立地是LLP2A前药、LLP2A、LXY30、叶酸、LHRH肽、HER2配体、EGFR配体、Gd(III)螯合剂、DOTA螯合剂或NOTA螯合剂。在一些实施方案中,每个亲水性靶向配体独立地是LLP2A前药、LLP2A、LXY30、LHRH肽、HER2配体、EGFR配体、DOTA螯合剂或NOTA螯合剂。在一些实施方案中,每个亲水性靶向配体独立地是LLP2A前药、LLP2A或LXY30。
在一些实施方案中,每个亲水性靶向配体独立地是LLP2A前药,具有以下结构:
在一些实施方案中,每个亲水性靶向配体独立地是LLP2A,具有以下结构:
在一些实施方案中,每个亲水性靶向配体独立地为LXY30,具有以下结构:
在一些实施方案中,第一偶联物具有以下结构:
在一些实施方案中,第二偶联物具有以下结构:
在一些实施方案中,第二偶联物原位转化为以下结构:
本发明的纳米载体的第一偶联物与第二偶联物的比率可以是本领域技术人员已知的任何合适的比率。在一些实施方案中,第一偶联物与第二偶联物的比率为约25:1至1:25。在一些实施方案中,第一偶联物与第二偶联物的比率为约25:1至1:10。在一些实施方案中,第一偶联物与第二偶联物的比率为约10:1至约1:10。在一些实施方案中,第一偶联物与第二偶联物的比率为约10:1、8:1、5:1、3:1或1:1。在一些实施方案中,第一偶联物与第二偶联物的比率为约1:1。
V.纳米纤维
在一些实施方案中,本发明提供了形成纳米纤维的方法,包括使本发明的纳米载体与肿瘤微环境中的细胞表面或无细胞成分接触,其中纳米载体经历原位转化以形成纤维结构,从而形成纳米纤维。
当本发明的纳米载体与肿瘤微环境中的细胞表面或非细胞成分结合时,它可以进行原位转化形成纳米纤维,从而破坏细胞和/或肿瘤微环境。当纳米载体的亲水性靶向配体与细胞表面或感兴趣的非细胞成分结合时,会发生纳米载体的转化,从而触发形成纳米纤维的纤维结构的形成。
肿瘤微环境包括肿瘤细胞和周围环境,包括但不限于细胞外基质、浸润宿主细胞、分泌因子、信号分子、免疫细胞、基质细胞、树突状细胞、T细胞、髓源性抑制细胞、脉管系统、血细胞、细胞因子、趋化因子、生长因子、成纤维细胞和巨噬细胞,本发明的纳米载体可以与之相互作用以形成纳米纤维。
本发明的纳米载体可以形成纳米纤维的高度有序的β-折叠纤维结构。不受任何特定理论的束缚,形成β-折叠纤维结构的一种可能解释是偶联物中的β-折叠形成肽影响纳米纤维的β-折叠纤维结构的形成。
本发明的纳米纤维可以具有本领域技术人员已知的任何合适的直径。在一些实施方案中,纳米纤维的直径为5至50nm。在一些实施方案中,纳米纤维的直径为5至30nm。在一些实施方案中,纳米纤维的直径为5至15nm。在一些实施方案中,纳米纤维的直径为5至10nm。在一些实施方案中,纳米纤维的直径为约5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm或约12nm。
纳米载体向纳米纤维的转化可以通过本领域技术人员已知的成像技术和通过测量纳米载体的粒度来确定。例如,纳米载体向纳米纤维的转变可以使用TEM成像来确定,其中圆形纳米载体形状在纳米载体与肿瘤微环境中的细胞表面或非细胞成分结合后转变为纳米纤维结构。在另一个例子中,纳米载体尺寸可以使用动态光散射(DLS)来确定。在DLS研究中,当纳米载体转化为纳米纤维时,纳米载体直径附近的峰值,例如10-100nm,会随着时间的推移而减少,而500nm-1000nm附近的峰值则随着时间的推移而增加,表明形成了纳米纤维。
VI.治疗和成像方法
在一些实施方案中,本发明提供治疗疾病的方法,包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的纳米载体,其中所述纳米载体在与肿瘤微环境中的细胞表面或非细胞成分结合后原位形成纳米纤维,从而治疗疾病。
与细胞表面或非细胞成分的结合可以由本领域普通技术人员使用荧光显微镜来确定。当纳米载体包含具有荧光染料作为疏水部分的偶联物并且细胞用本领域技术人员已知的任何荧光染料标记时,可以确定与细胞表面或无细胞组分的结合。本领域技术人员可以基于将哪种荧光染料用作疏水部分来选择合适的染料来使用。例如,当纳米载体包含其中疏水部分包含双芘(其为绿色荧光染料)的偶联物时,细胞可以用非绿色荧光染料标记,例如但不限于红色荧光染料或蓝色荧光染料。在另一个实例中,如果疏水部分包含红色荧光染料,例如但不限于卟啉,则本领域技术人员可以选择非红色荧光染料,例如绿色荧光染料或蓝色荧光染料。
肿瘤微环境包括肿瘤细胞和周围环境,包括但不限于细胞外基质、浸润宿主细胞、分泌因子、信号分子、免疫细胞、基质细胞、树突细胞、T细胞、髓源性抑制细胞、脉管系统、血细胞、细胞因子、趋化因子、生长因子、成纤维细胞和巨噬细胞。肿瘤的生长和进展可能受到癌细胞与微环境的相互作用的影响,从而导致癌细胞的根除、癌细胞的转移或建立休眠的微转移癌细胞。肿瘤微环境可以作为治疗反应的靶标。
在肿瘤微环境中与非细胞成分的结合包括但不限于与细胞外基质内的蛋白质和直接附着于肿瘤细胞或周围细胞的其他配体、化合物或树突细胞结合。
本发明的纳米载体可以施用于受试者以治疗疾病,包括癌症,例如但不限于:癌、神经胶质瘤、间皮瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、前列腺癌和伯基特淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝胆癌、胆囊癌、小肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、尿道癌、睾丸癌、宫颈癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、胰腺内分泌癌、类癌、骨癌、皮肤癌、视网膜母细胞瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(其他癌症参见,癌症:原则和实践(DeVita,V.T.等人,2008编辑))。
本发明的纳米载体可以治疗的其他疾病包括:(1)炎症或过敏性疾病,例如全身性过敏反应或超敏反应、药物过敏、昆虫叮咬过敏等;炎症性肠病,如克罗恩病、溃疡性结肠炎、回肠炎和肠炎;阴道炎;银屑病和炎症性皮肤病,如皮炎、湿疹、特应性皮炎、过敏性接触性皮炎、荨麻疹;血管炎;脊柱关节病;硬皮病;呼吸道过敏性疾病,例如哮喘、过敏性鼻炎、过敏性肺病等;(2)自身免疫性疾病,如关节炎(类风湿性和银屑病性)、骨关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、糖尿病、肾小球肾炎等;(3)移植排斥(包括同种异体移植排斥和移植物抗宿主病);和(4)其他需要抑制不良炎症反应的疾病(例如,动脉粥样硬化、肌炎、神经系统疾病,如中风和闭头损伤、神经退行性疾病、阿尔茨海默病、脑炎、脑膜炎、骨质疏松症、痛风、肝炎、肾炎、败血症、结节病、结膜炎、中耳炎、慢性阻塞性肺病、鼻窦炎和白塞综合征)。
在一些实施方案中,所述疾病是癌症。在一些实施方案中,所述疾病选自膀胱癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、食道癌、胆囊癌、胃癌、胶质母细胞瘤、肠癌、头颈癌、白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌和子宫癌。在一些实施方案中,所述疾病选自膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、食道癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、白血病、肺癌、骨髓瘤、卵巢癌和胰腺癌。
在一些实施方案中,本发明的纳米载体可以用于联合治疗。在一些实施方案中,联合疗法包括本发明的纳米载体和至少一种检查点抑制剂。代表性的检查点抑制剂包括但不限于例如抗CTLA-4疗法、抗PD-1疗法或抗PD-L1疗法。实例包括易普利姆玛、纳武单抗、派姆单抗、匹利珠单抗、阿特珠单抗、易普利姆玛和/或曲美木单抗,并且可以包括联合疗法,例如纳武单抗+易普利姆玛。
在一些实施方案中,本发明提供了成像方法,包括向待成像的对象施用有效量的本发明的纳米载体。
