CN117402304A - 酸激活生物正交点击两亲性聚合物及其纳米粒、制备方法及应用 - Google Patents

酸激活生物正交点击两亲性聚合物及其纳米粒、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药化工技术领域，具体涉及酸激活生物正交点击两亲性聚合物及其纳米粒、制备方法及应用。该纳米粒由点击反应基团接枝修饰的酸响应两亲性聚合物自组装形成的前体纳米粒和相对应的点击反应基团修饰的负载多种治疗剂效应纳米粒共同组成。利用酸响应高分子聚合物精确响应肿瘤胞外微酸环境以及胞内酸环境靶向递送和肿瘤原位激活释放生物正交点击反应基团后，通过组织原位生物正交点击反应提高治疗剂在肿瘤组织的蓄积，改善肿瘤治疗效果，同时减少毒副作用。所述生物正交点击基团标记的酸响应聚合物有以下式1，2所示结构式：

Description

酸激活生物正交点击两亲性聚合物及其纳米粒、制备方法及 应用
技术领域
本发明属于医药化工技术领域，具体涉及酸激活生物正交点击两亲性聚合物及其纳米粒、制备方法及应用。
背景技术
恶性肿瘤已成为危害我国人民健康的重大疾病之一。肿瘤治疗过程中，治疗剂在正常组织的蓄积导致强烈的毒副作用。例如，化学疗法常用的铂类药物会引起严重的恶心、呕吐(顺铂)，白细胞和血小板减少(卡铂)等副作用；免疫疗法常用的PD-1/PD-L1阻断抗体会引起间质性肺炎，引发呼吸功能衰竭等。生物正交点击化学由于其高效的反应速率，高度的反应特异性以及良好的生物相容性已经被开发用于提高药物对肿瘤的靶向性，从而增强治疗效果，同时减少毒副作用。然而，无组织选择的生物正交点击反应仍无法提高治疗剂在肿瘤组织的蓄积。由此本发明设计了一种肿瘤微酸环境激活型生物正交点击反应纳米平台，该纳米平台由点击反应基团接枝修饰的酸响应两亲性聚合物自组装形成的前体纳米粒和相对应的点击反应基团修饰的负载多种治疗剂效应纳米粒共同组成。利用酸响应高分子聚合物靶向递送和肿瘤原位激活释放生物正交点击反应基团后，通过组织原位生物正交点击反应提高治疗剂在肿瘤组织的蓄积，改善肿瘤治疗效果，同时减少毒副作用。
发明内容
基于以上背景，本发明的生物正交点击反应基团修饰的酸响应两嵌段聚合物及两嵌段聚合物制备的具有肿瘤组织酸响应纳米粒，通过肿瘤胞外微酸环境激活生物正交点击反应，用于多种治疗剂的精准递送，实现肿瘤精准治疗。
本发明提供了一种生物正交点击反应基团修饰的酸响应聚合物，其中，所述生物正交点击反应基团修饰的酸响应聚合物包括如式1所示的胞外酸响应两亲性嵌段聚合物和式2所示的胞内酸响应两亲性聚合物：
其中，
R1为N,N-乙基丙氨基、六亚甲基氨基；优选地，为N,N-乙基丙氨基；
R2为羧基修饰的二苯并环辛炔(DBCO)、羧基修饰的反式环辛烯(TCO)；优选地，为羧基修饰的DBCO；
x为10-145的整数；优选为113；
y为50-100的整数；优选为60；
以及z为1-5的整数；优选为3。
本发明式1所示的聚合物为线性聚合物，包括但不限于接枝聚合物，具有肿瘤胞外酸响应性质。
其中，
R3为叠氮基，四嗪基；优选地，为叠氮基；
R4为N,N-二乙基氨基，N,N-二异丙基氨基，N,N-二叔丁基氨基，N,N-乙基丙氨基、五亚甲基氨基，六亚甲基氨基；优选地，为N,N-二异丙基氨基；
m为10-145的整数；优选地，为113；
n为20-100的整数；优选地，为50；
o为1-10的整数；优选地，为5。
本发明式2所示的聚合物为线性聚合物，包括但不限于接枝聚合物。
本发明还提供了式1所示的胞外酸响应两亲性嵌段聚合物的制备方法，该方法通过以下反应路线I所示的可逆加成-断裂链转移聚合合成所述的胞外酸响应两亲性嵌段聚合物：
反应路线I
其中步骤a：聚乙二醇-b-聚(R1-r-甲基丙烯羟乙酯)共聚物的合成
将RAFT链转移剂封端的聚乙二醇大分子引发剂与含有R1的甲基丙烯酸乙酯单体、甲基丙烯酸羟乙酯单体、引发剂偶氮二异丁腈以摩尔比＝1:50-100:1-10:0.1(优选地，为1:70-5:0.1)的比例溶于N,N-二甲基甲酰胺；在无氧条件下，70℃反应24h，反应产物用适量DMF稀释后去离子水透析，截留量为3500道尔顿的透析袋，冷冻干燥，得到聚乙二醇-b-聚(R1-r-甲基丙烯羟乙酯)共聚物；
