WO2022106787A1 - Procédé de traitement de tumeurs par captation du cuivre et/ou du fer - Google Patents

Procédé de traitement de tumeurs par captation du cuivre et/ou du fer Download PDF

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WO2022106787A1
WO2022106787A1 PCT/FR2021/052040 FR2021052040W WO2022106787A1 WO 2022106787 A1 WO2022106787 A1 WO 2022106787A1 FR 2021052040 W FR2021052040 W FR 2021052040W WO 2022106787 A1 WO2022106787 A1 WO 2022106787A1
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WO
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copper
cells
nanoparticles
chelating
nanoparticle
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PCT/FR2021/052040
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Olivier Tillement
François LUX
Delphine VERNOS
Claire Rodriguez-Lafrasse
Thomas BRICHART
Marco NATUZZI
Alain Geloen
Simon Champagne
Matteo Martini
Paul ROCCHI
Original Assignee
Nh Theraguix
Universite Claude Bernard Lyon 1
Mexbrain
Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs -
INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale)
Hospices Civils De Lyon
Institut National De Recherche Pour L'agriculture, L'alimentation Et L'environnement
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Definitions

  • the present disclosure relates to nanoparticles and their uses in the field of medicine, in particular for the treatment of tumors by uptake of copper and/or iron.
  • Tetrathiomolybdate a copper chelator which is very effective in vitro, has shown an effect in particular on the suppression of angiogenesis and tumor growth, by inducing a reduction in accessible copper [Alvarez HM, Xue Y, Robinson CD , Canalizo-Hernéndez MA, Marvin RG, Kelly RA, Mondragon A, Penner-Hahn JE, & O'Halloran T V. (2010) Tetrathiomolybdate inhibits copper trafficking proteins through metal cluster formation Science (80- ) 327(5963) 331 — 334, https://doi.org/10-1126/science.1179907].
  • Zhou et al have proposed an association of a chelator within polymers which come together to form a capsule making it possible to associate another drug (resiquimod - R848).
  • the chelator used is TETA.
  • the particles formed are of large size (more than 400 kDa molecular weight of the RPTDH) and have a fairly limited extraction capacity, the complexing agent being quite specific for copper but of low stability.
  • a copper extraction capacity has been shown for copper ion contents greater than 50 pg/ml, or 50 ppm (more than an order of magnitude of the natural concentration within our organisms).
  • Wu et al proposed the use of copper-loaded nanoparticles to take advantage of the possibilities of releasing and then capturing copper to initiate an antitumor effect [Wu W, Yu L, Jiang Q, Huo M, Lin H, Wang L, Chen Y, & Shi J (2019) Enhanced Tumor-Specific Disulfiram Chemotherapy by in Situ Cu2+ Chelation-Initiated Nontoxicity-to-Toxicity Transition J Am Chem Soc 141(29) 11531-11539, https://doi.Org /10.1021 Ziacs.9b035031.
  • the size of these particles based on pegylated mesoporous silica on the surface is of the order of 165 nm.
  • Feng et al proposed the use of mesoporous particles of copper sulphide loaded with a drug known for its ability to complex copper (bleomycin). If this approach is interesting because of the optical properties of copper sulfide to initiate absorption in the near infrared, it must be considered that the use of copper sulfide, even charged with a complexing agent, risks causing a contribution excessive copper in some areas. For this use also, the particles are of large size (119.8 nm on average), in order to be able to encapsulate enough molecules.
  • DFO Deferoxamine
  • Deferoxamine which is also used for the treatment of metallic iron overload, was the first chelating agent to be used in oncology for treatment by iron sequestration. DFO has thus shown encouraging results for the treatment of leukemia and neuroblastoma in preliminary clinical trials (Wang et al., Iron and Leukemia, 2019, 38, 406).
  • the use of these molecular chelates is limited by their rapid elimination, their lack of tumor targeting, their toxicity at high doses and the side effects they cause.
  • Another objective of the present disclosure is to provide a compound allowing the uptake of copper and/or iron not only during its general blood circulation, but also more specifically within tumor areas.
  • an objective of the present disclosure is to provide a compound which makes it possible to capture more than 10 pmol of copper and/or iron per liter or even more than 100 pmol of copper and/or iron per liter in the tumor zone, c ie locally capture 100 to 10,000 ppb of copper or iron.
  • Another objective of the present disclosure is to provide a compound allowing chelation with high specificity with respect to copper and/or iron and a residence time in the tumor zones that is sufficiently long, in particular several days. , even several weeks.
  • Another objective of the present disclosure is to be able to locally release ions which would replace copper and/or iron in the body, thus neutralizing its effect.
  • Another objective of the present disclosure is to provide a compound whose size is sufficiently small and which allows targeting of numerous solid tumors, including metastases, and in particular bone metastases.
  • Another objective of the present disclosure is to provide a compound allowing both the uptake of copper and/or iron in tumors and to provide a radiosensitizing effect for treatment by radiotherapy.
  • the localized uptake of biometals should disrupt cellular repair mechanisms and amplify the effects of radiotherapy.
  • nanoparticle of the following formula is proposed:
  • - PS is an organic or inorganic polymer matrix
  • Ch1 is a chelating group not complexed or complexed with a metal cation M1
  • M1 is absent or chosen from metal cations whose complexation constant with Ch1 is lower than that of copper and/or iron, in particular at least ten times lower, for example M1 is chosen from zinc or alkaline earth metals , in particular calcium or magnesium,
  • - Ch2 is a chelating group, identical to or different from the chelating group Ch1, and complexed with a metal cation M2 with a high atomic number Z greater than 40, and preferably greater than 50, characterized in that
  • the n/(n+m) ratio is between 10% and 100%, preferably between 40% and 60%, and,
  • the mean hydrodynamic diameter of the nanoparticle is between 1 and 50 nm, preferably between 2 and 20 nm, and more preferably between 2 and 8 nm.
  • a pharmaceutical composition comprising said colloidal solution of nanoparticles and one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • the chelating group Ch1 is chosen from those having a complexation constant with respect to copper (II) greater than 10 15 .
  • the chelating group Ch1 is chosen from those having a complexation constant with copper (II) at least 10 times greater than their complexation constant with zinc and at least 10 6 times greater than their complexation constants with magnesium and calcium.
  • the chelating group Ch1 is chosen from those having a complexation constant with iron (II) at least 10 times greater than their complexation constant with zinc and at least 10 6 times greater than their complexation constants with magnesium and calcium.
  • At least 50% of the Ch1 is complexed with a metal cation chosen from alkaline earths.
  • At least 50% of the Ch1 is complexed with zinc, calcium or magnesium.
  • the chelating group Ch1 and where appropriate Ch2 is chosen from macrocyclic agents, preferably from 1,4,7-triazacyclononanetriacetic acid (NOTA), 1,4,7, 10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA), 1,4,7-triazacyclononane-l-glutaric-4,7-diacetic acid (NODAGA), and 1,4, 7,10-tetraazacyclododecane,1 -(glutaric acid)-4,7,10-triacetic acid (DOTAGA), 2,2',2”,2'”-(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4 ,7,10-tetrayl)tetraacetamide (DOTAM), and 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan (Cyclam), and 1,4,7,10-tetraazacyclododecane (Cyclen) and deferox
  • PS is a polysiloxane matrix.
  • the nanoparticle is characterized in that
  • the weight ratio of silicon to the total weight of the nanoparticle is between 5% and 25%
  • the total number n+m of chelating groups grafted onto the polymer is between 5 and 50 per nanoparticle, preferably between 10 and 30, and,
  • the nanoparticle has an average diameter of between 2 and 8 nm.
  • the nanoparticle is functionalized with a targeting agent, in particular a peptide, an immunoglobulin, a nanobody, an antibody, an aptamer or a targeting protein.
  • a targeting agent in particular a peptide, an immunoglobulin, a nanobody, an antibody, an aptamer or a targeting protein.
  • the metal cation M2 is chosen from radiosensitizing agents and/or contrast agents for magnetic resonance imaging, in particular gadolinium or bismuth.
  • the nanoparticle is characterized in that
  • PS is a polysiloxane matrix
  • Ch1 and Ch2 comprise DOTAGA chelating groups of formula (I) below [Chem. 1] (I) grafted to the polysiloxane matrix by covalent bonding,
  • M1 is absent and M2 is the gadolinium Gd 3+ cation
  • n+m is between 5 and 50, preferably between 10 and 30, and
  • the pharmaceutical composition is characterized in that it is an injectable composition for intravenous, intratumoral or intrapulmonary administration in a subject, in particular comprising an effective quantity of chelating group Ch1 for in vivo uptake of copper and/or iron in a tumor, the free chelating agent being for example at a concentration of at least 10 mM in the composition.
  • the present disclosure provides a pharmaceutical composition for use in the treatment of cancer in a subject, in particular for the in vivo uptake of copper and/or iron in a tumor.
  • said pharmaceutical composition may comprise an effective amount of metal cation M2, preferably gadolinium, for use as a radiosensitizing agent and the subject is treated with radiotherapy after administration of said composition.
  • Figure 1 shows an HPLC-ICP/MS chromatogram of the free Gadolinium in the reaction medium as a function of the retention time Tr in minutes.
  • Figure 2 shows the results of the titration of the free DOTAs of CuPRiX2o by measuring the luminescence intensity at 590 nm as a function of the amount of europium added per mg of CuPRiX2o (excitation at 395 nm).
  • Figure 3 is a chromatogram of AGulX® and CuPRiX2o before and after copper complexation.
  • Figure 4 shows the effect of increasing concentrations of CuPRiX2o (0, 50, 100, 500, 1000 pM free chelate equivalent to approximately 0, 150, 300, 600, 900, 1200, 1500 and 3000 pM gadolinium) on cell motility of A549 cells.
  • A Quantitative analysis of wound closure as a function of time. The relative density of the wound is a measure of the density of the wound region relative to the density of the region.
  • FIG. 5 shows the effect of increasing concentrations of CuPRiX2o (0, 100, 200, 300, 400 and 500 pM free chelate equivalent to approximately 0, 300, 600, 900, 1200 and 1500 pM gadolinium) on the cell motility of A549 cells.
  • B Representative images of each condition, showing the original injury, as well as the injury 24 h and 48 h after. The scale bar indicates 300 ⁇ m.
  • FIG. 6 shows the effect of CuPRiX20 (0 and 500 ⁇ M free chelate equivalent to about 0 and 1500 ⁇ M gadolinium) on cell motility of A549 cells. The cells were treated for 72 hours with CuPRiX2o before performing the wound.
  • B Representative images of each condition, showing the original injury, as well as the injury 24 h and 48 h after. The scale bar indicates 300 pm
  • FIG. 7 shows the effect of CuPRiX20 (0 and 500 pM free chelate equivalent to approximately 0 and 1500 pM gadolinium) on cell invasion of A549 cells.
  • B Representative images of each condition, showing the original injury, as well as the injury 24 h and 48 h after. The scale bar indicates 300 ⁇ m.
  • FIG. 9 shows the effect of the combination of CuPRiX30 with photon irradiation on the motility of A549 cells.
  • Figure 10 shows the radiosensitizing effect of CuPRiX30 in A549 cells.
  • Figure 11 shows the radiosensitizing effect of CuPRIX and AGulX on lines (A) A549, (B) SQ20B-CD44 and (C) 4T1.
  • FIG.12 Figure 12 shows the efficacy of CuPRIXso in a mouse model of triple negative breast cancer on (A) tumor growth and (B) metastasis formation.
  • A) Tumor growth is expressed as tumor volume (1/2*L*I 2 , where L is tumor length and I is tumor width) as a function of time. Results are expressed as mean ⁇ SD, *p 0.038.
  • Figure 13 shows an injection/irradiation diagram
  • Figure 14 shows the effectiveness of radiotherapy on tumor growth and survival
  • - PS is an organic or inorganic polymer matrix
  • Ch1 is a chelating group not complexed or complexed with a metal cation M1
  • M1 is absent or chosen from among the metal cations whose constant of complexation with Ch1 is lower than that of copper and/or iron, in particular at least ten times lower, for example M1 is chosen from zinc or alkaline earths, in particular calcium or magnesium,
  • - Ch2 is a chelating group, identical to or different from the chelating group Ch1, and complexed with a metal cation M2 with a high atomic number Z greater than 40, and preferably greater than 50, characterized in that
  • the n/(n+m) ratio is between 10% and 100%, preferably between 40% and 60%, and,
  • the mean hydrodynamic diameter of the nanoparticle is between 1 and 50 nm, preferably between 2 and 20 nm, and more preferably between 2 and 8 nm.
  • the nanoparticles according to the present disclosure are advantageously particles with a size of the order of a nanometer.
  • the nanoparticles are small enough to target tumor cells by the EPR effect via the vascular system and to be rapidly eliminated by the kidneys, after their intravenous administration.
  • nanoparticles of very small diameter for example between 1 and 10 nm, preferably between 2 and 8 nm, will be used more preferably.
  • the size distribution of the nanoparticles is for example measured using a commercial particle sizer, such as a Malvern Zetasizer Nano-S particle sizer based on PCS (Photon Correlation spectroscopy). This distribution is characterized by an average hydrodynamic diameter.
  • diameter of the nanoparticles we thus mean the mean hydrodynamic diameter, that is to say, the harmonic mean of the diameters of the particles. A method for measuring this parameter is also described in standard ISO 13321:1996.
  • the nanoparticles according to the present disclosure are nanoparticles comprising an organic or inorganic polymer PS matrix.
  • the polymer of the PS matrix is chosen from biocompatible polymers such as polyethylene glycol, polyethylene oxide, polyacrylamide, biopolymers, polysaccharides or polysiloxanes, or mixtures thereof, preferably the PS polymer is a polysiloxane.
  • nanoparticles comprising a matrix of polysiloxane polymers is meant in particular nanoparticles characterized by a mass percentage of silicon of at least 5%, for example between 5 and 20% of the total mass of the nanoparticle.
  • polysiloxane denotes an inorganic crosslinked polymer consisting of a sequence of siloxanes.
  • the structural units of the polysiloxane, which are identical or different, have the following formula: Si(OSi)nR4-n in which
  • - R is an organic molecule bonded to silicon by a covalent Si-C bond
  • - n is an integer between 1 and 4.
  • polysiloxane includes in particular polymers resulting from the sol-gel condensation of tetraethylorthosilicate (TEOS) and aminopropyltriethoxysilane (APTES).
  • TEOS tetraethylorthosilicate
  • APTES aminopropyltriethoxysilane
  • chelating group within the meaning of the present disclosure, is meant an organic group capable of complexing a metal cation.
  • said chelating groups above are bonded directly or indirectly by covalent bond to the polysiloxane silicons of the PS matrix of the nanoparticles.
  • “Indirect” bonding means the presence of a molecular “linker” or “spacer” between the nanoparticle and the chelating group, said linker or spacer being covalently bonded to one of the constituents of the nanoparticle.
  • the chelating group Ch1 has in particular the function of capturing endogenous copper or endogenous iron.
  • a chelating group Ch1 will advantageously be chosen from those having a complexation constant with respect to copper (II) greater than 10 15 , for example greater than 10 20 .
  • a chelating group Ch1 will advantageously be chosen from those having a complexation constant with respect to iron (II) greater than 10 15 , for example greater than 10 20 .
  • the chelating group Ch1 is free, or complexed (in part at least) with a metal cation M1.
  • the metal cation M1 is complexed with a chelating group chosen judiciously to allow the in vivo transmetallation of the metal cation M1 with copper and/or iron.
  • the chelating group Ch1 is advantageously chosen from those having a complexation constant with copper (II) or iron at least 10 times greater than their complexation constant with zinc and at least 10 6 times greater than their complexation constants with magnesium and calcium.
  • the chelating group Ch1 can be obtained by grafting (covalent bond) on the nanoparticle of macrocyclic agents, preferably chosen from DOTA (acid 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N”,N ”'-teracetic acid), NOTA (1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), NODAGA (1,4,7-triazacyclononane-1-glutaric-4,7-diacetic acid), DOTAGA (2-(4,7,10-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1-yl)pentanedioic acid), DOTAM (1,4,7,10-tetrakis(carbamoylmethyl)-1, 4,7,10 tetraazacyclododecane) and 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan (Cyclam), 1,4,7,10-tetraazacycl
  • the metal cation M1 complexed with the chelating group Ch1 is chosen from zinc, or alkaline earth metals, in particular magnesium or calcium.
  • the chelating group Ch1 is DOTAGA of formula (I) below [Chem. 1]
  • the chelating group Ch2 is complexed with a metal cation M2 with a high atomic number Z greater than 40, and preferably greater than 50.
  • a nanoparticle comprises, grafted onto the polymer matrix PS, one or more Ch1 groups complexed or not with a metal cation M1, for example zinc, magnesium, calcium, or other alkaline-earth metals, and one or more Ch2 groups complexed with a metal cation M2 with number atomic Z high, greater than 40.
  • the chelating group Ch2 is thus preferably chosen from among the chelating groups whose complexation constant with the metal cation M2 is greater than 10 15 , or even greater than 10 20 .
  • the metal cations M2 are chosen from those allowing said nanoparticle to be used as a radiosensitizing agent.
  • radiosensitizing agent means a compound making it possible to make cancerous cells more sensitive to the rays used in radiotherapy.
  • the chelating group Ch2 which is identical to or different from Ch1, can also be chosen from macrocyclic agents, and preferably from DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N”N”' acid -teracetic acid), NOTA (1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), NODAGA (1,4,7-triazacyclononane-1-glutaric-4,7-diacetic acid), DOTAGA ( 2-(4,7,10-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1-yl)pentanedioic), DOTAM (1,4,7,10-tetrakis(carbamoylmethyl)-1,4,7,10 tetraazacyclododecane) and 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan (Cyclam), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane
  • the metal cations M2 are chosen from heavy metals, preferably from the group consisting of: Pt, Pd, Sn, Ta, Zr, Tb, Tm, Ce, Dy, Er, Eu, La, Nd , Pr, Lu, Yb, Bi, Hf, Ho, Sm, In and Gd, or a mixture thereof.
  • the metal cations M2 are Bi and/or Gd.
  • the nanoparticle for the use according to the invention comprises between 3 and 100, preferably between 5 and 20 metal cations M2, in particular of Bi and/or Gd.
  • the nanoparticle according to the invention allows both the uptake of copper and/or iron, by the chelating group Ch1 and/or the imaging or treatment of tumors, by the chelating group Ch2 complexed with a metal cation.
  • M2 exhibiting properties of a contrast agent or of a radiosensitizing agent or of an agent for brachytherapy.
  • metal cation M2 which can be used as an MRI contrast agent, mention will be made of Gd, Dy, Mn and Fe.
  • metal cation M2 which can be used as a radiosensitizing agent, mention will be made of Gd, Lu, Yb and Bi, Hf and Ho, preferably gadolinium or bismuth.
  • n/(n+m) is greater than or equal to 20%; in particular comprised between 20% and 100%, preferably comprised between 40% and 60%.
  • n/(n+m) equals 100%. That is to say, m, representing the number of chelating agent Ch2 complexed with a metal cation M2 is equal to 0, and 100% of the chelating groups Ch are complexed with a metal cation M1 or not complexed.
  • the chelating group Ch1 is identical to the chelating group Ch2 and corresponds to the DOTAGA of formula (I) below [Chem. 1] grafted onto a PS matrix of the nanoparticle, for example a polysiloxane matrix.
  • the chelating group Ch1 is identical to the chelating group Ch2 and corresponds to DOTA of the following formula [Chem. 2] grafted onto a PS matrix of the nanoparticle, for example a polysiloxane matrix.
