WO2022207736A1 - Formulation pour la délivrance d'arn messager - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne une formulation sous forme de nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase dispersée sous forme de nanoparticules lipidiques dans laquelle au moins un ARN messager est complexé à la surface des nanoparticules lipidiques, son procédé de préparation et ses utilisations pour la prévention et/ou le traitement d'une maladie.
Description
TITRE : Formulation pour la délivrance d’ARN messager
La présente invention concerne une formulation de type nanoémulsion utile pour la délivrance d’ARN messager (ARNm).
L'acide ribonucléique messager, ARN messager ou ARNm, est une copie transitoire d'une portion de l'ADN correspondant à un ou plusieurs gènes et codant des protéines.
L'ARNm est utilisé comme intermédiaire par les cellules pour la synthèse des protéines.
L'ARNm est une copie simple brin linéaire de l'ADN et est composé d'ARN, qui comprend la région codant une protéine encadrée de régions non codantes. On distingue trois principales régions fonctionnelles dans un ARNm : la région 5' non traduite (5'-UTR), le ou les cistrons codants (région ORF) et enfin la région 3' non traduite (3'-UTR). Les deux régions non traduites ou régions UTR (de l'anglais « untranslated régions ») contiennent souvent des signaux d'expression ou de maturation de l'ARN. L’ARNm contient en outre une coiffe en 5' et une queue poly(A) en 3’, qui permettent une traduction de l’ARNm en protéine efficace. L'information portée par la région ORF de l'ARNm est constituée d'une série de codons, des triplets de nucléotides consécutifs qui codent chacun un acide aminé de la protéine correspondante.
Le développement de médicaments ou vaccins basés sur des ARNm est recherché, afin d’exprimer une protéine d’intérêt dans une cellule hôte. Une fois dans le cytoplasme de la cellule hôte, l’ARNm est lu par le ribosome et traduit en une protéine qui possède l’activité thérapeutique recherchée.
Le pré-requis est donc que l’ARNm parvienne au cytoplasme.
Il y a deux obstacles majeurs au développement de vaccins ou thérapies à base de ARNm: leur instabilité in vivo, en particulier à cause de leur dégradation pour les RNase, et leur instabilité lors de leur stockage, ce qui freine le développement de vaccin à ARNm. Augmenter la concentration en ARNm pour compenser l’ARNm dégradé n’est pas une solution envisageable, puisque le vaccin deviendrait alors beaucoup trop cher.
Les systèmes de délivrance utilisés incluent les nanoparticules lipidiques (LNP) ou les liposomes, permettant de protéger l’ARNm en l’encapsulant au sein d’une nanoparticule ou d’un vésicule lipidique. L’encapsulation de l’ARNm au cœur d’une LNP permet avantageusement de le protéger de la dégradation par des nucléases. La revue Guevara et al. Frontiers in Chemistry 2020, 8, 589959 rapporte l’utilisation de LNP dans lesquelles
l’ARNm est encapsulé comme véhicule pour la délivrance d’ARNm et son utilisation pour le traitement du cancer.
La littérature décrit quelques systèmes de délivrance basés sur l’utilisation de LNP à la surface desquelles sont complexées des séquences nucléotidiques. Ainsi, la demande WO 2014/032953 décrit une formulation sous forme de nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase dispersée, et comprenant un lipide amphiphile, un tensioactif cationique, un co-tensioactif, un lipide solubilisant, et une séquence nucléotidique susceptible de moduler les mécanismes d’interférence. Cette séquence nucléotidique est courte, puisqu’elle comprend moins de 200 bases pour une séquence nucléotidique mono brin ou moins de 200 paires de base pour une séquence nucléotidique double brin. Il s’agit de préférence de microARN ou SiARN. Dans les exemples, du siARN GFP-22 siRNA rhodamine, du siGFP ou du microARN miRIDIAN Mimic Fluman has-miR612 ont été utilisés. Ainsi, cette demande ne montre la faisabilité de cette approche qu’avec des ARN très courts, et ne suggère pas que le véhicule puisse être adapté pour la délivrance de séquences ayant plus de 200 bases.
Il existe en effet des préjugés pour l’homme du métier à utiliser un système de délivrance dans lequel une grosse séquence nucléotidique est localisée sur la couronne de nanoparticules lipidiques.
En effet, contrairement à l’encapsulation de l’ARNm dans le cœur des nanoparticules lipidiques, la complexation de l’ARNm à la surface de celles-ci conduit à l’exposer à la surface de la nanoparticule. Or, l’ARNm est une molécule fragile et sensible aux enzymes dégradant l’ARN (RNase) qui sont présentes dans la plupart des milieux biologiques. Complexer l’ARNm à la surface des nanoparticules lipidiques le rend donc accessible aux RNase, et ce d’autant plus qu’il s’agit d’une grosse molécule qui, une fois complexée sur la nanoparticule lipidique, dépasse bien au-delà de la nanoparticule lipidique. Pour cette raison, l’homme du métier est découragé de complexer de grosses séquences nucléotidiques à la surface de nanoparticules lipidiques.
Un autre préjugé à l’encontre de la méthode de complexation est la forte affinité de l’interaction électrostatique entre un acide nucléique (chargé négativement) de grande taille, tel que l’ARNm, et une nanoparticule lipidique cationique (chargée positivement), pouvant nuire au relargage de l’ARNm à partir du complexe ARNm-LNP une fois celui-ci dans le cytoplasme de la cellule hôte. Car il faut non seulement que l’ARNm atteigne le cytoplasme, mais en plus que celui-ci soit relargué pour qu’il puisse assurer son rôle.
Il existe un besoin de système de délivrance de grandes séquences nucléotidiques, en particulier d’ARNm, qui soit suffisamment stable au stockage et in vivo pour permettre une délivrance efficace.
A cet effet, selon un premier objet, l’invention concerne une formulation sous forme de nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase dispersée sous forme de nanoparticules lipidiques, et comprenant :
- au moins 5% molaire de lipide amphiphile, de 15 à 70% molaire de tensioactif cationique porteur d’au moins une charge positive comprenant :
- au moins un groupe lipophile choisi parmi :
- un groupe R ou R-(C=0)-, où R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 à 23 atomes de carbone, un ester ou un amide d’acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine, et
- un poly(oxyde de propylène), et
- au moins un groupe hydrophile comprenant au moins un groupe cationique choisi parmi :
- un groupe alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone et interrompu et/ou substitué par au moins un groupe cationique, et
- un groupe polymérique hydrophile comprenant au moins un groupe cationique, et
- de 10% à 55% molaire de co-tensioactif comprenant au moins une chaîne poly(oxyde d’éthylène) comprenant au moins 25 unités d’oxyde d’éthylène,
- un lipide solubilisant,
- éventuellement un lipide fusogène, où les pourcentages molaires de lipide amphiphile, de tensioactif cationique et de co- tensioactif sont par rapport aux proportions molaires cumulées du lipide amphiphile, du tensioactif cationique, du co-tensioactif et de l’éventuel lipide fusogène, dans laquelle au moins un ARN messager, dont la séquence nucléotidique monobrin comprend au moins 300 bases, est complexé à la surface des nanoparticules lipidiques, le rapport N/P de la quantité de charges positives du tensioactif cationique par rapport à la quantité de charges négatives de l’ARN messager étant supérieur ou égal à 2/1 .
De façon surprenante, une telle formulation est stable et a la capacité de protéger du milieu biologique extérieur et de délivrer efficacement un ARNm pour qu’il soit traduit en protéine par une cellule eucaryote. La formulation présente avantageusement une bonne biodisponibilité et permet de limiter la dégradation de l’ARNm généralement observée avec d’autres systèmes de délivrance, notamment de limiter la dégradation par des RNase.
Dans la formulation de l’invention, l’ARNm est complexé à la surface d’une nanoparticule lipidique, qui est avantageusement très stable au stockage. Le complexe
ARNm-nanoparticule lipidique peut être stockée au moins deux semaines à 4°C sans qu’aucune dégradation ne soit observée.
L’émulsion est une émulsion de type huile dans l’eau. Elle peut être simple ou multiple, notamment en comportant dans la phase dispersée une seconde phase aqueuse. De préférence, elle est simple. Lorsqu’elle est simple, les nanoparticules lipidiques ne comprennent pas de phase aqueuse interne, et ne sont donc pas des liposomes.
La formulation selon l’invention comprend un tensioactif cationique comprenant :
- au moins un groupe lipophile choisi parmi :
- un groupe R représentant une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 à 23 atomes de carbone, un ester ou un amide d’acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine, tel que le distéaryl phosphatidyléthanolamine (DSPE), et
- un poly(oxyde de propylène), et
- au moins un groupe hydrophile comprenant au moins un groupe cationique choisi parmi :
- un groupe alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone et interrompu et/ou substitué par au moins un groupe cationique, et
- un groupe polymérique hydrophile comprenant au moins un groupe cationique, ledit groupe polymérique étant notamment choisi parmi :
- un poly(oxyde d’éthylène) comprenant typiquement de 3 à 500 unités oxyde d’éthylène, de préférence de 20 à 200 unités oxyde d’éthylène, et comprenant au moins un groupe cationique.
- un polysaccharide, tel que du dextrane, de la cellulose ou du chitosan, ayant notamment des masses moléculaires comprises entre 0,5 et 20 kDa, par exemple entre 1 et 12 kDa,
- un polyamine, tel qu’un chitosan ou une polylysine, ayant notamment des masses moléculaires comprises entre 0,5 et 20 kDa, par exemple entre 1 et 12 kDa.
Lorsque la formulation comprend plusieurs tensioactifs cationiques, de préférence, chaque tensioactif cationique est tel que défini ci-dessus.
Par «ester ou amide d’acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine», on entend un groupe de formule :
dans laquelle - R3 et R4 représentent indépendamment une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 à 23 atomes de carbone,
- A3 et A représentent O ou NFI, et
- M représente Fl ou un cation.
Les groupes cationiques du tensioactif cationique (de préférence de chaque tensioactif cationique lorsqu’il y en a plusieurs) sont typiquement :
- des oniums choisis parmi les groupes ammonium, imidazolium, pyridinium, pyrrolidinium, pipéridinium, phosphonium ou sulfonium, ou
- des complexes métalliques entre un radical d’un groupe organique chélatant mono- ou multi-dentate, par exemple la phénantroline, la pyridine, l’acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA), l’acide diéthylène triamine penta acétique (DTPA), les porphyrines, les phtalocyanines, les clorines, les bactériochlorines complexé avec un cation inorganique, tel que Ca2+, Al3+, Ni+, Zn2+ , Fe2+, Fe3+ ou Cu2+,
- les groupes ammonium, notamment -+NMe3, -+NFIMe2, -+NFl2Me et -+NFl3, en particulier - +NFl3, étant particulièrement préféré. De préférence, le groupe cationique (ou chaque groupe cationique s’il y a plusieurs groupes cationiques) du tensioactif cationique (de chaque tensioactif cationique s’il y en a plusieur) n’est pas ionisable (c’est-à-dire que le (chaque) groupe cationique n’est ni donneur ni accepteur de proton). Typiquement, lorsque le groupe cationique comprend une fonction onium ou ammonium, l’azote de cette fonction (chaque azote s’il y en a plusieurs) n’est pas porteur (ou ne peut pas être porteur) d’un hydrogène. Un exemple de groupe ammonium non ionisable est -+NMe3.
Bien sûr, des anions sont associés au(x) groupe(s) cationique(s) pour que la formulation soit électriquement neutre. La nature des anions n’est pas limitée. A titre illustratif, on peut citer les halogénures, notamment le chlorure ou le bromure, ou le trifluoroacétate.
Dans le tensioactif cationique, la nature du groupe de liaison liant le(s) groupe(s) lipophile(s) au(x) groupe(s) hydrophile(s) comprenant au moins un groupe cationique n’est pas limitée. Des exemples de groupes de liaison sont fournis ci-dessous (groupe L).
Dans un mode de réalisation, le tensioactif cationique, de préférence chaque tensioactif cationique de la formulation, a la formule (A) suivante :
[(Lipo)i-L-(Hydro)h]n+, (n/m) [Af- (A) dans laquelle:
- 1 et h représentent des nombres entiers indépendamment compris entre 1 et 4,
- n est un nombre entier supérieur ou égal à 1 , généralement compris entre 1 et 50,
- Lipo représente un groupe lipophile tel que défini ci-dessus,
- Hydro représente un groupe hydrophile tel que défini ci-dessus comprenant au moins un groupe cationique,
- L représente un groupe de liaison,
- A représente un anion,
- m est un nombre entier représentant la charge de l’anion,
- vn est un nombre entier représentant la charge du cation [(Lipo)i-L-(Hydro)h].
Dans la formule (A) susmentionnée, de préférence L est tel que :
- lorsque I et h représentent 1 , L est un groupe de liaison divalent choisi parmi :
- une liaison simple,
- un groupe Z choisi parmi -O-, -NH-, -O(OC)-, -(CO)O-, -(CO)NH-, -NH(CO)-, -O- (CO)-O-, -NH-(C0)-0-, -0-(C0)-NH- et -NH-(CO)-NH, -0-P0(0H)-0- ou un radical divalent cyclique de 5 à 6 atomes,
- un groupe Alk étant un alkylène comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, et un groupe Z-Alk, Alk-Z, Alk-Z-Alk ou Z-Alk-Z où Alk et Z sont tels que définis ci- dessus et où les deux groupes Z du groupe Z-Alk-Z sont identiques ou différents, lorsque l’un des groupes I ou h représente 1, et l’autre représente 2, L est un groupe trivalent choisi parmi un groupe phosphate 0P-(0-)3, un groupe dérivé du glycérol de formule -0-CH2-CH-(0-)CH2-0- et un radical trivalent cyclique de 5 à 6 atomes,
- pour les autres valeurs de I et h, L est un radical multivalent cyclique de 5 à 6 atomes.
De manière particulièrement préférée, L est tel que :
- lorsque I et h représentent 1 , L est un groupe de liaison divalent choisi parmi :
- une liaison simple,
- un groupe Z choisi parmi -O-, -NH-, -O(OC)-, -(CO)O-, -(CO)NH-, -NH(CO)-, -O- (CO)-O-, -NH-(C0)-0-, -0-(C0)-NH- et -NH-(CO)-NH ou -0-P0(0H)-0-,
lorsque l’un des groupes I ou h représente 1, et l’autre représente 2, L est un groupe trivalent choisi parmi un groupe phosphate 0P-(0-)3 et un groupe dérivé du glycérol de formule -0-CH2-CH-(0-)CH2-0-.
