CN116472067A - 用于制备纳米颗粒的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及纳米颗粒及其在药物，特别是用于治疗肿瘤的药物中的用途。

Description

用于制备纳米颗粒的方法
技术领域
本公开涉及用于制备纳米颗粒的方法、纳米颗粒及其在药物，特别是用于治疗肿瘤的药物领域中的用途。
发明背景
目前对抗癌症基于三种主要治疗方法：手术、化学疗法和放射疗法。目前越来越多的研究集中在纳米颗粒的使用上，因为它们能够改善这三类治疗，此外还提出了改善成像技术，或甚至将成像和治疗结合起来，从而产生了治疗诊断学的概念。在放射治疗中，由于存在高原子序数的元素，可以提高局部剂量的功效，同时保护周围健康组织。
尽管它们具有吸引人的多种特性且有大量的临床前研究，但目前只有少数纳米颗粒进入临床阶段(Lux et al.,2018,Br.J.Radiology,2018,91,20180365)。
而对于静脉注射的纳米颗粒，这一数字更低，可以引用具有二氧化硅内核和约155nm的黄金外壳的AuroShell、由用于药物递送的聚乙二醇化金内核组成的CUT-6091、由用于核酸递送的金纳米颗粒组成的NU-0129、由用于黑色素瘤靶向的荧光聚硅氧烷组成的Cornell Dots、以及由用于放射治疗和MRI成像的基于聚硅氧烷和钆螯合物的纳米颗粒组成的AGuIX。
在这些纳米颗粒中，其中两种(AGuIX和Cornell Dots)的流体动力学直径小于10nm，这可以使其在静脉内给药后经肾脏消除。超细纳米颗粒特别适于临床应用，因为这种快速肾脏消除限制了可能存在的毒性，而且还得益于更好的肿瘤穿透性，且在对“纳米级剂量沉积”效应进行放射增敏的情况下，局部增加了递送剂量的有效性。
纳米颗粒表面螯合物的存在对于在成像或治疗中螯合可用的金属离子来说通常为必要的。近距离放射疗法或闪烁扫描中使用的放射性金属离子或MRI中使用的磁离子即为这种情况。目前文献中存在两种主要策略来获得纳米颗粒表面的金属螯合物或游离螯合物。
获得这类纳米颗粒的第一种策略为通过在纳米颗粒形成步骤中直接掺入螯合物来进行合成。例如，即N.G Chabloz等采用的策略(Chem.Eur.J.,2020,26,4552-4566)，以获得由钆络合物和卟啉实现官能化的金纳米颗粒，以用于光动力治疗和MRI。该策略亦可用于聚硅氧烷纳米颗粒一锅法合成，例如2018年V.L.Tran等提出的(Mt.Chem.B,2018,6,4821-4834)。
然后，这些纳米颗粒含有游离螯合物或包含钆的螯合物，这取决于所使用的起始硅烷。然而，这种方法存在几个缺陷，必须非常精确地确定添加比例和时间才能获得可复制的纳米颗粒，这使得临床使用的大规模尝试变得困难。
第二种策略在于获得所需的纳米颗粒，然后通过后官能化步骤加入游离螯合物或已包含金属的螯合物。即P.Bouziotis等采用的策略(Nanomedicine,2017,12,1561-1574)，其基于AGuIX基于聚硅氧烷的纳米颗粒。NODAGA酸酐通过酸酐和表面胺的反应而在纳米颗粒的表面官能化。然后，添加镓68以便能够进行临床前PET成像。M.Pretze等(Journal ofLabelled Compounds and Radiopharmaceuticals,2019,62,471-482)对金纳米颗粒采用了相同类型的策略，这些金纳米颗粒在通过配体交换反应引入马来酰亚胺官能团然后添加NODAGA之前合成。最后步骤中进行了铜64放射性标记。这种策略的主要缺点为其大大改变了纳米颗粒的粒度及其表面电荷，另外还改变了亲水性/亲脂性，这可能使得起始纳米颗粒具有不同的生物分布。
因此，似乎有必要开发用于在纳米颗粒表面产生游离螯合物的方法，该方法尽可能少地改变起始纳米颗粒的特征，特别为对于临床中已有的纳米颗粒，例如AGuIX纳米颗粒，并具有适当的生物分布特征。因此，本发明的另一个目的是提供获得相当于起始纳米颗粒的纳米颗粒的途径，但其中部分原始螯合物已释放出来且可以随后成为游离态或与另一种目的金属螯合。