  • the present disclosure relates to a [Ch1] n -PS-[Ch2] m nanoparticle wherein:
  • - PS is an organic or inorganic polymer matrix
  • - Ch1 is DOTA or DOTAGA not complexed or complexed with a metal cation M1,
  • M1 is absent or chosen from metal cations whose complexation constant with Ch1 is lower than that of copper and/or iron, in particular at least ten times lower, for example M1 is chosen from zinc or alkaline earth metals , in particular calcium or magnesium,
  • Ch2 identical to Ch1, is DOTA or DOTAGA and complexed with a metal cation M2 with a high atomic number Z greater than 40, and preferably greater than 50, preferably Gd, characterized in that
  • the n/(n+m) ratio is between 10% and 100%, preferably between 40% and 60%,
  • the mean hydrodynamic diameter of the nanoparticle is between 1 and 50 nm, preferably between 2 and 20 nm, and more preferably between 2 and 8 nm.
  • (n+m) corresponding to the number of Ch1 and Ch2 chelating groups grafted per nanoparticle is between 3 and 100, preferably between 5 and 50, and for example between 10 and 30.
  • the nanoparticles according to the present disclosure can be modified (functionalization) at the surface by hydrophilic compounds (PEG) and/or charged differently to adapt their biodistribution within the organism and/or targeting molecules to enable specific cell targeting, in particular for the targeting of specific tissues or tumor cells.
  • the targeting agents are grafted to the polymer matrix and are preferably present in a proportion of between 1 and 20 targeting agents per nanoparticle and preferably between 1 and 5 targeting agents.
  • the surface grafting of the targeting molecules it is possible to use a conventional coupling with reactive groups present, optionally preceded by an activation step.
  • the coupling reactions are known to those skilled in the art and will be chosen according to the structure of the surface layer of the nanoparticle and the functional groups of the targeting molecule. See, for example, “Bioconjugate Techniques", GT Hermanson, Academy Press, 1996, in “Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity", Second Edition, WT Mason, ed. Academic Press, 1999. Preferred coupling methods are described below.
  • these targeting molecules are grafted to the amine bonds of the nanoparticles according to the variant of the ultrafine nanoparticles or AGulX as described in the following paragraph.
  • the targeting molecules will be chosen according to the application envisaged.
  • the nanoparticles are functionalized with a targeting agent, such as a peptide, an immunoglobulin, a nanobody, VHH fragment or "single domain", an antibody, an aptamer or any other targeting protein.
  • a targeting agent such as a peptide, an immunoglobulin, a nanobody, VHH fragment or "single domain", an antibody, an aptamer or any other targeting protein.
  • tumor areas typically an antibody, immunoglobulin or nanobody targeting tumor-associated antigens (“tumor-associated antigens”) or certain cancer markers known to those skilled in the art.
  • the nanoparticles that can be used are nanoparticles comprising a polysiloxane PS matrix and which do not comprise a metal oxide-based core, unlike core-shell type nanoparticles comprising a core based on metal oxide and a polysiloxane coating (which are described in particular in WO2005/088314 and W02009/053644).
  • the nanoparticles according to the present disclosure are nanoparticles based on polysiloxane chelated with gadolinium, of formula [Ch1] n -PS-[Ch2] m , in which
  • PS is a polysiloxane matrix
  • Ch1 and Ch2 are DOTAGA chelating groups of formula (I) below [Chem. 1] [0094] and grafted to the polysiloxane matrix by covalent bonding,
  • M1 is absent and M2 is the gadolinium Gd 3+ cation
  • n+m is between 5 and 50, preferably between 10 and 30, and
  • the average hydrodynamic diameter is between 2 and 8 nm.
  • these gadolinium-chelated polysiloxane-based nanoparticles are ultrafine nanoparticles obtained from AGulX nanoparticles as starting material.
  • Such ultrafine AGulX nanoparticles can be obtained by a top-down synthesis method described in particular in Mignot et al Chem Eur J 2013 “A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica nanoparticles for theranostic applications” DOI: 10.1002/chem.201203003.
  • the AGulX nanoparticles which can be used as starting material for obtaining the nanoparticles according to the present disclosure, have in particular the following formula (III) [Chem. 3] in which PS is a polysiloxane matrix, and n is on average between 10 and 50, and the nanoparticles have an average hydrodynamic diameter of 4
  • the AGulX nanoparticles can also be characterized by the following formula (IV) [Chem. 4] (GdSi4-7C24-30N5-8Ol5-25H40-60.5-10H20)x
  • nanoparticles according to the present disclosure can be obtained by the process for preparing a colloidal solution of nanoparticles comprising chelating groups grafted onto a polymer matrix, only part of the chelating groups being complexed with a metal cation, the other part being uncomplexed, said method comprising
  • - PS is an organic or inorganic polymer matrix
  • - Ch2 is a chelating group complexed with a metal cation M2 with a high atomic number Z greater than 40, and preferably greater than 50, characterized in that
  • Ch2 is grafted onto the polymer matrix
  • n is between 5 and 100, and,
  • the average hydrodynamic diameter of the NP1 nanoparticle is between 1 and 50 nm, preferably between 2 and 20 nm, and more preferably between 2 and 8 nm
  • step (4) if necessary, a step of concentrating the solution of the nanoparticles obtained in step (4),
  • the NP1 nanoparticles are ultrafine or AGulX nanoparticles as defined in the previous section and complexed with the gadolinium cation. Specific embodiments are given in the Examples.
  • the duration of the treatment of step (2) can be between 0.5 and 8 hours, for example between 2 and 6 hours at a pH of less than 1.0.
  • the nanoparticles obtained according to the above process can, if necessary, then be functionalized by other chelating groups, different from Ch2 and/or targeting agents or hydrophilic molecules.
  • the nanoparticles obtained according to the above process are placed in the presence of metal cation M1, in order to obtain the complexation of at least part of the free chelating groups with the metal cation M1, of so as to obtain the nanoparticles of the following formula:
  • - PS is an organic or inorganic polymer matrix
  • Ch1 is a chelating group partially complexed with a metal cation M1
  • M1 is chosen from metal cations whose complexation constant with Ch1 is lower than that of copper and/or iron, in particular at least ten times lower, for example M1 is chosen from zinc, calcium or magnesium or other alkaline earths,
  • Ch2 is a chelating group, identical to Ch1, and complexed with a metal cation M2 with a high atomic number Z greater than 40, and preferably greater than 50, characterized in that
  • the n/(n+m) ratio is between 10% and 100%, preferably between 40% and 60%, and,
  • the mean hydrodynamic diameter of the nanoparticle is between 1 and 50 nm, preferably between 2 and 20 nm, and more preferably between 2 and 8 nm.
  • compositions comprising the nanoparticles according to the present disclosure are administered in the form of colloidal suspensions of nanoparticles. They can be prepared as described here or according to other methods known to those skilled in the art and administered via different routes, local or systemic, depending on the treatment and the area to be treated.
  • the present disclosure relates to a colloidal suspension of nanoparticles of formula [Ch1] n -PS-[Ch2] m as described in the preceding sections and the pharmaceutical compositions comprising these colloidal suspensions, where appropriate, in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • the pharmaceutical compositions can in particular be formulated in the form of freeze-dried powders, or of aqueous solutions for intravenous injection.
  • the pharmaceutical composition comprises a colloidal solution with a therapeutically effective amount of nanoparticles of formula [Ch1] n -PS-[Ch2] m as described in the previous sections, in particular nanoparticles based on chelated polysiloxane to gadolinium, and more specifically, as obtained from AGulX nanoparticles as described above.
  • the present disclosure relates to a pharmaceutical composition for its use as a solution for injection, comprising, as active principle, the nanoparticles of formula [Ch1]n-PS-[Ch2] m as described in the preceding sections, in particular nanoparticles based on polysiloxane chelated with gadolinium, and more precisely, as obtained from AGulX nanoparticles as described above.
  • the pharmaceutical composition is characterized in that it is an injectable composition for intravenous or intratumoral administration or an aerosol for intrapulmonary administration, in particular comprising an effective amount of chelating group Ch1 for the in vivo uptake of copper and/or iron in the tumor, the chelating agent Ch1 being for example at a concentration of at least 10 mM in the composition.
  • the composition is an injectable solution comprising nanoparticles based on polysiloxane chelated with gadolinium in a concentration of between 50 and 200 mg/ml, for example between 80 and 120 mg/ml.
  • the nanoparticles according to the present invention allow the uptake of endogenous copper and/or iron after their administration to a subject who needs them.
  • endogenous uptake of copper we preferably mean the local uptake of a quantity of between 100 ppb (0.1 mg of copper per litre) and 10,000 ppb (10 mg of copper per litre) of endogenous copper.
  • the present disclosure relates more particularly to a process for capturing endogenous copper in a subject, in particular a subject suffering from cancer.
  • endogenous uptake of iron is preferably meant the local uptake of a quantity of between 100 ppb (0.1 mg of iron per litre) and 10,000 ppb (10 mg of iron per litre) of the endogenous iron. Accordingly, this disclosure is intended more particularly a method for capturing endogenous iron in a subject, in particular a subject suffering from cancer.
  • the uptake of copper and/or iron can take place within the general blood circulation then afterwards within the tumors, after accumulation of the nanoparticles in tumours, in particular by passive targeting linked to the EPR effect.
  • passive tumor targeting and accumulation has been well demonstrated in particular by ultrafine nanoparticles of the AGulX type.
  • the disclosure therefore also relates to a method for treating tumors in a subject, said method comprising the administration to said subject, of an effective amount of a pharmaceutical composition of nanoparticles of formulas [Ch1] n -PS- [Ch2] m as described in the previous sections, in particular nanoparticles based on polysiloxane chelated with gadolinium, and more precisely, as obtained from AGulX nanoparticles as described above, and characterized in that the nanoparticles allow the treatment of the tumor partly by the uptake of endogenous copper and/or iron.
  • the composition also comprises an effective amount of metal cation M2, preferably gadolinium or bismuth, for use as a radiosensitizing agent and the method comprises, after administration of the composition, a step of irradiating the subject with an effective dose for the treatment of the tumor by radiotherapy.
  • metal cation M2 preferably gadolinium or bismuth
  • patient or “subject” is preferably meant a mammal or a human being including, for example, a subject having a tumour.
  • treatment refers to any act which aims to improve the state of health of a patient, such as therapy, prevention, prophylaxis, and the delay of a disease. In some cases, these terms refer to the amelioration or eradication of a disease or the symptoms associated with the disease. In other embodiments, these terms refer to the reduction in the spread or worsening of disease resulting from the administration of one or more therapeutic agents to a subject. suffering from such a disease.
  • treatment can typically encompass a treatment for stopping the growth of a tumor, reducing the size of the tumor and/or eliminating the tumor.
  • the nanoparticles are used for the treatment of solid tumors, for example brain cancer (primary and secondary, glioblastoma, etc.), hepatic cancers (primary and secondary), pelvic tumors (cancer of the cervical cancer, prostate cancer, anorectal cancer, colorectal cancer), upper aerodigestive tract cancers, lung cancer, oesophageal cancer, breast cancer, pancreatic cancer.
  • solid tumors for example brain cancer (primary and secondary, glioblastoma, etc.), hepatic cancers (primary and secondary), pelvic tumors (cancer of the cervical cancer, prostate cancer, anorectal cancer, colorectal cancer), upper aerodigestive tract cancers, lung cancer, oesophageal cancer, breast cancer, pancreatic cancer.
  • an effective amount of nanoparticles reference is made to the amount of nanoparticles as described above which, when administered to a patient, is sufficient to be localized in the tumor and allow treatment of the tumor by uptake of copper and / or endogenous iron, where appropriate in combination with a radiosensitizing effect and radiotherapy treatment.
  • This quantity is determined and adjusted according to factors such as the age, sex and weight of the subject.
  • the administration of the nanoparticles as described previously can be carried out by intratumoral, subcutaneous, intramuscular, intravenous, intradermal, intraperitoneal, oral, sublingual, rectal, vaginal, intranasal route, by inhalation or by transdermal application. Preferably, it is done intratumorally and/or intravenously.
  • Irradiation methods for treating tumors after administration of nanoparticles as radiosensitizing agent are well known to those skilled in the art and have been described in particular in the following publications: WO2018/224684, WO2019/008040 and C. Verry, et al, Science Advances, 2020, 6, eaay5279; and, C. Verry, et al, NANO-RAD, a phase I study protocol”, BMJ Open, 2019, 9, e023591.
  • the total dose of irradiation during radiotherapy will be adjusted according to the type of cancer, the stage and the subject to be treated.
  • a dose typical total for a solid tumor is in the range of 20 to 120 Gy.
  • Other factors may be taken into account such as chemotherapy treatment, co-morbidity, and/or the fact that radiotherapy takes place or after surgery.
  • the total dose is usually divided.
  • the radiotherapy step in the method according to the present disclosure may comprise, for example, several fractions between 2 and 6 Gy per day, for example 5 days per week, and in particular over 2 to 8 consecutive weeks, the total dose possibly being between 20 and 40 Gy, for example 30 Gy.
  • nanoparticles according to the present disclosure can be administered alone, or in combination with one or more other active ingredients, and in particular other drugs such as cytotoxic or antiproliferative agents or other anti-cancer agents and in particular inhibitors immune checkpoints.
  • other drugs such as cytotoxic or antiproliferative agents or other anti-cancer agents and in particular inhibitors immune checkpoints.
  • combined administration is meant simultaneous or sequential administration (at different times).
  • the CuPRiXx products are obtained by introducing the starting product AGulX®, supplied by the company Nh TherAguix (France), into a strongly acidic medium obtained from extra-pure 37% hydrochloric acid from Cari Roth.
  • the filtration steps are carried out using a peristaltic pump and a Vivaflow 200® - 5 kDa cassette from Sartorius Stedim Biotech (France) used as under the conditions described in the instructions linked to the Vivaflow 200® product.
  • the measurement of the hydrodynamic diameter as well as the titration of the isoelectric point are carried out with a Zetasizer Nano-S (633 nmHe-Ne laser) from Malvern Instruments (USA).
  • this apparatus is coupled to an automatic titrator MPT-2 from Malvern Instruments (USA).
  • the HPLC-UV is carried out with an Agilent 1200 with a DAD detector.
  • the reverse phase column used is a C4.5 ⁇ m, 300 ⁇ , 150 x 4.6 mm from Jupiter.
  • the detection is carried out by a UV detector at a wavelength of 295 nm.
  • the gradient of phases A (H2O/ACN/TFA: 98.9/1/0.1) and B (H2O/ACN/TFA: 10/89.9/0.1) is as follows: 5 minutes at 95/ 5 followed by a linear gradient over 10 min which makes it possible to reach the 10/90 ratio which is maintained for 15 minutes. At the end of these 15 minutes the rate of A is returned to 95% in 1 minute and is followed by a 7 minute plateau at 95/5.
  • the products used in the composition of the eluting phases are all HPLC grade certified.
  • the HPLC-ICP/MS is carried out with Nexion 2000 from Perkin-Elmer (USA).
  • the measurement of the free elements in the medium is carried out in isocratic mode with an elution phase of the following composition: 95% A and 5% B.
  • the composition of phases A and B is identical to the HPL-UV method.
  • the reverse phase column used is a C4.5 ⁇ m, 300 ⁇ , 150 ⁇ 4.6 mm from Jupiter.
  • the products used in the composition of the eluting phases are all HPLC grade certified.
  • the freeze-drying of the particles is carried out using an Alpha 2-4 LSC freeze-dryer from Christ (Germany) following the “primary drying” program.
  • the A549 cells (ECACC 86012804) are cultured in F12-K medium (GibcoTM, Thermofischer) supplemented with 10% fetal calf serum (Dutscher) and 1% penicillin-streptomycin (GibcoTM, Thermofischer). For each experiment, the cells are rinsed twice with 1X PBS (GibcoTM, Thermofischer), incubated for 5 minutes in an incubator at 37° C., 5% CO2 with trypsin-EDTA, then taken up in complete medium.
  • F12-K medium GibcoTM, Thermofischer
  • 1X PBS GibcoTM, Thermofischer
  • the CuPRiX2o and CuPRiXso products are taken up in sterile distilled water at a concentration of free DOTA equal to 10 mM (respectively 30 mM and 16.7 mM of gadolinium) and stored at 4°C.
  • the A549 cells are seeded (50,000 cells/well) in 96-well ImageLock plates (Essen BioScience) and incubated for 16 h at 37° C. and 5% CO2 until to reach 90-100% confluence.
  • the WoundMakerTM (Essen BioScience) is used to create wounds in the cell monolayer of each well. Then, each well is rinsed twice with 1X PBS.
  • the A549 cells are trypsinized, centrifuged and then resuspended with depleted medium (F12-K medium without FCS). The cells are then seeded (1000 cells per well, 40 ⁇ l per well) in the IncuCyte® Clearview insert (Essen BioScience). In the corresponding wells, 20 ⁇ l of depleted medium containing or not CuPRiX20 (500 ⁇ M of free chelate) are added. Finally, 200 ⁇ l of F-12K medium at 10% FCS containing or not CuPRiX20 (500 ⁇ M of free chelate) are added to the lower compartment of the chemotaxis chamber. Images of each insert are taken every hour.
  • Chemotactic migration from the upper reservoir to the lower reservoir is quantified as the confluence of cells on the underside of the membrane relative to the initial confluence of the seeded cells on the top of the membrane. The calculation is performed automatically with IncuCyte ZOOM 2015A microscopy software.
  • the A549 cells are cultured in ImageLock® 96-well culture plates (Essen BioScience) at 20,000 cells per well overnight at 37° C., 5% CO2.
  • the cells are treated with F-12K medium without FCS containing or not CuPRiX3o (500 pM of free chelate equivalent to 800 pM of gadolinium) for 24 h then they are irradiated at 8 Gy (X-Rad320 irradiator, 250 kV, 15 my).
  • the wound is made with the 96-well WoundMakerTM (Essen BioScience).
  • the cells are rinsed twice with 1X PBS to remove floating cells and 100 ⁇ l of medium containing CuPRiXso (0 and 500 ⁇ M of free chelate equivalent to approximately 0 and 800 ⁇ M of gadolinium) are added to each corresponding well.
  • the cells are seeded at 40,000 cells/cm 2 , ie 1 million cells in a 25cm 2 flask (Dutscher) and incubated overnight at 37° C., 5% CO2.
  • the cells are treated with medium without FCS containing or not CuPRiXso (500 ⁇ M of free chelate equivalent to 800 ⁇ M of gadolinium) for 24 h.
  • the cells were then irradiated at different doses (0, 2, 3, 4, 6 and 8 Gy). After irradiation, the cells are washed with 1X PBS, trypsinized and counted. The cells are then reseeded in 25 cm 2 flasks and grow for six divisions (7 days) before being fixed and stained.
  • the 4T1 line is a breast cancer cell line derived from the mammary gland of a BALB/c mouse strain.
  • the cells are cultured in RPMI medium (GibcoTM, Thermofischer) supplemented with 10% FCS and 1% penicillin-streptomycin.
  • the line of cancer of the upper aerodigestive tract (VADS), SQ20B, is derived from a recurrent cancer of the larynx.
  • the subpopulation of interest, SQ20B/CSCs (Stemcell like cancer cells), was collected after two successive cell sorting steps (Hoechst efflux and CD44 labeling) performed by flow cytometry. This population presents a low expression of EGFR and a mesenchymal phenotype, associated with the acquisition of migratory and invasive properties.