反应路线a
步骤b：聚乙二醇-b-聚(R1-r-甲基丙烯羟乙酯)共聚物耦连R2
取所述步骤a中得到的嵌段共聚物溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，得到质量浓度为10％w/v的溶液A，将羧基修饰的R2和N,N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺以摩尔比为1:1.5:1.5:1.5溶液N,N-二甲基甲酰胺中制得30％w/v溶液B，反应1.5h，然后将溶液A滴加到溶液B中，继续反应24h，然后用N,N-二甲基甲酰胺透析，再用去离子水透析，截留量为3500道尔顿的透析袋，冷冻干燥得到R2共价修饰的式1所示的胞外酸响应两亲性嵌段聚合物；
反应路线b
其中，R1、R2、x、y和z的定义如式1中所示。
在一个具体实施方式中，所述式1所示的胞外酸响应两亲性嵌段聚合物的制备具体包括如下步骤：通过以下反应路线I所示的可逆加成-断裂链转移聚合合成聚乙二醇-b-聚(甲基丙烯酸乙基丙胺基乙酯-r-二苯并环辛炔)嵌段共聚物：
反应路线I
步骤a’：聚乙二醇-b-聚(甲基丙烯酸乙基丙胺基乙酯-r-甲基丙烯羟乙酯)共聚物的合成
将RAFT链转移剂封端的聚乙二醇大分子引发剂与甲基丙烯酸乙基丙胺基乙酯、甲基丙烯羟乙酯单体、引发剂偶氮二异丁腈以摩尔比＝1:50-100:1-5:0.1的比例溶于适量的N,N-二甲基甲酰胺；在无氧条件下，70℃反应24h，反应产物用适量DMF稀释后去离子水透析，截留量为3500道尔顿的透析袋，冷冻干燥，得到聚乙二醇-b-聚(甲基丙烯酸乙基丙胺基乙酯-r-甲基丙烯羟乙酯)共聚物；
步骤b’：聚乙二醇-b-聚(甲基丙烯酸乙基丙胺基乙酯-r-甲基丙烯羟乙酯)共聚物耦连DBCO
取步骤a’中得到的嵌段共聚物溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，得到质量浓度为10％w/v的溶液A，将DBCO和N,N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺以摩尔比为1:1.5:1.5:1.5溶液N,N-二甲基甲酰胺中制得30％w/v溶液B，反应1.5h，然后将溶液A滴加到溶液B中，继续反应24h，然后用N,N-二甲基甲酰胺透析，再用去离子水透析，截留量为3500道尔顿的透析袋，冷冻干燥得到DBCO共价修饰得到式1所示的嵌段聚合物；
其中，R1、x、y和z如式1中所示。
本发明还提供了一种胞内酸响应两亲性聚合物的制备方法，该方法具体包含如下步骤：
将与式1生物正交点击反应配对基团封端的聚乙二醇大分子RAFT链转移剂与与含有R4的甲基丙烯酸乙酯单体、甲基丙烯酸羟乙酯单体、引发剂偶氮二异丁腈以摩尔比＝1:20-100:1-10:0.1(优选地，为1:50-5:0.1)的比例溶于适量的N,N-二甲基甲酰胺；在无氧条件下，70℃反应24h，反应产物用适量DMF稀释后去离子水透析，截留量为3500道尔顿的透析袋，冷冻干燥，得到聚乙二醇-b-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯共聚物；
通过以下反应路线II所示的可逆加成-断裂链转移聚合合成所述的胞内酸响应两亲性聚合物：
反应路线II
其中，R3、R4、m、n和o如式2所示。
本发明还提供了一种生物正交点击反应基团修饰的酸响应两嵌段聚合物构成的两类纳米粒，包括前体纳米粒(胞外酸响应纳米粒)及效应纳米粒(胞内酸响应纳米粒)，其中：
所述胞外酸响应纳米粒由式1所示的胞外酸响应两亲性嵌段聚合物制备而成；用于肿瘤胞外微环境递送生物正交点击反应式1所示的胞外酸响应两亲性嵌段聚合物中的基团R2；及负载所述纳米粒中的治疗剂。
所述胞内酸响应纳米粒由包含如式2所示的胞内酸响应两亲性聚合物、其他可自组装形成纳米粒的材料或负载治疗剂制备而成，其中，如式2所示的胞内酸响应两亲性聚合物占纳米粒总质量的10％-20％；通过与所述的胞外酸响应纳米粒发生生物正交反应提高治疗剂在肿瘤组织的分布。
