CN111818944A - 具有光动力活性的有机二氧化硅纳米粒子及其医学用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种有机二氧化硅纳米粒子，其包含：(a)共价并入其中的用于光动力疗法的光敏剂；和(b)任选地，至少一种包封在其中的药剂，以及包含所述有机二氧化硅纳米粒子的药物组合物。本文还提供所述有机二氧化硅纳米粒子或药物组合物，其用作药物或用于治疗疾病、病症或病况。更具体地，提供一种使用所述辅助有机二氧化硅纳米粒子或药物组合物治疗受试者的疾病、病症或病况的方法。

Description

具有光动力活性的有机二氧化硅纳米粒子及其医学用途
相关申请的交叉引用
本申请参考并要求2017年12月08日提交的新加坡专利申请第10201710241V号的优先权，其内容出于所有目的以引用的方式并入本文中，包括根据PCT规则4.18，并入未包含在本文中并在PCT规则20.5(a)中提及的说明书、权利要求或附图的任何要素或部分。
技术领域
本发明大体上涉及包含光敏剂并包封至少一种药剂的光动力活性有机二氧化硅纳米粒子，包含所述有机二氧化硅纳米粒子的药物组合物，以及使用所述有机二氧化硅纳米粒子或药物组合物的医学应用。
背景技术
光动力疗法(PDT)已被广泛用于治疗恶性肿瘤。PDT涉及光敏剂的利用，所述光敏剂在光照射后会产生单态氧物种，以消除照射部位附近的恶性细胞，同时避免全身毒性。PDT的优点包括无创性、高选择性和对远离照射部位的细胞的最小化的副作用或损害。为了在PDT中获得较高的治疗功效，将高效的光敏剂递送到疾病部位至关重要。在临床实践中，光敏剂已通过静脉内注射全身施用。然而，这种药物施用方法将导致光敏剂的全身分布，同时需要高得多的施用量。光敏剂也将需要修饰以便在血液中循环更长的时间。
经皮药物递送是一种有吸引力的药物施用方式，因为其具有无创性/微创性、高患者依从性以及绕过胃肠道或肝脏代谢的直接进入途径。它对于皮肤相关的恶性肿瘤(即皮肤癌)特别有吸引力。因此，通过PDT局部递送用于治疗浅表基底细胞癌和光化性角化病的光敏剂是理想的。
最近的一些研究报道了使用纳米粒子(例如金纳米粒子和胶束)来配制光敏剂，以提高PDT效率，通过全身递送增加循环时间并共同递送两种或更多种药物。例如，据报道脂质体包封了5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic)或替莫泊芬(temoporfin)用于皮肤癌的局部治疗。不幸的是，仍然存在如纳米粒子的低生物相容性和稳定性、低载药能力和缺乏有效的药物-光敏剂组合的局限性。更重要的是，所有这些制剂均缺乏透皮渗透能力，因为亲水性系统和大分子(>500Da)无法通过角质层的致密脂质富集基质扩散。
因此，在本领域中仍然需要克服现有技术的缺点的改进技术。
发明内容
通过提供新颖的有机二氧化硅纳米粒子和药物组合物以及使用它们的方法，本发明满足了本领域中的前述需求。
在第一方面，本发明提供了一种有机二氧化硅纳米粒子，其包含：
(a)与其共价连接的用于光动力疗法的光敏剂；和
(b)任选地，至少一种包封在其中的药剂。
在各种实施例中，有机二氧化硅纳米粒子是中孔有机二氧化硅纳米粒子，并且光敏剂被并入纳米粒子的框架内。
在各种实施例中，有机二氧化硅纳米粒子的直径小于50nm。
在各种实施例中，有机二氧化硅纳米粒子是通过使光敏剂与烷氧基硅烷，优选二烷氧基硅烷、三烷氧基硅烷或四烷氧基硅烷，更优选四甲氧基硅烷(TMOS)或四乙氧基硅烷(TEOS)缩合形成。
在各种实施例中，用式-Si(OR6)x(R7)3-x的含硅基团修饰光敏剂，其中R6和R7独立地选自C1-C4烷基和C2-C4烯基，优选甲基或乙基，并且x为0、1、2或3，优选2或3。
在各种实施例中，光敏剂是酞菁与式A-(CH2)y-Si(OR6)x(R7)3-x的烷氧基硅烷的反应产物，其中A是对酞菁具有反应性的基团，优选地选自-NCO、-COOH、-OH和环氧基，x为0、1、2或3，优选2或3，并且y为1、2或3，优选3。
在各种实施例中，光敏剂是式(I)或(I')的酞菁化合物，
Figure BDA0002529562360000021
其中：
M是选自由Zn、Al、Cu、Fe、Mn、Mo、Ni和V组成的群组的金属，优选Zn；
R1、R2、R3和R4各自独立地为C1-C6烷基；
m、n、p和q各自独立地为0、1、2或3；和
Figure BDA0002529562360000031
代表式-NH-B-的基团，其中B是共价整合到纳米粒子框架中的含硅连接基团。
在各种实施例中，有机二氧化硅纳米粒子可使用(a)式(II)或(II')的有机二氧化硅前体；和(b)选自由TMOS、TEOS及其组合组成的群组的无机二氧化硅源，通过硅烷共缩合和水解获得，
Figure BDA0002529562360000032
其中：
M是选自由Zn、Al、Cu、Fe、Mn、Mo、Ni和V组成的群组的金属，优选Zn；
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地为C1-C6烷基；和
m、n、p和q各自独立地为0、1、2或3。
在各种实施例中，m、n、p和q为0。
在各种实施例中，R5为CH2CH3。
在各种实施例中，R5为CH2CH3，并且m、n、p和q为0。
在各种实施例中，无机二氧化硅源是TMOS。
在各种实施例中，用于合成纳米粒子的式(II)或(II')的有机二氧化硅前体与无机二氧化硅源的摩尔比为1:100至1:1000，优选为1:200至1:500，更优选为1:250至1:300，最优选为1:270。
在各种实施例中，所述至少一种药剂是用于治疗或预防疾病、病症或病况的化合物。
在各种实施例中，所述疾病、病症或病况选自由以下组成的群组：原发性黑素瘤、转移性黑素瘤、基底细胞癌、鲍文氏病(Bowen's disease)、光化性角化病、异常瘢痕形成(瘢痕瘤和增生性瘢痕)、特应性皮炎、疣、癌前非黑素瘤皮肤病变和胆管癌。
在各种实施例中，所述至少一种药剂选自由以下组成的群组：抗生素、类固醇、化学治疗药物、免疫调节剂、消炎剂、用于治疗癌症的药物(如BRAF抑制剂)、治疗性肽或蛋白质或单克隆抗体(如抗CTLA4或抗PD-1抗体)、siRNA和质粒，或其组合。
在各种实施例中，所述至少一种药剂选自由以下组成的群组：达拉非尼(dabrafenib)、曲美替尼(trametinib)、喜树碱(camptothecin)、阿霉素(doxorubicin)及其组合。
在各种实施例中，所述疾病、病症或病况是黑素瘤，并且所述至少一种药剂是达拉非尼和/或曲美替尼。
在第二方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本文公开的有机二氧化硅纳米粒子和药学上可接受的载体。
在各种实施例中，药物组合物是局部制剂。
在第三方面，本发明提供了本文公开的有机二氧化硅纳米粒子或药物组合物，其用作药物。
在第四方面，本发明提供了本文公开的有机二氧化硅纳米粒子或药物组合物，其用于治疗疾病、病症或病况，优选癌症，更优选皮肤癌，最优选黑素瘤。
在第五方面，本发明提供了一种用于治疗受试者的疾病、病症或病况的方法，其包含以下步骤：
(a)向受试者施用，优选地局部施用，治疗有效量的本文公开的有机二氧化硅纳米粒子或药物组合物；和
(b)将受试者暴露于光照射下，从而至少部分地通过光动力疗法治疗所述疾病、病症或病况。
在各种实施例中，通过近红外光，优选地通过730nm激光进行光照射。
在各种实施例中，所述疾病、病症或病况选自由以下组成的群组：原发性黑素瘤、转移性黑素瘤、基底细胞癌、鲍文氏病、光化性角化病、异常瘢痕形成(瘢痕瘤和增生性瘢痕)、特应性皮炎、疣、癌前非黑素瘤皮肤病变和胆管癌。
在各种实施例中，所述疾病、病症或病况是皮肤癌，优选黑素瘤，并且所述有机二氧化硅纳米粒子或药物组合物是局部施用的。
在各种实施例中，所述方法包含使用微针贴片增强有机二氧化硅纳米粒子的皮肤渗透。
在各种实施例中，所述受试者是人类或哺乳动物。
附图说明
当结合非限制性实例和附图考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明。
图1.a)PcNP@Drug的合成及其渗透到患病皮肤中的方案。b)PcNP@Drug作用的细胞机制。
图2.PcNP的表征。a)PcNP的TEM图像，比例尺＝50nm。插图：单个PcNP的放大图像，比例尺＝20nm。b)Pc-Si和PcNP的吸光度曲线。c)纯化的PcNP和最终PcNP@Drug的DLS测量。d)PcNP的XPS光谱，指示PcNP的O、N、C和Si峰。e)PcNP的氮结合能的高分辨率扫描。f)在pH7.4和5，来自PcNP@Drug的达拉非尼和曲美替尼的累积药物释放动力学，*p<0.05。
图3.PcNP的表征。a)PcNP和b)Pc-Si在激光照射下的吸光度曲线，反映了PcNP的光稳定性。a)的插图：PcNP在600-900nm之间的吸光度曲线。c)针对照射时间绘制的PcNP和Pc-Si在722nm处的吸光度百分比。d)从P/Po＝0.05至0.2测量的PcNP和PcNP@Drug的N2吸附和解吸模式。e)通过DFT分析测量的PcNP和PcNP@Drug的孔径分布。f)在730nm，1W/cm2激光照射下，PcNP在2、0.5、0.1和0mg/mL浓度下的光热行为。