  • SQ20B-CSCs are cultured in DMEM:F12 medium (3:1, v:v) supplemented with 5% FCS, 1% PS, 0.04 mg/ml hydroctorisone and 20 ng/ml epidermal growth factor (EGF).
  • DMEM:F12 medium 3:1, v:v
  • FCS 5% FCS
  • PS 1% PS
  • hydroctorisone 0.04 mg/ml
  • EGF epidermal growth factor
  • mice received 3 injections of 50 ⁇ l each by intravenous route, 48 h apart, of 0.9% NaCl (control) or CuPRiX (200 mg/kg). The mice were weighed, their general state evaluated and the tumors measured 3 times per week. The mice were killed 5 days after the last injection and the metastases were quantified in the target organs (lungs, liver).
  • the quantification of the metastases was carried out according to the protocol of Pulaski et al (2000). For this, after killing the mice by cervical dislocation under isoflurane anesthesia, the lungs and livers are removed. The organs are washed with HBSS, cut mechanically and then subjected to enzymatic digestion with collagenase type IV (2 mg/ml) associated with DNAse I (Roche) for the lungs and with a collagenase cocktail of type IV (2 mg/ml). I (2 mg/ml), BSA (1 mg/ml) and hyaluronidase (2 mg/ml) for the livers. This digestion takes place for 2 hours (lungs) and 40 minutes (livers) at 37°C on a rotating wheel.
  • the digested organs are then filtered through 70 ⁇ m nylon filters. They are centrifuged at 1500 G for 5 minutes and washed twice with HBSS. The cell pellets are resuspended in RPMI medium at 60 pM 6-thioguanine for the study of clonogenic growth. The suspensions are put back into culture diluted to 1/6 for the lungs and pure for the livers in 10-cm petri dishes. After 8 days, the cells are fixed in 96% ethanol and stained with Giemsa (diluted 1/20 in distilled water). The clones are then counted digitally using the ColcountTM colony counter (Oxford Optronix).
  • the AGulX® product was placed in an acid medium with the aim of protonating the DOTA groups and thus releasing part of the Gd 3+ ions initially complexed.
  • a 200 g/L solution of AGulX® was prepared by dissolving 10 g of product in 50 ml of UltraPure water. The solution was left stirring at room temperature for 1 hour.
  • a solution of 2M hydrochloric acid was prepared by adding 10 ml of 37% hydrochloric acid (Hydrochloric acid 37%, extra-pure, 2.5 L, plastic, CarIRoth) to 50 ml of UltraPure water.
  • the solution was diluted by 10 with UltraPure water.
  • the pH is then measured and raised to 1 ⁇ 0.2 if necessary with 1 M sodium hydroxide so as not to destroy the filtration membrane.
  • the 500 ml of solution thus obtained were purified using a peristaltic pump and a Sartorius Vivaflow 200 - 5 kDa cassette in order to separate the particles from the Gd 3+ ions released in order to avoid the recomplexation of these ions.
  • the initial volume of 500 ml is concentrated to 50 ml and the operation is repeated. In total, the dilution/concentration operation was repeated 4 times and the final volume is 50 ml. Following purification, the 50 ml of solution were distributed into vials each containing 2 ml of solution. The vials are placed at -80°C in order to freeze the solution and then freeze-dried to obtain our final product in the form of a brown powder.
  • Example 3 Assay of the number of free DOTAGA by chelation and fluorescence of europium
  • the amount of free chelates present in CuPRiX2o can be determined by europium chelation followed by a luminescence study.
  • Europium indeed presents a luminescence mainly centered around 590 (5D0 -> 7F1) and 615 nm (5D0 -> 7F2). This luminescence is extinguished in the presence of water molecules.
  • the principle of the assay is to add increasing amounts of europium, as long as it is chelated, the luminescence increases, then when all the chelation sites are filled the luminescence reaches a plateau as shown in Figure 2.
  • the CuPRiX2o was placed in an acetate buffer at pH 5, a europium chloride salt dissolved in the acetate buffer is added. A dosage curve is then plotted by exciting at 396 nm and noting remission at 590 nm. This dosage makes it possible to go back to a quantity of chelate of 0.16 pmol per mg of CuPRiX2o. Knowing that there is a zero or negligible amount of gadolinium in the initial AGulX® product, then the initial amount of gadolinium is equal to the amount of DOTA. The initial gadolinium content of the starting material, measured by elemental analysis, was 0.81 pmol per mg of AGulX®.
  • the CuPRiX2o product therefore has 20% of its DOTA groups which are free.
  • the presence of free DOTA therefore indicates a potential application of CuPRiX2o as a possible chelating agent in the context of chelation therapy.
  • the complexing potential of CuPRiX2o was determined by copper chelation followed by an absorbance study using HPLC-UV/Vis.
  • the DOTA@Cu complex has an absorbance at 295 nm much higher than that of the DOTA@Gd complex, DOTA and copper ions in solution.
  • the absorbance of CuPRiX2o will increase as the free DOTA groups complex the available copper ions, until reaching a plateau where the addition of additional copper will not cause an increase in absorbance.
  • a series of samples was therefore prepared with an increasing quantity of copper chloride solution and a constant quantity of CuPRiX2o.
  • the level of free DOTA can be modulated according to the reaction time of AGulX in an acid medium. After 5h, the solution was diluted by 10 with UltraPure water. The pH is then measured and raised to 1 ⁇ 0.2 if necessary with 1 M sodium hydroxide so as not to destroy the filtration membrane.
  • the 500 ml of solution thus obtained are purified using a peristaltic pump and a Sartorius Vivaflow 200 - 5 kDa cassette in order to separate the particles from the Gd 3+ ions released to avoid the recomplexation of these ions
  • the initial volume of 500 ml is concentrated to 50 and the operation is repeated.
  • the dilution/concentration operation was repeated 4 times and the final volume is 50 ml.
  • the 50 ml of solution are divided into flasks each containing 2 ml of solution.
  • the vials are placed at -80°C in order to freeze the solution and then freeze-dried to obtain our final product CuPRiXso in the form of a brown powder. Once the product was obtained, a vial was removed from the batch to perform product characterizations.
  • the presence of free Dota therefore indicates a potential application of CuPRiXso as a possible chelating agent in the context of chelation therapy.
  • the complexing potential of CuPRiX2o was determined by copper chelation followed by an absorbance study using HPLC-UV/Vis.
  • the DOTA@Cu complex has an absorbance at 295 nm much higher than that of the DOTA@Gd complex, DOTA and copper ions in solution.
  • the absorbance of the product will increase as the free DOTA groups complex with the available copper ions, until it reaches a plateau where the addition of additional copper will not result in an increase in absorbance.
  • Cell migration is a multi-step process which is a fundamental component of many biological and pathological processes including tumor metastasis.
  • the wound test is based on the formation of a wound on a cell carpet and the study of cell motility, i.e. the ability of cells to move on a surface in response to a change in density, to close the wound. It is a direct measurement of cell motility on a solid 2D substrate.
  • the objective of this example was to show the ability of CuPRiX2o to reduce cell motility.
  • A549 cells were cultured in F12-K medium (Gibco) containing 8 nM CuSO4-5H2O. After having been cultured for 72 h with or without CuPRiX2o (500 ⁇ M of free chelate), the cells were trypsinized and then seeded at 40,000 cells per well in an ImageLock® 96-well culture plate (Essen BioScience). The plate was placed for overnight at 37°C, 5% CO2. The wound was then made with the IncuCyte® WoundMaker (Essen BioScience).
  • the cells were rinsed twice with PBS to remove floating cells and then treated with 100 ⁇ l of medium containing increasing concentrations of CuPRiX2o (0, 50, 100, 200, 300, 400, 500 and 1000 ⁇ M of free chelate equivalent to about 0, 150, 300, 600, 900, 1200, 1500 and 3000 ⁇ M gadolinium).
  • Example 8 Comparison of the effect of CuPRiX20 and CuPRiX30 on the motility of A549 cells
  • the objective of this example is to show the ability of CuPRiX20 and CuPRiX30 to reduce cell motility and to compare their effects.
  • A549 cells were grown in ImageLock® 96-well culture plates (Essen BioScience) at 40,000 cells per well overnight at 37°C, 5% CO2. Wound testing was performed with the 96-well IncuCyte® WoundMaker (Essen BioScience).
  • Cells were rinsed 2 times with PBS to remove floating cells and were then treated with 100 ⁇ l medium containing CuPRiX20 (0, 125, 250 and 500 ⁇ M free chelate equivalent to approximately 0, 375, 750 and 1500 pM gadolinium) or CuPRiX30 (0, 125, 250 and 500 pM free chelate is equivalent to approximately 0, 200, 400 and 800 pM gadolinium.
  • the images of the filling of the wounds were acquired automatically every 2 hours by the Zoom Incucyte software (Essen BioScience) in the CO2 incubator. The data was analyzed by the software and the results expressed as percentage of wound confluence.
  • the objective of this example is to show the ability of CuPRiX2o to reduce cell invasion - i.e. the ability of cells to break down an extracellular matrix and to move.
  • A549 cells were grown in ImageLock® 96-well culture plates at 40,000 cells per well overnight at 37°C, 5% CO2. The wound was then made with the IncuCyte® WoundMaker (Essen BioScience) then the cells were rinsed twice with PBS. 50 ⁇ l of Matrigel (corning)—diluted beforehand in F12-K medium, whether or not containing CuPRiX20—to a final concentration of 1 mg/ml, were added to each well.
  • Migration by chemotaxis is the directional movement of cells in response to a stimulus.
  • This test consists of a culture insert placed in a cell culture plate well. The cells are seeded in the insert - which contains a membrane with a defined pore size - with serum-free medium to starve them. The chemo-attractant medium is placed in the well below. Due to this chemical gradient, the cells capable of migrating are attracted by the chemo-attractant medium and pass through the pores.
  • the objective of this example is to show the ability of CuPRiX20 to reduce cell motility by a chemotaxis assay. For this, the IncuCyte ZOOM chemotaxis module was used.
  • A549 cells (1000 cells/well) were resuspended in F-12K medium containing 0% FCS and were seeded in the upper compartment of a 96-well Cell Migration Incucyte ClearView plate with 8 pm (40 ⁇ l/well).
  • 20 ⁇ l of F12-K medium without FCS containing or not CuPRiX20 (500 ⁇ M of final free chelate) were added.
  • 200 ⁇ l of F-12K medium at 10% FCS with or without CuPRiX20 (500 ⁇ M of free chelate) was added to the lower compartment of the chemotaxis chamber. Images of each insert were taken every hour.
  • Chemotactic migration from the upper reservoir to the lower reservoir was quantified as the confluence of cells on the underside of the membrane relative to the initial confluence of cells seeded on the top of the membrane. The calculation was performed automatically with IncuCyte ZOOM 2015A microscopy software.
  • Example 11 Effect of the combination of CuPRiX30 with photon irradiation on the motility of A549 cells
  • the objective of this example is to show the ability of CuPRiX30 to reduce cell motility after photon irradiation.
  • A549 cells were grown in ImageLock® 96-well culture plates at 20,000 cells per well overnight at 37°C, 5% CO2. The cells were incubated with F-12K medium without FCS containing or not CuPRiX30 (500 pM free chelate equivalent to 800 pM gadolinium) for 24 h. The cells were then irradiated at 8 Gy (X-Rad320 irradiator, 250 kV) and then wounding was performed. The cells were rinsed twice with PBS to remove floating cells and 100 ⁇ l of medium containing CuPRiX30 (0 and 500 ⁇ M free chelate equivalent to about 0 and 800 ⁇ M gadolinium) was added to each corresponding well.
  • the images of the filling of the wounds were acquired automatically every 2 hours by the Zoom Incucyte software in the CO2 incubator.
  • the data was analyzed by the software and the results expressed as percentage of wound confluence.
  • the results obtained showed superior efficacy (additive effect) of the CuPRiX30/irradiation combination in limiting motility compared to treatment with irradiation alone or with CuPRiX30 alone ( Figure 9).
  • Example 12 Effect of the combination of CuPRiX30 with photon irradiation on cell survival of A549 cells
  • the A549 cells were seeded at 40,000 cells/cm2, ie 1 million cells in a T25cm2 flask and incubated overnight at 37° C., 5% CO2.
  • the cells were treated with F-12K medium without FCS containing or not CuPRiX30 (500 pM free chelate equivalent to 800 pM gadolinium) for 24 h.
  • the cells were then irradiated at different doses (0, 2, 3, 4, 6 and 8 Gy). After irradiation, cells were washed with PBS, trypsinized and counted. Cells were then reseeded into 25 cm2 flasks and allowed to grow for six divisions (7 days) before being fixed and stained.
  • the results obtained show a decrease in cell survival after irradiation in the presence of CuPRiXso (FIG. 10).
  • Example 13 Effect of the combination of CuPRiXso with photon irradiation on cell survival of A549, SQ20B-CD44 + and 4T1 cells.
  • the cells were seeded at 40,000 cells/cm 2 , i.e. 1 million cells in a 25 cm 2 flask and incubated on overnight at 37°C, 5% CO2.
  • the medium is then removed and replaced with medium without FCS alone, containing CuPRiXso (500 ⁇ M of free chelate equivalent to 800 ⁇ M of gadolinium) or AGulX® (800 ⁇ M of gadolinium) for 24 h.
  • the cells are then irradiated at different doses (0, 2, 3, 4 and 6 Gy). After irradiation, the cells are washed with PBS, trypsinized and counted.
  • SF e - (- aD + P D2 )
  • SF the surviving fraction
  • a and p represent the probabilities of lethal and sublethal damage, respectively.
  • the results obtained show a reduction in cell survival after irradiation after treatment with AGulX and CuPRiXso.
  • the efficacy of CuPRiXso seems equal to that of AGulX, while it is superior to the AGulX in the case of the 4T 1 line (FIG. 11).
  • Example 14 Efficacy of CuPRiXso on tumor growth and the formation of metastases in a mouse model of metastatic breast cancer
  • the objective of this example is to show the capacity of CuPRiXso to slow down tumor growth and to reduce the formation of metastases.
  • 10 female BALB/c mice aged 8 weeks received a subcutaneous injection of 50,000 4T1 cells (triple negative breast cancer cells, 50:50, PBS:matrigel).
  • Two new injections were administered 48 h (D12) and 96 h (D14) after the first.
  • mice Nineteen days after the inoculation of the tumours, ie 5 days after the last injection, the mice were killed by cervical dislocation under isoflurane anesthesia and the organs which could present metastases (lungs and liver) were removed. For the quantification of metastases, the lungs and livers were mechanically dissociated and then underwent enzymatic digestion before being filtered. The cell suspensions are then cultured pure (livers) or diluted (lungs) in culture medium containing 60 ⁇ M of 6-thioguanine (selection agent for 4T1 cells), and incubated at 37° C. in a CO2 incubator. Eight days later, the cells are fixed, stained and the colonies are counted automatically, the results are listed in Table 1.
  • Example 15 Efficacy of the CuPRiX30 and radiotherapy combination on tumor growth and survival in a mouse model of metastatic breast cancer
  • the objective of this example is to show the ability of CuPRiXso to increase the effectiveness of radiotherapy on tumor growth and survival.
  • 42 female BALB/c mice aged 8 weeks received a subcutaneous injection of 50,000 4T1 cells (triple negative breast cancer cells, 50:50, PBS:matrigel).
  • mice received a total of 3 injections of 50 ⁇ l of CuPRiX (200 mg/ml) or NaCl (0.9%) spaced 48 hours apart, associated with fractionated radiotherapy of 5 x 2 Gy (2 Gy per day for 5 days) (Figure 13).
  • the irradiations took place 1 hour after administration of the treatment, under isoflurane anesthesia.
  • mice were weighed and the tumors measured 6 times a week. At the end of the therapeutic sequence, the mice having reached one of the following endpoints: loss of 15% of its weight; tumor volume > 1000 mm3; persistent ulceration; observation of signs of distress (prostration, rough hair, hunched back) for 2 consecutive days; were put to death.
  • the evolution of the tumor volume was calculated as follows: (Tumor volume at time t)/(Tumor volume at reference time) with the reference time corresponding to the first day of treatment, i.e. D10.
  • the results obtained show a greater reduction in tumor growth after the combination of CuPRiX + RT treatment compared to treatment with RT alone or CuPRiX alone.
  • the combination of CuPRiX with RT also prolonged animal survival compared to RT alone ( Figure 14).
  • the present technical solutions can find application in particular in the field of medicine, in particular for the treatment of tumours.

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Abstract

La présente divulgation porte sur des nanoparticules et leurs utilisations dans le domaine de la médecine, en particulier pour le traitement de tumeurs.

Description

Description
Titre : Procédé de traitement de tumeurs par captation du cuivre et/ou du fer
Domaine technique
[0001] La présente divulgation porte sur des nanoparticules et leurs utilisations dans le domaine de la médecine, en particulier pour le traitement de tumeurs par captation du cuivre et/ou du fer.
Technique antérieure
[0002] La diminution du taux de cuivre et/ou du fer dans les organismes est une stratégie intéressante dans le traitement de cancers métastatiques. Si cette diminution peut être proposée par de simples régimes [Counter CM, Brady DC, Turski ML, & Thiele DJ (2015) Methods of treating and preventing cancer by disrupting the binding of copper in the map-kinase pathway 1 (19) 0-4], l’idée est surtout d’administrer des médicaments capables de complexer le cuivre. Plusieurs agents chélatants du cuivre ont été testés à ce jour : pénicillamine, trientine, disulfiram, clioquinol et tétramolybdate ainsi que des agents chélatants du fer qui comme pour le cuivre étaient utilisés pour traiter les surcharges métalliques : deferoxamine (DFO), deferiprone (DFP) deferasirox (Gaur et al, Inorganics, 2018, 6, 126). Des résultats intéressants précliniques et cliniques ont été obtenus, mais souvent limités ou associés à des effets secondaires qui pourraient empêcher leur utilisation.
[0003] Le cuivre et/ou le fer sont des cations métalliques essentiels à la vie, cependant, de nombreux autres cations métalliques le sont également. Ainsi, l’utilisation de chélateurs trop puissants risque d’affaiblir le patient dans d’autres parties de l’organisme : il s’agit là d’une problématique courante dans l’utilisation de médicaments utilisés en chimiothérapie.
[0004] À l’inverse, l’utilisation d’un chélatant peu spécifique, qui possède alors une affinité plus forte pour d'autres métaux bio-essentiels comme le zinc, ou même le manganèse, peut également conduire à des effets secondaires gênants. [0005] Dans les stratégies de traitements par déplétion du cuivre ou du fer, un objectif est donc d’augmenter de plus en plus la constante de chélation et la spécificité au cuivre et/ou au fer, pour limiter les effets secondaires tout en assurant une bonne efficacité. Un autre objectif est de cibler la localisation de cette extraction et capter bien précisément le cuivre et/ou le fer dans la zone tumorale.
[0006] Le tétrathiomolybdate, un chélateur du cuivre très efficace in vitro, a montré un effet en particulier sur la suppression de l’angiogenèse et de la croissance tumorale, en induisant une diminution du cuivre accessible [Alvarez HM, Xue Y, Robinson CD, Canalizo-Hernéndez MA, Marvin RG, Kelly RA, Mondragon A, Penner-Hahn JE, & O’Halloran T V. (2010) Tetrathiomolybdate inhibits copper trafficking proteins through metal cluster formation Science (80- ) 327(5963) 331 — 334, https://doi.org/10-1126/science.1179907].
