JP2022545636A - 癌の免疫療法のための高性能ペプチド及び可変ナノ粒子 - Google Patents

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Abstract

本発明は、式(I)の化合物：A-B-C(I)｛式中、Aは、疎水性部分であり；Bは、ペプチドであり、ここで、該ペプチドはβ－シートを形成し；及びCは、親水性標的化リガンドであり、ここで、該親水性標的化リガンドは、LLP2Aプロドラッグ、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、フォラート、LHRHペプチド、HER2リガンド、EGFRリガンド、又はトール様受容体作動薬CpGオリゴヌクレオチドである｝を提供する。本発明はまた、本発明の化合物を含むナノ担体、そのナノ担体からのナノフィブリル形成、並びに疾患を処置するため及び画像化のためにそのナノ担体を使用する方法も提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、共に2019年8月14日に出願された米国特許仮出願第62/886,698号及び同第62/886,718号に対する優先権を主張し、そのそれぞれを全体としてあらゆる目的のために本明細書に援用する。
連邦政府が支援した研究開発下でなされた発明の権利に関する声明
本願発明は、米国立衛生研究所による助成番号第R01EB012569号及び同第U01CA198880号の下で政府助成によりおこなわれた。政府は本発明において一定の権利を有する
本発明の背景
近年の癌の免疫療法における臨床的成功は、癌と我々の戦いに対する強い関心をもたらした。例えば、抗PD-1、抗PD-L1、及び抗CTLA-4などの免疫チェックポイント受容体経路遮断モノクローナル抗体は、Tエフェクター細胞(Teff)機能不全と枯渇を覆すことができ、そして、腫瘍の劇的な縮小をもたらし、更に、後期ステージの転移性疾患であっても、一部の患者では完全な寛解をもたらすこともある。しかしながら、奏功率は、腫瘍タイプの間で大きく異なる：黒色腫において最大40%、非小細胞肺癌において25%、しかし、他のほとんどの腫瘍タイプにおいて<10%。これまで、米国食品医薬品局(FDA)は、さまざまな腫瘍タイプに対して単独、又は他の化学療法と組み合わせて使用される、7種類の免疫チェックポイント遮断モノクローナル抗体(ICB-Ab)：1種類のCTLA-4阻害剤(イピリムバブ)、3種類のPD-1阻害剤(ニボルマブ、ペムブロリズマブ、及びセミプリマブ)、及び3種類のPD-L1阻害剤(アテゾリズマブ、デュルバルマブ、及びアベルマブ)、を承認した。
免疫及びストロマ細胞、血管、細胞外マトリックス、サイトカイン、ケモカイン、及び増殖因子から成る、腫瘍微小環境(TME)は、免疫チェックポイント阻害(ICB)療法に対する腫瘍応答にあらゆる影響を及ぼし得る。新たなデータは、腫瘍部位へのTeff細胞ホーミングの欠陥がICB療法に対する抵抗性で重要因子であることを示している。ICB抵抗性の他の機構としては、腫瘍部位における免疫抑制性制御性T細胞(Treg)、骨髄球誘導性サプレッサ細胞(MDSC)、及びM2マクロファージの存在が挙げられる。高レベルのCCL5、CCL17、CCL22、CXCL8、及びCXCL12は、TMEへのTreg及びMDSCの動員を容易にし、そして、ICB応答をもたらす。対照的に、CXCL9及びCXCL10は、腫瘍部位への細胞障害性T細胞(CTL)のホーミングを促進し、そして、抗腫瘍性免疫応答を促進し；形質転換成長因子ベータ(TGF-β)は反対であるので、Tregも上方制御される。VEGFは、CTLに対する阻害受容体を上方制御し、それらの消尽に寄与する。例えば、ムチンドメイン-3タンパク質(TIM-3)、リンパ球活性化遺伝子3(LAG-3)、B及びTリンパ球アテネータ(BTLA)、T細胞性免疫受容体、チロシンベースの阻害モチーフドメイン(TIGIT)、及びT細胞活性化のV-ドメイン免疫グロブリン含有抑制因子(Vista)などの他の免疫チェックポイント受容体の上方制御は、ICB抵抗性に関係した。これらのチェックポイント受容体の同時発現はT細胞消尽につながり得る。癌細胞におけるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)やPI3K-γなどの発癌性又は腫瘍抑制因子経路はまた、免疫細胞組成物やサイトカインプロフィールを変更して、ICB抵抗性に寄与することによって、TMEに影響を及ぼす。これらの経路に対する阻害剤はICB応答を改善することがわかった。
ICB抵抗性を克服する試みでは、多くの併用療法戦略が前臨床的及び臨床的に試みられた。これらとしては、ICB-Abに対する以下の薬物：もうひとつのICB-Ab(CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、及びTIM-3に対する抗体)、化学療法薬(パクリタキセル、ゲムシタビン、及びカルボプラチン)、放射線療法、標的療法(PI3K、VEGF、BRAF/MEK、IDO、A2AR、FGFR、EGFR、PARP、及びmTORに対する阻害剤)、マクロファージ阻害剤(CSF1R及びARG1に対する阻害剤)、サイトカイン/ケモカイン阻害薬(CXCR4、CXCR2、及びTGF-βに対する阻害剤)、エピジェネティックモジュレーター(ヒストンデアセチラーゼ阻害剤及び低メチル化剤)、免疫調節薬(OX40、41BB、GITR、CD40、及びICOSに対する抗体)、養子細胞移入療法(carT、TIL、及びTCR)、並びに腸微生物叢の調節、の追加が挙げられる。
ナノ免疫療法の進歩と最適化は、免疫治療介入の特異性と制御性を高め、TMEにおける所望の細胞型を標的化するための革新的アプローチの開発にある。高度なバイオナノマテリアル又はより制御された様式でのアプローチが、TMEにおける免疫調整及び免疫細胞ホーミング剤の蓄積を増強し、かつ、滞留を延長することによって免疫治療効力を高める場合があると同時に、正常組織や臓器を温存し、これにより、全身的サイトカインストームなどの標的外の有害影響を軽減する。ナノマテリアルのインサイチュ集合（in situ assembly）では、生理活性分子の性能を改善することが実証された。1つの説得力のある説明は、インサイチュフィブリル可変ナノプラットフォームに組み込まれたT細胞標的化リガンド及び/又は免疫調整剤が、TMEにおけるナノフィブリルネットワークを作り出し、腫瘍部位へのTeff細胞ホーミングを高め、そして、追加ICB療法の有無にかかわらず、免疫治療が有効性を改善する、といったものである。
ヒト上皮成長因子受容体2(HER2)は、20%超の乳癌において、そしてより低い程度で胃癌、結腸直腸癌、卵巣癌、及び膀胱癌において過剰発現される。単独療法に対して良好に応答する突然変異又は融合癌遺伝子(例えば、肺癌におけるEGFR及び慢性骨髄性白血病におけるBcr-Abl)によって引き起こされるそれらの癌と異なって、HER2を過剰発現する癌は薬物併用を必要とすることが多い。腫瘍のこの後者の群がHER2の遺伝子増幅や大幅な過剰発現によって駆動されることが原因である。HER2は、それ自体、又はそのファミリーメンバーであるEGFR、HER3若しくはHER4により二量体化が誘発されることによって通常、活性化される受容体チロシンキナーゼである。HER2の陽性腫瘍では、HER2は、大幅に過剰発現され、かつ、構成的に二量化され、そして、下流の増殖及び生存経路、並びに悪性表現型の弱まることのない活性化につながる。
HER2、トラスツズマブ及びペルツズマブの高い発現レベルのため、2種類の抗HER2モノクローナル抗体は、これらの腫瘍に対する単独療法として効力がない。それらは、他のHER2標的療法、化学療法又はホルモン療法との組み合わせで与えられる必要がある。本明細書では、いくつかの実施形態が、HER2+乳癌異種移植モデルに対する単独療法として高度に効果的である、新規HER2媒介性、ペプチドベース、及び無毒性可変ナノ剤を説明する。この受容体媒介性可変ナノ療法(RMTN)は、水性条件下でミセルを形成する自己集合（self-assembly）、及びHER2が遭遇する腫瘍部位におけるナノフィブリルへの変形（transformation）を可能にする、独特なドメインを有するペプチドから成る。得られたナノフィブリルネットワークは、HER2二量体化と下流のシグナリングを効果的に抑制し、及び腫瘍細胞死を容易にする。
本明細書では、癌の免疫療法のための高性能な(smart)超分子材料が構築された。
本発明の簡潔な概要
一実施形態において、本発明は、式(I)の化合物：A-B-C(I)｛式中、Aは、疎水性部分であり；Bは、ペプチドであり、ここで、該ペプチドはβ－シートを形成し；及びCは、親水性標的化リガンドであり、ここで、該親水性標的化リガンドは、LLP2Aプロドラッグ、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、フォラート、LHRHペプチド、HER2リガンド、EGFRリガンド、又はトール様受容体作動薬CpGオリゴヌクレオチドである｝を提供する。
別の実施形態において、本発明は、式(I)の化合物：A-B-C(I)｛式中、Aは、疎水性部分であり；Bは、ペプチドであり、ここで、該ペプチドはβ－シートを形成し；及びCは、親水性標的化リガンドであり、ここで、該親水性標的化リガンドは、LLP2Aプロドラッグ、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、LHRHペプチド、HER2リガンド、EGFRリガンド、又はトール様受容体作動薬CpGオリゴヌクレオチドであり、かつ、ここで、該疎水性部分がビス－ピレンである場合、Cは、LLP2Aプロドラッグ、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、LHRHペプチド、EGFRリガンド、又はトール様受容体作動薬CpGオリゴヌクレオチドである｝を提供する。
別の実施形態において、本発明は、内側（interior）及び外側（exterior）を有するナノ担体を提供し、該ナノ担体は、複数の本発明の化合物を含み、ここで、各化合物は、水性溶媒中で自己集合して、疎水性ポケットがナノ担体の内側に形成され、かつ、親水基がナノ担体の外側で自己集合するような、ナノ担体を形成する。
別の実施形態において、本発明は、内側及び外側を有するナノ担体を提供し、該ナノ担体は、複数の第一のコンジュゲート及び第二のコンジュゲートを含み、ここで、該第一のコンジュゲートは、式(I)：A-B-C(I)を含み、かつ、第二のコンジュゲートは、式(II)：A’-B’-C’(II)を含む｛式中、A及びA’は、それぞれ独立して、疎水性部分であり；B及びB’は、それぞれ独立して、ペプチドであり、ここで、各ペプチドは、独立してβ－シートを形成し；並びにC及びC’は、それぞれ独立して、親水性標的化リガンドであり、ここで、それぞれの親水性標的化リガンドは、独立してLLP2Aプロドラッグ、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、フォラート、LHRHペプチド、HER2リガンド、EGFRリガンド、又は放射性金属キレート剤であり；そして、式中、A及びA’は、異なった疎水性部分であり、及び/又はC及びC’は、異なった親水性標的化リガンドである｝。
別の実施形態において、本発明は、ナノフィブリルを形成する方法であって、本発明のナノ担体を、腫瘍微小環境（tumor microenvironment）における細胞表面又は無細胞成分と接触させることを含む方法を提供し、ここで、該ナノ担体はインサイチュで変形（in situ transformation）を受けて、フィブリル構造を形成し、それによって、ナノフィブリルを形成する。
別の実施形態において、本発明は、疾患を処置する方法であって、それを必要としている対象に治療的有効量の本発明のナノ担体を投与することを含む方法を提供し、ここで、該ナノ担体は、腫瘍微小環境において細胞表面又は無細胞成分に結合した後にインサイチュでナノフィブリルを形成し、それによって、疾患を処置する。
別の実施形態において、本発明は、画像化する方法であって、画像化する対象に有効量の本発明のナノ担体を投与することを含む方法を提供する。
図1A～1Fは、可変ペプチドモノマー1 (TPM1’) BP-FFVLK-YCDGFYACYMDVの集合とフィブリル変形を示す。図1A～1Bは、0：100から20：80、40：60、60：40、80：20、90：10、98：2及び99.5：0.5のH2O：DMSOでのNP1のDMSO溶液への水の段階的な添加によるNP1のUV-vis吸収(図1A)及び蛍光(図1B)における変化を示す、Ex=380nm。図1C 初期NP1と、様々な時点(0.5、6、24時間)におけるHER2タンパク質(分子量≒72KDa)とのNP1相互作用によって変形したナノ繊維(NF1)のTEM画像。dのスケールバー：100nm。図1D～1Fは、様々な時点における初期NP1とNF1に関するサイズ分布のバリエーション(図1D)、CDスペクトル(図1E)、及び蛍光シグナル(図1F)を示す。HER2ペプチド/HER2タンパク質のモル比は約1000：1であった。
図2A～2Hは、HER2陽性癌細胞を用いたフィブリル可変NP1共培養の形態的特徴づけを示す。図2A～2Cは、6時間の時点におけるSKBR-3細胞(HER2+)(図2A)、BT474細胞(HER2+)(図2B)、及びMCF-7細胞(HER2－)(図2C)とのNP1相互作用の細胞蛍光分布画像を示す。図2A～2Cのスケールバー：50μm。図2Dは、MCF-7細胞及びMCF-7/C6細胞における相対的HER2タンパク質発現のウエスタンブロットと定量分析を示す。***P<0.001。図2Eは、様々な時点(0.5、6、24時間)におけるMCF-7/C6細胞(HER2+)とのNP1相互作用の細胞蛍光分布画像をを示す。eのスケールバー：50μm。図2Fは、MCF-7/C6細胞の細胞膜上のNF1とHER2抗体(29D8、ウサギ、NP1のHER2ペプチドとの異なった受容体結合部位)のナノフィブリルネットワークの蛍光結合分布画像を示す。HER2抗体が、HER2受容体を標識するのに使用された。図2Gは、無処置MCF-7/C6細胞と、6時間と24時間にわたりNP1で処置された細胞のSEM画像を示す。図2Hは、無処置MCF-7/C6細胞と、24時間にわたりNP1で処置された細胞のTEM画像を示す。赤色の矢印はフィブリルネットワークを示す。NP1の濃度は50μMであった。
図3A～3Gは、MCF-7/C6乳癌細胞を用いたフィブリル可変NP相互作用の細胞外及び細胞内機構を示す。図3Aは、それぞれMCF-7/C6細胞のNP1、NP2、及びHER2抗体(29D8、ウサギ、NP1及びNP2のHER2ペプチドとの異なった受容体結合部位)結合HER2受容体の細胞蛍光分布画像を示す。HER2抗体は、HER2受容体を標識するのに使用された。NP1とNP2の濃度は50μMである。aのスケールバー：20μm。図3Bは、様々な濃度のNP1～4と共にインキュベートされたMCF-7/C6細胞の生存率を示す(n=3)。*P<0.05、**P<0.01。図3Cは、24時間にわたり様々な濃度でNP1によって処置されたMCF-7/C6細胞におけるアポトーシス関連タンパク質とHER2総タンパク質のウエスタンブロット分析を示す。図3D～3Eは、24時間にわたり様々な濃度で(図3D) 、及び様々な時点で50μMにて(図3E)NP1によって処置されたMCF-7/C6細胞におけるHER2タンパク質二量体の阻害及び離解機構に関するウエスタンブロット分析を示す。図3Fは、様々な時点で50μMにて、及び様々な濃度で24時間にてNP1によって処置されたMCF-7/C6細胞における増殖タンパク質の阻害機序のウエスタンブロット分析を示す。図3Gは、36時間にてNP1～4及びHerceptin(HP)によって処置されたMCF-7/C6細胞における増殖タンパク質の阻害機序のウエスタンブロット分析を示す。NP1～4の濃度は50μMであり、及び陽性対照群としてのHerceptinの濃度は15μg/mLであった。
図4A～4Fは、フィブリル可変NPのインビボにおける評価を示す。図4Aは、時間依存せいのエクスビボ蛍光画像を示し、及び図4Bは、NP1注入後10、24、48、72及び168時間にて回収した腫瘍組織及び主要組織(心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、腸、筋肉及び皮膚)の定量分析を示す。図4Bでは、***P<0.001、他の臓器と比較した、72時間及び168時間の腫瘍組織における蛍光シグナルは、長い保持時間を有する腫瘍蓄積とフィブリルネットワークのインサイチュでの変形を示す；***P<0.001、72及び168時間のそれと比較した、10時間の肝臓及び腎臓の蛍光シグナルは、NP1が肝臓及び腎臓から迅速に取り除かれ得ることを示す。図4Cは、注入後72時間の腫瘍組織及び正常皮膚組織におけるNP1の蛍光分布画像及びH&E画像を示す(緑色：NP1のBP；青色：DAPI；cのスケールバー：100μm)。図4Dは、NP2～4注入後72時間にて回収した腫瘍組織及び主要組織の時間依存性エクスビボ蛍光画像を示す。図4Eは、NP1～4の注入後72時間にて回収した腫瘍組織及び肝臓の定量分析を示す。図4Eでは、***P<0.001、他の対照群のそれと比較した、NP1群の腫瘍組織に関する蛍光シグナルは、NP1群のフィブリルネットワークが腫瘍部位における長い保持時間を促進することを示した。図4Fは、i.v.注入後72時間及び無処置群におけるNP1～4の腫瘍組織内分布のTEM画像及びインサイチュでのフィブリル変形を示す。NP1～4の用量は、注入毎に8mg/kgである。図4Fでは、「C」はMCF-7/C6細胞を意味し；「N」は細胞核を意味する。
図5A～5Kは、HER2陽性乳房腫瘍を担持するBalb/cヌードマウスにおけるNPの抗腫瘍活性を示す。図5Aは、マウスの腫瘍接種及び処置プロトコールに関する略図を示す。図5B～5Cは、40日間の処置中の皮下腫瘍モデルにおける腫瘍阻害効果の観察(図5B)及びマウスの体重変化(図5C)を示す(1群あたりn=8；NP1～4の用量は注入毎に8mg/kgであった)。**P<0.01、***P<0.001。図5Dは、MCF-7/C6乳房腫瘍を担持するマウスの様々な処置群の累積生存率を示す。図5Eは、腫瘍組織分析のためのマウスの3回処置プロトコールに関する略図を示す。図5Fは、NP1の3回の注入後の腫瘍組織における蛍光分布画像及びH&E抗腫瘍画像を示す(緑色：NP1のBP；青色：DAPI；fのスケールバー：100μm)。図5Gは、3回のNP1の注入後のナノフィブリルネットワークによる遅発性膜破裂(rapture)及び細胞死に関する代表的なTEM画像を示す。赤色の矢印はフィブリルネットワークを示す。図5Hは、3回注入後の様々な群によって処置された腫瘍組織のKi-67染色画像を示す。hのスケールバー：25μm。図5Iは、3回の注入後に様々な群によって処置されたMCF-7/C6腫瘍組織におけるHER2タンパク質及び増殖タンパク質の阻害機序のウエスタンブロット分析を示す。図5J～5Kは、40日間の治療中の、皮下腫瘍SKBR-3(図5J)及びBT474 HER2陽性乳癌(図5K)モデルにおける腫瘍阻害効果に関する観察(oservation)を示す(1群あたりn=8、NP1の用量は注入毎に8mg/kgであった)。***P<0.001(PBS対照群と比較)。
図6は、可変ペプチドモノマー1 BP-FFVLK-YCDGFYACYMDVの化学構造とMALDI-TOFによる質量スペクトルを示す。
図7は、可変ペプチドモノマー2 BP-GGAAK-YCDGFYACYMDVの化学構造とMALDI-TOFによる質量スペクトルを示す。
図8は、可変ペプチドモノマー3 BP-FFVLK-PEGの化学構造とMALDI-TOFによる質量スペクトルを示す。
図9は、可変ペプチドモノマー4 BP-GGAAK-PEGの化学構造とMALDI-TOFによる質量スペクトルを示す。
図10は、フィブリル変形に対するHER2タンパク質/ペプチドリガンド比の効果を示す。NP1のTEM画像と粒径測定を、PBS溶液中、24時間にわたる可溶性HER2タンパク質とのインキュベーション後に得た。NP1濃度は20μMにて一定に維持された。スケールバーは200nmである。HER2タンパク質/ペプチドリガンド比は、各顕微鏡写真について標識される。実験は3回繰り返された。
図11Aは、40日間の処置中の皮下SKBR-3腫瘍における抗腫瘍効果の観察を示す(1群あたりn=6；NP1～4の用量は注入毎に8mg/kg、q.o.d.である；データは平均±s.d.として提示される)。統計的有意性は、Tukey事後検定を用いた一元配置ANOVAによって計算された。*P<0.05。図11B～11Cは、40日間の処置中の、皮下BT474腫瘍(図11B)及びSKBR-3腫瘍(図11C)を担持するマウスの体重を示す(1群あたりn=6；データは平均±s.d.として提示される)。赤色の矢印は、それぞれの単回i.v.注入を示す。
図12は、ナノフィブリルネットワークがT細胞ホーミングを促進し、及び増強された免疫療法のための腫瘍微小環境の再プログラム化することを示す。TPMの自己集合及びフィブリル変形、腫瘍組織における(I)、(II)、(III)プロセスに関する略図：NPのインサイチュフィブリル変形、プロLLP2AからのLLP2A転換、続くT細胞の結合と標的化、及びM2からM1表現型へのTAM再教育。TPM、NP、NF、M1-TAM及びM2-TAMはそれぞれ、可変ペプチドモノマー、ナノ粒子、ナノフィブリル、M1様腫瘍関連小食細胞、及びM2様腫瘍関連小食細胞を表す。