本公开改善了关于上述这些目标中的一个或多个的状况。
此外，还提出具有适当的生物分布的螯合纳米颗粒在治疗肿瘤，特别是原发性和/或转移性肿瘤中的用途。
发明简述
本发明涉及下述实施方案的其中之一或其组合。
实施方案1：用于制备纳米颗粒的胶体溶液的方法，每个纳米颗粒包含接枝到聚合物基质上的螯合基团，所述螯合基团只有一部分与金属阳离子络合，另一部分未络合，所述方法包括
(1)合成或提供前体纳米颗粒的胶体溶液，所述前体纳米颗粒具有以下化学式[Ch-M1]n-PS，其中：
-PS为有机或无机的聚合物基质，例如聚硅氧烷基质，
-[Ch-M1]为与具有大于40，优选大于50的高原子序数Z的金属阳离子M1络合的螯合基团，
-Ch共价接枝到聚合物基质表面，例如聚硅氧烷基质表面，
-n为5-100，且，
-纳米颗粒的平均流体动力学直径为1-50nm，优选2-20nm，更优选2-8nm，
(2)在酸性介质中处理胶体溶液的步骤，例如通过添加盐酸溶液，从而获得低于2.0、优选低于1.0的pH值，持续时间足以获得金属阳离子M1的部分释放，
(3)适当情况下，稀释胶体溶液的步骤，例如用水，
(4)纯化步骤，将步骤(2)中获得的纳米颗粒与释放的金属阳离子M1分离，
(5)适当情况下，浓缩步骤(4)中获得的纳米颗粒溶液的步骤，
(6)适当情况下，重复步骤(3)、(4)和(5)，
(7)适当情况下，冷冻和/或冻干步骤(4)、(5)或(6)之一获得的纳米颗粒溶液。
实施方案2：如实施方案1的方法，其特征在于，M1选自具有大于40，优选大于50的高原子序数Z的金属阳离子，特别地选自放射增敏剂和/或用于核磁共振成像(MRI)的造影剂，例如M1选自钆或铋。
实施方案3：如实施方案1或2所述的方法，其特征在于，螯合基团Ch选自大环试剂，优选选自1,4,7-三氮杂环壬烷三乙酸(NOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-l-戊二酸-4,7-二乙酸(NODAGA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷,1-(戊二酸)-4,7,10-三乙酸(DOTAGA)、2,2’,2”,2”’-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四基)四乙酰胺(DOTAM)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷(Cyclam)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷(Cyclen)和去铁胺(DFO)。
实施方案4：如实施方案1-3中任一项所述的方法，其特征在于，螯合基团Ch为以下化学式(I)的DOTAGA[化学式1]：
实施方案5：如实施方案1-4中一项所述的方法，其特征在于，PS为聚硅氧烷基质。
实施方案6：如实施方案5所述的方法，其特征在于，前体纳米颗粒具有以下特征：
-硅与纳米颗粒总重量的重量比为5％-25％，
-接枝到聚合物上的螯合基团的总数n为每个纳米颗粒5-50个，优选10-30个，以及
-纳米颗粒的平均直径为2-8nm。
实施方案7：如实施方案1-6中任一项所述的方法，其特征在于，前体纳米颗粒具有以下特征：
(i)PS为聚硅氧烷基质，
(ii)Ch为以下化学式(I)的DOTAGA螯合基团[化学式1]
且由Si-C键接枝到聚硅氧烷基质上，
(iii)M1为钆阳离子Gd3+，
(iv)n为5-50，优选10-30，以及
(v)平均流体动力学直径为2-8nm。