[0007] Cependant cette utilisation est encore limitée et des effets secondaires indésirables comme des érythèmes, névrites optiques, vomissements et leucopénies, sont observés pendant les traitements, probablement reliés à une extraction non sélective du cuivre dans tout le corps.
[0008] Zhou et al ont proposé une association d’un chélateur au sein de polymères qui s’assemblent pour former une capsule permettant d’associer un autre médicament (le resiquimod - R848). Le chélateur utilisé est le TETA. Les particules formées sont de taille importante (plus de 400 kDa de poids moléculaire du RPTDH) et possèdent une capacité d’extraction assez limitée, le complexant étant assez spécifique du cuivre mais de faible stabilité. Ainsi, il a été montré une capacité d’extraction du cuivre pour des teneurs en ions cuivre supérieur à 50 pg/ml, soit 50 ppm (plus d’un ordre de grandeur de la concentration naturelle au sein de nos organismes). [Zhou P, Qin J, Zhou C, Wan G, Liu Y, Zhang M, Yang X, Zhang N, & Wang Y (2019) Multifunctional nanoparticles based on a polymeric copper chelator for combination treatment of metastatic breast cancer Biomaterials 195 86-99, https://doi.Org/10.1016/j.biomaterials.2019.01 .0071. En outre, dans des expériences précliniques, on a observé qu’après injection, malgré un bon ciblage de la tumeur par les particules, une part importante des nanoparticules s’est retrouvée à 6h dans le foie, la rate, les reins et les poumons et encore dans les poumons à 24h.
[0009] Récemment, Wu et al ont proposé l’utilisation de nanoparticules chargées en cuivre pour profiter des possibilités de relargage puis de captation du cuivre pour initier un effet antitumoral [Wu W, Yu L, Jiang Q, Huo M, Lin H, Wang L, Chen Y, & Shi J (2019) Enhanced Tumor-Specific Disulfiram Chemotherapy by in Situ Cu2+ Chelation-Initiated Nontoxicity-to-Toxicity Transition J Am Chem Soc 141(29) 11531-11539, htps://doi.Org/10.1021 Ziacs.9b035031. La taille de ces particules à base de silice mésoporeuse pégylé en surface est de l’ordre de 165 nm. Les études de biodistribution pour ces grosses particules ont cependant montré une très forte captation dans les poumons, rate, foie et cœur. Outre l’aspect original réversible de la captation du cuivre, les particules présentent une faible capacité de chélation des cations cuivre endogènes.
[0010] Feng et al ont proposé l’utilisation de particules mésoporeuses de sulfure de cuivre chargées avec un médicament connu pour sa capacité de complexation du cuivre (la bléomycine). Si cette approche est intéressante du fait des propriétés optiques du sulfure de cuivre pour initier une absorption dans le proche infra-rouge, il faut bien considérer que l’utilisation du sulfure de cuivre, même chargé par un complexant, risque d’entrainer un apport de cuivre excessif dans certaines zones. Pour cette utilisation également, les particules sont de taille importante (119,8 nm en moyenne), afin de pouvoir encapsuler suffisamment de molécules. Feng Q, Zhang W, Li Y, Yang X, Hao Y, Zhang H, Li W, Hou L, & Zhang Z (2017) An intelligent NIR-responsive chelate copper-based anticancer nanoplatform for synergistic tumor targeted chemo-phototherapy Nanoscale 9(40) 15685-15695, https://doi.Org/10.1039/c7nr05003h.
[0011] Le déferoxamine (DFO) qui est également utilisé pour le traitement des surcharges métalliques en fer a été le premier chélatant à être utilisé en cancérologie pour un traitement par séquestration du fer. Le DFO a ainsi donné des résultats encourageants pour le traitement de la leucémie et du neuroblastome dans des essais cliniques préliminaires (Wang et al., Iron and Leukemia, 2019, 38, 406). [0012] Cependant l’utilisation de ces chélates moléculaires est limitée par leur élimination rapide, leur absence de ciblage de la tumeur, leur toxicité à haute dose et les effets secondaires qu’ils entraînent.
[0013] Pour pallier ces différents problèmes, plusieurs équipes ont proposés d’associer des chélateurs du fer à des nanoparticules ou d’user des nanoparticules intrinsèquement chélatantes pour le fer. Ainsi J. Perring et al (Journal of Materials Science : Materials in medicine 2018, 29, 181 ) ont proposé de former des nanoparticules de mélanine qui présente naturellement une chélation pour le fer. Ces particules présentent une taille proche de 220 nm et ont montré leur capacité à capter le fer et à entrainer la mort cellulaire de cellules cancéreuses (rhabdomyosarcome et glioblastome). La taille importante des nanoparticules risque néanmoins d’induire une biodistribution peu adaptée à une utilisation clinique.
[0014] Des dispositifs de drug delivery classique à base de liposomes ont également été proposés afin d’améliorer la biodistribution du DFO. C’est ce qu’ont proposé Lang et al (ACS Nano, 2019, 13, 2176-2189). Ils ont également associé le DFO au sein de ce liposome à un inhibiteur HIF1a (hypoxia-inducible factor 1a) afin de limiter la surexpression d’HIFIa qui est habituellement observée avec le DFO. L’encapsulation au sein des liposomes a permis d’obtenir des nanoparticules d’une centaine de nanomètres environ. Les essais précliniques in vitro et in vivo sur des modèles rongeurs ont permis de montrer une action antitumorale. Néanmoins en raison de la taille des nanoparticules, une forte accumulation dans le foie et la rate est observée.
[0015] Suivant la même logique, M. Theerasilp et al. (RSC Advances, 2017, 7, 11158) ont proposé l’encapsulation d’un autre chélateur du fer à l’intérieur de micelles polymériques. Ces micelles sont formées à partir de polymères présentant une partie hydrophobe pour constituer le cœur de la micelle et une partie hydrophile pour assurer la stabilité colloïdale. Ces micelles ont montré une activité anticancéreuse sur différentes lignées cellulaires et présentent des tailles autour de 25 nm ainsi qu’un relargage en fonction du chélateur en fonction du pH. [0016] De toutes ces études, force est de constater qu’il n’existe pas à l’heure actuelle de solutions permettant à la fois un ciblage efficace et spécifique des tumeurs et une chélation locale du cuivre et/ou du fer endogène suffisante pour une utilisation dans le traitement de tumeurs, notamment par l’administration de nanoparticules dans des concentrations efficaces de l’ordre du mg/l.
[0017] Un autre objectif de la présente divulgation est de fournir un composé permettant la captation du cuivre et/ou du fer non seulement lors de sa circulation sanguine générale, mais également plus spécifiquement au sein de zones tumorales. En particulier, un objectif de la présente divulgation est de fournir un composé permettant de capter dans la zone tumorale plus de 10 pmole de cuivre et/ou de fer par litre voire plus de 100 pmole de cuivre et/ou de fer par litre, c’est- à-dire capter localement de 100 à 10 000 ppb de cuivre ou de fer.
[0018] Un autre objectif de la présente divulgation est de fournir un composé permettant une chélation avec une grande spécificité vis-à-vis du cuivre et/ou du fer et un temps de résidence dans les zones tumorales suffisamment élevé, notamment de plusieurs jours, voire plusieurs semaines.
[0019] Un autre objectif de la présente divulgation est de pouvoir libérer localement des ions qui viendraient se substituer au cuivre et/ou au fer dans l’organisme en neutralisant ainsi son effet.
[0020] Un autre objectif de la présente divulgation est de fournir un composé dont la taille est suffisamment faible et permettant un ciblage de nombreuses tumeurs solides, y compris les métastases, et en particulier les métastases osseuses.
[0021] Un autre objectif de la présente divulgation est de fournir un composé permettant à la fois la captation du cuivre et/ou du fer dans les tumeurs et de fournir un effet radiosensibilisant pour un traitement par radiothérapie. Ainsi, pendant l’irradiation, la captation localisée des biométaux devrait perturber les mécanismes de réparation cellulaire et amplifier les effets de la radiothérapie.
[0022] La présente divulgation vient améliorer la situation vis-à-vis d’un ou plusieurs de ces objectifs énoncés ci-dessus. [0023] Il est en effet proposé d’utiliser des nanoparticules chélatantes présentant une biodistribution adaptée et des caractéristiques thermodynamiques et cinétiques appropriée à un traitement de tumeurs, notamment de tumeurs primaires et/ou métastatiques.
[0024] Selon un premier aspect, il est proposé une nanoparticule de formule suivante :
[Ch1]n-PS-[Ch2]m dans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Ch1 est un groupement chélatant non complexé ou complexé avec un cation métallique M1 ,
- M1 est absent ou choisi parmi les cations métalliques dont la constante de complexation avec Ch1 est inférieure à celle du cuivre et/ou du fer, en particulier au moins dix fois inférieure, par exemple M1 est choisi parmi le zinc ou les alcalino-terreux, notamment le calcium ou le magnésium,
- Ch2 est un groupement chélatant, identique ou différent du groupement chélatant Ch1 , et complexé à un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50, caractérisé en ce que
(i) les groupements chélatants Ch1 et Ch2 sont greffés sur la matrice de polymères PS,
(ii) le ratio n/(n+m) est compris entre 10% et 100%, de préférence entre 40% et 60%, et,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm.
[0025] Selon un autre aspect, il est proposé une solution colloïdale de nanoparticules comme définies ci-dessus.
[0026] Selon un autre aspect, il est proposé une composition pharmaceutique comprenant ladite solution colloïdale de nanoparticules et un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
[0027] Les caractéristiques exposées dans les paragraphes suivants peuvent, optionnellement, être mises en œuvre. Elles peuvent être mises en œuvre indépendamment les unes des autres ou en combinaison les unes avec les autres :
[0028] Dans un mode de réalisation, le groupement chélatant Ch1 est choisi parmi ceux ayant une constante de complexation par rapport au cuivre (II) supérieure à 1015.
[0029] Dans un mode de réalisation, le groupement chélatant Ch1 est choisi parmi ceux ayant une constante de complexation avec le cuivre (II) au moins 10 fois supérieure à leur constante de complexation avec le zinc et au moins 106 fois supérieure à leurs constantes de complexation avec le magnésium et le calcium.
[0030] Dans un autre mode de réalisation, le groupement chélatant Ch1 est choisi parmi ceux ayant une constante de complexation avec le fer (II) au moins 10 fois supérieure à leur constante de complexation avec le zinc et au moins 106 fois supérieure à leurs constantes de complexation avec le magnésium et le calcium.
[0031] Dans un mode de réalisation, au moins 50% des Ch1 est complexé avec un cation métallique choisi parmi les alcalino-terreux.
[0032] Dans un mode de réalisation, au moins 50% des Ch1 est complexé avec le zinc, le calcium ou le magnésium.
[0033] Dans un mode de réalisation, le groupement chélatant Ch1 , et le cas échéant Ch2, est choisi parmi les agents macrocycliques, de préférence parmi l’acide 1 ,4,7-triazacyclononanetriacétique (NOTA), 1 ,4,7,10- tetraazacyclododecane-l,4,7,10-tetraacétique (DOTA), l’acide 1 ,4,7- triazacyclononane-l-glutarique-4,7-acide diacetique (NODAGA), et l’acide 1 ,4,7,10-tetraazacyclododececane,1 -(glutaric acid)-4,7,10-triacetique (DOTAGA), 2,2’,2”,2’”-(1 ,4,7,10-tetraazacyclododecane-1 ,4,7,10-tetrayl)tetraacetamide (DOTAM), et 1 ,4,8,11 -tetraazacyclotetradecan (Cyclam), et 1 ,4,7,10- tetraazacyclododecane (Cyclen) et le déferoxamine (DFO) ou autre agent chélatant du fer. [0034] Dans un mode de réalisation, le groupement chélatant Ch1 est le DOTAGA de formule (I) suivante [Chem. 1]
Figure imgf000009_0001
[0035] Dans un mode de réalisation, PS est une matrice de polysiloxane.
[0036] Dans un mode de réalisation, la nanoparticule est caractérisée en ce que
- le ratio poids en silicium sur le poids total de la nanoparticule est compris entre 5% et 25%,
- le nombre total n+m de groupements chélatants greffés sur le polymère est compris entre 5 et 50 par nanoparticule, de préférence entre 10 et 30, et,
- la nanoparticule a un diamètre moyen compris entre 2 et 8 nm.
[0037] Dans un mode de réalisation, la nanoparticule est fonctionnalisée avec un agent de ciblage, en particulier un peptide, une immunoglobuline, un nanobody, un anticorps, un aptamère ou une protéine ciblante.
[0038] Dans un mode de réalisation, le cation métallique M2 est choisi parmi des agents radiosensibilisants et/ou des agents de contraste pour l’imagerie par résonance magnétique, en particulier le gadolinium ou le bismuth.
[0039] Dans un mode de réalisation, la nanoparticule est caractérisée en ce que
(i) PS est une matrice de polysiloxane,
(ii) Ch1 et Ch2 comprennent des groupements chélatants DOTAGA de formule (I) suivante [Chem. 1]
Figure imgf000009_0002
(I) greffés à la matrice de polysiloxane par liaison covalente,
(iii) M1 est absent et M2 est le cation gadolinium Gd3+,
(iv) n+m est compris entre 5 et 50, de préférence entre 10 et 30, et
(v) le diamètre hydrodynamique moyen est compris entre 2 et 8 nm.
[0040] Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique est caractérisée en ce qu’il s’agit d’une composition injectable pour une administration intraveineuse, intratumorale ou intrapulmonaire chez un sujet, en particulier comprenant une quantité efficace de groupement chélatant Ch1 pour la captation in vivo du cuivre et/ou du fer dans une tumeur, le chélatant libre étant par exemple à une concentration d’au moins 10 mM dans la composition.
[0041] Dans un mode de réalisation, la présente divulgation fournit une composition pharmaceutique pour son utilisation dans le traitement du cancer chez un sujet, en particulier pour la captation in vivo du cuivre et/ou du fer dans une tumeur. En particulier, dans ce mode de réalisation, ladite composition pharmaceutique peut comprendre une quantité efficace de cation métallique M2, de préférence du gadolinium, pour une utilisation en tant qu’agent radiosensibilisant et le sujet est traité par radiothérapie après administration de ladite composition.
Brève description des dessins
[0042] D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels :
Fig. 1
[0043] [Fig. 1] La figure 1 montre un chromatogramme HPLC-ICP/MS du Gadolinium libre dans le milieu réactionnel en fonction du temps de rétention Tr en minute.
Fig. 2 [0044] [Fig. 2] La figure 2 montre les résultats de la titration des DOTA libres de CuPRiX2o par mesure de l’intensité de luminescence à 590 nm en fonction de la quantité d’europium ajoutée par mg de CuPRiX2o (excitation à 395 nm).
Fig. 3
[0045] [Fig. 3] La figure 3 est un chromatogramme de AGulX® et de CuPRiX2o avant et après complexation de cuivre.
Fig. 4
[0046] [Fig. 4] La figure 4 montre l’effet de concentrations croissantes de CuPRiX2o (0, 50, 100, 500, 1000 pM de chélate libre équivalent à environ 0, 150, 300, 600, 900, 1200, 1500 et 3000 pM de gadolinium) sur la motilité cellulaire de cellules A549. (A) Analyse quantitative de la fermeture de la blessure en fonction du temps. La densité relative de la blessure est une mesure de la densité de la région de la blessure par rapport à la densité de la région.
Fig. 5
[0047] [Fig. 5] La figure 5 montre l’effet de concentrations croissantes de CuPRiX2o (0, 100, 200, 300, 400 et 500 pM de chélate libre équivalent à environ 0, 300, 600, 900, 1200 et 1500 pM de gadolinium) sur la motilité cellulaire de cellules A549. (A) Analyse quantitative de la fermeture de la blessure en fonction du temps. La densité relative de la blessure est une mesure de la densité de la région de la blessure par rapport à la densité de la région cellulaire (%). Les données sont présentées comme la moyenne ± SEM (n=6). (B) Images représentatives de chaque condition, montrant la blessure d’origine, ainsi que la blessure 24 h et 48 h après. La barre d’échelle indique 300 pm.
Fig. 6
[0048] [Fig. 6] La figure 6 montre l’effet de CuPRiX2o (0 et 500 pM de chélate libre équivalent à environ 0 et 1500 pM de gadolinium) sur la motilité cellulaire de cellules A549. Les cellules ont été traitées durant 72h par CuPRiX2o avant de réaliser la blessure. (A) Analyse quantitative de la fermeture de la blessure en fonction du temps. La densité relative de la blessure est une mesure de la densité de la région de la blessure par rapport à la densité de la région cellulaire (%). Les données sont présentées comme la moyenne ± SEM (n=6). (B) Images représentatives de chaque condition, montrant la blessure d’origine, ainsi que la blessure 24 h et 48 h après. La barre d’échelle indique 300 pm
Fig. 7
[0049] [Fig. 7] La figure 7 montre l’effet du CuPRiX20 (0 et 500 pM de chélate libre équivalent à environ 0 et 1500 pM de gadolinium) sur l’invasion cellulaire de cellules A549. (A) Analyse quantitative de la fermeture de la blessure en fonction du temps. La densité relative de la blessure est une mesure de la densité de la région de la blessure par rapport à la densité de la région cellulaire (%). Les données sont présentées comme la moyenne ± SEM (n=6). (B) Images représentatives de chaque condition, montrant la blessure d’origine, ainsi que la blessure 24h et 48h après. La barre d’échelle indique 300 pm.
Fig. 8
[0050] [Fig. 8] La figure 8 montre l’effet du CuPRiX20 sur la migration par chimiotactisme de cellules A549. La migration est exprimée comme un rapport de la confluence des cellules ayant traversé la membrane sur la confluence initiale des cellules ensemencées sur la membrane. Les données sont présentées comme la moyenne ± SEM (n=5).
Fig. 9
[0051] [Fig. 9] La figure 9 montre l’effet de l’association du CuPRiX30 à une irradiation photonique sur la motilité des cellules A549. La densité relative de la blessure est une mesure de la densité de la région de la blessure par rapport à la densité de la région cellulaire (%). Les données sont présentées comme la moyenne ± SEM (n=6).
Fig. 10
[0052] [Fig. 10] La figure 10 montre l’effet radiosensibilisant du CuPRiX30 dans les cellules A549.
Fig.11 [0G53] [Fig. 11] La figure 11 montre l’effet radiosensibilisant de CuPRIX et AGulX sur les lignées (A) A549, (B) SQ20B-CD44 et (C) 4T1 .
Fig.12
[0054] [Fig.12] La figure 12 montre l’efficacité de CuPRIXso dans un modèle murin de cancer du sein triple négatif sur (A) la croissance tumorale et (B) la formation de métastases. (A) la croissance tumorale est exprimé comme volume tumoral (1/2*L*I2, où L est la longueur de la tumeur et I est la largeur de la tumeur) en fonction du temps. Les résultats sont exprimés comme moyenne ± SD, *p=0.038. AUC comparaison : Kruskal-Wallis test. (B) Nombre de colonies issues des poumons selon le groupe de traitement. NaCI n=4, CuPRiXso n=6.
F g.13
[0055] La figure 13 représente un schéma d’injections/irradiation
Fig.14
[0056] La figure 14 montre l’efficacité d’une radiothérapie sur la croissance tumorale et la survie
Description des modes de réalisation
[0057] Les dessins et la description ci-après contiennent, pour l’essentiel, des éléments de caractère certain. Ils pourront donc non seulement servir à mieux faire comprendre la présente divulgation, mais aussi contribuer à sa définition, le cas échéant.