在一个具体实施方案中，所述前体纳米粒包括式1所示的胞外酸响应两亲性嵌段聚合物，其中，所述的前体纳米粒包括聚乙二醇亲水外层、聚(甲基丙烯酸乙基丙胺基乙酯-r-二苯并环辛炔)疏水内核及负载的肿瘤多种治疗剂中的任意一种。
在一个具体实施方案中，所述效应纳米粒包括式2所示的胞内酸响应两亲性聚合物的任意纳米粒，包括脂质体，胶束，囊泡等；其中，所述的效应纳米粒包括与式1所示的胞外酸响应两亲性嵌段聚合物中生物正交点击反应配对的基团修饰的聚乙二醇亲水外层、其他自组装形成纳米粒的材料如脂质，嵌段聚合物，树枝状大分子等内层及负载的肿瘤多种治疗剂中的任意一种。
本发明还提供了所述胞外酸响应纳米粒的制备方法，所述方法包括将式1所示的胞外酸响应两亲性嵌段聚合物和治疗剂前药以质量比＝99-4的比例同时溶于有机溶剂中，得到含有胞外酸响应两亲性嵌段聚合物和治疗剂前药的溶液，在超声条件下将该混合溶液滴加到去离子水中，与水的体积比为1:9，然后通过超滤或透析法除去有机溶剂或为负载的治疗剂前药，得到包载有治疗剂前药的聚合物纳米粒。
在一个具体实施方案中，所述纳米粒的制备方法包括如下步骤：
将式1所示的胞外酸响应两亲性嵌段聚合物和治疗剂前药溶解于有机溶剂中，得到含有两亲性嵌段共聚物和治疗剂前药的溶液，将该溶液在超声下滴入去离子水中，其中有机溶剂的体积比小于10％；然后通过超滤法或透析法除去有机溶剂和为负载的治疗剂前药，得到所述酸响应效应纳米粒。
本发明还提供了所述胞内酸响应纳米粒的制备方法，所述方法包括将式2所示的酸响应两亲性聚合物和其他如脂质，两亲性嵌段聚合物，树枝状大分子等可组装成纳米粒辅料、治疗剂前药共同溶解在有机溶剂中，其中式2所示的酸响应两亲性聚合物占总质量的1.0％-20％，治疗剂前药占总质量的1.0％-20％；利用超声沉淀法或薄膜分散法制备得到纳米粒。
在一个具体实施方案中，所述纳米粒的制备方法包括如下步骤：
将式2所示的两亲性聚合物和其他可自组装成纳米粒的材料如脂质、两亲性嵌段聚合物和树枝状大分子等及治疗剂前药溶于有机溶剂中，得到混合物溶液，将该溶液在超声下滴入去离子水中，其中有机溶剂的体积比小于10％；然后通过超滤法或透析法除去有机溶剂和为负载的治疗剂前药，得到所述酸响应效应纳米粒。
所述的有机溶剂优选为选自四氢呋喃、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺中的至少一种。
所述治疗剂为小分子前药，选自化疗剂、靶向剂、光动力治疗剂、免疫治疗剂及这些治疗剂的协同组合；
其中，所述化疗剂为奥沙利铂，紫杉醇，喜树碱，阿霉素；所述靶向剂为帕博西尼、玻玛西尼、瑞博西尼、G1T28；所述光动力治疗剂为PPa；所述免疫治疗剂为IDO抑制剂NLG919，PD-L1抑制剂JQ1，STING激动剂，TLR激动剂。
本发明还提供了一种生物正交点击反应基团修饰的酸响应两嵌段聚合物构成的两类纳米粒的应用，其中：
所述前体纳米粒具有肿瘤组织胞外酸环境响应性，基于肿瘤微酸环境，两嵌段聚合物可特异性用生物正交点击反应基团标记肿瘤胞外微环境，及特异性肿瘤组织治疗剂释放；前体纳米粒在正常生理条件下(如pH＝7.4)自组装成稳定的纳米粒，流体力学粒径约70纳米；在血液循环时具有良好的稳定性，防止生物正交点击反应基团和治疗剂前药泄露；在肿瘤组织胞外微酸环境下，前体纳米粒中甲基丙烯酸乙基丙胺基乙酯被质子化，暴露出生物正交点击反应基团和治疗剂前药。
所述效应纳米粒在肿瘤胞外微环境中与激活后的前体纳米粒发生生物正交点击反应，促进效应纳米粒在肿瘤组织中的蓄积，延长滞留时间；效应纳米粒在正常生理条件下(如pH＝7.4)自组装成稳定的纳米粒，在血液循环时具有良好的稳定性。
本发明的还提供了一种基于肿瘤胞外微酸环境激活的生物正交点击反应纳米平台肿瘤协同治疗用途，提高肿瘤免疫原性和抑制肿瘤免疫逃逸；所述纳米粒用于肿瘤组织原位生物正交点击反应，提高多种治疗剂的精准递送，实现肿瘤精准治疗。其中，前体纳米粒可负载用于提高肿瘤免疫原性的治疗剂前药，如光动力治疗剂，化学疗法治疗剂，分子靶向治疗剂等；效应纳米粒可负载用于抑制肿瘤免疫逃逸的治疗剂前药，如IDO抑制剂，PD-L1抑制剂等；或者满足本发明用途任意治疗剂组合。