适用于本发明纳米载体的成像剂如上所述。例如,成像剂包括但不限于顺磁剂、光学探针和放射性核素。光学探针包括但不限于荧光染料,例如花青染料、双芘和卟啉。
VII.实施例
实施例1:BP-FFVLK-YCDGFYACYMDV的纳米载体
本实施例描述了一种智能超分子肽BP-FFVLK-YCDGFYACYMDV的设计和合成,该肽能够(1)在水性条件和血液循环中组装成纳米颗粒(NPs),以及(2)在与肿瘤部位的细胞表面HER2结合后,原位转化为纳米纤维(NFs)结构。这种可转化的肽单体(TPM)是一种超分子材料,由三个离散的功能域组成:(1)双芘(BP)部分,具有用于荧光报告的聚集诱导发射(AIE)特性,并作为疏水核心诱导胶束NPs的形成,(2)源自β-淀粉样蛋白(Aβ)肽的KLVFFβ-折叠形成肽结构域,和(3)YCDGFYACYMDV二硫环肽HER2结合结构域,一种抗HER2/neu抗体肽模拟物,衍生自抗HER2重组人抗体4D5的CDR-H3环的一级序列。在水性条件下,超分子肽会自组装成球形NP,其中BP和KLVFF结构域构成疏水核,YCDGFYACYMDV肽构成带负电荷的亲水冠。经静脉内注射(i.v.)到携带HER2+肿瘤的小鼠体内的NPs,被发现优先积聚在肿瘤部位。在与肿瘤细胞表面显露的HER2相互作用后,NPs将原位转化为纤维状结构网络,且具有较长的保留时间。发现这种结合HER2的细胞外纤维网络极大地抑制了HER2的二聚化,并阻止下游细胞信号传导以及细胞核中增殖和存活基因的表达。这些基于结构转化的超分子肽代表了一类新型的受体介导的针对癌症的靶向疗法。
材料和方法
可转化肽单体(TPMS)1'-4'的制备。疏水性双芘单元(BP-COOH)的合成方法如先前报道(Qiao,S.-L.等人,细胞表面聚合物-肽的温控原位相变以实现高效增殖抑制。美国化学学会-应用材料与界面8,17016-17022(2016)。)。TPM1'-4'通过标准固相肽合成技术合成。作为疏水部分的BP-COOH与TPMs的1'-4'链相连。对于TPMs3'和4',PEG1000作为亲水单元连接到肽上,以取代分子1和2的HER2配体。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱确认BP染料和肽的分子结构(ESI和MALDI-TOF质谱,布鲁克·道尔顿)。
NPs的自组装制备和表征。TPMs 1'-4'分别溶解在DMSO中形成溶液。肽溶液(5μL)进一步用DMSO(995,795,595,395,195,95,15,0μL)稀释并分别与去离子水(0,200,400,600,800,900,980,995μL)混合。测量不同含水量混合物溶液的UV-vis吸收和荧光光谱(赛飞科技,沃尔瑟姆,马萨诸塞州)以验证NPs的形成。新鲜的NPs(99%的水含量,20μM)作为初始状态用于测量。通过添加HER2胞外受体蛋白(在HEK 293细胞中表达,西格玛奥德里奇)并在37℃下培养数小时,将NPs形态转化为NFs。在不同的时间点(0.5、6和24小时),溶液用于粒径/zeta电位(麦奇克,美国)、CD(JASCO公司,伊斯顿,马里兰州,美国)和TEM测量(飞利浦CM-120TEM,美国)。TEM样品用乙酸双氧铀染色。
NPs1在人血浆中的稳定性。在来自健康人类志愿者的10%(v/v)血浆中研究了NPs1的稳定性。将混合物在生理体温(37℃)下孵育,然后以预定的时间间隔进行尺寸测量,最长可达168小时。
MCF-7/C6细胞诱导过程。MCF-7/C6细胞的诱导方法获自李健健教授实验室(放射肿瘤学系,加州大学戴维斯分校)。MCF-7/C6抗辐射细胞系在25次分次电离辐射中存活,总剂量为50Gyγ射线(每次2Gy,每周5次)。
细胞表面上NPs结构转变的CLSM和SEM验证。将细胞在玻璃底培养皿中培养12小时。37℃下NPs1-4(50μM)与细胞在DMEM中分别孵育0.5、6和24小时。对于共聚焦激光扫描显微镜(CLSM,蔡司LSM710,耶拿,德国)成像,样品用戊二醛(4%)固化10分钟,用PBS洗涤3次,并用40×或63×浸没物镜使用405nm的激光检查。为了进一步验证NPs1与HER2的结合,使用兔抗HER2(29D8)单克隆抗体(MAb)(西格玛奥德里奇,美国)检测MCF-7/C6细胞表面HER2的胞外结构域。对于SEM(飞利浦XL30TMP,FEI公司,新墨西哥州),细胞用戊二醛(4%)固化过夜,然后用金包被2分钟。
体外细胞毒试验。MCF-7/C6、MCF-7、SKBR-3和BT474细胞用于评估NPs1-4的细胞毒性。将每孔细胞接种在96孔板(n=3)中,37℃,在含有5%CO2的湿润环境中,用补充有10%FBS和1%青霉素的DMEM中培养。将1-4的DMSO溶液用DMEM(1.5,7.5,15,75,150,300μM)稀释,然后加入每个孔中与细胞一起孵育。孵育48h后,每孔加入MTS试剂。通过酶标仪(SpectraMax M2)测量相对细胞活力。细胞活力百分比代表药物作用,100%表示所有细胞存活。使用以下等式计算细胞活力:细胞活力(%)=(处理的OD490nm/空白对照的OD490nm)×100%。
蛋白质印迹分析。MCF-7/C6细胞在不同条件下处理,然后在14,000rpm下离心10分钟收集,并用含有蛋白酶抑制剂的1%(v/v)Triton X-100的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 8.0,150mM NaCl)裂解。使用BCA试剂盒(普利莱)估计总细胞蛋白。对每个样品(50μg蛋白质)进行SDS-PAGE并转移到硝酸纤维素膜上。在室温下用5%(wt/v)脱脂奶粉在印迹溶液(20mM Tris-HCl、pH 7.5、150mM NaCl和0.1%吐温20)中封闭2小时后,在4℃下将膜与一级抗体孵育过夜。然后将膜用TBST溶液洗涤(3×5分钟),并与二级抗体在室温下孵育2小时。在Typhoon Trio可变模式成像仪上通过化学发光显示信号。使用NIH ImageJ软件计算条带密度。
对于HER2二聚体蛋白质印迹分析,用指定的方案处理MCF-7/C6细胞,然后在含有137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、1%Triton X-100和蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液中裂解(西格玛奥德里奇)。在12,000rpm下离心15分钟后收集裂解上清液。在37℃下将0.2%戊二醛添加到裂解上清液中10分钟。收集裂解物用于蛋白质印迹分析。
动物模型。所有动物实验均符合加州大学戴维斯分校动物使用和护理行政咨询委员会批准的第19724号协议。雌性BALB/c裸鼠为6-8周龄(体重22±2g),购自Harlan(利弗莫尔,加利福利亚州,美国)。将MCF-7/C6细胞(每只小鼠5×106个细胞)分别皮下接种到每只雌性BALB/c裸鼠的胁腹。大约10天后,通过尾静脉注射NPs1-4(8mg/Kg),并在注射后10、24、48、72、168小时,收集肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、肠、肌肉、皮肤的离体图像,。通过体内荧光成像系统(Carestream In-Vivo Imaging System FXPRO,美国)收集图像。在注射NPs后72小时收集肿瘤和主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和脑)并用戊二醛(4%)固化以进行TEM成像。
体内治疗效果。在我们的实验中,使用皮下接种到侧腹的具有MCF-7/C6细胞(每只小鼠5×106个细胞)肿瘤的BALB/c裸鼠。在肿瘤接种后10天,将小鼠随机分为5组。每48小时通过静脉注射PBS、NPs1、NPs2、NPs3和NPs4处理一次。在治疗过程中(40天),每周两次测量肿瘤体积和体重。同时,用上述类似的实验方法,在携带SKBR-3和BT474肿瘤的小鼠中验证了NPs1的治疗效果。对于苏木精和伊红(H&E)染色试验和Ki-67试验,3次处理后处死MCF-7/C6荷瘤小鼠,收集肿瘤组织。