图4.PcNP和PcNP@Drug的体外实验。a)在培育0.5h、2h和4h后，A375细胞中PcNP的时间依赖性细胞内化。蓝色通道：Hoechst 33342滤光片，指示核位置。红色通道：纳米载体位置。λex：488和561nm，λem：565-700nm。比例尺＝20μm。b)SKMEL-28细胞系对PcNP+hv(PDT)、PcNP@Drug-hv(靶向疗法)和PcNP@Drug+hv(联合治疗)的活/死细胞成像。将细胞用PcNP或PcNP@Drug培育4小时。照射：730nm，0.5W/cm2激光，持续15分钟。λex：640nm，λem：650-700nm。比例尺＝200μm。c)A375、d)SKMEL-28、e)HDF和f)B16F10细胞系的相应细胞活力。培育时间：16小时，照射8分钟/孔。
图5.细胞死亡的机制。a)在不存在(PcNP-hv)和存在(PcNP+hv)NIR光下，SKMEL-28细胞系对PcNP的体外细胞氧化应激成像。Hoechst 33342通道指示核位置，而羧基-H2DCFDA通道指示存在氧化应激。比例尺＝200μm。b)在各种纳米载体治疗下检测A375细胞中的半胱天冬酶3活性。*p<0.005。
图6.PcNP对3D肿瘤球状体的功效。a)代表性肿瘤球状体随时间接受不同治疗的显微图像。比例尺＝500μm。b)相对肿瘤大小图。误差条代表平均值的标准误差，*p<0.05，n＝5。c)使用酸性磷酸酶测定法进行的肿瘤球状体的活力。PcNP+hv(接受PDT治疗的组)，PcNP@Drug-hv(接受靶向疗法治疗的组)和PcNP@Drug+hv(接受联合PDT和靶向疗法治疗的组)。误差条代表标准偏差，*p<0.05，**p<0.001，n＝5。
图7.PcNP在猪皮上的局部渗透。a)在有和没有微针(MN)辅助下，渗透的PcNP(20mg/mL)相对于游离Pc在新鲜猪皮上持续10分钟和1小时的荧光。在IVIS机器上记录发光。λex：620nm，λem：640-700nm。b)将猪皮上的发光强度制成图表。**p<0.01。c)用PcNP(20mg/mL)渗透的猪皮的横截面图像，(i)在没有MN的情况下10分钟，ii)在有MN的情况下10分钟，iii)在没有MN的情况下1小时和iv)在有MN的情况下1小时。比例尺＝200μm。从猪的肋部获得皮肤，在成像之前将其切片并固定。d)在有和没有MN的情况下，用PcNP(20mg/mL)渗透10分钟和1小时的皮肤切片的荧光强度。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，n＝4。
图8.PcNP的体内抗肿瘤功效。a)对照、PcNP+hv(接受PDT治疗的组)、PcNP@Drug-hv(接受靶向疗法治疗的组)和PcNP@Drug+hv(接受联合治疗的组)的相对肿瘤大小生长图。使用数字卡尺与小鼠皮肤一起测量肿瘤大小。绿色箭头：纳米载体治疗，红色箭头：激光治疗。*p<0.05，n＝5。b)在整个治疗期间小鼠的体重。c)在第16天切除的肿瘤的照片显示每组的相对大小。d)从不同组的小鼠切除的肿瘤的重量。取出肿瘤，然后进行测量。*p<0.05，**p<0.01。e)肿瘤横截面的H&E染色图像表明细胞核密度。
图9.Pc-4NH2与异氰酸3-(三乙氧基硅烷基)丙酯形成Pc-Si的反应流程。
图10.TMOS与Pc的比率的优化。a)纳米粒子中装载的Pc的实际量(右轴，点线)与通过元素分析所确定的理论量(实线)相对应。b)使用ABDA测试的单态氧生产效率。
图11.单态氧量子产率计算。当a)亚甲基蓝和d)PcNP与相似光密度的DPBF混合时，DPBF的淬灭。照射条件是730nm，1W/cm2激光。b)亚甲基蓝和e)PcNP在423nm处DPBF吸光度的一阶指数拟合。c)PcNP和亚甲蓝的吸光度曲线。f)PcNP的激发依赖性发光，在638nm激发下显示峰值荧光。g)PcNP@Drug的TEM图像。比例尺＝50nm。
图12.a)PcNP和b)PcNP@Drug的ζ电位。
图13.a)达拉非尼、b)曲美替尼和c)达拉非尼+曲美替尼组合装入PcNP的载药能力(DLC)和包封效率(EE)。
图14.历时48小时对a)A375、b)B16-F10、c)SKMEL-28、d)HDF和e)HEK细胞系测试的各种浓度的PcNP的细胞毒性。
图15.体外剂量优化结果。对a)SKMEL-28、b)B16-F10、c)A375、d)HDF和e)HEK细胞系测试的达拉非尼与曲美替尼的各种比率(1:0、150:1、50:1、1:1)。
图16.A375细胞中PcNP@Drug的时间依赖性内化。比例尺＝20μm。
图17.a)使用MTT对2D A375细胞和b)使用酸性磷酸酶测定法对3D A375球状体进行游离药物+游离Pc溶液的细胞活力研究。
图18.氧化应激细胞数量与存在细胞数量的定量测量。
图19.治疗期间不同实验组中小鼠的照片。
图20.在没有MN的情况下用游离Pc+游离药物混合物治疗的小鼠和作为对照的未治疗的小鼠的相对肿瘤生长曲线。
图21.PcNP+hν、PcNP@Drug-hν和PcNP@Drug+hν治疗组的肿瘤生长抑制(TGI)值。
图22.在用PBS(对照)、PcNP+hν、PcNP@Drug-hν或PcNP@Drug+hν治疗小鼠后，肿瘤组织的免疫组织化学表征(TUNEL染色)。a)代表性TUNEL染色影像，比例尺＝100μm。b)肿瘤组织中TUNEL阳性细胞的定量结果(n＝5)。**,p<0.01；***,p<0.001。
具体实施方式
下面的详细描述通过说明的方式指可以实践本发明的具体细节和实施例。对这些实施例进行了足够详细的描述，以使本领域技术人员能够实施本发明。在不脱离本发明的范围的情况下，可以利用其它实施例，并且可以进行结构和逻辑上的改变。各个实施例不必互相排斥，因为一些实施例可以与一个或多个其它实施例组合以形成新的实施例。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解相同的含义。除非上下文另外明确指示，否则单数术语“一(a/an)”和“所述”包括复数指示物。类似地，除非上下文另有明确指示，否则词语“或”旨在包括“和”。术语“包含”意指“包括”。在有矛盾的情况下，将以本说明书(包括术语的解释)为准。
本发明人惊奇地发现，包含与其共价连接的光敏剂如酞菁的有机二氧化硅纳米粒子适用于疾病、病症或病况如黑素瘤的光动力疗法，并且包封在有机二氧化硅纳米粒子中的药剂可以与光动力疗法协同作用。因此，这类有机二氧化硅纳米粒子可以用作新型药物。
在第一方面，本发明提供了一种有机二氧化硅纳米粒子，其包含：
(a)与其共价连接的用于光动力和/或光热疗法的光敏剂；和
(b)任选地，至少一种包封在其中的药剂。
如本文所用，术语“纳米粒子”是指尺寸为10至250nm的任何粒子。如本文所述的纳米粒子的直径可以在10nm至250nm；10nm至200nm；10nm至160nm；10nm至140nm；10nm至120nm；10nm至100nm；10nm至80nm；10nm至60nm；10nm至50nm；20nm至250nm；30nm至250nm；40nm至250nm；80nm至250nm；100nm至250nm；或150nm至250nm的尺寸范围内。在优选实施例中，纳米粒子的直径小于50nm。纳米粒子可以具有多种形状和横截面几何形状。
如本文所用，术语“有机二氧化硅”是指包含与两个或更多个Si原子键合的一个或多个有机基团的有机硅氧烷化合物。在本文中关于纳米粒子使用的是指包含有机硅氧烷化合物的粒子。
如本文所用，术语“光敏剂”是指在用波长至少部分对应于所述“光敏剂”的吸收带的光照射时，通过与另一分子的能量转移而相互作用产生自由基和/或单态氧和/或ROS的分子。例如，在其激发态下，光敏剂可能会发生系间窜越，并将能量转移到通过光动力疗法进行治疗的组织中的氧，从而产生ROS，如单态氧。光敏分子在本领域中是众所周知的，并且包括铅化合物，包括但不限于氯、叶绿素、香豆素、花青素、富勒烯、金属酞菁、金属卟啉、甲基卟啉、萘二甲酰亚胺、萘酞菁、尼罗蓝、苝醌、苯酚、脱镁叶绿酸、脱镁叶绿素、酞菁、卟啉烯、卟啉、补骨脂素、红紫素、奎宁、视黄醇、若丹明、噻吩、维汀、呫吨及其二聚体和低聚物。术语“光敏剂”还包括光敏剂衍生物；例如，光敏剂中的位置可以被烷基、官能团、肽、蛋白质或核酸或其组合官能化。
术语“光动力疗法”是指将特定波长的光引导至已经通过施用光敏剂而变得感光的正在接受治疗的组织或细胞的过程。该术语应广义地解释为涵盖“光热疗法”，即通过在光敏剂暴露于光时产生热量的治疗。
在本申请中，光敏剂共价连接到有机二氧化硅纳米粒子。术语“共价连接”可与“共价键合”互换使用，并且是指化学键的形成，其特征在于原子之间电子对的共享。由于光动力疗法不需要释放光敏剂，因此在二氧化硅基质中光敏剂的共价键可以使光敏剂充分装载，并防止其聚集诱导的淬灭，从而提高了系统中光敏剂的量子产率。
如本文所用，术语“药剂”是指化合物、生物大分子(如核酸、抗体、抗体片段、蛋白质或肽)或其组合。这类药剂的活性可以使它们适合作为治疗剂，所述治疗剂是在受试者局部或全身起作用的生物学、生理学或药理学活性物质。本文公开的有机二氧化硅纳米粒子可以包含一种或多种这类药剂。
在优选实施例中，本发明的有机二氧化硅纳米粒子是中孔有机二氧化硅纳米粒子，并且光敏剂被并入纳米粒子的框架内，即光敏剂共价连接到中孔有机二氧化硅纳米粒子的无机框架并形成其整体部分。
术语“中孔有机二氧化硅纳米粒子”在本领域中也称为周期性中孔有机二氧化硅(PMO)，这是一类有机-无机聚合物，其特征在于具有大表面积的高度有序的孔。这些材料还显示出低细胞毒性，可调节的孔径，并且可生物降解。孔的直径可以在0.05nm至10nm之间，优选在1nm至8nm之间，更优选在2.5nm至5nm之间。
在各种实施例中，有机二氧化硅纳米粒子是通过使光敏剂与烷氧基硅烷，优选二烷氧基硅烷、三烷氧基硅烷或四烷氧基硅烷，更优选TMOS或TEOS缩合形成。
在各种实施例中，用式-Si(OR6)x(R7)3-x的含硅基团修饰光敏剂，其中R6和R7独立地选自C1-C4烷基和C2-C4烯基，优选甲基或乙基，并且x为0、1、2或3，优选2或3。