Nanoparticules
[0058] La présente divulgation concerne ainsi des nanoparticules de formule suivante :
[Ch1]n-PS-[Ch2]m dans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Ch1 est un groupement chélateur non complexé ou complexé avec un cation métallique M1 ,
- M1 est absent ou choisi parmi les cations métalliques dont la constante de complexation avec Ch1 est inférieure à celle du cuivre et/ou du fer, en particulier au moins dix fois inférieure, par exemple M1 est choisi parmi le zinc ou les alcalino-terreux, notamment le calcium ou le magnésium,
- Ch2 est un groupement chélateur, identique ou différent du groupement chélateur Ch1 , et complexé à un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50, caractérisé en ce que
(i) les groupements chélateurs Ch1 et Ch2 sont greffés sur la matrice PS de polymères,
(ii) le ratio n/(n+m) est compris entre 10% et 100%, de préférence entre 40% et 60%, et,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm.
[0059] Les nanoparticules selon la présente divulgation sont avantageusement des particules de taille de l’ordre du nanomètre. En particulier, les nanoparticules sont suffisamment petites pour cibler les cellules tumorales par effet EPR via le système vasculaire et être éliminées rapidement par les reins, après leur administration par voie intraveineuse.
[0060] Selon la présente divulgation, on utilisera plus préférentiellement des nanoparticules de très faible diamètre par exemple, compris entre 1 et 10 nm, de préférence entre 2 et 8 nm.
[0061] La distribution de taille des nanoparticules est par exemple mesurée à l’aide d’un granulomètre commercial, tel qu’un granulomètre Malvern Zetasizer Nano-S basé sur la PCS (Photon Correlation spectroscopy). Cette distribution est caractérisée par un diamètre hydrodynamique moyen.
[0062] Au sens de l’invention, par « diamètre » des nanoparticules, on entend ainsi le diamètre hydrodynamique moyen, c’est-à-dire, la moyenne harmonique des diamètres des particules. Une méthode de mesure de ce paramètre est également décrite dans la norme ISO 13321 :1996.
[0063] Les nanoparticules selon la présente divulgation sont des nanoparticules comprenant une matrice PS de polymère organique ou inorganique. [0064] Dans certains modes de réalisation, le polymère de la matrice PS est choisi parmi les polymères biocompatibles tels que le polyéthylène glycol, le polyéthylèneoxide, polyacrylamide, biopolymères, polysaccharides ou les polysiloxane, ou leurs mélanges, de préférence le polymère PS est un polysiloxane.
[0065] Par « nanoparticules comprenant une matrice de polymères de polysiloxane », on entend en particulier des nanoparticules caractérisées par un pourcentage massique en silicium d’au moins 5%, par exemple entre 5 et 20% de la masse totale de la nanoparticule.
[0066] Par « polysiloxane », on désigne un polymère réticulé inorganique consistant en un enchainement de siloxanes. Les unités structurales du polysiloxane, identiques ou différentes, sont de formule suivante : Si(OSi)nR4-n dans laquelle
- R est une molécule organique liée au silicium par une liaison covalente Si-C
- n est un entier compris entre 1 et 4.
[0067] A titre d’exemple préféré, le terme « polysiloxane » englobe notamment les polymères issus de la condensation par procédé sol gel de tetraéthylorthosilicate (TEOS) et de aminopropyltriethoxysilane (APTES).
[0068] Par « groupement chélatant », au sens de la présente divulgation, on entend un groupement organique capable de complexer un cation métallique. De préférence, lesdits groupements chélatants ci-dessus sont liés directement ou indirectement par liaison covalente aux siliciums de polysiloxanes de la matrice PS des nanoparticules. Par liaison « indirecte », on entend la présence d’un « linker » moléculaire ou « espaceur » entre la nanoparticule et le groupement chélatant, ledit linker ou espaceur étant lié de manière covalente à l’un des constituants de la nanoparticule.
[0069] Le groupement chélatant Ch1 a en particulier pour fonction de capter le cuivre endogène ou le fer endogène. Dans un mode de réalisation, pour permettre la captation in vivo du cuivre, on choisira avantageusement un groupement chélatant Ch1 parmi ceux ayant une constante de complexation par rapport au cuivre (II) supérieure à 1015, par exemple supérieur à 1O20. [0070] Dans un mode de réalisation, pour permettre la captation in vivo du fer, on choisira avantageusement un groupement chélatant Ch1 parmi ceux ayant une constante de complexation par rapport au fer (II) supérieure à 1015, par exemple supérieur à 1O20.
[0071] Dans un mode de réalisation, le groupement chélatant Ch1 est libre, ou complexé (en partie au moins) avec un cation métallique M1. Dans ce cas, le cation métallique M1 est complexé à un groupement chélateur choisi judicieusement pour permettre la transmétallation in vivo du cation métallique M1 avec le cuivre et/ou le fer. Ainsi, dans un mode de réalisation spécifique, le groupement chélatant Ch1 est avantageusement choisi parmi ceux ayant une constante de complexation avec le cuivre (II) ou le fer au moins 10 fois supérieure à leur constante de complexation avec le zinc et au moins 106 fois supérieure à leurs constantes de complexation avec le magnésium et le calcium.
[0072] Le groupement chélatant Ch1 peut être obtenu par greffage (liaison covalente) sur la nanoparticule d’agents macrocycliques, de préférence choisis parmi DOTA (acide 1 ,4,7,10-tétraazacyclododécane-N,N’,N”,N”’-téracétique), NOTA (acide 1 ,4,7-triazacyclononane-1 ,4,7-triacétique), NODAGA (acide 1 ,4,7- triazacyclononane-1-glutarique-4,7-acide diacétique), DOTAGA (acide 2-(4,7,10- tris(carboxymethyl)-1 ,4,7,10-tétraazacyclododécan-1 -yl)pentanedioïque), DOTAM (1 ,4,7,10-tetrakis(carbamoylméthyl)-1 ,4,7,10 tétraazacyclododécane) et 1 ,4,8,11- tetraazacyclotetradecan (Cyclam), 1 ,4,7,10-tetraazacyclododecane (Cyclen), le déferoxamine. Le déferoxamine est plus particulièrement intéressant en vue de la captation du fer.
[0073] Dans un mode de réalisation, en particulier dans les modes de réalisation décrits aux deux paragraphes précédents, le cation métallique M1 complexé avec le groupement chélatant Ch1 est choisi parmi le zinc, ou les alcalino-terreux, en particulier le magnésium ou le calcium. De préférence, au moins 50%, 60%, 70%, 80%, voire au moins 90% des Ch1 est complexé avec le zinc, le calcium ou le magnésium ou un autre alcalino-terreux. [0074] Dans un mode préféré, le groupement chélatant Ch1 est le DOTAGA de formule (I) suivante [Chem. 1]
Figure imgf000017_0001
[0075] Selon la présente divulgation, le groupement chélatant Ch2, identique ou différent de Ch1 , est complexé à un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50. Ainsi une nanoparticule comprend, greffé sur la matrice de polymère PS, un ou plusieurs groupements Ch1 complexés ou non avec un cation métallique M1 , par exemple du zinc, du magnésium, du calcium, ou autres alcalino-terreux, et un ou plusieurs groupements Ch2 complexés avec un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé, supérieur à 40.
[0076] Le groupement chélateur Ch2 est ainsi choisi de préférence parmi les groupements chélateurs dont la constante de complexation avec le cation métallique M2 est supérieure à 1015, voire supérieure à 1O20. Dans un mode de réalisation particulier, les cations métalliques M2 sont choisis parmi ceux permettant d’utiliser ladite nanoparticule comme agent radiosensibilisant.
[0077] Au sens de la présente divulgation, on entend par « agent radiosensibilisant » un composé permettant de rendre les cellules cancéreuses plus sensibles aux rayons utilisés en radiothérapie.
[0078] Le groupement chélatant Ch2, identique ou différent de Ch1 peut être choisi également parmi les agents macrocycliques, et de préférence parmi DOTA (acide 1 ,4,7,10-tétraazacyclododécane-N,N’,N”,N”’-téracétique), NOTA (acide 1 ,4,7-triazacyclononane-1 ,4,7-triacétique), NODAGA (acide 1 ,4,7- triazacyclononane-1-glutarique-4,7-acide diacétique), DOTAGA (acide 2-(4,7,10- tris(carboxymethyl)-1 ,4,7,10-tétraazacyclododécan-1 -yl)pentanedioïque), DOTAM (1 ,4,7,10-tetrakis(carbamoylméthyl)-1 ,4,7,10 tétraazacyclododécane) et 1 ,4,8,11- tetraazacyclotetradecan (Cyclam), 1 ,4,7,10-tetraazacyclododecane (Cyclen), et le déferoxamine (DFO).
[0079] Plus particulièrement, les cations métalliques M2 sont choisis parmi les métaux lourds, de préférence parmi le groupe constitué de : Pt, Pd, Sn, Ta, Zr, Tb, Tm, Ce, Dy, Er, Eu, La, Nd, Pr, Lu, Yb, Bi, Hf, Ho, Sm, In et Gd, ou un mélange de ces derniers. De préférence, les cations métalliques M2 sont du Bi et/ou Gd.
[0080] Dans un mode de réalisation particulier, la nanoparticule pour l’utilisation selon l’invention comprend entre 3 et 100, de préférence entre 5 et 20 cations métalliques M2, en particulier de Bi et/ou Gd.
[0081] La nanoparticule selon l’invention permet à la fois la captation du cuivre et/ou du fer, par le groupement chélatant Ch1 et/ou l’imagerie ou le traitement de tumeurs, par le groupement chélatant Ch2 complexé avec un cation métallique M2 présentant des propriétés d’agent de contraste ou d’agent radiosensibilisant ou d’agent pour la curiethérapie.
[0082] A titre d’exemples de cation métallique M2 utilisable comme agent de contraste IRM, on citera Gd, Dy, Mn et Fe.
[0083] A titre d’exemples de cation métallique M2 utilisable comme agent radiosensibilisant, on citera le Gd, Lu, Yb et Bi, Hf et Ho, de préférence le gadolinium ou le bismuth.
[0084] L’homme du métier sélectionnera le ratio n/(n+m) en fonction de l’effet souhaité, et notamment en fonction du traitement souhaité, du type de patients, de la dose utilisée, et/ou du patient à traiter. Par exemple, le ratio n/(n+m) est supérieur ou égal à 20% ; notamment compris entre 20% et 100%, de préférence compris entre 40% et 60%. Dans un mode de réalisation, n/(n+m) est égal à 100%. C’est-à-dire, m, représentant le nombre d’agent chélatant Ch2 complexé avec un cation métallique M2 est égal à 0, et 100% des groupements chélatants Ch sont complexés à un cation métallique M1 ou non complexés.
[0085] Dans un mode plus particulier, le groupement chélateur Ch1 est identique au groupement chélatant Ch2 et correspond au DOTAGA de formule (I) suivante [Chem. 1]
Figure imgf000019_0001
greffé sur une matrice PS de la nanoparticule, par exemple une matrice de polysiloxane.
[0086] Dans un autre mode plus particulier, le groupement chélatant Ch1 est identique au groupement chélatant Ch2 et correspond au DOTA de formule suivante [Chem. 2]
Figure imgf000019_0002
greffé sur une matrice PS de la nanoparticule, par exemple une matrice de polysiloxane.
[0087] Ainsi ; dans un mode de réalisation, la présente divulgation concerne une nanoparticule [Ch1]n-PS-[Ch2]m dans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Ch1 est le DOTA ou DOTAGA non complexé ou complexé avec un cation métallique M1 ,
- M1 est absent ou choisi parmi les cations métalliques dont la constante de complexation avec Ch1 est inférieure à celle du cuivre et/ou du fer, en particulier au moins dix fois inférieure, par exemple M1 est choisi parmi le zinc ou les alcalino-terreux, notamment le calcium ou le magnésium,
- Ch2, identique à Ch1 , est le DOTA ou DOTAGA et complexé à un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50, de préférence Gd, caractérisé en ce que
(i) les groupements chélatants Ch1 et Ch2 sont greffés sur la matrice de polymères,
(ii) le ratio n/(n+m) est compris entre 10% et 100%, de préférence entre 40% et 60%,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm.
[0088] Dans un mode particulier et préféré, (n+m) correspondant au nombre de groupements chélatants Ch1 et Ch2 greffés par nanoparticule (optionnellement Ch1 et Ch2 étant le DOTA ou DOTAGA) est compris entre 3 et 100, de préférence entre 5 à 50, et par exemple entre 10 et 30.
[0089] Outre la fonctionnai isation chélatante, les nanoparticules selon la présente divulgation peuvent être modifiées (fonctionnai isation) en surface par des composés hydrophiles (PEG) et/ou chargées différemment pour adapter leur biodistribution au sein de l'organisme et/ou des molécules ciblantes pour permettre un ciblage cellulaire spécifique, en particulier pour le ciblage de tissus ou cellules tumorales spécifiques. Les agents de ciblage sont greffés à la matrice de polymères et sont présents préférentiellement dans une proportion comprise entre 1 et 20 agents de ciblages par nanoparticule et de préférence entre 1 et 5 agents de ciblages.
[0090] Pour le greffage en surface des molécules ciblantes, on pourra utiliser un couplage classique avec des groupes réactifs présents, éventuellement précédé d’une étape d’activation. Les réactions de couplage sont connues de l’homme du métier et seront choisies en fonction de la structure de la couche superficielle de la nanoparticule et des groupements fonctionnels de la molécule ciblante. Voir par exemple, « Bioconjugate Techniques », G.T Hermanson, Academie Press, 1996, dans « Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity », Second Edition, W.T. Mason, ed. Academie Press, 1999. Des méthodes de couplage préférées sont décrites plus loin. De préférence, ces molécules ciblantes sont greffées aux liaisons amines des nanoparticules selon la variante des nanoparticules ultrafines ou AGulX telle que décrite au paragraphe suivant. On choisira les molécules ciblantes en fonction de l’application envisagée.
[0091] Dans un mode de réalisation spécifique, les nanoparticules sont fonctionnalisées avec un agent de ciblage, tel qu’un peptide, une immunoglobuline, un nanobody, fragment VHH ou « single domain », un anticorps, un aptamère ou tout autre protéine ciblante, par exemple des zones tumorales, typiquement un anticorps, immunoglobuline ou nanobody ciblant des antigènes associés à des tumeurs (« tumor-associated antigens ») ou certains marqueurs cancéreux connus de l’homme du métier.
Nanoparticules ultrafines et nanoparticules AGulX
[0092] Dans un mode de réalisation plus particulièrement préféré, en raison notamment de leur très faible dimension et leur stabilité, les nanoparticules utilisables sont des nanoparticules comprenant une matrice PS de polysiloxane et qui ne comprennent pas de cœur à base d’oxyde métallique, à la différence des nanoparticules de type cœur-coquille comprenant un cœur à base d’oxyde métalliques et un enrobage de polysiloxane (qui sont décrites notamment dans W02005/088314 et W02009/053644).
[0093] Aussi, dans un mode de réalisation spécifique, les nanoparticules selon la présente divulgation sont des nanoparticules à base de polysiloxane chélaté au gadolinium, de formule [Ch1]n-PS-[Ch2]m, dans laquelle
(i) PS est une matrice de polysiloxane,
(ii) Ch1 et Ch2 sont des groupements chélatants DOTAGA de formule (I) suivante [Chem. 1]
Figure imgf000021_0001
[0094] et greffés a la matrice de polysiloxane par liaison covalente,
(iii) M1 est absent et M2 est le cation gadolinium Gd3+,
(iv) n+m est compris entre 5 et 50, de préférence entre 10 et 30, et
(iv) le diamètre hydrodynamique moyen est compris entre 2 et 8 nm.
[0095] Plus spécifiquement, ces nanoparticules à base de polysiloxane chélaté au gadolinium sont des nanoparticules ultrafines obtenues à partir de nanoparticules AGulX comme matériel de départ.
[0096] De telles nanoparticules ultrafines AGulX peuvent être obtenues par une méthode de synthèse top-down décrites notamment dans Mignot et al Chem Eur J 2013 « A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica nanoparticles for theranostic applications » DOI: 10.1002/chem.201203003.
[0097] D’autres procédés de synthèse des nanoparticules ultrafines sont également décrits dans WO2011/135101 , WO2018/224684 et WO2019/008040.
[0098] Les nanoparticules AGulX, qui peuvent servir de matériel de départ pour obtenir les nanoparticules selon la présente divulgation ont en particulier la formule (III) suivante [Chem. 3]
Figure imgf000022_0001
dans laquelle PS est une matrice de polysiloxane, et n est en moyenne, entre 10 et 50, et les nanoparticules présentent un diamètre hydrodynamique moyen de 4
±2 nm et une masse d’environ 10 kDa.
[0099] Les nanoparticules AGulX peuvent également être caractérisées par la formule (IV) suivante [Chem. 4] (GdSi4-7C24-30N5-8Ol5-25H40-60, 5-10 H20)x
(IV)
Procédé de synthèse des nanoparticules selon la présente divulgation
[0100] Les nanoparticules selon la présente divulgation peuvent être obtenues par le procédé de préparation d’une solution colloïdale de nanoparticules comprenant des groupements chélatants greffés sur une matrice de polymère, une partie seulement des groupements chélatants étant complexés à un cation métallique, l’autre partie étant non complexée, ledit procédé comprenant
(1 ) la synthèse ou la fourniture, à titre de matériel de départ, d’une solution colloïdale de nanoparticules NP1 de formule suivante [Ch2]n-PS dans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Ch2 est un groupement chélatant complexé à un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50, caractérisé en ce que
(1) Ch2 est greffé sur la matrice de polymères,
(ii) n est compris entre 5 et 100, et,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule NP1 est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm
(2) une étape de traitement de la solution colloïdale de nanoparticules NP1 dans un milieu acide, par exemple en ajoutant une solution d’acide chlorhydrique, afin d’obtenir un pH inférieur à 2,0, de préférence inférieur à 1 ,0 pendant une durée suffisante pour obtenir un relargage partiel ou complet des cations métalliques M2,
(3) le cas échéant, une étape de dilution de la solution, par exemple avec de l’eau,
(4) une étape de purification pour séparer les nanoparticules obtenues à l’étape (2) des cations métalliques M2 libres,
(5) le cas échéant une étape de concentration de la solution des nanoparticules obtenues à l’étape (4),
(6) le cas échéant la répétition des étapes (3), (4) et (5),
(7) le cas échéant, la congélation et/ou la lyophilisation de la solution de nanoparticules obtenues à l’une des étapes (4), (5) ou (6). [0101] Un tel procédé permet d’obtenir les nanoparticules [Ch1]n-PS-[Ch2]m dans lesquelles Ch1 et Ch2 sont identiques. Le procédé permet ainsi avantageusement d’obtenir un relargage partiel ou complet des cations métalliques M2, initialement complexé au groupement chélatant Ch2 sur la nanoparticule NP1. L’homme du métier pourra moduler le degré de relargage des cations métalliques M2, et donc le ratio n/(n+m) moyen dans la solution finale, en jouant notamment sur le pH et la durée de l’étape (2) de traitement.
[0102] Dans un mode de réalisation préféré, les nanoparticules NP1 sont des nanoparticules ultrafines ou AGulX comme définies à la section précédente et complexées avec le cation gadolinium. Des modes de réalisation spécifiques sont donnés dans les Exemples. Typiquement, la durée du traitement de l’étape (2) peut être comprise entre 0,5 et 8 heures, par exemple entre 2 et 6 heures à pH inférieur à 1 ,0.