包含式1两亲性酸响应聚合物前体纳米粒通过溶液自组装方法制备，具有多层结构，包括聚乙二醇外层、聚(R1-r-R2)内层，前体纳米粒的平均流体力学粒径优选为70纳米。
所述的前体纳米粒具有肿瘤胞外微酸环境响应功能，使相应的前体纳米粒具备多功能性。聚乙二醇亲水层，能够防止蛋白吸附，使前体纳米粒在血液循环中保持稳定，减少内皮网状系统的清除，延长血液循环时间。前体纳米粒通过EPR效应到达肿瘤组织后，聚甲基丙烯酸乙基丙胺基乙酯被质子化，前体纳米粒解离，暴露出生物正交点击反应基团用于标记肿瘤胞外环境，通过原位生物正交点击反应提高效应纳米粒在肿瘤组织的蓄积和滞留；且实现肿瘤胞外微酸环境触发实现治疗剂前药特异性释放。
包含式2两亲性酸响应聚合物效应纳米粒通过溶液自组装方法制备，具体包含脂质体，胶束，囊泡等纳米粒。
所述的效应纳米粒可选多种类型纳米粒，使效应纳米粒具备多功能性。效应纳米粒具有式2所述的生物正交点击反应基团封端的两嵌段聚合物外层，以及其他可自组装成纳米粒材料及治疗剂内层；效应纳米粒在血液循环中保持良好的流体力学稳定性，到达肿瘤组织后与激活的前体纳米粒发生生物正交点击反应，促进效应纳米粒在肿瘤组织中滞留，实现治疗剂精准、高效递送。
本发明还提供一种治疗剂精准递送纳米平台用于在肿瘤协同治疗的用途，例如，化学疗法治疗剂和免疫治疗剂共同精准递送的用途，主要用于对肿瘤的免疫协同治疗。所述的治疗剂前药，只要出于本发明的目的，可以选自任何可以提高肿瘤免疫原性死亡的治疗剂，包含化学治疗剂，光动力治疗剂，分子靶向治疗剂和免疫治疗剂等所组成的组中的至少一种，或根据协同治疗需要可实现多种治疗剂组合。
根据本发明提供的酸响应聚阳离子胶束纳米粒在治疗癌症中的用途，所述的癌症类型主要为乳腺癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌或前列腺癌等。
本发明的有益效果包括：
1)本发明利用两类酸响应高分子聚合物，精确区分胞外微酸环境和胞内酸环境，精准实现胞外激活释放用于生物正交点击反应基团(如，DBCO，TCO等)，然后通过原位生物正交点击反应提高与之匹配的生物正交点击反应基团修饰的治疗剂在肿瘤组织的蓄积(包括小分子，抗体，纳米粒等)，改善治疗效果，同时减少毒副作用。
2)本发明关键技术创新在于通过肿瘤胞外微酸激活的前体纳米粒可特异性对肿瘤组织胞外微环境进行生物正交点击反应基团标记，无法对正常组织胞外微环境标记；从而提高治疗剂在肿瘤组织的蓄积，减少在正常组织的分布。
3)本发明的创新独特性在于前体纳米粒对实体瘤胞外微酸环境这一广谱特异性生理环境响应，使得本发明具有广谱性，可应用于所有实体肿瘤治疗场景。
附图说明
图1为本发明实施例1、2中聚合物结构为聚乙二醇-b-聚(甲基丙烯酸乙基丙胺基乙酯-r-二苯并环辛炔)两嵌段共聚物(mPEG113-b-P(EPA40-r-DBCO3))，聚合物结构为叠氮基-聚乙二醇-GG-聚(甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯-r-甲基丙烯酸羟乙酯)(N3-GG-PEG113-b-PDPA50-r-HEMA5)的核磁共振氢谱图。
图2为本发明实施例3中所制备的酸激活生物正交纳米平台在不同pH缓冲液中的粒径变化。
图3为本发明实施例4中活体水平探究前体纳米粒对肿瘤微酸环境的响应。
图4为本发明实施例5中所制备的NP1与N3-CyOH；联合注射和单独注射的(A)小鼠活体分布成像以及(B)肿瘤组织荧光半定量分析。
图5为本发明实施例6中所制备NP1和NP3中NP3单独注射以及NP1和NP3联合注射的(A)活体分布和(B)肿瘤组织半定量分析。
图6为本发明实施例7中所制备的纳米粒PEID，N3PGDJ和PGDJ的抑瘤曲线。
具体实施方式
通过以下具体实施例和附图对本发明进行说明，但本发明不受这些具体实施例限定。