统计分析。数据表示为平均值±标准偏差(SD)。使用学生t检验(双尾)分析组间的比较。单因素方差分析(ANOVA)用于多组分析。显著性水平定义为*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。所有统计测试都是双向的。
结果和讨论
超分子材料的自组装和纤维状转化。可转化肽单体1(TPM1'),BP-FFVLK-YCDGFYACYMDV,采用标准固相肽合成技术制备,然后用双芘在N端加帽,并通过MALDI-TOF-MS确认其身份(图6)。为进行比较,合成了TPM2'(BP-GGAAK-YCDGFYACYMDV)、TPM3'(BP-FFVLK-PEG1000)和TPM4'(BP-GGAAK-PEG1000)作为阴性对照(表1和图7-9)。随着TPM1'溶液的混合溶剂(水和DMSO)中水的比例增加,吸收峰(250-450nm)逐渐减少,反映了纳米粒子NPs1通过自组装逐渐形成,这是由BP和β-折叠形成肽序列的π-π相互作用和强疏水性(图1A)引起的。同时,由于BP染料的AIE荧光特性,发现520nm处的荧光峰显著增加(图1B)。TPM2'、TPM3'和TPM4'都表现出相似的自组装特性。通过动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)分析由四种TPMs通过快速水稀释法组装而成的纳米颗粒(NPs1、NPs2、NPs3和NPs4)(图1C)。发现NPs1-4的直径分别约为20nm、30nm、25-60nm和20nm。
表1.可转化肽单体(TPM)1'-4'的分子组成
TPM1’BP-FFVLK-YCDGFYACYMDV(带有HER2结合肽,但没有β-折叠形成肽);
TPM2’BP-GGAAK-YCDGFYACYMDV(带有HER2结合肽,但没有β-折叠形成肽);
TPM3’BP-FFVLK-PEG1000(不含HER2结合肽,但具有β-折叠形成肽);
TPM4’BP-GGAAK-PEG1000(不含HER2结合肽或β-折叠形成肽)。
为了在体外研究NPs1与HER2的相互作用,选择了HER2蛋白的可溶性胞外域作为转化诱导剂。如图1C中的TEM图像所示,发现在与HER2相互作用之前,NPs1保持约20nm的球形结构。在室温下与HER2蛋白孵育仅30分钟后(HER2肽/HER2蛋白的摩尔比≈1000:1),少量颗粒状纳米纤维结构(NFs1,宽度直径约10nm)变得明显;在6小时时,检测到更多的NFs1。到24小时,清晰地检测到具有广泛尺寸分布的纤维状网络,表明转化过程是受体介导的和时间依赖性的。即使在24小时后,在不添加HER2蛋白的情况下,在NPs1制剂中也没有观察到转化。DLS也证实了溶液中从NPs1到NFs1的结构转变(图1D),随着时间的推移,20nm峰逐渐降低,100至1000nm峰相应增加。相比之下,用HER2对NPs2、NPs3和NPs4溶液进行类似处理,在24小时内没有显示任何显著变化。形成这三个阴性对照NPs的TPMs的共同特征是,在NPs1中缺乏同时存在的受体介导转化的两个基本结构域:HER2配体和KLVFFβ-折叠形成肽。圆二色(CD)光谱术用于监测TPM1'在转化后的构象和二级结构(图1E)。在快速自组装形成NPs1的初始阶段,没有观察到明显的二级结构,可能是因为BP诱导的疏水相互作用太快而无法形成任何分子间氢键。在HER2存在的情况下,随着NPs1在24小时内开始转变为NFs1,216nm的负CD信号和195nm的正CD信号随着时间的推移逐渐形成,表明通过氢键形成β-折叠。除了CD之外,还利用了BP独特的AIE荧光特性来监测TPM1转化的动力学。如图1F所示,NPs1中BP的荧光强度在加入HER2后30分钟下降约10%,但随着向NFs1转化的进行,转而增加,最终在24小时时增加约50%。对这一有趣观察结果的合理解释是,BP或TPM1'在纤维状网络(24小时时的NFs1)中的堆积密度显著高于初始球形结构(NPs1)中的堆积密度。然而,在球形NPs1暴露于HER2的初始转变过程中,在重新组织成更密集的纳米纤维网络之前,堆积密度有一个短暂的松弛。还证明了在37℃下,不含HER2的PBS中NPs1的粒径在7天内保持不变,无论是否存在10%胎牛血清(FBS)。
NPs纤维状转化的形态特征。为了进一步表征转化肽与活细胞表面受体之间的相互作用,将HER2+乳腺癌细胞系(SKBR-3和BT474细胞)与NPs1一起孵育,然后使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)跟踪荧光绿BP发出的信号(图2A-2B)。将NPs1与这两种细胞系孵育6小时后,在细胞表面而不是细胞内部观察到绿色荧光信号。相比之下,对于HER2表达水平低的MCF-7乳腺癌细胞,发现大部分荧光信号在6-24小时后驻留在细胞内(图2C),表明HER2蛋白的细胞表面显露是在细胞附近将NPs1转化为纳米纤维网络必需的。
放射治疗通常用于治疗乳腺癌患者。以前有报道称,长期少量电离辐射(FIR)可以在临床和实验模型中诱导HER2表达。事实上,所使用的HER2+MCF-7/C6肿瘤细胞系来源于HER2阴性人乳腺癌MCF-7细胞系,该细胞系经过30天的FIR诱导,随后进行集落形成和克隆分离。MCF-7/C6细胞表现出抗辐射、HER2高表达、更具侵袭性的表型和增强的癌症干细胞特性水平的特点。发现通过蛋白质印迹测定的HER2蛋白的相对表达水平在MCF-7/C6细胞中比在MCF-7细胞中高5倍(图2D)。在将MCF-7/C6细胞与NPs1(100μM)孵育30分钟后,在细胞膜上观察到绿色荧光点(图2E)。到24小时,发现整个细胞周围有一层茂盛的绿色荧光层。
为了进一步验证NPs1与HER2的结合,使用兔抗HER2(29D8)单克隆抗体(MAb)检测MCF-7/C6细胞表面HER2的胞外结构域。抗HER2MAb被二级抗体标记为荧光红色。NPs1和转化的纳米纤维网络(NFs1)被BP的固有光学特性标记为荧光绿色。如图2F所示,绿色荧光与两个细胞周围的红色荧光完全重叠。合并图像显示细胞表面周围的绿色和红色重叠(形成黄色),除了两个细胞之间的粘附界面,它仅被抗HER2MAb(红色荧光)染色,而不是被NPs1染色。该数据与我们的观点一致,即NPs1向NFs1的转化是由其与暴露于培养基的细胞表面HER2受体的相互作用触发的。还在MCF-7/C6细胞中研究了阴性对照NPs(NPs2、NPs3和NPs4)的细胞分布。孵育24小时后,大部分荧光信号出现在细胞内而不是细胞表面。扫描电子显微镜(SEM)证实了在NPs1处理的MCF-7/C6细胞的表面上存在纳米纤维网络(NFs1),但未处理的细胞不存在(图2G)。相反,在用NPs2、NPs3或NPs4处理的细胞表面上没有检测到纳米纤维结构。透射电子显微镜(TEM)用于更好地测定纳米纤维网络的超结构。与通过SEM获得的结果相似,在与NPs1孵育24小时后,在MCF-7/C6细胞的表面和之间检测到大量的纳米纤维束。在未处理的MCF-7/C6细胞或用三种阴性对照NPs处理24小时的细胞上未检测到纳米纤维结构。在另一个阴性对照实验中,MCF-7(一种HER2表达水平低的细胞系)与NPs1一起孵育24小时,在细胞膜上仅检测到最少量的纳米纤维。
纤维转化的细胞外和细胞内机制。可以想象,HER2介导的纳米颗粒(NPs1)向纳米纤维网络(NFs1)的转化可能会损害HER2二聚化,从而抑制下游信号转导。为了证明这种可行的机制,将MCF-7/C6细胞与NPs1、NPs2或PBS一起孵育8小时(图3A)。对于NPs1处理的细胞,发现大部分绿色荧光信号(BP)与红色荧光(抗HER2)共定位,表明纳米纤维网络与细胞表面显露的HER2受体密切相关。对于用NPs2处理的细胞,其中存在HER2配体但β-折叠形成肽发生突变,细胞表面绿色荧光较弱。此外,NPs1处理细胞膜上的绿色/红色荧光信号似乎明显更厚且不连续,这表明纳米纤维结构的聚集,甚至可能破坏细胞膜。