在各种实施例中，光敏剂是酞菁与式A-(CH2)y-Si(OR6)x(R7)3-x的烷氧基硅烷的反应产物，其中A是对酞菁具有反应性的基团，优选地选自-NCO、-COOH、-OH和环氧基，x为0、1、2或3，优选2或3，并且y为1、2或3，优选3。
如本文所用，术语“酞菁”是指属于大环酞菁的一般类别的任何化合物，并且包括萘酞菁、喹啉酞菁等，以及其被取代的衍生物。这类酞菁包括无金属的酞菁，并且进一步包括含有如锌、铝、铜、铁、锰、钼、镍和钒的金属的酞菁。
在优选实施例中，光敏剂是式(I)或(I')的酞菁化合物，
Figure BDA0002529562360000091
其中：
M是选自由Zn、Al、Cu、Fe、Mn、Mo、Ni和V和Ni组成的群组的金属，优选Zn；
R1、R2、R3和R4各自独立地为C1-C6烷基；
m、n、p和q各自独立地为0、1、2或3；和
Figure BDA0002529562360000092
代表式-NH-B-的基团，其中B是共价整合到纳米粒子框架中的含硅连接基团。
B可以是在光敏剂和纳米粒子的框架之间形成键的任何含硅官能团或部分。
本文公开的有机二氧化硅纳米粒子可以使用本领域已知的任何方法来制备。
在优选实施例中，有机二氧化硅纳米粒子可使用(a)式(II)或(II')的有机二氧化硅前体；和(b)选自由TMOS、TEOS及其组合组成的群组的无机二氧化硅源，通过硅烷共缩合和水解获得。
如本文所用，术语“共缩合和水解”是指烷氧基硅烷的标准溶胶-凝胶法。通过形成硅氧烷键建立网络的最常用的可缩合无机前体是TMOS/TEOS。也可以使用其它二氧化硅源，如水玻璃、无定形二氧化硅和水硅钠石，但所得材料对于治疗应用可能不是最佳的。参见例如Hoffmann和
Figure BDA0002529562360000101
《化学学会评论(Chem.Soc.Rev.)》,2011,40,608-620，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。
Figure BDA0002529562360000102
其中：
M是选自由Zn、Al、Cu、Fe、Mn、Mo、Ni和V组成的群组的金属，优选Zn；
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地为C1-C6烷基；和
m、n、p和q各自独立地为0、1、2或3。
在各种实施例中，m、n、p和q为0。在各种实施例中，R5为CH2CH3。在优选实施例中，R5为CH2CH3，并且m、n、p和q为0。
在各种实施例中，无机二氧化硅源是TMOS。在优选实施例中，R5为CH2CH3，m、n、p和q为0，并且无机二氧化硅源是TMOS。
在各种实施例中，用于合成纳米粒子的式(II)或(II')的有机二氧化硅前体(例如当R5为CH2CH3，并且m、n、p和q为0时)与无机二氧化硅源(例如TMOS)的摩尔比为1:100至1:1000，优选为1:200至1:500，更优选为1:250至1:300，最优选为1:270。
在各种实施例中，至少一种药剂是用于治疗或预防疾病、病症或病况的化合物。
如本文所用，术语“治疗”是指部分或完全缓解、减缓、改善、减轻特定疾病、病症或病况，延缓其发作，抑制其进展，降低其严重程度和/或其一种或多种症状或特征的发病率。所述药剂还可以施用于未表现出疾病、病症或病况的病征的受试者以预防所述疾病、病症或病况，和/或施用于仅表现出疾病、病症或病况的早期病征的受试者以降低与所述疾病、病症或病况相关的发展病理的风险。
在各种实施例中，所述疾病、病症或病况选自由以下组成的群组：原发性黑素瘤、转移性黑素瘤、基底细胞癌、鲍文氏病、光化性角化病、异常瘢痕形成(瘢痕瘤和增生性瘢痕)、特应性皮炎、疣、癌前非黑素瘤皮肤病变和胆管癌。
在各种实施例中，至少一种药剂选自由以下组成的群组：抗生素、类固醇、化学治疗药物、免疫调节剂、消炎剂、用于治疗癌症的药物(如BRAF抑制剂)、治疗性肽或蛋白质或单克隆抗体(如抗CTLA4或抗PD-1抗体)、siRNA和质粒，或其组合。
在各种实施例中，至少一种药剂选自由以下组成的群组：达拉非尼、曲美替尼、喜树碱、阿霉素及其组合。
在各种实施例中，所述疾病、病症或病况是黑素瘤，并且所述至少一种药剂是达拉非尼和/或曲美替尼。
在第二方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本文公开的有机二氧化硅纳米粒子和药学上可接受的载体。
术语“药物组合物”是指在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的相应组合物。
本文公开的药物组合物包含药学上可接受的载体，如本文所用，其包括但不限于任何和所有溶剂、缓冲剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒剂、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，适合所需的特定剂型。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备所述组合物的技术是本领域已知的(参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；以引入的方式并入本文中)。可以考虑在本发明的范围内使用常规的赋形剂介质，除非任何常规的赋形剂介质可能与物质或其衍生物不相容，例如通过产生任何不希望的生物学作用或以有害的方式与药物组合物的任何其它组分相互作用。
示例性防腐剂可以包括但不限于抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、酒精防腐剂、酸性防腐剂和/或其它防腐剂。示例性抗氧化剂包括但不限于α-生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、单硫代甘油、焦亚硫酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和/或亚硫酸钠。示例性螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸一水合物、依地酸二钠、依地酸二钾、依地酸、富马酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和/或依地酸三钠。示例性抗微生物防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、溴硝醇、西曲溴铵、氯化十六烷基吡啶、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶、咪唑烷脲、苯酚、苯氧基乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和/或硫柳汞。示例性抗真菌防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和/或山梨酸。示例性醇防腐剂包括但不限于乙醇、聚乙二醇、苯酚、酚类化合物、双酚、氯丁醇、羟基苯甲酸酯和/或苯乙醇。示例性酸性防腐剂包括但不限于维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、脱氢乙酸、抗坏血酸、山梨酸和/或植酸。也可以使用本领域已知的其它防腐剂。
示例性缓冲剂包括但不限于柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡糖酸钙、d-葡萄糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊酸、磷酸氢二钙、磷酸、磷酸三钙、磷酸氢氧化钙、乙酸钾、氯化钾、葡糖糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、缓血酸胺、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原质水、等渗生理盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、乙醇等，和/或其组合。
本文描述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。
在各种实施例中，药物组合物是局部制剂。
术语“局部制剂”是指可以放置以直接施用于皮肤表面并从其释放有效量的生物活性组分的组合物。这类制剂可以包括液体、霜剂、软膏剂、凝胶剂、洗剂或适合于局部施用等的任何其它剂型。在一些实施例中，这类制剂可以具有/不具有附加的背衬、结构或装置的不阻塞的形式施用于皮肤。
在第三方面，本发明提供了本文公开的有机二氧化硅纳米粒子或药物组合物，其用作药物。
在第四方面，本发明提供了本文公开的有机二氧化硅纳米粒子或药物组合物，其用于治疗疾病、病症或病况，优选癌症，更优选皮肤癌，最优选黑素瘤。
在第五方面，本发明提供了一种用于治疗受试者的疾病、病症或病况的方法，其包含以下步骤：
(a)向受试者施用，优选地局部施用治疗有效量的本文公开的有机二氧化硅纳米粒子或药物组合物；和
(b)将受试者暴露于光照射下，从而至少部分地通过光动力疗法治疗所述疾病、病症或病况。
在各种实施例中，通过近红外光，优选地通过730nm激光进行光照射。
在各种实施例中，所述疾病、病症或病况选自由以下组成的群组：原发性黑素瘤、转移性黑素瘤、基底细胞癌、鲍文氏病、光化性角化病、异常瘢痕形成(瘢痕瘤和增生性瘢痕)、特应性皮炎、疣、癌前非黑素瘤皮肤病变和胆管癌。
在各种实施例中，所述疾病、病症或病况是皮肤癌，优选黑素瘤，并且所述有机二氧化硅纳米粒子或药物组合物是局部施用的。