实施方案8：用于制备纳米颗粒的胶体溶液的方法，每个纳米颗粒包含接枝到聚合物基质上的螯合基团，螯合基团的第一部分f1与金属阳离子M1络合，第二部分f2与阳离子M2络合，第三部分f3未络合，所述方法包括：
(1)合成或提供前体纳米颗粒的胶体溶液，所述前体纳米颗粒具有以下化学式[Ch-M1]n-PS，其中：
-PS为有机或无机的聚合物基质，
-Ch为与具有大于40，优选大于50的高原子序数Z的金属阳离子M1络合的螯合基团，
-Ch接枝到聚合物基质上，
-n为5-100，且
-纳米颗粒的平均流体动力学直径为1-50nm，优选2-20nm，更优选2-8nm，
(2)在酸性介质中处理胶体溶液的步骤，例如通过添加盐酸溶液，从而获得低于2.0、优选低于1.0的pH值，持续时间足以获得金属阳离子M1的部分释放，
(3)适当情况下，稀释溶液的步骤，例如用水，
(4)纯化步骤，将步骤(2)中获得的纳米颗粒与游离金属阳离子M1分离，
(5)适当情况下，浓缩步骤(4)中获得的纳米颗粒溶液的步骤，
(6)适当情况下，重复步骤(3)、(4)和(5)，
(7)任选地，用确定量的金属阳离子M1，部分再络合步骤(2)、(3)、(4)、(5)或(6)获得的纳米颗粒的步骤，从而获得确定量的与金属阳离子M1络合的螯合基团Ch，
(8)使步骤(4)、(5)、(6)或(7)获得的纳米颗粒溶液与足量阳离子M2接触，例如与不同于金属阳离子M1的金属阳离子或放射性同位素接触，以络合至少一部分在步骤(2)中游离的螯合基团Ch1，以及
(9)适当情况下，冷冻和/或冻干步骤(8)获得的纳米颗粒溶液。
实施方案9：如实施方案8的方法，其特征在于，M1和/M2选自具有大于40，优选大于50的高原子序数Z的金属阳离子，特别地选自放射增敏剂和/或用于核磁共振成像(MRI)的造影剂，例如钆或铋。
实施方案10：如实施方案8或9所述的方法，其特征在于，螯合基团Ch选自大环试剂，优选选自1,4,7-三氮杂环壬烷三乙酸(NOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-l-戊二酸-4,7-二乙酸(NODAGA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷,1-(戊二酸)-4,7,10-三乙酸(DOTAGA)、2,2’,2”,2”’-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四基)四乙酰胺(DOTAM)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷(Cyclam)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷(Cyclen)和去铁胺(DFO)。
实施方案11：如实施方案8-10中的一项所述的方法，其特征在于，螯合基团Ch为以下化学式(I)的DOTAGA[化学式1]：
实施方案12：如实施方案8-11中的一项所述的方法，其特征在于，PS为聚硅氧烷基质。
实施方案13：如实施方案12所述的方法，其特征在于，前体纳米颗粒具有以下特征：
-硅与纳米颗粒总重量的重量比为5％-25％，
-接枝到聚合物上的螯合基团的总数n为每个纳米颗粒5-50个，优选10-30个，以及
-平均直径为2-8nm。
实施方案14：如实施方案8-13中任一项所述的方法，其特征在于，前体纳米颗粒具有以下特征：
(i)PS为聚硅氧烷基质，
(ii)Ch为以下化学式(I)的DOTAGA螯合基团[化学式1]
且由Si-C键接枝到聚硅氧烷基质上，
(iii)M1为钆阳离子Gd3+，
(iv)n为5-50，优选10-30，以及
(v)平均流体动力学直径为2-8nm。
实施方案15：如实施方案8-14中任一项所述的方法，其特征在于，阳离子M2选自用于闪烁扫描的成像剂，例如44Sc、64Cu、68Ga、89Zr、111In、99mTc。