通过MTS测定确定孵育48小时后,NPs1和三个阴性对照NPs对MCF-7/C6细胞的细胞毒作用。如图3B所示,用NPs1处理以剂量依赖性方式导致显著的细胞死亡,在150μM和300μM时细胞活力分别为37%和13%。其他两种HER2+乳腺癌细胞系SKBR-3和BT474也获得了类似的结果。然而,当这四种NPs处理HER2表达水平低的MCF-7细胞时,即使在300μM的最高浓度下也没有观察到明显的细胞毒性。这与我们的观点一致,即NPs1的纳米转化和因此的细胞毒性是HER2介导的。为了探索NPs1诱导细胞凋亡的机制,通过蛋白质印迹评估了各种促凋亡和抗凋亡蛋白的表达水平。如图3C所示,用NPs1处理MCF-7/C6细胞导致抗凋亡蛋白Bcl-2的下调和凋亡蛋白Bax的上调,呈剂量依赖性。为了研究NPs1对HER2二聚化的影响,采用了一种简单的方法,即用0.2%戊二醛进行短暂化学交联,然后用抗HER2抗体进行蛋白质印迹分析。这种方法使我们能够将二聚HER2与其单体形式区分开来。图3D和图3E表明NPs1能够以剂量依赖性方式抑制HER2二聚化。时程研究表明,NPs1(50μM)不仅可以抑制HER2二聚化,还可以促进HER2从二聚体形式向单体形式的转化。还通过蛋白质印迹研究了NPs1对MAPK途径的影响。当用50μM NPs1处理细胞时,观察到pErk、pMek和pRaf-1水平随时间显著降低;这种抑制作用是剂量依赖性的(图3F)。为了比较,将MCF-7/C6细胞与50μM的每种NPs孵育36小时,赫赛汀用作阳性对照(图3G)。与赫赛汀一样,NPs1能够强烈抑制Erk、Mek和Raf-1的磷酸化。相比之下,三个阴性对照NPs没有显著改变Erk、Mek和Raf-1的磷酸化水平。总之,这些数据强烈支持在HER2+肿瘤细胞表面,NPs1转化为纳米纤维网络,从而抑制HER2二聚化和HER2二聚体转化为单体,从而抑制下游增殖和存活细胞信号传导以及细胞死亡。
纤维状转化的体内评估。NPs1被发现是无毒的;从连续8次隔日一次治疗的正常Balb/c小鼠获得的血细胞计数、血小板、总蛋白、肌酐和肝功能测试。NPs1的剂量在正常范围内。对于生物分布研究,给携带MCF-7/C6肿瘤的小鼠静脉内注射NPs1;10、24、48、72和168小时后,收集主要器官用于离体荧光成像研究(图4A-4B)。肿瘤和正常器官如肝、肺和肾的荧光摄取在10小时时很高。荧光信号在肿瘤中持续存在超过3天,即使在7天后仍有明显的残留信号。相比之下,正常器官的荧光信号在10小时后开始下降,主要器官在72小时几乎检测不到。在72小时,切除肿瘤和覆盖的皮肤进行荧光显微镜研究。很明显,与肿瘤中的强荧光信号相比,在正常皮肤中检测到的信号可忽略不计(图4C)。切除的正常器官的组织学检查未发现任何病理学情况。在相同的肿瘤模型中也对NPs2、NPs3和NPs4作类似的体内生物分布研究。在72小时,发现源自用NPs1处理的小鼠的肿瘤的荧光信号比用NPs2-4处理的小鼠高2-3倍(图4D-4E)。即使在7天后,NPs1处理的小鼠中荧光信号的延长保留,也可归因于在肿瘤微环境中原位受体介导的NPs1向NFs1网络的转化。静脉内注射72小时后,对切除肿瘤的TEM研究显示,肿瘤切片的细胞外基质中有大量的纳米纤维束。在阴性对照NP处理和未处理的小鼠中没有观察到这种纳米纤维(图4F)。此外,从NPs1处理的小鼠切除的肿瘤中的许多细胞似乎正在死亡,细胞间隙很大。从同一只小鼠身上切除的其他器官(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和大脑)的TEM图像是正常的,没有任何纳米纤维网络的迹象,这与上述光学成像和组织病理学研究的结果一致。
纤维状可转化NPs的抗肿瘤活性。在携带MCF-7/C6HER2+乳腺癌的小鼠中进行了NPs1、NPs2、NPs3和NPs4的治疗功效研究(图5A)。当小鼠肿瘤体积达到约50-80mm3时,连续隔日通过尾静脉注射NPs 8次(第1、3、5、7、9、11、13、15天),连续观察40天。如图5B所示,经NPs1处理的小鼠的肿瘤体积逐渐缩小并在处理后完全消除,没有任何复发迹象。相比之下,其他3个阴性对照组(NPs2、NPs3和NPs4)均未引发任何显著的肿瘤反应。在整个40天的治疗研究期间,该治疗研究中的小鼠均未表现出任何脱水症状和显著体重减轻(图5C)。存活曲线与肿瘤生长结果良好相关(图5D)。接受NPs1治疗的8只小鼠中有7只存活了150多天,没有任何肿瘤复发的迹象。这八只小鼠中的一只,不再具有可检测到的肿瘤,在第60天左右因不明原因死亡。相比之下,PBS、NPs2、NPs3和NPs4处理组中的所有小鼠分别在51、63、57和60天内死亡。这一结果非常令人鼓舞,并清楚地证明了受体介导的转化性超分子纳米疗法(例如NPs1)整体上对实体瘤的临床潜力,尤其是对HER2+肿瘤的临床潜力。
为了更好地了解NPs1的体内抗肿瘤机制,在3次连续隔日注射NPs1后,处死小鼠并收集残留肿瘤进行生化和形态学评估(图5E)。获得冷冻切片用于荧光显微术和苏木精和伊红(H&E)染色(图5F)。发现细胞杀伤程度与荧光强度密切相关;在具有强荧光强度的肿瘤区域检测到坏死。为了解纳米纤维网络如何杀死HER2+肿瘤细胞,对从NPs1处理的小鼠获得的肿瘤进行高倍透射电镜观察。图5G中坏死或坏死细胞的TEM图像显示质膜破裂,破裂的细胞内存在大量的纤维状纳米结构。在细胞核的核膜附近发现了一些纳米纤维束。在从用PBS、NPs2、NPs3或NPs4处理的小鼠获得的肿瘤切片中未检测到显著的细胞杀伤。Ki-67标记的组织切片染色是评估NPs1在体内的抗增殖作用的好方法。与从用阴性对照NPs处理的小鼠获得的肿瘤相比,在用NPs1处理3次后,肿瘤组织中Ki-67的表达水平显著降低(图5H)。
以上研究表明,在细胞培养中,NPs1可以抑制HER2+细胞系中的HER2二聚化和Erk、Mek和Raf-1的磷酸化。在这里,对从经受3次连续NPs1隔日静脉注射处理的小鼠身上切除的肿瘤进行了类似的蛋白质印迹研究。如图5I所示,与其他阴性对照组相比,总HER2水平保持不变,但发现Erk、Mek和Raf-1的磷酸化显著降低。总之,数据清楚地表明,受体介导的转化性超分子纳米治疗NPs1在抑制肿瘤组织水平的下游增殖和存活细胞信号传导方面非常有效。为了更好地研究NPs1作为有效治疗HER2+肿瘤的普遍性,我们选择了另外两种人HER2+乳腺癌异种移植模型(SKBR-3和BT474)进行研究。如图5J-5K所示,用NPs1治疗的小鼠的肿瘤体积反应非常好,SKBR-3肿瘤完全消除,到第40天几乎完全消除BT474肿瘤。相比之下,PBS对照组的肿瘤体积在第40天已增长到1200-1500mm3。
赫赛汀的一种已知副作用是心脏毒性。不能与多柔比星等心脏毒性药物同时服用。到目前为止,在我们的NPs1异种移植研究中没有观察到心脏毒性作用。在心肌中未检测到NPs1的摄取。这并不奇怪,因为预计冠状血管是完整的,而20nm NPs1将无法到达心肌。NPs1对三种不同的HER2+肿瘤非常有效,这一事实保证了NPs1对HER2+乳腺癌、卵巢癌、胃癌和膀胱癌的进一步临床前和临床开发。有良好的临床证据表明,一些原本HER2阴性的乳腺癌在长期电离辐射(FIR)后可被诱导表达HER2。这进一步扩大了可能从这种新型受体介导的可转化纳米疗法(RMTN)中受益的患者群体。
已经证明,单独使用8次连续隔日静脉注射剂量的NPs1作为单一疗法可有效治愈大百分比的携带相对较小(≤100mm3)HER2+乳腺癌异种移植物的小鼠。
实施例2:包含两种不同的多个偶联物的纳米载体
免疫检查点阻断(ICB)疗法彻底改变了临床肿瘤学。ICB耐药性的主要促成因素之一是Teff细胞归巢到肿瘤部位的缺陷。本实施例描述了28nm无毒肽胶束纳米颗粒,显露LXY30,一种α3β1整合素靶向配体。在与许多上皮癌中过度表达的α3β1整合素相互作用后,这些纳米颗粒将在肿瘤微环境(TME)中原位转化为纳米纤维状结构网络。当与抗PD-1抗体一起给药时,纳米纤维网络不仅促进细胞毒性CD8+T细胞归巢到肿瘤部位和巨噬细胞在肿瘤部位的再训练,而且还允许在TME经由酯酶持续释放TLR 7/8免疫激动剂(雷西莫特),从而消除小鼠的同源4T1乳腺癌症和Lewis肺癌模型。这些基于结构转化的超分子肽代表了一类创新的受体介导的靶向免疫疗法,通过增强T细胞肿瘤归巢和TME重编程来对抗癌症。