Dans la formule (A) susmentionnée, I et h représentent de préférence indépendamment 1 ou 2.
De préférence, les groupes Z définis ci-dessus ne sont pas clivables, en particulier dans les conditions d’utilisation de la formulation (au pH de la phase aqueuse continue notamment).
Selon une première alternative, le groupe hydrophile du tensioactif cationique (de préférence de chaque tensioactif cationique) est un groupe alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone et interrompu et/ou substitué par au moins un groupe cationique. Comme exemple de tels tensioactifs cationiques, on peut citer:
1) (Lipo)-(CH2)mi-NR3oR3iR32, où Lipo est un groupe lipophile tel que défini ci-dessus, m1 représente 1 ou 2 et R30, R31 et R32 représentent indépendamment H, Me ou -CH2-CH2- OH,
chaque Lipo est indépendamment un groupe lipophile tel que défini ci-dessus, et R33 représente H, Me ou -CH2-CH2-OH,
Lipo est un groupe lipophile tel que défini ci- dessus, et R34, R35, R36, R37, R38, R39, R40, R41 , R42 et R43 représentent indépendamment H,
Me ou -CH2-CH2-OH.
Dans un mode de réalisation, le tensioactif cationique (de préférence chaque tensioactif cationique de la formulation) est choisi parmi : le L/[1 -(2,3-dioléyloxy) propyl]-/V,/V,/V-triméthylammonium (DOTMA), le 1 ,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane (DOTAP), - le A/-(2-hydroxyethyl)-/V,/V-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy-1-propananium) (DMRIE), le 1-[2-(oleoyloxy)ethyl]-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazolinium (DOTIM), et
- le dioctadecylamidoglycylspermine (DOGS) (sous forme protonée), et est de préférence le 1 ,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane (DOTAP).
Selon une deuxième alternative, le groupe hydrophile du tensioactif cationique (de préférence de chaque tensioactif cationique) est un groupe polymérique hydrophile comprenant au moins un groupe cationique.
Lorsque le groupe hydrophile du tensioactif cationique est polymérique, le(s) groupe(s) cationique(s) peu(ven)t être un(des) groupe(s) terminal(aux) ou pendant(s). Par exemple : - lorsque groupe polymérique hydrophile est un poly(oxyde d’éthylène), le(s) groupe(s) cationique(s) est(sont) généralement situé(s) sur un groupe terminal à l’extrémité de la chaîne poly(oxyde d’éthylène).
- lorsque le groupe polymérique hydrophile est du dextrane ou de la cellulose, le(s) groupe(s) cationiques est(sont) généralement situé(s) sur un groupe terminal à l’extrémité de la chaîne polysaccharidique.
- lorsque le groupe polymérique hydrophile est du chitosan, le(s) groupe(s) cationiques est(sont) généralement un(des) groupe(s) pendant(s), en particulier des groupes -NH3 + présents en milieu acide sur le chitosan.
Dans un mode de réalisation, le(s) groupe(s) cationique(s) est(sont) un(des) groupe(s) terminal(aux). En effet, les groupes pendants de tensioactifs anioniques adjacents en surface des nanoparticules lipidiques de la phase dispersée se repoussent par interactions électrostatiques et, par conséquent, les formulations comprenant des tensioactifs cationiques dont le groupe Hydro comprend des groupes pendants sont généralement moins stables. Dans un autre mode de réalisation, le(s) groupe(s) cationique(s) est(sont) un(des) groupe(s) pendant(s). Il est avantageusement possible d’utiliser un tensioactif cationique dont le groupe hydrophile comprend plusieurs groupes cationiques pendants, et donc d’obtenir une formulation plus chargée positivement, et qui permettra d’autant mieux la complexation d’espèces négatives comme les ARNm.
Le groupe polymérique hydrophile préféré est un radical d’un poly(oxyde d’éthylène) comprenant typiquement de 3 à 500 unités oxyde d’éthylène, de préférence de 20 à 200 unités oxyde d’éthylène, et comprenant au moins un groupe cationique.
Ainsi, dans un mode de réalisation, le tensioactif cationique (de préférence chaque tensioactif cationique de la formulation) a l’une des formules suivantes : )
dans lesquelles :
- FL, R2, R3 et R4 représentent indépendamment une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 à 23 atomes de carbone,
- Ai, A2, A3 et A représentent O ou NH,
- m, n, 0 et p représentent indépendamment des nombres entiers de 3 à 500, de préférence 20 à 200, et
- a représente un nombre entier de 20 à 120, - M représente H ou un cation,
- A10, An, AI2 et A13 représentent indépendamment un groupe -+NR20R2IR22, dans lequel R20, R21 et R22 représentent indépendamment H, Me ou -CH2-CH2-OH.
Dans un mode de réalisation, dans la formule (Ail), An représente -+NH3 et le tensioactif cationique (de préférence de chaque tensioactif cationique) a la formule suivante :
dans laquelle A2, R2 et n sont tels que définis ci-dessus. De préférence, dans la formule (AN), R2 représente C17H35.
Sans vouloir être liés à une théorie particulière, la présence du groupe polymérique hydrophile permettrait :
- de stabiliser la formulation, et
- de protéger les ARNm, localisés à la surface des nanoparticules lipidiques, des protéines du milieu dans lequel la formulation est administrée/utilisée, et donc la dégradation des ARNm par ces protéines.
Selon une troisième alternative, la formulation selon l’invention comprend au moins deux tensioactifs cationiques, de préférence exactement deux, dont : l’un est choisi parmi : le L/[1 -(2,3-dioléyloxy) propyl]-/V,/V,/V-triméthylammonium (DOTMA), le 1 ,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane (DOTAP), le A/-(2-hydroxyethyl)-/V,/V-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy-1-propananium) (DMRIE), le 1-[2-(oleoyloxy)ethyl]-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazolinium chloride (DOTIM), et
- le dioctadecylamidoglycylspermine (DOGS), et est de préférence le 1 ,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane (DOTAP), et
- l’autre est un tensioactif cationique comprenant :
- au moins un groupe lipophile choisi parmi :
- un groupe R ou R-(C=0)-, où R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 à 23 atomes de carbone, un ester ou un amide d’acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine, tel que le distéaryl phosphatidyléthanolamine (DSPE), et
- un poly(oxyde de propylène), et
- un groupe polymérique hydrophile comprenant au moins un groupe cationique, ledit groupe polymérique étant choisi parmi : un poly(oxyde d’éthylène) comprenant typiquement de 3 à 500 unités oxyde d’éthylène, de préférence de 20 à 200 unités oxyde d’éthylène, et comprenant au moins un groupe cationique,
- un polysaccharide, tel que du dextrane, de la cellulose ou du chitosan,
un polyamine, tel qu’un chitosan ou une polylysine, et est de préférence un poly(oxyde d’éthylène) comprenant au moins un groupe cationique.
Dans un mode de réalisation, la formulation selon l’invention comprend, à titre de tensioactifs cationiques :
- du 1 ,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane, et
- un tensioactif cationique comprenant :
- au moins un groupe lipophile choisi parmi :
- un groupe R ou R-(C=0)-, où R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 à 23 atomes de carbone, un ester ou un amide d’acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine, tel que le distéaryl phosphatidyléthanolamine (DSPE), et
- un poly(oxyde d’éthylène) comprenant typiquement de 3 à 500 unités oxyde d’éthylène, de préférence de 20 à 200 unités oxyde d’éthylène, et comprenant au moins un groupe cationique.
Dans un mode de réalisation, la formulation selon l’invention comprend, à titre de tensioactifs cationiques :
- du 1 ,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane, et
- un composé de formule (Ail) telle que définie ci-dessus, notamment de formule (AV).
La formulation est de préférence exempte de lipide cationique comprenant un groupe -S-S-, ou plus généralement comprenant un groupe clivable, et/ou comprenant un groupe ionisable.
De préférence, la formulation ne comprend pas d’autre lipide cationique que ceux mentionnés ci-dessus. Le(s) lipide(s) cationique(s) décrit(s) ci-dessus est(sont) alors le(s) seul(s) lipide(s) cationique(s) de la formulation. Le tensioactif cationique se situe dans la couronne des nanoparticules lipidiques de la formulation. Grâce à la ou es charge(s) positive(s) de son(es) groupe(s) cationique(s), il se lie par interactions électrostatiques aux ARNm et permet de maintenir les ARNm à la surface des nanoparticules lipidiques.
La formulation comprend de 15 à 70% molaire de tensioactif cationique par rapport aux proportions molaires cumulées du lipide amphiphile, du tensioactif cationique, du co- tensioactif et de l’éventuel lipide fusogène. En dessous de 15%, la formulation ne comprend pas assez de charges positives et la complexation ultérieure de la formulation « prémix » avec l’ARNm (chargé négativement) est insuffisante. Au-delà de 70%, les formulations ne sont pas stables, et ne peuvent généralement même pas être formulées (la formation de la nanoémulsion n’est pas possible car les nanoparticules lipidiques coalescent pour former
deux phases), et les nanoparticules lipidiques deviennent généralement toxiques pour les cellules. Lorsque la formulation comprend plusieurs tensioactifs cationiques, c’est leur quantité molaire cumulée qui doit respecter la plage de 15 à 70% molaire. De manière générale, au sens de la demande, lorsqu’il y a plusieurs composants du même type, il faut tenir compte de la proportion, de la masse ou de la quantité de l’ensemble d’entre eux.
Ces proportions sont particulièrement adaptées pour obtenir une complexation efficace des ARNm, et donc une bonne délivrance.
Lipide fusooène (« helper lipid » en anolais)
Dans un mode de réalisation, la formulation selon l’invention comprend un lipide fusogène, qui est susceptible de faciliter la libération cytosolique par déstabilisation de la membrane endosomale, dit lipide « helper ». De préférence, ce lipide est le dioléylphosphatidyléthanolamine (DOPE).
Ce lipide permet de favoriser l’échappement endosomal des nanoparticules lipidiques de la formulation selon l’invention, et donc ARNm qu’elles contiennent.
Le lipide fusogène se situe dans la couronne des nanoparticules lipidiques de la formulation.
La formulation comprend au moins un lipide amphiphile, qui se situe dans la couronne des nanoparticules lipidiques de la formulation.
Afin de former une nanoémulsion stable, il est nécessaire d’inclure dans la composition au moins un lipide amphiphile à titre de tensioactif. La nature amphiphile du tensioactif assure la stabilisation des nanoparticules lipidiques au sein de la phase continue aqueuse. En dessous de 5% molaire de lipide amphiphile par rapport aux proportions molaires cumulées du lipide amphiphile, du tensioactif cationique, du co-tensioactif et de l’éventuel lipide fusogène, les formulations ne sont pas stables, et ne peuvent généralement même pas être formulées (la formation de la nanoémulsion n’est pas possible car les nanoparticules lipidiques coalescent pour former deux phases).
Généralement, la formulation comprend de 5 à 85% molaire, de préférence de 5 à 75% molaire, en particulier de 5 à 50% molaire et tout particulièrement de 8 à 30% molaire de lipide amphiphile par rapport aux proportions molaires cumulées du lipide amphiphile, du tensioactif cationique, du co-tensioactif et de l’éventuel lipide fusogène.
La quantité de lipide amphiphile contribue avantageusement à contrôler la taille de la phase dispersée de la nanoémulsion.
Les lipides amphiphiles comportent une partie hydrophile et une partie lipophile. Ils sont généralement choisis parmi les composés dont la partie lipophile comprend une chaîne saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, ayant de 8 à 30 atomes de carbone. Ils peuvent
être choisis parmi les phospholipides, les cholestérols, les lysolipides, les sphingomyélines, les tocophérols, les glucolipides, stéarylamines, les cardiolipines d’origine naturelle ou synthétique ; les molécules composées d’un acide gras couplé à un groupement hydrophile par une fonction éther ou ester tels que les esters de sorbitan comme par exemple les monooléate et monolaurate de sorbitan vendus sous les dénominations Span® par la société Sigma; les lipides polymérisés ; les lipides conjugués à de courtes chaînes d'oxyde de polyéthylène (PEG) tels que les tensioactifs non-ioniques vendus sous les dénominations commerciales Tween® par la société ICI Americas, Inc. et Triton® par la société Union Carbide Corp.; les esters de sucre tels que les mono- et di-laurate, mono- et di-palmitate, mono- et distéarate de saccharose; lesdits tensioactifs pouvant être utilisés seuls ou en mélanges.
Les phospholipides sont les lipides amphiphiles préférés.
La lécithine est le lipide amphiphile particulièrement préféré.
La formulation comprend par ailleurs un lipide solubilisant comprenant au moins un glycéride d’acides gras, qui se situe dans la phase dispersée de la nanoémulsion, plus précisément dans le cœur des nanoparticules lipidiques. Ce composé a pour mission principale de solubiliser le lipide amphiphile, peu soluble, dans la phase dispersée de la nanoémulsion.
Le lipide solubilisant est un lipide présentant une affinité avec le lipide amphiphile suffisante pour permettre sa solubilisation. De préférence, le lipide solubilisant est solide à température ambiante (20°C).
Dans le cas où le lipide amphiphile est un phospholipide, il peut s’agir notamment : d’esters d’acides gras et d’alcool gras, comme le cétylpalmitate, ou - de dérivés du glycérol, et en particulier de glycérides obtenues par estérification de glycérol avec des acides gras.
Le lipide solubilisant utilisé est avantageusement choisi en fonction du lipide amphiphile utilisé. Il présentera généralement une structure chimique proche, afin d’assurer la solubilisation recherchée. Il peut s’agir d’une huile ou d’une cire. De préférence, le lipide solubilisant est solide à température ambiante (20°C), mais liquide à la température du corps (37°C).
Les lipides solubilisants préférés, en particulier pour les phospholipides, sont les esters d’acides gras et d’alcool gras, comme le cétylpalmitate, ou les glycérides d’acides gras, notamment d’acides gras saturés, et en particulier d'acides gras saturés comportant 8 à 18 atomes de carbone, encore préféré 12 à 18 atomes de carbone. Avantageusement, il s’agit d’un mélange de différents glycérides.