实施例中所用的甲氧基封端的聚乙二醇5000、4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫羰基)硫烷基]戊酸、甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯、甲基丙烯酸乙基丙胺基乙酯和甲基丙烯酸羟乙酯购自西格玛奥德里奇(中国)公司。甲基丙烯酸羟乙酯购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。如无特殊说明，其余所用试剂和溶剂均购自国药集团(上海)化学试剂有限公司。
4T1乳腺癌细胞购自中科院上海细胞库，细胞培养用DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司，产品编号11965118。
样品数据由以下仪器测定：核磁共振氢谱(1HNMR)用BRUKERAVANCENEO500核磁共振仪，以TMS为内标，化学位移单位为ppm-1；
阳离子胶束的流体力学粒径和表面电位由MALVERNNANOSIZER型粒径测定仪测定透射电镜照片由TalosL120C型透射电子显微镜获得；
在本申请中，如无特殊说明，所用设备及测试方法均为本领域常规的设备和方法。
为了解决肿瘤治疗过程中治疗剂在正常组织的蓄积导致强烈的毒副作用。本发明实施例提出了一种肿瘤微酸环境激活型生物正交点击反应纳米平台。该纳米平台由点击反应基团接枝修饰的酸响应两亲性聚合物自组装形成的前体纳米粒和相对应的点击反应基团修饰的负载多种治疗剂效应纳米粒共同组成。利用酸响应高分子聚合物靶向递送和肿瘤原位激活释放生物正交点击反应基团后，通过组织原位生物正交点击反应提高治疗剂在肿瘤组织的蓄积，改善肿瘤治疗效果，同时减少毒副作用。
本发明提供的纳米平台包括点击反应基团接枝修饰的酸响应两亲性聚合物及其自组装形成的前体纳米粒和相对应的点击反应基团修饰的负载多种治疗剂的效应纳米粒。
生物正交点击反应的基团，生物正交点击反应基团修饰的前药小分子、抗体、纳米颗粒。聚合物为聚乙二醇修饰的线性聚合物，但不限于线性聚合物，包括接枝聚合物等；生物正交点击反应基团包括叠氮、二苯并环辛炔，四嗪、反式环辛烯等；
实施例1：聚乙二醇-b-聚(甲基丙烯酸乙基丙胺基乙酯-r-二苯并环辛炔)两嵌段共聚物(mPEG113-b-P(EPA40-r-DBCO3))的制备
取分子量5000Da的聚乙二醇大分子引发剂(mPEG113-CTA)0.2克、甲基丙烯酸乙基丙胺基乙酯(EPA-MA)0.517克、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)0.048克和偶氮二异丁腈(AIBN)0.0004克溶于1.0毫升N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中。真空除氧后，70℃反应24小时。待反应结束后，用乙醇和去离子水透析纯化，截留量3.5kDa，冻干得产品0.529克，产率69.2％。以氘代氯仿为溶剂，由核磁共振氢谱确定聚合物结构为聚乙二醇-b-聚(甲基丙烯酸乙基丙胺基乙酯-r-甲基丙烯酸羟乙酯)两嵌段共聚物(mPEG113-b-p(EPA40-r-HEMA7))。
取聚乙二醇-b-聚(甲基丙烯酸乙基丙胺基乙酯-r-甲基丙烯酸羟乙酯)两嵌段共聚物(mPEG113-b-p(EPA40-r-HEMA7))0.2克溶于5毫升DMF中，待用；羧基DBCO0.010克，DMAP0.008克，EDCI0.009克溶于2毫升DMF中，反应1.5小时，然后将聚合溶液滴加到上述溶液中，继续反应24小时。待反应结束后用乙醇，去离子水透析，截留量3.5kDa，冻干得产品0.168克，产率81.3％。以氘代氯仿为溶剂，经核磁共振氢谱确认聚合物结构为聚乙二醇-b-聚(甲基丙烯酸乙基丙胺基乙酯-r-二苯并环辛炔)两嵌段共聚物(mPEG113-b-P(EPA40-r-DBCO3))，见图1。