在各种实施例中，所述方法包含使用微针贴片增强有机二氧化硅纳米粒子的皮肤渗透。微针贴片可用于刺穿角质层并产生瞬态微通道，以增强有机二氧化硅纳米粒子的透皮运输。替代地或另外，还可以使用本领域已知的任何其它方式来促进有机二氧化硅纳米粒子的透皮递送。这些包括化学、物理和生物增强剂。化学增强剂是化学化合物或配制方法，可通过干扰角质层、增加分配系数或增加溶解度来提供帮助。物理方法利用设备或装置来物理生成药物渗透的途径。它们包括电穿孔、空化超声和微针等。生物学方法包括使用酶、合成脂质抑制剂和其它改变角质层代谢平衡和活性的生物制剂。
在各种实施例中，受试者是人类或哺乳动物。
通过以下实例进一步说明本发明。然而，应当理解，本发明不限于示例性实施例。
实例
材料和方法
化学物质
从J&K Scientific获得四甲氧基硅烷(TMOS)，并且从Gelest,Inc获得2-甲氧基(聚乙烯氧基)-丙基)三甲氧基硅烷tech-90。从ActiveBioChem购得达拉非尼甲磺酸盐(GSK-2118436B)和曲美替尼(GSK-1120212，JTP-74057)。所有其它化学物质均从Sigma-Aldrich获得。在整个实验过程中均使用去离子水。
表征
透射电子显微镜(TEM)图像是在TEM JEOL 1400上以100kV获得的。在MalvernZetasizer Z模型上测量动态光散射(DLS)。Brunauer-Emmett-Teller(BET)表面积是通过Quantachrome Instruments Autosorb-iQ(Boynton Beach,Florida USA)测量的N2吸附/解吸等温线获得的。在Shimadzu UV-Vis-NIR 3600上进行UV-Vis光谱分析。在Shimadzu RF5301PC光谱仪上测量荧光光谱。用Fortessa X20(3激光)流式细胞仪测量流式细胞术。使用Tecan Infinite M200酶标仪进行3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)测定。使用单色Mg X射线辐射源在Phoibos 100SPECS上测定X射线光电子能谱(XPS)。使用EuroEA CHNS-O分析仪EuroVector测定元素分析。共焦激光扫描显微镜(CLSM)使用Carl Zeiss LSM800成像。在FLIR红外照相机温度计上进行温度测量。在IVIS SpectrumCT临床前体内成像系统上进行猪皮渗透实验。在Life Technologies EVOS显微镜上进行组织学成像。
Pc-Si的合成
简单来说，称重Pc-4NH2(9.0mg)并转移到三颈烧瓶中。添加无水DMF(5mL)以溶解Pc-4NH2。将异氰酸3-(三乙氧基硅烷基)丙酯(13.8μL)溶解于无水DMF(0.1mL)中，然后注入烧瓶中。将反应在氮气保护下于120℃回流过夜。所得的Pc-Si溶液直接用于PcNP的合成(参见图9)。
PcNP的合成
将CTAB(1.0g)溶解于H2O(120mL)中。添加三乙醇胺(420μL，1:1w/w于水中)，将得到的溶液在80℃下剧烈搅拌30分钟，形成胶束。将TMOS(160μL)和Pc-Si(800μL)均匀混合，然后在剧烈搅拌下逐滴添加到CTAB溶液中。使反应进行2小时。随后，将温度降低至50℃，并逐滴添加2-甲氧基(聚乙烯氧基)-丙基)三甲氧基硅烷溶液(400μL，1g/mL于乙醇中)。将反应搅拌过夜以完成反应。将反应混合物相对于10％v/v乙酸/无水乙醇溶液透析3天，以去除未反应的硅烷前体和CTAB，然后相对于DMSO透析2天，以去除未反应的Pc-Si(MWCO 12,000)。最后，将其相对于水透析并冷冻干燥。
PcNP@Drug的合成
将含达拉非尼(2mg/mL)和曲美替尼(2mg/mL)的DMSO储备溶液添加到含PcNP(1mg)的DMSO中，获得最终比率为1mg/mL的载药溶液。在连续搅拌下进行药物装载24小时，然后用乙醇和水反复洗涤纳米粒子以去除过量的药物和DMSO。通过在9000rpm下离心45分钟收集产物PcNP@Drug。
硅烷前体比的优化
通过合成一系列Pc-Si:TMOS摩尔比分别为1:100、270、500和1000的纳米粒子(A、B、C和D)来确定Pc-Si与TMOS的最佳比率，其中确保所有样品的总硅烷浓度相同。然后针对9,10-蒽二基-双(亚甲基)亚乙基四甲酸(ABDA)测试了单态氧的产生效率。将A、B、C和D的水溶液分别与ABDA溶液混合，所有溶液在730nm处的吸光度读数相似。相应地调整基线以抵消纳米粒子的吸光度读数。用1W/cm2 730nm激光照射溶液，并在不同的时间间隔测量吸光度值。由提供最佳ABDA淬灭确定的Pc-Si与TMOS的最佳比率用于随后的PcNP合成。
TEM图像
将PcNP或PcNP@Drug分散于水中，将10μL滴在碳涂布的铜栅格上，在空气中干燥24小时，然后使用TEM成像。
N2吸附/解吸和孔径分析
在分析之前，将PcNP和PcNP@Drug在180℃的真空中脱气6小时。通过取P/P0＝0.05-0.2范围获得数据。使用DFT方法获得PcNP的孔径分布。
载药量的测定
根据达拉非尼和曲美替尼的1:1v/v混合物的校准曲线计算DLC和EE。
Figure BDA0002529562360000151
Figure BDA0002529562360000152
其中药物0表示装载溶液中药物的初始质量，药物上清液表示装载后上清液中药物的质量。
光热测量
在水中制备不同浓度(0、0.1、0.5、1mg/mL)的PcNP溶液。将730nm 1W/cm2激光照在溶液上10分钟，并每30秒用红外枪记录一次温度升高。
光稳定性测量
制备PcNP溶液和Pc-Si溶液，使其在730nm处的光密度相似。两种溶液都经过730nm，1W/cm2激光照射50分钟，每隔几分钟记录一次相应的吸收光谱。然后相对于时间标绘722nm处的光密度。
细胞培养
使用人BRAFV600E黑素瘤细胞(A375和SKMEL-28)、BRAF野生型黑素瘤(B16F10)、正常人表皮角质形成细胞(HEK)和正常人皮肤成纤维细胞(HDF)。A375、HDF和B16F10在达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)中培养，而SKMEL-28在罗斯威尔帕克纪念研究所培养基(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)1640中培养。DMEM和RPMI 1640补充有10％胎牛血清(FBS)、青霉素(100U mL-1)和链霉素(100μg mL-1)。在补充有EpiGRO人角质形成细胞补充剂试剂盒的EpiGRO人角质形成细胞完全培养基中培养HEK。培养物在37℃的5％CO2气氛下生长。
细胞摄取研究
将A375细胞接种在共聚焦培养皿中。当细胞达到70％汇合时，将PcNP以不同的时间间隔以20μg/mL的浓度添加到细胞中。在为纳米载体内化分配的持续时间之后，去除培养基，并用PBS洗涤细胞三次，固定并通过CLSM分析。
剂量优化
将细胞接种在96孔板中并培育过夜。制备达拉非尼与曲美替尼的比率和浓度不同的溶液，达到10μL。同样，将10μL每种药物溶液添加到90μL新鲜培养基中。培育24小时后，通过MTT测定法测试细胞活力。
累积药物释放
将PcNP@Drug(2mg)分别分散于pH 7.4和5的PBS(2mL)中。将纳米载体连续搅拌48小时。在一定的时间间隔，将一部分溶液等分，并以14800rpm离心以获得上清液，将其上清液放入96孔板中。将具有相同体积的新鲜PBS放回释放溶液中。使用酶标仪分析不同时间上清液的吸光度，并根据达拉非尼和曲美替尼混合物的校准曲线计算药物释放动力学。
细胞毒性研究
将细胞以每孔105个细胞的密度接种在96孔板中，并培育过夜。当细胞达到约70％汇合时，去除培养基并添加新鲜的培养基(90μL)。制备各种浓度的PcNP的PBS溶液达到10μL，并添加到孔中。在90μL培养基和10μL PBS中生长的细胞用作对照。在黑暗中培育48小时后，去除培养基，并将MTT(10μL，5mg/mL)与90μL新鲜培养基的溶液添加到每个孔中。4小时后，将培养基替换为100μL DMSO，以溶解紫色的甲臜晶体。使用酶标仪在570nm波长和690nm参比下计算细胞活力。
为了进行毒性研究，将细胞接种在96孔板中并培育过夜。制备不同浓度的PcNP和PcNP@Drug的PBS溶液。培育16小时后，每孔用730nm 0.5W/cm2照射需要照射(PDT和PDT+药物组合)的细胞8分钟。随后，将细胞再培育16小时，然后通过MTT测量测试细胞活力。
单态氧量子产率(ΦΔ)测定
PcNP的单态氧量子产率是通过化学方法使用DPBF作为单态氧阱并参照MB来测量的。首先确保PcNP和MB溶液在730nm处的光密度相似。将基线调整为PcNP的吸收光谱。将PcNP溶液(750μL)添加到DPBF溶液(50μL，2.5mM)中，并用730nm，1W/cm2激光(0.1-5W可调节的CW 730nm激光，DL-730-1500，型号ADR-1805，Shanghai Solution Co.Ltd)照射合并的溶液。历时10分钟时段定期测量DPBF的吸光度。对于具有DPBF的MB重复相同的步骤。相对于时间记录428nm处的吸光度值，并使用一阶指数拟合法拟合曲线，以获得衰减时间(t)数据。根据公式ΦΔ(PcNP)＝ΦΔ(MB)x(tMB/tPcNP)计算PcNP的单态氧量子产率，其中在线获得0.52的ΦΔ(MB)。
体外协同计算