De préférence, il s'agit de glycérides d'acides gras saturés comportant au moins 10% en poids d'acides gras en C12, au moins 5% en poids d'acides gras en C14, au moins 5% en poids d'acides gras en C16 et au moins 5% en poids d'acides gras en C18.
De préférence, il s'agit de glycérides d'acides gras saturés comportant 0% à 20% en poids d'acides gras en C8, 0% à 20% en poids d'acides gras en C10, 10% à 70% en poids d'acides gras en C12, 5% à 30% en poids d'acides gras en C14, 5% à 30% en poids d'acides gras en C16 et 5% à 30% en poids d'acides gras en C18.
Particulièrement préférés sont les mélanges de glycérides semi-synthétiques solides à température ambiante vendus sous la dénomination commerciale Suppocire®NC par la société Gattefossé et approuvé pour l’injection chez l’homme. Les Suppocire® de type N sont obtenues par estérification directe d'acides gras et de glycérol. Il s'agit de glycérides hémi-synthétiques d'acides gras saturés de C8 à C18, dont la composition quali- quantitative est indiquée dans le tableau 1.
[Table 1]
Tableau 1 : Composition en acides gras du Suppocire® NC de Gattefossé
Les lipides solubilisants précités permettent d’obtenir une formulation sous forme de nanoémulsion avantageusement stable. Sans vouloir être lié à une théorie particulière, il est supposé que les lipides solubilisants précités permettent d’obtenir des nanoparticules lipidiques présentant un cœur amorphe. Le cœur ainsi obtenu présente une viscosité interne élevée sans pour autant présenter de cristallinité. Or, la cristallisation est néfaste pour la stabilité de la nanoémulsion car elle conduit généralement à une agrégation des nanoparticules lipidiques et/ou à une expulsion des molécules encapsulées à l’extérieur des nanoparticules lipidiques. Ces propriétés physiques favorisent la stabilité physique de la nanoémulsion. La quantité de lipide solubilisant peut varier largement en fonction de la nature et de la quantité de lipide amphiphile présent dans la phase dispersée. Généralement, le cœur des nanoparticules lipidiques (comprenant le lipide solubilisant, l’éventuelle huile, l’éventuel agent d’imagerie, l’éventuel agent thérapeutique s’il est lipophile) comprend de 1 à 100%
en poids, de préférence de 5 à 80% en poids et tout particulièrement de 40 à 75% en poids de lipide solubilisant.
Huile
La phase dispersée peut comporter par ailleurs une ou plusieurs autres huiles, qui se situe(nt) dans le cœur des nanoparticules lipidiques.
Les huiles utilisées présentent de préférence une balance hydrophile-lipophile (HLB) inférieure à 8 et encore plus préférentiellement comprise entre 3 et 6. Avantageusement, les huiles sont utilisées sans modification chimique ou physique préalablement à la formation de l’émulsion.
Les huiles sont généralement choisies parmi les huiles biocompatibles, et en particulier parmi les huiles d’origine naturelle (végétale ou animale) ou synthétique. Parmi de telles huiles, on peut notamment citer les huiles d’origine naturelle végétale parmi lesquelles figurent notamment les huiles de soja, de lin, de palme, d’arachide, d’olives, de pépin de raisins et de tournesol ; les huiles synthétiques parmi lesquelles figurent notamment les triglycérides, di glycérides et les mono glycérides. Ces huiles peuvent être de premières expressions, raffinées ou inter-estérifiées.
Les huiles préférées sont l’huile de soja et l’huile de lin.
Généralement, si présente, l’huile sera contenue dans le cœur des nanoparticules lipidiques (comprenant le lipide solubilisant, l’éventuelle huile, l’éventuel agent d’imagerie, l’éventuel agent thérapeutique s’il est lipophile) dans une proportion allant de 1 à 80% en poids, de préférence entre 5 et 50 % en poids et tout particulièrement 10 à 30% en poids.
De préférence, la formulation est exempte de squalène.
La phase dispersée peut contenir en outre d’autres additifs tels que des colorants, stabilisants, conservateurs ou d’autres principes actifs, en quantité appropriée. Co-tensioactif
La formulation comprend un co-tensioactif, qui permet de stabiliser la nanoémulsion.
Les co-tensioactifs utilisables dans les formulations utilisées dans l’invention sont généralement des tensioactifs hydrosolubles. Ils comprennent au moins une chaîne poly(oxyde d’éthylène) comprenant au moins 25, notamment au moins 30, de préférence au moins 35, unités d’oxyde d’éthylène. Le nombre d’unités d’oxyde d’éthylène est généralement inférieur à 500.
Des formulations comprenant un co-tensioactif comprenant une chaîne poly(oxyde d’éthylène) comprenant moins de 25 unités d’oxyde d’éthylène ne sont en effet pas stables. Généralement, il n’est même pas possible de préparer la nanoémulsion.
Ces nombres d’unités sont en effet particulièrement adaptés pour éviter la fuite des ARNm hors des nanoparticules lipidiques.
En effet, les inventeurs ont observé qu’une formulation ne comprenant pas un co- tensioactif n’est pas suffisamment stable.
De plus, sans vouloir être liés à une théorie particulière, la présence de la chaîne composée de motifs d'oxyde d’éthylène du co-tensioactif permettrait de protéger les ARNm, localisés à la surface des nanoparticules lipidiques, des nucléases du milieu dans lequel la formulation est administrée/utilisée, et donc la dégradation desdits ARNm par ces nucléases.
A titre d'exemple de co-tensioactifs, on peut en particulier citer les composés conjugués polyéthylèneglycol/phosphatidyl-éthanolamine (PEG-PE), les éthers d'acide gras et de polyéthylèneglycol tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Brij® (par exemple Brij® 35, 58, 78 ou 98) par la société ICI Americas Inc., les esters d'acide gras et de polyéthylèneglycol tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Myrj® par la société ICI Americas Inc. (par exemple Myrj® 45, 52, 53 ou 59) et les copolymères blocs d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Pluronic® par la société BASF AG (par exemple Pluronic® F68, F127, L64, L61 , 10R4, 17R2, 17R4, 25R2 ou 25R4 ) ou les produits vendus sous la dénomination commerciale Synperonic® par la société Unichema Chemie BV (par exemple Synperonic® PE/F68, PE/L61 ou PE/L64).
Ainsi, le co-tensioactif se situe à la fois dans la phase aqueuse continue et dans la phase dispersée. En effet, la partie hydrophobe du co-tensioactif s’insère dans les nanoparticules lipidiques de la phase dispersée, alors que les chaînes polyalcoxylées sont dans la phase aqueuse continue. Dans la présente demande, les pourcentages molaires ou massiques de phase dispersée décrits sont calculés en considérant que le co-tensioactif appartient à la phase dispersée.
La formulation comprend de 10% à 55% molaire de co-tensioactif par rapport aux proportions molaires cumulées du lipide amphiphile, du tensioactif cationique, du co- tensioactif et de l’éventuel lipide fusogène. En dessous de 10%, les formulations ne sont pas stables, et ne peuvent généralement même pas être formulées (la formation de la nanoémulsion n’est pas possible car les nanoparticules lipidiques coalescent pour former deux phases). Au-delà de 55%, la complexation ultérieure de la formation « prémix » avec l’ARNm n’a pas lieu, probablement car les charges positives du tensioactif cationique sont masquées par les chaînes poly(oxyde d’éthylène) du co-tensioactif, et donc plus accessibles pour se lier par liaison électrostatique à l’ARNm.
Le co-tensioactif peut par ailleurs présenter d’autres effets dans l’application envisagée de la nanoémulsion.
Selon un mode de réalisation, la phase dispersée de la nanoémulsion est greffée en surface avec des molécules d’intérêts tels que des ligands biologiques, afin d’augmenter le ciblage spécifique d’un organe. Un tel greffage permet une reconnaissance spécifique de certaines cellules ou de certains organes en favorisant l’internalisation des nanoparticules lipidiques de la formulation selon l’invention par les cellules cibles qui expriment le récepteur en surface. De préférence, le greffage en surface est réalisé par couplage des molécules d’intérêts ou de leurs précurseurs avec un composé amphiphile, notamment avec le co- tensioactif. La nanoémulsion comprend alors un co-tensioactif greffé. Dans ce cas, le co- tensioactif joue le rôle d’un espaceur permettant d’accommoder les molécules d’intérêt en surface.
Les molécules d'intérêt peuvent être par exemple :
- des ligands biologiques de ciblage tels que des anticorps, peptides, saccharides, aptamères, oligonucléotides ou des composés comme l’acide folique ;
- un agent de furtivité : une entité ajoutée afin de conférer à la nanoémulsion une furtivité vis-à-vis du système immunitaire, d'augmenter son temps de circulation dans l'organisme, et de ralentir son élimination.
Par exemple, lorsque le ligand biologique est un peptide comprenant une ou plusieurs cystéine (par exemple pour utiliser la formulation pour le traitement d’une maladie), le greffage à la chaîne oxyde d’alkylène du tensioactif peut être assuré par couplage thiol maléimide.
Agent d’imagerie
Dans un mode de réalisation, la formulation comprend un agent d’imagerie, qui permet avantageusement de visualiser la distribution des nanoparticules lipidiques dans les cellules ou le corps du patient, et donc la distribution des ARNm.
L’agent d’imagerie peut notamment être utilisé dans les imageries de type :
- tomographie à émission de positons (Positron Emission Tomography (PET) en anglais) (l’agent d’imagerie pouvant être un composé comprenant un radionucléide, tel que 18F, 1 1C, un chélate de cations métalliques 68Ga, 64Cu),
- tomographie d'émission monophotonique (TEMP) (Single photon émission computed tomography (SPECT) en anglais) (l’agent d’imagerie pouvant être un composé comprenant un radionucléide par exemple 123l, ou un chélate de 99mTc ou 1 1 1 In),
- imagerie par résonance magnétique (IRM) (l’agent d’imagerie pouvant être un chélate de gadolinium ou un nanocristal magnétique tel qu’un nanocristal d’oxyde de fer, d’oxyde de manganèse ou de fer-platine FePt),
- imagerie optique ou imagerie aux rayons X (l’agent d’imagerie pouvant être un fluorophore lipophile ou un agent de contraste, par exemple une molécule iodée telle que l’iopamidol, l’amidotrizoate, ou des nanoparticules d’or).
De préférence, l’agent d’imagerie est un fluorophore lipophile permettant de réaliser de l’imagerie optique.
La nature du ou des fluorophores lipophiles utilisables n'est pas critique à partir du moment où ils sont compatibles avec l'imagerie in vivo (c’est à dire qu’ils sont biocompatibles et non toxiques). De préférence, les fluorophores utilisés comme agent d’imagerie absorbent et émettent dans le visible ou le proche infrarouge. Pour l’imagerie non invasive dans un tissu ou un organisme vivant (animal, homme) les fluorophores préférés absorbent et émettent dans le proche infrarouge. En effet, pour que la lumière d'excitation et la lumière émise par le fluorophore puissent mieux traverser les tissus, il convient d'utiliser des fluorophores absorbant et émettant dans le proche infrarouge, c'est- à-dire à une longueur d'onde comprise entre 640 et 900 nm.
A titre de fluorophore lipophile on peut par exemple citer les composés décrits dans le chapitre 13 ("Probes for Lipids and Membranes") du catalogue InVitrogen. De façon plus précise, on peut notamment citer, à titre de fluorophore, le vert d’indocyanine (ICG), les analogues d'acides gras et les phospholipides fonctionnalisés par un groupement fluorescent tels que les produits fluorescents vendus sous les dénominations commerciales Bodipy (R) tels que le Bodipy (R) 665/676 (Ex/Em.) ; les dérivés lipophiles de carbocyanines telles que le perchlorate de 1 ,1 '-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindodicarbocyanine (DiD), par exemple vendu sous la référence D-307, le perchlorate de 3,3'- dihexadecyloxacarbocyanine (DiO), par exemple vendu sous la référence D1125, le perchlorate de 1 ,1'-dihexadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine (Dil), par exemple vendu sous la référence D384; les sondes fluorescentes dérivées de sphingolipides, de stéroïdes ou de lipopolysaccharides tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales BODIPY ® TR céramides, BODIPY ® FL C5-lactosylcéramide, BODIPY ® FL C5-ganglioside, BODIPY ® FL cérébrosides ; les dérivés amphiphiles de cyanines, de rhodamines, de fluorescéines ou de coumarines tels que l'octadécyl rhodamine B, l'octadécyl ester de fluorescéine et la 4-heptadécyl-7- hydroxycoumarine ; et le diphénylhexatriène (DPH) et ses dérivés ; l'ensemble de ces produits étant vendus par la société Invitrogen.
Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, le fluorophore est le vert d’indocyanine, le perchlorate de 1 ,1 '-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindodicarbocyanine, le perchlorate de 3,3'-dihexadecyloxacarbocyanine, ou le perchlorate de 1,T-dihexadecyl- 3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine.
Agent thérapeutique
La formulation selon l’invention peut comporter un agent thérapeutique.
Les agents thérapeutiques susceptibles d’être encapsulés dans la nanoémulsion selon l’invention comprennent en particulier les principes actifs agissant par voie chimique, biologique ou physique. Ainsi, il peut s’agir de principes actifs pharmaceutiques ou d’agents biologiques tels que de l’ADN, des protéines, peptides ou anticorps ou encore des agents utiles pour des thérapies physiques tels que des composés utiles pour la thermothérapie, les composés relarguant de l’oxygène singulet lorsqu’ils sont excités par une lumière utiles pour la photothérapie et des agents radioactifs. De préférence, il s’agit de principes actifs administrés de façon parentérale.
Selon son affinité lipophile ou amphiphile, l’agent thérapeutique sera encapsulé par la phase dispersée ou se situera à l’interface des deux phases.
La nature des agents thérapeutiques encapsulés dans la nanoémulsion n’est pas particulièrement limitée. Cependant, la nanoémulsion est particulièrement intéressante pour des composés peu solubles, qui sont difficiles à formuler dans les systèmes d’administration classiques et pour les principes actifs utiles pour la photothérapie, dont le rendement quantique peut être préservé.
Du fait des conditions douces du procédé de préparation, la formulation décrite est particulièrement intéressante pour l’encapsulation d’agents thérapeutiques qui se dégradent à température élevée.