实施方案16：如实施方案8-15中任一项所述的方法，其特征在于，阳离子M2选自用于放射疗法的治疗剂，例如90Y、166Ho、177Lu、212Bi、213Bi、211At。
实施方案17：如实施方案8-16中任一项所述的方法，其特征在于，f1为0.1-0.9，f2为0.1-0.9，f3为0-0.5，典型地，f1为0.25-0.35，f2为0.65-0.75，f3基本上为0。
实施方案18：如实施方案8-17中任一项所述的方法，其特征在于，每个纳米颗粒还由靶向剂官能化，所述靶向剂特别地为肽、免疫球蛋白、纳米抗体、抗体、适体或靶向蛋白。
实施方案19：纳米颗粒溶液或纳米颗粒冻干物，由如实施方案1-18中任一项所述方法获得。
实施方案20：纳米颗粒，具有以下化学式(II)[化学式2]：
其中：
-PS为有机或无机的聚合物基质，例如聚硅氧烷基质，
-[Ch-M1]为与金属阳离子M1络合(例如与钆阳离子络合)的螯合基团Ch，所述M1具有大于40，优选大于50的高原子序数Z，
-[Ch-M2]为与不同于金属阳离子M1的阳离子M2络合的螯合基团Ch，所述M2例如选自具有大于40，优选大于50的高原子序数Z的金属阳离子，或者选自放射性同位素，优选地M2为铋离子，
-[Ch]为未络合的螯合基团Ch，
其特征在于，
(i)螯合剂Ch共价接枝到聚合物基质表面上，
(ii)摩尔比n/(n+m+p)为10％-90％，优选25％-35％，摩尔比m/(n+m+p)为10％-90％，优选65％-75％，摩尔比p/(n+m+p)基本上为0，且
(iii)纳米颗粒的平均流体动力学直径为1-50nm，优选2-20nm，更优选2-8nm。
实施方案21：如实施方案20的纳米颗粒，其特征在于，金属阳离子M1以及适当情况下的M2，选自放射增敏剂和/或用于核磁共振成像的造影剂，特别为钆或铋。
实施方案22：如实施方案20或21中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，螯合基团Ch选自大环试剂，优选选自1,4,7-三氮杂环壬烷三乙酸(NOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-l-戊二酸-4,7-二乙酸(NODAGA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷,1-(戊二酸)-4,7,10-三乙酸(DOTAGA)、2,2’,2”,2”’-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四基)四乙酰胺(DOTAM)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷(Cyclam)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷(Cyclen)和去铁胺(DFO)。
实施方案23：如实施方案20-22中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述螯合基团Ch为以下化学式(I)的DOTAGA[化学式1]
实施方案24：如实施方案20-23中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，PS为聚硅氧烷基质。
实施方案25：如实施方案24所述的纳米颗粒，其特征在于，
-硅与纳米颗粒总重量的重量比为5％-25％，
-接枝到聚合物上的螯合基团的总数n+m+p为每个纳米颗粒5-50个，优选10-30个，以及
-平均直径为2-8nm。
实施方案26：如实施方案20-25中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，金属阳离子M2选自用于闪烁扫描的成像剂，例如44Sc、64Cu、68Ga、89Zr、111In、99mTc。