实施例2：叠氮基-聚乙二醇-GG-聚(甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯-r-甲基丙烯酸羟乙酯)(N3-GG-PEG113-b-PDPA50-r-HEMA5)的制备
取分子量5000Da的叠氮基封端的聚乙二醇大分子引发剂(N3-PEG113-GPLGLAG-CTA)0.15克、甲基丙烯酸二异丙胺基乙酯(DPA-MA)0.322克、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)0.048克和偶氮二异丁腈(AIBN)0.0004克溶于1.0毫升N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中。真空除氧后，70℃反应24小时。待反应结束后，用乙醇和去离子水透析纯化，截留量3.5kDa，冻干得产品0.429克，产率85.1％。以氘代氯仿为溶剂，由核磁共振氢谱确定聚合物结构为叠氮基-聚乙二醇-GG-聚(甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯-r-甲基丙烯酸羟乙酯)(N3-GG-PEG113-b-PDPA50-r-HEMA5)，见图1。
实施例3:溶液中酸激活生物正交反应验证
取本发明实施例1中制备的mPEG113-b-P(EPA40-r-DBCO3)酸响应聚合物制备的纳米粒NP1，取本发明实施例2中制备的N3-GG-PEG113-b-PDPA50酸响应聚合物与mPEG113-GG-b-P(DPA50-r-JQ1)酸响应聚合物公共组装成的纳米粒NP2；将NP1和NP2分别分散到pH＝7.4和6.5的PBS缓冲液中，37℃下共孵育30min后，利用动态光散射仪测定胶束流体力学半径并利用透射电镜观察纳米粒粒径的变化，测试结果如图2所示。实验结果表明，肿瘤微酸环境可以触发NP1和NP2发生生物正交点击反应交联形成尺寸较大的颗粒。
实施例4:前体纳米粒对肿瘤微酸环的响应
使用三阴性乳腺癌4T1的Balb/c模型评估酸激活生物正交纳米平台中前体纳米粒对肿瘤微酸环境的响应。待肿瘤体积长到100mm3时，随机分成两组，一组单独注射(i.v.)NP1(由本发明实施例1中制备的mPEG113-b-P(EPA40-r-DBCO3)，另外一组用2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)预处理小鼠24h后注射(i.v.)NP1。2-DG是一种糖酵解抑制剂，通过抑制肿瘤细胞糖酵解代谢从而抑制肿瘤胞外微酸环境的形成。如图3所示，与单独注射NP1组相比，2-DG预处理组小鼠肿瘤组织的荧光显著被抑制，说明前体纳米粒具有肿瘤胞外微酸响应性。
实施例5：酸激活生物正交纳米平台促进小分子探针(或药物)在肿瘤组织蓄积
使用三阴性乳腺癌4T1的Balb/c模型评估酸激活生物正交纳米平台促进小分子药物在肿瘤组织蓄积；选取叠氮修饰的半花菁(N3-CyOH)为模型分子。荷瘤小鼠分别注射(1)NP1(DBCO为1.0mg/kg)+N3-CyOH(2.0mg/kg)；(2)N3-CyOH(2.0mg/kg)；尾静脉NP1(由本发明实施例1中制备的mPEG113-b-P(EPA40-r-DBCO3)酸响应聚合物制备的纳米粒)注射后2小时尾静脉注射N3-CyOH。4小时后用小动物活体成像仪对两组小鼠进行成像并对肿瘤组织进行荧光半定量，实验结果如图4所示。肿瘤微酸环境激活生物正交纳米平台使得在肿瘤组织的蓄积N3-CyOH增加了大约2倍。
实施例6：酸激活生物正交纳米平台促进纳米粒在肿瘤组织蓄积
使用三阴性乳腺癌4T1的Balb/c模型评估酸激活生物正交纳米平台能否纳米粒在肿瘤组织的蓄积；取本发明实施例1中制备的mPEG113-b-P(EPA40-r-DBCO3)酸响应聚合物制备的纳米粒NP1，取本发明实施例2中制备的N3-PEG113-GG-b-P(DPA50-r-HEMA5)酸响应聚合物与负载光敏剂PPa的mPEG113-GG-b-P(DPA50-r-PPa)酸响应聚合物公共组装成的纳米粒NP3。荷瘤小鼠分别注射(1)NP1(DBCO为1.0mg/kg)+NP3(PPa为5.0mg/kg)；(2)NP3(PPa为5.0mg/kg)；尾静脉NP1注射后2小时尾静脉注射NP3。72小时后用小动物活体成像仪对两组小鼠进行成像并对肿瘤组织进行荧光半定量，实验结果如图5所示。相比于NP3单独注射组，3天后NP1和NP3组合组中小鼠肿瘤组织的PPa的荧光强度大约提高了3倍，说明该酸激活纳米平台可有效提高治疗剂在肿瘤组织的蓄积。