使用Chou-Talalay(Chou,T.-C.；Talalay,P.《酶调节进展(Adv.Enzyme Regul.)》1984,22,27-55)的组合指数(CI)定理对各种治疗方法之间的协同作用进行了定量分析。药物组合的作用可能是累加性(CI＝1)、协同性(CI<1)或拮抗性(CI>1)。使用CompuSyn软件计算CI。
体外氧化应激检测
根据制造商的说明，使用Thermo Fisher的
Figure BDA0002529562360000171
LIVE绿色活性氧物种检测试剂盒分析了体外氧化应激。将SKMEL-28细胞接种在12孔板中。添加最终浓度为25μg/mL的PcNP。培育12小时后，将细胞用羧基-H2DCFDA标记10分钟，并用PBS洗涤。对应于PcNP+hv治疗的细胞用730nm，0.75W/cm2激光照射20分钟。添加使用普通ROS产生诱导剂TBHP的阳性对照至最终浓度1μM，并培育15分钟。治疗后，用Hoechst 33342(1μM)标记细胞核。然后将盖玻片用PBS洗涤，固定并安装在显微镜载玻片上，以通过CLSM成像。羧基-H2DCFDAλex/em：488/529nm，Hoechst 33342λex/em：350/461nm。
活/死共聚焦测定
钙黄绿素AM和PI从Life Technologies获得。将SKMEL-28细胞接种在μ-Slide 4孔玻璃底，并静置粘附过夜。在添加纳米载体之前，通过使用无血清培养基使细胞饥饿。添加PcNP和PcNP@Drug至最终浓度为10μg/mL。培育4小时后，用730nm，0.5W/cm2激光照射对应于PcNP@Drug+hv治疗和PcNP+hv治疗的细胞，每次20分钟。随后，将细胞再培育16小时。为了将细胞染色，去除培养基，并且将钙黄绿素AM和PI的混合物添加到每个孔中以将细胞染色。将细胞在37℃下培育15分钟。然后，将细胞用PBS冲洗两次，并准备进行共聚焦成像。钙黄绿素λex/em：485/535nm，PIλex/em：530/620nm。
半胱天冬酶3活性
使用来自Abcam的半胱天冬酶3测定试剂盒(比色法)检测半胱天冬酶3，并根据制造商的说明进行。
3D肿瘤球状体
使用悬滴法产生3D肿瘤球状体。将8000个A375细胞分散在完全培养基(35μL)中，并以一定间隔小心地吸移到细胞培养皿的盖子上。小心地将盖子倒在装有PBS(15mL)的培养皿上，以防止液滴蒸发。使球状体聚集并生长2周以达到400μm的直径。之后，开始治疗。
每隔2天，将液滴培养基(5μL)移出并更换为新鲜的培养基。相应地添加PcNP@Drug或PcNP，并培育24小时，然后每隔2天用730nm激光照射。使用以下公式计算球状体体积：
Figure BDA0002529562360000181
其中r是球状体的半径。
对于酸性磷酸酶测定，在将50μL球状体转移到96孔板中之前，先用ApH缓冲液仔细清洗球状体的液滴。添加ApH缓冲液以补足至100μL。将磷酸对硝基苯酯(pNPP，10μL，2mg/mL)添加到每个孔中，然后在37℃下培育3小时。之后，添加NaOH溶液(10μL，1M)以淬灭反应。通过在630nm处进行参考，在405nm处读取吸光度。使用0.1M NaAc+0.1％Triton X-100制备ApH缓冲液。
猪皮的局部渗透
从当地批发商处获得新鲜的全层猪皮，切成1cm×1cm的小块。将皮下脂肪从猪皮上轻轻剥离。将所有剩余的皮肤保持在-20℃冷冻，并尽快使用。从MicropointTechnologies Pte Ltd(新加坡)获得金字塔形的不锈钢微针贴片，其由100根针以高度约500μm，尖端半径5μm，间距约700μm，基部宽度约300μm的10×10阵列组成。为了证明使用微针贴片对皮肤渗透的功效，将皮肤分为4组。将浓度为20mg/mL的PcNP溶液与游离Pc(相当于20mg/mL的PcNP中的Pc浓度)进行比较。在两个持续时间：10分钟和1小时之后，测试了PcNP的渗透。在有和没有微针贴片的帮助下进行渗透。简而言之，如果需要，在约4N的力下用微针贴片刺穿皮肤10秒钟，随后将微针贴片移除。将PcNP或游离Pc溶液(40μL)添加至皮肤，以覆盖直径约0.6cm的圆形区域。10分钟或1小时后，使用微量移液器轻轻去除PcNP或游离Pc溶液，并用PBS(50μL)冲洗皮肤3次，以去除任何多余的溶液。作为对照添加到皮肤上的PBS、PcNP溶液(20mg/mL)和游离Pc溶液未被去除掉。使用IVIS SpectrumCT临床前体内成像系统(Perkin Elmer)测量吸附的Pc的荧光强度，其中λex/em为640/700-760nm。使用仪器软件(Living Image)中的功能可去除猪皮的自发荧光。为了计算渗透到皮肤中的PcNP的百分比，将每个皮肤的强度读数相对于PBS和PcNP阳性对照的强度读数进行标准化。在游离Pc渗透的情况下，通过将读数相对于PBS和游离Pc阳性对照的读数标准化来计算该百分比。
将在有或没有微针贴片的情况下用20mg/mL PcNP渗透10分钟和1小时的新鲜全层猪皮固定在4％多聚甲醛中，包埋在石蜡块中，纵向切片，并安装在减少自发荧光的载玻片上。切片在CLSM上成像，λex：488+561nm，λem：565-700nm。定量基于校正的总细胞荧光(CTCF)公式：
CTCF＝Intden-(AxFI背景)
其中Int den是积分密度，A是感兴趣的面积，Fl背景是背景的平均荧光，使用软件ImageJ计算得出。
A375异种移植
使用雌性纯合CrTac:NCr-Foxn1nu NCr裸小鼠(4周龄)。在T175烧瓶中培养A375细胞，并在达到汇合后收获。将细胞在基质胶中以1:1v/v的比例混合。将4×106个细胞(200μL)皮下注射到每只小鼠的腹侧。每个实验组使用五只小鼠。
实验动物的护理和使用是根据新加坡南洋理工大学的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的协议进行的。
PcNP@Drug的体内功效
当小鼠体内出现肿瘤时，就开始治疗。在第1天、第3天、第7天和第10天进行纳米载体(PcNP或PcNP@Drug)治疗。在纳米载体治疗后的次日(即第2天、第4天、第8天和第11天)进行激光治疗。这种安排将使PcNP有足够的时间扩散穿过肿瘤组织边界，并使黑素瘤细胞对纳米载体的内化达到最大。纳米载体治疗包含麻醉小鼠，然后微针贴片应用30秒，并添加PcNP溶液(40μL，50mg/mL的3％羧甲基纤维素钠溶液)。激光治疗的过程包括麻醉和在15cm高处用730nm，2W激光照射。对于药物组，未进行激光治疗。每组使用五只小鼠，定期测量肿瘤体积，并使用以下公式计算：体积＝0.5×L×W2，其中L是肿瘤的最长长度，W是肿瘤的宽度。相对肿瘤体积通过下式计算：相对肿瘤体积＝(第n天的肿瘤体积/第1天的肿瘤体积)×100％。
根据公式％TGI＝(Vc-Vt)/(Vc-V0)×100％计算肿瘤生长抑制率，其中Vc表示实验第16天对照组的中位肿瘤体积，Vt表示实验第16天实验组的中位肿瘤体积，而V0表示在实验开始时对照组的中位肿瘤体积。
肿瘤的组织学分析
给药后第18天，通过吸入CO2使小鼠安乐死。之后，小心地取出肿瘤，并用4％甲醛固定。将肿瘤包埋在石蜡块中，切片，用H&E和TUNEL试剂盒(Millopore S7101)染色，然后安装在载玻片上。
统计分析
所有数据均表示为平均值±平均值标准误。通过单因素方差分析确定两组数据之间的统计差异，并且p<0.05被认为是统计学上显著的。
实例1：用于深部黑素瘤联合治疗的光动力活性中孔制剂的微针辅助局部递送
恶性黑素瘤的患病率很高，尤其是在白种人中，每年检出的病例超过一百万。它占皮肤癌发病率的4％，但占皮肤癌死亡率的79％。它对放射疗法和化学疗法具有抵抗力，由于非特异性靶向，后者显示出严重的副作用。手术切除在所有病例中也有20％无效。最近，已经采用靶向疗法来改善黑素瘤的总存活率。超过60％的黑素瘤与BRAF突变有关，其中90％是BRAFV600E亚型。BRAFV600E是由于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径过度活跃，导致过度刺激的细胞转化和增殖。
本文描述了解决上述限制的新颖且有创造性的技术(图1)。具体地，本发明人开发了与光敏剂(即酞菁)预共轭的含药物的中孔有机二氧化硅纳米载体。由于PDT不需要释放光敏剂，因此在二氧化硅基质中光敏剂的共价键将使光敏剂充分装载，并防止其聚集诱导的淬灭，从而提高了系统中光敏剂的量子产率。多孔纳米结构还可以促进治疗药物的共同装载。作为概念证明，本发明人在有机二氧化硅纳米粒子中共包封了两种FDA批准的药物，即达拉非尼和曲美替尼，用于突变黑素瘤的联合治疗。
如本文所公开的，微针贴片由于其简单性和商业可获得性而被使用。使用它们不需要特殊的培训和许可，并且与其它物理增强技术(例如微晶换肤术)相比，它们很便宜。微针贴片具有微尺度长度的三维微结构。治疗程序如下。首先，使用微针贴片刺穿角质层并产生瞬时微通道。其次，局部施用装载药物的纳米粒子。这些纳米粒子可以通过微通道进入皮肤并在皮肤层内扩散。最后，执行PDT。治疗后，在小鼠模型中观察到肿瘤在16天内缩小。
达拉非尼和曲美替尼的组合已被批准用于治疗BRAFV600E不可切除的黑素瘤。达拉非尼和曲美替尼分别抑制BRAF(一种蛋白激酶激活剂)和下游MEK途径。在临床上，这种组合口服剂量高，但生物利用度低，且具有一系列潜在的致命副作用。局部使用纳米载体来增强两种药物在黑素瘤部位的聚积将显著减轻身体负担。