实施方案27：如实施方案20-25中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，金属阳离子M2选自用于放射疗法的治疗剂，例如90Y、166Ho、177Lu、212Bi、213Bi、211At。
实施方案28：如实施方案20-27中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，
(i)PS为聚硅氧烷基质，
(ii)Ch为以下化学式(I)的DOTAGA螯合基团[化学式1]
且由Si-C键接枝到聚硅氧烷基质上，
(iii)M1为钆阳离子Gd3+，
(iv)p为0，m+n为5-50，优选10-30，
(v)n/n+p为0.1-0.9，例如0.25-0.35或0.65-0.75，或0.45-0.55，且
(vi)平均流体动力学直径为2-8nm。
实施方案29：如实施方案20-28中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，
(i)PS为聚硅氧烷基质，
(ii)Ch1为以下化学式(I)的DOTAGA螯合基团[化学式1]
且由Si-C键接枝到聚硅氧烷基质上，
(iii)M1为钆阳离子Gd3+，M2为铋阳离子Bi3+，
(iv)n+m+p为5-50，优选10-30，
(v)n/(n+m+p)为10％-90％，优选45％-55％，
(vi)m/(n+m+p)为10％-90％，优选45％-55％，
(vii)p基本上为0，且
(viii)平均流体动力学直径为2-8nm。
实施方案30：如实施方案20-29中任一项所述的纳米颗粒的胶体溶液。
实施方案31：药物组合物，包含如实施方案20-29中任一项所述的纳米颗粒的胶体溶液，以及一种或多种药学可接受的赋形剂。
实施方案32：如实施方案31所述的药物组合物，其用于检测或治疗受试者的癌症，其特征在于，所述组合物包含有效量的金属阳离子M1，适当情况下还包含阳离子M2作为放射增敏剂，优选地M1为钆，
且在施用所述组合物后，对受试者进行放射疗法治疗。
附图说明
下面由详细说明，并结合以下附图分析来阐述其他特征、细节及优点，其中：
图1
[图1]图1示出了整个Gd/Bi纳米颗粒形成过程中游离DOTA的中间滴定结果：100/0(A.)70/30(B.)、50/50(C.)、30/70(D.)。
发明详述
超细纳米颗粒和AGuIX纳米颗粒
在一个更特别优选的实施方案中，本公开的方法中可用的前体纳米颗粒，特别地由于其非常小的粒度、其稳定性及其生物分布，为包括聚硅氧烷基质PS且不包括基于金属氧化物的内核的纳米颗粒，这不同于包括基于金属氧化物的内核和聚硅氧烷外层的内核-外壳型纳米颗粒(特别地如WO2005/088314和WO2009/053644所述)。
因此，在一个具体实施方案中，根据本公开方法的可用前体纳米颗粒为具有化学式[Ch-M1]n-PS的基于聚硅氧烷的钆螯合的纳米颗粒，其中
(i)PS为聚硅氧烷基质，
(ii)Ch为具有以下化学式(I)的DOTAGA螯合基团[化学式1]
且由共价键接枝到聚硅氧烷基质上，
(iii)M1为钆阳离子Gd3+，
(iv)n为5-50，优选10-30，以及
(v)平均流体动力学直径为2-8nm。
更具体地，这些基于聚硅氧烷的钆螯合的纳米颗粒为由AGuIX纳米颗粒作为起始材料获得的超细纳米颗粒。
这种超细AGuIX纳米颗粒可以由自上而下的合成方法获得，特别地如Mignot等在Chem Eur J 2013中的“A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctionalGd-based silica nanoparticles for theranostic applications”,DOI:10.1002/chem.201203003中所述。