図13A～13Hは、可変ペプチドTPM1(LXY30-KLVFFK(Pa))及びTPM2(プロLLP2A-KLVFFK(R848))の集合とフィブリル変形を示す。図13Aは、TPM1及びTPM2の分子構造と機能に関する略図を示す。図13Bは、1：1比のTPM1とTPM2から成るDMSO中のT-NPの溶液への段階的な水の添加(0～99%)後のT-NPの蛍光(FL)における変化を示す；励起波長、405nm。図13Cは、初期T-NPと、24時間にわたる可溶性α3β1インテグリンタンパク質との相互作用後にナノフィブリル(T-NF)に変形したT-NPのTEM画像を示す(99：1のH2O対DMSO比)。実験に使用されるT-NPの濃度は20μMであった。cのスケールバーは100nmである。図13Dは、経時的なT-NPのT-NFへのフィブリル変形過程におけるPaに関する蛍光シグナルにおけるバリエーションをに示す。図13Eは、24時間にわたるエステラーゼ、可溶性α4β1インテグリンタンパク質又はα4β1インテグリンタンパク質＋エステラーゼとの相互作用後の初期T-NP及びT-NFのTEM画像を示す(99：1のH2O対DMSO比)。実験に使用されるT-NPの濃度は20μMであった。eのスケールバーは100nmである。図13F～3Gは、様々な条件下での初期T-NP及びT-NFのサイズ分布(図13F)及び円偏光二色性スペクトル(図13G)の差異を示す。図13Hは、経時的なT-NFからのR848のTteインビトロ放出プロフィールを示す。α3β1又はα4β1インテグリンタンパク質対ペプチドリガンドのモル比は約1：1000であった。a.u.、任意単位；mdeg、ミリ度。
図14は、T-NPのT-NFへの変形を確認するためのDLS実験を示す。20nmのピークは溶液中で徐々に下がり、その一方で、700nm付近のピークは上がった。
図15A～15Hは、4T1マウス乳癌細胞とのインキュベーション後のフィブリル可変ナノ粒子の形態的特徴づけを示す。図15Aは、6時間にわたる4T1細胞とのT-NP及びUT-NP相互作用の細胞蛍光分布画像を示す。スケールバーは10μmである。実験は3回繰り返された。図15Bは、6時間にわたるT-NP及びUT-NPへの曝露と、それに続く18時間にわたるNP不含新鮮培地でのインキュベーション後の4T1細胞の細胞蛍光シグナル滞留画像を示す。スケールバーは10μmである。実験は3回繰り返された。図15Cは、T-NPで処置された細胞周辺の豊富なナノフィブリルを示す、24時間にわたりT-NP及びUT-NPで処置された4T1細胞の代表的なTEM画像を示す。スケールバーは200nmである。実験は3回繰り返された。T-NPの濃度は50μMであった。図15Dは、エステラーゼ処置T-NPとのインキュベーション後のJurkatTリンパ腫細胞(GFP標識)の細胞蛍光分布画像を示す。Jurkat細胞が、Tリンパ球を模倣するために使用され、そしてそれはまた、α4β1インテグリンも発現する。スケールバーは10μmである。実験は3回繰り返された。図15Eは、無処置4T1及びJurkat細胞、並びに6時間にわたりT-NPで処置された細胞の代表的なSEM画像を示す。スケールバーは10μmである。実験は3回繰り返された。図15Fは、実験スキームと、4T1との相互作用後のT-NP(蛍光赤色)の細胞蛍光分布画像、及びGFP標識Jurkat細胞を示す。それは4T1細胞を覆うナノフィブリルネットワークを示し、そしてそれは、次々にJurkat悪性T細胞を引き付け、そして、結合し得る。スケールバーは10μmである。実験は3回繰り返された。図15Gは、T-NPでの処置後の4T1及びJurkat細胞の代表的なSEM画像を示す(図15Fを参照のこと)。実験は3回繰り返された。図15Hは、様々な時点でのT-NF、T-NF＋エステラーゼ、又はR848によるM2様マウスマクロファージとその後の再教育の代表的な画像を示す。スケールバーは20μmである。実験は3回繰り返された。統計的有意性は、対応のない両側t検定を使用して計算された。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
図16A～16Mは、フィブリル可変ナノ粒子のインビボにおける評価を示す。図16A～16Bは、T-NP注入後10、24、48、72、120及び168時間にて回収された腫瘍組織と主要組織(心臓(H)、肝臓(Li)、脾臓(Sp)、肺(Lu)、腎臓(K)、腸(I)、筋(M)及び皮膚(Sk))の時間依存性エクスビボ蛍光(FL)画像(図16A)及び定量分析(図16B)を示す。データは平均±s.d.、n=3の独立した実験として提示される。図16Cは、UT-NP注入後10、24、48、72、120及び168時間にて回収された腫瘍組織の時間依存性エクスビボ蛍光(FL)画像を示す。データは平均±s.d.、n=3の独立した実験として提示される。図16Dは、T-NP及びUT-NP注入後10、24、48、72、120及び168時間にて回収された腫瘍組織の蛍光(FL)定量化を示す。図16Eは、注入後72時間のT-NP、UT-NP、及び無処置の対照群に関する腫瘍組織の分布及びインサイチュフィブリル変形の代表的なTEM画像を示す。「N」は核を示す。図16Fは、注入後72時間での腫瘍組織及び正常皮膚組織におけるT-NPの蛍光(FL)分布画像を示す(赤色、T-NPのPa；青色、DAPI；スケールバー、50μm)。図16Gは、T-NP及びUT-NPの注入後の様々な時点での腫瘍組織におけるR484分布滞留を示す。R848の用量：0.94mgkg-1；データは平均±s.d.、それぞれの時点に関してn=3であった。図16Hは、T-NP、UT-NP及び生理食塩水処置の3日後の腫瘍組織内のCXCL10ケモカインの発現を示す(n=3；データは平均±s.d.であった)。図16I～16Kは、T-NP、UT-NP又は生理食塩水対照で処置されたマウスから摘出された4T1腫瘍内のCD45+CD3+(図16I)、CD8+/CD4+(図16J)及びCD4+Foxp3+(図16 K)T細胞を示す代表的なフローサイトメトリー解析画像である。図16Lは、T-NP又はUT-NPでの処置後にマウスから摘出した腫瘍の免疫組織化学(IHC)を示す。代表的な画像は、T細胞(CD8+、CD4+、Foxp3+)及びマクロファージマーカー(CD68、CD163)のIHC染色に関して示されている。スケールバーは100μmである。図16Mは、T-NP又はUT-NPでの処置の15日後にマウスから摘出した4T1腫瘍におけるIFN-γ、TGF-β、IL12、IL10、Nos2及びArg-1の発現レベル(qPCRアッセイ)を示す(n=3；データは平均±s.d.であった)。統計的有意性は、対応のない両側t検定を使用して計算された。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
図17A～17Gは、4T1乳房腫瘍を担持するBalb/cマウスにおけるフィブリル可変ナノ粒子の抗腫瘍効果を示す。図17Aは実験計画を示す：同所性腫瘍接種と処置プロトコール；レジメン6は、全部で4つの重要な要素を有するT-NPである。図17B～17Cは、処置開始後21日にわたる、同所性4T1腫瘍を担持するマウスの腫瘍抑制効果(図17B)と体重変化(図17C)の観察(Oservation)を示す(1群あたりn=8)。データは平均±s. dとして提示される。図17Dは、4T1乳房腫瘍を担持するマウスの様々な処置群の累積生存率を示す。図17Eは、21日目の処置マウスから摘出した4T1腫瘍内のCD3+CD8+T細胞の代表的なフローサイトメトリー解析画像を示す。図17Fは、摘出腫瘍のH&E及びIHC画像を示す。代表的な画像は、Ki67、T細胞(CD8、Foxp3)及びマクロファージマーカー(CD68、CD163)のIHC染色に関して示されている。スケールバーは100μmである。図17Gは、21日目のマウスから摘出された4T1腫瘍におけるIFN-γ、TNF-α、IL12、IL6、TGF-β、IL10、Nos2、及びArg-1のyhe発現レベル(qPCRによって分析される)を示す(データは平均±s.d.であった)。統計的有意性は、対応のない両側t検定を使用して計算された。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
図18A～18Lは、4T1乳房腫瘍又はLewis肺腫瘍を担持するマウスにおけるフィブリル可変ナノ粒子＋抗PD-1処置の抗腫瘍効果を示す。図18Aは実験計画を示す：同所性腫瘍接種と処置プロトコール(4つの処置群；レジメン4、5及び6は図4aに示されているものと同じである)。図18Bは、21日間の処置にわたる同所性4T1腫瘍を担持するマウスにおける腫瘍応答を示す(1群あたりn=8)。データは平均±s. dとして提示される。***P<0.001。図18Cは4つの処置群に関する累積生存率を示す。図18Dは実験計画を示す：T-NP(レジメン6)＋抗PD-1 Abで予め処置されたマウスが、90日目の癌細胞と、それに続く抗PD-1 Abの3回のq.o.dのi.p.用量の再接種によって再び抗原投与された。図18Eは、抗腫瘍免疫記憶効果が、同月齢の未感作マウスで観察されなかったことを示す。図18Fは、抗腫瘍免疫記憶効果が、T-NP及び抗PD-1 Abで予め処置されたマウスで観察されたことを示す。図18Gは、未感作マウスと、T-NP＋抗PD-1で予め処置されたマウスの累積生存率を示す。図18H～18Iは、マウスが4T1腫瘍細胞を用いて再び抗原投与された6日後及び抗PD-1 Abの最後の用量の1日後のマウス血清中のIFN-γ(図18H)及びTNF-α(図18I)レベルを示す。図18J～18Kは、処置開始後の21日間に及ぶ、皮下マウスLewis肺腫瘍を担持するマウスの腫瘍抑制効果(図18J)及び体重変化(図18 K)の観察を示す(1群あたりn=8)；処置プロトコールは図18Aの実験設計に従った、5サイクル(i.v.レジメン4～6及びi.p.抗PD-1)。データは平均±s.d.として提示される。図18Lは、マウスLewis肺腫瘍を担持するマウスの様々な処置群の累積生存率を示す。統計的有意性は、対応のない両側t検定を使用して計算された；*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
図19Aは、CPTNP(BP-k-l-v-f-f-k-(r)8)の構造を示し、ここで、緑色－Bispyrene。青色－疎水性結合モチーフ。赤色－細胞透過性ペプチド。図19Bは、Aと同じ色をつけたGG-CPTNP(BP-k-l-v-g-g-k-(r)8)を示し、ここで、二重(duel)フェニルアラニンモチーフは二重(duel)グリシンモチーフに置換される。図19Cは、種々のpHにおけるCPTNP(FF)及びGG-CPTNP(GG)のDLSを示す。図19Dは、CPTNPナノ粒子とCPTNPモノマーの蛍光を示し、ここで、BPのAIEE効果が観察され得る。図19Eは、50μMにて計測されたFF及びGG CPTNPのゼータ電位を示す(a：b、p<0.0005)。図19Fは、様々な指定された環境におけるCPTNPのTEM画像を示す。各画像のスケールバーは100μmである。
図20は、可変ペプチドモノマー(TPM)1 LXY30-KLVFFK(Pa)、2 プロLLP2A-KLVFFK(R848)、3 LXY30-KAAGGK(Pa)、4 プロLLP2A-KAAGGK(R848)の化学的構造と、MALDI-TOFによる質量スペクトルを示す。実験は3回繰り返された。
図21Aは、99：1のH2OとDMSOの比における、NPTPM1、NPTPM1及びT-NPのTEM画像及びサイズ分布を示す。実験は3回繰り返された。図21Bは、T-NPの臨界凝集濃度(CAC)が、プローブとしてピレンを使用することによって計測されたことを示す。実験は3回繰り返された。図21Cは、37℃にて血清及びプロテアーゼ(10%のFBS及びプロテアーゼを含む/含まないpH7.4のPBS溶液)中のT-NPのナノ粒子安定性が動的光散乱によって計測されたことを示す。データは平均±s.d.、n=3回の独立した実験、として提示される。図21Dは、新たに調製したT-NPと、PBS溶液中での24時間後のT-NPのTEM画像を示す。実験は3回繰り返された。図21Eは、T-NFのTte CACがプローブとしてピレンを使用することによって計測されたことを示す。実験は3回繰り返された。すべてのTEM画像のスケールバーは100nmである。図21A、21C、及び21Dで使用されるT-NPの濃度は20μMであった。
図22は、初期UT-NPと、24時間にわたるα3β1インテグリンタンパク質とのUT-NP相互作用のTEM画像を示す。α3β1インテグリンタンパク質/ペプチドリガンドのモル比は、約1：1000であった。スケールバーは100nmである。実験に使用される濃度は20μMであった。実験は3回繰り返された。
図23は、ビオチン化LXY30ペプチド(青色の曲線)及び陰性対照(赤色の曲線)の4T1細胞を伴ったインキュベーションが、フローサイトメトリーで分析されたことを示す。実験は3回繰り返された。3×105個の細胞は、氷上、1μMのビオチン化LXY30と共に30分間インキュベートされ、PBSでの洗浄後に、続いて、1：500のストレプトアビジン-PE(1mg/mL)と共に30分間インキュベートされ、次に、フローサイトメトリーが実施された。
図24は、48時間にわたる様々な濃度でのT-NP及びUT-NPとのインキュベーション後の4T1細胞の生存率を示す。データは平均±s.d.、n=3回の独立した実験、として提示される。
図25は、T-NP及びUT-NP(1注入あたり13mg/kg)の8回のq.o.d.静脈内注入後の健常Balb/cマウスの赤血球(RBC)、白血球(WBC)、血小板、ヘモグロビン、リンパ球及び総タンパク質に関する血液試験パラメーターを示す。データは平均±s.d.、n=3回の独立した実験、として提示される。
図26は、T-NP及びUT-NP(1注入あたり13mg/kg)の8回のq.o.d.静脈内注入後の健常Balb/cマウスの肝機能クレアチニン、アラニントランスアミナーゼ、アスパルタートトランスアミナーゼ、アルブミン、アルカリフォスファターゼ、総ビリルビンに関する血液試験パラメーターを示す。データは平均±s.d.、n=3回の独立した実験、として提示される。
図27は、T-NP及びUT-NPに関するインビトロ血液薬物動態及びパラメーターを示す(データは平均±s.d.、n=3回の独立した実験、として提示される)。C-最大、AUC、及びT1/2(時間)はKinetica5.0によって計算された。
本発明の詳細な説明
I. 通則
本発明は、疎水性部分、β－シートペプチド、及び親水性標的化リガンドを含む化合物を提供し、そしてそれは、ナノ担体を形成し得る。そのナノ担体は、複数の1種類のコンジュゲート又は2種類の別個のコンジュゲートを含み得る。そのナノ担体は、インサイチュで変形して、疾患の処置及び画像化のためのナノフィブリルを形成し得る。
II. 定義
別段で特別に指示されない限り、本明細書中に使用されるすべて技術的及び学術的用語は、本願発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。加えて、本明細書中に記載した方法又は材料に類似した又は同等のあらゆる方法又は材料が、本発明の実施に使用できる。本発明の目的のために、次の用語が定義される。
本明細書中で使用される場合、「a」、「an」又は「the」は、1つのメンバーを伴った態様を含むだけではなく、2以上のメンバーを伴った態様もまた含む。例えば、単数形「a」、「an」及び「the」は、別段内容が明確に指示されない限り、複数の指示物を含む。よって、例えば、「細胞」に対する言及は、複数の斯かる細胞を含み、そして、「剤」に対する言及は、当業者などに知られている1若しくは複数の剤に対する言及を含む。
「疎水性部分」は、水中で実質的に不溶性である化合物の一部を指す。例えば、疎水性及び親水性部分を含む複数の化合物が存在するとき、その疎水性部分は、水分子との相互作用を避ける及び最小限にするような形にそれら自体を向ける。部分の疎水度は、分布係数(logP値)の対数を計測するためのにオクタノール－水基準系を使用することで当業者によって測定され得る。0を超えるLogP値は、化合物が疎水性であることを示し、大きい値ほど、より大きい疎水度を示す。
「ペプチド」とは、ペプチド結合によって共有結合された2以上のアミノ酸を含む化合物を指す。本明細書中に使用される場合、その用語は、完全長のタンパク質を含めた、あらゆる長さのアミノ酸鎖も含む。
βプリーツシートとしても知られている「β－シート」とは、タンパク質の二次構造を指し、そして、水素結合によって安定化さらたβ鎖を含む。β鎖は、互いに平行又は逆平行に積み重ねられて、β－シートを形成する。
「β－シートペプチドドメイン」とは、β－シートを含むタンパク質構造内のドメインを指す。
「β－アミロイドペプチド」とは、脳内のアミロイドプラークを形成するペプチドを指す。脳内でのアミロイドプラークの形成は、アルツハイマー病を患っている対象に見られる。
「親水性標的化リガンド」は、細胞表面受容体、細胞表面タンパク質、又は細胞外成分を標的化でき、かつ、親水性である化合物の一部を指す。親水度は、化合物のlogP値を計測することによって測定でき、ここで、0未満の値は親水性を示す。より低い値は、より高い親水度を示す。標的化リガンドは、これだけに限定されるものではないが、インテグリンや上皮成長因子受容体などの膜貫通受容体を標的化するため、細胞若しくは細胞外環境に化合物、薬物、又は着目の成分を送達するために使用できる。親水性標的化リガンドとしては、これだけに限定されるものではないが、ペプチドが挙げられる。
「プロドラッグ」とは、生物学的に不活性である化合物を指すが、それは、インサイチュで代謝された後に生物活性になる。プロドラッグは、自然反応又は哺乳動物内の酵素によって代謝され、そして、活性化合物をもたらす。プロドラッグに有用な官能基としては、これだけに限定されるものではないが、エステル、アミド、カルバマート、オキシム、イミン、エーテル、ホスファート、又はベータ－アミノケトンが挙げられる。
「LLP2A」、「LXY30」、及び「LXW64」とは、インテグリンタンパク質に結合できる化合物を指す。その3種類の個々の化合物の構造は当業者によって知られている。
「DUPA」とは、グルタミン酸尿素化合物を指し、そして、前立腺癌細胞に細胞毒性薬物を送達するのに使用できる。DUPA、2－[3－(1,3-ジカルボキシプロピル)ウレイド]ペンタン二酸は、以下の構造：
Figure 2022545636000001
 を有する。
「LHRHペプチド」とは、黄体形成ホルモン放出ホルモンペプチドを指し、市販されている。LHRHペプチドは、卵巣及び前立腺癌細胞を標的化するのに使用できる。
「HER2リガンド」とは、HER2タンパク質に結合できるリガンドを指す。例としては、これだけに限定されるものではないが、抗HER2モノクローナル抗体、例えば、これだけに限定されるものではないが、トラスツズマブ及びペルツズマブなど、並びに以下で列挙されたEGFRリガンド、が挙げられる。
「EGFRリガンド」とは、EGFRタンパク質に結合できるリガンドを指す。例としては、これだけに限定されるものではないが、EGF、TGF－α、HB-EGF、アンフィレグリン、ベタセルリン、エピジェン、エピレグリン、ニューレグリン1、ニューレグリン2、ニューレグリン3、及びニューレグリン4が挙げられる。
「Toll様受容体作動薬」とは、細胞上のトール様受容体に結合する化合物を指し、そしてそれは、免疫系で重要な役割を果たす。受容体への結合は、受容体は活性化して、生物反応を生じさせ得る。トール様受容体作動薬に関する例としては、これだけに限定されるものではないが、CpGオリゴヌクレオチドが挙げられる。
CpG ODNとしても知られている「CpGオリゴヌクレオチド」とは、シトシン－グアノシンジヌクレオチドモチーフを指す。2つのヌクレオチドが、ホスホジエステルリンカー又は修飾ホスホロチオアートリンカーによって連結され得る。
「色素」又は「蛍光色素」とは、化学分子の励起後に、一般的に300～700nmの範囲内で発光する化学分子を指す。移動した光エネルギー(例えば、光子)の吸収時に、色素分子は励起状態に至る。分子が励起状態を終了するとき、それは、より低いエネルギー光子(例えば、蛍光の発光)の形態で光エネルギーを発し、色素分子がその基底状態に戻る。色素は、天然の化学物質であるか又は合成の化学物質であり得る。色素としては、これだけに限定されるものではないが、シアニン、ポルフィリン、及びビス－ピレンが挙げられる。
「ポルフィリン」とは、以下のポルフィンコア：
Figure 2022545636000002
 を有するあらゆる化合物を指し、ここで、該ポルフィンコアは、置換又は非置換である。
「ビス－ピレン」とは、互いに共有結合で連結された2つのピレンサブユニットを含む化合物を指す。その2つのピレンサブユニットは、直接的に又はリンカーを通して連結され得る。そのリンカーは、これだけに限定されるものではないが、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリール、ヘテロアリール、アリールケトン、ケトン、アミン、アミド、及び尿素などの当業者に知られているあらゆるリンカーであり得、ここで、該リンカーは置換され得る。
「放射性金属キレート剤」とは、一つの中心金属原子又はイオンに結合する多座リガンドを指す。その金属原子又はイオンは、金属の放射性同位体であり得る。放射性金属キレート剤としては、これだけに限定されるものではないが、Gd(III)キレート剤、DOTAキレート剤、及びNOTAキレート剤が挙げられる。Gd(III)キレート剤としては、これだけに限定されるものではないが、ガドペンテト酸、ガドテル酸、ガドジアミド、ガドベニン酸、ガドテリドール、ガドベルセタミド、及びガドブトロールが挙げられる。