首先使用文献报道的相似方法(图9)(Tham,H.P.等人,《化学通讯(Chem.Commun.)》2016,52,8854-8857；Lindig,B.A.等人,《美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)》1980,102,5590-5593)合成用四个硅酸盐单元(Pc-Si)官能化的酞菁(Pc)。Pc可以被能够穿透黑素瘤浸润的皮肤真皮的远红光激发。然后，使用Pc-Si通过硅烷共缩合和水解合成与Pc键合的中孔有机二氧化硅(PcNP)。十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)用作结构导向剂在三乙醇胺(TEOA)(一种碱性催化剂)的存在下形成胶束(Mizoshita,N.；Tani,T.；Inagaki,S.《化学学会评论》2011,40,789-800.)。与通常使用的原硅酸四乙酯(TEOS)相比，原硅酸四甲酯(TMOS)被选作无机二氧化硅源，因为它具有更高的水溶性。这种方法加快但可控制地完成水解过程，从而形成适合局部递送的均匀小粒子(Yamada,H.等人,《材料化学(Chem.Mater.)》2012,24,1462-1471)。在剧烈搅拌下逐滴添加两种前体，即TMOS和Pc-Si。随后，添加2-甲氧基(聚乙烯氧基)-丙基)三甲氧基硅烷(PEG)以淬灭粒子生长，并为所得PcNP提供亲水性。然后通过透析纯化PcNP。将小型抑制剂药物达拉非尼和曲美替尼装入PcNP孔中，以得到载药的PcNP@Drug(图1)。当用微针贴片递送的PcNP@Drug治疗小鼠时，PcNP@Drug能够在NIR光照射下在体内产生活性氧物种(ROS)。另外，药物的释放可以抑制突变型BRAF和随后的癌细胞MEK途径。
众所周知，当某些光敏剂聚集时，强烈的π-π堆积可能会由于其激发态的淬灭而导致其ROS生成能力受阻(Ali,H.；van Lier,J.E.《化学评论(Chem.Rev.)》1999,99,2379-2450)。为了找出要包含在每个纳米粒子中的最佳Pc浓度，使用了不同的TMOS与Pc比率(100、270、500和1000：1)，分别表示为A、B、C和D。观察到当TMOS∶Pc比进一步降低时，由于使用大量的Pc-Si，纳米粒子不能形成。合成并纯化纳米粒子后，通过元素分析(EA)分析Pc含量，并根据氮的重量百分比进行计算(图10a和表1)。
表1.理论Pc和实际负载Pc及其相应效率的列表。效率＝实际Pc/理论Pc×100％。
样品 TMOS:Pc 理论Pc(μmol/mg) 实际Pc(μmol/g) 效率(％)
A 100:1 9.90 68.5 0.69
B 270:1 3.69 53.2 1.44
C 500:1 1.99 25.7 1.29
D 1000:1 1.00 24.2 2.42
为了确定PcNP中Pc的最佳浓度，本发明人采用了化学ROS捕集方法，所述方法使用9,10-蒽二基-双(亚甲基)亚乙基四甲酸(ABDA)作为捕集剂。ABDA的吸光度随着与ROS不可逆地反应形成内过氧化物而降低(图10b)。观察到纳米粒子C和D稍微淬灭了ABDA的吸光度，而纳米粒子B给出了最明显的淬灭作用。然而，由于上述聚集诱导的淬灭，纳米粒子A仅显示出中间的猝灭作用。通过该实验，证明用于合成纳米粒子B的TMOS:Pc比率是最佳的。
如通过透射电子显微镜(TEM，图2a)观察到的，合成的PcNP是单分散的，直径为33±4nm(n＝30)。药物装载后，PcNP@Drug显示34±5nm的直径(n＝30，图11)，这意味着药物装载后没有可见的聚集。如通过动态光散射(DLS，图2c)所测定，PcNP和PcNP@Drug的流体力学直径分别为50nm和78nm。流体动力学直径的这种略微增加可以归因于药物装载后PcNP的光折射率的变化。对于PcNP@Drug，测得的多分散指数(PDI)为0.161±0.004，表明在药物装载后，PcNP高度单分散。PcNP的ζ电位为-21.3±0.8mV，在PcNP@Drug装载药物后，其为-28.7±0.4mV(图12)。纳米粒子的高度负的ζ电位赋予很大的静电稳定性和在溶液中的可分散性。吸收光谱(图2b)表明Pc已成功地并入框架中，其中DMSO中烷基化的酞菁(Pc-Si)光谱在707nm处显示Q带，而水中的PcNP则红移至718nm。在PcNP中，Pc-Si在636nm处的肩峰类似地红移至649nm。由于介质环境以及与3D结构中的二氧化硅共轭时Pc的构象的变化，这种红移行为是Pc-Si和TMOS的Si基团之间相互作用的典型指示。X射线光电子能谱(XPS，图2d)表明在531.6eV处存在的氧源自TMOS。在284.5eV处相对较高的碳1s峰归因于框架中的碳。TMOS和Pc-Si中的硅分别贡献了153.6eV和67.5eV处的硅2s和2p峰。此外，在401.7eV处观察到了来自Pc的氮1s峰(图2d，e)，表明Pc已成功并入纳米粒子中。
通过相对于Pc-Si的校准曲线的计算来确定PcNP@Drug的载药能力(DLC)和包封效率(EE)。测试了达拉非尼、曲美替尼及其组合的各种药物装载浓度(1、2、5、10mg/mL)，并绘制了相应的DLC和EE值(图13)。通常，DLC随着药物装载浓度的增加而增加，而EE则降低。由于曲美替尼的溶解度较低，其装载量低于达拉非尼。在达拉非尼+曲美替尼装载浓度为10mg/mL时，DLC为36.9±7.8％，EE为11.9±3.5％。在1mg/mL时，DLC和EE分别为16.2±1.1％和41.0±1.6％。对于随后的实验，使用1mg/mL的浓度，因为经证明所述浓度足以用于细胞实验。
从元素分析结果得出氮重量百分比为1.19重量％，并且PcNP中的相应Pc含量经计算为53.2μmol/mg。然后，本发明人测试了在不同pH水平下PcNP@Drug内抑制剂的累积药物释放动力学(图2f)。在pH 7.4下，PcNP@Drug在第一个小时内释放3.5％的有效负载，然后在48小时后逐渐减少到总计释放24.9％。在pH 5下，PcNP@Drug在第一个小时内释放5.9％，而在48小时后总计释放38.9％。如以下研究所示，这一药物释放量足以用于疗法。这种持续释放意味着装载的药物不会在皮肤表皮中过早释放，在药物释放到其最大值之前，PcNP@Drug将在很大程度上积聚在恶性部位。此外，在酸性pH下增加的药物释放是有益的，因为可以加快内体逃逸。
使用1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF，图11a，d)通过间接化学方法计算出PcNP的单态氧产生量子产率(ΦΔ)。确保PcNP和亚甲基蓝(MB)在730nm处的光密度相似(图11c)。经计算，PcNP的ΦΔ为0.42，对于水溶液中合成的有机光敏剂而言相当高(图11b，e)。为了比较，确定Pc-4NH2的ΦΔ为0.43，Pc-Si的ΦΔ为0.40。然后研究了PcNP的光稳定性。照射50分钟后，PcNP的吸光度曲线几乎未淬灭(图3a)。相比之下，Pc-Si曲线几乎完全淬灭，在照射的前5分钟内大幅降低了85.3％(图3b)。绘制了整个激光辐照过程中在722nm处的相对吸光度(图3c)，证明了将Pc并入框架时，二氧化硅网络可以保护光敏剂免受光降解。高稳定性是因为Pc的更多锚固位点增强了其在二氧化硅纳米粒子内部的结构。单态氧和/或其它ROS倾向于侵蚀Pc的次甲基链，这种增强作用使链更稳固，从而使其在光照射过程中稳定。增加光稳定性的另一种解释是，二氧化硅基质保护Pc分子免受外界环境的影响，从而防止被外表面吸附物或氧化还原活性分子意外淬灭。
通过N2吸附/解吸分析获得PcNP和PcNP@Drug的IV型等温线，在p/p0＝0.35-0.45附近显示出一个孔凝结步骤，在p/p0＝0.8-1.0的较高相对压力下显示出另一个孔凝结步骤，表示均一的中孔隙。大致在p/p0＝0.8-1.0处观察到的H1型滞后是PcNP的构造中孔特征的明显表现(图3d)。据估计，PcNP和PcNP@Drug的Brunauer-Emmett-Teller(BET)表面积分别为1036和597m2/g。甚至在药物装载后，纳米粒子的高表面积也可归因于其较小的粒径。孔径显示出狭窄的分布，PcNP和PcNP@Drug均在3.2nm达到峰值(图3e)。药物装载后，吸附等温线保持相似的形状，这意味着药物装载过程中孔结构没有变化。PcNP和PcNP@Drug的孔体积分别为1.763和0.851cm3/g，其中PcNP@Drug的孔体积因被药物占据而较低。药物装载后dV/(log r)的强度从0.14降低到0.06，也表明药物已成功装载到PcNP的中孔。
然后研究了PcNP的光热行为。测试了各种浓度的水溶液中的PcNP并记录了相应的温度变化(图3f)。辐照10分钟后，水的温度升高了2.9℃，而0.1、0.5和2mg/mL的PcNP溶液的温度仅分别升高了3.5、4.1和6.9℃。对于细胞实验，使用约0.15mg/mL PcNP的低重量浓度，并且该浓度在照射后不会产生任何明显的温度升高。这一观察证实了PcNP的光热性能相当差，也意味着其光动力学能力很高。
在不存在药物和光照的情况下，针对各种细胞系测试了PcNP的细胞毒性(图14)。在一系列浓度下培育48小时后，细胞存活良好，证明即使在高浓度下，PcNP的暗细胞毒性也低。临床上，达拉非尼和曲美替尼以150:1的比率每日施用。由于这一比率难以控制，因此本发明人探索了不同的比率以获得最佳的体外治疗效果。所述药物对BRAFV600E突变细胞(SKMEL-28和A375)有效(图15a，c)，而对BRAF野生型细胞系B16F10的效力低得多(图15b)。健康细胞(HDF和HEK)显示无明显毒性(图15d，e)。表明达拉非尼和曲美替尼仅对BRAFV600E突变细胞具有特异性。对于所有细胞系，当达拉非尼与曲美替尼的比率发生变化时，疗效均无显著差异。