WO2011/135101、WO2018/224684和WO2019/008040中也描述了其他的超细纳米颗粒合成方法。
可用作根据本公开方法中的起始材料的AGuIX纳米颗粒特别地具有以下化学式(III)[化学式3]
其中PS为聚硅氧烷基质，n平均为约10±2，且纳米颗粒的平均流体动力学直径为4±2nm，质量约为10kDa。
AGuIX纳米颗粒也可以由下式(IV)来表征[化学式4]
(GdSi4-7C24-30N5-8O15-25H40-60,5-10H2O)x
(IV)。
在一个优选实施方案中，前体纳米颗粒为如前部分中定义的超细纳米颗粒或AGuIX纳米颗粒，并与钆阳离子络合。
根据上述方法获得的纳米颗粒随后可以有利地用不同于Ch和/或靶向剂或亲水分子的其他螯合基团进行官能化。因此，本发明方法的其中一个方面为提供用于获得具有有利优点的纳米颗粒的方法，特别地用作如上所述的药物或诊断剂或诊断治疗剂。
用于生产包含与螯合基团Ch络合的金属阳离子M1和M2的纳米颗粒的方法的变体
在一个实施方案中，使根据上述方法获得的纳米颗粒与不同于金属阳离子M1的阳离子M2接触，例如目的金属阳离子或放射性同位素，以获得至少一部分在处理步骤(2)后游离的螯合基团Ch的络合。
因此，本公开涉及用于制备纳米颗粒的胶体溶液的方法，每个纳米颗粒包含接枝到聚合物基质上的螯合基团，螯合基团的第一部分f1与金属阳离子M1络合，第二部分f2与阳离子M2络合，第三部分f3未络合，所述方法包括：
(1)合成或提供前体纳米颗粒的胶体溶液，所述前体纳米颗粒具有以下化学式[Ch-M1]n-PS，其中：
-PS为有机或无机的聚合物基质，
-Ch为与具有大于40，优选大于50的高原子序数Z的金属阳离子M1络合的螯合基团，
-Ch接枝到聚合物基质上，
-n为5-100，且
-前体纳米颗粒的平均流体动力学直径为1-50nm，优选2-20nm，更优选2-8nm
(2)在酸性介质中处理胶体溶液的步骤，例如通过添加盐酸溶液，从而获得优选低于2.0的pH值，持续时间足以获得金属阳离子M1的部分释放，
(3)适当情况下，稀释溶液的步骤，例如用水，
(4)纯化步骤，将步骤(2)中获得的纳米颗粒与游离金属阳离子M1分离，
(5)适当情况下，浓缩步骤(4)中获得的纳米颗粒溶液的步骤，
(6)适当情况下，重复步骤(3)、(4)和(5)，
(7)任选地，用确定量的金属阳离子M1，部分再络合步骤(2)、(3)、(4)、(5)或(6)获得的纳米颗粒的步骤，从而获得确定量的由金属阳离子M1络合的螯合基团Ch，
(8)使步骤(2)、(3)、(4)、(5)或(6)获得的纳米颗粒溶液与足量阳离子M2接触，例如与不同于金属阳离子M1的金属阳离子或目标放射性同位素接触，以络合至少一部分在步骤(2)中游离的螯合基团Ch1，从而获得纳米颗粒的胶体溶液，每个纳米颗粒包含接枝到聚合物基质上的螯合基团，螯合基团的第一部分f1与金属阳离子M1络合，第二部分f2与阳离子M2络合，第三部分f3未络合，且
(9)适当情况下，冷冻和/或冻干步骤(8)获得的纳米颗粒溶液。
根据本公开的方法的具体实施方案在实施例中给出。典型地，在该方法的两种实施方案中，无论在步骤(2)中与金属M2再络合(实施方案8)还是未再络合(实施方案1)，本领域技术人员将能够根据金属阳离子M1的预期释放量来调整pH值和/或处理时间。也可在步骤(2)-(6)中释放更多量的金属阳离子M1，并由与金属阳离子M1部分再络合的步骤(7)调节所需的f1部分。实际上，特别地根据待解络合的所需Ch基团的比例，步骤(2)的酸处理持续时间将由本领域技术人员进行调整。典型地，本领域技术人员将能够由其选定的分析方法，例如通过HPLC-ICP/MS法来监控解络合。换言之，在步骤(2)期间，可以通过分析技术(诸如HPLC-ICP/MS)来监控所述释放，从而确定足够的持续时间。
在一个具体实施方案中，特别地使用AGuIX纳米颗粒作为前体纳米颗粒，步骤(2)的处理时间可以为0.5-90小时，例如为1-72小时，特别地为至少4、5、24或72小时，pH值低于2.0，优选低于1.0。