「シアニン」又は「シアニン色素」とは、ポリメチン群に属する合成色素ファミリーを指す。シアニンは、生物医学画像化のための蛍光色素として使用できる。シアニンは、ストレプトシアニン(開放鎖シアニンとしても知られている)、ヘミシアニン、及び閉鎖シアニンであり得る。閉鎖シアニンは、それぞれ独立して複素芳香族部分の一部である窒素を有する。
「薬物」とは、病態又は疾患を治療及び／又は改善することが可能である物質をいう。薬物は、疎水性薬物であってよく、これは水を撥水する任意の薬物である。本発明において有用な疎水性薬物としては、これだけに限定されるものではないが、デオキシコール酸、タキサン、ドキソルビシン、エトポシド、イリノテカン、ＳＮ－３８、シクロスポリンＡ、ポドフィロトキシン、カルムスチン、アンホテリシン、イクサベピロン、パツピロン(エポテロンクラス)、ラパマイシン及び白金薬物が挙げられる。他の薬剤としては、非ステロイド系抗炎症薬、及びビンブラスチンやビンクリスチンなどのビンカアルカロイドが挙げられる。本発明の薬物はまた、プロドラッグ型も含む。当業者は、他の薬物は本発明において有用であることを理解するであろう。
「化学療法薬」とは、これだけに限定されるものではないが、癌、腫瘍、及び新生物などの疾患の処置に使用できる化学薬品を指す。いくつかの実施形態において、化学療法薬は、細胞傷害性形態に活性化され得るプロドラッグの形態であり得る。当業者によって一般的に知られている化学療法薬が、本発明に使用できる。化学療法薬としては、これだけに限定されるものではないが、レシキモド、ガーディキモド、及びイミキモドが挙げられる。
「免疫調節薬」とは、免疫系を刺激又は抑制することによって免疫応答を修飾する一種の薬物を指す。免疫調節薬としては、これだけに限定されるものではないが、レシキモド、ガーディキモド、及びイミキモドが挙げられる。
「抗-HER2 rhumAb 4D5」とは、一種のHER2抗体を指し、トラスツズマブとしても知られている。トラスツズマブは、乳房や胃の癌を処置するために一般的に使用され、市販されている。トラスツズマブは、配列番号4の少なくとも50%のペプチド配列同一性を含む。トラスツズマブのペプチド配列は、「合理的に設計された抗HER2/neuペプチド模倣薬は、インビトロ及びインビボにおいてP185HER2/neuチロシンキナーゼを無効にする」と記載される(Park et al. Nat Biotechnol. 2000 Feb;18(2):194-8.)。
「CDR-H3ループ」とは、抗原結合にかかわるHER2抗体の内側の領域を指す。
「ナノ担体」又は「ナノ粒子」とは、本発明の化合物の凝集から生じるミセルを指す。本発明のナノ担体は、疎水性コアと親水性外部を有し得る。
「ナノフィブリル」とは、数十～数百ナノメートルに及ぶ直径を有するチューブ状の、棒状フィブリルを指す。ナノフィブリルは、高い長さ対直径比を有し得る。本発明のナノフィブリルは、標的化部位での結合後にナノ粒子のインサイチュ変形によって形成され得る。
「フィブリル構造」とは、ナノメートル～マイクロメートル程度の直径を有する直鎖の、棒状フィブリルを指し、高い長さ対直径比を有する。フィブリル構造は、生体高分子を含み得る。フィブリル構造としては、これだけに限定されるものではないが、ナノフィブリル及びミクロフィブリルが挙げられる。
「細胞表面」とは、原形質膜を指し、そしてそれは、細胞の内側と細胞外空間を隔てる。細胞表面は、脂質二重層、タンパク質、及び炭水化物を含む。
「無細胞成分」とは、細胞の細胞外環境を指し、そして、これだけに限定されるものではないが、細胞外マトリックス、細胞外小胞、及び細胞周囲のサイトカインが挙げられる。細胞外マトリックスは、コラーゲン、フィブロネクチン、及び他の基質タンパク質を含む。リガンドと化合物は、癌細胞の増殖に影響するように癌細胞の無細胞成分と相互作用できる。
「腫瘍微小環境」とは、腫瘍細胞とそれを取り囲む無細胞環境を指し、そして、これだけに限定されるものではないが、細胞外マトリックス、シグナル伝達分子、免疫細胞、ストロマ細胞、脈管構造、血管、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、及び繊維芽細胞が挙げられる。腫瘍は、癌細胞の増殖と発生に影響するように、リンパ系や循環系を通じて微小環境内の周辺細胞と相互作用する。
「処置する」、「処置すること」及び「処置」とは、緩解；軽快；症状の減弱、又は症状、傷害、病態若しくは状態を患者にとってより耐容できるものにすること；症状又は状態の頻度又は持続期間を低減すること；或いは、いくつかの場合には、症状の発症を予防することなどの任意の客観的又は主観的パラメーターを含む、傷害、病態、状態、又は症状(例えば、疼痛)の処置又は改善における成功の任意の指標を意味する。症状の処置又は改善は、例えば、身体検査の結果を含む、任意の客観的又は主観的パラメーターに基づくものでありうる。
「投与すること」とは、対象への経口投与、坐剤としての投与、局所接触、非経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、鼻内若しくは皮下投与、くも膜下腔内投与、リンパ内、微小液滴の吸入、又は徐放性装置、例えば、ミニ浸透圧ポンプの埋込を意味する。
「対象」とは、霊長類(例えば、ヒト)、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどを含むが、それらに限定されるわけではない、哺乳動物などの動物を意味する。特定の態様において、対象はヒトである。
「処置上有効な量」又は「処置上十分な量」又は「有効又は十分な量」とは、投与の目的である処置効果を生じる用量を意味する。正確な用量は処置の目的に依存することになり、当業者であれば、公知の技術を用いて確認可能であろう(例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992)；Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)；Pickar, Dosage Calculations (1999)；及びRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkinsを参照のこと)。感作された細胞では、処置上有効な用量は非感作細胞に対する通常の処置上有効な用量よりも低いことが多くなりうる。
「癌」とは、異常な細胞増殖と制御されていない分裂を伴う疾患を指す。癌細胞は、局所的に又は血流及びリンパ系を通して身体の他の部分に拡散し得る。その用語はまた、その組織内の正常若しくは異常細胞の十分に制御されていない又は制御されていない増殖を特徴とする臓器又は組織のあらゆる疾患と、全身へのその影響も含むことを意図する。
「画像化」とは、本発明の化合物などの造影剤の位置を測定するために対象の外側でデバイスを使用することを指す。画像化ツールの例としては、これだけに限定されるものではないが、蛍光顕微鏡、陽電子放射断層撮影(PET)、磁気共鳴画像化(MRI)、超音波、単光子放出コンピューター断層撮影(SPECT)、及びX線コンピューター断層撮影(CT)が挙げられる。陽電子放射断層撮影は、造影剤による陽電子の発光から放射を検出する。
III. 化合物
いくつかの実施形態において、本発明は、式(I)の化合物：A-B-C(I)｛式中、Aは、疎水性部分であり；Bは、ペプチドであり、ここで、該ペプチドはβ－シートを形成し；及びCは、親水性標的化リガンドである｝を提供する。その親水性標的化リガンドとしては、HER2リガンド及び任意の他の好適な標的リガンドが挙げられ得る。
いくつかの実施形態において、本発明は、式(I)の化合物：A-B-C(I)｛式中、Aは、疎水性部分であり；Bは、ペプチドであり、ここで、該ペプチドはβ－シートを形成し；及びCは、親水性標的化リガンドであり、ここで、該親水性標的化リガンドは、LLP2Aプロドラッグ、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、フォラート、LHRHペプチド、HER2リガンド、EGFRリガンド、又はトール様受容体作動薬CpGオリゴヌクレオチドである｝を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、式(I)の化合物｛式中、Aは、ビス－ピレンであり；Bは、ペプチドであり、ここで、該ペプチドはβ－シートを形成し；及びCは、HER2リガンドである｝を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、式(I)の化合物：A-B-C(I)｛式中、Aは、疎水性部分であり；Bは、ペプチドであり、ここで、該ペプチドはβ－シートを形成し；及びCは、親水性標的化リガンドであり、ここで、疎水性部分がビス－ピレンである場合、Cは、HER2リガンド以外である｝を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、式(I)の化合物：A-B-C(I)｛式中、Aは、疎水性部分であり；Bは、ペプチドであり、ここで、該ペプチドはβ－シートを形成し；及びCは、親水性標的化リガンドであり、ここで、該親水性標的化リガンドは、LLP2Aプロドラッグ、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、フォラート、LHRHペプチド、HER2リガンド、EGFRリガンド、又はトール様受容体作動薬CpGオリゴヌクレオチドであり；そして、ここで、上記疎水性部分がビス－ピレンである場合、Cは、LLP2Aプロドラッグ、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、フォラート、LHRHペプチド、EGFRリガンド、又はトール様受容体作動薬CpGオリゴヌクレオチドである｝を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、式(I)の化合物：A-B-C(I)｛式中、Aは、疎水性部分であり；Bは、ペプチドであり、ここで、該ペプチドはβ－シートを形成し；及びCは、親水性標的化リガンドであり、ここで、該親水性標的化リガンドは、LLP2Aプロドラッグ、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、LHRHペプチド、HER2リガンド、EGFRリガンド、又はトール様受容体作動薬CpGオリゴヌクレオチドであり；そして、ここで、上記疎水性部分がビス－ピレンである場合、Cは、LLP2Aプロドラッグ、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、LHRHペプチド、EGFRリガンド、又はトール様受容体作動薬CpGオリゴヌクレオチドである｝を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、式(I)の化合物：A-B-C(I)｛式中、Aは、疎水性部分であり；Bは、ペプチドであり、ここで、該ペプチドはβ－シートを形成し；及びCは、親水性標的化リガンドであり、ここで、該親水性標的化リガンドは、LLP2Aプロドラッグ、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、フォラート、LHRHペプチド、HER2リガンド、EGFRリガンド、又はトール様受容体作動薬CpGオリゴヌクレオチドであり；そして、ここで、上記疎水性部分がビス－ピレンである場合、Cは、LLP2Aプロドラッグ、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、フォラート、LHRHペプチド、EGFRリガンド、又はトール様受容体作動薬CpGオリゴヌクレオチドである｝を提供する。
本発明に有用な疎水性部分としては、当業者に知られているあらゆる好適な疎水性部分が挙げられる。疎水度と親水度は、オクタン－水基準系を使用した化合物のlogP値によって一般的に計測される。0より低い値は疎水性を示し、それに対して、0より高い値は親水性を示す。本発明に有用な疎水性部分としては、1未満のlogP値を有する部分が挙げられる。いくつかの実施形態において、本発明に有用な疎水性部分は、少なくとも1.5のlogP値を有する。いくつかの実施形態において、本発明に有用な疎水性部分は、1.5～15のlogP値を有する。疎水性部分としては、これだけに限定されるものではないが、コレステロール、ビタミンD、ビタミンD誘導体、ビタミンE、ビタミンE誘導体、色素、薬物、及び放射性金属キレーター(chealators)が挙げられる。いくつかの実施形態において、疎水性部分は、コレステロール、ビタミンD、ビタミンD誘導体、ビタミンE、ビタミンE誘導体、色素、又は薬物である。いくつかの実施形態において、疎水性部分は、コレステロール、ビタミンD、ビタミンE、色素、又は薬物である。いくつかの実施形態において、疎水性部分は、コレステロール、ビタミンD、又はビタミンEである。いくつかの実施形態において、疎水性部分は、色素又は薬物である。
本発明に有用な色素としては、これだけに限定されるものではないが、Johnson, I., Histochemical Journal, 20:123-140 (1998)、及びThe Molecular ProbesR Handbook, 11th Edition, ed. Johnson and Spence, Life Technologies, Carlsbad, CA, 2010、に記載のあらゆる色素が挙げられる。色素は、蛍光色素、トリアリルメタン色素、シアニン色素、ベンジリデンイミダゾリノン色素、インジゴ色素、ビス－ピレン及びポルフィリンであり得る。いくつかの実施形態において、疎水性部分は色素である。いくつかの実施形態において、疎水性部分は、蛍光色素、ポルフィリン、又はビス－ピレンである。いくつかの実施形態において、疎水性部分は、シアニン色素、ポルフィリン、又はビス－ピレンである。
本発明に有用な薬物としては、化学療法薬及び免疫調節薬が挙げられる。例えば、薬物は、これだけに限定されるものではないが、デオキシコール酸、又は塩形態のデオキシコレート、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、タキサン(例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、バッカチンIII、10-デアセチルバッカチン、ホングドウシャンA、ホングドウシャンB、又はホングドウシャンC)、ドキソルビシン、エトポシド、イリノテカン、SN-38、シクロスポリンA、ポドフィロトキシン、カルムスチン、アンホテリシン、イクサベピロン、パツピロン(エポテロンクラス)、ラパマイシン及び白金薬物であり得る。他の薬剤としては、非ステロイド系抗炎症薬、並びに例えば、ビンブラスチン及びビンクリスチンなどのビンカアルカロイドが挙げられる。いくつかの実施形態において、薬物は、パクリタキセル、レシキモド、ガーディキモド、又はデオキシコレートである。
いくつかの実施形態において、疎水性部分は、化学療法薬、蛍光色素、免疫調節薬、トール様受容体作動薬、インターフェロン遺伝子の刺激物質の小分子作動薬(STING)、ポルフィリン、デオキシコレート、コレステロール、ビタミンD、又はビタミンEである。いくつかの実施形態において、疎水性部分は、化学療法薬、蛍光色素、免疫調節薬、インターフェロン遺伝子の刺激物質の小分子作動薬(STING)、ポルフィリン、コレステロール、ビタミンD、又はビタミンEである。いくつかの実施形態において、疎水性部分は化学療法薬、蛍光色素、免疫調節薬、インターフェロン遺伝子の刺激物質(STING)、ポルフィリン又はデオキシコレートの小分子作動薬である。いくつかの実施形態において、疎水性部分は、化学療法薬、蛍光色素、免疫調節薬、ポルフィリン又はデオキシコレートである。いくつかの実施形態において、疎水性部分は、パクリタキセル、ビス－ピレン、シアニン色素、レシキモド、ガーディキモド、アミドベンズイミダゾール、ポルフィリン、又はデオキシコレートである。いくつかの実施形態において、疎水性部分は、パクリタキセル、ビス－ピレン、シアニン色素、レシキモド、ガーディキモド、ポルフィリン、又はデオキシコレートである。いくつかの実施形態において、疎水性部分は、レシキモド又はポルフィリンである。
本発明に有用なポルフィリンとしては、当業者に知られているあらゆるポルフィリンが挙げられる。いくつかの実施形態において、ポルフィリンは、置換若しくは非置換ポルフィン、プロトポルフィリンIX、オクタエチルポルフィリン、テトラフェニルポルフィリン、ピロフェオホルビド－a、フェオホルビド、クロリンe6、プルプリン又はプルプリンイミドである。いくつかの実施形態において、ポルフィリンは、ピロフェオホルビド－a、フェオホルビド、クロリンe6、プルプリン又はプルプリンイミドである。いくつかの実施形態において、ポルフィリンはフェオホルビド－aである。いくつかの実施形態において、ポルフィリンは、次の構造：
Figure 2022545636000003
 を有する。
いくつかの実施形態において、疎水性部分はビス－ピレンである。本発明に有用なビス－ピレンとしては、当業者に知られているあらゆるビス－ピレンが挙げられる。いくつかの実施形態において、ビス－ピレンは、次の部分：
Figure 2022545636000004
 を含む。いくつかの実施形態において、ビス－ピレンは、次のもの：
Figure 2022545636000005
 を含む。いくつかの実施形態において、ビス－ピレンは、次の構造：
Figure 2022545636000006
 を有する。
本発明に有用なペプチドは、あらゆる好適なペプチドであり得、当業者に知られている任意の好適なペプチド配列長を有する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、長さが5～50個のアミノ酸のペプチド配列である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、長さが5～40個のアミノ酸のペプチド配列である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、長さが5～30個のアミノ酸のペプチド配列である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、長さが5～25個のアミノ酸のペプチド配列である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、長さが5～20個のアミノ酸のペプチド配列である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、長さが5～15個のアミノ酸のペプチド配列である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、長さが約5～10個のアミノ酸のペプチド配列である。
隣接するβ鎖ペプチドは、β－シートペプチドをもたらす、それぞれの鎖の間の水素結合を形成する。本発明に有用なβ－シートペプチド配列は、当業者に知られているあらゆる好適なペプチド配列であり得る。例えば、一般的に知られているβ－シートペプチドは、「Branched KLVFF tetramers strongly potentiate inhibition of beta-amyloid aggregation」(Chafekar et al., Chembiochem. 2007 Oct 15;8(15):1857-64)に記載されている。いくつかの実施形態において、ペプチドは、緑色蛍光タンパク質、インターロイキン、免疫グロブリン、又はβ－アミロイドペプチドのβ－シートペプチドドメインからのペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、β－アミロイドペプチドのβ－シートペプチドドメインからのペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、β－アミロイドペプチドは、β－アミロイド40又はβ－アミロイド42である。いくつかの実施形態において、β－アミロイドペプチドはβ－アミロイド40である。
いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号1に対して少なくとも40%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号1に対して少なくとも50%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号1に対して少なくとも60%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号1に対して少なくとも80%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは配列番号1を含む。
いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号2に対して少なくとも40%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号2に対して少なくとも50%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号2に対して少なくとも60%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号2に対して少なくとも80%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは配列番号2を含む。
いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号3に対して少なくとも40%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号3に対して少なくとも50%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号3に対して少なくとも60%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号3に対して少なくとも80%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは配列番号3を含む。
本発明に有用な親水性標的化リガンドは、細胞表面上の受容体、又は腫瘍微小環境の無細胞成分を標的化できる。親水後及び疎水度は、オクタン－水基準系を使用した化合物のlogP値によって一般的に計測される。0より低い値は疎水性を示し、それに対して、0より高い値は親水性を示す。いくつかの実施形態において、親水性標的化リガンドとしては、細胞表面受容体又は腫瘍微小環境内の無細胞成分を標的化するペプチドが挙げられ、そしてそれには、これだけに限定されるものではないが、例えば、マクロファージ、T細胞、及びB細胞などの免疫細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、親水性標的化リガンドは、例えば、これだけに限定されるものではないが、インテグリンや表皮増殖因子受容体などの細胞表面受容体を標的化する。いくつかの実施形態において、親水性標的化リガンドは、インテグリン、上皮成長因子、及びトール様受容体を標的化する。
いくつかの実施形態において、親水性標的化リガンドは、HER2リガンド、HER2リガンドのプロドラッグ、受容体チロシンタンパク質キナーゼ標的化リガンド、インテグリン標的化リガンド、上皮成長因子受容体標的化リガンド、卵巣癌細胞標的化リガンド、又は前立腺癌細胞標的化リガンドである。いくつかの実施形態において、親水性標的化リガンドは、HER2リガンド、HER2リガンドのプロドラッグ、インテグリン標的化リガンド、上皮成長因子受容体標的化リガンド、卵巣癌細胞標的化リガンド、又は前立腺癌細胞標的化リガンドである。
いくつかの実施形態において、親水性標的化リガンドは、HER2リガンドである。いくつかの実施形態において、HER2リガンドは、抗HER2抗体ペプチドである。いくつかの実施形態において、親水性標的化リガンドは、HER2リガンドであり、ここで、該HER2リガンドは、抗HER2 rhumAb 4D5のCDR-H3ループの一次配列由来の抗HER2抗体ペプチド模倣体である。いくつかの実施形態において、HER2リガンドは、「合理的に設計された抗HER2/neuペプチド模倣薬は、インビトロ及びインビボにおいてP185HER2/neuチロシンキナーゼを無効にする」と記載される(Park et al. Nat Biotechnol. 2000 Feb;18(2):194-8.)。
いくつかの実施形態において、HER2リガンドは、配列番号4に対して少なくとも40%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、HER2リガンドは、配列番号4に対して少なくとも50%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、HER2リガンドは、配列番号4に対して少なくとも60%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、HER2リガンドは、配列番号4に対して少なくとも80%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、HER2リガンドは配列番号4である。
いくつかの実施形態において、親水性標的化リガンドは、インテグリン標的化リガンド、上皮成長因子受容体標的化リガンド、卵巣癌細胞標的化リガンド、又は前立腺癌細胞標的化リガンドである。いくつかの実施形態において、親水性標的化リガンドは、インテグリン標的化リガンドのプロドラッグ、上皮成長因子受容体標的化リガンド、卵巣癌細胞標的化リガンド、又は前立腺癌細胞標的化リガンドである。
いくつかの実施形態において、親水性標的化リガンドは、LLP2Aプロドラッグ、LLP2A、LXY30、DUPA、フォラート、LHRHペプチド、又はEGFRリガンドである。DUPA構造のカルボン酸基のいずれか1つが、β－シートペプチドに連結するのに使用され得る。LHRH類似体ペプチドは、次のペプチド配列：H-Glp-His-Trp-Ser-Thr-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2又はH-Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2を含む。LHRHペプチドのLys側鎖NH2基は、β－ペプチドシートに連結するのに使用され得る。いくつかの実施形態において、NH2基は、β－ペプチドシートとの共有結合による連結に使用される。
本発明に有用なEGFRリガンドとしては、当業者に知られているあらゆるEGFRリガンドが挙げられる。いくつかの実施形態において、EGFRリガンドは、EGF、TGF－α、HB-EGF、アンフィレグリン、ベタセルリン、エピジェン、エピレグリン、ニューレグリン1、ニューレグリン2、ニューレグリン3、及びニューレグリン4であり得る。
いくつかの実施形態において、親水性標的化リガンドは、LLP2Aプロドラッグ、LLP2A、又はLXY30である。LLP2Aプロドラッグとしては、当業者に知られているインサイチュで代謝されるあらゆる切断可能な官能基を挙げることができる。いくつかの実施形態において、LLP2Aプロドラッグは、エステル、アミド、カルバマート、オキシム、イミン、エーテル、ホスファート、又はβ－アミノ-ケトン官能基を含む。いくつかの実施形態において、LLP2Aプロドラッグは、エステル、アミド、カルバマート、エーテル、又はホスファート官能基を含む。いくつかの実施形態において、LLP2Aプロドラッグは、エステル、アミド、カルバマート又はホスファート官能基を含む。いくつかの実施形態において、LLP2Aプロドラッグは、エステル基を含む。
いくつかの実施形態において、親水性標的化リガンドは、次の構造：
Figure 2022545636000007
 を有するLLP2Aプロドラッグである。いくつかの実施形態において、親水性標的化リガンドは、次の構造：
Figure 2022545636000008
 を有するLLP2Aである。いくつかの実施形態において、親水性標的化リガンドは、次の構造：
Figure 2022545636000009
 を有するLXY30である。
いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、次の構造：
Figure 2022545636000010
 を有する。
いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、次の構造：
Figure 2022545636000011
 を有する。
いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、次の構造：
Figure 2022545636000012
 を有する。
いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、次の構造：
Figure 2022545636000013
 を有する。
いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、次の構造：
Figure 2022545636000014
 を有する。
いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、次の構造：
Figure 2022545636000015
 を有する。
IV. ナノ担体
いくつかの実施形態において、本発明は、内側及び外側を有するナノ担体を提供し、該ナノ担体は、複数の本発明の化合物を含み、ここで、各化合物は、水性溶媒中で自己集合して、疎水性ポケットがナノ担体の内側に形成され、かつ、親水基がナノ担体の外側で自己集合するような、ナノ担体を形成する。
本発明のナノ担体の直径は、当業者に知られている好適なサイズのいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、ナノ担体は、5～100nmの直径を有する。いくつかの実施形態において、ナノ担体は、10～100nmの直径を有する。いくつかの実施形態において、ナノ担体は、15～80nmの直径を有する。いくつかの実施形態において、ナノ担体は、25～60nmの直径を有する。いくつかの実施形態において、ナノ担体は、約20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、又は約70nmの直径を有する。いくつかの実施形態において、ナノ担体は、約20nm又は約30nmの直径を有する。いくつかの実施形態において、ナノ担体は、約20nmの直径を有する。いくつかの実施形態において、ナノ担体は、約30nmの直径を有する。
ナノ担体の外部は、細胞標的化に使用され得る。本発明のナノ担体は、細胞膜表面受容体、並びにこれだけに限定されるものではないが、インテグリン、ヒト上皮成長因子受容体2(HER2)、上皮成長因子受容体、Gタンパク質結合受容体などのタンパク質を標的化できる。いくつかの実施形態において、ナノ担体は、インテグリンとHER2を標的化し得る。
ナノ担体は、細胞表面の受容体又はタンパク質に結合した後に、インサイチュで変形して、ナノフィブリル構造を形成し得る。いくつかの実施形態において、ナノ担体は、細胞表面のHER2に結合した後にインサイチュで変形し得る。
いくつかの実施形態において、ナノ担体は、そのナノ担体の疎水性ポケット内に封鎖された疎水性薬物又は造影剤を更に含む。
本発明に有用な疎水性薬物は、当業者に知られている疎水性薬物のいずれかであり得る。本発明に有用な疎水性薬物としては、これだけに限定されるものではないが、デオキシコール酸、デオキシコレート、レシキモド、ガーディキモド、イミキモド、タキサン(例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、バッカチンIII、10-デアセチルバッカチン、ホングドウシャンA、ホングドウシャンB、又はホングドウシャンC)、ドキソルビシン、エトポシド、イリノテカン、SN-38、シクロスポリンA、ポドフィロトキシン、カルムスチン、アンホテリシン、イクサベピロン、パツピロン(エポテロンクラス)、ラパマイシン及び白金薬物が挙げられる。他の薬剤としては、非ステロイド系抗炎症薬、並びにビンブラスチンやビンクリスチンなどのビンカアルカロイドが挙げられる。
本発明に有用な造影剤は、当業者に知られている造影剤のいずれかであり得る。造影剤としては、これだけに限定されるものではないが、常磁性剤、光学プローブ、及び放射性核種が挙げられる。常磁性剤は、外部から適用された領域下で磁気を帯びた造影剤である。常磁性剤の例としては、これだけに限定されるものではないが、ナノ粒子を含めた鉄粒子が挙げられる。光学プローブは、1つの発光波長での励起及び第二の異なる発光波長での検出により検出し得る蛍光化合物である。本発明において有用な光学プローブとしては、これだけに限定されるものではないが、Cy5.5、Alexa 680、Cy5、DiD(1,1’-ジオクタデシル-3,3,3’,3’-テトラメチルインドジカルボシアニン過塩素酸塩)及びDiR(1,1’-ジオクタデシル-3,3,3’,3’-テトラメチルインドトリカルボシアニンヨウ化物)が挙げられる。他の光学プローブには量子ドットが含まれる。放射性核種は、放射性崩壊を起こす元素を意味する。本発明に有用な放射性核種としては、これだけに限定されるものではないが、3H、11C、13N、18F、19F、60Co、64Cu、67Cu、68Ga、82Rb、90Sr、90Y、99Tc、99mTc、111In、123I、124I、125I、129I、131I、137Cs、177Lu、186Re、188Re、211At、Rn、Ra、Th、U、Pu及び241Amが挙げられる。
ナノ担体は、複数のコンジュゲートを含み得る。例えば、ナノ担体は、複数の、2、3、4、5、6種類又はそれを超える別個のコンジュゲートを含み得る。いくつかの実施形態において、ナノ担体は、複数の、2種類の別個のコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態において、ナノ担体は、複数の、3種類の別個のコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態において、ナノ担体は、複数の、4種類の別個のコンジュゲートを含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、内側及び外側を有するナノ担体を提供し、該ナノ担体は、複数の第一のコンジュゲート及び第二のコンジュゲートを含み、ここで、該第一のコンジュゲートは、式(I)：A-B-C(I)を含み、かつ、第二のコンジュゲートは、式(II)：A’-B’-C’(II)を含む｛式中、A及びA’は、それぞれ独立して、疎水性部分であり；B及びB’は、それぞれ独立して、ペプチドであり、ここで、各ペプチドは、独立してβ－シートを形成し；並びにC及びC’は、それぞれ独立して、親水性標的化リガンドであり、ここで、それぞれの親水性標的化リガンドは、独立してLLP2Aプロドラッグ、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、フォラート、LHRHペプチド、HER2リガンド、EGFRリガンド、又は放射性金属キレート剤であり；そして、ここで、A及びA’は、異なった疎水性部分であり、及び/又はC及びC’は、異なった親水性標的化リガンドである｝。
いくつかの実施形態において、ナノ担体は、先に記載のとおり複数の第一のコンジュゲート及び第二のコンジュゲートを含み、かつ、式(III)：A'''-B'''-C'''(III)｛式中、A''は、疎水性部分であり、B''は、ペプチドであり、ここで、該ペプチドは、β－シートを形成し、及びC''は、親水性標的化リガンドであり、並びにここで、A、A'、及びA''は、異なる疎水性部分であり、及び/又はC、C'、及びC''は、異なる親水性標的化リガンドである｝を更に含む。いくつかの実施形態において、ナノ担体は、それぞれの追加のコンジュゲートが式IIIとは独立している、第四、第五、又は第六のコンジュゲートを更に含む。
本発明のナノ担体は、複数の2種類の別個のコンジュゲートを含み得る。複数の2種類の別個のコンジュゲートを含むナノ担体は、先に記載した直径を有し得る。複数の2種類の別個のコンジュゲートを含むナノ担体は、先に記載したのと類似した標的化特性及び可変特性を有し得る。
本発明のナノ担体に好適な疎水性部分は、先に記載されている。いくつかの実施形態において、各疎水性部分は、独立して、色素、薬物、又は放射性金属キレート剤である。いくつかの実施形態において、各疎水性部分は、独立して、ビス－ピレン、ポルフィリン、レシキモド、又はガーディキモドである。
いくつかの実施形態において、各疎水性部分は、独立して、ポルフィリン又はレシキモドである。いくつかの実施形態において、ポルフィリンは、ピロフェオホルビド－a、フェオホルビド、クロリンe6、プルプリン又はプルプリンイミドである。いくつかの実施形態において、ポルフィリンはフェオホルビド－aである。いくつかの実施形態において、ポルフィリンは、次の構造：
Figure 2022545636000016
 を有する。
いくつかの実施形態において、レシキモドは、次の構造：
Figure 2022545636000017
 を有する。
本発明に有用な放射性金属キレート剤としては、当業者に知られているあらゆる放射性金属キレート剤が挙げられる。いくつかの実施形態において、放射性金属キレート剤は、Gd(III)キレート剤、ジエチレントリアミンペンタ無水酢酸(DTPA)、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,8,11-四酢酸(TETA)、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸(DOTA)、又は1,4,7-トリアザシクロノナン-1,4,7-トリ酢酸(NOTA)である。いくつかの実施形態において、放射性金属キレート剤は、Gd(III)キレート剤、DOTAキレート剤、又はNOTAキレート剤である。
本発明のナノ担体のための好適なペプチド配列長は、先に記載されている。いくつかの実施形態において、各ペプチドは独立して、長さが5～30個のアミノ酸のペプチド配列である。いくつかの実施形態において、各ペプチドは独立して、長さが5～25個のアミノ酸のペプチド配列である。いくつかの実施形態において、各ペプチドは独立して、長さが5～20個のアミノ酸のペプチド配列である。
本発明のナノ担体のための好適なペプチド配列は、先に記載されている。いくつかの実施形態において、各ペプチドは独立して、β－アミロイドペプチドのβ－シートペプチドドメインからのペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、β－アミロイドペプチドは、β－アミロイド40又はβ－アミロイド42である。いくつかの実施形態において、β－アミロイドペプチドは、β－アミロイド40である。
いくつかの実施形態において、各ペプチドは独立して、配列番号1に対して少なくとも40%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、各ペプチドは独立して、配列番号1に対して少なくとも50%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、各ペプチドは独立して、配列番号1に対して少なくとも60%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、各ペプチドは独立して、配列番号1に対して少なくとも80%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、各ペプチドは独立して配列番号1を含む。
いくつかの実施形態において、各ペプチドは独立して、配列番号2に対して少なくとも40%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、各ペプチドは独立して、配列番号2に対して少なくとも50%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、各ペプチドは独立して、配列番号2に対して少なくとも60%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、各ペプチドは独立して、配列番号2に対して少なくとも80%の配列同一性を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のナノ担体のための好適な親水性標的化リガンドは、先に記載されている。いくつかの実施形態において、それぞれの親水性標的化リガンドは独立して、LLP2Aプロドラッグ、LLP2A、LXY30、フォラート、LHRHペプチド、HER2リガンド、EGFRリガンド、Gd(III)キレート剤、DOTAキレート剤、又はNOTAキレート剤である。いくつかの実施形態において、それぞれの親水性標的化リガンドは独立して、LLP2Aプロドラッグ、LLP2A、LXY30、LHRHペプチド、HER2リガンド、EGFRリガンド、DOTAキレート剤、又はNOTAキレート剤である。いくつかの実施形態において、それぞれの親水性標的化リガンドは独立して、LLP2Aプロドラッグ、LLP2A又はLXY30である。
いくつかの実施形態において、それぞれの親水性標的化リガンドが独立して、次の構造：
Figure 2022545636000018
 を有するLLP2Aプロドラッグである。
いくつかの実施形態において、それぞれの親水性標的化リガンドは独立して、次の構造：
Figure 2022545636000019
 を有するLLP2Aである。
いくつかの実施形態において、それぞれの親水性標的化リガンドは独立して、次の構造：
Figure 2022545636000020
 を有するLXY30である。
いくつかの実施形態において、第一のコンジュゲートは、以下の構造：
Figure 2022545636000021
 を有する。
いくつかの実施形態において、第二のコンジュゲートは、以下の構造：
Figure 2022545636000022
 を有する。
いくつかの実施形態において、第二のコンジュゲートは、次の構造：
Figure 2022545636000023
 にインサイチュ（in situ）で変換される。
本発明のナノ担体の第一のコンジュゲート対第二のコンジュゲートの比は、当業者に知られているいずれかの好適な比である。いくつかの実施形態において、第一のコンジュゲート対第二のコンジュゲートの比は、約25：1～1：25である。いくつかの実施形態において、第一のコンジュゲート対第二のコンジュゲートの比は、約25：1～1：10である。いくつかの実施形態において、第一のコンジュゲート対第二のコンジュゲートの比は、約10：1～約1：10である。いくつかの実施形態において、第一のコンジュゲート対第二のコンジュゲートの比は、約10：1、8：1、5：1、3：1、又は1：1である。いくつかの実施形態において、第一のコンジュゲート対第二のコンジュゲートの比は、約1：1である。