Parmi les principes actifs pharmaceutiques intéressants comme agents thérapeutiques, on peut citer en particulier les agents utilisés dans le traitement du SIDA, les agents utilisés dans le traitement des maladies cardiaques, les analgésiques, les anesthésiques, les anorexigènes, les anthelmintiques, les antiallergiques, les antiangineux, les antiarythmisants, les anticholinergiques, les anticoagulants, les antidépresseurs, les antidiabétiques, les antidiurétiques, les antiémétiques, les anticonvulsivants, les antifongiques, les antihistaminiques, les antihypertenseurs, les anti-inflammatoires, les anti migraineux, les antimuscariniques, les antimycobactériens, les anticancéreux y compris les antiparkinsoniens, les antithyroïdiens, les antiviraux, les astringents, les agents bloquants, les produits sanguins, les substituts sanguins, les agents inotropes cardiaques, les agents cardiovasculaires, les agents du système nerveux central, les chélateurs, les agents de chimiothérapie, les facteurs de croissance hématopoïétiques, les corticostéroïdes, les antitussifs, les agents dermatologiques, les diurétiques, les dopaminergiques, les inhibiteurs de l'élastase, les agents endocrines, les alkaloïdes de l'ergot, les expectorants, les agents gastro-intestinaux, les agents génito-urinaires, le facteur de déclenchement de l'hormone de croissance, les hormones de croissance, les agents hématologiques, les
agents hématopoïétiques, les hémostatiques, les hormones, les immunosuppresseurs, les interleukines, les analogues d'interleukines, les agents de régulation des lipides, la gonadolibérine, les myorelaxants, les antagonistes narcotiques, les nutriments, les agents nutritifs, les thérapies oncologiques, les nitrates organiques, les vagomimétiques, les prostaglandines, les antibiotiques, les agents rénaux, les agents respiratoires, les sédatifs, les hormones sexuelles, les stimulants, notamment les immunostimulants, les adjuvants, les agonistes Toll-like récepteur (TLRs), les sympathomimétiques, les anti-infectieux systémiques, le tacrolimus, les agents thrombolytiques, les agents thyroïdiens, les traitements pour les troubles de l'attention, les vasodilatateurs, les xanthines, les agents diminuant le cholestérol. Particulièrement visés sont les anticancéreux tels que le taxol (paclitaxel), la doxorubicine et le cisplatine en particulier pour les applications thérapeutiques, ou bien les agents immunostimulants, les adjuvants, les agonistes TLRs, en particulier pour les applications prophylactiques (vaccins)
Parmi les agents physiques ou chimiques, on peut citer notamment les isotopes radioactifs et les photo-sensibilisateurs.
Parmi les photo-sensibilisateurs, on peut citer notamment ceux appartenant à la classe des tétrapyrroles comme les porphyrines, les bactériochlorines, les phtalocyanines, les chlorines, les purpurines, les porphycènes, les phéophorbides, ou encore ceux appartenant à la classe des texaphyrines ou des hypericines. Parmi les photo sensibilisateurs de première génération, on peut mentionner l’hémato-porphyrine et un mélange de dérivés d’hémato-porphyrine (HpD) (vendu sous la marque commerciale Photofrin® par Axcan Pharma). Parmi les photo-sensibilisateurs de seconde génération, on peut mentionner le méta-tetra-hydroxyphenyl chlorine (mTHPC ; nom commercial Foscan®, Biolitec AG) et le dérivé monoacide du cycle A de la benzoporphyrine (BPD-MA vendu sous la marque commerciale Visudyne® par QLT et Novartis Opthalmics). Les formulations des photo-sensibilisateurs de seconde génération qui associent à ces photo-sensibilisateurs une molécule (lipide, peptide, sucre etc..) qualifiée de transporteur qui permet leur acheminement sélectif au niveau du tissu tumoral sont appelées photo-sensibilisateurs de troisième génération.
Parmi les agents biologiques, on peut mentionner les oligonucléotides, de l’ADN, de l’ARN, des siARN, les peptides et les protéines et les saccharides, de préférence les peptides et les protéines et les saccharides. De préférence, la formulation est exempte de SiARN et/ou de microARN, et plus généralement exempte de séquence nucléotidique susceptible de moduler des mécanismes endogènes d’ARN interférence, voire même exempte d’ARN autre que le mARN, voire même exempte de séquence nucléotidique autre que le mARN.
Bien entendu, l’agent thérapeutique peut être formulé directement sous sa forme active ou sous forme d’un prodrug. Par ailleurs, il est envisagé que plusieurs agents thérapeutiques puissent être formulés en association dans la nanoémulsion.
La quantité d’agent thérapeutique dépend de l’application visée ainsi que de la nature de l’agent. Toutefois, on cherchera généralement à formuler la nanoémulsion avec une concentration maximale en agent thérapeutique, notamment lorsqu’il s’agit d’agents thérapeutiques peu solubles, afin de limiter le volume et/ou la durée d’administration au patient.
Or il a été constaté que la présence du lipide solubilisant dans la phase dispersée permet d’incorporer une quantité importante de composés mêmes hydrophobes ou amphiphiles.
Généralement, la proportion molaire des composants du cœur des nanoparticules lipidiques par rapport aux composants des nanoparticules lipidiques, sans tenir compte de la quantité molaire de(des) l’ARNm, est de 10 à 80%, notamment de 25 à 75%, de préférence de 33,35 à 73,99%. Autrement dit, la proportion molaire (mol/mol) des quantités molaires cumulées de lipide solubilisant, de l’éventuelle huile, de l’éventuel agent d’imagerie, de l’éventuel agent thérapeutique lipophile) par rapport à la quantité molaire de la phase dispersée (c'est-à-dire à la quantité molaire cumulée de tous les composants de la phase dispersée, sauf de celle du(des) ARNm, c’est-à-dire la quantité molaire cumulée de lipide solubilisant, éventuelle huile, éventuel agent d’imagerie, éventuel agent thérapeutique lipophile, lipide amphiphile, tensioactif cationique, co-tensioactif, éventuel lipide fusogène, éventuel agent thérapeutique amphiphile, est généralement de 10 à 80%, notamment de 25 à 75%, de préférence de 33,35 à 73,99%.
Généralement, la proportion massique (wt/wt) des composants du cœur des nanoparticules lipidiques par rapport aux composants des nanoparticules lipidiques, sans tenir compte du poids de(des) l’ARNm, est de 10 à 60%, notamment de 20 à 60%, de préférence de 23,53 à 59,51%. Autrement dit, la proportion massique des masses cumulées du lipide solubilisant, de l’éventuelle huile , de l’éventuel agent d’imagerie, de l’éventuel agent thérapeutique lipophile par rapport à la phase dispersée (c'est-à-dire à la masse de tous les composants de la phase dispersée sauf l’ARNm, c’est-à-dire les masses cumulées de lipide solubilisant / éventuelle huile / éventuel agent d’imagerie / éventuel agent thérapeutique lipophile/ lipide amphiphile / tensioactif cationique / co-tensioactif / éventuel lipide fusogène, éventuel agent thérapeutique amphiphile, est généralement de 10 à 60%, notamment de 20 à 60%, de préférence de 23,53 à 59,51%.
Ces proportions molaires et/ou massiques sont particulièrement adaptées pour que la formulation « prémix » (celle utilisée pour préparer la formulation selon l’invention, avant complexation de l’ARNm) soit stable au stockage, notamment qu’elle soit stable en étant stockée plus de 2 ans à 4°C. La stabilité peut notamment être mesurée en suivant la taille des nanoparticules lipidiques, leur index de polydispersité et/ou leur potentiel zêta (par exemple par diffusion quasi-élastique de la lumière, notamment par un appareil de type ZetaSizer, Malvern). Cette stabilité de la formulation « prémix » est importante pour les applications envisagées. Il est particulièrement intéressant de pouvoir stocker la formulation « prémix » et d’effectuer la complexation avec l’ARNm juste avant utilisation de la formulation selon l’invention.
La phase aqueuse de la nanoémulsion utilisée dans l’invention est de préférence constituée d'eau et/ou d'un tampon tel qu'un tampon phosphate comme par exemple du PBS ("Phosphate Buffer Saline") ou d'une solution saline, notamment de chlorure de sodium.
Selon un mode de réalisation, la phase aqueuse continue comporte également un agent épaississant tel que du glycérol, un saccharide, oligosaccharide ou polysaccharide, une gomme ou encore une protéine, de préférence du glycérol. En effet, l’utilisation d’une phase continue de viscosité plus élevée facilite l’émulsification et permet de ce fait de réduire le temps de sonication.
La phase aqueuse comporte avantageusement de 0 à 50% en poids, de préférence de 1 à 30% en poids et tout particulièrement de 5 à 20% en poids d’agent épaississant.
Bien entendu, la phase aqueuse peut contenir en outre d’autres additifs tels que des colorants, stabilisants et conservateurs en quantité appropriée.
La proportion de phase dispersée et de phase aqueuse est très variable. Cependant, le plus souvent, les nanoémulsions seront préparées avec 1 à 50%, de préférence 5 à 40% et tout particulièrement 10 à 30% en poids de phase dispersée (sans tenir compte de l’ARNm) et 50 à 99%, de préférence 60 à 95% et tout particulièrement 70 à 90 % en poids de phase aqueuse.
ARN messager (ARNm)
Dans la formulation, au moins un ARN messager (ARNm), dont la séquence nucléotidique monobrin comprend au moins 300 bases, est complexé à la surface des nanoparticules lipidiques.
Cet ARNm est susceptible d’être traduit en protéine par une cellule eucaryote.
Sa séquence nucléotidique est monobrin, et il comprend au moins 300 bases, typiquement au moins 400 bases, notamment au moins 500 bases, de préférence au moins
1000 bases, de manière particulièrement préféré au moins 2000 bases, voire même plus de 10000 bases. Généralement, il comprend moins de 50 000 bases.
L’ARNm comprend typiquement (et est généralement constitué de) une coiffe en 5’, une région 5’-UTR, une région ORF, une région 3’-UTR et une queue poly(A) en 3’.
L’ARNm peut être naturel ou synthétique.
L’ARNm peut notamment être un ARNm synthétique transcrit in vitro (IVT mARN), par exemple tel que décrit dans l’article Sahin et al. Nature Reviews 13, 2014, 759.
L’ARNm synthétique peut comprendre une ou plusieurs bases non naturelles, notamment choisies parmi l’uridine, la pseudoridine, la N1-méthyl-pseudouridine, la 5- méthoxy-uridine et la 5-méthyl-cytidine, sous réserve que l’ARNm reste susceptible d’être traduit en protéine par une cellule eucaryote.
Sa région 3’-UTR peut être stabilisée, notamment par une séquence de stabilisation riche en pyrimidines. Typiquement la région 3’UTR est celle de la a- ou b-globine. Des modifications usuelles de l’ARNm synthétique sont décrites au paragraphe « Improving the translation and stability of mRNA » de l’article Sahin et al. Nature Reviews 13, 2014, 759.
L’ARNm synthétique comprend généralement une queue poly(A) en 3’.
Dans la formulation, l’ARNm n’est pas lié de façon covalente aux autres composants des nanoparticules lipidiques. Notamment, l’ARNm n’est pas lié de façon covalente ni au co-tensioactif, ni au lipide amphiphile, ni à l’éventuel agent d’imagerie. Ceci est très avantageux car les ARNm, une fois libérés dans leur site d’action, ne sont pas dénaturées et peuvent jouer le rôle attendu.
Un ARNm comprend des liaison phosphodiester, qui comprennent des groupements phosphates chargés négativement. L’ARNm est donc naturellement porteur de charges négatives.
Grâce à leurs charges négatives, les ARNm sont maintenus à la surface des nanoparticules lipidiques de la phase dispersée de la formulation grâce aux interactions électrostatiques avec les charges positives des tensioactifs cationiques.
Ils sont donc localisés à la surface des nanoparticules lipidiques, au niveau de la couronne des nanoparticules lipidiques, du côté hydrophile de la couronne.
Dans la formulation selon l’invention, le rapport N/P de la quantité de charges positives du tensioactif cationique par rapport à la quantité de charges négatives de l’ARN messager est supérieur ou égal à 2/1 , notamment supérieur ou égal à 4/1 , notamment supérieur ou égal à 5/1 , de préférence supérieur ou égal à 6/1 , de manière particulièrement préférée supérieur ou égal à 8/1 . Des rapports N/P inférieurs conduisent à une délivrance insuffisante de l’ARNm. Plus le rapport N/P est important, plus les nanoparticules lipidiques sont chargées en ARNm. Le rapport N/P est généralement inférieur à 2000.
Généralement, l’ARNm n’est pas susceptible de moduler des mécanismes endogènes d’ARN interférence.
La formulation peut comprendre de la protamine, de préférence du sulfate de protamine. Celle-ci permet avantageusement de contracter l’ARNm et donc de limiter son encombrement stérique, ce qui améliore la complexation entre l’ARNm et les nanoparticules lipidiques. Ce mode de réalisation est donc particulièrement avantageux pour les ARNm à chaîne longue, comprenant typiquement au moins 2000 bases.
Taille
Les nanoparticules lipidiques de la formulation ont généralement un diamètre compris entre 20 et 250 nm, typiquement entre 40 et 200 nm. Ce diamètre peut notamment être mesuré par diffusion quasi-élastique de la lumière sur un appareil ZetaSizer, Malvern.
Comme illustré sur la figure 1 , les nanoparticules lipidiques de la formulation selon l’invention s’organisent sous forme de cœur - couronne, où :
- le cœur comprend :
- le lipide solubilisant, l’éventuelle huile, l’éventuel agent d’imagerie, l’éventuel agent thérapeutique s’il est lipophile,
- la couronne comprend :
- le lipide amphiphile,
- le tensioactif cationique, le co-tensioactif (éventuellement greffé avec une molécule d’intérêt),
- l’ARNm, l’éventuel lipide fusogène, l’éventuel agent thérapeutique s’il est amphiphile, l’éventuel tensioactif de formule (I).
De préférence, le cœur des nanoparticules lipidiques de la formulation est exempt d’ARNm, voire d’ARN, voire même de séquence nucléotidique. Autrement dit, il n’y a généralement pas d’ARNm, voire d’ARN, voire même de séquence nucléotidique, encapsulé à l’intérieur des nanoparticules lipidiques. La localisation des ARNm peut par exemple être vérifiée par microscopie électronique en transmission (TEM) ou par cryo- microscopie (cryo-TEM).
[Procédé de préparation]
Selon un deuxième objet, l’invention concerne le procédé de préparation de la formulation définie ci-dessus.