本实施例描述了一种配体受体介导的、基于肽的、无毒的双配体纤维状可转化纳米平台,能够产生抵御癌症的系统性抗免疫反应。该纳米平台最初为纳米颗粒形式,由两个智能可转化肽单体TPM1和TPM2自组装而成。TPM1,LXY30-KLVFFK(Pa),由三个独立的功能域组成:(1)高亲和力和高特异性LXY30环肽(cdG-Phe(3,5-diF)-G-Hyp-NcR)配体,靶向许多实体瘤表达的α3β1整合素异二聚体跨膜受体,(2)源自β-淀粉样蛋白(Aβ)肽的KLVFFβ-折叠形成肽结构域,和(3)具有荧光特性的脱镁叶绿素a(Pa)部分,作为疏水核诱导胶束纳米颗粒的形成。TPM2,前LLP2A-KLVFFK(R848),也由三个独立的功能域组成:(1)前LLP2A,LLP2A的“前配体”形式,它是一种针对淋巴细胞的活化α4β1整合素的高亲和力和高特异性拟肽配体,(2)相同的KLVFFβ-折叠形成肽结构域,和(3)R848(雷西莫特),一种疏水性toll样受体(TLR)7/8激动剂,通过酯键接枝到TPM2主链上。在前LLP2A中,LLP2A的羧基被3-甲氧基-1-丙醇酯化,因此在血液循环过程中,它不会与正常淋巴细胞和间充质干细胞相互作用。在具有丰富酯酶的TME中,前LLP2A将转化为LLP2A,以促进免疫细胞归巢到肿瘤部位。同样,R848的酯酶反应性释放将在TME发生,以激活抗原呈递细胞(APC),促进免疫细胞产生抗肿瘤反应因子,并将巨噬细胞的表型从M2逆转为M1。
在水性条件下和血液循环中,TPM1和TPM2以1:1的比例自组装成一个球形可变形纳米颗粒(T-NP),其中KLVFFK(Pa)和KLVFFK(R848)结构域构成疏水核,LXY30和前LLP2A配体肽构成亲水冠。在与肿瘤细胞膜上显露的α3β1整合素受体蛋白相互作用后,T-NPs将在肿瘤细胞表面和肿瘤相关外泌体丰富的TME内原位转化为纳米纤维(T-NFs)结构网络,从而保持纳米纤维网络在肿瘤部位的长时间保留(至少7天)。在这种情况下,亲水性更强的前LLP2A肽配体将显露在原纤维的外表面,而疏水性Pa和R848将被隔离在原纤维的核心。随着TME和肿瘤细胞中酯酶的升高,前LLP2A将迅速转化为LLP2A(T细胞配体),以对抗活化的α4β1整合素。显露在原纤维上的LLP2A将有助于激活的免疫细胞如Teff细胞(例如CD8+T)细胞,在TME和肿瘤细胞附近的归巢和保留。它还将增强Teff的T细胞受体(TCR)与肿瘤细胞的主要组织相容性复合物(MHC)之间的相互作用。抗PD-1ICB疗法的加入,将通过激活细胞毒性T细胞、逆转Teff的功能障碍和耗竭,来进一步增强抗肿瘤免疫反应。此外,由于肿瘤部位酯酶升高,R848从纳米纤维网络中持续释放,将逆转免疫抑制性TME。这些基于结构转化的超分子肽,代表了一类创新的受体介导的针对癌症的靶向免疫疗法,通过增强T细胞对肿瘤的归巢并将TME从免疫抑制状态提高到持久的免疫活性状态(图12)。
纳米平台的自组装和纤维状转变。合成并表征了两种可转化的肽单体(TPM1:LXY30-KLVFFK(Pa);TPM2:前LLP2A-KLVFFK(R848))(图13A和图20)。随着TPM1和TPM2混合溶液的混合溶剂(水和DMSO)中水的比例(比例为1:1)的增加,由于Pa染料的ACQ特性,在675nm处的荧光峰逐渐减小(图13B),反映了通过自组装逐渐形成可转化的NPs(称为T-NP)。同时,在405和680nm处的吸收峰都有适度的下降。通过透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)分析纳米颗粒。TPM1和TPM2各自单独能够在18和55nm处自组装形成球形纳米颗粒(NPsTPM1和NPsTPM2)。T-NPs由TPM1和TPM2的1:1混合物组装而成,产生约28nm的球形结构,其大小介于NPsTPM1和NPsTPM2之间(图21A)。T-NPs的临界聚集浓度(CAC)确定为8μM(图21B)。还证明了T-NPs可以在37℃下保持良好的血清稳定性和蛋白水解稳定性超过7天(图21C)。
为了验证受体介导的T-NPs在体外的纤维状转化过程,将可溶性α3β1整合素蛋白(LXY30的受体)添加到T-NPs溶液中。在室温下孵育24小时后,清楚地检测到尺寸分布宽的纤维状网络(T-NFs,宽度直径约8nm)(图13C、13F)。在不添加α3β1整合素蛋白的情况下,即使在24小时后(图21D),在T-NPs制剂中也未观察到转化。T-NFs的CAC确定为5μM,低于T-NPs(8μM),表明T-NFs比T-NPs具有更高的纳米结构形成倾向(图21E)。Pa的荧光也用于监测T-NPs的纤维状转化过程(图13D)。在T-NPs溶液中加入α3β1整合素蛋白导致Pa的荧光强度逐渐降低,并且在前2小时内荧光峰从680nm向红色区域显著偏移至725nm,与在此期间Pa的聚集结构从球形结构变为纤维状结构的变化一致。
研究了在有和没有酯酶存在下,在T-NPs表面上展示的前LLP2A和LLP2A对可溶性α4β1整合素蛋白的响应性(图13E-13F)。即使在孵育24小时后,单独的可溶性α4β1整合素蛋白也不能改变展示前LLP2A的T-NPs的球形结构。相反,连续添加酯酶,随后添加可溶性α4β1整合素蛋白能够在孵育24小时后,引发球形T-NPs转化为纤维状网络。该结果证实,酯酶能够将前配体前LLP2A转化为配体LLP2A,进而能够触发受体介导的T-NPs向T-NFs的转化。T-NPs转化过程的圆二色谱(CD)光谱分析显示,在与α3β1整合素蛋白或组合酯酶/α4β1整合素蛋白孵育后,216nm处的负信号和195nm处的正信号逐渐进展,表明β-折叠形成(图2G),并且与图13C和图13E中所示的TEM结果一致。在pH 6.5下研究了R848从T-NFs的体外释放行为,并添加了酯酶来模拟TME条件。如图13H所示,前24h释放了约45%的R848,之后释放速率逐渐减慢,到168h累积释放约86%,表明R848在TME处可发生延长和持续释放。为了证明T-NPs独特的可转化特性,由两个没有β-折叠形成KLVFF肽序列的TPMs(TPM3:LXY30-KAAGGK(Pa)和TPM4:proLLP2A-KAAGGK(R848)),以1:1的比例组装而成的不可转化纳米颗粒(UT-NP)作为相关对照。正如预期,即使在24小时后,α3β1整合素蛋白也无法将UT-NPs转化为纤维状结构,这表明β-折叠肽是T-NPs转化为T-NFs所必需的(图20和21)。
纳米颗粒的纤维状转化和T效应细胞归巢至肿瘤部位的体外评价。为了进一步表征可转化纳米颗粒与活细胞表面的α3β1整合素受体之间的相互作用,选择了表达α3β1整合素的4T1鼠乳腺癌细胞。流式细胞术分析证实,高亲和力α3β1整和素蛋白配体LXY30确实与4T1肿瘤细胞结合(图23)。还发现T-NPs对4T1细胞具有轻微的细胞毒性,在50μM时具有85%的细胞活力(图24)。通过使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)跟踪Pa发出的红色荧光信号来研究NPs的分布。用T-NPs孵育4T1细胞6小时后,在细胞表面及其附近观察到强红色荧光信号,但在细胞内未观察到(图15A)。
相反,发现在UT-NPs处理组中Pa的荧光信号主要集中在细胞的细胞质中。为了研究形成的纳米纤维网络在肿瘤细胞表面的保留和稳定性,在孵育6小时后将未结合的NPs洗掉,然后加入不含NPs的新鲜培养基再孵育细胞18小时。T-NPs处理的细胞在24小时时仍然在细胞表面保留强烈的红色荧光信号(图15B)。与此形成鲜明对比的是,在24小时后用UT-NPs处理的细胞内仅观察到微弱的荧光信号。这可能是由于在孵育18小时后已经内吞的UT-NP发生酶降解,但在此期间没有任何新的内吞摄取。
TEM图像证实在与T-NPs孵育24小时后,在4T1细胞的表面和之间存在纳米纤维网络(T-NF),但在用UT-NPs处理的细胞上不存在这种纳米纤维结构(图15C)。远离细胞表面的纤维状结构可能是由展示α3β1整合素蛋白的分泌性肿瘤外泌体诱导的。