实施例7：酸激活生物正交纳米平台增强抗肿瘤免疫治疗的疗效
使用三阴性乳腺癌4T1的Balb/c模型评估酸激活生物正交纳米平台提高抗肿瘤免疫治疗的疗效；取本发明实施例1中制备的mPEG113-b-P(EPA40-r-DBCO3)胞外酸响应聚合物负载光热剂ICG，制备成共载DBCO和ICG的纳米粒(PEID)；ICG介导光热疗法诱导炎症反应，提高肿瘤免疫原性。利用本发明实施例2中制备的N3-GG-PEG113-b-PDPA50-r-HEMA5)胞内酸响应聚合与负载治疗剂JQ1的mPEG113-GG-b-P(DPA50-r-JQ1)酸响应聚合物共组装成叠氮修饰的纳米粒(N3PGDJ)，其中mPEG113-GG-b-P(DPA50-r-JQ1)酸响应聚合物自组装成无叠氮修饰的纳米粒(PGDJ)，作为对照。
将携带4T1肿瘤的小鼠随机分成5组(n＝6)：PBS作为对照；PEID纳米粒单独治疗组；N3PGDJ单独治疗组；PEID@PGDJ联合治疗组；PEID@N3PGDJ联合治疗组。ICG和JQ1的给药剂量分别为2.0mg/kg和10.0mg/kg；纳米粒静脉内(i.v.)注射给动物，每3天一次，共进行3次注射。联合治疗组，PEID纳米粒尾静脉注射给动物2小时后，注射PGDJ或N3PGDJ纳米粒，用2％(v/v)异氟烷麻醉小鼠，然后用808nm激光器辐照，温度持续稳定在45℃,5分钟后结束辐照。每隔两天用数字卡尺测量肿瘤尺寸并计算如下：(宽2×长)/2，在实验结束时，将小鼠实施安乐死。
如图6所示，在用PEID@N3PGDJ处理后肿瘤在第10天后逐渐减小且没有复发；而PEID@PGDJ处理后可抑制肿瘤生长，但是肿瘤在第10天复发。抑瘤实验说明酸激活生物正交平台由于原位肿瘤胞外微酸环境激活生物正交反应，提高药物在肿瘤组织的蓄积，从而可显著抑制肿瘤生长。

Claims (12)

1.一种胞外酸响应两亲性嵌段聚合物，其特征在于，其具有以下式1所示结构：
其中，
R1为N,N-乙基丙氨基、六亚甲基氨基；
R2为羧基修饰的二苯并环辛炔DBCO、羧基修饰的反式环辛烯TCO；
x为10-145的整数；
y为50-100的整数；
以及z为1-5的整数。
2.一种胞内酸响应两亲性聚合物，其特征在于，其具有以下式2所示结构：
其中，
R3为叠氮基，四嗪基；
R4为N,N-二乙基氨基，N,N-二异丙基氨基，N,N-二叔丁基氨基，N,N-乙基丙氨基、五亚甲基氨基，六亚甲基氨基；
m为10-145的整数
n为20-100的整数；
o为1-10的整数。
3.一种如权利要求1所述的胞外酸响应两亲性嵌段聚合物的制备方法，其特征在于，通过以下反应路线I所示的可逆加成-断裂链转移聚合合成所述的胞外酸响应两亲性嵌段聚合物：
其中步骤a：聚乙二醇-b-聚共聚物的合成
将RAFT链转移剂封端的聚乙二醇大分子引发剂与含有R1的甲基丙烯酸乙酯单体、甲基丙烯酸羟乙酯单体、引发剂偶氮二异丁腈以摩尔比＝1:50-100:1-5:0.1的比例溶于N,N-二甲基甲酰胺；在无氧条件下，70℃反应24h，反应产物用适量DMF稀释后去离子水透析，截留量为3500道尔顿的透析袋，冷冻干燥，得到聚乙二醇-b-聚共聚物；
步骤b：聚乙二醇-b-聚共聚物耦连R2
取所述步骤a中得到的嵌段共聚物溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，得到质量浓度为10％w/v的溶液A，将羧基修饰的R2和N,N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺以摩尔比为1:1.5:1.5:1.5溶液N,N-二甲基甲酰胺中制得30％w/v溶液B，反应1.5h，然后将溶液A滴加到溶液B中，继续反应24h，然后用N,N-二甲基甲酰胺透析，再用去离子水透析，截留量为3500道尔顿的透析袋，冷冻干燥得到R2共价修饰得到式1所示的嵌段聚合物；