Typiquement, on mélange d’abord les différents constituants huileux pour préparer un pré-mélange huileux pour la phase dispersée de la nanoémulsion, puis on le disperse dans une phase aqueuse sous l’effet d’un cisaillement, et enfin on complexe l’ARNm.
Le procédé de préparation comprend typiquement les étapes suivantes :
(i) préparer une phase huileuse comprenant le lipide solubilisant, le lipide amphiphile, le tensioactif cationique, l’éventuel lipide fusogène;
(ii) préparer une phase aqueuse comprenant le co-tensioactif;
(iii) disperser la phase huileuse dans la phase aqueuse sous l’action d’un cisaillement suffisant pour former une formulation sous forme de nanoémulsion; puis
(iv) ajouter l’ARN messager dont la séquence nucléotidique monobrin comprend au moins 300 bases à la formulation obtenue à l’étape (iii), puis
(v) récupérer la formulation ainsi formée.
Généralement, la préparation de la phase huileuse comprend le mélange des composants huileux de la formulation (lipide solubilisant / lipide amphiphile / tensioactif cationique). Lorsque la formulation comprend un lipide susceptible de faciliter la libération cytosolique par déstabilisation de la membrane endosomale et/ou une huile, et/ou un agent d’imagerie et/ou un agent thérapeutique, ceux-ci sont généralement introduits dans la phase huileuse lors de l’étape (i).
Le mélange peut éventuellement être facilité par mise en solution d’un des constituants ou du mélange complet dans un solvant organique approprié. Le solvant organique est ensuite évaporé, pour obtenir un pré-mélange huileux homogène pour la phase dispersée.
Par ailleurs, il est préféré de réaliser le pré-mélange (étape (i)) à une température à laquelle l’ensemble des ingrédients est liquide.
Avantageusement, la phase huileuse est dispersée dans la phase aqueuse à l’état liquide. Si l’une des phases se solidifie à température ambiante, il est préférable de réaliser le mélange avec l’une ou de préférence les deux phases chauffées à une température supérieure ou égale à la température de fusion.
L’émulsification sous l’effet de cisaillement est de préférence réalisée à l'aide d'un sonificateur ou d'un microfluidiseur. De préférence, la phase aqueuse puis la phase huileuse sont introduites dans les proportions souhaitées dans un récipient cylindrique approprié puis le sonificateur est plongé dans le milieu et mis en marche pendant une durée suffisante pour obtenir une nanoémulsion, le plus souvent quelques minutes.
A la fin de l’étape (iii), on obtient généralement une nanoémulsion homogène dans laquelle :
- le diamètre moyen des nanoparticules lipidiques, mesuré par diffusion quasi-élastique de la lumière, par exemple sur un appareil ZetaSizer, Malvern, est généralement supérieur à 10 nm et inférieur à 200 nm, notamment de 20 à 200 nm, de préférence de 30 à 190 nm, et
- le potentiel zêta est supérieur à 20 mV, généralement compris entre 25 mV et 60 mV, de préférence entre 40 et 55 mV, mesuré par diffusion électrophorétique de la lumière (ELS), par exemple sur un appareil ZetaSizer, Malvern, de préférence lorsque la phase aqueuse de la formulation est une solution aqueuse de NaCI 0,15 mM.
La nanoémulsion obtenue à la fin de l’étape (iii) (donc avant la complexation avec l’ARNm) correspond à la formulation dite « prémix ».
Pour une formulation prémix comprenant des nanoparticules lipidiques de taille comprise entre 20 et 40 nm, on préférera utiliser une formulation comprenant au moins 5% molaire de lipide amphiphile et :
- de 25 à 45% molaire de co-tensioactif (en dessous de 25% molaire, la formulation peut présenter des problèmes de stabilité), et/ou
- de 15 à 50% molaire de tensioactif cationique.
Pour une formulation prémix comprenant des nanoparticules lipidiques de taille comprise entre 40 et 100 nm, on préférera utiliser une formulation comprenant au moins 5% molaire de lipide amphiphile et :
- de 45 à 50% molaire de co-tensioactif (en dessous de 45% molaire, la formulation peut présenter des problèmes de stabilité. Au-delà de 50%, le relargage de l’ARNm du complexe LNP-ARNm est moins efficace, et/ou
- de 30 à 40% molaire de tensioactif cationique (en dessous de 30% molaire, le relargage de l’ARNm du complexe LNP-ARNm est moins efficace. Au-delà de 40%, la formulation peut présenter des problèmes de stabilité).
Pour une formulation prémix comprenant des nanoparticules lipidiques de taille comprise entre 130 et 175 nm, on préférera utiliser une formulation comprenant
- au moins 5% molaire de lipide amphiphile et de 15 à 70% molaire d’au moins un tensioactif cationique et :
- de 10 à 25% molaire, notamment de 10 à 15% de co-tensioactif.
Les pourcentages molaires de lipide amphiphile, de tensioactif cationique et de co- tensioactif sont par rapport aux proportions molaires cumulées du lipide amphiphile, du tensioactif cationique, du co-tensioactif et de l’éventuel lipide fusogène.
En complexant la formulation « prémix » définie ci-dessus avec de l’ARNm, on obtient la formulation selon l’invention.
L’étape (iv) permet alors de préparer la formulation par complexation desdits ARNm sur la formulation « prémix » obtenue à la fin de l’étape (iii).
Généralement, les ARNm sont ajoutés à la nanoémulsion formée et le mélange obtenu est mélangé à température ambiante (de 20 à 25°C), par exemple de 5 à 30 minutes.
Lors de l’étape (iv), les ARNm, porteurs de groupes phosphates chargés négativement, se lient par liaisons électrostatiques aux nanoparticules lipidiques dont la surface est chargée positivement grâce aux groupes cationiques des tensioactifs cationiques. Des complexes sont ainsi formés entre les ARNm et les nanoparticules lipidiques de la nanoémulsion. Les ARNm sont généralement ajoutés en solution aqueuse, par exemple de l’eau exempte de nucléases, des milieux de culture cellulaire, des milieux de culture. L’étape (iv) est typiquement réalisée à température ambiante (25°C), après simple homogénéisation ou sous agitation (par exemple entre 100 et 1000 tours par minute), pendant une durée comprise entre 5 minutes et 2 heures, par exemple de l’ordre de 30 minutes.
Lors de l'étape (iv), la quantité d’ARNm introduite est telle que le rapport entre la quantité de charges positives dues au tensioactif cationique dans la formulation « prémix » sur la quantité de charges négatives apportées par les séquences nucléotidiques introduites dans le milieu est supérieur ou égal à 2/1. L’homme du métier est à même de calculer la quantité de charges négatives apportées par les séquences nucléotidiques introduites dans le milieu, et la quantité de charges positives dues au tensioactif cationique dans la formulation « prémix ».
L’étape (iv) peut être suivie par diverses méthodes, par exemple par : électrophorèse sur gel d’agarose, qui permet d’observer la migration des ARNm. S’il y a une bonne complexation, alors les ARNm complexés aux nanoparticules lipidiques sont plus lourds et sont visualisés dans les puits. Si la complexation est moins importante, des ARNm libres migreront à une autre position. diffusion dynamique de la lumière (DLS), en observant l’impact de la complexation sur le diamètre hydrodynamique. Plus la complexation est efficace, plus le profil s’oriente vers une distribution monomodale.
A la fin de l’étape (iv), on obtient généralement une nanoémulsion homogène dans laquelle le diamètre moyen des nanoparticules lipidiques est généralement supérieur à 10 nm et inférieur à 200 nm, de préférence entre 60 et 200 nm.
Avantageusement, le procédé de préparation de la formulation ne nécessite pas de modifier chimiquement les ARNm, et ne nécessite en particulier pas de les greffer de façon
covalente à un autre composant de la formulation. Il est donc très aisé de préparer en parallèle de nombreuses formulations selon l’invention comprenant des ARNm.
L’ajout de l’ARNm après la fabrication des nanoparticule lipidiques permet de rationaliser la fabrication à grande échelle d’une formulation prémix, qui sera complexé ultérieurement avec des ARNm distincts. Ceci apporte une forte amélioration par rapport à l’encapsulation d’ARNm au cœur de LNP, qui nécessite de préparer à nouveau les LNP dès que l’on souhaite changer la nature de l’ARNm.
La formulation peut être purifiée, par exemple par purification sur colonne ou par dialyse.
Avant conditionnement, l'émulsion peut être diluée et/ou stérilisée, par exemple par filtration ou dialyse. Cette étape permet d'éliminer les éventuels agrégats qui pourraient s'être formés au cours de la préparation de l'émulsion.
L’émulsion ainsi obtenue est prête à l’emploi, le cas échéant après dilution.
Selon un troisième objet, l’invention concerne la formulation susceptible d’être obtenue par le procédé défini ci-dessus.
[Kit]
Selon un quatrième objet, l’invention concerne un kit comprenant la formulation « prémix » telle que définie ci-dessus, et séparément, au moins un ARNm.
Dans le kit, la formulation « prémix » est séparée physiquement de l’ARNm. On peut par exemple utiliser un kit comprenant au moins deux récipients, un pour la formulation « prémix », et au moins un pour un ARNm, de préférence plusieurs contenant chacun des ARNm de nature différente.
De préférence, la quantité d’ARNm du kit est telle que le rapport N/P de la quantité de charges positives du tensioactif cationique de la formulation « prémix » par rapport à la quantité de charges négatives de l’ARN messager est supérieur ou égal à 2/1. Autrement dit, le mélange de la formulation « prémix » et l’ARNm conduit à la préparation de la formulation selon l’invention.
Comme explicité ci-dessus, la formulation « prémix », notamment grâce à :
- la proportion molaire de tensioactif cationique dans la couronne des nanoparticules lipidiques,
- la proportion molaire de lipide amphiphile dans la couronne des nanoparticules lipidiques,
- la proportion molaire de co-tensioactif dans la couronne des nanoparticules lipidiques,
- le fait que le co-tensioactif comprenne une chaîne poly(oxyde d’éthylène) comprenant au moins 25 unités d’oxyde d’éthylène,
- la présence de lipide solubilisant dans le cœur des nanoparticules lipidiques, et/ou
- la proportion molaire et/ou massique de cœur dans les nanoparticules lipidiques, est avantageusement stable. Cette stabilité de la formulation « prémix » permet de stocker à long terme la formulation « prémix », notamment plus de deux ans à 4°C, ce qui est un énorme avantage pour pouvoir stocker et commercialiser le kit défini ci-dessus.
Il est ainsi avantageusement possible de préparer la formulation selon l’invention à partir de la formulation « prémix » et de l’ARNm juste avant utilisation de la formulation selon l’invention. La formulation « prémix » peut être stockée. Ainsi, il n’est pas nécessaire de préparer l’émulsion « prémix » à chaque fois que l’on souhaite utiliser la formulation selon l’invention, ce qui est un avantage en termes de gain de temps et de coût. [Utilisation]
La formulation est avantageusement stable et peu toxique. Elle peut être utilisée comme système de délivrance in vitro ou in vivo de ARNm.
Ainsi, selon un cinquième objet, l’invention concerne la formulation définie ci-dessus pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement d’une maladie.
Une utilisation préférentielle de la formulation selon l’invention est la délivrance d’une séquence d’ARNm codant pour une protéine antigénique dans le but d’induire une réponse immunitaire prophylactique contre des pathogènes. Ces pathologies peuvent être par exemple des pathologies inflammatoires, les cancers (cancer, les tumeurs solides, les métastases mais également les leucémies myéloïdes chroniques), ou bien les maladies infectieuses dans le cas d’une thérapie prophylactique. La maladie infectieuse peut être celle induite le virus de l’hépatite C (VHC), par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), par le virus respiratoire syncytial (VRS), par un coronavirus, notamment par la souche de coronavirus SARS-CoV-2, par exemple la COVID19, ou la grippe.
Lorsque la formulation comprend un agent d’imagerie, il est avantageusement possible de suivre la délivrance des ARNm, par exemple par suivi de la fluorescence lorsque l’agent d’imagerie est un fluorophore lipophile.
Avantageusement, comme explicité ci-dessus, la formulation selon l’invention protège les ARNm du corps du patient (et de ces nucléases) auquel la formulation est administrée.
La formulation peut comprendre un agent thérapeutique permettant de traiter la maladie, ce qui permet de bénéficier d’un double effet thérapeutique ou prophylactique : celui induit par les ARNm et celui induit par l’agent thérapeutique.
Du fait qu’elle peut être préparée exclusivement à partir de constituants approuvés pour l’homme, elle est intéressante pour une administration par voie parentérale. Cependant, il est également possible d’envisager une administration par d’autres voies, notamment par voie orale, par voie topique, ou par voie ophtalmologique.
Une méthode de prévention et/ou de traitement d’une maladie comprenant l'administration chez un mammifère, de préférence un humain, qui en a besoin d'une quantité efficace de la formulation telle que définie ci-dessus est également un des objets de la présente invention.
[Définitions]
Dans le cadre de la présente demande, on entend par le terme « nanoémulsion » une composition présentant au moins deux phases, généralement une phase huileuse et une phase aqueuse, dans laquelle la taille moyenne de la phase dispersée est inférieure à 1 micron, de préférence de 10 à 500 nm et en particulier de 20 à 200 nm, et tout préférentiellement de 50 à 200 nm (voir article C. Solans, P. Izquierdo, J. Nolla, N. Azemar and M. J. Garcia-Celma, Curr Opin Colloid In, 2005, 10, 102-110).
Au sens de la présente demande, l’expression « phase dispersée » signifie les nanoparticules lipidiques comprenant l’éventuelle huile / le tensioactif cationique / le lipide solubilisant/ le lipide amphiphile/ le co-tensioactif/ l’éventuel tensiactif de formule (I)/ l’éventuel lipide fusogène / l’éventuel agent d’imagerie / l’éventuel agent thérapeutique / l’ARNm. La phase dispersée est généralement exempte de phase aqueuse.
Le terme « nanoparticules lipidiques » englobe à la fois les gouttelettes d’huile liquide proprement dites ainsi que les particules solides issues d’émulsions de type huile- dans-eau dans lesquelles la phase dispersée est solide. Dans ce dernier cas, on parle souvent aussi d’émulsion solide.