在将前配体前-LLP2A转化为T-NPs表面展示的LLP2A后,研究了酯酶对T-NPs和T细胞表面α4β1整合素之间相互作用的影响。用GFP转染的活Jurkat T淋巴细胞白血病细胞,具有高表达水平的组成型激活的α4β1整合素蛋白,用于模拟T细胞。如图15D所示,在Jurkat细胞与T-NPs(用酯酶预处理)孵育6小时后,在Jurkat细胞周围发现了丰富的红色荧光层,表明前配体向LLP2A配体的转化是成功的。扫描电子显微镜(SEM)证实T-NPs处理的4T1细胞和酯酶预处理的T-NPs处理的Jurkat细胞表面存在纤维状网络(图15E)。
为了模拟T-NPs在4T1细胞表面上的初始纤维状转化,随后的T细胞归巢过程,首先将4T1细胞与T-NPs孵育6小时,然后洗掉未结合的T-NPs,然后加入含有酯酶但不含T-NPs的新鲜培养基。孵育1小时后,加入Jurkat细胞并与4T1细胞孵育2或4小时。之后,在CLSM成像之前轻轻去除未结合的Jurkat细胞(图15F)。正如预期,在4T1细胞表面周围检测到具有红色荧光的纤维状结构层,并且在孵育2小时后,发现Jurkat细胞(GFP+)与红色荧光纤维状网络相互作用,并靠近4T1乳腺肿瘤细胞。随着孵育时间增加到4小时,发现更多的Jurkat细胞聚集在4T1肿瘤细胞周围,这与我们的观点一致,即纤维状网络将促进免疫细胞(如T细胞)归巢到肿瘤部位。SEM成像提供了关键证据,证明纳米纤维结构在4T1细胞和Jurkat细胞之间通过纳米纤维网络的直接物理接触中发挥了重要作用(图15G)。
TAMs从免疫抑制性M2极化表型转变为抗肿瘤发生M1极化表型,是逆转免疫抑制性肿瘤微环境的主要免疫治疗策略之一。巨噬细胞极化状态表现出标志性形态,例如,M2样细胞的细长投影与M1样细胞的圆形和扁平形态相反。IL-4已被用于诱导骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)为M2极化巨噬细胞,这反映在代谢检查点酶精氨酸酶-1(Arg1)和甘露糖受体-1(Mrc1)的表达水平增加。
据报道,R848是体外M1表型的强大驱动力,导致这些细胞产生的白细胞介素12(IL-12)和一氧化氮合酶(Nos2)水平升高。研究了使用T-NF将巨噬细胞从M2表型重新训练为M1表型的可能性。在纳米平台中,R848通过酯键与TMP2共价连接。因此,不出意料,4T1细胞与T-NPs和可溶性α3β1整合素蛋白预先形成的T-NFs的孵育对IL-4诱导的M2极化巨噬细胞没有显著影响(图15H)。即使在12小时后,也没有观察到巨噬细胞形态和Arg1和Mrc1表达水平的显著变化,这可以用T-NF释放的R848不足来解释。相反,向培养基中添加酯酶,然后孵育12小时,导致M2状态巨噬细胞向M1状态的形态变化,Arg1和Mrc1减少,以及通过qPCR检测IL-12和Nos2表达增加。这些变化在24小时后更加明显,此时巨噬细胞完全转变为圆形扁平形态(M1样),Arg1和Mrc1进一步减少,IL-12和Nos2表达增加。T-NFs锚定在TME的能力,使R848从纤维网络中持续释放,将产生持久的抗癌免疫活性TME。
体内评价纳米颗粒的纤维状转化和T效应细胞的肿瘤归巢。T-NPs被发现是无毒的:从隔日一次连续8次治疗的正常Balb/c小鼠获得的血细胞计数、血小板、肌酐和肝功能测试。T-NPs的静脉内(i.v.)剂量在正常范围内(图25-26)。体内血液药代动力学(PK)研究表明T-NPs具有较长的循环时间(T-半值(α):2.866h和T-半值(β):23.186h),表明其在循环过程中的稳定性(图27)。
对于生物分布研究,T-NPs是尾静脉注射到携带同基因原位4T1乳腺癌的Balb/c小鼠中;10、24、48、72、120和168小时后,切除肿瘤和主要器官,用于离体荧光成像(图16A-16B)。Pa的显著荧光信号在肿瘤组织中持续存在168h以上,而正常器官中的荧光信号在10h后开始下降,72h后在主要器官中几乎检测不到。与此形成鲜明对比的是,发现经UT-NPs处理的肿瘤组织中,Pa的荧光信号在24小时达到峰值后随时间逐渐下降(图16C-16D)。到168小时,不到2.88%的UT-NPs峰值荧光信号保留在肿瘤中,而对于T-NPs,超过59.89%的信号保留在肿瘤中(图16D)。
在T-NPs处理的小鼠中,荧光信号的保留延长可归因于TME中T-NP原位受体介导转化为T-NFs网络。静脉内注射72小时后,对切除肿瘤切片的TEM研究显示,细胞外基质中有大量的纳米纤维束,而在阴性对照UT-NPs处理和生理盐水处理的小鼠中未观察到此类纳米纤维(图16E)。
肿瘤和覆盖皮肤的荧光显微照片显示肿瘤区域有强烈的荧光信号,但在正常皮肤中的信号可以忽略不计。这与我们的观点一致:(1)T-NPs会通过渗漏的肿瘤脉管系统(EPR效应)渗入TME,然后与肿瘤细胞和肿瘤相关外泌体上的α3β1整合素相互作用以产生T-NFs,以及(2)血管在正常皮肤中没有渗漏(图16F)。R848随时间的组织分布也用高压液相色谱-质谱(HPLC-MS)测定。发现使用T-NPs,在24小时时,肿瘤对R848的吸收显著高于其他正常器官,并且即使在注射后7天,R848在肿瘤部位的保留量也很高,为1.18μg/g组织(图16G)。尽管UT-NPs也可以将大量的R848递送到肿瘤部位(T-NPs可以递送的80%),但R848在肿瘤部位的保留率远低于T-NPs。R848在肿瘤部位的长时间保留表明T-NPs可以实现持续的免疫活性TME。
为了评估展示LLP2A和R848的纳米纤维网络在TME处是否可以促进体内T细胞归巢到肿瘤部位,在单次静脉内注射T-NPs后第15天切除来自T-NPs治疗的小鼠的肿瘤。并通过流式细胞术、免疫组织化学(IHC)和qPCR分析肿瘤内的免疫细胞群。同时还进行了使用UT-NPs作为不可转化/内吞阴性对照组的实验。发现尾静脉注射T-NP可产生持续的免疫活性TME。首先,发现T-NPs显著刺激肿瘤部位趋化因子CXCL10的产生(图16H),已知该因子促进T效应细胞募集。观察到T-NPs处理的肿瘤组织中CD45+CD3+和CD45+CD3+CD8+T细胞的比例显著高于仅经内吞UT-NPs或生理盐水处理的小鼠的比例(图16I-16J)。更具体地,发现肿瘤中CD3+CD8+T效应细胞的百分比分别相对于盐水和UT-NPs处理的小鼠增加了18倍和4倍(图16J)。其次,发现接受T-NPs治疗的小鼠中,肿瘤部位CD4+Foxp3+Tregs的相对丰度显著低于接受UT-NPs,即(4.97%对13.0%)或生理盐水(4.97%对14.6%)治疗的小鼠(图16K)。发现可以作为抗肿瘤免疫平衡指标的肿瘤浸润性CD8+杀伤性T细胞与免疫抑制性Tregs(CD3+CD4+Foxp3+)的比率在T-NPs治疗组中最高(图16J-16K)。肿瘤组织切片的IHC染色也证实了CD8/CD4的增加和Foxp3的减少(图16L)。第三,肿瘤切片的IHC染色表明,与UT-NPs处理的肿瘤组织相比,T-NPs处理组中M1极化巨噬细胞标志物CD68的增加、M2极化巨噬细胞标志物CD163减少。这可能是由于R848在肿瘤部位的持续释放,导致TAM表型再训练。第四,通过qPCR也评估了细胞免疫相关标志物(IFN-γ、TGF-β)和巨噬细胞标志物(IL-12、IL-10、Nos2和Arg-1)的基因表达水平。如图16M所示,肿瘤组织中IFN-γ的高表达水平和TGF-β的低表达水平证实了肿瘤的强烈特异性免疫反应。此外,发现IL-12和Nos2的分泌显著上调,而IL-10和Arg-1的分泌显著下调,表明在T-NPs处理(而非UT-NPs处理和生理盐水对照)下,TAM从M2状态显著转化为M1状态。
在携带同源原位4T1乳腺癌的小鼠中进行疗效研究。将小鼠随机分为六组,每组接受不同的治疗方案:(1)生理盐水;(2)(EK)3-KLVFFK(Pa)/(EK)3-KLVFFK(R848);(3)前LLP2A-KLVFFK(R848)(单个单体);(4)LXY30-KAAGGK(Pa)/前LLP2A-KAAGGK(R848)(不可转化的UT-NPs);(5)LXY30-KLVFFK(Pa)/前LLP2A-KLVFFK(Pa)(纤维状转化但R848缺失);(6)LXY30-KLVFFK(Pa)/前LLP2A-KLVFFK(R848)。方案6是完整的T-NPs,包含所有4个关键组件:LXY30、前LLP2A、R848和KLVFF,而方案2、3、4或5都缺少T-NPs的一些组件。当肿瘤体积达到约50mm3时,所有治疗方案均为每隔一日尾静脉注射,连续注射8次。并且连续观察小鼠21天(图17A)。如图17B所示,方案2、3和4无效。与第2、3和4组相比,方案5(纤维状转化但没有R848)表现出显著的肿瘤抑制。发现方案6(T-NPs,纤维状转化和R848)是最有效的,具有显著的肿瘤生长抑制(图17B)和延长存活(图17D),表明组合T细胞归巢策略和TLR7/8激动剂持续释放的重要性。该治疗研究中的小鼠在整个治疗期间均未表现出任何脱水症状或显著体重减轻(图17C)。生存曲线与肿瘤生长结果良好相关。与其他治疗组(分别为方案1、2、3、4和5的29、32.5、33.5、33.5和39天)相比,方案6(或T-NPs)治疗的小鼠获得了更长的中位生存时间(62天))。