其中，R1、R2、x、y和z的定义如权利要求1所述。
4.一种如权利要求2所述的胞内酸响应两亲性聚合物制备方法，该方法具体包含如下步骤：将RAFT链转移剂封端的聚乙二醇大分子引发剂与含有R4的甲基丙烯酸乙酯单体、甲基丙烯酸羟乙酯单体、引发剂偶氮二异丁腈以摩尔比＝1:20-100:0.1的比例溶于适量的N,N-二甲基甲酰胺；在无氧条件下，70℃反应24h，反应产物用适量DMF稀释后去离子水透析，截留量为3500道尔顿的透析袋，冷冻干燥，得到胞内酸响应两亲性聚合物；
通过以下反应路线II所示的可逆加成-断裂链转移聚合合成所述的胞内酸响应两亲性聚合物：
其中，R3、R4、m、n和o的定义如权利要求2所述。
5.一种胞外酸响应纳米粒，其特征在于，由如权利要求1所示的胞外酸响应两亲性嵌段聚合物制备而成；用于肿瘤胞外微环境递送生物正交点击反应基团R2；及负载所述纳米粒中的治疗剂。
6.一种胞内酸响应纳米粒，其特征在于，由包含如权利要求2所示的胞内酸响应聚合物、其他可自组装形成纳米粒的材料或负载治疗剂制备而成，其中，如权利要求2所示的胞内酸响应聚合物占纳米粒总质量的10％-20％；通过与如权利要求5所述的胞外酸响应纳米粒发生生物正交反应提高治疗剂在肿瘤组织的分布。
7.一种如权利要求5所述的纳米粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括将式1所示的酸响应两嵌段聚合物和治疗剂前药以质量比＝99-4的比例同时溶于有机溶剂中，得到含有酸响应两嵌段聚合物和治疗剂前药的溶液，在超声条件下将该混合溶液滴加到去离子水中，与水的体积比为1:9，然后通过超滤或透析法除去有机溶剂或为负载的治疗剂前药，得到包载有治疗剂前药的聚合物纳米粒。
8.一种如权利要求6所述的纳米粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括将式2所示的酸响应两嵌段聚合物和其他如脂质，两亲性嵌段聚合物，树枝状大分子等可组装成纳米粒辅料、治疗剂前药共同溶解在有机溶剂中，其中式2所示的酸响应两嵌段聚合物占总质量的1.0％-20％，治疗剂前药占总质量的1.0％-20％；利用超声沉淀法或薄膜分散法制备得到纳米粒。
9.根据权利要求7或8所述的纳米粒的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自四氢呋喃、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺中的至少一种；
和/或，所述治疗剂为小分子前药，选自化疗剂、靶向剂、光动力治疗剂、免疫治疗剂及这些治疗剂的协同组合；
其中，所述化疗剂为奥沙利铂，紫杉醇，喜树碱，阿霉素；所述靶向剂为帕博西尼、玻玛西尼、瑞博西尼、G1T28；所述光动力治疗剂为PPa；所述免疫治疗剂为IDO抑制剂NLG919，PD-L1抑制剂JQ1，STING激动剂，TLR激动剂。
10.如权利要求1所述的胞外酸响应两亲性嵌段聚合物，如权利要求2所述的胞内酸响应两亲性聚合物、如权利要求5所述的胞外酸响应纳米粒或如权利要求所述的6胞内酸响应纳米粒在制备治疗癌症中的用途。
11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述治疗包括化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗及上述疗法的联合治疗。
12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的癌症为黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌或前列腺癌。
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