Le terme « lipide » désigne dans le cadre de cet exposé l’ensemble des corps gras ou des substances contenant des acides gras présents dans les graisses d’origine animales et dans les huiles végétales. Ce sont des molécules hydrophobes ou amphiphiles principalement constituées de carbone, d’hydrogène et d’oxygène et ayant une densité inférieure à celle de l'eau. Les lipides peuvent être à l'état solide à température ambiante (25°C), comme dans les cires, ou liquide, comme dans les huiles.
Le terme « phospholipide » vise des lipides possédant un groupe phosphate, notamment les phosphoglycérides. Le plus souvent, les phospholipides comportent une extrémité hydrophile formée par le groupe phosphate éventuellement substitué et deux extrémités hydrophobes formées par des chaînes d’acides gras. Parmi les phospholipides, on citera en particulier la phosphatidylcholine, la phosphatidyl éthanolamine, la phophatidyl inositol, la phosphatidyl sérine et la sphingomyéline.
Le terme « lécithine » désigne la phosphatidylcholine, c’est-à-dire un lipide formé à partir d'une choline, d'un phosphate, d'un glycérol et de deux acides gras. Il couvre de manière plus large les phospholipides extraits du vivant, d’origine végétale ou animale, dans la mesure où ils sont majoritairement constitués de phosphatidylcholine. Ces
lécithines constituent généralement des mélanges de lécithines portant différents acides gras.
On entend par le terme « acide gras » désigner des acides carboxyliques aliphatiques présentant une chaîne carbonée d’au moins 4 atomes de carbone. Les acides gras naturels possèdent une chaîne carbonée de 4 à 28 atomes de carbone (généralement un nombre pair). On parle d'acide gras à longue chaîne pour une longueur de 14 à 22 carbones et à très longue chaîne s'il y a plus de 22 carbones.
On entend par le terme « tensioactif » des composés à structure amphiphile qui leur confère une affinité particulière pour les interfaces de type huile/eau et eau/huile ce qui leur donne la capacité d'abaisser l'énergie libre de ces interfaces et de stabiliser des systèmes dispersés.
On entend par le terme « co-tensioactif » un tensioactif agissant en plus d’un tensioactif pour abaisser davantage l’énergie de l’interface.
On entend par le terme « chaîne hydrocarbonée » désigner une chaîne composée d’atomes de carbone et d’hydrogène, saturée ou insaturée (double ou triple liaison). Les chaînes hydrocarbonées préférées sont les alkyle ou alcényle.
On entend par le terme « alkylène » désigner un groupe divalent aliphatique hydrocarboné, saturé, linéaire ou ramifié, de préférence linéaire.
On entend par « radical cyclique » un radical issu d’un cycle. Par exemple, un radical phénylène est un radical divalent issu d’un groupe benzène. Par « cycle », on entend un carbocycle ou un hétérocycle, saturé, insaturé ou aromatique (aryle ou hétéroaryle), un carbocycle : un cycle composé d’atomes de carbone, saturé (les carbocycles saturés préférés étant notamment un cycloalkyle, tel que un cyclopentyle ou un cyclohexyle), insaturé (par exemple un cyclohexène) ou aromatique (c'est-à-dire un phényle),
- un hétérocycle : un groupe cyclique comprenant, sauf mention contraire, de 5 à 6 atomes, et comprenant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et/ou S. Ledit hétérocycle peut être saturé ou partiellement insaturé et comprendre une ou plusieurs doubles liaisons. On parle alors de groupe hétérocycloalkyle. Il peut également être aromatique, comprenant, sauf mention contraire, de 5 à 6 atomes et représenter alors un groupe hétéroaryle. à titre d’hétérocycle non aromatique ou hétérocycloalkyle, on peut citer, le pyrazolidinyle, l’imidazolidinyle, le tétrahydrothiophényle, le dithiolanyle, le thiazolidinyle, le tétrahydropyranyle, le dioxanyle, le morpholinyle, le pipéridyle, le pipérazinyle, le tétrahydrothiopyranyle, le thiomorpholinyle, le
dihydrofuranyle, le 2-imidazolinyle, le 2,-3-pyrrolinyle, le pyrazolinyle, le dihydrothiophényle, le dihydropyranyle, le pyranyle, le tétrahydropyridyle, le dihydropyridyle, le tétrahydropyrinidinyle, le dihydrothiopyranyle, l’isoxazolidinyle, à titre d’hétéroaryle, on peut notamment citer les groupes représentatifs suivants : furyle, imidazolyle, isoxazolyle, isothiazolyle, oxadiazolyle, 1 ,2,4- oxadiazolyle, 1 ,3,4-oxadiazolyle, pyrazinyle, pyridazinyle, pyrazolyle, pyridyle, pyrimidinyle, pyrrolyle, 1 ,3,4-thiadiazolyle, 1 ,2,3-thiadiazolyle, thiazolyle, thiényle, triazolyle, 1 ,2,3-triazolyle et 1 ,2,4-triazolyle.
Par « ester activé », on entend un groupe de formule -CO-LG, et par « carbonate activé », on entend un groupe de formule -O-CO-LG où LG est un bon groupe partant notamment choisi parmi un chlore, un imidazolyle, un pentafluorophénolate, un pentachlorophénolate, un 2,4,5-trichlorophénolate, 2,4,6-trichlorophénolate, un groupe -O- succinimidyle, -O-benzotriazolyle, -0-(7-aza-benzotriazolyle) et -0-(4-nitrophényle).
L’invention sera décrite plus en détail au moyen des figures en annexe et des exemples qui suivent.
FIGURES
[Fig. 1] La figure 1 représente un schéma de la complexation de l’ARNm avec une nanoparticule lipidique (« LNP ») ayant une structure cœur/couronne afin de former un complexe ARNm-LNP. Dans la couronne de la nanoparticule lipidique sont illustrés les phospholipides (lécithine en tant que lipide amphiphile et DOTAP en tant que tensioactif cationique) et le co-tensioactif dont la chaîne poly(oxyde d’éthylène) se repliant est représentée dans la phase aqueuse. Dans le complexe ARNm-LNP, l’ARNm se localise dans la couronne des nanoparticules lipidiques.
[Fig. 2] La figure 2 représente le pourcentage de cellules positives à la GFP déterminé à partir d’images de microscopie confocale pour chaque expérience, les expériences différant les unes des autres par le rapport N/P des complexes ARNm-LNP utilisés et/ou par la dose de complexes ARNm-LNP par puits (exemple 2).
* P < 0.05, ** P < 0.01 , *** P < 0.001 . NT, Non traité.
[Fig. 3] La figure 3 représente le pourcentage de cellules positive pour la GFP en fonction du nombre de nanoparticules lipidiques (« LNP ») par cellules (moyenne, ± S.E.M., N = 3 expériences indépendantes) (exemple 2).
[Fig. 4] La figure 4 représente le pourcentage de cellules positives à la GFP déterminé à partir d’images de microscopie confocale pour chaque expérience (exemple 3).
n.s., non-significatif, * P < 0.05, ** P < 0.01 , *** P < 0.001 .
NT, Non traité.
Lipo : Lipofectamine (contrôle positif),
LNP2018 : complexe ARNm-LNP préparé à partir de LNP ayant été stockées pendant 2 ans à +4°C avant la complexation avec l’ARNm,
LNP 2020 : complexe ARNm-LNP préparé à partir de LNP ayant été préparés juste avant la complexation avec l’ARNm
[Fig. 5] La figure 5 représente le pourcentage de cellules positives à la GFP déterminé à partir d’images de microscopie confocale pour chaque expérience (exemple
4).
* P < 0.05, NT, Non traité.
[Fig. 6] La figure 6 représente le pourcentage de cellules positives à la GFP déterminé à partir d’images de microscopie confocale pour chaque expérience (exemple
5).
*** P < 0.001. NT, Non traité.
[Fig. 7] La figure 7 représente le pourcentage de lymphocytes T CD4 exprimant CD69 en réponse aux cellules dendritiques traitées avec des complexes ARNm Ova - LNP conservés pendant 7 jours, 1 mois ou 3 mois à 4°C ou -20°C, déterminé à partir d’images de microscopie confocale pour chaque expérience (exemple 6).
No ttt : sans ajout de LNP ou de complexe (témoin)
CL40 : LNP non complexé
CL40-mRNA cherry frais : complexe LNP- mRNA cherry fraîchement complexé (contrôle positif)
CL40-mRNA OVA frais: complexe LNP- mRNA OVA fraîchement complexé (contrôle positif)
CL40-mRNA OVA -20°C: complexe LNP- mRNA OVA après conservation à -20°C. CL40-mRNA OVA 4°C: complexe LNP- mRNA OVA après conservation à 4°C.
[Fig. 8A] La figure 8A représente la concentration d’IFNy dans les surnageants des splénocytes cultivés 4 jours en présence de OVA + lipopolysaccharide (LPS) (exemple 7). Chaque point représente une souris.
CL40-mRNA control : complexe LNP- mRNA contrôle CL40-mRNA OVA : complexe LNP- mRNA OVA
[Fig. 8B] La figure 8B représente la concentration sérique d’anticorps anti-OVA (exemple 7). Chaque point représente une souris.
CL40-mRNA control : complexe LNP- mRNA contrôle CL40-mRNA OVA : complexe LNP- mRNA OVA
[Fig. 9A] La figure 9A représente la concentration CI’IFNY dans les surnageants des splénocytes cultivés 2 jours en présence de Spike + lipopolysaccharide (LPS) (exemple 8). Chaque point représente une souris.
CL40-mRNA OVA I.P. : complexe LNP- mRNA OVA (contrôle), injection par voie intrapéritonéale
CL40-mRNA Spike I.P. : complexe LNP- mRNA Spike, injection par voie intrapéritonéale CL40-mRNA Spike I.M. : complexe LNP- mRNA Spike, injection par voie intramulsculaire [Fig. 9B] La figure 9B représente la concentration sérique d’anticorps anti-Spike (exemple 8). Chaque point représente une souris.
CL40-mRNA OVA : complexe LNP- mRNA OVA (contrôle)
CL40-mRNA Spike: complexe LNP- mRNA Spike
[Fig. 10] La figure 10 représente l’indice d’expression de la protéine Spike déterminé par des mesures en cytométrie de flux de la proportion de cellules PC3 exprimant la protéine Spike et de l’intensité moyenne de fluorescence de ces cellules (exemple 9). SPIKE Compacté seul : ARNm Spike et sulfate de protamine (exempt de LNP)
LNP seules : LNP non complexées
SPIKE-LNP N/P=6 : Complexe LNP-ARNm Spike avec un ratio N/P de 6 (exempt de sulfate de protamine)
SPIKE compacté-LNP N/P=6 : Complexe LNP-ARNm Spike compacté avec du sulfate de protamine.
EXEMPLES
Exemple 1 : Préparation de complexes ARNm-LNP
Dans les exemples qui suivent, des nanoparticules cationiques LNP sont celles de l’émulsion A3 du tableau 1 de la demande de brevet WO 2014/032953 en suivant le procédé de préparation décrit p. 65, 1. 30 à p. 66, 1. 16.
Un ARNm codant pour une protéine fluorescente (GFP, Green Fluorescent Protein, Tebu-Bio) a été utilisé.
La complexation de l’ARNm a été réalisée par mélange de la formulation préparée avec une solution d’ARNm dans du milieu OptiMEM.
Le mélange a été agité durant 10 minutes à 600 rpm à température ambiante (environ 25°C).
La figure 1 schématise l’étape de complexation entre les nanoparticules lipidiques et l’ARNm afin de forme le complexe LNP-ARNm.
Exemple 2 : Détermination des conditions de complexation ARNm-LNP pour une déliyrance optimale de l’ARNm
Un ARNm codant pour une protéine fluorescente (GFP, Green Fluorescent Protein) a été utilisé pour démontrer la capacité des complexes ARNm-LNP à délivrer l’ARNm.
Des cellules des cellules épithéliales (PC3, adénocarcinome de la prostate, ATCC) ont été ensemencées sur une plaque 96 puits à une densité de 8400 cellules par puits 24 h avant l’incubation avec les différents complexes.
Des complexes ARNm-LNP ont été préparés extemporanément avec des rapports N/P de 2/1 , 4/1 , 8/1 , 16/1 , 24/1 ou 36/1 . Le rapport N/P est le rapport de la quantité de charges positives dues au tensioactif cationique dans la formulation avant complexation (dues à l’azote chargé, d’où le N de N/P) par rapport à la quantité de charges négatives apportée par l’ARNm (dues au phosphate de l’ARNm, d’où le P de N/P).
Dans chaque cas, une dose de complexes ARNm-LNP par puits a été ajoutée sur les cellules PC3 dans du milieu RPMI supplémenté en HEPES pH7,3 à 20 mM de manière que la dose d’ARNm par puits soit de 7,8 ng, 15,8 ng, 31 ,25 ng, 62,5 ng, 125 ng ou 250 ng.
Le réactif Lipofectamine (Lipo) (Sigma) a été utilisé comme méthode de contrôle positif (référence) pour la délivrance d’ARNm. L’ARNm seul (ARNm) a été utilisé comme contrôle négatif.
Après 6 h d’incubation, le milieu a été aspiré et remplacé par du milieu RPMI supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal et 1% de pénicilline/streptomycine. Les noyaux cellules ont ensuite été marqués 24h après l’incubation avec les complexes avec du Hoechst 33342 (2 mM) pendant 20 min puis les cellules ont été fixées avec une solution de paraformaldéhyde 4% pendant 20 min. Enfin, les cellules ont été observées au microscope confocal (Zeiss LSM880) par une prise d’image automatisée (25 images par puits, temps d’illumination de 4 psec par pixel). Les images ont été segmentées à l’aide du logiciel Cell Profiler et la positivité de chaque cellule pour la GFP a été évaluée par rapport à l’intensité de fluorescence normalisée pour corriger le bruit de fond à l’aide d’un script Python (>2000 cellules par conditions). Enfin, le pourcentage de cellules positives pour la GFP a été quantifié (moyenne, ± S.E.M., N = 3 expériences indépendantes). Les P-values ont été déterminées par un test ANOVA. * P < 0.05, ** P < 0.01 , *** P < 0.001 .
Les résultats sont fournis à la figure 2, où LNP NPX correspond aux résultats pour le complexe ARNm-LNP préparé avec un rapport N/P de X/1 , X étant le nombre indiqué. Par exemple, LNP NP2 signifie complexe ARNm-LNP préparé avec un rapport N/P de 2/1 .