为了阐明可转化纳米颗粒诱导的免疫治疗作用的机制,收集肿瘤组织并使用流式细胞术来量化肿瘤浸润性CD3+(CD45+CD3+)和CD8+(CD45+CD3+CD8+)T细胞(图17E)。只有能够原位纤维状转化和呈递前LLP2A的治疗方案(方案5和6)显著增加肿瘤内CD3+和CD8+T细胞的频率,特别是与T-NPs中的免疫佐剂R848联合使用(方案6),这与在T-NPs中观察到的最强抗肿瘤作用一致。与其他对照组相比,从用T-NPs处理的小鼠获得的肿瘤切片(H&E)显示Ki-67表达显著降低、CD8+T细胞增加和Foxp3(Treg细胞)减少(图17F)。CD68增加,CD163减少,表明巨噬细胞的表型在8剂T-NPs后发生逆转。众所周知,CD8+T细胞会分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α来杀伤肿瘤细胞。通过qPCR进一步评估肿瘤组织中IFN-γ和TNF-α的表达水平。如图17G所示,治疗方案6(T-NPs)在恢复肿瘤微环境的免疫活性状态方面最有效,IFN-γ和TNF-α的表达水平最高。此外,T-NPs还显著诱导IL-12、IL-6和Nos2的表达,并抑制TGF-β、IL-10和Arg-1的表达,从而抑制Treg细胞的募集和M2样巨噬细胞转化为M1表型的再训练。
然而,尽管有希望,但单独的T-NPs并不能完全消除肿瘤。这可能是由于肿瘤微环境中T效应细胞的激活和归巢不足所致。众所周知,肿瘤细胞通过过表达PD-L1劫持T细胞的PD-1受体,PD-L1可激活PD-1,从而抑制T细胞增殖、活化、细胞因子产生、代谢改变和细胞毒性T淋巴细胞杀伤功能,并最终导致活化的T细胞死亡。临床上,靶向PD-1或PD-L1的抗体已被证明能够重振肿瘤微环境中“耗尽”的T细胞。但除黑色素瘤和非小细胞肺癌外,ICB抗PD-1或抗PD-L1治疗的临床反应率有限,大部分患者仍难治。一个关键原因是肿瘤微环境中没有足够的Teff细胞。我们的受体介导的纤维状可转化纳米平台(促进T细胞归巢和改善肿瘤微环境)可能能够纠正这种缺陷,因此将极大地协同PD-1和PD-L1检查点阻断免疫疗法。同源原位4T1乳腺癌小鼠被随机分为四组,在有或没有额外纳米平台的情况下进行抗PD-1抗体(抗PD-1)治疗:(1)单独抗PD-1;(2)方案4(UT-NPs)加抗PD-1;(3)方案5加抗PD-1;(4)方案6(T-NPs)加抗PD-1。当肿瘤体积达到约100mm3时,第1天静脉内注射NPs,第2天腹腔注射抗PD-1,在第3、5、7和9天重复相同的周期,共5个周期,连续观察小鼠21天(图18A)。无意外地,单独的抗PD-1和方案4加抗PD-1治疗无效(图18B)。相比之下,与不使用抗PD-1的方案5的8次治疗相比,方案5加抗PD-1治疗确实显著抑制了肿瘤生长,使得中位生存期更长,如图18B、18D(49.5天对39天)所示;然而,这两种治疗都不能完全消除肿瘤。最显著的是,用方案6(T-NPs)加抗PD-1治疗的小鼠在21天内使得肿瘤逐渐缩小并最终完全消除,并且在90天的观察期内没有任何复发迹象(图18C),验证了我们的可转化纳米免疫平台T-NPs与检查点阻断免疫疗法的协同作用。
与临床肿瘤学中的传统化学疗法或靶向疗法不同,免疫疗法可以潜在地诱导具有记忆能力的适应性反应。记忆对于实现持久的肿瘤反应和预防复发至关重要,而复发通常会导致死亡。为了评估T-NPs与免疫检查点抗PD-1疗法(T-NPs加抗PD-1抗体)的协同治疗是否能诱导记忆反应,在第90天用4T1细胞在对侧乳腺脂肪垫上再次激发先前实验中治愈的小鼠(图18A-18C);相同年龄的空白小鼠作为阴性对照(图18D)。在本实验中,小鼠在91,93和95天通过腹腔注射给予抗PD-1 3次。即使注射了抗PD-1,所有空白小鼠的肿瘤体积在30天内也迅速增加(图18E)。然而,在先前用T-NPs加抗PD-1治疗成功的小鼠中未观察到肿瘤生长或肿瘤生长显著延迟(图18F),证实了这些先前治疗的小鼠产生了极好的免疫记忆反应。该实验组的生存曲线与肿瘤生长结果良好相关(图18G)。在60天观察期(第90-150天)期间,所有小鼠均存活。此外,在用4T1肿瘤细胞再次攻击6天后,发现该实验组中TNF-α和IFN-γ等细胞因子的血清水平远高于对照同龄空白小鼠组(图18H-18I)。这些结果表明,先前给出的方案6(或T-NPs)加上抗PD-1产生了持久而强大的T细胞记忆反应。
除了4T1同基因原位乳腺癌模型外,在Lewis肺同基因皮下鼠肿瘤模型中进行了类似的治疗研究,结果非常好(图18J-18L)。用T-NPs加抗PD-1治疗获得了完全的肿瘤消退和生存期延长。未检测到全身毒性和体重减轻。
尽管检查点阻断免疫疗法在临床上取得了成功,但只有一小部分癌症患者从这种疗法中受益。归巢到肿瘤部位的Teff细胞的缺陷,可能是许多患者仍然对这种治疗无效的主要原因之一。将免疫学上的“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤的方法正在世界范围内进行深入研究。本文描述的受体介导的可转化纳米粒子(T-NPs)可以为这一挑战提供相对简单的解决方案。在同基因4T1乳腺癌和Lewis肺癌模型中证明,通过将前配体LLP2A和R848结合到纳米颗粒中,这种无毒治疗可以(1)促进T细胞归巢到肿瘤部位,(2)促进T细胞在靠近肿瘤细胞的位置保留,以及(3)在肿瘤微环境中提供R848的持续释放,使得TAM再训练为M1表型。由于纳米平台是模块化的,因此可以选择将各种不同的配体、前配体或免疫调节剂组合到纳米平台中。免疫纳米平台的一个独特特征是在肿瘤微环境中形成的纳米纤维网络是持久的,这可以解释其显著的体内抗肿瘤免疫反应和记忆效应,但没有任何全身免疫毒性迹象,即使与抗PD-1抗体一起服用。使用LLP2A在肿瘤部位捕获T细胞的前配体概念是创新的,可用于捕获其他有益的免疫细胞,包括自然杀伤细胞。也可以尝试针对其他途径的其他有效免疫调节剂,例如IFN基因刺激剂(STING)途径。纳米平台是高度模块化的,可能看起来很复杂。然而,实际上,它是非常强大的。每个可转化的肽单体在化学上都有明确的定义,最终的免疫纳米颗粒可以通过在DMSO中简单混合,然后用水稀释来组装。用于临床开发而扩大生产应该不是问题。
统计分析。数据表示为平均值±标准偏差(SD)。使用学生t检验(双尾)分析组间的比较。显著性水平定义为*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。所有统计测试都是双向的。
尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和示例的方式对前述发明进行了一些详细的描述,但是本领域技术人员将理解,在所附权利要求的范围内可以实施某些改变和修改。此外,本文提供的每篇参考文献均以引用方式全文并入,其程度与每篇参考文献单独以引用方式并入的程度相同。在本申请与本文提供的参考文献之间存在冲突的情况下,应以本申请为准。
序列表:
SEQ ID NO:1:KLVFF
SEQ ID NO:2:klvff
SEQ ID NO:3:FFVLK
SEQ ID NO:4:YCDGFYACYMDV
Claims (64)
1.一种式(I)的化合物:A-B-C(I);
其中,
A是疏水部分;
B是肽,其中所述肽形成β-折叠;和