V. ナノフィブリル
いくつかの実施形態において、本発明は、ナノフィブリルを形成する方法であって、本発明のナノ担体を、腫瘍微小環境において細胞表面又は無細胞成分と接触させることを含む方法を提供し、ここで、該ナノ担体はインサイチュで変形を受けて、フィブリル構造を形成し、それによって、ナノフィブリルを形成する。
本発明のナノ担体が細胞表面又は腫瘍微小環境にて無細胞成分と結合するとき、それは、インサイチュ変形を受けて、ナノフィブリルを形成し、そしてそれは、細胞及び/又は腫瘍微小環境を混乱させる。ナノ担体の変形は、ナノ担体の親水性標的化リガンドが細胞表面又は着目の無細胞成分に結合し、そして、ナノフィブリルを形成するフィブリル構造の形成を引き起こすときに起こる。
腫瘍微小環境は、腫瘍細胞と、これだけに限定されるものではないが、細胞外マトリックス、浸潤宿主細胞、分泌因子、シグナル伝達分子、免疫細胞、ストロマ細胞、樹状細胞、T細胞、骨髄球誘導サプレッサ細胞、脈管構造、血球細胞、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、繊維芽細胞、及びマクロファージを含めた周囲環境を含み、そしてそのいずれかと、本発明のナノ担体が相互作用して、ナノフィブリルを形成する。
本発明のナノ担体は、ナノフィブリルの高秩序β－シートフィブリル構造を形成し得る。いずれか特定の理論値によって拘束されるものではないが、β－シートフィブリル構造の形成に関して可能性のある1つの解釈は、コンジュゲート中のβ－シート形成ペプチドがナノフィブリルのβ－シートフィブリル構造の形成に影響を及ぼすというものである。
本発明のナノフィブリルは、当業者によって知られているいずれかの好適な直径を有し得る。いくつかの実施形態において、ナノフィブリルの直径は、5～50nmである。いくつかの実施形態において、ナノフィブリルの直径は、5～30nmである。いくつかの実施形態において、ナノフィブリルの直径は、5～15nmである。いくつかの実施形態において、ナノフィブリルの直径は、5～10nmである。いくつかの実施形態において、ナノフィブリルの直径は、約5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、又は約12nmである。
ナノ担体のナノフィブリルへの変形は、当業者に知られている画像化技術によって、及びナノ担体の粒度を計測することによって測定できる。例えば、ナノ担体のナノフィブリルへの変形は、TEM画像化を使用して測定でき、ここで、丸いナノ担体の形状は、腫瘍微小環境にて細胞表面又は無細胞成分へのナノ担体の結合に続いて、ナノフィブリル構造に変形する。別の例では、ナノ担体サイズは、動的光散乱(DLS)を使用することによって測定できる。DLS調査では、ナノ担体がナノフィブリルに変形するとき、ナノ担体の直径の周辺のピーク、例えば、10～100nmが、約500nm～1000nmのピークが経時的に増大するように、経時的に増大し、そして、ナノフィブリルの形成を示す。
VI. 処置と画像化の方法
いくつかの実施形態において、本発明は、疾患を処置する方法であって、それを必要としている対象に治療的有効量の本発明のナノ担体を投与することを含む方法を提供し、ここで、該ナノ担体は、腫瘍微小環境において細胞表面又は無細胞成分に結合した後にインサイチュでナノフィブリルを形成し、それによって、疾患を処置する。
細胞表面又は無細胞成分への結合は、蛍光顕微鏡を使用して当業者によって測定され得る。細胞表面又は無細胞成分への結合は、ナノ担体が疎水性部分として蛍光色素を伴ったコンジュゲートを含み、かつ、細胞が当業者によって知られている任意の蛍光色素を用いて標識されたときに測定できる。当業者は、どの蛍光色素が疎水性部分として使用されるかに基づいて、使用する好適な色素を選択できる。例えば、ナノ担体が、疎水性部分が緑色蛍光色素であるビス－ピレンを含むコンジュゲートを含むとき、細胞がは、これだけに限定されるものではないが、赤色蛍光色素又は青色蛍光色素などの、緑色ではない蛍光色素を用いて標識され得る。別の例では、疎水性部分が、これだけに限定されるものではないが、ポルフィリンなどの赤色蛍光色素を含むとき、当業者は、例えば、緑色蛍光色素又は青色蛍光色素などの赤色ではない蛍光色素を選択できる。
腫瘍微小環境は、腫瘍細胞と、これだけに限定されるものではないが、細胞外マトリックス、浸潤宿主細胞、分泌因子、シグナル伝達分子、免疫細胞、ストロマ細胞、樹状細胞、T細胞、骨髄球誘導サプレッサ細胞、脈管構造、血球細胞、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、繊維芽細胞、及びマクロファージを含めた周囲環境を含む。腫瘍増殖と進行は、微小環境と癌細胞の相互作用によって影響される可能性があり、そしてそれは、癌細胞の根絶、癌細胞の転移、又は微小転移癌細胞の休止状態の確立をもたらし得る。腫瘍微小環境は、処置応答のために標的化され得る。
腫瘍微小環境での無細胞成分への結合としては、これだけに限定されるものではないが、細胞外マトリックス内のタンパク質、並びに腫瘍細胞又は周囲の細胞に直接付着する他のリガンド、化合物、若しくは樹状細胞への結合が挙げられる。
本発明のナノ担体を、例えば、これだけに限定されるものではないが、癌腫、神経膠腫、中皮腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、神経膠芽腫、白血病、リンパ腫、前立腺癌、及びバーキットリンパ腫、頭頸部癌、結腸癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、食道の癌、胃癌、膵臓癌、肝胆道癌、胆嚢の癌、小腸の癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、尿道癌、精巣癌、子宮頸癌、膣癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、膵内分泌癌、カルチノイド癌、骨癌、皮膚癌、網膜芽細胞腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫などの癌を含む過剰増殖障害の処置のために対象に投与され得る(その他の癌についてはCANCER: PRINCIPLES AND PRACTICE (DeVita, V. T. et al. eds 2008)を参照のこと)。
本発明のナノ担体によって処置し得る他の疾患としては：(I)全身性アナフィラキシー又は過敏性反応、薬物アレルギー、昆虫刺創アレルギーなどの炎症又はアレルギー疾患；クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎及び腸炎などの炎症性腸疾患；膣炎；皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、蕁麻疹などの乾癬及び炎症性皮膚疾患；脈管炎；脊椎関節症；強皮症；喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患などの呼吸器アレルギー疾患など、(2)関節炎(リウマチ性及び乾癬性)、骨関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、真性糖尿病、糸球体腎炎などの自己免疫疾患など、(3)移植片拒絶(同種移植片拒絶及び移植片対宿主病を含む)、並びに(4)望まれない炎症反応が阻害されるべき他の疾患(例えば、アテローム性動脈硬化症、筋炎、卒中及び非開放性頭部損傷などの神経状態、神経変性疾患、アルツハイマー病、脳炎、髄膜炎、骨粗鬆症、痛風、肝炎、腎炎、敗血症、サルコイドーシス、結膜炎、耳炎、慢性閉塞性肺疾患、副鼻腔炎及びベーチェット症候群)が挙げられる。
いくつかの実施形態において、疾患は癌である。いくつかの実施形態において、疾患は、膀胱癌、脳癌、乳癌、子宮頚癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、神経膠芽腫、腸癌、頭頚部癌、白血病、肝臓癌、肺癌、黒色腫、骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌及び子宮癌から成る群から選択される。いくつかの実施形態において、疾患は、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、食道癌、神経膠芽腫、頭頚部癌、白血病、肺癌、骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌から成る群から選択される。
いくつかの実施形態において、本発明のナノ担体は、併用療法に使用され得る。いくつかの実施形態において、併用療法は、本発明のナノ担体及び少なくとも1つのチェックポイント阻害剤を含む。代表的なチェックポイント阻害剤としては、これだけに限定されるものではないが、例えば、抗CTLA-4療法、抗PD-1療法、又は抗PD-L1療法が挙げられる。例としては、イピリムバブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、アテゾリズマブ、イピリムマブ、及び/又はトレメリムマブが挙げられ、更に、ニボルマブ＋イピリムバブなどの併用療法を挙げることもできる。
いくつかの実施形態において、本発明は、画像化する方法であって、画像化する対象に有効量の本発明のナノ担体を投与することを含む方法を提供する。
本発明のナノ担体のための好適な造影剤は、先に記載されている。例えば、造影剤としては、これだけに限定されるものではないが、常磁性剤、光学プローブ、及び放射性核種が挙げられる。光学(Opitcal)プローブとしては、これだけに限定されるものではないが、シアニン色素、ビス－ピレン、及びポルフィリンなどの蛍光色素が挙げられる。
VII. 実施例
実施例1：BP-FFVLK-YCDGFYACYMDVのナノ担体
この実施例は、(1)水性条件下、血液循環中でのナノ粒子(NP)への集合、及び(2)腫瘍部位にて細胞表面HER2に結合することでナノフィブリル(NF)構造へのインサイチュ変形、が可能な高性能な超分子ペプチド、BP-FFVLK-YCDGFYACYMDVの設計と合成を説明する。この可変ペプチドモノマー(TPM)である超分子材料は、3つの個別の機能ドメイン：(1)蛍光レポーターのための凝集誘導放出(AIE)特性を有し、かつ、ミセル状NPの形成を引き起こす疎水性コアとしての、ビス－ピレン(BP)部分、(2)β－アミロイド(Aβ)ペプチドを起源とするKLVFFβ－シート形成ペプチドドメイン、及び(3)YCDGFYACYMDVジスルフィド環状ペプチドHER2－結合ドメイン、抗HER2 rhumAb 4D5のCDR-H3ループの一次配列由来の抗HER2/neu抗体ペプチド性模倣体、から成った。水性条件下、超分子ペプチドは、球状NPに自己集合するであろうが、そこで、BP及びKLVFFドメインは疎水性コアを構成し、かつ、YCDGFYACYMDVペプチドは陰性荷電親水性コロナを構成した。HER2+腫瘍を担持するマウスに静脈内(i.v.)注入したNPは、腫瘍部位にて優先的に蓄積されることがわかった。腫瘍細胞表面に提示されたHER2との相互作用により、NPは、長い保持時間を有する、フィブリル構造ネットワークへのインサイチュで変形を受けるであろう。斯かるHER2結合細胞外フィブリルネットワークは、HER2の二量体化を強く抑制し、核内の増殖及び生存遺伝子の下流細胞シグナル伝達及び発現を予防することがわかった。これらの構造的な変形ベースの超分子ペプチドは、新規クラスの、癌に対する受容体媒介性標的化処置薬を示す。
材料と方法
可変ペプチドモノマー(TPMS)1’～4’の調製。疎水性ビス－ピレンユニット(BP-COOH)を先に報告されているとおり合成した(Qiao, S.-L. et al. Thermo-Controlled in Situ Phase Transition of Polymer-Peptides on Cell Surfaces for High-Performance Proliferative Inhibition. ACS Appl. Mater. Interfaces 8, 17016-17022 (2016).)。TPM1’～4’を、標準的な固相ペプチド合成技術によって合成した。疎水性部分としてのBP-COOHを、TPM1’～4’ 鎖に連結した。TPM3’と4’に関しては、親水性ユニットとしてのPEG1000をペプチドに連結して、分子1と2のHER2リガンドを置換した。BP色素とペプチドの分子構造を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法(ESI及びMALDI-TOF質量スペクトル、Bruker Daltonics)によって確認した。
NPの自己集合調製と特徴づけ。TPM1’～4’をDMSOで溶解して、それぞれ、溶液を形成した。ペプチド溶液(5μL)を、DMSO(995、795、595、395、195、95、15、0μL)で更に希釈し、それぞれ、脱イオン水(0、200、400、600、800、900、980、995μL)と混合した。様々な水分含量の混合液のUV-vis吸収及び蛍光スペクトル(Thermo Scientific, Waltham, MA)を、計測して、NPの形成の正当性を確認した。新しいNP(99%の水分含量、20μM)を初期状態として計測に使用した。NPのNFへの形態学的変形を、HER2細胞外受容体タンパク質(HEK293細胞で発現された、Sigma-Aldrich)を加え、そして37℃にて数時間培養することによって処理した。様々な時点(0.5、6、及び24時間)にて、溶液を、サイズ/ゼータ電位(Microtrac, America)、CD(JASCO Inc, Easton, MD, USA)、及びTEM計測(Philips CM-120 TEM, America)に使用した。TEMサンプルを酢酸ウラニルによって染色した。
ヒト血漿中のNP1の安定性。NP1の安定性を、健常ヒトボランティアからの10%(v/v)の血漿で調査した。混合物を、生理学的体温(37℃)にてインキュベートし、それに続いて、168時間まで予定した時間間隔にてサイズ測定した。
MCF-7/C6細胞誘導プロセス。MCF-7/C6細胞の誘導法を、教授Jian Jian Li’s研究室(Departments of Radiation Oncology, University of California Davis)から入手した。MCF-7/C6放射線抵抗性細胞株は、全量で50Gyのγ線(1分割あたり2Gy、1週間あたり5回)を用いた25回の分割電離放射線から生き残った。
細胞表面におけるNP構造的変形のCLSM及びSEMバリデーション。細胞をガラス底部ディッシュ内で12時間培養した。NP1～4(50μM)をDMEM中の細胞と共に、それぞれ37℃にて0.5、6、及び24時間にわたりインキュベートした。共焦点レーザー顕微鏡(CLSM, Zeiss LSM710, Jena, Germany)画像化のために、標本を、グルタルアルデヒド(4%)によって10分固形化し、PBSで3回洗浄し、そして、405nmレーザーを使用して40×又は63×液浸対物レンズを用いて調べた。HER2へのNP1の結合を更に正当性確認するために、ウサギ抗HER2(29D8)モノクローナル抗体(MAb)(Sigma Aldrich, USA)を、MCF-7/C6細胞の表面のHER2の細胞外ドメインを検出するために使用した。SEM(Philips XL30 TMP, FEI Company, Hillsboro)のために、細胞を、グルタルアルデヒド(4%)によって一晩固形化し、次に、2分間金でコートした。
インビトロ細胞毒性アッセイ。MCF-7/C6、MCF-7、SKBR-3及びBT474細胞を、NP1～4の細胞毒性を評価するために使用した。ウェル毎の細胞を96ウェルプレート内に播種し(n=3)、10%のFBS及び1%のペニシリンを補充したDMEMを用いて、5%のCO2を含有する加湿環境内で37℃にて培養した。1～4のDMSO溶液を、DMEMによって希釈し(1.5、7.5、15、75、150、300μM)、次に、各ウェルに加えて、細胞と共にインキュベートした。48時間のインキュベーション後、MTS試薬を各ウェルに加えた。相対細胞生存率を、マイクロプレートリーダ(SpectraMax M2)によって計測した。細胞生存率のパーセンテージは薬効を表し、そして、100%とはすべての細胞が生き残ったことを意味する。細胞生存率を、以下の方程式を使用して計算した：細胞生存率(%)=(処置のOD490nm/ブランク対照のOD490nm)×100 %。
ウエスタンブロット分析。MCF-7/C6細胞を様々な条件によって処置し、次に、14,000rpmにて10分間の遠心分離によって回収し、そして、1%(v/v)のTriton X-100を含有する、プロテアーゼ阻害剤を伴った溶解バッファー(50mMのTris-HCl、pH8.0、150mM NaCl)で溶解した。総細胞タンパク質を、BCAキット(Applygen)を使用して推定した。各サンプル(50μgのタンパク質)をSDS-PAGEに供し、ニトロセルロース膜に移した。ブロット溶液(20mMのTris-HCl、pH7.5、150mMのNaCl、及び0.1%のTween20)中の5%(wt/v)の脱脂粉乳を用いた室温にて2時間のブロッキング後に、その膜を一次抗体と共に4℃にて一晩インキュベートした。次に、その膜を、TBST溶液で洗浄し(3×5分)、そして、二次抗体と共に室温にて2時間インキュベートした。シグナルを、Typhoon Trio Variable Mode Imagerによる化学発光によって可視化した。バンド密度を、NIH Image Jソフトウェアを使用して計算した。
HER2二量体ウエスタンブロット分析のために、MCF-7/C6細胞を、示したプロトコールを用いて処置し、次に、137mMのNaCl、2.7mMのKCl、10mMのNa2HPO4、1.8mMのKH2PO4、1%のTriton X-100及びプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma-Aldrich)を含有するバッファーで溶解した。溶解上清を、12,000rpmにて15分間の遠心分離後に回収した。0.2%のグルタルアルデヒドを37℃にて10分間溶解上清に加えた。溶解物を、ウエスタンブロット分析のために回収した。
動物モデル。すべての動物実験は、the University of California, DavisのAnimal Use and Care Administrative Advisory Committeeによって承認されたプロトコールNo.19724によるものである。雌BALB/cヌードマウスは6～8週齢(体重22±2g)であり、そしてそれを、Harlan (Livermore, CA, USA)から購入した。MCF-7/C6細胞(1マウスあたり5×106個の細胞)を、それぞれ、各雌BALB/cヌードマウスの脇腹に皮下接種した。約10日後に、NP1～4(8mg/kg)を、尾静脈を介して注入し、腫瘍、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、腸、筋肉、皮膚のエクスビボ画像を、注入後10、24、48、72、168時間にて集めた。画像は、インビボ蛍光画像化システム(Carestream In-Vivo Imaging System FXPRO, USA)によって集めた。腫瘍及び主要臓器(心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、及び脳)を回収し、TEM画像化のためにNPの注入後72時間にてグルタルアルデヒド(4%)を用いて固形化した。
インビボにおける処置の効果。脇腹に皮下接種されたMCF-7/C6細胞(1マウスあたり5×106個の細胞)の腫瘍を有するBALB/cヌードマウスを、我々の実験に使用した。腫瘍接種10日後に、マウスを5つの群に無作為に割り付けた。それらのそれぞれを、i.v.投与によって48時間毎にPBS、NP1、NP2、NP3、及びNP4で処置した。処置のプロセス中(40日間)、腫瘍体積と体重を週二回計測した。並行して、NP1の処置効果を、先に触れた類似の実験法を用いて、SKBR-3及びBT474腫瘍を担持するマウスで確認した。ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)染色試験及びKi-67試験のために、MCF-7/C6腫瘍を担持するマウスを、3回の処置後に屠殺し、そして、腫瘍組織を回収した。
統計解析。データを、平均±標準偏位(SD)として提示する。群間の比較を、スチューデントのt検定(両側)を用いて分析した。一元配置分散分析(ANOVA)を、多群分析に使用した。有意水準を、*p <0.05、**p<0.01、及び***p<0.001と定義した。すべての統計的検定は両側であった。
結果と考察