On a observé que l’intensité de fluorescence est variable en fonction du rapport N/P des complexes ARNm-LNP, correspondant au rapport entre les charges positives portées
les groupement amines des LNP et les groupements phosphates de chaque liaison phosphodiester de l’ARNm.
Une quantification systématique du nombre de cellules positives pour la GFP a été réalisée pour déterminer une plage optimale de rapport N/P permettant avoir une bonne efficacité de délivrance de l’ARNm GFP. Cette plage optimale du rapport N/P est dépendante de la quantité d’ARNm par puits.
En exprimant l’efficacité de transfection en fonction du nombre de LNP par cellules, qui est le produit du rapport N/P par la quantité d’ARNm, nous pouvons identifier une quantité optimale de nanoparticules par cellules à utiliser pour la délivrance d’ARNm. Ce nombre optimal peut être déterminé à partir de la figure 3 et s’élève à 8,32 millions de LNP par cellules dans le cas des cellules épithéliales PC3.
Ce nombre optimal est bien sûr variable en fonction du type de cellules. Cette méthode de détermination des paramètres des complexes formés pour une délivrance optimale d’ARNm permet ainsi une mise au point rapide et applicable à différents types cellulaires d’intérêt.
Exemple 3 : Etude de stabilité au stockage des LNP (avant complexation)
Pour démontrer la stabilité au stockage des LNP à +4°C, des complexes LNP-ARNm ont été préparés à partir :
- soit de LNP préparées en 2018 , soit deux ans avant la complexation, les LNP ayant été conservés à +4°C
- soit de LNP préparées en 2020, soit juste avant la complexation.
Des expériences ont été réalisées dans les conditions optimales déterminées sur les cellules épithéliales PC3 dans l’Exemple 2, c’est-à-dire avec un nombre de LNP par cellules constant à 8 millions.
Les cellules PC3 ont été ensemencées sur une plaque 96 puits à une densité de 8400 cellules par puits 24 h avant l’incubation avec les différents complexes LNP-ARNm. Les complexes ARNm-LNP ont été réalisés extemporanément aux rapports N/P de 8/1 , 16/1 , 32/1 , 64/1 , 128/1 , 256/1 , 512/1 ou 1024/1 et ceux-ci ont été ajoutés sur les cellules PC3 dans du milieu RPMI supplémenté en HEPES pH7.3 à 20mM à une dose de complexes ARNm-LNP par puits telle que la dose d’ARNm soit respectivement de 100 ng, 50 ng, 25 ng, 12,5 ng, 6,25 ng, 3,13 ng, 1 ,56 ng et 0,78 ng par puits, ce qui a permis un nombre constant de 8 millions de LNP par cellules.
Le réactif Lipofectamine (Lipo) a été utilisé comme méthode contrôle positif de référence pour la délivrance d’ARNm, tandis que l’ARNm seul (ARNm) a été utilisé comme contrôle négatif.
Après 6 h d’incubation, le milieu a été aspiré et remplacé par du milieu RPMI supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal et 1% de pénicilline/streptomycine. 24h après l’incubation avec les complexes, les noyaux cellules ont été marqués avec du Hoechst 33342 (2 mM) pendant 20 min puis les cellules ont été fixées avec une solution de paraformaldéhyde 4% pendant 20 min. Les cellules fixées ont été observées au microscope confocal (Zeiss LSM880) par une prise d’image automatisée (25 images par puits, temps d’illumination de 4 psec par pixel). Les images ont été segmentées à l’aide du logiciel Cell Profiler et la positivité de chaque cellule pour la GFP a été évaluée par rapport à l’intensité de fluorescence normalisée pour corriger le bruit de fond à l’aide d’un script Python (>2000 cellules par conditions). Enfin, le pourcentage de cellules positives pour la GFP a été quantifié (moyenne, ± S.E.M., N = 3 expériences indépendantes). Les P-values ont été déterminées par un test ANOVA.
Les résultats sont fournis à la figure 4.
Les résultats montrent un pourcentage de cellules positives pour la GFP élevé et statistiquement significatif par rapport au contrôle non traité jusqu’à 3 ng d’ARNm par puits, lorsque l’ARNm est délivré par des LNP. Cela confirme bien l’efficacité des paramètres déterminés par la méthode décrite dans l’Exemple 2.
De plus, des LNP fabriquées en mars 2018 ou bien en septembre 2020 ont été utilisés, sans noter de différences statistiquement significatives (n.s., P-Values affichées) entre ces deux groupes. Ainsi, les complexes LNP-ARNm sont efficaces pour la délivrance d’ARNm, avec une efficacité similaire au contrôle positif commercial (Lipofectamine, Lipo). Cet exemple démontre la très forte stabilité dans le temps des LNP, et la possibilité de stocker les LNP non complexées à +4°C pendant au moins 2 ans.
Exemple 4: Etude de stabilité au stockage à +4°C des complexes ARNm-LNP
Dans l’exemple 3, ce sont les LNP avant complexation qui avaient été stockés à 4°C pendant deux ans.
A l’exemple 4, ce sont les complexes LNP-ARNm (donc une fois la complexation effectuée) qui ont été stockés 2 semaines à +4°C afin de déterminer leur capacité à délivrer un ARNm GFP dans des cellules cibles après 2 semaines de stockage.
Les cellules PC3 ont été ensemencées sur une plaque 96 puits à une densité de 8400 cellules par puits 24 h avant l’incubation avec les différents complexes.
Les complexes ont été réalisé extemporanément à un rapport de N/P de 8/1 (CL40- NP8 CTRL) ou bien 2 semaines avant l’expérience au rapport N/P de 32/1 (CL40-NP32 2sem-4C), 8/1 (CL40-NP82sem-4C) ou 4/1 (CL40-NP42sem-4C). Pour chacun des quatre
types de complexes, et une dose d’ARNm par puits de 6,25, 12,5, 25, 50 ou 100 ng a été ajoutée sur les cellules PC3 dans du milieu RPMI supplémenté en HEPES pH7,3 à 20mM.
Les nanoparticules non complexées (exemptes d’ARNm) (LNP CTRL) ont été utilisées comme contrôle négatif.
Après 6 h d’incubation, le milieu a été aspiré et remplacé par du milieu RPMI supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal et 1% de pénicilline/streptomycine. 24h après l’incubation avec les complexes, les noyaux cellules ont ensuite été marqués avec du Hoechst 33342 (2 mM) pendant 20 min puis les cellules ont été fixées avec une solution de paraformaldéhyde 4% pendant 20 min. Les cellules fixées ont été observées au microscope à épifluorescence (TECAN SparkCyto) par une prise d’image automatisée (5 images par puits, objectif X10). Les images ont été segmentées à l’aide du logiciel Cell Profiler et la positivité de chaque cellule pour la GFP a été évaluée par rapport à l’intensité de fluorescence normalisée pour corriger le bruit de fond à l’aide d’un script Python (>4000 cellules par conditions). Enfin, le pourcentage de cellules positives pour la GFP a été quantifié (moyenne, ± S.E.M., N = 3 expériences indépendantes). Les P-values ont été déterminées par un test ANOVA. * P < 0.05. NT, Non traité.
Les résultats sont fournis à la figure 5.
Une bonne efficacité de délivrance de l’ARNm GFP pour la dose de 100 ng est observée, que ce soit avec des complexes formés extemporanément à N/P de 8/1 ou bien 2 semaines au préalable à N/P 8/1 et N/P de 32/1 . En revanche, les complexes réalisés à N/P de 4/1 ne possèdent pas une efficacité de délivrance suffisante. Il faudrait augmenter la quantité de complexes LNP-ARNm introduits.
Les complexes LNP-ARNm sont donc stables pendant au moins deux semaines et permettent une bonne efficacité de délivrance d’ARNm. Le rapport N/P semble également jouer un rôle dans la conservation des complexes d’ARNm et de LNP à cœur lipidique à +4°C.
Exemple 5 : Démonstration de la résistance aux RNase de l’ARNm complexé à la surface des complexes LNP-ARNm
Dans cet exemple d’utilisation de l’invention, la résistance à la RNase de complexes formés par l’ARNm complexé à la surface des LNP a été testée.
Les cellules PC3 ont été ensemencées sur une plaque 96 puits à une densité de 8400 cellules par puits 24 h avant l’incubation avec les différents complexes.
Les complexes ont été réalisés à une dose de 100 ng ng d’ARNm par puits, extemporanément à un rapport de N/P de 8/1 ou 32/1.
Dans le cas du groupe « Pre-RNAse », la RNase A est ajoutée à l’ARNm GFP seul à une concentration de 1 ng/mL finale puis incubée 10 min à 25°C, préalablement à l’ajout des LNP (comparatif). L’ARNm a dont été mis en contact de RNase avant la complexation avec les LNP.
Dans le cas du groupe « Post-RNase », la RNase A est ajoutée aux complexes ARNm-LNP à une concentration de 1 ng/mL finale puis les complexes ont été incubés 10 min à 25°C. L’ARNm mis en contact de RNase est donc complexé avec les LNP.
Les différents complexes ou contrôles ont ensuite été ajoutés sur les cellules PC3 dans du milieu RPMI supplémenté en HEPES pH7,3 à 20 mM.
Les LNP seules exemptes de ARNm (N/P de 8/1 et N/P de 32/1 seul, exempt d’ARNm, les quantités de LNP (non compléxés) introduites correspondants à celles introduites respectivement pour les tests NP8-ARNm et NP32-ARNm) ainsi que l’ARNm seul ont été utilisé comme contrôle négatif.
Après 6 h d’incubation, le milieu a été aspiré et remplacé par du milieu RPMI supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal et 1% de pénicilline/streptomycine. Les noyaux cellules ont ensuite été marquées 24h après l’incubation avec les complexes avec du Hoechst 33342 (2 mM) pendant 20 min puis les cellules ont été fixées avec une solution de paraformaldéhyde 4% pendant 20 min. Les cellules fixées ont été observées au microscope à épifluorescence (TECAN SparkCyto) par une prise d’image automatisée (5 images par puits, objectif X10). Les images ont été segmentées à l’aide du logiciel Cell Profiler et la positivité de chaque cellule pour la GFP a été évaluée par rapport à l’intensité de fluorescence normalisée pour corriger le bruit de fond à l’aide d’un script Python (>4000 cellules par conditions). Enfin, le pourcentage de cellules positives pour la GFP a été quantifié (moyenne, ± S.E.M., N = 3 expériences indépendantes). Les P-values ont été déterminées par un test ANOVA. *** P < 0.001 . NT, Non traité.
Les résultats sont fournis à la figure 6.
Le prétraitement de l’ARNm GFP par la RNase A, à une concentration de 1 ng/mL pendant 10 min à 25°C (groupe Pre-RNAse), entraine une dégradation de celui-ci. En effet, nous n’observons pas de cellules PC3 positives pour la GFP en ajoutant les LNP à N/P de 8/1 ou N/P de 32/1 après ce prétraitement à la RNase A.
En revanche, si l’on complexe en premier une quantité d’ARNm GFP équivalente à la surface d’une LNP (groupe Post-RNAse), l’effet de la RNase A à 1 ng/mL pendant 10 min à 25°C est alors fortement réduit et nous observons toujours un nombre important de cellules positives pour la GFP aux rapports N/P de 8 ou N/P de 32. On note également que la conditions N/P de 8/1 est également plus favorable avec un taux de cellules positives pour la GFP plus important.
Cette expérience démontre que l’ARNm est bien protégé d’une dégradation enzymatique bien qu’il ne soit pas encapsulé dans le cœur des LNP et qu’il soit exposé à la surface des LNP.
Les LNP protègent l’ARNm complexé à leurs surfaces de la dégradation par des enzymes présentes dans le milieu extérieur, telles que les RNAses (enzymes dégradant l’ARN), et ce grâce à la couronne protectrice de co-tensioactif présente à la surface des LNP.
Exemple 6 : Etude de stabilité au stockage à +4°C ou -20°C des complexes
ARNm Ova -LNP
Comme à l’exemple 4, ce sont les complexes LNP-ARNm (donc une fois la complexation effectuée) qui ont été stockés 2 semaines à +4°C afin de déterminer leur capacité à délivrer un ARNm dans des cellules cibles après 2 semaines de stockage. Dans cet exemple, l’ARNm était l’ARNm Ova.
A partir d’un même pool d’ARNm Ova complexés aux LNP, des aliquots ont été réalisés le même jour et ont été conservés à 4°C ou -20°C. A chacun des temps indiqués, des cellules dendritiques primaires ont été transfectées avec 1 aliquot conservés à 4°C ou 1 aliquot conservés à -20°C ou des LNP seuls ou de l’ARNm Ova ou Cherry fraîchement complexé aux LNP. 6h00 post transfection, des lymphocytes T CD4 d’OT-ll ont été co cultivés pendant 48h00 avec les cellules dendritiques préalablement traitées et la fréquence de lymphocytes T CD4 activés (CD69+) a été évaluée par cytométrie en flux.
Comme contrôle positif, des complexations LNP-ARNm Ova réalisées extemporanément (« frais ») ont été utilisés.
Les résultats sont fournis à la figure 7.
Alors que la conservation à 4°C des complexes LNP-ARNm Ova pendant 7 jours n’affecte pas l’activation des lymphocytes T CD4 induite par les cellules dendritiques traitées en comparaison aux complexes réalisées fraîchement, la conservation à -20°C altère la capacité des cellules dendritiques traitées à induire l’expression de CD69 dès J7. D’autre part, il faut atteindre 3 mois de conservation à 4°C pour que les complexes deviennent complètement inefficaces à induire une réponse cellulaire.
Exemple 7 : Induction d’une réponse immunitaire par une vaccination à base de LNP-ARNm Ova
Les souris C57BI6 ont été immunisées à JO et J21 par injection intrapéritonéale avec 10 pg d’ARNm Ova ou contrôle complexés aux LNP à un ratio N/P de 6. Une semaine après le rappel, à J28, les animaux ont été sacrifiés. Le sang a été récolté pour doser les anticorps
anti-OVA par ELISA dans les sérums et les splénocytes ont été restimulés ex vivo avec la protéine OVA en présence de LPS pendant 4 jours afin d’évaluer la sécrétion d’IFNy par ELISA.
Les résultats sont fournis aux figures 8A et 8B. Cette expérience a été réalisé trois fois indépendamment et les résultats des figures 8A et 8B représentent l’ensemble de ces expériences regroupées.
