FR3116216A1 - Procédé de préparation de nanoparticules - Google Patents

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Abstract

La présente divulgation porte sur des nanoparticules et leurs utilisations dans le domaine de la médecine, en particulier pour le traitement de tumeurs.

Description

Procédé de préparation de nanoparticules
La présente divulgation porte sur un procédé de préparation de nanoparticules, des nanoparticules et leurs utilisations dans le domaine de la médecine, en particulier pour le traitement de tumeurs.
La lutte contre le cancer se base actuellement sur trois grandes méthodes thérapeutiques : la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie. De plus en plus, de recherches se portent actuellement sur l’utilisation de nanoparticules en raison de leurs capacités à améliorer ces 3 types de traitement mais également à proposer une amélioration des techniques d’imagerie voire à combiner imagerie et thérapie conduisant à la notion de théranostic. Pour la radiothérapie, il est ainsi possible d’augmenter l’effet de la dose localement tout en épargnant les tissus sains environnants grâce à la présence d’éléments de haut numéro atomique.
Malgré leurs propriétés multimodales intéressantes et une forte recherche préclinique, seul un petit nombre de nanoparticules est actuellement arrivé en clinique (Lux et al 2018, Br. J. Radiology, 2018, 91, 20180365).
Ce nombre est d’autant plus faible pour les nanoparticules injectées par voie intraveineuse pour lesquelles on peut citer AuroShell présentant un cœur de silice et une coquille d’or d’environ 155 nm, CUT-6091 constituées d’un cœur d’or Pegylé pour la délivrance de médicaments, NU-0129 des nanoparticules d’or pour la délivrance d’acides nucléiques, les Cornell Dots du polysiloxane fluorescent pour le ciblage du mélanome et AGuIX des nanoparticules à base de polysiloxane et de chélates de gadolinium pour la radiothérapie et l’imagerie IRM.
Parmi ces nanoparticules, deux d’entre elles (AGuIX et Cornell Dots) présentent un diamètre hydrodynamique inférieur à 10 nm permettant leur élimination rénale après administration intraveineuse. Les nanoparticules ultrafines sont particulièrement adaptées à l’utilisation clinique en raison de cette élimination rénale rapide limitant l’éventuelle toxicité mais également grâce à une meilleure pénétration tumorale et dans le cas de la radiosensibilisation à des effets de « nanoscale dose deposition » augmentant localement l’efficacité de la dose délivrée.
La présence de chélates à la surface d’une nanoparticule est souvent nécessaire pour la chélation d’ions métalliques utiles en imagerie ou en thérapie. C’est ainsi le cas pour les ions métalliques radioactifs utilisés en Curie-thérapie ou en scintigraphie ou pour les ions magnétiques utilisés en IRM. Deux grandes stratégies existent actuellement dans la littérature pour obtenir des chélates métalliques ou libres à la surface de la nanoparticule.
La première stratégie pour obtenir ce type de nanoparticules est de procéder à une synthèse en incorporant les chélates directement lors de l’étape de formation des nanoparticules. C’est par exemple la stratégie employée par N. G Chabloz et al. (Chem. Eur. J., 2020, 26, 4552-4566) pour l’obtention de nanoparticules d’or fonctionnalisées par des complexes de gadolinium et par des porphyrines pour la thérapie photodynamique et l’IRM. Cette stratégie peut également être employée pour la synthèse one pot de nanoparticules de polysiloxane comme proposé par V. L. Tran et al. 2018 (Mat. Chem. B, 2018, 6, 4821-4834).
Ces nanoparticules présentent alors des chélates libres ou comprenant du gadolinium suivant les silanes de départ utilisés. Cette méthodologie présente néanmoins plusieurs défauts, les ratios et les temps d’ajout doivent être déterminés avec une très grande précision pour avoir des nanoparticules reproductibles ce qui rend les tentatives de scale-up pour une utilisation clinique délicate.
La seconde stratégie consiste à obtenir la nanoparticule voulue puis, par une étape de post fonctionnalisation, à ajouter des chélates libres ou comprenant déjà un métal. C’est la stratégie utilisée par P. Bouziotis et al. (Nanomedicine, 2017, 12, 1561-1574) sur les nanoparticules à base de polysiloxane AGuIX. Le NODAGA anhydride a été fonctionnalisé à la surface des nanoparticules par une réaction entre l’anhydride et les amines de surface. Puis le galium 68 a été ajouté pour pouvoir réaliser de l’imagerie PET préclinique. M. Pretze et al. (Journal of labelled compounds and radiopharmaceuticals, 2019, 62, 471-482) ont utilisé le même type de stratégie sur des nanoparticules d’or qui ont été synthétisées avant l’introduction d’une fonction maléimide par réaction d’échange de ligand puis l’ajout de NODAGA. Le marquage radioactif au cuivre 64 a eu lieu dans une dernière étape. L’inconvénient principal de cette stratégie est qu’elle modifie grandement la taille des nanoparticules ainsi que leur surface en termes de charge de surface mais également d’hydrophilie/lypophilie pouvant conduire à une biodistribution différente de la nanoparticule de départ.
Il semble donc nécessaire de développer un procédé de génération de chélates libres à la surface de la nanoparticule qui modifie le moins possible les caractéristiques de la nanoparticule de départ d’autant plus dans le cas d’une nanoparticule déjà présente en clinique, telle que la nanoparticule AGuIX, et présentant des caractéristiques de biodistribution adaptées. Un autre objectif de la présente invention est ainsi de donner accès à des nanoparticules équivalentes à une nanoparticule de départ mais dont une partie des chélates d’origine ont été libérés, et pouvant ensuite être laissés libres ou chélatés avec un autre métal d’intérêt.
La présente divulgation vient améliorer la situation vis-à-vis d’un ou plusieurs de ces objectifs énoncés ci-dessus.
Il est en outre proposé d’utiliser les nanoparticules chélatantes présentant une biodistribution adaptée dans le traitement de tumeurs, notamment de tumeurs primaires et/ou métastatiques.
Résumé
L’invention concerne l’un des modes décrits ci-dessous ou leurs combinaisons :
Mode 1 : Procédé de préparation d’une solution colloïdale de nanoparticules, chaque nanoparticule comprenant des groupements chélatants greffés sur une matrice de polymère, une partie seulement des groupements chélatants étant complexée à un cation métallique, l’autre partie étant non complexée, ledit procédé comprenant
(1) la synthèse ou la fourniture d’une solution colloïdale de nanoparticules précurseurs, lesdites nanoparticules précurseurs étant de formule suivante [Ch-M1]n-PS dans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique, par exemple une matrice de polysiloxane,
- [Ch-M1] est un groupement chélatant complexé à un cation métallique M1 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50,
- Ch est greffé de manière covalente à la surface d’une matrice de polymères, par exemple, une matrice de polysiloxane,
- n est compris entre 5 et 100, et,
- le diamètre hydrodynamique moyen des nanoparticules est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm,
(2) une étape de traitement de la solution colloïdale dans un milieu acide, par exemple en ajoutant une solution d’acide chlorhydrique, afin d’obtenir un pH de préférence inférieur à 2,0, de préférence inférieur à 1,0, pendant une durée suffisante pour obtenir un relargage partiel des cations métalliques M1,
(3) le cas échéant, une étape de dilution de la solution colloïdale, par exemple avec de l’eau,
(4) une étape de purification pour séparer les nanoparticules obtenues à l’étape (2) des cations métalliques M1 relargués,
(5) le cas échéant une étape de concentration de la solution des nanoparticules obtenues à l’étape (4),
(6) le cas échéant la répétition des étapes (3), (4) et (5),
(7) le cas échéant, la congélation et/ou la lyophilisation de la solution de nanoparticules obtenues à l’une des étapes (4), (5) ou (6).
Mode 2 : Procédé selon le Mode 1, caractérisé en ce que M1 est choisi parmi les cations métalliques à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50, en particulier sélectionné parmi des agents radiosensibilisants et/ou des agents de contraste pour l’imagerie par résonnance magnétique (IRM), par exemple M1 est choisi parmi le gadolinium et le bismuth.
Mode 3 : Procédé selon le Mode 1 ou 2, caractérisé en ce que le groupement chélatant Ch est choisi parmi les agents macrocycliques, de préférence parmi l’acide 1,4,7-triazacyclononanetriacétique (NOTA), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-l,4,7,10-tetraacétique (DOTA), l’acide 1,4,7-triazacyclononane-l-glutarique-4,7-acide diacetique acid (NODAGA), et l’acide 1,4,7,10-tetraazacyclododececane,1-(glutaric acid)-4,7,10-triacetic acid (DOTAGA), 2,2’,2’’,2’’’-(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrayl)tetraacetamide (DOTAM), et 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan (Cyclam), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane (Cyclen) et la déferoxamine (DFO).
Mode 4 : Procédé selon l’un quelconque des modes 1 à 3, caractérisé en ce que le groupement chélatant Ch est le DOTAGA de formule (I) suivante [Chem. 1]:

(I).
Mode 5 : Procédé selon l’un des modes 1 à 4, caractérisé en ce que PS est une matrice de polysiloxane.
Mode 6 : Procédé selon le mode 5, caractérisé en ce que les nanoparticules précurseurs ont les caractéristiques suivantes :
- le ratio poids en silicium sur le poids total de la nanoparticule est compris entre 5% et 25%,
- le nombre total n de groupements chélatants greffés sur le polymère est compris entre 5 et 50 par nanoparticule, de préférence entre 10 et 30, et,
- la nanoparticule a un diamètre moyen compris entre 2 et 8 nm.
Mode 7 : Procédé selon l’un quelconque des modes 1 à 6, caractérisé en ce que les nanoparticules précurseurs ont les caractéristiques suivantes :
(i) PS est une matrice de polysiloxane,
(ii) Ch est un groupement chélatant DOTAGA de formule (I) suivante [Chem. 1]


(I)
et greffé à la matrice de polysiloxane par liaison Si-C,
(iii) M1 est le cation gadolinium Gd3+,
(iv) n est compris entre 5 et 50, de préférence entre 10 et 30, et
(iv) le diamètre hydrodynamique moyen est compris entre 2 et 8 nm.
Mode 8 : Procédé de préparation d’une solution colloïdale de nanoparticules, chaque nanoparticule comprenant des groupements chélatants greffés sur une matrice de polymère, une première fraction f1 des groupements chélatants étant complexée à un cation métallique M1, une deuxième fraction f2 étant complexée à un cation M2, et une troisième fraction f3 étant non complexée, ledit procédé comprenant
(1) la synthèse ou la fourniture d’une solution colloïdale de nanoparticules précurseurs, lesdites nanoparticules précurseurs étant de formule suivant [Ch-M1]n-PS dans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Ch est un groupement chélatant complexé à un cation métallique M1 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50,
- Ch est greffé sur la matrice de polymères,
- n est compris entre 5 et 100, et,
- le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm
(2) une étape de traitement de la solution colloïdale dans un milieu acide, par exemple en ajoutant une solution d’acide chlorhydrique, afin d’obtenir un pH inférieur à 2,0, de préférence inférieur à 1,0, pendant une durée suffisante pour obtenir un relargage partiel des cations métalliques M1,
(3) le cas échéant, une étape de dilution de la solution, par exemple avec de l’eau,
(4) une étape de purification pour séparer les nanoparticules obtenues à l’étape (2) des cations métalliques M1 libres,
(5) le cas échéant une étape de concentration de la solution des nanoparticules obtenues à l’étape (4),
(6) le cas échéant la répétition des étapes (3), (4) et (5),
(7) éventuellement, une étape de recomplexation partielle des nanoparticules obtenues à l’étape (2), (3), (4), (5) ou (6) avec une quantité déterminée de cation métallique M1 afin d’obtenir une quantité déterminée de groupement chélatant Ch complexé avec le cation métallique M1,
(8) la mise en contact de la solution de nanoparticules obtenues à l’étape (4), (5) (6) ou (7) avec une quantité suffisante de cation M2, par exemple un cation métallique différent des cations métalliques M1 ou un radioisotope, pour complexer au moins une partie des groupements chélatants Ch1 rendus libres à l’étape (2) et,
(9) le cas échéant, la congélation et/ou la lyophilisation de la solution de nanoparticules obtenues l’étape (8).
Mode 9 :Procédé selon le mode 8, caractérisé en ce que M1 et/ou M2 sont choisis parmi les cations métalliques à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50, en particulier sélectionné parmi des agents radiosensibilisants et/ou des agents de contraste pour l’imagerie par résonnance magnétique (IRM), par exemple le gadolinium ou le bismuth.
Mode 10 : Procédé selon le mode 8 ou 9, caractérisé en ce que le groupement chélatant Ch est choisi parmi les agents macrocycliques, de préférence parmi l’acide 1,4,7-triazacyclononanetriacétique (NOTA), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-l,4,7,10-tetraacétique (DOTA), l’acide 1,4,7-triazacyclononane-l-glutarique-4,7-acide diacetique acid (NODAGA), et l’acide 1,4,7,10-tetraazacyclododececane,1-(glutaric acid)-4,7,10-triacetic acid (DOTAGA), 2,2’,2’’,2’’’-(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrayl)tetraacetamide (DOTAM), et 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan (Cyclam), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane (Cyclen) et la déferoxamine (DFO).
Mode 11 : Procédé selon l’un des modes 8 à 10, caractérisé en ce que le groupement chélatant Ch est le DOTAGA de formule (I) suivante [Chem. 1]:

(I).
Mode 12 : Procédé selon l’un des modes 8 à 11, caractérisé en ce que PS est une matrice de polysiloxane.
Mode 13 : Procédé selon le Mode 12, caractérisé en ce que les nanoparticules précurseurs ont les caractéristiques suivantes :
- le ratio poids en silicium sur le poids total de la nanoparticule est compris entre 5% et 25%,
- le nombre total n de groupements chélatants greffés sur le polymère est compris entre 5 et 50 par nanoparticule, de préférence entre 10 et 30, et,
- un diamètre moyen compris entre 2 et 8 nm.
Mode 14 : Procédé selon l’un quelconque des Modes 8 à 13, caractérisé en ce que les nanoparticules précurseurs ont les caractéristiques suivantes :
(i) PS est une matrice de polysiloxane,
(ii) Ch est un groupement chélatant DOTAGA de formule (I) suivante [Chem.1]


(I)
et greffé à la matrice de polysiloxane par liaison Si-C,
(iii) M1 est le cation gadolinium Gd3+,
(iv) n est compris entre 5 et 50, de préférence entre 10 et 30, et
(iv) le diamètre hydrodynamique moyen est compris entre 2 et 8 nm.
Mode 15 : Procédé selon l’un quelconque des Modes 8 à 14, caractérisé en ce que le cation M2 est choisi parmi des agents d’imagerie pour la scintigraphie, par exemple44Sc,64Cu,68Ga,89Zr,111In,99mTc.
Mode 16 : Procédé selon l’un quelconque des Modes 8 à 15, caractérisé en ce que le cation M2 est choisi parmi des agents thérapeutiques pour la curiethérapie, par exemple90Y,166Ho,177Lu,212Bi,213Bi,211At.
Mode 17 : Procédé selon l’un quelconque des modes 8 à 16, caractérisé en ce que f1 est compris entre 0,1 et 0,9, f2 est compris entre 0,1 et 0,9 et f3 entre 0 et 0,5, typiquement f1 est compris entre 0,25 et 0,35, f2 est compris entre 0,65 et 0,75, et f3 est sensiblement nul.
Mode 18 : Procédé selon l’un quelconque des modes 8 à 17, caractérisé en ce chaque nanoparticule est en outre fonctionnalisée avec un agent de ciblage, en particulier un peptide, une immunoglobuline, un nanobody, un anticorps, un aptamère ou une protéine ciblante.
Mode 19 : Solution de nanoparticules ou lyophilisat de nanoparticules telles qu’obtenues par un procédé selon l’une quelconque des modes 1 à 18.
Mode 20 : Nanoparticule de formule (II) suivante [Chem. 2]:

(II)
dans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique, par exemple du polysiloxane,
- [Ch-M1] est un groupement chélatant Ch complexé avec un cation métallique M1 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50, par exemple un cation gadolinium,
- [Ch-M2] est un groupement chélatant Ch complexé à un cation M2 différent du cation métallique M1, par exemple choisi parmi les cations métalliques à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50, ou choisi parmi des isotopes radioactifs, de préférence M2 est un cation bismuth,
- [Ch] est un groupement chélatant Ch non complexé
caractérisé en ce que
(i) les agents chélateurs Ch sont greffés de manière covalente à la surface de la matrice de polymères,
(ii) le ratio molaire n/(n+m+p) est compris entre 10% et 90%, de préférence entre 25% et 35%, le ratio molaire m/(n+m+p) est compris entre 10% et 90%, de préférence entre 65% et 75%, et le ratio molaire p/(n+m+p) est sensiblement nul, et,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm.
Mode 21 : Nanoparticule selon le mode 20, caractérisée en ce que le cation métallique M1, et le cas échéant M2, est choisi parmi des agents radiosensibilisants et/ou des agents de contraste pour l’imagerie par résonnance magnétique, en particulier le gadolinium ou le bismuth.
Mode 22 : Nanoparticule selon l’un quelconque des modes 20 ou 21, caractérisée en ce que le groupement chélatant Ch est choisi parmi les agents macrocycliques, de préférence parmi l’acide 1,4,7-triazacyclononanetriacétique (NOTA), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-l,4,7,10-tetraacétique (DOTA), l’acide 1,4,7-triazacyclononane-l-glutarique-4,7-acide diacetique acid (NODAGA), et l’acide 1,4,7,10-tetraazacyclododececane,1-(glutaric acid)-4,7,10-triacetic acid (DOTAGA), 2,2’,2’’,2’’’-(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrayl)tetraacetamide (DOTAM), et 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan (Cyclam), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane (Cyclen) et la déferoxamine (DFO).
Mode 23 : Nanoparticule selon l’un quelconque des modes 20 à 22, caractérisé en ce que le groupement chélatant Ch est le DOTAGA de formule (I) suivante [Chem. 1]

(I).
Mode 24 : Nanoparticule selon l’un des modes 20 à 23, caractérisée en ce que PS est une matrice de polysiloxane.
Mode 25 : Nanoparticule selon le mode 24, caractérisée en ce que
- le ratio poids en silicium sur le poids total de la nanoparticule est compris entre 5% et 25%,
- le nombre total n+m+p de groupements chélatants greffés sur le polymère est compris entre 5 et 50 par nanoparticule, de préférence entre 10 et 30, et,
- un diamètre moyen compris entre 2 et 8 nm.
Mode 26 : Nanoparticule selon l’un quelconque des modes 20 à 25, caractérisé en ce que le cation métallique M2 est choisi parmi des agents d’imagerie pour la scintigraphie, par exemple44Sc,64Cu,68Ga,89Zr,111In,99mTc.
Mode 27 : Nanoparticule selon l’un quelconque des modes 20 à 25, caractérisé en ce que le cation métallique M2 est choisi parmi des agents thérapeutiques pour la curiethérapie, par exemple90Y,166Ho,177Lu,212Bi,213Bi,211At.
Mode 28 : Nanoparticule selon l’un quelconque des modes 20 à 27, caractérisée en ce que
(i) PS est une matrice de polysiloxane,
(ii) Ch est un groupement chélatant DOTAGA de formule (I) suivante [Chem. 1]


(I)
et greffé a la matrice de polysiloxane par liaison Si-C,
(iii) M1 est le cation gadolinium Gd3+,
(iv) p est nul, et m+n est compris entre 5 et 50, de préférence entre 10 et 30,
(v) n/n+p est compris entre 0,1 et 0,9, par exemple entre 0,25 et 0,35 ou entre 0,65 et 0,75, ou entre 0,45 et 0,55, et
(vi) le diamètre hydrodynamique moyen est compris entre 2 et 8 nm.
Mode 29 : Nanoparticule selon l’un quelconque des modes 20 à 28, caractérisée en ce que
(i) PS est une matrice de polysiloxane,
(ii) Ch1 est un groupement chélatant DOTAGA de formule (I) suivante [Chem. 1]


(I)
et greffé a la matrice de polysiloxane par liaison Si-C,
(iii) M1 est le cation gadolinium Gd3+, M2 est le cation Bismuth Bi3+,
(iv) n+m+p est compris entre 5 et 50, de préférence entre 10 et 30,
(v) m/(n+m+p) est compris entre 10% et 90%, de préférence entre 45% et 55%,
(vi) m/(n+m+p) est compris entre 10% et 90%, de préférence entre 45% et 55%,
(vii) p est sensiblement nul, et
(viii) le diamètre hydrodynamique moyen est compris entre 2 et 8 nm.
Mode 30 : Solution colloïdale de nanoparticules selon l’un quelconque des modes 20 à 29.
Mode 31 : Composition pharmaceutique comprenant une solution colloïdale de nanoparticules selon l’un quelconque des modes 20 à 29, et un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
Mode 32 : Composition pharmaceutique selon le mode 31, pour son utilisation dans la détection et ou le traitement du cancer chez un sujet, caractérisée en ce que ladite composition comprend une quantité efficace de cation métallique M1 et le cas échéant de cations M2, à titre d’agent radiosensibilisant, de préférence M1 étant du gadolinium,
et en ce que le sujet est traité par radiothérapie après administration de ladite composition.
D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels :
Fig. 1
La montre les résultats de la titration intermédiaire des DOTA libres tout au long du processus de formations des nanoparticules Gd/Bi : 100/0 (A) 70/30 (B.), 50/50 (C.), 30/70 (D.).
Nanoparticules ultrafines et nanoparticules AGuIX
Dans un mode de réalisation plus particulièrement préféré, en raison notamment de leur très faible dimension et leur stabilité et de leur biodistribution, les nanoparticules précurseurs utilisables dans les procédés de la présente divulgation sont des nanoparticules comprenant une matrice PS de polysiloxane et qui ne comprennent pas de cœur à base d’oxyde métallique, à la différence des nanoparticules de type cœur-coquille comprenant un cœur à base d’oxyde métalliques et un enrobage de polysiloxane (qui sont décrites notamment dans WO2005/088314 et WO2009/053644).
Aussi, dans un mode de réalisation spécifique, les nanoparticules précurseurs utilisables selon procédé de la présente divulgation sont des nanoparticules à base de polysiloxane chélaté au gadolinium, de formule [Ch-M1]n-PS, dans laquelle
(i) PS est une matrice de polysiloxane,
(ii) Ch est un groupement chélatant DOTAGA de formule (I) suivante [Chem. 1]

(I)
et greffé a la matrice de polysiloxane par liaison covalente,
(iii) M1 un cation gadolinium Gd3+,
(iv) n est compris entre 5 et 50, de préférence entre 10 et 30, et
(iv) le diamètre hydrodynamique moyen est compris entre 2 et 8 nm.
Plus spécifiquement, ces nanoparticules à base de polysiloxane chélaté au gadolinium sont des nanoparticules ultrafines obtenues à partir de nanoparticules AGuIX comme matériel de départ.
De telles nanoparticules ultrafines AGuIX peuvent être obtenues par une méthode de synthèse top-down décrites notamment dans Mignot et al Chem Eur J 2013 « A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica nanoparticles for theranostic applications » DOI: 10.1002/chem.201203003.
D’autres procédés de synthèse des nanoparticules ultrafines sont également décrits dans WO2011/135101, WO2018/224684 et WO2019/008040.
Les nanoparticules AGuIX, qui peuvent servir de matériel de départ pour dans le procédé selon la présente divulgation ont en particulier la formule (III) suivante [Chem. 3]