对A375细胞进行了PcNP和PcNP@Drug的时间依赖性内化(图3a和16)。如PcNP或PcNP@Drug通道中的红色荧光越来越强所证明，纳米粒子在0.5小时内快速内化到细胞的细胞质中，并显示随着时间的推移摄取逐渐增加。在4小时内，观察到纳米载体移位进入细胞核区。先前的研究表明，具有相似电荷和大小的基于二氧化硅的纳米载体可能会发生网格蛋白介导的内吞作用，并且能够进入细胞核。然后使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM，图4b)在活/死细胞测定中检查PcNP@Drug系统的功效。PBS对照显示无死细胞可见。有照射的PcNP(PcNP+hv)和无照射的PcNP@Drug(PcNP@Drug-hv)在碘化丙啶(PI)通道中显示了一些红色荧光，如在合并通道中所见，显示了一些但不是全部细胞死亡。然而，在有照射的PcNP@Drug(PcNP@Drug+hv)的情况下，合并通道中没有可见的绿色荧光，但有很强的红色荧光，表明细胞完全死亡。
使用A375、SKMEL-28、B16F10和HDF细胞系测试了PcNP@Drug对不同细胞系的治疗效果，其中A375和SKMEL-28是靶向的BRAF突变细胞系，而B16F10是野生型黑素瘤。将PcNP@Drug+hv的联合治疗效果与PDT的单一治疗(PcNP+hv)、单独的靶向疗法(PcNP@Drug-hv)以及游离Pc和游离药物的物理组合进行了比较。在所有浓度的SKMEL-28和A375细胞系中，联合治疗相比单一治疗(图4c，d)以及游离Pc和游离药物的物理组合(图17a)能够杀死更多的细胞。在更高的浓度下，这种治疗效果更加明显，其中A375和SKMEL-28细胞的细胞活力分别下降至10.0％和6.2％，对应于5.36μM药物和10.0μM Pc。如通过平台效应所观察到的，即使当浓度增加时，单一PcNP+hv治疗的效果也受到限制。HDF细胞对所述治疗具有相当的抵抗力，在最高浓度下仅显示略微降低至67.5％的细胞活力。此结果证明，与靶向的黑素瘤细胞相比，PcNP@Drug的局部治疗不会影响皮肤的真皮层(如果它能深入渗透的话)。通过Chou-Talalay方法计算，联合治疗显示出协同效应(对于A375，联合指数＝0.79，对于SKMEL-28细胞系，联合指数＝0.44)，表明是对靶细胞的有效疗法。在A375中使用等效的1.25μM Pc和0.67μM药物检测到协同作用，而在所有使用浓度下，它对SKMEL-28均有效。还观察到在联合治疗中由PcNP+hv生的ROS对HEK细胞有毒性(数据未显示)。为了使治疗功效最大化，如稍后所讨论的，使用微针增加对恶性区域的渗透。
进行了使用PcNP的体外氧化应激检测测定，以证明PcNP中的Pc仅在光存在下才负责产生氧化应激(图5a)。在无光存在下(PcNP-hv)的PBS对照和PcNP中，未检测到可观察到的绿色荧光，表明PcNP的暗毒性低。在NIR光(PcNP+hv)存在下，在细胞溶质中观察到绿色荧光，与每个细胞的位置很好地融合。此观察结果类似于使用叔丁基过氧化氢(TBHP)进行的阳性对照实验，所述实验在体外化学诱导氧化应激。定量评估(图18)显示，在PBS和PcNP-hv组中，分别只有约15％和19％的细胞在绿色通道中显示可见的绿色荧光。显著地，在照射后，明显增加到55％的细胞受到氧化应激，而在TBHP治疗的细胞中约有74％的细胞受到氧化应激，证实PcNP中的Pc仅在光存在下才能被激活，并负责产生ROS。
然后确定关键的半胱天冬酶3蛋白的活性，以测试不同治疗后细胞的凋亡活性(图5b)。在PcNP+hv治疗下，细胞的半胱天冬酶3蛋白酶增加了4.1倍。当用PcNP@Drug-hv治疗时，这种增加是1.6倍。在PcNP@Drug+hv治疗后，半胱天冬酶3蛋白酶增加了6.8倍，进一步表明联合治疗有效且凋亡是细胞死亡的可能机制。
另外，研究了纳米载体对3D肿瘤球状体的治疗功效。数码照片显示，未治疗的对照组球状体尺寸从470μm稳定地增加到670μm(图6a)。接受PcNP+hv或PcNP@Drug-hv单一治疗的球状体尺寸略有增长。有趣的是，接受PcNP@Drug+hv联合治疗的球状体性能最佳，从第3天开始尺寸缩小，从第4天开始分解。历时8天，球状体的直径从平均502μm缩小到452μm。计算出相应的球状体体积，并绘制其相对大小(图6b)。在治疗结束时，PcNP@Drug+hv联合治疗明显比单一治疗和对照组更有效。如若干研究中所报道的，还使用酸性磷酸酶测定法分析了球状体的细胞活力。在所有浓度下，PcNP@Drug+hv联合治疗均显示出比单独的PcNP+hv(PDT)、PcNP@Drug-hv(靶向疗法)或游离Pc和游离药物的物理混合物更好的细胞杀伤功效(图17b)。在最高浓度下，接受单一治疗的球状体的细胞活力分别下降至PcNP+hv和PcNP@Drug-hv的39％和33％。另一方面，联合治疗的细胞活力低得多，为8％(图6c)。
在猪皮上测试了微针改善PcNP皮肤渗透的有效性，这是最适合人类皮肤的模型。在有和没有微针贴片的帮助下，测试了PcNP相对于游离Pc的渗透性。
在局部递送PcNP或Pc后，本发明人进行了IVIS离体成像(图7a)和皮肤样品的组织学分析(图7c)。在10分钟时，未治疗和经过微针治疗的皮肤样品之间的纳米粒子信号没有显著差异(图7a，b)。然而，一小时后，经过微针治疗的样品上的信号急剧增加。在不使用微针和使用微针的情况下，渗透量分别为27.2％和63.1％。当没有微针辅助时，本发明人没有观察到纳米粒子渗透的显著变化。此观察结果表明，PcNP渗透并分布在皮肤层中耗时1小时。有趣的是，不管微针治疗如何，游离Pc的皮肤渗透率均最低。这一结果应归因于药物的疏水性，所述药物不能通过皮肤扩散。
然后，我们使用共聚焦成像检查了经过治疗的皮肤切片的组织学样品(图7c)。如图7c(i)所示，在制剂的10分钟局部治疗后，皮肤中的纳米粒子几乎没有任何信号。表皮层中的这一信号随时间增加一点(图7c(iii))。然而，真皮层中的信号在视觉上保持不变，表明即使在更长的持续时间之后，PcNP也无法进入真皮层。当用微针对皮肤进行预治疗时，表皮层中的纳米粒子信号仅在10分钟后已很强(图7c(ii))。60分钟后，在表皮和真皮层均可见增强的荧光信号。更有趣的是，信号均匀地分布在每一层中，表明PcNP通过扩散渗透到皮肤中。
猪皮中校正的总细胞荧光(CTCF)通过取皮肤表皮和真皮中4个区域的平均值进行定量(图7d)。最初在10分钟且未进行微针预治疗的情况下，整个皮肤不存在大量信号。但是随着时间的流逝，检测到表皮增加了64％，真皮增加了85％。当用微针对皮肤进行预治疗时，10分钟后，表皮(78％)和真皮(46％)的荧光信号均增加。施用1小时后，表皮(142％)和真皮(152％)的增加更为明显。当用微针预治疗时，表皮和真皮中的信号也增加了112％和368％。这些观察结果积极地证明了使用微针辅助PcNP纳米载体渗透的益处。
最后，使用异种移植的肿瘤小鼠模型，本发明人通过包含PDT、靶向疗法和微针的联合治疗检查了载药纳米载体(PcNP@Drug)的抗肿瘤功效(图19)。通过将A375细胞皮下注射到4周龄纯合雌性CrTac:NCr-Foxn1nu小鼠的腹侧来建立肿瘤模型。当肿瘤直径达到约5mm的大小时，每周进行微针辅助纳米载体(PcNP或PcNP@Drug)治疗两次，连续两周(如由图8a中的绿色箭头所指示)，然后进行NIR激光治疗(如由图8a中的红色箭头所指示)。如肿瘤生长曲线所示(图8a)，对照组显示肿瘤呈指数增长，而单独的PcNP+hv(PDT)或PcNP@Drug-hv(靶向疗法)治疗均显示出对肿瘤生长的适度抑制。对于在没有微针辅助的情况下接受游离药物和游离Pc的物理混合物的小鼠，情况也相似(图20)。相比之下，与PBS对照或单独的PcNP@Drug-hv相比，PcNP@Drug+hv联合治疗导致显著的肿瘤消退(P<0.05)。此外，PcNP+hv和PcNP@Drug-hv组的肿瘤生长抑制(TGI)值分别为44.4％和17.2％，而PcNP@Drug+hv联合组的TGI值则为76.0％(图21)。由于TGI>50％被认为是有意义的，50这些数据得出结论，PcNP@Drug纳米载体具有出色的抗肿瘤功效。
在研究过程之后，处死小鼠，切除肿瘤并拍照(图8c)。PcNP@Drug+hv组的肿瘤大小明显小于其它组。PcNP@Drug+hv组的肿瘤重量也明显轻于其它组(图8d)。在对照组中，很明显，肿瘤大小在整个治疗过程中都扩大了，而PcNP@Drug+hv组的肿瘤大小则明显缩小。从小鼠的不同治疗组获得的肿瘤切片的苏木精和曙红(H&E)染色显示在联合治疗组(PcNP@Drug+hv)中癌细胞的严重破坏。从单一疗法组(PcNP+hv或PcNP@Drug)获得的图像仅显示轻微损伤。此观察结果证实了肿瘤抑制数据，并进一步证明了通过PDT和抑制剂的联合治疗的优越疗效(图8e)。此外，不同治疗组的组织切片的末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色证实，与对照组或单一疗法组相比，PcNP@Drug+hv组的凋亡细胞比例显著增加(图22)。经证实，这种类型的联合治疗对于局部体内施用是安全的，其中在整个治疗期间，小鼠的体重都得到了很好的维持(图8b)。
本文中已经广泛和概括地描述了本发明。属于一般公开内容的每个较狭义的种类和亚类分组也构成本发明的一部分。这包括对本发明的一般性描述，其附带条件或否定限制从所述属中去除了任何主题，无论本文中是否具体叙述了删除的材料。其它实施例在所附权利要求书内。另外，在根据马库什组(Markush group)描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也因此根据马库什组的任何单个成员或成员的子组进行描述。