超分子材料の自己集合とフィブリル変形。可変ペプチドモノマー1(TPM1’)、BP-FFVLK-YCDGFYACYMDVを、標準的な固相ペプチド合成技術によって調製し、それに続いて、ビス－ピレンを用いてN末端キャッピングをおこない、そしてその同一性をMALDI-TOF-MSによって確認した(図6)。比較目的のために、TPM2’(BP-GGAAK-YCDGFYACYMDV)、TPM3’(BP-FFVLK-PEG1000)、及びTPM4’(BP-GGAAK-PEG1000)を、陰性対照として合成した(表1及び図7～9)。TPM1’溶液の混合溶媒(水とDMSO)中の水の割合が増加するにしたがって、π-π相互作用、及びBPとβ－シート形成ペプチド配列の強い疎水度によって引き起こされる、自己集合を介したナノ粒子NP1の段階的な形成を反映した、吸収ピーク(250-450nm)の漸減があった(図1A)。それに付随して、520nmの蛍光ピークが、BP色素のAIE蛍光特性に起因して、劇的に増強することがわかった(図1B)。TPM2’、TPM3’、及びTPM4’はすべて、類似の自己集合特性を示した。急速な水性希釈法によって4種類のTPMから集合したナノ粒子(NP1、NP2、NP3、及びNP4)を、動的光散乱法(DLS)とTEM法(TEM)で分析した(図1C)。NP1～4の直径が、それぞれ約20nm、30nm、25～60nm及び20nmであることがわかった。
Figure 2022545636000024
インビトロにおけるHER2とNP1の相互作用を調査するために、変形誘導因子としてHER2タンパク質の可溶性細胞外ドメインを選択した。図1CのTEM画像によって示されるように、NP1は、HER2との相互作用前に、約20nmにて球状構造を維持することがわかった。室温にてたった30分間にわたるHER2タンパク質とのインキュベーション後に(HER2ペプチド/HER2タンパク質のモル比≒1000：1)、少数の粒状ナノフィブリル構造(NF1、約10nmの幅径)が明らかになり；より多くのNF1が6時間の時点で検出された。24時間で、幅広いサイズ分布を有するフィブリルネットワークが明確に検出され、変形プロセスが受容体媒介性であり、かつ、時間依存性であることを示した。24時間以降であっても、HER2タンパク質の添加を伴わないNP1調製において、変形は観察されなかった。NP1からNF1への構造的変形はまた、経時的な20nmのピークの漸増と、対応する100～1000nmピークの漸減により、DLSによって溶液中で確認された(図1D)。対照的に、HER2を用いたNP2、NP3及びNP4溶液の類似処置では、24時間にわたっていずれの著しい変化も明らかにならなかった。これらの3種類の陰性対照NPを形成したTPMの共通の特徴は、NP1：HER2リガンド及びKLVFFβ－シート形成ペプチドにおける受容体媒介性変形のための2つの必須ドメインの同時存在欠如であった。円偏光二色性(CD)分光法を、変形によるTPM1’の立体構造と二次構造を観察するために使用した(図1E)。NP1を形成するための急速な自己集合の初期では、恐らくいずれかの分子間水素結合を形成するには、BPによって誘発される疎水性相互作用が早すぎたため、明確な二次構造は観察されなかった。HER2の存在下で24時間の期間を通じてNP1がNF1への変形を開始する場合、216nmの陰性CDシグナル及び195nmの陽性CDシグナルは経時的に徐々に進行し、水素結合形成を介したβ－シート形成を示す。CDに加えて、TPM1’変形の反応速度を観察するために独特なBPのAIE蛍光特性を利用した。図1Fに示されているように、NP1のBPの蛍光強度は、HER2の添加の30分後に約10%低下したが、NF1への変形が進むと復元し、かつ、増加し、そして、最終的に24時間までに約50%の増大に達した。この興味深い観察に関する説得力のある説明の1つは、フィブリルネットワーク(24時間にてNF1)内のBP又はTPM1の充填密度が、初期球状構造(NP1)のそれより有意に高かったというものである。しかしながら、球状NP1がHER2に晒されたときに、初期変形プロセス中、より密に充填されたナノフィブリルネットワークへの再編成前に、充填密度の過渡的緩和があった。HER2を伴わないPBS中のNP1の粒度が、10%のウシ胎仔血清(FBS)が存在するか否かに関係なく、37℃にて7日間にわたり変化がないままであることも実証した。
NPのフィブリル変形の形態的特徴づけ。生細胞における変形ペプチドと細胞表面受容体との相互作用を更に特徴づけするために、HER2+乳癌細胞株(SKBR-3とBT474細胞)を、NP1と共にインキュベートし、次に、共焦点レーザー走査顕微鏡法(CLSM)を使用して、BPによって放出された蛍光緑色シグナルを追跡した(図2A～2B)。これらの2種類の細胞株を伴ったNP1の6時間のインキュベーション後、緑色蛍光シグナルを細胞内よりむしろ細胞表面で観察した。対照的に、HER2の低い発現レベルを有するMCF-7乳癌細胞に関して、蛍光シグナルの大部分が、6～24時間後に細胞内に常駐することがわかり、HER2タンパク質の細胞表面提示が、細胞付近でのNP1のナノフィブリルネットワークへの変形に必要であったことを示した(図2C)。
放射線処置は、乳癌患者の管理に一般的に使用される。長期の分割電離放射線(FIR)が、臨床モデルと実験モデルの両方でHER2発現を引き起こすことが以前に報告されていた。実際には、使用したHER2+MCF-7/C6腫瘍細胞株は、30日間のFIR誘導を受け、それに続いて、コロニー形成とクローン単離を受けたHER2陰性ヒト乳癌MCF-7細胞株に由来した。MCF-7/C6細胞は、放射線耐性の特徴、HER2の高発現レベル、より高悪性の表現型、及び高レベルの癌幹細胞特性を示す。ウエスタンブロットで測定された、HER2タンパク質の相対発現レベルは、MCF-7細胞よりMCF-7/C6細胞で5倍高いことがわかった(図2D)。NP1(100μM)を伴ったMCF-7/C6細胞の30分間のインキュベーション後に、緑色蛍光ドットを細胞膜上で観察した(図2E)。24時間までに、非常に多くの緑色蛍光層が細胞全体を囲んでいるのが見られた。
NP1のHER2への結合の更なる妥当性を確認するために、ウサギ抗HER2(29D8)モノクローナル抗体(MAb)を使用して、MCF-7/C6細胞の表面上のHER2の細胞外ドメインを検出した。抗HER2 MAbを二次Abによって蛍光赤色に標識した。NP1と変形ナノフィブリルネットワーク(NF1)を、BPの固有光学特性によって蛍光緑色に標識した。図2Fに示したように、緑色蛍光は、2つの細胞の外縁周りの赤色蛍光と完全に重なった。重ね合わせ画像は、NP1ではなく、抗HER2 MAb(赤色蛍光)だけによって染色した2つの細胞間の接着界面を除いて、細胞表面周りに緑色と赤色(黄色を形成)の重なりを示した。このデータは、NF1へのNP1の変形が培地に晒された細胞表面HER2受容体との相互作用によって引き起こされるという我々の概念と一致していた。陰性対照NP(NP2、NP3、及びNP4)の細胞分布もまた、MCF-7/C6細胞で調査した。24時間のインキュベーション後に、蛍光シグナルの大部分が、細胞表面上の代わりに細胞内で見られた。走査電子顕微鏡法(SEM)では、無処置細胞ではなく、NP1-処理MCF-7/C6細胞表面上のナノフィブリルネットワーク(NF1)の存在を確認した(図2G)。対照的に、ナノフィブリル構造は、NP2、NP3又はNP4で処置した細胞表面において検出されなかった。透過型電子顕微鏡(TEM)を、ナノフィブリルネットワークの超微細構造をよりよく定義するために使用した。SEMによって得られた結果と同様に、ナノフィブリルの豊富なバンドルを、NP1とのインキュベーションの後に24時間にわたりC6細胞とMCF-7/C6細胞の間の表面に検出した。無処置MCF-7/C6細胞又は3種類の陰性対照NPで24時間処置した細胞において、ナノフィブリル構造は検出されなかった。低レベルのHER2発現を有する細胞株MCF-7をNP1と共に24時間インキュベートした別の陰性対照実験では、最少量のナノフィブリルしか細胞膜上で検出されなかった。
フィブリル変形の細胞外機構と細胞内機構。ナノフィブリルネットワーク(NF1)へのナノ粒子(NP1)のHER2媒介性変形が、HER2二量体化を弱め、下流のシグナル変換の抑制につながる可能性があることが考えられる。この説得力のある機構を実証するために、MCF-7/C6細胞をNP1、NP2、又はPBSと共に8時間インキュベートした(図3A)。NP1処置細胞に関して、緑色蛍光シグナル(BP)の大部分が赤色蛍光(抗HER2)と共存することがわかり、ナノフィブリルネットワークが細胞表面に提示されたHER2受容体と密接に関係していることを示した。HER2リガンドが存在しているが、β－シート形成ペプチドが突然変異している、NP2で処置した細胞に関して、細胞表面の緑色蛍光が弱かった。更に、NP1処置細胞の膜上の緑色/赤色蛍光シグナルは、有意に濃く、かつ、不連続であるように見え、ナノフィブリル構造のクラスタリング、恐らく、細胞膜の破損すら示唆された。
48時間のインキュベーション後のMCF-7/C6細胞に対するNP1及び3種類の陰性対照NPの細胞傷害効果をMTSアッセイで測定した。図3Bに示したように、NP1での処置は、それぞれ150μM及び300でμMにて37%及び13%の細胞生存率の、用量依存性様式で有意な細胞死をもたらした。類似の結果を、他の2種類のHER2+乳癌細胞株、SKBR-3及びBT474に関して得た。しかしながら、低レベルのHER2発現を有するMCF-7細胞をこれらの4種類のNPで処置したとき、300μMの最高濃度でさえ、あらゆる明確な細胞毒性も観察されなかった。これは、ナノ変形とその結果としてのNP1の細胞毒性がHER2媒介性であるという我々の概念と一致している。それによってNP1がアポトーシスを誘発する機構を探るために、種々のアポトーシス促進タンパク質及び抗アポトーシスタンパク質の発現レベルをウエスタンブロットによって評価した。図3Cに示したように、NP1を用いたMCF-7/C6細胞の処置は、用量依存性様式による、抗アポトーシスタンパク質Bcl-2の下方調節とアポトーシスタンパク質Baxの上方制御をもたらした。HER2の二量体化に対するNP1の効果を調査するために、0.2%のグルタルアルデヒド(glutaraldehye)を用いた簡単な化学的架橋とそれに続く、抗HER2抗体を用いたウエスタンブロット解析を利用した。この方法は、我々が二量体HER2を単量体形態と区別することを可能にした。NP1が、用量依存的様式でHER2の二量体化を阻害できることは、図3D及び図3Eから明らかであった。経時的調査では、NP1(50μM)が、HER2の二量体化を阻害する場合があるだけではなく、二量体形態から単量体形態へのHER2の転換を促進する可能性があることを示した。MAPK経路に対するNP1の効果もまた、ウエスタンブロットによって調査した。経時的なpErk、pMek及びpRaf-1レベルの有意な減少が、細胞を50μMのNP1で処置したときに観察された；この抑制効果は用量依存的であった(図3F)。比較の目的のために、MCF-7/C6細胞を36時間にわたり50μMのそれぞれのNPと共にインキュベートし、そして、Herceptinを正の対照として使用した(図3G)。Herceptinのように、NP1は、Erk、Mek及びRaf-1のリン酸化を強力に阻害することができた。対照的に、3種類の陰性対照NPは、Erk、Mek及びRaf-1のリン酸化レベルを有意に変更することはなかった。総合して、これらのデータは、HER2+腫瘍細胞の表面上の、ナノフィブリルネットワークへのNP1の変形が、HER2二量体化及びモノマーへのHER2二量体の転換の阻害を引き起こし、下流の増殖、生存細胞シグナル伝達、そして、細胞死の阻害につながることを強く支持している。
フィブリル変形のインビボにおける評価。NP1は無毒であることがわかった；NP1の8回の連続q.o.d.用量で処置した正常Balb/cマウスから得た血球数、血小板、総タンパク質、クレアチニン及び肝臓機能試験は、正常範囲の範囲内であった。生体分布調査のために、MCF-7/C6腫瘍を担持するマウスに、NP1をi.v.で与えた；10、24、48、72、及び168時間後に、主要臓器を、エクスビボにおける蛍光画像化調査のために採収した(図4A～4B)。腫瘍、並びに、例えば、肝臓、肺及び腎臓などの正常な臓器による蛍光の取り込みは、10時間にて高かった。蛍光シグナルは、7日後でさえ有意な残留シグナルを伴って、3日間超にわたって腫瘍内に存続した。対照的に、正常な臓器の蛍光シグナルは、10時間以降に下がり始め、そして、72時間にて主要臓器でほとんど検出されなかった。72時間にて、腫瘍及び覆っている皮膚を、蛍光顕微鏡試験のために摘出した。腫瘍における非常に強い蛍光シグナルと比較して、正常皮膚では無視できるほどのシグナルを検出したことが明らかになった(図4C)。摘出した正常な臓器の組織学的検査は、いずれの病理も明らかにしなかった。NP2、NP3、及びNP4に対する類似のインビボ生体分布試験もまた、同じ腫瘍モデル系で実施した。72時間にて、NP1で処置したマウス由来の腫瘍の蛍光シグナルが、NP2-4で処置したマウスのものより2～3倍高いことがわかった(図4D～4E)。7日後でさえある、NP1で処置したマウスの蛍光シグナルの延長された滞留は、腫瘍微小環境内においてNF1ネットワークへのNP1のインサイチュでの受容体媒介性変形の結果と考えることができる。i.v.投与後72時間の、摘出腫瘍のTEM試験では、腫瘍区画の細胞外マトリックス内へのナノフィブリルの大量の抱き込みを示した。斯かるナノフィブリルは、陰性対照NP処置マウス及び無処置マウスで観察されなかった(図4F)。加えて、NP1処理マウスから摘出した腫瘍内の多くの細胞が、大きい細胞間隙を伴って死滅しているように見えた。同じマウスから摘出した他の臓器(心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、及び脳)のTEM画像では、ナノフィブリルネットワークの兆候がなく、正常であることがわかり、そしてそれは、前記の光学画像化と組織病理学試験の結果と一致していた。
フィブリル可変NPの抗腫瘍活性。NP1、NP2、NP3、及びNP4の処置効率試験を、MCF-7/C6 HER2+乳癌担持マウスで実施した(図5A)。マウスの腫瘍体積が約50～80mm3に達したとき、NPを、尾静脈を介して連続した8回のq.o.d(1、3、5、7、9、11、13、15日目)で注入し、そして、40日間観察し続けた。図5Bに示したように、
NP1処置マウスの腫瘍体積は徐々に縮小し、処置後に再発の兆候なしに完全に排除された。対照的に、他の3種類の陰性対照群(NP2、NP3、及びNP4)はいずれも、有意な腫瘍応答を引き出さなかった。この処置研究のマウスは、40日間の処置研究の全体を通して、いずれの脱水症状も示すことなく、かつ、有意な体重減少もなかった(図5C)。生存曲線は、腫瘍成長結果とよく相関した(図5D)。NP1処置を受けた8匹のマウスのうち7匹が、腫瘍再発のいずれの兆候もなしに、150日間にわたり生き残った。これらの8匹のマウスのうちの1匹が、検出可能な腫瘍によってではなく、未知の理由で60日目辺りに死亡した。対照的に、PBS、NP2、NP3、及びNP4処置群のすべてのマウスが、それぞれ51、63、57、及び60日以内に死亡した。この結果は、一般に固形腫瘍に対する、そして、より具体的にはHER2+腫瘍に対する受容体媒介性可変超分子ナノ治療法(例えば、NP1)の臨床的可能性を、大いに奨励して、かつ、明確に実証する。
NP1のインビボ抗腫瘍機構をよりよく理解するために、マウスを屠殺し、そして、残留腫瘍をNP1の3回の連続したq.o.d注入後の生化学的及び形態学的評価のために採収した(図5E)。蛍光顕微鏡及びヘマトキシリン-エオジン(H&E)染色のために凍結切片を入手した(図5F)。細胞殺滅の程度が蛍光強度の程度とよく相関することがわかった；ネクローシスを、強い蛍光強度を有する腫瘍区域で検出した。ナノフィブリルネットワークがどのようにHER2+腫瘍細胞を殺滅するかを理解するために、NP1処理マウス由来の腫瘍に対する高倍率TEMを実施した。図5Gにおけるネクローシス性又はネクロトーシス性細胞のTEM画像では、原形質膜が破損し、破損細胞の内側に大量のフィブリルナノ構造が存在しているのを明らかにした。一部のナノフィブリル抱き込みが、核の核外膜に隣接して見られた。有意な細胞殺滅は、PBS、NP2、NP3又はNP4で処置したマウス由来の腫瘍では検出されなかった。Ki-67マーカーについて染色した組織切片は、インビボにおけるNP1の抗増殖促進効果を評価するのに良好な手段である。NP1を用いた3回の処置後、腫瘍組織におけるKi-67の発現レベルは、陰性対照NPで処置したマウス由来の腫瘍と比較して、有意に減少した(図5H)。
NP1が、細胞培養において、HER2二量体化、並びにHER2+細胞株におけるErk、Mek、及びRaf-1のリン酸化を阻害し得ることは、先に示された。ここで、類似のウエスタンブロット試験を、NP1の3回の連続したq.o.d.処置を受けたマウスから摘出した腫瘍で実施した。図5Iで示したとおり、総HER2レベルは、変化がないままであったが、Erk、Mek、及びRaf-1のリン酸化が、他の陰性対照群と比較して、有意に減少することがわかった。総合すると、そのデータは、受容体媒介性可変超分子ナノ治療法用NP1が、腫瘍組織レベルにて下流増殖性及び生存細胞シグナル伝達を抑制するのに大いに有効であることを明確に実証した。HER2+腫瘍に対する有効な処置薬としてのNP1の普遍性をより上手に調査するために、他の2種類のヒトHER2+乳癌異種移植モデル(SKBR-3及びBT474)を、我々の試験のために選択した。図5J～5Kに示したように、NP1で処置したマウスの腫瘍体積は、40日目までにSKBR-3腫瘍の完全排除及びBT474腫瘍のほぼ完全な排除を伴った、非常に良好な応答があった。対照的に、PBS対照群の腫瘍体積は、40日目において1200～1500mm3に増殖した。
Herceptinの既知の副作用の一つが心臓毒性である。それは、ドキソルビシンなどの心臓毒性薬物と一緒に患者に与えることができない。これまでのところ、NP1を用いた我々の異種移植試験における心臓血管効果は観察されなかった。心筋におけるNP1の取り込みは検出されなかった。冠状血管が損傷を受けていないことが予想され、かつ、20nmのNP1は心筋に達することができないので、これは驚くべきことではない。NP1が3種類の異なるHER2+腫瘍に対して非常に効果的であったという事実は、HER2+乳房癌、卵巣癌、胃癌、及び膀胱癌に対する更なるNP1の前臨床及び臨床開発を保証する。いくつかの元々HER2陰性の乳癌が長期の分割電離放射線(FIR)後にHER2の発現を誘発し得るという優れた臨床上の証拠が存在する。このことは、この新規の受容体媒介性可変ナノ療法(RMTN)の利益を享受し得る患者集団を更に拡大する。
単独療法としてのNP1だけの8回の連続したq.o.d用量が、比較的小さい(≦100mm3)HER2+乳癌異種移植片を担持するマウスの大部分を治癒するのに有効であることを実証した。
実施例2：複数の、2種類の別個のコンジュゲートを含むナノ担体
免疫チェックポイント遮断(ICB)療法は、臨床腫瘍学に変革をもたらした。ICB抵抗性の主な要因の1つが、腫瘍部位へのTeff細胞ホーミングの欠如である。この実施例では、28nmの無毒性ペプチドミセル状ナノ粒子を説明し、LXY30、α3β1インテグリン標的化リガンドを示す。多くの上皮癌で過剰発現されるα3β1インテグリンとの相互作用により、これらのナノ粒子は、腫瘍微小環境(TME)内においてナノフィブリル構造ネットワークへのインサイチュ変形を受けるであろう。ナノフィブリルネットワークは、腫瘍部位への細胞傷害性CD8+T細胞ホーミング及び腫瘍部位におけるマクロファージの再教育を促進するだけではなく、TMEにおけるエステラーゼを介したTLR7/8免疫作動物質(レシキモド)の持続放出を可能にし、抗PD-1抗体と一緒に与えられたときに、マウスの同種同系4T1乳癌モデル及びルイス肺癌モデルの排除をもたらした。これらの構造的変形ベースの超分子ペプチドは、TMEのT細胞腫瘍ホーミング及び再プログラミングを促進することによって、革新的なクラスの、癌に対する受容体媒介性標的化免疫治療法を示す。
この実施例では、癌に対する全身的抗免疫応答を付与できる、リガンド受容体媒介性、ペプチドベース、かつ、無毒二重リガンドのフィブリル可変ナノプラットフォームを説明する。最初はナノ粒子形態である、このナノプラットフォームは、2つの高性能な可変ペプチドモノマーTPM1及びTPM2から自己集合される。TPM1、LXY30-KLVFFK(Pa)は、3つの個別の機能ドメイン：(1)多くの固形腫瘍によって発現されるα3β1インテグリンヘテロ二量体膜貫通受容体を標的化する高親和性、かつ、高特異性LXY30環状ペプチド(cdG-Phe(3,5-diF)-G-Hyp-NcR)リガンド；(2)β－アミロイド(Aβ)ペプチドを起源とするKLVFFβ－シート形成ペプチドドメイン；及び(3)ミセル状ナノ粒子の形成を引き起こす疎水性コアとしての役割を果たす、蛍光特性を有するフェオホルビド－a(Pa)部分、から成る。TPM2、プロLLP2A-KLVFFK(R848)はまた、3つの個別の機能ドメイン：(1)プロLLP2A、LLP2Aの「親リガンド」バージョン、そしてそれは、リンパ球の活性化α4β1インテグリンに対する高親和性、かつ、高特異性ペプチド模倣リガンドである、(2)同じKLVFFβ－シート形成ペプチドドメイン、及び(3)R848(レシキモド)、エステル結合を介してTPM2主鎖に結び付けた、疎水性トール様受容体(TLRs)7/8作動薬、から成る。プロLLP2Aでは、LLP2Aのカルボキシル基が、それが、血液循環中に正常リンパ球及び間充織幹細胞と相互作用しないように、3-メトキシ-1-プロパノールによってエステル化される。豊富なエステラーゼを有するTMEでは、プロLLP2AはLLP2Aに変形して、腫瘍部位への免疫細胞のホーミングを促進する。同様に、R848のエステラーゼ応答性放出は、抗原提示細胞(APC)を活性化するために、免疫細胞を促進して抗腫瘍応答因子を生じさせるために、及びM2からM1にマクロファージの表現型を覆すために、TMEで起こるであろう。