(III)
dans laquelle PS est une matrice de polysiloxane, et n est en moyenne, environ 10 ±2, et les nanoparticules présentent un diamètre hydrodynamique moyen de 4 ±2 nm et une masse d’environ 10 kDa.
Les nanoparticules AGuIX peuvent également être caractérisées par la formule (IV) suivante [Chem. 4]
(GdSi4-7C24-30N5-8O15-25H40-60, 5-10 H2O)x
(IV)
Dans un mode de réalisation préféré, les nanoparticules précurseurs sont des nanoparticules ultrafines ou AGuIX comme définies à la section précédente et complexées avec le cation gadolinium.
Les nanoparticules obtenues selon le procédé ci-dessus peuvent ensuite être avantageusement fonctionnalisées par d’autres groupements chélatants, différent de Ch et/ou des agents de ciblage ou molécules hydrophiles. C’est donc l’un des aspects du procédé de la présente divulgation de fournir une méthode pour obtenir des nanoparticules aux propriétés avantageuses, notamment pour leurs utilisations comme médicament ou agent de diagnostic ou theragnostic, comme décrits ci-après.
Variante du procédé pour la production de nanoparticules comprenant des cations métalliques M1 et M2 complexés aux groupement chélatants Ch
Dans un mode de réalisation, les nanoparticules obtenues selon le procédé ci-dessus sont mises en présence d’un cation M2, différent du cation métallique M1, par exemple un cation métallique ou un radioisotope d’intérêt, afin d’obtenir la complexation d’une partie au moins des groupements chélatants Ch rendus libres suite à l’étape (2) de traitement.
Ainsi, la présente divulgation porte sur un procédé de préparation d’une solution colloïdale de nanoparticules, chaque nanoparticule comprenant des groupements chélatants greffés sur une matrice de polymère, une première fraction f1 des groupements chélatants étant complexée à un cation métallique M1, une deuxième fraction f2 étant complexée à un cation M2, et une troisième fraction f3 étant non complexée, ledit procédé comprenant
(1) la synthèse ou la fourniture d’une solution colloïdale de nanoparticules précurseurs, lesdites nanoparticules précurseurs étant de formule suivant [Ch-M1]n-PS dans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Ch est un groupement chélatant complexé à un cation métallique M1 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50,
- Ch est greffé sur la matrice de polymères,
- n est compris entre 5 et 100, et,
- le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule précurseur est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm
(2) une étape de traitement de la solution colloïdale dans un milieu acide, par exemple en ajoutant une solution d’acide chlorhydrique, afin d’obtenir un pH de préférence inférieur à 2,0, pendant une durée suffisante pour obtenir un relargage partiel des cations métalliques M1,
(3) le cas échéant, une étape de dilution de la solution, par exemple avec de l’eau,
(4) une étape de purification pour séparer les nanoparticules obtenues à l’étape (2) des cations métalliques M1 libres,
(5) le cas échéant une étape de concentration de la solution des nanoparticules obtenues à l’étape (4),
(6) le cas échéant la répétition des étapes (3), (4) et (5),
(7) éventuellement, une étape de recomplexation partielle des nanoparticules obtenues à l’étape (2), (3), (4), (5) ou (6) avec une quantité déterminée de cation métallique M1 afin d’obtenir une quantité déterminée de chélatant Ch complexé par le cation métallique M1,
(8) la mise en contact de la solution de nanoparticules obtenues à l’étape (2), (3), (4), (5) ou (6) avec une quantité suffisante de cation M2, par exemple un cation métallique différent des cations métalliques M1, ou un radioisotope d’intérêt, pour complexer au moins une partie des groupements chélatants Ch1 rendus libres à l’étape (2), de sorte à obtenir une solution colloïdale de nanoparticules, chaque nanoparticule comprenant des groupements chélatants greffés sur une matrice de polymère, une première fraction f1 des groupements chélatants étant complexée à un cation métallique M1, une deuxième fraction f2 étant complexée à un cation métallique M2, et une troisième fraction f3 étant non complexée et,
(9) le cas échéant, la congélation et/ou la lyophilisation de la solution de nanoparticules obtenues à l’étape (8).
Des modes de réalisation spécifiques du procédé selon la présente divulgation sont donnés dans les Exemples. Typiquement, à l’étape (2), l’homme du métier sera en mesure d’adapter le pH, et/ou la durée du traitement en fonction de la quantité de relargage souhaitée des cations métalliques M1. Il pourra également être possible de relarguer une quantité supérieure de cation métallique M1 aux étapes (2) à (6) et ajuster la fraction f1 souhaitée avec l’étape (7) de recomplexation partielle avec le cation métallique M1.
Dans un mode de réalisation spécifique, en particulier avec l’utilisation de nanoparticules AGuIX comme nanoparticules précurseurs, le temps de traitement est compris entre 0,5 et 90 heures, par exemple entre 1 et 72 heures, notamment au moins 4, 5, 24 ou 72 heures, à pH inférieur à 2,0, de préférence inférieur à 1,0.
Les étapes (7) et (8) peuvent nécessiter le rétablissement d’un pH compris entre 6,0 et 8,0, de préférence un pH neutre et/ou le chauffage de la solution de nanoparticules à une température et un temps suffisant pour obtenir la complexation. Par exemple, l’étape (7) ou (8) peut être effectuée à une température comprise entre 60 et 95°C, typiquement 80°C pendant une durée comprise entre 24 et 72 heures, par exemple 48 heures.
L’homme du métier sera également en mesure d’adapter la quantité de cation M2 à l’étape (8) en fonction de la quantité de groupements chélatants libre, et les fractions f2 et f3 souhaitées, représentant respectivement la fraction d’agent chélatant complexé au cation métallique M2 ou radioisotope et la quantité d’agent chélatant restant non complexé.
Dans un mode de réalisation, l’homme du métier utilisera une quantité en excès de cations M2 de sorte à complexer essentiellement tous les agents chélatants libres. Ainsi la fraction f3 est sensiblement nulle.
Dans un autre mode de réalisation, s’il reste des groupements chélatants libres après l’étape (8) de complexation avec un cation M2, il pourra être possible également de réaliser une autre étape de complexation avec un cation métallique M1, afin d’adapter les fractions f2 et f3 souhaités.
Variante du procédé pour la fonctionnalisation des nanoparticules avec des molécules ciblantes
Outre la fonctionnalisation chélatante, les nanoparticules obtenues dans le procédé selon la présente divulgation peuvent éventuellement être modifiées (fonctionnalisation) en surface par des composés hydrophiles (PEG) et/ou chargées différemment pour adapter leur bio-distribution au sein de l'organisme et/ou des molécules ciblantes pour permettre un ciblage cellulaire spécifique, en particulier pour le ciblage de tissus ou cellules tumorales spécifiques. Les agents de ciblage sont greffés à la matrice de polymères et sont présents préférentiellement dans une proportion comprise entre 1 et 20 agents de ciblages par nanoparticule et de préférence entre 1 et 5 agents de ciblages.
Pour le greffage en surface des molécules ciblantes, on pourra utiliser un couplage classique avec des groupes réactifs présents, éventuellement précédé d’une étape d’activation. Les réactions de couplage sont connues de l’homme du métier et seront choisies en fonction de la structure de la couche superficielle de la nanoparticule et des groupements fonctionnels de la molécule ciblante. Voir par exemple, « Bioconjugate Techniques », G.T Hermanson, Academic Press, 1996, dans « Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity », Second Edition, W.T. Mason, ed. Academic Press, 1999. Des méthodes de couplage préférées sont décrites plus loin. De préférence, ces molécules ciblantes sont greffées aux liaisons amines des nanoparticules selon la variante des nanoparticules ultrafines ou AGuIX telle que décrite au paragraphe précédent. On choisira les molécules ciblantes en fonction de l’application envisagée.
Dans un mode de réalisation spécifique, les nanoparticules précurseurs sont fonctionnalisées avec un agent de ciblage, tel qu’un un peptide, une immunoglobuline, un nanobody, un anticorps, un aptamère ou tout autre protéine ciblante, par exemple des zones tumorales, typiquement un anticorps, immunoglobuline ou nanobody, fragment VHH, ou « single domain », ciblant des antigènes associés à des tumeurs (« tumor-associated antigens ») ou certains marqueurs cancéreux connus de l’homme du métier.
Nanoparticules comprenant des cations M1 et M2 complexé s à un groupement chélatant Ch
La présente divulgation porte également sur les nanoparticules et solutions de nanoparticules telles qu’obtenues par les procédés décrits aux paragraphes précédents, ou susceptibles d’être obtenues par les procédés décrits aux paragraphes précédentes.
Ainsi, la présente divulgation concerne des nanoparticules de formule (II) suivante [Chem. 2]