[0103] Les nanoparticules obtenues selon le procédé ci-dessus peuvent le cas échéant être ensuite fonctionnalisées par d’autres groupements chélatants, différent de Ch2 et/ou des agents de ciblage ou molécules hydrophiles.
[0104] Dans un mode de réalisation, les nanoparticules obtenues selon le procédé ci-dessus sont mis en présence de cation métallique M1 , afin d’obtenir la complexation d’une partie au moins des groupements chélatants libres avec le cation métallique M1 , de sorte à obtenir les nanoparticules de formule suivante :
[Ch1]n-PS-[Ch2]m dans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Ch1 est un groupement chélatant en partie complexé avec un cation métallique M1 ,
- M1 est choisi parmi les cations métalliques dont la constante de complexation avec Ch1 est inférieure à celle du cuivre et/ou du fer, en particulier au moins dix fois inférieure, par exemple M1 est choisi parmi le zinc, le calcium ou la magnésium ou autres alcalino-terreux,
- Ch2 est un groupement chélatant, identique à Ch1 , et complexé à un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50, caractérisé en ce que
(i) les groupements chélatants Ch1 et Ch2 sont greffés sur la matrice de polymères,
(ii) le ratio n/(n+m) est compris entre 10% et 100%, de préférence entre 40% et 60%, et,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm.
Formulations pharmaceutiques des nanoparticules selon la présente divulgation
[0105] Les compositions comprenant les nanoparticules selon la présente divulgation sont administrées sous la forme de suspensions colloïdales de nanoparticules. Elles peuvent être préparées comme décrits ici ou selon d’autres méthodes connues de l’homme du métier et administrées via différentes voies, locale ou systémique, selon le traitement et la zone à traiter.
[0106] Aussi, la présente divulgation porte sur une suspension colloïdale de nanoparticules de formule [Ch1]n-PS-[Ch2]m telles que décrites aux sections précédentes et les compositions pharmaceutiques comprenant ces suspensions colloïdales, le cas échéant, en association avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
[0107] Les compositions pharmaceutiques peuvent être en particulier formulées sous la forme de poudres lyophilisées, ou de solutions aqueuses pour une injection intraveineuse. Dans un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique comprend une solution colloïdale avec une quantité thérapeutiquement efficace de nanoparticules de formule [Ch1]n-PS-[Ch2]m telles que décrites aux sections précédentes, en particulier des nanoparticules à base de polysiloxane chélaté au gadolinium, et plus précisément, telles qu’obtenues à partir de nanoparticules AGulX comme décrit plus haut.
[0108] Dans certains modes de réalisations, il s’agit de poudre lyophilisée, comprenant entre 200 mg et 15 g par flacon, de préférence entre 250 et 1250 mg de nanoparticules. La poudre peut comprendre en outre d’autres excipients, et notamment du CaCl2. [0109] Les poudres lyophilisées peuvent être reconstituées dans une solution aqueuse, typiquement de l’eau stérile pour injection. Ainsi, la présente divulgation porte sur une composition pharmaceutique pour son utilisation comme solution pour injection, comprenant à titre de principe actif, les nanoparticules de formule [Ch1]n-PS-[Ch2]m telles que décrites aux sections précédentes, en particulier des nanoparticules à base de polysiloxane chélaté au gadolinium, et plus précisément, telles qu’obtenues à partir de nanoparticules AGulX comme décrit plus haut.
[0110] Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique est caractérisée en ce qu’il s’agit d’une composition injectable pour une administration intraveineuse ou intratumorale ou un aérosol pour un administration intrapulmonaire, en particulier comprenant une quantité efficace de groupement chélatant Ch1 pour la captation in vivo du cuivre et/ou du fer dans la tumeur, le chélatant Ch1 étant par exemple à une concentration d’au moins 10 mM dans la composition.
[0111] Par exemple, pour ses utilisations comme décrites ci-après, en particulier pour le traitement de tumeur par la captation in vivo de cuivre et/ou du fer, la composition est une solution injectable comprenant des nanoparticules à base de polysiloxane chélaté au gadolinium dans une concentration comprise entre 50 et 200 mg/ml, par exemple entre 80 et 120 mg/mL.
Utilisations des nanoparticules
[0112] Du fait de la présence de groupements chélatants Ch1 libres ou complexés avec des cations métalliques M1 , les nanoparticules selon la présente invention permettent la captation du cuivre et/ou du fer endogène après leur administration chez un sujet qui en a besoin. Par captation endogène du cuivre, on entend de préférence la captation locale d’une quantité comprise entre 100 ppb (0.1 mg de cuivre par litre) et 10 000 ppb (10 mg de cuivre par litre) du cuivre endogène. Ainsi, la présente divulgation vise plus particulièrement un procédé de captation du cuivre endogène chez un sujet, en particulier un sujet souffrant de cancer.
[0113] Par captation endogène du fer, on entend de préférence la captation locale d’une quantité comprise entre 100 ppb (0.1 mg de fer par litre) et 10 000 ppb (10 mg de fer par litre) du fer endogène. Ainsi, la présente divulgation vise plus particulièrement un procédé de captation du fer endogène chez un sujet, en particulier un sujet souffrant de cancer.
[0114] Dans le cas d’une administration des nanoparticules par voie intraveineuse, ou pulmonaire, la captation du cuivre et/ou du fer peut se faire au sein de la circulation sanguine générale puis après au sein des tumeurs, après accumulation des nanoparticules dans les tumeurs, notamment par ciblage passif lié à l’effet EPR. Cet effet de ciblage passif des tumeurs et d’accumulation a été bien mis en évidence en particulier par les nanoparticules ultrafines de type AGulX.
[0115] La divulgation porte donc également sur un procédé de traitement de tumeurs chez un sujet, ledit procédé comprenant l’administration chez ledit sujet, d’une quantité efficace d’une composition pharmaceutique de nanoparticules de formules [Ch1]n-PS-[Ch2]m telles que décrites aux sections précédentes, en particulier des nanoparticules à base de polysiloxane chélaté au gadolinium, et plus précisément, telles qu’obtenues à partir de nanoparticules AGulX comme décrit plus haut, et caractérisé en ce que les nanoparticules permettent le traitement de la tumeur en partie par la captation du cuivre et/ou du fer endogène.
[0116] Dans un mode particulier dudit procédé, la composition comprend également une quantité efficace de cation métallique M2, de préférence du gadolinium ou du bismuth, pour une utilisation en tant qu’agent radiosensibilisant et le procédé comprend, après administration de la composition, une étape d’irradiation du sujet par une dose efficace pour le traitement de la tumeur par radiothérapie.
[0117] Par « patient » ou « sujet », on entend de préférence un mammifère ou un être humain incluant par exemple un sujet ayant une tumeur.
[0118] Les termes « traitement », « thérapie », se réfèrent à n’importe quel acte qui a pour but d’améliorer l’état de santé d’un patient, tel que la thérapie, la prévention, la prophylaxie, et le retardement d’une maladie. Dans certains cas, ces termes se réfèrent à l’amélioration ou l’éradication d’une maladie ou des symptômes associés à la maladie. Dans d’autres modes de réalisation, ces termes se réfèrent à la réduction de la propagation ou l’aggravation de la maladie résultant de l’administration d’un ou plusieurs agents thérapeutiques à un sujet atteint d’une telle maladie. Dans le cadre du traitement de tumeurs, le terme « traitement » peut englober typiquement un traitement permettant l’arrêt de la croissance d’une tumeur, la réduction de la taille de la tumeur et/ou l’élimination de la tumeur.
[0119] En particulier, les nanoparticules sont utilisées pour le traitement des tumeurs solides, par exemple le cancer du cerveau (primaires et secondaires, le glioblastome...), les cancers hépatiques (primaires et secondaires), les tumeurs pelviennes (cancer du col de l’utérus, cancer de la prostate, cancer anorectal, cancer colorectal), les cancers des voies aérodigestives supérieures, le cancer des poumons, le cancer de l’œsophage, le cancer du sein, le cancer du pancréas.
[0120] Par « quantité efficace » de nanoparticules, il est fait référence à la quantité de nanoparticules telles que décrites précédemment qui administrée à un patient est suffisante pour être localisées dans la tumeur et permettre un traitement de la tumeur par la captation du cuivre et/ou du fer endogène, le cas échéant en combinaison avec un effet radiosensibilisant et un traitement de radiothérapie.
[0121] Cette quantité est déterminée et ajustée en fonction de facteurs tels que l’âge, le sexe et le poids du sujet.
[0122] L'administration des nanoparticules telles que décrites précédemment peut être réalisée par voie intratumorale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intradermique, intrapéritonéale, orale, sublinguale, rectale, vaginale, intranasale, par inhalation ou par application transdermique. De préférence, elle se fait par voie intratumorale et/ou intraveineuse.
[0123] Les méthodes d’irradiation pour le traitement de tumeurs après administration de nanoparticules en tant qu’agent radiosensibilisant sont bien connues de l’homme du métier et ont été décrites en particulier dans les publications suivantes : WO2018/224684, WO2019/008040 et C. Verry, et al, Science Advances, 2020, 6, eaay5279 ; et, C. Verry, et al, NANO-RAD, a phase I study protocol », BMJ Open, 2019, 9, e023591 .
[0124] La dose totale d’irradiation lors d’une radiothérapie sera ajustée selon le type de cancer, le stade et le sujet à traiter. Pour une dose curative, une dose totale typique pour une tumeur solide est de l’ordre de 20 à 120 Gy. D’autres facteurs peuvent être pris en compte tel qu’un traitement par chimiothérapie, une co-morbidité, et/ou le fait que la radiothérapie a lieu avant ou après une intervention chirurgicale. La dose totale est en général fractionnée. L’étape de radiothérapie dans le procédé selon la présente divulgation peut comprendre par exemple plusieurs fractions entre 2 et 6 Gy par jour, par exemple 5 jours par semaines, et notamment sur 2 à 8 semaines consécutives, la dose totale pouvant être entre 20 et 40 Gy, par exemple 30 Gy.
[0125] Les nanoparticules selon la présente divulgation peuvent être administrées seules, ou en combinaison avec un ou plusieurs autres principes actifs, et notamment d’autres médicaments tels que des agents cytotoxiques ou antiprolifératifs ou d’autres agents anti-cancéreux et notamment des inhibiteurs de checkpoint immunitaires. Par administration combinée, on entend une administration simultanée ou séquentielle (à des temps différents).
Exemples
Matériel et méthodes
[0126] Les produits CuPRiXx sont obtenus en introduisant le produit de départ AGulX®, fourni par la société Nh TherAguix (France), dans un milieu fortement acide obtenu à partir d’acide chloridrique 37% extra-pur provenant de chez Cari Roth.
[0127] Les étapes de filtration sont réalisées grâce à une pompe péristaltique et une cassette Vivaflow 200® - 5kDa de chez Sartorius Stedim Biotech (France) utilisé comme dans les conditions décrites dans la notice reliée au produit Vivaflow 200®.
[0128] La mesure du diamètre hydrodynamique ainsi que la titration du point isoélectrique sont effectuées avec un Zetasizer Nano-S (633 nmHe-Ne laser) de chez Malvern Instruments (USA). Pour la mesure du point isoélectrique, cet appareil est couplé à un titrateur automatique MPT-2 de chez Malvern Instruments (USA). [0129] L’HPLC-UV est réalisée avec une Agilent 1200 avec un détecteur DAD. La colonne phase inverse utilisée est une C4, 5 pm, 300 Â, 150 x 4,6 mm de chez Jupiter. La détection est opérée par un détecteur UV à une longueur d’onde de 295 nm. Le gradient des phases A (H2O/ACN/TFA : 98,9/1/0,1 ) et B (H2O/ACN/TFA : 10/89,9/0,1) est le suivant : 5 minutes à 95/5 suivi d’un gradient linéaire sur 10 min qui permet d’atteindre le ratio 10/90 qui est maintenu pendant 15 minutes. Au bout de ces 15 minutes le taux de A est repassé à 95% en 1 minute et est suivi d’un plateau 7 minute à 95/5. Les produits utilisés dans la composition des phases éluantes sont tous certifiés HPLC grade.
[0130] L’analyse élémentaire a été faite à l’institut des Sciences Analytiques, UMR 5280, Pole Isotopes & Organique, 5 rue de la Doua 69100 Villeurbanne.
[0131] L’HPLC-ICP/MS est réalisée avec Nexion 2000 de chez Perkin-Elmer (USA). La mesure des éléments libres dans le milieu est effectuée en mode isocratique avec une phase d’élution de la composition suivante : 95% A et 5% B. La composition des phases A et B est identique à la méthode HPL-UV. La colonne phase inverse utilisée est une C4, 5 pm, 300 Â, 150x4,6 mm de chez Jupiter. Les produits utilisés dans la composition des phases éluantes sont tous certifiés HPLC grade.
[0132] La lyophilisation des particules est réalisée par l’intermédiaire d’un lyophilisateur Alpha 2-4 LSC de chez Christ (Allemagne) en suivant le programme “dessiccation primaire”.
[0133] Les cellules A549 (ECACC 86012804) sont cultivées dans du milieu F12-K (Gibco™, Thermofischer) supplémenté avec 10% de Sérum de Veau Fœtal (Dutscher) et 1 % de pénicilline-streptomycine (Gibco™, Thermofischer). Pour chaque expérience, les cellules sont rincées 2 fois au PBS 1X (Gibco™, Thermofischer), incubées 5 minutes dans un incubateur à 37°C, 5% CO2 avec de la trypsine-EDTA, puis reprises dans du milieu complet.
[0134] Au minimum 1 h avant le test, les produits CuPRiX2o et CuPRiXso sont repris dans de l’eau distillée stérile à une concentration en DOTA libre égale à 10 mM (respectivement 30 mM et 16,7 mM de gadolinium) et conservé à 4°C. [0135] Pour le test de migration et d’invasion, les cellules A549 sont ensemencées (50,000 cellules/puits) dans des plaques 96-puits ImageLock (Essen BioScience) et incubées pendant 16h à 37°C et 5% de CO2 jusqu’à atteindre 90-100% de confluence. Le WoundMaker™ (Essen BioScience) est utilisé pour créer les blessures dans la monocouche cellulaire de chaque puit. Ensuite, chaque puit est rincé 2 fois au PBS 1X. Pour l’invasion, 50 pl de Matrigel (Corning) - préalablement dilué dans du milieu F12-K contenant ou non du CuPRiX2o - à une concentration finale de 1 mg/ml, sont ajoutés à chaque puit. La plaque est incubée 30 minutes à 37°C, pour permettre la polymérisation du Matrigel. Enfin, 100 pl de milieu contenant des concentrations croissantes de CuPRiX sont ajoutés dans chaque puit (contenant ou non du Matrigel). La plaque est placée dans l’Incucyte (objectif 10x) et les images du comblement des blessures sont acquises automatiquement toutes les 2h par le logiciel Zoom Incucyte (Essen BioScience) dans l’incubateur à CO2. Les données sont analysées par le logiciel et les résultats exprimés en pourcentage de confluence de blessures.
[0136] Pour le test de migration par chimiotactisme, les cellules A549 sont trypsinées, centrifugées puis remises en suspension avec du milieu appauvri (milieu F12-K sans SVF). Les cellules sont ensuite ensemencées (1000 cellules par puits, 40 pl par puits) dans l’insert IncuCyte® Clearview (Essen BioScience). Dans les puits correspondants, 20 pl de milieu appauvri contenant ou non du CuPRiX2o (500 pM de chélate libre) sont ajoutés. Enfin, 200 pl de milieu F-12K à 10 % de SVF contenant ou non du CuPRiX2o (500 pM de chélate libre) sont ajouté dans le compartiment inférieur de la chambre de chimiotaxie. Des images de chaque insert sont prises toutes les heures. La migration chimiotactique du réservoir supérieur vers le réservoir inférieur est quantifiée en tant que confluence de cellules sur le dessous de la membrane par rapport à la confluence initiale des cellules ensemencées sur le dessus de la membrane. Le calcul est effectué automatiquement avec le logiciel de microscopie IncuCyte ZOOM 2015A.
[0137] Pour le test de migration après irradiation, les cellules A549 sont cultivées dans des plaques de culture 96 puits ImageLock® (Essen BioScience) à 20 000 cellules par puits pendant une nuit à 37°C, 5% CO2. Les cellules sont traitées avec du milieu F-12K sans SVF contenant ou non du CuPRiX3o (5OO pM de chélate libre équivalent à 800 pM de gadolinium) pendant 24 h puis elles sont irradiées à 8 Gy (irradiateur X-Rad320, 250 kV, 15 mA). Après irradiation, la blessure est réalisée avec le 96-well WoundMaker™ (Essen BioScience). Les cellules sont rincées 2 fois avec du PBS 1X pour ôter les cellules flottantes et 100 pi de milieu contenant du CuPRiXso (0 et 500 pM de chélate libre équivalent à environ 0 et 800 pM de gadolinium) sont ajoutés dans chaque puit correspondant.
[0138] Pour évaluer la survie clonogénique les cellules sont ensemencées à 40 000 cellules/cm2, soit 1 millions de cellules dans une flasque de 25cm2 (Dutscher) et incubées sur la nuit à 37°C, 5 % de CO2. Les cellules sont traitées avec du milieu sans SVF contenant ou non du CuPRiXso (500 pM de chélate libre équivalent à 800 pM de gadolinium) pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été irradiées à différentes doses (0, 2, 3, 4, 6 et 8 Gy). Après l’irradiation, les cellules sont lavées au PBS 1X, trypsinées et comptées. Les cellules sont ensuite reensemencées dans des flasques de 25 cm2 et se développent pendant six divisions (7 jours) avant d'être fixées et colorées. Les colonies sont fixées avec une solution d’éthanol à 96% (VWR) pendant 30 minutes puis colorées avec une solution de Giemsa (Sigma-Aldrich) diluée au 1/20 pendant 30 minutes. Les flasques sont ensuite rincées, puis les colonies contenant 64 cellules ou plus ont été comptées numériquement à l’aide du compteur de colonies Colcount™ (Oxford Optronix). La survie clonogénique a été déterminée selon un modèle quadratique linéaire de la forme SF = e-(.aD+PD2) , où SF est la fraction survivante, et a et 0 représentent les probabilités de dommages létaux et sublétaux, respectivement.
[0139] La lignée 4T1 est une lignée cellulaire de cancer du sein dérivée de la glande mammaire d’une souche BALB/c de souris. Les cellules sont cultivées dans du milieu RPMI (Gibco™, Thermofischer) supplémenté avec 10 % de SVF et 1% de pénicilline- streptomycine.
[0140] La lignée de cancer des voies aérodigestives supérieures (VADS), SQ20B, est issue d’un cancer récurrent du larynx. La sous-population d’intérêt, SQ20B/CSCs (Stemcell like cancer cells), a été collectée après deux étapes successives de tri cellulaires (efflux de Hoechst et marquage CD44) réalisées par cytométrie en flux. Cette population présente une faible expression de l’EGFR et un phénotype mésenchymateux, associé à l’acquisition de propriétés migratoires et invasives. Ces cellules, SQ20B-CSCs sont cultivées dans du milieu DMEM:F12 (3:1 , v:v) supplémenté avec 5 % de SVF, 1 % PS, 0,04 mg/ml hydroctorisone et 20 ng/ml d’epidermal growth factor (EGF).