C是亲水性靶向配体,其中所述亲水性靶向配体是LLP2A前药、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、叶酸、LHRH肽、HER2配体、EGFR配体或toll样受体激动剂CpG寡核苷酸;和
其中当疏水部分是双芘时,C是LLP2A前药、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、叶酸、LHRH肽、EGFR配体或toll样受体激动剂CpG寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的化合物,其中,所述疏水部分是染料或药物。
3.根据权利要求1或2所述的化合物,其中所述疏水部分为化疗剂、荧光染料、免疫调节剂、toll样受体激动剂、干扰素基因刺激蛋白(STING)小分子激动剂、卟啉、胆固醇、维生素D,或维生素E。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物,其中所述疏水部分为紫杉醇、双芘、花青染料、雷西莫特、加地喹莫特、氨基苯并咪唑、卟啉、胆固醇、维生素D或维生素E。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的化合物,其中,所述疏水部分是雷西莫特或卟啉。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的化合物,其中,所述卟啉是焦脱镁叶绿酸-a、脱镁叶绿酸、二氢卟吩e6、红紫素或红紫素酰亚胺。
8.如权利要求3-6中任一项所述的化合物,其中,卟啉是脱镁叶绿酸-a。
9.如权利要求1-8中任一项所述的化合物,其中,所述肽是长度为5-20个氨基酸的肽序列。
10.如权利要求1-9中任一项所述的化合物,其中,所述肽是长度为5-15个氨基酸的肽序列。
11.如权利要求1-10中任一项所述的化合物,其中,所述肽包含来自β-淀粉样蛋白肽的β-折叠肽结构域的肽序列。
12.如权利要求11所述的化合物,其中,所述β-淀粉样蛋白肽是β-淀粉样蛋白40。
13.如权利要求1-12中任一项所述的化合物,其中,所述肽包含与SEQ ID NO:1至少50%的序列同一性。
14.如权利要求1-13中任一项所述的化合物,其中,所述肽包含SEQ ID NO:1。
15.如权利要求1-12中任一项所述的化合物,其中,所述肽包含与SEQ ID NO:2至少50%的序列同一性。
16.如权利要求1-13中任一项所述的化合物,其中,所述肽包含SEQ ID NO:2。
17.如权利要求1-12中任一项所述的化合物,其中,所述肽包含与SEQ ID NO:3至少50%的序列同一性。
18.如权利要求17所述的化合物,其中,所述肽包含与SEQ ID NO:3至少80%的序列同一性。
19.如权利要求17或18所述的化合物,其中,所述肽包含SEQ ID NO:3。
20.如权利要求1-19中任一项所述的化合物,其中,所述亲水性靶向配体是HER2配体,其中所述HER2配体是抗-HER2抗体肽模拟物,该肽模拟物来源于抗-HER2重组人抗体4D5的CDR-H3环的一级序列。
21.如权利要求20所述的化合物,其中,所述HER2配体与SEQ ID NO:4具有至少50%的序列同一性。
22.如权利要求20或21所述的化合物,其中,所述HER2配体与SEQ ID NO:4具有至少80%的序列同一性。
23.如权利要求20-22中任一项所述的化合物,其中,所述HER2配体是SEQ ID NO:4。
24.如权利要求1-19中任一项所述的化合物,其中,所述亲水性靶向配体是LLP2A前药、LLP2A、LXY30、DUPA、叶酸、LHRH肽或EGFR配体。
25.如权利要求1-19或24中任一项所述的化合物,其中,所述亲水性靶向配体是LLP2A前药、LLP2A或LXY30。
33.一种具有内部和外部的纳米载体,所述纳米载体包含多个权利要求1-32中任一项所述的化合物,其中各化合物在水性溶剂中自组装形成所述纳米载体,从而在所述纳米载体的内部形成疏水袋,亲水基团在纳米载体的外部自组装。
34.如权利要求33所述的纳米载体,其中,所述纳米载体还包含隔离在所述纳米载体的疏水袋中的疏水药物或成像剂。
35.一种具有内部和外部的纳米载体,所述纳米载体包含多个第一偶联物和第二偶联物,其中所述第一偶联物包含式(I):
A-B-C(I);和
所述第二偶联物包含式(II):
A'-B'-C'(II)
其中:
A和A'各自独立地是疏水部分;
B和B'各自独立地是肽,其中,各肽独立地形成β-折叠;和
C和C'各自独立地是亲水性靶向配体,其中,各亲水性靶向配体独立地是LLP2A前药、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、叶酸、LHRH肽、HER2配体、EGFR配体或放射性金属螯合剂;和
其中,A和A'是不同的疏水部分和/或C和C'是不同的亲水性靶向配体。
36.如权利要求35所述的纳米载体,其中,各疏水部分独立地是染料、药物或放射性金属螯合剂。
37.如权利要求35或36所述的纳米载体,其中,各疏水部分独立地是双芘、卟啉、雷西莫特或加地喹莫特。
38.如权利要求35-37中任一项所述的纳米载体,其中,各疏水部分独立地是卟啉或雷西莫特。
39.如权利要求37或38所述的纳米载体,其中,所述卟啉是焦脱镁叶绿酸-a、脱镁叶绿酸、二氢卟吩e6、红紫素或红紫素酰亚胺。
40.如权利要求37-39中任一项所述的纳米载体,其中,所述卟啉是脱镁叶绿酸-a。
43.如权利要求35-42中任一项所述的纳米载体,其中,各肽独立地是长度为5-20个氨基酸的肽序列。
44.如权利要求35-43中任一项所述的纳米载体,其中,各肽独立地包含来自β-淀粉样蛋白肽的β-折叠肽结构域的肽序列。
45.如权利要求44所述的纳米载体,其中,所述β-淀粉样蛋白肽是β-淀粉样蛋白40。
46.如权利要求35-45中任一项所述的纳米载体,其中,各肽独立地包含与SEQ ID NO:1至少50%的序列同一性。
47.如权利要求35-46中任一项所述的纳米载体,其中,各肽独立地包含SEQ ID NO:1。
48.如权利要求35-45中任一项所述的纳米载体,其中,各肽独立地包含与SEQ ID NO:2至少50%的序列同一性。
49.如权利要求35-46中任一项所述的纳米载体,其中,各肽独立地包含SEQ ID NO:2。
50.如权利要求35-49中任一项所述的纳米载体,其中,各亲水性靶向配体独立地是LLP2A前药、LLP2A、LXY30、叶酸、LHRH肽、HER2配体、EGFR配体、Gd(III)螯合剂、DOTA螯合剂,或NOTA螯合剂。
51.如权利要求35-50中任一项所述的纳米载体,其中,各亲水性靶向配体独立地是LLP2A前药、LLP2A或LXY30。
58.如权利要求35-57中任一项所述的纳米载体,其中,所述第一偶联物与所述第二偶联物的比率为约10:1至约1:10。
59.如权利要求35-58中任一项所述的纳米载体,其中,所述第一偶联物与所述第二偶联物的比率为约1:1。
60.一种形成纳米纤维的方法,包括使权利要求33-59中任一项的纳米载体与肿瘤微环境中的细胞表面或无细胞组分接触,其中,所述纳米载体经历原位转化以形成纤维结构,从而形成所述纳米纤维。
61.一种治疗疾病的方法,包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求33-59中任一项所述的纳米载体,其中,所述纳米载体在肿瘤微环境中与细胞表面或非细胞成分结合后原位形成纳米纤维,从而治疗疾病。
62.如权利要求61所述的方法,其中,所述疾病是癌症。
63.如权利要求61所述的方法,其中,所述疾病选自:膀胱癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、食道癌、胆囊癌、胃癌、胶质母细胞瘤、肠癌、头颈癌、白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌和子宫癌。
64.一种成像方法,包括向待成像的对象施用有效量的权利要求33-59中任一项的纳米载体。
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