(II)
dans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique, par exemple du polysiloxane,
- [Ch-M1] est un groupement chélatant Ch complexé avec un cation métallique M1 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50, par exemple un cation gadolinium,
- [Ch-M2] est un groupement chélatant Ch complexé à un cation M2 identique ou différent du cation métallique M1, par exemple un cation métallique à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50, ou un radioisotope, par exemple M2 est un cation bismuth,
- [Ch] est un groupement chélatant Ch non complexé
et caractérisées en ce que
(i) les agents chélateurs Ch sont greffés de manière covalente à la surface de la matrice de polymères,
(ii) le ratio molaire n/(n+m+p) est compris entre 10% et 90%, de préférence entre 25% et 35%, typiquement 30%, le ratio molaire m/(n+m+p) est compris entre 10 et 90%, de préférence entre 65% et 75%, et,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm.
Dans un mode de réalisation qui peut être préférentiellement combiné avec le mode précédent, le ratio molaire p/(n+m+p) est sensiblement nul.
Dans un autre mode de réalisation préféré qui peut être combiné avec les 2 modes précédents, le ratio molaire m/(n+m+p) est compris entre 45% et 55%, typiquement 50%, le ratio molaire n/(n+m+p) est compris entre 45% et 55%, typiquement 50%, et le ratio molaire p/(n+m+p) est sensiblement nul.
Les caractéristiques concernant notamment la nature chimique de la matrice de polymère PS, le diamètre hydrodynamique moyen, le groupement chélatant Ch, et le nombre de groupement chélatant par nanoparticule, à savoir n+m+p, seront intrinsèquement associées au choix des nanoparticules précurseurs dans le procédé comme décrites au paragraphe précédent. Elles s’appliquent donc également aux nanoparticules telles qu’obtenues par le procédé, ou susceptibles d’être obtenues par le procédé.
Les nanoparticules ont de préférence de très faibles diamètres par exemple, compris entre 1 et 10 nm, de préférence entre 2 et 8 nm.
Les nanoparticules sont également de préférence des nanoparticules comprenant une matrice de polysiloxane.
Dans un mode préféré, le groupement chélatant Ch est le DOTAGA de formule(I) suivante [Chem. 1]

(I)
Plus particulièrement, les cations métalliques M1 et M2 sont choisis indépendamment parmi les métaux lourds, de préférence parmi le groupe constitué de : Pt, Pd, Sn, Ta, Zr, Tb, Tm, Ce, Dy, Er, Eu, La, Nd, Pr, Lu, Yb, Bi, Hf, Ho, Sm, In et Gd. De préférence, les cations métalliques M1 et M2 (ou M2 et M1) sont Gd et Bi respectivement.
Dans un mode de réalisation particulier, la nanoparticule comprend entre 3 et 100, de préférence entre 5 et 50 cations métalliques M1 et M2, par exemple entre 10 et 30, en particulier de Gd et Bi.
Dans un autre mode de réalisation, M1 est choisi parmi les métaux lourds comme indiqué plus haut et M2 est choisi parmi les isotopes radioactifs, en particulier pour leur utilisation pour l’imagerie par scintigraphie ou la curiethérapie.
L’homme du métier sélectionnera les ratios molaires n/(n+m+p) et m/(n+m+p) en fonction de l’effet souhaité, et notamment en fonction du traitement souhaité, du type de patients, de la dose utilisée, et/ou du patient à traiter. Par exemple, dans un mode de réalisation particulier le ratio (n+m)/(n+m+p) est supérieur ou égal à 80% ; notamment compris entre 90 et 100.
Dans un mode de réalisation préféré, les nanoparticules de formule (2) ci-dessus sont caractérisées en ce que
(i) PS est une matrice de polysiloxane,
(ii) Ch1 est un groupement chélatant DOTAGA de formule (I) suivante [Chem. 1]


(I)
et greffé a la matrice de polysiloxane par liaison Si-C,
(iii) M1 est le cation gadolinium Gd3+, M2 est le cation bismuth Bi3+,
(iv) n+m+p est compris entre 5 et 50, de préférence entre 10 et 30,
(v) n/(n+m+p) est compris entre 10% et 90%, de préférence entre 45% et 55%,
(vi) m/(n+m+p) est compris entre 10% et 90%, de préférence entre 45% et 55%,
(vii) p est sensiblement nul, et
(viii) le diamètre hydrodynamique moyen est compris entre 2 et 8 nm.
Dans un mode de réalisation préféré, les nanoparticules de formule (2) ci-dessus sont caractérisées en ce que
(i) PS est une matrice de polysiloxane,
(ii) Ch1 est un groupement chélatant DOTAGA de formule (I) suivante [Chem. 1]


(I)
et greffé a la matrice de polysiloxane par liaison Si-C,
(iii) M1 est le cation gadolinium Gd3+, M2 est le cation bismuth Bi3+,
(iv) n+m+p est compris entre 5 et 50, de préférence entre 10 et 30,
(v) n/(n+m+p) est compris entre 25% et 35%,
(vi) m/(n+m+p) est compris entre 65% et 75%,
(vii) p est sensiblement nul, et
(viii) le diamètre hydrodynamique moyen est compris entre 2 et 8 nm.
Dans un mode de réalisation préféré, les nanoparticules de formule (2) ci-dessus sont caractérisées en ce que
(i) PS est une matrice de polysiloxane,
(ii) Ch1 est un groupement chélatant DOTAGA de formule (I) suivante [Chem. 1]