[0141] Le protocole de l’étude in vivo (2021021714569264) a été accepté par le comité d’éthique de l’université Claude Bernard Lyon 1. L’étude a été réalisée sur un modèle murin de cancer du sein triple négatif (lignée cellulaire 4T1). Des souris BALB/c femelles âgées de 7 semaines (Janvier Labs) ont été utilisées. Les cellules 4T1 (5 x 105, matrigel 50 :50) ont été injectées en sous-cutané dans le 4ème coussin mammaire sous anesthésie à isoflurane. Cette localisation a été choisie afin d’épargner les tissus vitaux lors du traitement par radiothérapie. Dix jours après transplantation, les souris ont été aléatoirement réparties en 2 groupes : le groupe NaCI (contrôle) (n = 4) et le groupe CuPRiX (n = 6). Les souris ont reçu 3 injections de 50 pl chacune par voie intraveineuse, espacées de 48 h, de NaCI 0,9 % (contrôle) ou CuPRiX (200 mg/kg). Les souris ont été pesées, leur état général évalué et les tumeurs mesurées 3 fois par semaine. Les souris ont été mise à mort 5 jours après la dernière injection et les métastases ont été quantifiées dans les organes cibles (poumons, foie).
[0142] La quantification des métastases a été réalisée selon le protocole de Pulaski et al (2000). Pour cela, après mise à mort des souris par dislocation cervicale sous anesthésie à isoflurane, les poumons et les foies sont prélevés. Les organes sont lavés avec de l’HBSS, découpés mécaniquement puis soumis à une digestion enzymatique par de la collagénase de type IV (2 mg/ml) associés à de la DNAse I (Roche) pour les poumons et par un cocktail collagénase de type I (2 mg/ml), BSA (1 mg/ml) et hyaluronidase (2 mg/ml) pour les foies. Cette digestion a lieu pendant 2 heures (poumons) et 40 minutes (foies) à 37°C sur une roue rotative. Les organes digérés sont ensuite filtrés à travers des filtres en nylon de 70 pm. Ils sont centrifugés à 1500 G pendant 5 minutes et lavés deux fois avec du HBSS. Les culots cellulaires sont remis en suspension dans du milieu RPMI à 60 pM de 6-thioguanine pour l’étude de la croissance clonogénique. Les suspensions sont remises en culture diluées au 1/6 pour les poumons et pures pour les foies dans des boites de pétri 10-cm. Après 8 jours, les cellules sont fixées à l’éthanol 96 % et colorées au Giemsa (dilué au 1/20 dans de l’eau distillée). Les clones sont ensuite comptés numériquement à l’aide du compteur de colonies Colcount™ (Oxford Optronix).
Exemple 1 : Acidification du milieu et relargage d’ion Gd3+
[0143] Afin d’obtenir une nanoparticule capable de complexer des ions cuivres tout en conservant ses propriétés d’agent radiosensibilisant, le produit AGulX® a été placé dans un milieu acide dans le but de protoner les groupements DOTA et ainsi libérer une partie des ions Gd3+ initialement complexé.
[0144] Premièrement, une solution d’AGulX® à 200 g/L a été préparée en dissolvant 10 g de produit dans 50 ml d’eau UltraPure. La solution a été laissée sous agitations à température ambiante pendant 1 h. En parallèle, une solution d’acide chlorhydrique 2M a été préparée en ajoutant 10 ml d’acide chlorhydrique 37% (Acide chlorhydrique 37%, extra-pur, 2,5 L, plastique, CarIRoth) à 50 ml d’eau UltraPure.
[0145] Après une heure d’agitation, 50 ml de la solution d’acide chlorhydrique 2M sont ajoutés aux 50 ml d’AGulX®. Le pH a été alors mesuré et est inférieur à 0,5. La solution obtenue est de couleur marron-orangé. L’ensemble est laissé dans une étuve préalablement chauffée à 50°C pendant 4 heures. Un prélèvement d’échantillon chaque heure a été effectué afin d’observer par HPLC-ICP/MS le relargage des ions gadolinium (Figure 1 ). On constate que le pic de Gd3+ libre dans le milieu au temps de rétention Tr = 2,3 min augmente avec le temps de réaction.
Exemple 2 : CuPRiX2o : 4h de réaction
[0146] Après 4h, la solution a été diluée par 10 avec de l’eau UltraPure. Le pH est alors mesuré et remonté à 1 ± 0,2 si nécessaire avec de la soude 1 M afin de ne pas détruire la membrane de filtration. Les 500 ml de solution ainsi obtenus ont été purifiés au moyen d’une pompe péristaltique et d’une cassette Sartorius Vivaflow 200 - 5kDa afin de séparer les particules des ions Gd3+ libérés pour éviter la recomplexation de ces ions.
[0147] Le volume initial de 500 ml est concentré à 50 ml et l’opération est répétée. Au total, l’opération dilution/concentration a été répétée 4 fois et le volume final est de 50 ml. A la suite de la purification, les 50 ml de solution ont été répartis dans des flacons contenant chacun 2 ml de solution. Les flacons sont placés à -80°C afin de congeler la solution puis lyophilisés pour obtenir notre produit final sous forme d’une poudre de couleur marron.
[0148] Une fois le produit obtenu, un flacon est retiré du lot pour faire les caractérisations du produit. Une solution de 1 ml à 100 g/L du nouveau produit est préparée en ajoutant de l’eau UltraPure. Après 1 heure en solution, le diamètre a été mesuré par notre appareil de DLS indiquant un diamètre de 4,4 nm ± 1 ,2 nm. Le chromatogramme HPLC-UV/Vis a été effectué et indique un temps de rétention de 11 min ± 0,1 min, identique aux particules d’origines. Le point isoélectrique du CuPRiX2o a aussi été mesuré et est égale à 6,29, supérieur au point isoélectrique de AGulX® égal à 7,15. Le gadolinium ayant des propriétés magnétiques la constante de relaxivité n de CuPRiX2o a été mesurée, et est égale à 18,9 mM’1.s’1 par atome de gadolinium.
Exemple 3 : Dosage du nombre de DOTAGA libres par chélation et fluorescence de l’europium
[0149] La quantité de chélates libres présente dans le CuPRiX2o peut être déterminée par chélation de l’europium suivie d’une étude de luminescence. L’europium présente en effet une luminescence principalement centrée autour de 590 (5D0 -> 7F1 ) et 615 nm (5D0 -> 7F2). Cette luminescence est éteinte en présence de molécules d’eau. Le principe du dosage est d’ajouter des quantités croissantes d’europium, tant que celui-ci est chélaté, la luminescence augmente, puis lorsque tous les sites de chélation sont remplis la luminescence atteint un plateau comme montré en Figure 2.
[0150] Pour réaliser le dosage, le CuPRiX2o a été placé dans un tampon acétate à pH 5, un sel de chlorure d’europium dissous dans le tampon acétate est ajouté. Une courbe de dosage est ensuite tracée en excitant à 396 nm et en relevant rémission à 590 nm. Ce dosage permet de remonter à une quantité de chélate de 0.16 pmol par mg de CuPRiX2o. Sachant qu’il y a une quantité nulle ou alors négligeable de gadolinium dans le produit initial AGulX® alors la quantité de gadolinium initiale est égale à la quantité de DOTA. La teneur initiale en gadolinium du produit de départ, mesurée par analyse élémentaire, était de 0,81 pmol par mg d’AGulX®.
[0151] Le produit CuPRiX2o présente donc 20% de ses groupements DOTA qui sont libres.
Exemple 4 : Chélation du cuivre
[0152] La présence de DOTA libres indique donc un potentiel d’application du CuPRiX2o comme possible agent chélateur dans le cadre d’une thérapie par chélation. Le potentiel complexant du CuPRiX2o a été déterminé par chélation du cuivre suivie d’une étude d’absorbance à l’aide de l’HPLC-UV/Vis. Le complexe DOTA@Cu présente une absorbance à 295 nm bien supérieur à celles du complexe DOTA@Gd, DOTA et des ions cuivre en solution. [0153] L’absorbance du CuPRiX2o augmentera à mesure que les groupements DOTA libres complexeront les ions cuivre disponibles, jusqu’à atteindre un plateau où l’ajout de cuivre supplémentaire n’entrainera pas d’augmentation de l’absorbance. Pour réaliser cette expérience une série d’échantillon a donc été préparée avec une quantité croissante de solution de chlorure de cuivre et une quantité constante de CuPRiX2o. Les volumes de tous les échantillons sont égalisés. Cette expérience permet de remonter à une quantité de cuivre complexable de 0.18 pmol par mg de CuPRiX2o. Une expérience identique menée sur le produit de départ AGulX® indique la forte augmentation du potentiel chélateur de CuPRiX2o (Figure 3).
Exemple 5 : CuPRiX3o : 5h de réaction
[0154] Le taux de DOTA libre est modulable en fonction du temps de réaction d’AGulX en milieu acide. Après 5h, la solution a été diluée par 10 avec de l’eau UltraPure. Le pH est alors mesuré et remonté à 1 ± 0,2 si nécessaire avec de la soude 1 M afin de ne pas détruire la membrane de filtration. Les 500 ml de solution ainsi obtenus sont purifiés au moyen d’une pompe péristaltique et d’une cassette Sartorius Vivaflow 200 - 5kDa afin de séparer les particules des ion Gd3+ libérés pour éviter la recomplexation de ces ions Le volume initial de 500 ml est concentré à 50 et l’opération est répété.
[0155] Au total, l’opération dilution/concentration a été répétée 4 fois et le volume final est de 50 ml. A la suite de la purification, les 50 ml de solution sont répartis dans des flacons contenant chacun 2 ml de solution. Les flacons sont placés à - 80°C afin de congeler la solution puis lyophilisé pour obtenir notre produit final CuPRiXso sous forme d’une poudre de couleur marron. Une fois le produit obtenu, un flacon a été retiré du lot pour faire les caractérisations du produit.
[0156] Une solution de 1 ml à 100 g/L du nouveau produit a été préparé en ajoutant de l’eau UltraPure. Après 1 heure en solution le diamètre a été mesuré par notre appareil de DLS indiquant un diamètre de 5,7 nm ± 1 nm. Le chromatogramme HPLC-UV/Vis a été effectué et indique un temps de rétention de 10,8 min ± 0,1 min, identique aux particules d’origines. Exemple 6 : CuPRiX3o : amélioration du potentiel complexant par rapport à CuPRiX2o
[0157] La présence de Dota libre indique donc un potentiel d’application du CuPRiXso comme possible agent chélateur dans le cadre d’une thérapie par chélation. Le potentiel complexant du CuPRiX2o a été déterminé par chélation du cuivre suivie d’une étude d’absorbance à l’aide de l’HPLC-UV/Vis. Le complexe DOTA@Cu présente une absorbance à 295 nm bien supérieur à celles de du complexe DOTA@Gd, DOTA et des ions cuivre en solution. L’absorbance du produit augmentera à mesure que les groupements DOTA libres complexeront les ions cuivre disponibles, jusqu’à atteindre un plateau ou l’ajout de cuivre supplémentaire n’entrainera pas d’augmentation de l’absorbance.
[0158] Pour réaliser cette expérience une série d’échantillon a donc été préparée avec une quantité croissante de solution de chlorure de cuivre et une quantité constante de CuPRiX2o. Les volumes de tous les échantillons sont égalisés. Cette expérience permet de remonter à une quantité de cuivre complexable de 0.24 pmol par mg de CuPRiXso. Le produit CuPRiXso présente donc 30% de ses groupements DOTA qui sont libres.
Exemple 7 : Analyse de l’effet du CuPRiX20 sur la motilité de cellules A549
[0159] La migration cellulaire est un processus en plusieurs étapes qui est une composante fondamentale de nombreux processus biologiques et pathologiques parmi lesquelles les métastases tumorales. In vitro, le test de blessure est basé sur la formation d’une blessure sur un tapis cellulaire et de l’étude de la motilité cellulaire, c’est-à-dire la capacité des cellules à se déplacer sur une surface en réponse à un changement de densité, pour refermer la blessure. C’est une mesure directe de la motilité des cellules sur un substrat solide en 2D.
[0160] L’objectif de cet exemple a été de montrer la capacité du CuPRiX2o à réduire la motilité cellulaire. Les cellules A549 ont été cultivées dans du milieu F12-K (Gibco) contenant 8 nM de CuSO4-5H2O. Après avoir été cultivées pendant 72 h avec ou sans CuPRiX2o (500 pM de chélate libre), les cellules ont été trypsinées puis ensemencées à 40 000 cellules par puit dans une plaque de culture 96 puits ImageLock® (Essen BioScience). La plaque a été placée pendant une nuit à 37°C, 5% CO2. La blessure a ensuite été réalisée avec l’IncuCyte® WoundMaker (Essen BioScience). Les cellules ont été rincées 2 fois avec du PBS pour ôter les cellules flottantes puis traitées avec 100 pl de milieu contenant des concentrations croissantes de CuPRiX2o (0, 50, 100, 200, 300, 400, 500 et 1000 pM de chélate libre équivalent à environ 0, 150, 300, 600, 900, 1200, 1500 et 3000 pM de gadolinium).
[0161] Les images du comblement des blessures ont été acquises automatiquement toutes les 2 h pendant 72 h par le logiciel Zoom Incucyte (Essen BioScience) dans l’incubateur à CO2. Les données ont été analysées par le logiciel et les résultats exprimés en pourcentage de confluence de la blessure. Les résultats obtenus ont permis de mettre en évidence un ralentissement de la motilité cellulaire des A549 dû au traitement par le CuPRiX20 à des concentrations différentes (Figure 4, Figure 5 et Figure 6)
Exemple 8 : Comparaison de l’effet du CuPRiX20 et du CuPRiX30 sur la motilité de cellules A549
[0162] L’objectif de cet exemple est de montrer la capacité des CuPRiX20 et CuPRiX30 à réduire la motilité cellulaire et de comparer leurs effets. Les cellules A549 ont été cultivées dans des plaques de culture 96 puits ImageLock® (Essen BioScience) à 40 000 cellules par puits pendant une nuit à 37°C, 5% CO2. Le test de blessure a été réalisé avec le 96-puits IncuCyte® WoundMaker (Essen BioScience). Les cellules ont été rincées 2 fois avec du PBS pour ôter les cellules flottantes et ont ensuite été traitées avec 100 pl de milieu contenant du CuPRiX20 (0, 125, 250 et 500 pM de chélate libre équivalent à environ 0, 375, 750 et 1500 pM de gadolinium) ou du CuPRiX30 (0, 125, 250 et 500 pM de chélate libre équivalent à environ 0, 200, 400 et 800 pM de gadolinium.
[0163] Les images du comblement des blessures ont été acquises automatiquement toutes les 2h par le logiciel Zoom Incucyte (Essen BioScience) dans l’incubateur à CO2. Les données ont été analysées par le logiciel et les résultats exprimés en pourcentage de confluence de blessures.
[0164] Les résultats obtenus ont permis de montrer qu’à concentration de chélate libre constante, l’effet des deux types de CuPRiX est équivalent. Exemple 9 : Analyse de l’effet du CuPRiX20 sur l’invasion de cellules A549
[0165] L’invasion cellulaire est l’une des caractéristiques du cancer. Elle est liée à la migration cellulaire et joue un rôle clé dans le développement de métastases. La capacité des cellules tumorales à former des métastases est principalement déterminée par la capacité de la cellule à changer et à réorganiser sa morphologie cellulaire ainsi qu’à dégrader la matrice extracellulaire (MEC). In vitro, les tests d’invasion sont basés sur l’approche du test de blessure mais comprennent l’ajout d’une matrice de gel mimant la MEC. L’ajout de la matrice 3D exige que les cellules dégradent cette matrice pour se déplacer.
[0166] L’objectif de cet exemple est de montrer la capacité du CuPRiX2o à réduire l’invasion cellulaire - i.e. la capacité des cellules à décomposer une matrice extracellulaire et à se déplacer. Les cellules A549 ont été cultivées dans des plaques de culture 96 puits ImageLock® à 40 000 cellules par puit pendant une nuit à 37°C, 5% CO2. La blessure a ensuite été réalisée avec l’IncuCyte® WoundMaker (Essen BioScience) puis les cellules ont été rincées 2 fois avec du PBS. 50 pl de Matrigel (corning) - préalablement dilué dans du milieu F12-K contenant ou non du CuPRiX2o - à une concentration finale de 1 mg/ml, ont été ajouté à chaque puits. La plaque a été incubée 30 minutes à 37°C, pour permettre la polymérisation du Matrigel. Enfin, 100 pl de milieu contenant ou non du CuPRiX2o (0 et 500 pM de chélate libre) ont été ajouté. Les images du comblement des blessures ont été acquises automatiquement toutes les 2 h pendant 72 h par le logiciel Zoom Incucyte (Essen BioScience) dans l’incubateur à CO2. Les données ont été analysées par le logiciel Zoom Incucyte (Essen BioScience) et les résultats exprimés en pourcentage de confluence de la blessure. Les résultats obtenus ont permis de mettre en évidence un ralentissement de l’invasion cellulaire des A549 dû au traitement par CuPRiX2o (Figure 7).
Exemple 10 : Effet du CuPRiX20 sur la migration par chimiotactisme des cellules A549
[0167] La migration par chimiotactisme est le mouvement directionnel des cellules en réponse à un stimulus. Ce test consiste en un insert de culture placé au sein d’un puits de plaque de culture cellulaire. Les cellules sont ensemencées dans l’insert - qui contient une membrane avec une taille de pores définie - avec du milieu sans sérum pour les affamer. Le milieu chimio-attractant est placé dans le puits en dessous. Dû à ce gradient chimique, les cellules capables de migrer sont attirées par le milieu chimio-attractant et passent à travers les pores. L’objectif de cet exemple est de montrer la capacité du CuPRiX20 à réduire la mobilité cellulaire par un test de chimiotactisme. Pour cela, le module de chimiotaxie IncuCyte ZOOM a été utilisé. Les cellules A549 (1 000 cellules/puits) ont été remises en suspension dans du milieu F-12K contenant 0% de SVF et ont été ensemencées dans le compartiment supérieur d’une plaque 96-puits Cell Migration Incucyte ClearView avec des pores de 8 pm (40 pl/puits). Dans les puits adéquats, 20 pl de milieu F12-K sans SVF contenant ou non du CuPRiX20 (500 pM de chélate libre final) ont été ajouté. Enfin, 200 pl de milieu F-12K à 10 % de SVF contenant ou non du CuPRiX20 (500 pM de chélate libre) ont été ajoutés dans le compartiment inférieur de la chambre de chimiotaxie. Des images de chaque insert ont été prises toutes les heures. La migration chimiotactique du réservoir supérieur vers le réservoir inférieur a été quantifié en tant que confluence de cellules sur le dessous de la membrane par rapport à la confluence initiale des cellules ensemencées sur le dessus de la membrane. Le calcul a été effectué automatiquement avec le logiciel de microscopie IncuCyte ZOOM 2015A.
[0168] Les résultats obtenus ont permis de mettre en évidence une forte diminution de la migration par chimiotactisme des cellules par CuPRiX20 (Figure 8).
Exemple 11 : Effet de l’association du CuPRiX30 à une irradiation photonique sur la motilité de cellules A549
[0169] L’objectif de cet exemple est de montrer la capacité du CuPRiX30 à réduire la motilité cellulaire après une irradiation photonique. Les cellules A549 ont été cultivées dans des plaques de culture 96 puits ImageLock® à 20 000 cellules par puits pendant une nuit à 37°C, 5% CO2. Les cellules ont été incubées avec du milieu F-12K sans SVF contenant ou non du CuPRiX30 (500 pM de chélate libre équivalent à 800 pM de gadolinium) pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été irradiées à 8 Gy (irradiateur X-Rad320, 250 kV) puis la blessure a été réalisée. Les cellules ont été rincées 2 fois avec du PBS pour ôter les cellules flottantes et 100 pl de milieu contenant du CuPRiX30 (0 et 500 pM de chélate libre équivalent à environ 0 et 800 pM de gadolinium) ont été ajoutés dans chaque puit correspondant.