Après 4 de jours de stimulation avec la protéine OVA en présence de LPS, les niveaux d’IFNy sécrétés dans le surnageant cellulaire sont supérieurs pour les cultures de splénocytes issues de souris immunisées avec l’ARNm Ova vectorisé. Bien qu’hétérogène, la production d’anticorps est aussi plus élevée dans ce groupe d’animaux.
Exemple 8 : Induction d’une réponse immunitaire par une vaccination à base de LNP-ARNm Spike
L’ARNm Spike a 4074 bases et est donc plus long que les ARNm testés dans les exemples qui précèdent.
10 pg d’ARNm Spike ou contrôle (Ova) vectorisés par des LNP à un ratio N/P de 6 ont été injectés à J0 et J27 par voie intrapéritonéale (I.P.) ou par voie intramusculaire (I.M.). A J34, les souris ont été sacrifiées et les splénocytes ont été restimulés ex vivo pendant 48h avec un pool de peptides Spike en présence de LPS afin d’évaluer la sécrétion d’IFNy par ELISA. Chaque groupe était composé de trois souris C57BI6.
Dosage d’anticorps anti-Spike : 3 pg d’ARNm Spike ou contrôle (Ova) vectorisés par des LNP à ratio N/P de 6 ont été injectés à J0 et J21 par voie intramusculaire. A J28, les souris ont été sacrifiées et le sérum a été utilisé pour doser les anticorps anti-Spike circulants par ELISA. Chaque groupe était composé de cinq souris Balb/c.
Les résultats sont fournis aux figures 9A et 9B.
La voie d’immunisation par injection intramusculaire permet de monter une réponse cellulaire spécifique contre la protéine spike impliquant la production d’IFNy, alors que la voie d’immunisation par injection intrapéritonéale n’induit aucune réponse.
Bien que la production d’anticorps anti-spike circulants soit relativement faible en comparaison à une immunisation avec la stratégie vaccinale de Pfizer (résultats non montrés), nous observons une augmentation dans le groupe de souris immunisé avec 3 pg d’ARNm Spike vectorisés par les LNP en comparaison au groupe contrôle (ARNm Ova vectorisé).
Exemple 9 : Effet de la compactation au sulfate de protamine pour améliorer la délivrance d’un ARNm Long
Les cellules ont été transfectées à 1 ,5 pg/ml avec l’ARNm Spike-SARS-CoV-2 (4074 bases) complexés ou non avec des LNP selon un ratio N/P de 6, avec ou sans compactation par du sulfate de protamine.
Les contrôles négatifs utilisés étaient les LNP seules et l’ARNm Spike compacté seul.
Plus précisément, le protocole ci-dessous a été suivi.
Les cellules PC3 (lignée cellulaire épithéliale issue de cancer de la prostate) ont été cultivées en RPMI (Gibco™ 61870044) 10%SVF 1% AT B (Gibco™ 15140122) dans un incubateur à 37°C à 0% de C02 (PHCbi_MCO-20AIC).
Les cellules ont été ensemencées à 4.104cellules/cm2 en plaque 24 puits.
Au bout de 24h, les cellules ont été transfectées en milieu sans SVF et sans antibiotiques.
Les cellules ont été transfectées avec l’ARNm codant pour la protéine SPIKE du virus SARS-CoV-2 (taille ARNm 4074NT) à 1 ,5 pg/ml dans un volume final de 500mI par puits.
Pour la condition compactée, l’ARNm à 0,250 mg/ml en H20 a été préalablement mélangé selon un ratio 1 :1 avec le sulfate de protamine également à 0,250mg/ml en H20.
L’ARNm a été complexé avec les LNP selon un ratio N/P=6. Le volume de complexation a été ajusté à 50mI en Optimem (Gibco™ A4124801) avant d’être complété à 500mI final en milieu de transfection. Les cellules ont été incubées avec les complexes à 37°c pendant 6h. Le milieu a ensuite été remplacé par du milieu de culture RPMI 10%SVF 1% ATB.
Au bout de 24h de transfection les cellules ont été détachées 10 minutes en tryple (Gibco™ 12605010) après rinçage en PBS sans calcium et sans magnésium (Gibco™ 14190250). Elles ont ensuite été fixées en PFA 4% pendant 20 minutes. La protéine Spike était marquée avec un anticorps primaire anti-Spike (Cell signaling 42172) et un anticorps secondaire FITC (Jackson Lab 115.095.146) en PBS 1%BSA 0,1% Saponine.
La quantité de protéine Spike traduite suite à la transfection de l’ARNm spike est mesurée en cytométrie de flux (Becton Dickinson FACS_BD LSR II) en mesurant la proportion de cellules fluorescentes et l’intensité moyenne de fluorescence = 24h après la transfection des ARNm
Les résultats sont issus de deux expériences avec chacune au moins un duplicat par condition. L’indice d’expression de la protéine spike a été calculé en multipliant le pourcentage de cellules exprimant la protéine spike par l’intensité moyenne de fluorescence de ces cellules.
Les résultats présentés sur la figure 10 montrent la capacité des LNP à acheminer efficacement l’ARNm Spike-SARS-CoV-2 de 4074 nucléotides dans les cellules lorsque celui-ci est préalablement compacté avec du sulfate de protamine. La présence de protamine améliore la délivrance de l’ARNm dans les cellules par les LNP. La protamine seule ne permet pas d’acheminer l’ARNm Spike dans les cellules.
Claims
1. Formulation sous forme de nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase dispersée sous forme de nanoparticules lipidiques, et comprenant :
- au moins 5% molaire de lipide amphiphile, de 15 à 70% molaire de tensioactif cationique porteur d’au moins une charge positive comprenant :
- au moins un groupe lipophile choisi parmi :
- un groupe R ou R-(C=0)-, où R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 à 23 atomes de carbone, un ester ou un amide d’acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine, et
- un poly(oxyde de propylène), et
- au moins un groupe hydrophile comprenant au moins un groupe cationique choisi parmi :
- un groupe alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone et interrompu et/ou substitué par au moins un groupe cationique, et
- un groupe polymérique hydrophile comprenant au moins un groupe cationique, et
- de 10% à 55% molaire de co-tensioactif comprenant au moins une chaîne poly(oxyde d’éthylène) comprenant au moins 25 unités d’oxyde d’éthylène,
- un lipide solubilisant,
- éventuellement un lipide fusogène, où les pourcentages molaires de lipide amphiphile, de tensioactif cationique et de co- tensioactif sont par rapport aux proportions molaires cumulées du lipide amphiphile, du tensioactif cationique, du co-tensioactif et de l’éventuel lipide fusogène, dans laquelle au moins un ARN messager, dont la séquence nucléotidique monobrin comprend au moins 300 bases, est complexé à la surface des nanoparticules lipidiques, le rapport N/P de la quantité de charges positives du tensioactif cationique par rapport à la quantité de charges négatives de l’ARN messager étant supérieur ou égal à 2/1.
2. Formulation selon la revendication 1 , dans laquelle le tensioactif cationique, de préférence chaque tensioactif cationique de la formulation, a la formule (A) suivante :
[(Lipo)i-L-(Hydro)h]n+, (n/m) [Af (A)
dans laquelle:
I et h représentent des nombres entiers indépendamment compris entre 1 et 4, n est un nombre entier supérieur ou égal à 1 , généralement compris entre 1 et 50, Lipo représente un groupe lipophile tel que défini à la revendication 1 ,
Hydro représente un groupe hydrophile tel que défini à la revendication 1 comprenant au moins un groupe cationique,
L représente un groupe de liaison tel que :
- lorsque I et h représentent 1 , L est un groupe de liaison divalent choisi parmi :
- une liaison simple,
- un groupe Z choisi parmi -O-, -NH-, -O(OC)-, -(CO)O-, -(CO)NH-, -NH(CO)- , -0-(C0)-0-, -NH-(C0)-0-, -0-(C0)-NH- et -NH-(CO)-NH, -0-P0(0H)-0- ou un radical divalent cyclique de 5 à 6 atomes,
- un groupe Alk étant un alkylène comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, et un groupe Z-Alk, Alk-Z, Alk-Z-Alk ou Z-Alk-Z où les deux groupes Z du groupe Z-Alk-Z sont identiques ou différents, lorsque l’un des I ou h représente 1, et l’autre représente 2, L est un groupe trivalent choisi parmi un groupe phosphate 0P-(0-)3, un groupe dérivé du glycérol de formule -0-CH2-CH-(0-)CH2-0- et un radical trivalent cyclique de 5 à 6 atomes, pour les autres valeurs de I et h, L est un radical multivalent cyclique de 5 à 6 atomes,
A représente un anion, m est un nombre entier représentant la charge de l’anion, n est un nombre entier représentant la charge du cation [(Lipo)i-L-(Hydro)h].
3. Formulation selon la revendication 2, dans laquelle, dans la formule (A) du tensioactif cationique, L est tel que :
- lorsque I et h représentent 1 , L est un groupe de liaison divalent choisi parmi :
- une liaison simple,
- un groupe Z choisi parmi -O-, -NH-, -O(OC)-, -(CO)O-, -(CO)NH-, -NH(CO)-, -O- (CO)-O-, -NH-(C0)-0-, -0-(C0)-NH- et -NH-(CO)-NH ou -0-P0(0H)-0-, lorsque l’un des groupes I ou h représente 1, et l’autre représente 2, L est un groupe trivalent choisi parmi un groupe phosphate 0P-(0-)3 et un groupe dérivé du glycérol de formule -0-CH2-CH-(0-)CH2-0-.
4. Formulation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le tensioactif cationique, de préférence chaque tensioactif cationique de la formulation, est choisi parmi : le L/[1 -(2,3-dioléyloxy) propyl]-/V,/V,/V-triméthylammonium,
- le 1 ,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane,
- le A/-(2-hydroxyethyl)-/V,/V-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy-1 -propananium), le 1-[2-(oleoyloxy)ethyl]-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazolinium, et
- le dioctadecylamidoglycylspermine.
5. Formulation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant un lipide fusogène, tel que la 1 ,2-Dioléoyl-sn-Glycéro-3-Phosphoéthanolamine.
6. Formulation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle le lipide amphiphile est un phospholipide.
7. Formulation selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant de la protamine, de préférence du sulfate de protamine.
8. Formulation selon la revendication 7, dans laquelle l’ARN messager comprend au moins 2000 bases.
9. Formulation selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, comprenant un agent d’imagerie et/ou un agent thérapeutique.
10. Formulation selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, comprenant un co-tensioactif greffé avec une molécule d’intérêt, de préférence un ligand biologique de ciblage.
11. Procédé de préparation d’une formulation selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, comprenant les étapes suivantes :
(i) préparer une phase huileuse comprenant le lipide solubilisant, le lipide amphiphile, le tensioactif cationique, l’éventuel lipide fusogène;
(ii) préparer une phase aqueuse comprenant le co-tensioactif;
(iii) disperser la phase huileuse dans la phase aqueuse sous l’action d’un cisaillement suffisant pour former une formulation sous forme de nanoémulsion; puis
(iv) ajouter l’ARN messager dont la séquence nucléotidique monobrin comprend au moins 300 bases à la formulation obtenue à l’étape (iii), puis
(v) récupérer la formulation ainsi formée.
12. Méthode d’introduction in vitro d’un ARN messager, dont la séquence nucléotidique monobrin comprend au moins 300 bases, dans une cellule eucaryote, comprenant la mise en contact de la cellule eucaryote avec une formulation selon l’une quelconque des revendications 1 à 10.
13. Formulation selon l’une quelconque des revendications 1 à 9 pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement d’une maladie.
14. Formulation pour son utilisation selon la revendication 13, pour le traitement d’un cancer.
15. Kit comprenant :
- une formulation sous forme de nanoémulsion comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase dispersée sous forme de nanoparticules lipidiques, et comprenant :
- au moins 5% molaire de lipide amphiphile, de 15 à 70% molaire d’au moins un tensioactif cationique porteur d’au moins une charge positive comprenant :
- au moins un groupe lipophile choisi parmi :
- un groupe R ou R-(C=0)-, où R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 à 23 atomes de carbone, un ester ou un amide d’acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine, et
- un poly(oxyde de propylène), et
- au moins un groupe hydrophile comprenant au moins un groupe cationique choisi parmi :
- un groupe alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone et interrompu et/ou substitué par au moins un groupe cationique, et
- un groupe polymérique hydrophile comprenant au moins un groupe cationique, et de 10% à 55% molaire d’un co-tensioactif comprenant au moins une chaîne poly(oxyde d’éthylène) comprenant au moins 25 unités d’oxyde d’éthylène,
- un lipide solubilisant,
- éventuellement un lipide fusogène,
où les pourcentages molaires de lipide amphiphile, de tensioactif cationique et de co- tensioactif sont par rapport aux proportions molaires cumulées du lipide amphiphile, du tensioactif cationique, du co-tensioactif et de l’éventuel lipide fusogène, et - séparément, au moins un ARN messager dont la séquence nucléotidique monobrin comprend au moins 300 bases.
Priority Applications (1)
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| EP22719866.0A EP4312989A1 (fr) | 2021-03-30 | 2022-03-30 | Formulation pour la délivrance d'arn messager |
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| FRFR2103254 | 2021-03-30 | ||
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|---|---|
| WO2022207736A1 true WO2022207736A1 (fr) | 2022-10-06 |
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Citations (2)
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-
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Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| US20180169015A1 (en) * | 2012-03-29 | 2018-06-21 | Translate Bio, Inc. | Lipid-derived neutral nanoparticles |
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Non-Patent Citations (4)
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| C. SOLANSP. IZQUIERDOJ. NOLLAN. AZEMARM. J. GARCIA-CELMA, CURR OPIN COLLOID IN, vol. 10, 2005, pages 102 - 110 |
| GUEVARA ET AL., FRONTIERS IN CHEMISTRY, vol. 8, 2020, pages 589959 |
| LUIS A BRITO ET AL: "A Cationic Nanoemulsion for the Delivery of Next-generation RNA Vaccines", MOLECULAR THERAPY, vol. 22, no. 12, 16 July 2014 (2014-07-16), pages 2118 - 2129, XP055180488, ISSN: 1525-0016, DOI: 10.1038/mt.2014.133 * |
| SAHIN ET AL., NATURE REVIEWS, vol. 13, 2014, pages 759 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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