(I)
et greffé a la matrice de polysiloxane par liaison Si-C,
(iii) M1 est le cation gadolinium Gd3+, M2 est le cation bismuth Bi3+,
(iv) n+m+p est compris entre 5 et 50, de préférence entre 10 et 30,
(v) n/(n+m+p) est compris entre 65% et 75%,
(vi) m/(n+m+p) est compris entre 25% et 35%,
(vii) p est sensiblement nul, et
(viii) le diamètre hydrodynamique moyen est compris entre 2 et 8 nm.
Formulations pharmaceutiques des nanoparticules selon la présente divulgation
Les compositions comprenant les nanoparticules selon la présente divulgation sont administrées sous la forme de suspensions colloïdales de nanoparticules. Elles peuvent être préparées comme décrits ici ou selon d’autres méthodes connues de l’homme du métier et administrées via différentes voies, locale ou systémique, selon le traitement et la zone à traiter.
Aussi, la présente divulgation porte sur une suspension colloïdale de nanoparticules de formule (2) telles que décrites aux sections précédentes et les compositions pharmaceutiques comprenant ces suspensions colloïdales, le cas échéant, en association avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
Les compositions pharmaceutiques peuvent être en particulier formulées sous la forme de poudres lyophilisées, ou de solutions aqueuses pour une injection intraveineuse. Dans un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique comprend une solution colloïdale avec une quantité thérapeutiquement efficace de nanoparticules de formule (2) telles que décrites aux sections précédentes, en particulier des nanoparticules à base de polysiloxane chélaté au gadolinium et au moins un autre cation métallique, par exemple le bismuth, et plus précisément, telles qu’obtenues à partir de nanoparticules AGuIX comme décrit plus haut.
Dans certains modes de réalisations, il s’agit de poudre lyophilisée, comprenant entre 200 mg et 15 g par flacon, de préférence entre 250 et 1250 mg de nanoparticules. La poudre peut comprendre en outre d’autres excipients, et notamment du CaCl2.
Les poudres lyophilisées peuvent être reconstituées dans une solution aqueuse, typiquement de l’eau stérile pour injection. Ainsi, la présente divulgation porte sur une composition pharmaceutique pour son utilisation comme solution pour injection, comprenant à titre de principe actif, les nanoparticules de formule (2) telles que décrites aux sections précédentes, en particulier des nanoparticules à base de polysiloxane chélaté au gadolinium, et plus précisément, telles qu’obtenues à partir de nanoparticules AGuIX comme décrit plus haut.
Utilisations des nanoparticules
Du fait de la présence de groupements chélatants Ch1 libres ou complexés avec des cations métalliques M1, et, le cas échéant, des cations M2, les nanoparticules selon la présente divulgation permettent une utilisation en tant qu’agent radiosensibilisant lorsque M1 et/ou M2 sont judicieusement choisis pour une utilisation comme agent radiosensibilisant, et le procédé comprend, après administration de la composition, une étape d’irradiation du sujet par une dose efficace pour le traitement de la tumeur par radiothérapie.
Dans certains modes de réalisation, les nanoparticules selon la présente divulgation permettent une utilisation en tant qu’agent d’imagerie, pour l’imagerie médicale, par exemple, l’imagerie par résonance magnétique (IRM), notamment pour la détection de tumeurs chez un sujet, lorsque M1 et/ou M2 sont judicieusement choisis pour une utilisation comme agent d’imagerie, par exemple agent de contraste pour l’IRM, et le procédé comprend, après administration de la composition, une étape d’imagerie du sujet par une dose efficace pour l’imagerie de la zone d’intérêt, notamment l’imagerie par IRM chez un sujet en vue de la détection de tumeurs.
Par « patient » ou « sujet », on entend de préférence un mammifère ou un être humain incluant par exemple un sujet ayant une tumeur.
Les termes « traitement », « thérapie », se réfèrent à n’importe quel acte qui a pour but d’améliorer l’état de santé d’un patient, tel que la thérapie, la prévention, la prophylaxie, et le retardement d’une maladie. Dans certains cas, ces termes se réfèrent à l’amélioration ou l’éradication d’une maladie ou des symptômes associés à la maladie. Dans d’autres modes de réalisation, ces termes se réfèrent à la réduction de la propagation ou l’aggravation de la maladie résultant de l’administration d’un ou plusieurs agents thérapeutiques à un sujet atteint d’une telle maladie. Dans le cadre du traitement de tumeurs, le terme « traitement » peut englober typiquement un traitement permettant l’arrêt de la croissance d’une tumeur, la réduction de la taille de la tumeur et/ou l’élimination de la tumeur.
En particulier, les nanoparticules sont utilisées pour la détection et/ou le traitement des tumeurs solides, par exemple le cancer du cerveau (primaires et secondaires, le glioblastome…), les cancers hépatiques (primaires et secondaires), les tumeurs pelviennes (cancer du col de l’utérus, cancer de la prostate, cancer anorectal, cancer colorectal), les cancers des voies aérodigestives supérieures, le cancer des poumons, le cancer de l’œsophage, le cancer du sein, le cancer du pancréas.
Par « quantité efficace » de nanoparticules, il est fait référence à la quantité de nanoparticules telles que décrites précédemment qui administrée à un patient est suffisante pour être localisées dans la tumeur et permettre une détection et/ou un traitement de la tumeur par effet radiosensibilisant avec un traitement de radiothérapie.
Cette quantité est déterminée et ajustée en fonction de facteurs tels que l’âge, le sexe et le poids du sujet.
L'administration des nanoparticules telles que décrites précédemment peut être réalisée par voie intratumorale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intradermique, intrapéritonéale, orale, sublinguale, rectale, vaginale, intranasale, par inhalation ou par application transdermique. De préférence, elle se fait par voie intratumorale et/ou intraveineuse.
Les méthodes d’irradiation pour le traitement de tumeurs après administration de nanoparticules en tant qu’agent radiosensibilisant sont bien connues de l’homme du métier et ont été décrites en particulier dans les publications suivantes : WO2018/224684, WO2019/008040 et C. Verry, et al, Science Advances, 2020, 6, eaay5279 ; et, C. Verry, et al, NANO-RAD, a phase I study protocol », BMJ Open, 2019, 9, e023591.
La dose totale d’irradiation lors d’une radiothérapie sera ajustée selon le type de cancer, le stade et le sujet à traiter. Pour une dose curative, une dose totale typique pour une tumeur solide est de l’ordre de 20 à 120 Gy. D’autres facteurs peuvent être pris en compte tel qu’un traitement par chimiothérapie, une co-morbidité, et/ou le fait que la radiothérapie a lieu avant ou après une intervention chirurgicale. La dose totale est en général fractionnée. L’étape de radiothérapie dans le procédé selon la présente divulgation peut comprendre par exemple plusieurs fractions entre 2 et 6 Gy par jour, par exemple 5 jours par semaines, et notamment sur 2 à 8 semaines consécutives, la dose totale pouvant être entre 20 et 40 Gy, par exemple 30 Gy.
Aussi, la présente divulgation vise une méthode de traitement de tumeurs, notamment de tumeurs solides, chez un sujet qui en a besoin, ladite méthode comprenant l’administration chez le sujet d’une quantité efficace de nanoparticules de formule (2) comme décrit ci-dessus, et pour lesquelles M1 et M2 sont choisis parmi des agents d’imagerie par résonance magnétique et radiosensibilisants, en particulier le gadolinium et le bismuth.
Les nanoparticules selon la présente divulgation peuvent être administrées seules, ou en combinaison avec un ou plusieurs autres principes actifs, et notamment d’autres médicaments tels que des agents cytotoxiques ou anti-prolifératifs ou d’autres agents anti-cancéreux et notamment des inhibiteurs de checkpoint immunitaires. Par administration combinée, on entend une administration simultanée ou séquentielle (à des temps différents).
Exemples
Matériel et méthodes
Les produits Acidix sont obtenus en introduisant le produit de départ AGuIX®, fourni par la société Nh Theraguix (France), dans un milieu fortement acide obtenu à partir d’acide chloridrique 37% extra-pur provenant de chez CarlRoth.
Les étapes de filtration sont réalisées grâce à une pompe péristaltique et une cassette Vivaflow 200® – 5kDa de chez Sartorius Stedim Biotech (France) utilisé comme dans les conditions décrites dans la notice reliée au produit Vivaflow 200®.
La mesure du diamètre hydrodynamique ainsi que la titration du point isoélectrique sont effectuées avec un Zetasizer Nano-S (633 nmHe-Ne laser) de chez Malvern Instruments (USA). Pour la mesure du point isoélectrique, cet appareil est couplé à un titrateur automatique MPT-2 de chez Malvern Instruments (USA).
L’HPLC-UV est réalisée avec une Agilent 1200 avec un détecteur DAD. La colonne phase inverse utilisée est une C4, 5 µm, 300 Å, 150 x 4,6 mm de chez Jupiter. La détection est opérée par un détecteur UV à une longueur d’onde de 295 nm. Le gradient des phases A (H20/ACN/TFA : 98,9/1/0,1) et B (H20/ACN/TFA : 10/89,9/0,1) est le suivant : 5 minutes à 95/5 suivi d’un gradient linéaire sur 10 min qui permet d’atteindre le ratio 10/90 qui est maintenu pendant 15 minutes. Au bout de ces 15 minutes le taux de A est repassé à 95% en 1 minute et est suivi d’un plateau 7 minute à 95/5. Les produits utilisés dans la composition des phases éluantes sont tous certifiés HPLC grade.