水性条件及び血液循環下では、TPM1及びTPM2は、1：1の比にて1つの球状の可変ナノ粒子(T-NP)に自己集合するであろうが、そこでは、KLVFFK(Pa)とKLVFFK(R848)ドメインは疎水性コアを構成し、LXY30とプロLLP2Aリガンドペプチドは親水性コロナを構成した。腫瘍細胞膜上に提示されたα3β1インテグリン受容体タンパク質との相互作用により、T-NPは、腫瘍関連エクソソームが豊富である腫瘍細胞の表面上及びTME内で、ナノフィブリル(T-NF)構造ネットワークへのインサイチュ変形を受け、これにより、(少なくとも7日間)腫瘍部位におけるナノフィブリルネットワークの延長された滞留を維持するであろう。この場合、より多くの親水性プロLLP2Aペプチドリガンドはフィブリルの外側表面に提示されるであろうし、それと同時に、疎水性PaとR848はフィブリルのコアに封鎖されるであろう。TME内の高いエステラーゼにより及び腫瘍細胞上では、プロLLP2Aは、活性化されたα4β1インテグリンに対してLLP2A(T細胞リガンド)に迅速に変形するであろう。フィブリル上に提示されたLLP2Aは、TMEにおける及び腫瘍細胞に隣接したTeff細胞(例えば、CD8+T)細胞などの活性化免疫細胞のホーミングと滞留を容易にするであろう。それはまた、TeffのT細胞受容体(TCR)と、腫瘍細胞の主要組織適合性複合体(MHC)との相互作用を高めるであろう。抗PD-1 ICB療法の追加は、細胞毒性T細胞を活性化する及びTeffの機能不全と消尽を食い止めることによって、抗腫瘍免疫応答を更に高めるであろう。加えて、腫瘍部位における高いエステラーゼの結果としてのナノフィブリルネットワークからのR848の持続放出は免疫抑制性TMEを食い止めるであろう。これらの構造的変形ベースの超分子ペプチドは、腫瘍に対するT細胞ホーミングを高めることによって、及び免疫抑制状態から永続的な免疫活性状態へとTMEを改善することによって、革新的なクラスの、癌に対する受容体媒介性標的化免疫治療法を示す(図12)。
ナノプラットフォームの自己集合とフィブリル変形。2つの可変ペプチドモノマー(TPM1：LXY30-KLVFFK(Pa)；TPM2：プロLLP2A-KLVFFK(R848))を合成し、そして、特徴づけした(図13A及び図20)。TPM1とTPM2混合液(1：1の比)の混合溶媒(水とDMSO)中の水の割合が増大するに従って、Pa色素のACQ特性による675nmの蛍光ピークの漸減があり(図13B)、そして、自己集合を介した可変NP(T-NPと称される)の段階的な形成を反映した。同時、405及び680nm両方における吸収ピークのわずかな減少があった。ナノ粒子を、透過型電子顕微鏡法(TEM)と動的光散乱法(DLS)によって分析した。TPM1及びTPM2はそれぞれ単独で、自己集合して、それぞれ18及び55nmの球状のナノ粒子(NPTPM1及びNPTPM2)を形成することができた。TPM1とTPM2の1：1混合物から集合したT-NPは、約28nmの球状構造体をもたらし、そしてそれは、NPTPM1とNPTPM2のサイズの間にある(図21A)。T-NPの臨界凝集濃度(CAC)は、8μMであると決定した(図21B)。T-NPが、37℃にて7日間にわたって良好な血清安定性及びタンパク分解安定性を維持し得ることもまた実証した(図21C)。
インビトロにおけるT-NPの受容体媒介性フィブリル可変プロセスを検証するために、可溶性α3β1インテグリンタンパク質(LXY30の受容体)をT-NP溶液に追加した。室温にて24時間のインキュベーション後に、広いサイズ分布を有するフィブリルネットワーク(T-NF、約8nmの幅径)を明確に検出した(図13C、13F)。24時間後であっても、α3β1インテグリンタンパク質の添加なしのT-NP調製物では、変形は観察されなかった(図21D)。T-NFのCACが5μMであることを決定し、そしてそれは、T-NPのもの(8μM)より低く、T-NFがT-NPよりもナノ構造を形成するための高い傾向を有することを示した(図21E)。Paの蛍光もまた、T-NPのフィブリル変形プロセスを観察するために使用した(図13D)。T-NP溶液へのα3β1インテグリンタンパク質の添加は、Paの蛍光強度の漸減、及び最初の2時間以内の680nmから725nmまでの赤色領域に向かう蛍光ピークの顕著なシフトをもたらし、その期間の球状構造体からフィブリル形状へのPaの凝集構造における変化と一致した。エステラーゼの存在又は不存在下での可溶性α4β1インテグリンタンパク質に対する、T-NPの表面に提示されたプロLLP2A及びLLP2Aの応答性を調査した(図13E～13F)。可溶性α4β1インテグリンタンパク質だけでは、24時間のインキュベーション後であっても、プロLLP2Aを提示するT-NPの球状構造を変化させることができなかった。対照的に、エステラーゼの連続添加とそれに続く、可溶性α4β1インテグリンタンパク質の添加は、24時間のインキュベーション後に、フィブリルネットワークへの球状T-NPの転換を引き起こすことができた。この結果は、エステラーゼが親リガンドのプロLLP2AをリガンドのLLP2Aに変形でき、そしてそれが、順番にT-NFへのT-NPの受容体媒介性変形を誘発できることを確認した。T-NPの変形プロセスの円偏光二色性(CD)分光分析では、β－シート形成の兆候である、α3β1インテグリンタンパク質又はエステラーゼ/α4β1インテグリンタンパク質の組み合わせとのインキュベーションにより216nmの陰性シグナル及び195nmの陽性シグナルの段階的な進行を示し(図2G)、そして、図13C及び13Eで示したTEMの結果と一致した。T-NFからのR848のインビトロ放出挙動を、エステラーゼの添加を伴ってpH6.5にて調査し、そして、TME条件をシミュレートした。図13Hに示したように、約45%のR848が最初の24時間で放出され、その後、放出速度は徐々に減速し、約86%の累積放出を168時間までに観察し、そして、延長された、かつ、持続的なR848の放出がTMEにて起こる可能性があることを示した。T-NPの独特な可変特性を実証するために、関連する対照非可変ナノ粒子(UT-NP)を、1：1(TPM3：LXY30-KAAGGK(Pa)とTPM4：プロLLP2A-KAAGGK(R848))の比にて、β－シート形成KLVFFペプチド配列なしで2種類のTPMの集合によって形成した。予想されるように、α3β1インテグリンタンパク質は、24時間後であってもUT-NPをフィブリル構造に変形することができず、β－シートペプチドがT-NFへのT-NPの変形に必要であることを示した(図20及び21)。
ナノ粒子のフィブリル変形、及び腫瘍部位へのTエフェクター細胞ホーミングに関するインビトロにおける評価。生細胞の表面における可変ナノ粒子とα3β1インテグリン受容体との間の相互作用を更に特徴づけるために、α3β1インテグリン発現4T1マウス乳癌細胞を選択した。フローサイトメトリー分析では、LXY30(高親和性α3β1インテグリンリガンド)が4T1腫瘍細胞に結合したことを確認した(図23)。T-NPが、50μMにて85%の細胞生存率であり、4T1細胞に対してわずかに細胞傷害性であったこともまたわかった(図24)。NPの分布を、共焦点レーザー走査顕微鏡法(CLSM)を使用して、Paによって放出された赤色蛍光シグナルを追跡することによって調査した。T-NPを伴った4T1細胞のインキュベーションの6時間後に、強い赤色蛍光シグナルを、細胞の内側ではなく、細胞表面とその付近で観察した(図15A)。対照的に、UT-NP処置群におけるPaの蛍光シグナルが、細胞の細胞質で主に濃縮されることがわかった。腫瘍細胞の表面で形成されたナノフィブリルネットワークの滞留と安定性を試験するために、非結合性NPをインキュベーションの6時間後に洗い落とし、NPを含まない新鮮培地を加えて、細胞をもう18時間インキュベートした。T-NP処置細胞は、24時間においても細胞表面にまだ強い赤色蛍光シグナルを保持していた(図15B)。非常に対照的に、24時間後のUT-NPで処置した細胞では、とても弱い蛍光シグナルしか観察されなかった。これは恐らく、その期間中に新しいエンドサイトーシスによる取り込みまったく無いにもかかわらず、18時間のインキュベーション後に既に取り込まれたUT-NPの酵素的分解に起因する。TEM画像では、24時間にわたるT-NPとのインキュベーション後に、4T1細胞の表面及び4T1細胞間のナノフィブリルネットワーク(T-NF)の存在を確認したが、UT-NPで処置した細胞上の斯かるナノフィブリル構造の不存在を確認した(図15C)。細胞表面から遠く離れたフィブリル構造は、恐らく、α3β1インテグリンタンパク質を提示する分泌腫瘍エクソソームによって引き起こされた。T-NPの表面に提示される、親リガンドプロLLP2AのLLP2Aへの転換後の、T-NPとT細胞表面α4β1インテグリンとの間の相互作用に対するエステラーゼの効果を調査した。高発現レベルの構成的に活性化したα4β1インテグリンタンパク質を有する、生きたGFP形質移入Jurkat Tリンパ性白血病細胞を、T細胞を模倣するために使用した。図15Dに示したように、(エステラーゼで前処置した)T-NPを伴ったJurkat細胞の6時間のインキュベーション後に、非常に多くの赤色蛍光層がJurkat細胞周囲に見られ、親リガンドのLLP2Aリガンドへの転換がうまくいったことを示した。走査電子顕微鏡法(SEM)では、T-NP処置4T1細胞及びエステラーゼで前処置したT-NP処置Jurkat細胞の表面におけるフィブリルネットワークの存在を確認した(図15E)。
4T1細胞表面上のT-NPの最初のフィブリル変形のプロセスと、それに続く、T細胞ホーミングをシミュレートするために、まず4T1細胞をT-NPと共に6時間インキュベートし、次に、非結合T-NPを洗い落とし、それに続いて、エステラーゼを含有するがT-NPを含まない新鮮培地を添加した。1時間のインキュベーション後に、Jurkat細胞を加え、4T1細胞と共に2時間又は4時間インキュベートした。その後、CLSM画像化前に、非結合Jurkat細胞をそっと取り除いた(図15F)。予想されるように、2時間のインキュベーション後に、赤色蛍光に伴うフィブリル構造層を、4T1細胞表面の周囲で検出し、そして、Jurkat細胞(GFP+)が、赤色蛍光フィブリルネットワークと相互作用し、かつ、4T1乳房腫瘍細胞に非常に近接していることがわかった。インキュベーション時間を4時間まで延ばした場合、より多くのJurkat細胞が、4T1腫瘍細胞の周りに群がったことがわかり、そしてそれは、フィブリルネットワークが腫瘍部位へのT細胞などの免疫細胞のホーミングを容易にするであろうという我々の概念と一致していた。SEM画像化では、ナノフィブリル構造がナノフィブリルネットワークを通して4T1細胞とJurkat細胞との間の直接的な物理的接触に重要な役割を担っている決定的証拠を提供した(図15G)。
免疫抑制M2分極表現型から抗腫瘍形成M1分極表現型へのTAMの転換は、免疫抑制腫瘍微小環境を復元するための主要な免疫処置ストラテジーの1つある。マクロファージ偏光状態は、顕著な特徴である形態、例えば、M1様対応物の円形や板状形態とは対照的なM2様細胞の細長い突起、を実証する。IL-4を、代謝チェックポイント酵素アルギナーゼ-1(Arg1)及びマンノース受容体1(Mrc1)の発現レベルの増大によって反映される、骨髄誘導マクロファージ(BMDM)をM2分極マクロファージに誘導するのに使用した。R848は、これらの細胞によって産生される高レベルのインターロイキン12(IL-12)と酸化窒素合成酵素(Nos2)をもたらす、インビトロにおけるM1表現型の強力な駆動因子であると報告された。M2表現型からM1表現型へのマクロファージの再教育のためのT-NF使用の可能性を調査した。ナノプラットフォームでは、R848は、エステル結合を介してTMP2に共有結合により連結された。そのため、予想外ではなかったが、可溶性α3β1インテグリンタンパク質を用いてT-NPから事前に形成したT-NFを伴った4T1細胞のインキュベーションは、IL-4によって誘導されたM2分極マクロファージに対して有意な効果がなかった(図15H)。マクロファージの形態及びArg1とMrc1の発現レベルにおける有意な変化は12時間後であっても観察されなかったが、それは、T-NFから放出されたR848の不足によって説明できた。対照的に、培地へのエステラーゼの添加に続く、12時間のインキュベーションは、M1状態に向けたM2状態マクロファージの形態学的変化、Arg1及びMrc1の減少、並びにqPCRによって計測されるIL-12及びNos2発現の増大をもたらした。これらの変化は24時間後により一層顕著であり、その時には、マクロファージが、円形及び板状形態(M1様)に完全に変形し、Arg1及びMrc1が更に減少し、及びIL-12及びNos2発現が増加した。フィブリルネットワークからのR848の持続的な放出を提供する、TMEをとどめるT-NFの能力は、永続的な抗癌免疫活性TMEを作り出す。
ナノ粒子のフィブリル変形、及びTエフェクター細胞の腫瘍ホーミングに関するインビボにおける評価。T-NPは無毒であることがわかった：T-NPの8回の連続したq.o.d.静脈(i.v.)用量で処置した正常Balb/cマウス由来の血球数、血小板、クレアチニン、及び肝臓機能試験は、正常範囲の範囲内であった(図25～26)。インビボにおける血液薬物動態(PK)試験では、T-NPが長い循環時間(T－半減(α)：2.866時間及びT－半減(β)：23.186時間)を有し、循環中でのその安定性を示した(図27)。生体分布試験のために、T-NPを、同系同所性4T1乳癌を担持するBalb/cマウスに尾静脈注入し；10、24、48、72、120及び168時間後に、腫瘍及び主要臓器をエクスビボ蛍光イメージングのために摘出した(図16A～16B)。Paの有意な蛍光シグナルでは、168時間超にわたって腫瘍組織に存続することがわかり、その一方で、正常な臓器における蛍光シグナルは、10時間後に減少し始め、72時間にて主要臓器においてほとんど検出されなかった。非常に対照的に、UT-NPによって処置した腫瘍組織におけるPaの蛍光シグナルは、24時間にピークに達した後に経時的に漸減することがわかった(図16C～16D)。168時間までに、UT-NPのピーク蛍光シグナルの2.88%未満が腫瘍において維持されたが、その一方で、T-NPに関しては、59.89%超のシグナルあが腫瘍において維持された(図16D)。T-NP処置マウスにおける蛍光シグナルの延長された滞留は、TMEにおけるT-NFネットワークへのT-NPのインサイチュでの受容体媒介性変形の結果と考えることができる。i.v.投与の72時間後の、摘出した腫瘍切片に対するTEM試験では、細胞外マトリックス内のナノフィブリルの豊富な抱き込みを示したが、それに対して、陰性対照UT-NP処置マウス及び生理食塩水処置マウスにおいて、斯かるナノフィブリルは観察されなかった(図16E)。腫瘍及び覆っている皮膚の蛍光顕微鏡写真では、腫瘍領域における強い蛍光シグナルが明らかになったが、正常皮膚では無視できるほどのシグナルであった。これは、(1)T-NPが、漏出性腫瘍脈管構造(EPR効果)を通してTMEに漏れ、それに続いて、腫瘍細胞及び腫瘍関連エクソソーム上のα3β1インテグリンとの相互作用によってT-NFを作り出す、及び(2)正常皮膚では血管が漏出性でない、であろうという我々の概念と一致している(図16F)。経時的なR848の組織分布もまた、高圧力液体クロマトグラフィー質量分析法(HPLC-MS)によって測定した。T-NPを用いて、腫瘍によるR848の取り込みは、24時間にて他の正常な臓器のものより有意に高かったこと、及び腫瘍部位におけるR848の滞留は、注入の7日後でさえ、組織1gあたり1.18μgにて非常に高かったことがわかった(図16G)。UT-NPもまた、腫瘍部位に有意量のR848を送達し得るが(T-NPが送達し得るものの80%)、腫瘍部位におけるR848の滞留は、T-NPのそれよりはるかに低かった。腫瘍部位におけるR848の延長された滞留は、持続的な免疫型活性TMEがT-NPを用いて達成され得ることを示す。
TMEにてLLP2A及びR848を提示するナノフィブリルネットワークが、腫瘍部位へのインビボT細胞ホーミングを促進し得るかどうか評価するために、T-NP処置マウスからの腫瘍を、T-NPの単回i.v.注入後15日目に摘出し、そして、腫瘍内の免疫細胞集団をフローサイトメトリー、免疫組織化学(IHC)、及びqPCRによって分析した。非可変/エンドサイトーシス陰性対照群としてUT-NPを使用する実験もまた、同時に実施した。T-NPの尾静脈注入が持続的免疫活性TMEをもたらしたことがわかった。第一に、T-NPが腫瘍部位(図16H)にてケモカインCXCL10の産生を有意に刺激することがわかったが、それは、Tエフェクター細胞動員を容易にすることが知られていた。T-NP処置腫瘍組織内のCD45+CD3+とCD45+CD3+CD8+ T細胞の割合が、エンドサイトーシスUT-NP又は生理食塩水のみで処置したマウスからのものより実質的に高いことが観察された(図16I～16J)。より具体的には、腫瘍内のCD3+CD8+Tエフェクター細胞のパーセンテージは、それぞれ生理食塩水及びUT-NPで処置したマウスのものに対して18倍及び4倍増加したことがわかった(図16J)。第二に、腫瘍部位におけるCD4+Foxp3+ Tregの相対的量が、UT-NP、すなわち(4.97%対13.0%)又は生理食塩水(4.97%対14.6%)で処置したマウスのそれよりT-NP処置を受け入れたマウスにおいて実質的により低いことがわかった(図16K)。抗腫瘍免疫バランスの指標である、腫瘍浸透性CD8+キラーT細胞対免疫抑制性Treg(CD3+CD4+Foxp3+)の比が、T-NP処置群において最も高いことがわかった(図16J～16K)。腫瘍組織切片のIHC染色でもまた、CD8/CD4の増大及びFoxp3の減少を確認した(図16L)。第三に、腫瘍切片のIHC染色では、UT-NPによって処置した腫瘍組織と比較して、T-NP処置群におけるM1分極マクロファージマーカーCD68の増大とM2分極マクロファージマーカーCD163の減少を実証した。これは、腫瘍部位でのR848の持続放出によって説明でき、そして、TAMの表現型再教育を引き起こした。第四に、細胞免疫関連マーカー(IFN-γ、TGF-β)及びマクロファージマーカー(IL-12、IL-10、Nos2及びArg-1)の遺伝子発現レベルもまた、qPCRによって評価した。図16Mに示したように、腫瘍組織における、IFN-γの高発現レベルとTGF-βの低発現レベルでは、強い腫瘍特異的免疫応答が引き起こされたことを確認した。更に、IL-12及びNos2の分泌が有意に上方制御されることがわかったが、それに対して、IL-10及びArg-1の分泌は有意に下方制御され、そして、UT-NP処置でも生理食塩水対照でもなく、T-NP処置を用いた、M2状態からM1状態へのTAMの有意な表現型転換を示した。
処置効果試験を、同系同所性4T1乳房癌担持マウスで実施した。それぞれ異なる処置レジメン：(1)生理食塩水；(2)(EK)3-KLVFFK(Pa)/(EK)3-KLVFFK(R848)；(3)プロLLP2A-KLVFFK(R848)(単一モノマー)；(4)LXY30-KAAGGK(Pa)/プロLLP2A-KAAGGK(R848)(非可変UT-NP)；(5)LXY30-KLVFFK(Pa)/プロLLP2A-KLVFFK(Pa)(フィブリル変形、しかしR848の不存在)；(6)LXY30-KLVFFK(Pa)/プロLLP2A-KLVFFK(R848)、を受けたマウスを無作為に6つの群に割り付けた。レジメン6は、4種類の重要な要素：LXY30、プロLLP2A、R848、及びKLVFF、のすべてを含む完全なT-NPであるが、それに対して、レジメン2、3、4又は5はすべて、T-NPの一部の成分を欠いている。腫瘍体積が約50mm3に達したとき、すべての処置レジメンに、連続した8回のq.o.d.で尾静脈注入し、そして、そのマウスを、21日間にわたり継続的に観察した(図17A)。図17Bに示したように、レジメン2、3、及び4は、不活性であった。レジメン5(フィブリル変形だが、R848なし)は、群2、3及び4と比較して、有意な癌抑制を実証した。レジメン6(T-NP、フィブリル変形とR848の両方)は、有意な腫瘍増殖抑制(図17B)及び長期生存(図17D)によって最も効果的であることがわかり、T細胞ホーミングストラテジーとTLR7/8作動因子の持続放出の組み合わせの重要性を示した。この処置試験におけるマウスのいずれも、全処置期間を通じて脱水状態の症状も、有意な体重減少のいずれも示さなかった(図17C)。生存曲線は、腫瘍増殖の結果とよく相関した。レジメン6(又はT-NP)で処置したマウスは、他の処置群と比較して、より長い生存期間の中央値(62日)を達成した(レジメン1、2、3、4、及び5に関して、それぞれ29、32.5、33.5、33.5、及び39日)。
可変ナノ粒子によって引き起こされる免疫処置効果の機構を解明するために、腫瘍組織を採集し、腫瘍浸透CD3+(CD45+CD3+)及びCD8+(CD45+CD3+CD8+)T細胞を定量化するためにフローサイトメトリーを使用した(図17E)。インサイチュフィブリル変形及びプロLLP2Aの提示を可能にする処置レジメン(レジメン5及び6)だけが、特にT-NPの免疫アジュバントR848と組み合わせて(レジメン6)、腫瘍内のCD3+及びCD8+T細胞の頻度を有意に増強し、そしてそれは、観察したT-NPにおける最も強い抗腫瘍効果と一致した。T-NPで処置したマウス由来の腫瘍切片(H&E)では、他の対照群と比較して、Ki-67発現の顕著な減少、CD8+T細胞の増大、及びFoxp3(Treg細胞)の減少が明らかになった(図17F)。CD68の増大とCD163の減少があり、マクロファージの表現型がT-NPの8回の用量後に復元したことを示した。CD8+T細胞が、サイトカインIFN-γとTNF-αを分泌して、腫瘍細胞を殺滅することが知られている。腫瘍組織におけるIFN-γとTNF-αの発現レベルを、qPCRによって更に評価した。図17Gに示したように、処置レジメン6(T-NP)は、IFN-γとTNF-αの最も高い発現レベルにより、腫瘍微小環境の免疫活性状態を復元するのに最も効果的であった。加えて、T-NPはまた、IL-12、IL-6、及びNos2の発現を有意に誘発し、かつ、TGF-β、IL-10、及びArg-1の発現を抑制し、そして、Treg細胞動員の抑制及びM2様マクロファージのM1表現型への再教育につながった。