[0170] Les images du comblement des blessures ont été acquises automatiquement toutes les 2h par le logiciel Zoom Incucyte dans l’incubateur à CO2. Les données ont été analysées par le logiciel et les résultats exprimés en pourcentage de confluence de blessures. Les résultats obtenus ont permis de montrer une efficacité supérieure (effet additif) de l’association CuPRiX30/irradiation pour limiter la motilité en comparaison d’un traitement par irradiation seul ou par CuPRiX30 seul (Figure 9).
Exemple 12 : Effet de l’association du CuPRiX30 à une irradiation photonique sur la survie cellulaire de cellules A549
[0171] Les cellules A549 ont été ensemencées à 40 000 cellules/cm2, soit 1 millions de cellules dans une flasque T25cm2 et incubées sur la nuit à 37°C, 5 % de CO2. Les cellules ont été traitées avec du milieu F-12K sans SVF contenant ou non du CuPRiX30 (500 pM de chélate libre équivalent à 800 pM de gadolinium) pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été irradiées à différentes doses (0, 2, 3, 4, 6 et 8 Gy). Après l’irradiation, les cellules ont été lavées au PBS, trypsinées et comptées. Les cellules ont ensuite été réensemencées dans des flasques de 25 cm2 et ont pu se développer pendant six divisions (7 jours) avant d'être fixées et colorées. Les colonies contenant 64 cellules ou plus ont été comptées numériquement. La survie clonogénique a été déterminée selon un modèle quadratique linéaire de la forme SF = e-(-aD+PD2) , où SF est la fraction survivante, et a et p représentent les probabilités de dommages létaux et sublétaux, respectivement. Les résultats obtenus montrent une diminution de la survie cellulaire après irradiation en présence de CuPRiXso (Figure 10).
Exemple 13 : Effet de l’association de CuPRiXso à une irradiation photonique sur la survie cellulaire des cellules A549, SQ20B-CD44+ et 4T1.
[0172] Pour chaque lignée cellulaire, les cellules ont été ensemencées à 40 000 cellules/cm2, soit 1 million de cellules dans une flasque de 25 cm2 et incubées sur la nuit à 37°C, 5 % de CO2. Le milieu est ensuite ôté et remplacé par du milieu sans SVF seul, contenant du CuPRiXso (500 pM de chélate libre équivalent à 800 pM de gadolinium) ou du AGulX® (800 pM de gadolinium) pendant 24 h. Les cellules sont ensuite irradiées à différentes doses (0, 2, 3, 4 et 6 Gy). Après l’irradiation, les cellules sont lavées au PBS, trypsinées et comptées. Elles sont ensuite réensemencées dans des flasques de 25 cm2 et peuvent se développer pendant six divisions (7 jours) avant d'être fixées avec de l’éthanol à 96% et colorées au Giemsa. Les colonies contenant 64 cellules ou plus sont comptées numériquement. La survie clonogénique a été déterminée selon un modèle quadratique linéaire de la forme SF = e-(-aD+PD2) , où SF est la fraction survivante, et a et p représentent les probabilités de dommages létaux et sublétaux, respectivement. Pour les 3 lignées cellulaires, les résultats obtenus montrent une diminution de la survie cellulaire après irradiation après traitement par AGulX et CuPRiXso. Dans le cas des lignées A549 et SQ20B-CD44+, l’efficacité de CuPRiXso semble égale à celle de AGulX, tandis qu’elle est supérieure aux AGulX dans le cas de la lignée 4T 1 (Figure 11 ).
Exemple 14 : Efficacité de CuPRiXso sur la croissance tumorale et la formation de métastases dans un modèle murin de cancer du sein métastatique
[0173] L’objectif de cet exemple est de montrer la capacité du CuPRiXso à ralentir la croissance tumorale et à diminuer la formation de métastases. Pour cela, 10 souris femelles BALB/c âgées de 8 semaines ont reçu une injection sous-cutanée de 50 000 cellules 4T1 (cellules de cancer du sein triple négatif, 50:50, PBS:matrigel). Dix jours après (J10), lorsque les tumeurs ont atteint 100 mm3 en moyenne, les souris ont reçu une première injection de 50 pl de CuPRiXso (200 mg/kg, n=6) ou de NaCI (0,9%, n=4) par voie intraveineuse. Deux nouvelles injections ont été administrées 48 h (J12) et 96 h (J14) après la première. Dix-neuf jours après l’inoculation des tumeurs, soit 5 jours après la dernière injection, les souris ont été mises à mort par dislocation cervicale sous anesthésie à isoflurane et les organes pouvant présenter des métastases (poumons et foie) ont été prélevés. [0174] Pour la quantification des métastases, les poumons et foies ont été dissociés mécaniquement puis ont subi une digestion enzymatique avant d’être filtrés. Les suspensions cellulaires sont ensuite mises en culture pures (foies) ou diluées (poumons) dans du milieu de culture à 60 pM de 6-thioguanine (agent de sélection des cellules 4T1 ), et incubées à 37°C dans un incubateur à CO2. Huit jours après, les cellules sont fixées, colorées et les colonies sont comptées automatiquement, les résultats sont répertoriés dans le tableau 1 .
[0175] [Tableau 1] : Nombre de colonies clonogéniques métastatiques 19 jours après inoculation des cellules tumorales
Figure imgf000043_0001
[0176] Les résultats obtenus montrent un ralentissement de la croissance tumoral ainsi qu’une diminution du nombre de métastases aux poumons après traitement des souris par CuPRiXso. Les 4 souris du groupe contrôle présentaient des métastases aux poumons tandis que 2 souris sur les 6 traitées par CuPRiX n’en présentaient aucune. Aucune métastase au foie n’a été observé dans les deux conditions (figure 12).
Exemple 15 : Efficacité de l’association CuPRiX30 et radiothérapie sur la croissance tumorale et la survie dans un modèle murin de cancer du sein métastatique
[0177] L’objectif de cet exemple est de montrer la capacité du CuPRiXso à augmenter l’efficacité d’une radiothérapie sur la croissance tumorale et la survie. Pour cela, 42 souris femelles BALB/c âgées de 8 semaines ont reçu une injection sous-cutanée de 50 000 cellules 4T1 (cellules de cancer du sein triple négatif, 50:50, PBS:matrigel). Dix jours après la greffe tumorale, les souris ont été réparties aléatoirement en 4 groupes pour recevoir les traitements : le groupe NaCI (contrôle, n = 12), le groupe CuPRiX (n = 10), le groupe NaCI + radiothérapie (RT, n = 9) et le groupe CuPRiX + RT (n = 11 ).
[0178] Les souris ont reçu au total 3 injections de 50 pl de CuPRiX (200 mg/ml) ou NaCI (0,9 %) espacées de 48 h associées à une radiothérapie fractionnée de 5 x 2 Gy (2 Gy par jour pendant 5 jours) (Figure 13). Les irradiations ont eu lieu 1 heure après administration du traitement, sous anesthésie à isoflurane.
[0179] Pour suivre l’évolution tumorale et établir des courbes de survie de Kaplan- Meier, les souris ont été pesées et les tumeurs mesurées 6 fois par semaine. À la fin de la séquence thérapeutique, les souris ayant atteint un des points limites suivant : perte de 15 % de son poids ; volume tumoral > 1000 mm3 ; ulcération persistante ; observation de signes de détresse (prostration, poil non lisse, dos voûté) pendant 2 jours consécutifs ; ont été mises à mort.
[0180] L’évolution du volume tumoral a été calculé comme suit : (Volume tumoral au temps t)/(Volume tumoral au temps de référence) avec le temps de référence correspondant au premier jour du traitement soit J10. Les résultats obtenus montrent une diminution de la croissance tumorale plus importante après la combinaison de traitement CuPRiX + RT par rapport à un traitement par RT seule ou CuPRiX seul. L’association de CuPRiX avec la RT a également permis de prolonger la survie des animaux comparé la RT seule (figure 14).
Application industrielle
[0181] Les présentes solutions techniques peuvent trouver à s’appliquer notamment dans le domaine de la médecine, en particulier pour le traitement de tumeurs.
[0182] La présente divulgation ne se limite pas aux exemples décrits ci-avant, seulement à titre d’exemple, mais elle englobe toutes les variantes que pourra envisager l’homme de l’art dans le cadre de la protection recherchée.

Claims

44 Revendications
[Revendication 1] Nanoparticule de formule suivante : [Ch1]n-PS-[Ch2]m dans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Ch1 est un groupement chélatant non complexé ou complexé avec un cation métallique M1 ,
- M1 est absent ou choisi parmi les cations métalliques dont la constante de complexation avec Ch1 est inférieure à celle du cuivre, en particulier au moins dix fois inférieure, par exemple M1 est choisi parmi le zinc ou les alcalino-terreux, notamment le calcium ou le magnésium,
- Ch2 est un groupement chélatant, identique ou différent du groupement chélatant Ch1 , et complexé à un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50, caractérisée en ce que
(i) les agents chélateurs Ch1 et Ch2 sont greffés sur la matrice de polymères,
(ii) le ratio n/(n+m) est compris entre 10% et 100% et,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm.
[Revendication 2] Nanoparticule selon la revendication 1 , caractérisée en ce que au moins 50% des Ch1 est complexé avec le zinc, le calcium ou le magnésium.
[Revendication 3] Nanoparticule selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le groupement chélatant Ch1 , et le cas échéant Ch2, est choisi parmi les agents macrocycliques, de préférence parmi l’acide 1 ,4,7-triazacyclononanetriacétique (NOTA), 1 ,4,7,10- tetraazacyclododecane-1 ,4,7,10-tetraacétique (DOTA), l’acide 1 ,4,7- triazacyclononane-1-glutarique-4,7-acide diacetique (NODAGA), et l’acide
1 .4.7.10-tetraazacyclododececane,1 -(glutaric acid)-4,7,10- acide triacetique (DOTAGA), 2,2’,2”,2’”-(1 ,4,7,10-tetraazacyclododecane-1 ,4,7,10- tetrayl)tetraacetamide (DOTAM), et 1 ,4,8,11 -tetraazacyclotetradecan (Cyclam),
1 .4.7.10-tetraazacyclododecane (Cyclen), le déferoxamine (DFO). 45
[Revendication 4] Nanoparticule selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le cation métallique M2 est choisi parmi des agents de radiosensibilisant et/ou des agents de contraste pour l’imagerie par résonnance magnétique, en particulier le gadolinium ou le bismuth.
[Revendication 5] Nanoparticule selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que
(i) PS est une matrice de polysiloxane,
(ii) Ch1 et Ch2 sont des groupements chélatants DOTAGA de formule (I) suivante
Figure imgf000046_0001
et greffés a la matrice de polysiloxane par liaison Si-C,
(iii) M1 est absent et M2 est le cation gadolinium Gd3+,
(iv) n+m est compris entre 5 et 50, de préférence entre 10 et 30, et
(iv) le diamètre hydrodynamique moyen est compris entre 2 et 8 nm.
[Revendication 6] Solution colloïdale de nanoparticules selon l’une quelconque des revendications 1 à 5.
[Revendication 7] Composition pharmaceutique comprenant une solution colloïdale de nanoparticules selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, et un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
[Revendication 8] Composition pharmaceutique selon la revendication 7, caractérisée en ce qu’il s’agit d’une composition injectable pour une administration intraveineuse, intratumorale ou intrapulmonaire chez un sujet, en particulier comprenant une quantité efficace de groupement chélatant Ch1 pour la captation in vivo du cuivre dans une tumeur, le chélatant libre étant par exemple à une concentration d’au moins 10 mM dans la composition. 46
[Revendication 9] Composition pharmaceutique selon l’une des revendications 7 ou 8, pour son utilisation dans le traitement du cancer chez un sujet, en particulier pour la captation in vivo du cuivre et/ou du fer dans une tumeur.
[Revendication 10] Composition pharmaceutique, pour son utilisation selon la revendication 9, caractérisée en que ladite composition comprends une quantité efficace de cation métallique M2, de préférence du gadolinium, pour une utilisation en tant qu’agent radiosensibilisant et en ce que le sujet est traité par radiothérapie après administration de ladite composition.
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5208324A (en) * 1988-01-26 1993-05-04 Nycomed Imaging As Paramagnetic compounds
WO2005088314A1 (fr) 2004-03-02 2005-09-22 Universite Claude Bernard Lyon I Nanoparticules hybrides comprenant un coeur de ln2o3 porteuses de ligands biologiques et leur procede de preparation
WO2009053644A2 (fr) 2007-10-16 2009-04-30 Universite Claude Bernard Lyon I Utilisation de nanoparticules a base de lanthanides comme agents radiosensibilisants
WO2011135101A2 (fr) 2010-04-30 2011-11-03 Nanoh Nanoparticules ultrafines a matrice polyorganosiloxane fonctionnalisee et incluant des complexes metalliques; leur procede d'obtention et leurs applications en imagerie medicale et/ou therapie
WO2018224684A2 (fr) 2017-06-09 2018-12-13 Nh Theraguix Procédé de synthèse de nanoparticules de silice
WO2019008040A1 (fr) 2017-07-05 2019-01-10 Nh Theraguix Méthodes de traitement de tumeurs
WO2019073182A1 (fr) * 2017-10-13 2019-04-18 Nh Theraguix Nanovecteurs et utilisations
WO2019122790A1 (fr) * 2017-12-22 2019-06-27 Mexbrain Dispositif pour le maintien de l'homeostasie metallique, et ses utilisations

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5208324A (en) * 1988-01-26 1993-05-04 Nycomed Imaging As Paramagnetic compounds
WO2005088314A1 (fr) 2004-03-02 2005-09-22 Universite Claude Bernard Lyon I Nanoparticules hybrides comprenant un coeur de ln2o3 porteuses de ligands biologiques et leur procede de preparation
WO2009053644A2 (fr) 2007-10-16 2009-04-30 Universite Claude Bernard Lyon I Utilisation de nanoparticules a base de lanthanides comme agents radiosensibilisants
WO2011135101A2 (fr) 2010-04-30 2011-11-03 Nanoh Nanoparticules ultrafines a matrice polyorganosiloxane fonctionnalisee et incluant des complexes metalliques; leur procede d'obtention et leurs applications en imagerie medicale et/ou therapie
WO2018224684A2 (fr) 2017-06-09 2018-12-13 Nh Theraguix Procédé de synthèse de nanoparticules de silice
WO2019008040A1 (fr) 2017-07-05 2019-01-10 Nh Theraguix Méthodes de traitement de tumeurs
WO2019073182A1 (fr) * 2017-10-13 2019-04-18 Nh Theraguix Nanovecteurs et utilisations
WO2019122790A1 (fr) * 2017-12-22 2019-06-27 Mexbrain Dispositif pour le maintien de l'homeostasie metallique, et ses utilisations

Non-Patent Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AINSI J. PERRING ET AL., JOURNAL OF MATERIALS SCIENCE : MATERIALS IN MEDICINE, vol. 29, no. 181, 2018
ALVAREZ HMXUE YROBINSON CDCANALIZO-HERNÂNDEZ MAMARVIN RGKELLY RAMONDRAGÔN APENNER-HAHN JEO'HALLORAN T V., TETRATHIOMOLYBDATE INHIBITS COPPER TRAFFICKING PROTEINS THROUGH METAL CLUSTER FORMATION SCIENCE, vol. 327, no. 5963, 2010, pages 331 - 334
ANNA MIGNOT ET AL: "A Top-Down Synthesis Route to Ultrasmall Multifunctional Gd-Based Silica Nanoparticles for Theranostic Applications", CHEMISTRY - A EUROPEAN JOURNAL, vol. 19, no. 19, 3 May 2013 (2013-05-03), pages 6122 - 6136, XP055283579, ISSN: 0947-6539, DOI: 10.1002/chem.201203003 *
BOUZIOTIS PENELOPE ET AL: "68 Ga-radiolabeled AGuIX nanoparticles as dual-modality imaging agents for PET/MRI-guided radiation therapy", vol. 12, no. 13, 1 July 2017 (2017-07-01), GB, pages 1561 - 1574, XP055830220, ISSN: 1743-5889, Retrieved from the Internet <URL:https://www.futuremedicine.com/doi/pdfplus/10.2217/nnm-2017-0032> DOI: 10.2217/nnm-2017-0032 *
C. VERRY ET AL., SCIENCE ADVANCES, vol. 6, 2020
C. VERRY ET AL.: "NANO-RAD, a phase I study protocol", BMJ OPEN, vol. 9, 2019
FENG QZHANG WLI YYANG XHAO YZHANG HLI WHOU LZHANG Z: "An intelligent NIR-responsive chelate copper-based anticancer nanoplatform for synergistic tumor targeted chemo-phototherapy", NANOSCALE, vol. 9, no. 40, 2017, pages 15685 - 15695, Retrieved from the Internet <URL:https://doi.org/10.1039/c7nr05003h>
G.T HERMANSON: "Bioconjugate Techniques", 1996, ACADEMIC PRESS
GAUR ET AL., INORGANICS, vol. 6, no. 126, 2018
LANG ET AL., ACS NANO, vol. 13, 2019, pages 2176 - 2189
M. THEERASILP ET AL., RSC ADVANCES, vol. 7, no. 11158, 2017
MIGNOT ANNA: "Supporting Information A Top-Down Synthesis Route to Ultrasmall Multifunctional Gd-Based Silica Nanoparticles for Theranostic Applications", 3 May 2013 (2013-05-03), pages 1 - 6, XP055892147, Retrieved from the Internet <URL:https://chemistry-europe.onlinelibrary.wiley.com/action/downloadSupplement?doi=10.1002/chem.201203003&file=chem_201203003_sm_miscellaneous_information.pdf> [retrieved on 20220215] *
MIGNOT ET AL.: "A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica nanoparticles for theranostic applications", CHEM EUR J, 2013
W.T. MASON: "Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity", 1999, ACADEMIC PRESS
WANG ET AL., IRON AND LEUKEMIA, vol. 38, no. 406, 2019
WU WYU LJIANG QHUO MLIN HWANG LCHEN YSHI J: "Enhanced Tumor-Specific Disulfiram Chemotherapy by in Situ Cu2+ Chelation-Initiated Nontoxicity-to-Toxicity Transition", J AM CHEM SOC, vol. 141, no. 29, 2019, pages 11531 - 11539, Retrieved from the Internet <URL:https:l/doi.orQ/10.1021/iacs.9b03503>
ZHOU PING ET AL: "Multifunctional nanoparticles based on a polymeric copper chelator for combination treatment of metastatic breast cancer", BIOMATERIALS, vol. 195, 1 March 2019 (2019-03-01), AMSTERDAM, NL, pages 86 - 99, XP055830230, ISSN: 0142-9612, DOI: 10.1016/j.biomaterials.2019.01.007 *
ZHOU PQIN JZHOU CWAN GLIU YZHANG MYANG XZHANG NWANG Y, MULTIFUNCTIONAL NANOPARTICLES BASED ON A POLYMERIC COPPER CHELATOR FOR COMBINATION TREATMENT OF METASTATIC BREAST CANCER BIOMATERIALS, vol. 195, 2019, pages 86 - 99, Retrieved from the Internet <URL:https://d0i.0rg/l0.1016/i.biomaterials.2019.01.0071>

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