L’analyse élémentaire a été faite à l’Institut des Sciences Analytiques, UMR 5280, Pole Isotopes & Organique, 5 rue de la Doua 69100 Villeurbanne.
L’HPLC-ICP/MS est réalisée avec Nexion 2000 de chez Perkin-Elmer (USA). La mesure des éléments libres dans le milieu est effectuée en mode isocratique avec une phase d’élution de la composition suivante : 95% A et 5% B. La composition des phases A et B est identique à la méthode HPL-UV. La colonne phase inverse utilisée est une C4, 5 µm, 300 Å, 150x4,6 mm de chez Jupiter. Les produits utilisés dans la composition des phases éluantes sont tous certifiés HPLC grade.
La lyophilisation des particules est réalisée par l’intermédiaire d’un lyophilisateur Alpha 2-4 LSC de chez Christ (Allemagne) en suivant le programme “dessiccation primaire”.
La mesure de Dota libre est effectuée en ajoutant une quantité croissante de Cu2+a une quantité fixe de produit. Le cuivre provient d’une solution de Cu2+15mM préalablement préparée à partir de CuCl2(Sigma Aldrich, 99%, poudre, 25g) dissous dans de l’eau ultra pure. Le volume des échantillons est ensuite ajusté avec une solution tampon d’acétate à pH 5 pour assurer une complexation totale. Une fois les échantillons préparés une mesure HPLC-UV est effectuée à 295 nm comme précisé précédemment. L’absorbance totale est mesurée en intégrant le segment 0-15 min du chromatogramme obtenu. L’augmentation du signal d’absorbance étant basé sur la formation du complexe Dota(Cu) la quantité de Dota libre dans le milieu peut être obtenue lorsque le point de steochiometrie entre Dota libre et Cu2+ajouté est atteint. Ce point se traduit par une rupture de pente sur le graphique obtenu.
Exemple 1: Acidification du milieu et relargage d’ion Gd 3+
Afin d’obtenir une nanoparticule selon le procédé, le produit AGuIX® a été placé dans un milieu acide dans le but de protoner les groupements DOTA et ainsi libérer une partie des ions Gd3+initialement complexés.
Premièrement, une solution d’AGuIX® à 200 g/L a été préparée en dissolvant 10 g de produit dans 50 ml d’eau UltraPure. La solution a été laissée sous agitations à température ambiante pendant 1h. En parallèle, une solution d’acide chlorhydrique 2M a été préparée en ajoutant 10 ml d’acide chlorhydrique 37% (Acide chlorhydrique 37%, extra-pur, 2,5 L, plastique, CarlRoth) à 50 ml d’eau UltraPure.
Après une heure d’agitation, 50 ml de la solution d’acide chlorhydrique 2M sont ajoutés aux 50 ml d’AGuIX®. Le pH a été alors mesuré et est inférieur à 0,5. La solution obtenue est de couleur marron-orangé. L’ensemble est laissé dans une étuve préalablement chauffée à 50°C pendant 4 heures. Un prélèvement d’échantillon chaque heure a été effectué afin d’observer par HPLC-ICP/MS le relargage des ions gadolinium. On constate que le pic de Gd3+libre dans le milieu au temps de rétention Tr = 2,3 min augmente avec le temps de réaction.
Exemple 2: Obtention d’une nanoparticule sans gadolinium
Une solution d’AGuIX® à 100 g/L est préparée en dissolvant 5 g de produit dans 50 mL d’eau UltraPure. La solution est laissée sous agitations à température ambiante pendant 1 h. En parallèle, une solution d’acide chlorhydrique 2M est préparée en ajoutant 10 mL d’acide chlorhydrique 37% (Acide chlorhydrique 37%, extra-pur, 2,5L, plastique, CarlRoth) à 50 ml d’eau UltraPure.
Après une heure d’agitation, 50 mL de la solution d’acide chlorhydrique 2 M sont ajoutés aux 50 mL de la solution contenant AGuIX®. L’ensemble est chauffé à 50°C pendant 1 h. Les 100 mL de solution ainsi obtenus sont purifiés au moyen d’une pompe péristaltique et d’une cassette Sartorius Vivaflow 50 R - 5kDa afin de séparer les particules des ions Gd3+libérés et ainsi pousser l’équilibre vers la libération du Gd3+encore complexé. Le volume de la solution initiale est ainsi concentré à 50 mL. Le filtrat est directement analysé en ICP-MS afin d’estimer la quantité de Gd3+encore présente dans le milieu. La solution d’AGuIX est de nouveau rediluée avec 50 ml d’une solution d’acide chlorhydrique 1M. De même, la solution est laissée à 50°C pendant 1 h puis reconcentrée à 50 mL. Le procédé se répète jusqu’à ce que la quantité de Gd3+mesurée soit nul. Une fois ce niveau atteint, la solution est purifiée par un facteur 10 000 en utilisant de l’eau Ultrapure afin d’éliminer l’excès de sel dû à l’usage de l’acide chlorhydrique concentré. En fin de procédé, une mesure ICP-MS sur le produit final permet de vérifier qu’il est exempt de tout Gd3+.
Une fois le produit final récupéré, il est mis en flacon, congelé à -80°C puis lyophilisé. La poudre obtenue est ensuite re-dispersée dans l’eau Ultrapure afin d’obtenir une solution à 100g/L. Une mesure de DOTA libre est effectuée par complexation du cuivre et mesure de l’absorbance à 295 nm. Cette mesure indique que le nouveau produit présente un taux de de DOTA libre de 71 µmol/mg de produit. A titre de comparaison le lot d’AGuIX® utilisé pour cette expérience contenait 12,7% (m%) de Gd3+soit un taux de DOTA(Gd) de 81 µmol/mg d’AGuIX.
De plus, un échantillon de produit final est envoyé à un laboratoire spécialisé pour vérifier le taux de Gd encore présent dans l’échantillon, le résultat indique un taux massique de Gd de 0,19% (m%) (Tableau 1) à comparer avec les 12,7% (%m) du lot initial précédemment évoqué. La taille de la nanoparticule obtenue est mesurée par DLS et présente un diamètre hydrodynamique moyen de 5,2 nm ± 2,6 nm du même ordre que le produit AGuIX® d’origine. De plus, le point iso-électrique du produit final est mesuré, le produit final a donc une charge neutre pour un pH de 5,2. Ce pH est inférieur au point iso-électrique de AGuIX® de l’ordre de 7. Cette diminution va dans le sens d’une génération de Dota libre en surface.
%Gd (m%)
AGuIX ® 12,7
Produit final 0,19
Tableau 1. Analyse élémentaire en Gd sur AGuIX® et le produit final.
Exemple 3: Libération de 80% du Gd complexé : 72h
Le procédé présenté dans l’exemple précédent a été adapté pour ne présenter qu’une libération partielle et contrôlée du gadolinium. Premièrement, une solution d’AGuIX® à 200 g/L est préparée en dissolvant 10 g de produit dans 50 ml d’eau UltraPure. La solution est laissée sous agitations à température ambiante pendant 1 h. En parallèle, une solution d’acide chlorhydrique 2M est préparée en ajoutant 10 mL d’acide chlorhydrique 37% (Acide chlorhydrique 37%, extra-pur, 2,5L, plastique, CarlRoth) à 50 mL d’eau UltraPure.
Après une heure d’agitation, 50 mL de la solution d’acide chlorhydrique 2 M sont ajoutés aux 50 mL d’AGuIX®. Le pH est alors mesuré et est inférieur à 0,5. L’ensemble est laissé dans une étuve préalablement chauffée à 50°C pendant 72 h. Un prélèvement d’échantillon est effectué au bout de 4 h de réaction ainsi qu’en fin de réaction afin d’observer par HPLC-ICP/MS le relargage final des ions Gd3+. Le pic de Gd3+ libre dans le milieu au temps de rétention Tr = 2,3 min augmente avec le temps de réaction. Le pic à 72 h recouvre 77,2% du pic de référence Gd3+ 12 ppm qui correspond à la concentration en Gd totale de notre solution d’AGuIX utilisée. Ainsi il reste dans nos particules 22,7% des complexes Dotaga(Gd) initialement présent.
Exemple 4 : Formation de nano particule s Gd/Bi et suivi de complexation
Pour réaliser une nanoparticule avec un ratio spécifique de Gd/Bi la quantité de Dota libre est mesurée. Ainsi le produit de départ de la formation de particule est une nanoparticule où 80% des Dotas sont libres et les 20% restants sont complexés par du Gd3+.
Pour réaliser les 3 lots Gd/Bi (nGd/nBi) suivant 30/70, 50/50 et 70/30 nous commençons par effectuer la complexation du Bi. La complexation du Bi3+ est un processus long. Ainsi après ajout de la quantité nécessaire de BiCl3 (Sigma-Aldrich, reagent grade, >98%) pour atteindre le ratio désiré, le pH est ajusté à 7 avec une solution de NaOH 1M et le mélange est placé à 80°C pour 48h. Après chaque étape de complexation du Bi3+, une mesure du nombre de DOTA libre restant est effectué par complexation du cuivre afin de confirmer l’avancement de la complexation ( ). Une fois le taux de DOTA libre restant conforme aux ratios, on ajoute la quantité nécessaire de GdCl3.6H20 (Merck, 99%) pour complexer le reste des Dota et ainsi former les particules désirées. L’ajout de GdCl3 est suivi d’un réajustement de pH à 7 et de 24h à 80°C. Les particules sont ensuite lyophilisées. Une fois les produits obtenus, un échantillon de chaque lot est envoyé à notre partenaire pour analyse élémentaire afin de vérifier la teneur réelle en chaque élément des différents lots (Tableau 2)
Lot %Gd (%m) / %Bi (%m) nGd/nBi
Gd/Bi : 70/30 7,54% / 4,24% 70,6/29,4
Gd/Bi : 50/50 5,38% / 6,84% 50,7/49,3
Gd/Bi : 30/70 3,16% / 9,97% 29,9/70,1
Tableau 2. Résultats des analyses élémentaires des particules finales
Les présentes solutions techniques peuvent trouver à s’appliquer notamment dans le domaine de la médecine, en particulier pour le traitement de tumeurs.
La présente divulgation ne se limite pas aux exemples décrits ci-avant, seulement à titre d’exemple, mais elle englobe toutes les variantes que pourra envisager l’homme de l’art dans le cadre de la protection recherchée.