見込みはあるが、しかしながら、T-NP単独では、腫瘍を完全に排除できたわけではない。これは、腫瘍微小環境におけるTエフェクター細胞の不十分な活性化とホーミングによって引き起こされ得る。腫瘍細胞が、PD-L1の過剰発現によってT細胞のPD-1受容体を乗っ取るすることは周知であり、そしてそれは、PD-1を活性化し、そして、T細胞増殖、活性化、サイトカイン産生、変更された代謝及び細胞傷害Tリンパ球キラー機能、並びに活性T細胞の最終的な死滅の阻害につながり得る。臨床的に、PD-1又はPD-L1を標的化する抗体は、腫瘍微小環境内で「使い果たされた」T細胞を再活性化できることを実証した。しかしながら、黒色腫と非小細胞肺癌を除いて、ICB抗PD-1又は抗PD-L1療法の臨床応答率は限られているので、ほとんどの患者が難治性のままである。1つの重要な理由は、腫瘍微小環境において十分なTeff細胞が存在しないことである。(プロモートT細胞ホーミングを促進し、かつ、腫瘍微小環境を改善する)我々の受容体媒介フィブリル可変ナノプラットフォームは、斯かる欠陥を修正できる可能性があり、そのため、PD-1及びPD-L1チェックポイント遮断免疫療法に大いにシナジーを与える。同系同所性4T1乳房癌担持マウスを、追加のナノプラットフォームあり又はなしでの抗PD-1抗体(抗PD-1)療法のために4つの群：(1)抗PD-1単独；(2)レジメン4(UT-NP)＋抗PD-1；(3)レジメン5＋抗PD-1；(4)レジメン6(T-NP)＋抗PD-1、に無作為化した。腫瘍体積が約100mm3に達したとき、NPを1日目に注入されるi.v.で与え、そして、抗PD-1を2日目にi.p.で与えた。同じサイクルを、合計5サイクルにわたり3、5、7、及び9日目に繰り返し、そして、マウスを21日間にわたり継続的に観察した(図18A)。予想外ではなかったが、抗PD-1単独、及びレジメン4＋抗PD-1処置は、効力がなかった(図18B)。対照的に、レジメン5＋抗PD-1処置は、腫瘍増殖を有意に抑制し、図18B、18Dに示したように、抗PD-1を伴わないレジメン5の8回の処置と比較して、より長い生存中央値をもたらした(49.5日対39日)；しかしながら、これらの処置の両方とも、腫瘍を完全に排除することはできなかった。最も意外なことには、レジメン6(T-NP)＋抗PD-1で処置したマウスは、90日間の観察期間を通じて再発のあらゆる兆候なしに、21日以内に腫瘍の段階的な縮小と最終的に完全な排除をもたらし、そして、我々の可変ナノ免疫プラットフォームT-NPの、チェックポイント遮断免疫療法との相乗効果の妥当性を確認した(図18C)。
臨床の腫瘍学における従来の化学療法又は標的化療法と異なって、免疫療法は、記憶容量に合わせた応答を潜在的に誘発できる。記憶は、永続的な腫瘍応答と再発防止を達成するために重要であり、そしてそれは、死亡率につながることが多い。免疫チェックポイント抗PD-1療法を伴ったT-NPの相乗療法(T-NPと抗PD-1 Ab)が記憶応答を誘発し得るかどうか評価するために、先の実験から回復したマウスに、90日目の反対の乳房脂肪褥上に4T1細胞を用いて再び抗原投与した(図18A～18C)；同齢の未感作マウスを陰性対照として使用した(図18D)。この実験では、マウスに、91、93及び95日目にi.p.を介して抗PD-1を3回投与した。すべての未感作マウスの腫瘍体積は、抗PD-1の注入を伴ってでさえ、30日以内に迅速に増強された(図18E)。しかしながら、腫瘍増殖がないか又は腫瘍増殖の有意な遅延のいずれかが、T-NP＋抗PD-1処置であらかじめ首尾よく処置したマウスにおいて観察され(図18F)、これらのあらかじめ処置したマウスによって発揮される優れた免疫記憶応答の存在を確認した。この実験群の生存曲線は、腫瘍増殖の結果とよく相関した(図18G)。すべてのマウスが、60日間の観察期間(90～150日目)を通じて生存状態を保っている。加えて、この実験群におけるTNF-αやIFN-γなどのサイトカインの血清レベルが、6日間にわたり4T1腫瘍細胞を用いて再び抗原投与した後の対照の同齢未感作マウス群におけるそれらに比べて、非常に高いことがわかった(図18H～18I)。これらの結果は、永続的及び頑強なT細胞記憶応答があらかじめ与えられたレジメン6(又はT-NP)＋抗PD-1によって作り出されたことを示唆する。
4T1同系同所性乳癌モデルに加えて、Lewis肺同系皮下マウス腫瘍モデルにおける類似処置試験を実施し、非常に優れた結果を収めた(図18J～18L)。T-NP及び抗PD-1を用いた療法に関して、完全な腫瘍退縮と長期生存を得た。全身毒性と体重減少は検出されなかった。
チェックポイント遮断免疫療法の臨床的成功にもかかわらず、癌患者のほんの一部だけがこの療法の恩恵を受ける。腫瘍部位へのTeff細胞ホーミングの欠陥は、おそらく、なぜ多くの患者が斯かる処置に対して難治性のままであるかの主な理由の一つである。免疫学的に「非免疫原性(cool)」腫瘍を「免疫原性(hot)」腫瘍に変換するアプローチの開発は、世界中で徹底的な調査されている。本明細書中に記載した受容体媒介性可変ナノ粒子(T-NP)は、この課題に比較的簡単な解決策を提供する。親リガンドLLP2AとR848をナノ粒子に取り込むことによって、この無毒性処置が、(1)腫瘍部位へのT細胞のホーミングを容易にし、(2)腫瘍細胞に近接したT細胞の滞留を促進し、及び(3)腫瘍微小環境におけるR848の持続放出を提供し、そして、M1表現型へのTAMの再教育をもたらし得ることを、同系4T1乳癌及びルイス肺癌モデルにおいて実証した。ナノプラットフォームがモジュールであるので、様々なリガンド、親リガンド、又は免疫調節薬をナノプラットフォームに連結によって取り込む選択肢が存在する。免疫ナノプラットフォームの独特な特徴の1つは、腫瘍微小環境で形成されるナノフィブリルネットワークが永続的であり、そしてそれが、抗PD-1抗体と併せて与えられたときでさえ、全身的な免疫毒性の兆候なしに、その顕著なインビボ抗腫瘍免疫応答と記憶効果を明らかにし得る。腫瘍部位においてT細胞を捕獲するためにLLP2Aを使用する親リガンド概念は、革新的であり、かつ、ナチュラルキラー細胞を含めた他の有益な免疫細胞を捕獲するために適用され得る。IFN遺伝子経路の刺激物質(STING)などの他の経路に対する他の強力な免疫調節薬もまた、試験してもよい。ナノプラットフォームは、高度にモジュール式であるため、複雑であるように見える。しかしながら、実際には、それは非常に頑強である。それぞれの可変ペプチドモノマーは、化学的に十分に定義されており、最終的な免疫ナノ粒子は、DMSO中での単純な混合と、それに続く、水での希釈によって集合され得る。臨床開発のためのスケールアップ製造は問題にならないはずである。
統計解析。データを、平均±標準偏位(SD)として提示する。群間の比較を、スチューデントのt検定(両側)を用いて分析した。有意水準を、*p <0.05、**p<0.01、及び***p<0.001と定義した。すべての統計的検定は両側であった。
前述の発明を、理解を明確にするために例示及び実施例によって多少詳しく説明してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲内である程度の変更及び改変を加え得ることを理解するであろう。加えて、本明細書に提供する参考文献はそれぞれ、参考文献がそれぞれ個別に参照により組み込まれた場合と同程度に、その全体が参照により援用される。本出願と、本明細書に提供される参考文献との間に矛盾がある場合には、本出願に優位性があるものとする。
配列表：
配列番号1：KLVFF
配列番号2：klvff
配列番号3：FFVLK
配列番号4：YCDGFYACYMDV

Claims (64)

  1. 式(I)の化合物：
    A-B-C (I)
    ｛式中、
    Aは、疎水性部分であり；
    Bは、ペプチドであり、ここで、該ペプチドはβ－シートを形成し；及び
    Cは、親水性標的化リガンドであり、ここで、該親水性標的化リガンドは、LLP2Aプロドラッグ、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、フォラート、LHRHペプチド、HER2リガンド、EGFRリガンド、又はトール様受容体作動薬CpGオリゴヌクレオチドであり；そして、
    ここで、上記疎水性部分がビス－ピレンである場合、Cは、LLP2Aプロドラッグ、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、フォラート、LHRHペプチド、EGFRリガンド、又はトール様受容体作動薬CpGオリゴヌクレオチドである｝。
  2. 前記疎水性部分が、色素又は薬物である、請求項1に記載の化合物。
  3. 前記疎水性部分が、化学療法薬、蛍光色素、免疫調節薬、トール様受容体作動薬、インターフェロン遺伝子の刺激物質の小分子作動薬(STING)、ポルフィリン、コレステロール、ビタミンD、又はビタミンEである、請求項1又は2に記載の化合物。
  4. 前記疎水性部分が、パクリタキセル、ビス－ピレン、シアニン色素、レシキモド、ガーディキモド、アミドベンズイミダゾール、ポルフィリン、コレステロール、ビタミンD、又はビタミンEである、請求項1～3のいずれか一項に記載の化合物。
  5. 前記疎水性部分が、レシキモド又はポルフィリンである、請求項1～4のいずれか一項に記載の化合物。
  6. 前記ポルフィリンが、ピロフェオホルビド－a、フェオホルビド、クロリンe6、プルプリン又はプルプリンイミドである、請求項3～5のいずれか一項に記載の化合物。
  7. 前記ポルフィリンが、次の構造：
    Figure 2022545636000025
     を有する、請求項3～6のいずれか一項に記載の化合物。
  8. 前記ポルフィリンが、フェオホルビド－aである、請求項3～6のいずれか一項に記載の化合物。
  9. 前記ペプチドが、長さ5～20アミノ酸のペプチド配列である、請求項1～8のいずれか一項に記載の化合物。
  10. 前記ペプチドが、長さ5～15アミノ酸のペプチド配列である、請求項1～9のいずれか一項に記載の化合物。
  11. 前記ペプチドが、β－アミロイドペプチドのβ－シートペプチドドメインからのペプチド配列を含む、請求項1～10のいずれか一項に記載の化合物。
  12. 前記β－アミロイドペプチドが、β－アミロイド40である、請求項11に記載の化合物。
  13. 前記ペプチドが、配列番号1に対して少なくとも50%の配列同一性を含む、請求項1～12のいずれか一項に記載の化合物。
  14. 前記ペプチドが、配列番号1を含む、請求項1～13のいずれか一項に記載の化合物。
  15. 前記ペプチドが、配列番号2に対して少なくとも50%の配列同一性を含む、請求項1～12のいずれか一項に記載の化合物。
  16. 前記ペプチドが、配列番号2を含む、請求項1～13のいずれか一項に記載の化合物。
  17. 前記ペプチドが、配列番号3に対して少なくとも50%の配列同一性を含む、請求項1～12のいずれか一項に記載の化合物。
  18. 前記ペプチドが、配列番号3に対して少なくとも80%の配列同一性を含む、請求項17に記載の化合物。
  19. 前記ペプチドが、配列番号3を含む、請求項17又は18に記載の化合物。
  20. 前記親水性標的化リガンドが、HER2リガンドであり、ここで、該HER2リガンドが、抗HER2 rhumAb 4D5のCDR-H3ループの一次配列由来の抗HER2抗体ペプチド模倣体である、請求項1～19のいずれか一項に記載の化合物。
  21. 前記HER2リガンドが、配列番号4に対して少なくとも50%の配列同一性を有する、請求項20に記載の化合物。
  22. 前記HER2リガンドが、配列番号4に対して少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項20又は21に記載の化合物。
  23. 前記HER2リガンドが、配列番号4である、請求項20～22のいずれか一項に記載の化合物。
  24. 前記親水性標的化リガンドが、LLP2Aプロドラッグ、LLP2A、LXY30、DUPA、フォラート、LHRHペプチド、又はEGFRリガンドである、請求項1～19のいずれか一項に記載の化合物。
  25. 前記親水性標的化リガンドが、LLP2Aプロドラッグ、LLP2A、又はLXY30である、請求項1～19、又は24のいずれか一項に記載の化合物。
  26. 前記親水性標的化リガンドが、次の構造：
    Figure 2022545636000026
     を有するLLP2Aプロドラッグである、請求項1～19、又は24～25のいずれか一項に記載の化合物。
  27. 前記親水性標的化リガンドが、次の構造：
    Figure 2022545636000027
     を有するLLP2Aである、請求項1～19、又は24～25のいずれか一項に記載の化合物。
  28. 前記親水性標的化リガンドが、次の構造：
    Figure 2022545636000028
     を有するLXY30である、請求項1～19、又は24～25のいずれか一項に記載の化合物。
  29. 次の構造：
    Figure 2022545636000029
     を有する、請求項1～7、9～14、24～25、又は28のいずれか一項に記載の化合物。
  30. 次の構造：
    Figure 2022545636000030
     を有する、請求項1～5、9～14、又は24～26のいずれか一項に記載の化合物。
  31. 前記化合物が、次の構造：
    Figure 2022545636000031
     にインサイチュで変換される、請求項30に記載の化合物。
  32. 次の構造：
    Figure 2022545636000032
     を有する、請求項1～5、9～14、24～25又は28のいずれか一項に記載の化合物。
  33. 請求項1～32のいずれか一項に記載の化合物を複数含む、内側及び外側を有するナノ担体であって、ここで、各化合物が、水性溶媒中で自己集合して、疎水性ポケットがナノ担体の内側に形成され、かつ、親水基がナノ担体の外側で自己集合するようなナノ担体を形成する、ナノ担体。
  34. 前記ナノ担体が、そのナノ担体の疎水性ポケット内に封鎖された疎水性薬物又は造影剤を更に含む、請求項33に記載のナノ担体。
  35. 複数の第一のコンジュゲート及び第二のコンジュゲートを含む、内側及び外側を有するナノ担体であって、ここで、該第一のコンジュゲートが、式(I)：
    A-B-C (I)
    を含み、かつ、第二のコンジュゲートが、式(II)：
    A’-B’-C’ (II)
    を含む、ナノ担体
    ｛式中、
    A及びA’が、それぞれ独立して、疎水性部分であり；
    B及びB’が、それぞれ独立して、ペプチドであり、ここで、各ペプチドは、独立してβ－シートを形成し；並びに
    C及びC’が、それぞれ独立して、親水性標的化リガンドであり、ここで、それぞれの親水性標的化リガンドは、独立してLLP2Aプロドラッグ、LLP2A、LXY30、LXW64、DUPA、フォラート、LHRHペプチド、HER2リガンド、EGFRリガンド、又は放射性金属キレート剤であり；そして
    ここで、A及びA’が、異なった疎水性部分であり、及び/又はC及びC’が、異なった親水性標的化リガンドである｝。
  36. 各疎水性部分が独立して、色素、薬物、又は放射性金属キレート剤である、請求項35に記載のナノ担体。
  37. 各疎水性部分が独立して、ビス－ピレン、ポルフィリン、レシキモド、又はガーディキモドである、請求項35又は36に記載のナノ担体。
  38. 各疎水性部分が独立して、ポルフィリン又はレシキモドである、請求項35～37のいずれか一項に記載のナノ担体。
  39. 前記ポルフィリンが、ピロフェオホルビド－a、フェオホルビド、クロリンe6、プルプリン又はプルプリンイミドである、請求項37又は38に記載のナノ担体。
  40. 前記ポルフィリンが、フェオホルビド－aである、請求項37～39のいずれか一項に記載のナノ担体。
  41. 前記ポルフィリンは、次の構造：
    Figure 2022545636000033
     を有する、請求項37～39のいずれか一項に記載のナノ担体。
  42. 前記レシキモドが、次の構造：
    Figure 2022545636000034
     を有する、請求項37又は38に記載のナノ担体。
  43. 各ペプチドが独立して、長さが5～20個のアミノ酸のペプチド配列である、請求項35～42のいずれか一項に記載のナノ担体。
  44. 各ペプチドが独立して、β－アミロイドペプチドのβ－シートペプチドドメインからのペプチド配列を含む、請求項35～43のいずれか一項に記載のナノ担体。
  45. 前記β－アミロイドペプチドが、β－アミロイド40である、請求項44に記載のナノ担体。
  46. 各ペプチドが独立して、配列番号1に対して少なくとも50%の配列同一性を含む、請求項35～45のいずれか一項に記載のナノ担体。
  47. 各ペプチドが独立して、配列番号1を含む、請求項35～46のいずれか一項に記載のナノ担体。
  48. 各ペプチドが独立して、配列番号2に対して少なくとも50%の配列同一性を含む、請求項35～45のいずれか一項に記載のナノ担体。
  49. 各ペプチドが独立して、配列番号2を含む、請求項35～46のいずれか一項に記載のナノ担体。
  50. 各親水性標的化リガンドが独立して、LLP2Aプロドラッグ、LLP2A、LXY30、フォラート、LHRHペプチド、HER2リガンド、EGFRリガンド、Gd(III)キレート剤、DOTAキレート剤、又はNOTAキレート剤である、請求項35～49のいずれか一項に記載のナノ担体。
  51. 各親水性標的化リガンドが独立して、LLP2Aプロドラッグ、LLP2A又はLXY30である、請求項35～50のいずれか一項に記載のナノ担体。
  52. 各親水性標的化リガンドが独立して、次の構造：
    Figure 2022545636000035
     を有するLLP2Aプロドラッグである、請求項35～51のいずれか一項に記載のナノ担体。
  53. 各親水性標的化リガンドが独立して、次の構造：
    Figure 2022545636000036
     を有するLLP2Aである、請求項35～51のいずれか一項に記載のナノ担体。
  54. 各親水性標的化リガンドが独立して、次の構造：
    Figure 2022545636000037
     を有するLXY30である、請求項35～51のいずれか一項に記載のナノ担体。
    。
  55. 前記第一のコンジュゲートが、次の構造：
    Figure 2022545636000038
     を有する、請求項35～51のいずれか一項に記載のナノ担体。
  56. 前記第二のコンジュゲートが、次の構造：
    Figure 2022545636000039
     を有する、請求項35～55のいずれか一項に記載のナノ担体。
  57. 前記第二のコンジュゲートが、次の構造：
    Figure 2022545636000040
     にインサイチュで変換される、請求項56に記載のナノ担体。
  58. 前記第一のコンジュゲート対前記第二のコンジュゲートの比が、約10：1～約1：10である、請求項35～57のいずれか一項に記載のナノ担体。
  59. 前記第一のコンジュゲート対前記第二のコンジュゲートの比が、約1：1である、請求項35～58のいずれか一項に記載のナノ担体。
  60. ナノフィブリルを形成する方法であって、請求項33～59のいずれか一項に記載のナノ担体を、腫瘍微小環境において細胞表面又は無細胞成分と接触させることを含み、ここで、該ナノ担体がインサイチュで変形を受けて、フィブリル構造を形成し、それによって、ナノフィブリルを形成する、方法。
  61. 疾患を処置する方法であって、それを必要としている対象に治療的有効量の、請求項33～59のいずれか一項に記載のナノ担体を投与することを含み、ここで、該ナノ担体が、腫瘍微小環境において細胞表面又は無細胞成分に結合した後にインサイチュでナノフィブリルを形成し、それによって、疾患を処置する、方法。
  62. 前記疾患が癌である、請求項61に記載の方法。
  63. 前記疾患が、膀胱癌、脳癌、乳癌、子宮頚癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、神経膠芽腫、腸癌、頭頚部癌、白血病、肝臓癌、肺癌、黒色腫、骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌及び子宮癌から成る群から選択される、請求項61に記載の方法。
  64. 画像化する方法であって、画像化する対象に有効量の、請求項33～59のいずれか一項に記載のナノ担体を投与することを含む、方法。
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