本领域技术人员将容易理解，本发明非常适合于实现目标并获得所提及的目的和优点以及其中固有的目的和优点。此外，对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的发明进行各种替换和修改。本文所述的组合物、方法、程序、治疗、分子和具体化合物目前代表优选实施例，它们是示例性的，并不意在限制本发明的范围。本领域技术人员将想到其中的改变和其它用途，其涵盖在本发明的精神内，由权利要求书的范围限定。在本说明书中对先前已出版文件的列举或论述未必应视为承认所述文件是目前先进技术的一部分或是公共常识。
本文示例性描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个元素、一个或多个限制的情况下适当地实践。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被广泛地理解而不是限制。词语“包含(comprise)”或如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变化形式将因此被理解为暗示包括陈述的整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。另外，本文所采用的术语和表达已被用作描述而非限制的术语，并且不打算使用这类术语和表达来排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同形式，但是应当认识到，在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管已经通过示例性实施例和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文所公开的内容中所体现的发明进行修改和变化，并且这类修改和变化被认为在本发明的范围内。
本文引用的所有文件和专利文件的内容以全文引用的方式并入本文。

Claims (28)

1.一种有机二氧化硅纳米粒子，其包含：
(a)与其共价连接的用于光动力疗法的光敏剂；和
(b)任选地，至少一种包封在其中的药剂。
2.根据权利要求1所述的有机二氧化硅纳米粒子，其特征在于，所述有机二氧化硅纳米粒子是中孔有机二氧化硅纳米粒子，并且所述光敏剂被并入所述纳米粒子的框架内。
3.根据权利要求1或2所述的有机二氧化硅纳米粒子，其特征在于，所述有机二氧化硅纳米粒子的直径小于50nm。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的有机二氧化硅纳米粒子，其特征在于，所述有机二氧化硅纳米粒子是通过使所述光敏剂与烷氧基硅烷，优选二烷氧基硅烷、三烷氧基硅烷或四烷氧基硅烷，更优选四甲氧基硅烷(TMOS)或四乙氧基硅烷(TEOS)缩合形成。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的有机二氧化硅纳米粒子，其特征在于，所述光敏剂用式-Si(OR6)x(R7)3-x的含硅基团修饰，其中R6和R7独立地选自C1-C4烷基和C2-C4烯基，优选甲基或乙基，并且x为0、1、2或3，优选2或3。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的有机二氧化硅纳米粒子，其特征在于，所述光敏剂是酞菁与式A-(CH2)y-Si(OR6)x(R7)3-x的烷氧基硅烷的反应产物，其中A是对酞菁具有反应性的基团，优选地选自-NCO、-COOH、-OH和环氧基，x为0、1、2或3，优选2或3，并且y为1、2或3，优选3。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的有机二氧化硅纳米粒子，其特征在于，所述光敏剂是式(I)或(I')的酞菁化合物，
Figure FDA0002529562350000011
其中：
M是选自由Zn、Al、Cu、Fe、Mn、Mo、Ni和V组成的群组的金属，优选Zn；
R1、R2、R3和R4各自独立地为C1-C6烷基；
m、n、p和q各自独立地为0、1、2或3；和
Figure FDA0002529562350000021
代表式-NH-B-的基团，其中B是共价整合到所述纳米粒子的框架中的含硅连接基团。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的有机二氧化硅纳米粒子，其特征在于，所述有机二氧化硅纳米粒子能够使用(a)式(II)或(II')的有机二氧化硅前体；和(b)选自由TMOS、TEOS及其组合组成的群组的无机二氧化硅源，通过硅烷共缩合和水解获得，
Figure FDA0002529562350000022
其中：
M是选自由Zn、Al、Cu、Fe、Mn、Mo、Ni和V组成的群组的金属，优选Zn；
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地为C1-C6烷基；和
m、n、p和q各自独立地为0、1、2或3。
9.根据权利要求7或8所述的有机二氧化硅纳米粒子，其特征在于，m、n、p和q为0。
10.根据权利要求8或9所述的有机二氧化硅纳米粒子，其特征在于，R5为CH2CH3。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的有机二氧化硅纳米粒子，其特征在于，R5为CH2CH3，并且m、n、p和q为0。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的有机二氧化硅纳米粒子，其特征在于，所述无机二氧化硅源是TMOS。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的有机二氧化硅纳米粒子，其特征在于，用于合成所述有机二氧化硅纳米粒子的所述式(II)或(II')的有机二氧化硅前体与所述无机二氧化硅源的摩尔比为1:100至1:1000，优选为1:200至1:500，更优选为1:250至1:300，最优选为1:270。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的有机二氧化硅纳米粒子，其特征在于，所述至少一种药剂是用于治疗或预防疾病、病症或病况的化合物。
15.根据权利要求14所述的有机二氧化硅纳米粒子，其特征在于，所述疾病、病症或病况选自由以下组成的群组：原发性黑素瘤、转移性黑素瘤、基底细胞癌、鲍文氏病、光化性角化病、异常瘢痕形成(瘢痕瘤和增生性瘢痕)、特应性皮炎、疣、癌前非黑素瘤皮肤病变和胆管癌。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的有机二氧化硅纳米粒子，其特征在于，所述至少一种药剂选自由以下组成的群组：抗生素；类固醇；化学治疗药物；免疫调节剂；消炎剂；用于治疗癌症的药物，如BRAF抑制剂；治疗性肽或蛋白质或单克隆抗体，如抗CTLA4或抗PD-1抗体；siRNA；和质粒，或其组合。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的有机二氧化硅纳米粒子，其特征在于，所述至少一种药剂选自由以下组成的群组：达拉非尼(dabrafenib)、曲美替尼(trametinib)、喜树碱(camptothecin)、阿霉素(doxorubicin)及其组合。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的有机二氧化硅纳米粒子，其特征在于，所述疾病、病症或病况是黑素瘤，并且所述至少一种药剂是达拉非尼和/或曲美替尼。
19.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至18中任一项所述的有机二氧化硅纳米粒子和药学上可接受的载体。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是局部制剂。
21.根据权利要求1至18中任一项所述的有机二氧化硅纳米粒子或根据权利要求19或20所述的药物组合物，其用作药物。
22.根据权利要求1至18中任一项所述的有机二氧化硅纳米粒子或根据权利要求19或20所述的药物组合物，其用于治疗疾病、病症或病况，优选癌症，更优选皮肤癌，最优选黑素瘤。
23.一种用于治疗受试者的疾病、病症或病况的方法，包含以下步骤：
(c)向所述受试者施用，优选地局部施用，治疗有效量的根据权利要求1至18中任一项所述的有机二氧化硅纳米粒子或根据权利要求19或20所述的药物组合物；和
(d)将所述受试者暴露于光照射下，从而至少部分地通过光动力疗法治疗所述疾病、病症或病况。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述光照射是通过近红外光，优选地通过730nm激光来进行。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其特征在于，所述疾病、病症或病况选自由以下组成的群组：原发性黑素瘤、转移性黑素瘤、基底细胞癌、鲍文氏病、光化性角化病、异常瘢痕形成(瘢痕瘤和增生性瘢痕)、特应性皮炎、疣、癌前非黑素瘤皮肤病变和胆管癌。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其特征在于，所述疾病、病症或病况是皮肤癌，优选黑素瘤，并且所述有机二氧化硅纳米粒子或药物组合物是局部施用的。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述方法包含使用微针贴片增强所述有机二氧化硅纳米粒子的皮肤渗透。
28.根据权利要求23至27中任一项所述的方法，其特征在于，所述受试者是人类或哺乳动物。
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