Claims (10)

  1. Procédé de préparation d’une solution colloïdale de nanoparticules, chaque nanoparticule comprenant des groupements chélatants greffés sur une matrice de polymère, une partie seulement des groupements chélatants étant complexée à un cation métallique, l’autre partie étant non complexée, ledit procédé comprenant
    (1) la synthèse ou la fourniture d’une solution colloïdale de nanoparticules précurseurs, lesdites nanoparticules précurseurs étant de formule suivante [Ch-M1]n-PS dans laquelle :
    - PS est une matrice de polymère organique ou inorganique, par exemple une matrice de polysiloxane,
    - [Ch-M1] est un groupement chélatant complexé à un cation métallique M1 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50,
    - Ch est greffé de manière covalente à la surface d’une matrice de polymères, par exemple, une matrice de polysiloxane,
    - n est compris entre 5 et 100, et,
    - le diamètre hydrodynamique moyen des nanoparticules est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm,
    (2) une étape de traitement de la solution colloïdale dans un milieu acide, par exemple en ajoutant une solution d’acide chlorhydrique, afin d’obtenir un pH de préférence inférieur à 2,0, de préférence inférieur à 1,0, pendant une durée suffisante pour obtenir un relargage partiel des cations métalliques M1,
    (3) le cas échéant, une étape de dilution de la solution colloïdale, par exemple avec de l’eau,
    (4) une étape de purification pour séparer les nanoparticules obtenues à l’étape (2) des cations métalliques M1 relargués,
    (5) le cas échéant une étape de concentration de la solution des nanoparticules obtenues à l’étape (4),
    (6) le cas échéant la répétition des étapes (3), (4) et (5),
    (7) le cas échéant, la congélation et/ou la lyophilisation de la solution de nanoparticules obtenues à l’une des étapes (4), (5) ou (6).
  2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que M1 est choisi parmi les cations métalliques sélectionné parmi des agents radiosensibilisants et/ou des agents de contraste pour l’imagerie par résonnance magnétique (IRM), par exemple M1 est choisi parmi le gadolinium et le bismuth.
  3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le groupement chélatant Ch est choisi parmi les agents macrocycliques, de préférence parmi l’acide 1,4,7-triazacyclononanetriacétique (NOTA), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-l,4,7,10-tetraacétique (DOTA), l’acide 1,4,7-triazacyclononane-l-glutarique-4,7-acide diacetique acid (NODAGA), et l’acide 1,4,7,10-tetraazacyclododececane,1-(glutaric acid)-4,7,10-triacetic acid (DOTAGA), 2,2’,2’’,2’’’-(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrayl)tetraacetamide (DOTAM), et 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan (Cyclam), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane (Cyclen) et la déferoxamine (DFO).
  4. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le groupement chélatant Ch est le DOTAGA de formule (I) suivante :

    (I).
  5. Procédé selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que PS est une matrice de polysiloxane.
  6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les nanoparticules précurseurs ont les caractéristiques suivantes :
    - le ratio poids en silicium sur le poids total de la nanoparticule est compris entre 5% et 25%,
    - le nombre total n de groupements chélatants greffés sur le polymère est compris entre 5 et 50 par nanoparticule, de préférence entre 10 et 30, et,
    - la nanoparticule a un diamètre moyen compris entre 2 et 8 nm.
  7. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les nanoparticules précurseurs ont les caractéristiques suivantes :
    (i) PS est une matrice de polysiloxane,
    (ii) Ch est un groupement chélatant DOTAGA de formule suivante [Chem. 1]


    (I)
    et greffé à la matrice de polysiloxane par liaison Si-C,
    (iii) M1 est le cation gadolinium Gd3+,
    (iv) n est compris entre 5 et 50, de préférence entre 10 et 30, et
    (iv) le diamètre hydrodynamique moyen est compris entre 2 et 8 nm.
  8. Procédé de préparation d’une solution colloïdale de nanoparticules, chaque nanoparticule comprenant des groupements chélatants greffés sur une matrice de polymère, une première fraction f1 des groupements chélatants étant complexée à un cation métallique M1, une deuxième fraction f2 étant complexée à un cation M2, et une troisième fraction f3 étant non complexée, ledit procédé comprenant
    (1) la synthèse ou la fourniture d’une solution colloïdale de nanoparticules précurseurs, lesdites nanoparticules précurseurs étant de formule suivant [Ch-M1]n-PS dans laquelle :
    - PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
    - Ch est un groupement chélatant complexé à un cation métallique M1 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50,
    - Ch est greffé sur la matrice de polymères,
    - n est compris entre 5 et 100, et,
    - le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule est compris entre 1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8 nm
    (2) une étape de traitement de la solution colloïdale dans un milieu acide, par exemple en ajoutant une solution d’acide chlorhydrique, afin d’obtenir un pH inférieur à 2,0, de préférence inférieur à 1,0, pendant une durée suffisante pour obtenir un relargage partiel des cations métalliques M1,
    (3) le cas échéant, une étape de dilution de la solution, par exemple avec de l’eau,
    (4) une étape de purification pour séparer les nanoparticules obtenues à l’étape (2) des cations métalliques M1 libres,
    (5) le cas échéant une étape de concentration de la solution des nanoparticules obtenues à l’étape (4),
    (6) le cas échéant la répétition des étapes (3), (4) et (5),
    (7) éventuellement, une étape de recomplexation partielle des nanoparticules obtenues à l’étape (2), (3), (4), (5) ou (6) avec une quantité déterminée de cation métallique M1 afin d’obtenir une quantité déterminée de groupement chélatant Ch complexé avec le cation métallique M1,
    (8) la mise en contact de la solution de nanoparticules obtenues à l’étape (4), (5) (6) ou (7) avec une quantité suffisante de cation M2, de préférence à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50, par exemple un cation métallique différent des cations métalliques M1 ou un radioisotope, pour complexer au moins une partie des groupements chélatants Ch1 rendus libres à l’étape (2) et,
    (9) le cas échéant, la congélation et/ou la lyophilisation de la solution de nanoparticules obtenues l’étape (8).
  9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que M1 et/ou M2 sont choisis parmi les cations métalliques sélectionné parmi des agents radiosensibilisants et/ou des agents de contraste pour l’imagerie par résonnance magnétique (IRM), par exemple le gadolinium ou le bismuth.
  10. Procédé selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que le groupement chélatant Ch est choisi parmi les agents macrocycliques, de préférence parmi l’acide 1,4,7-triazacyclononanetriacétique (NOTA), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-l,4,7,10-tetraacétique (DOTA), l’acide 1,4,7-triazacyclononane-l-glutarique-4,7-acide diacetique acid (NODAGA), et l’acide 1,4,7,10-tetraazacyclododececane,1-(glutaric acid)-4,7,10-triacetic acid (DOTAGA), 2,2’,2’’,2’’’-(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrayl)tetraacetamide (DOTAM), et 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan (Cyclam), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane (Cyclen) et la déferoxamine (DFO).
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