步骤(7)和(8)可能需要将pH值恢复到6.0-8.0，优选中性pH值，和/或将纳米颗粒溶液加热到足以实现络合的温度和时间。例如，步骤(7)或(8)可以在60-95℃，典型地在80℃的温度下持续24-72小时，例如48小时。
本领域技术人员也可根据游离螯合基团的量，以及所需的f2和f3部分来调整步骤(8)中阳离子M2的量，所述f2和f3部分分别代表与金属阳离子M2或放射性同位素络合的螯合剂部分和剩余未络合的螯合剂部分的量。
在一个实施方案中，本领域技术人员将使用过量的阳离子M2来基本络合所有的游离螯合剂。因此，f3部分基本上为0。
在另一个实施方案中，如果与阳离子M2络合的步骤(8)之后仍有游离螯合基团，则也可进行另一步骤，以与金属阳离子M1络合，从而调整预期的f2和f3部分。
用于利用靶向分子对纳米颗粒官能化的方法的变体
除了螯合官能化之外，根据本公开的方法获得的纳米颗粒可以任选地在表面经亲水化合物(PEG)修饰(官能化)和/或载有不同负荷以适应它们在机体和/或靶向分子内的生物分布，从而可以进行特异性细胞靶向，特别地为特异性肿瘤组织或细胞靶向。靶向剂接枝到聚合物基质上且优选地每个纳米颗粒的靶向剂比例为1-20个，优选1-5个靶向剂。
对于靶向分子的表面接枝，可以采用常规偶联，其利用了已有反应基团，任选地在活化步骤之前进行。偶联反应为本领域技术人员已知的且应根据纳米颗粒表面层的结构和靶向分子的官能团来选择。例如参见“Bioconjugate Techniques”,G.T Hermanson,Academic Press,1996,in“Fluorescent and Luminescent Probes for BiologicalActivity”,Second Edition,W.T.Mason,ed.Academic Press,1999。优选的偶联方法将在下文进行描述。优选地，如上文段落中描述的，这些靶向分子根据超细纳米颗粒或AGuIX纳米颗粒的变体被接枝到纳米颗粒的胺键上。将根据所需应用来选择靶向分子。
在一个具体实施方案中，前体纳米颗粒由靶向剂官能化，所述靶向剂例如为肽、免疫球蛋白、纳米抗体、抗体、适体或任何其他靶向(例如肿瘤区域的)蛋白，典型地为靶向肿瘤相关抗原的抗体、免疫球蛋白或纳米抗体、VHH片段或“单域”，或本领域技术人员已知的某些癌症标志物。
包含与螯合基团Ch络合的阳离子M1和M2的纳米颗粒
本公开还涉及由如前部分所述的方法获得的，或能够由如前面部分所述的方法获得的纳米颗粒和纳米颗粒溶液。
因此，本发明涉及以下化学式(II)的纳米颗粒[化学式2]：
其中：
-PS为有机或无机的聚合物基质，例如聚硅氧烷基质，
-[Ch-M1]为与金属阳离子M1络合(例如与钆阳离子络合)的螯合基团Ch，所述M1具有大于40，优选大于50的高原子序数Z，
-[Ch-M2]为与阳离子M2络合的螯合基团Ch，所述阳离子M2与金属阳离子M1相同或不同，例如为具有大于40，优选大于50的高原子序数Z的金属阳离子，或者为放射性同位素，例如M2为铋离子，
-[Ch]为未络合的Ch螯合基团
其特征在于，
(i)螯合剂Ch共价接枝到聚合物基质表面上，
(ii)摩尔比n/(n+m+p)为10％-90％，优选25％-35％，典型地为30％，摩尔比m/(n+m+p)为10％-90％，优选65％-75％，且
(iii)所述纳米颗粒的平均流体动力学直径为1-50nm，优选2-20nm，更优选2-8nm。
在一个可优选地与前述实施方案结合的实施方案中，摩尔比p/(n+m+p)基本上为0。
在另一个可以与前述2种实施方案结合的优选实施方案中，摩尔比m/(n+m+p)为45％-55％，典型地为50％，摩尔比n/(n+m+p)为45％-55％，典型地为50％，摩尔比p/(n+m+p)基本上为0。
特别地，涉及聚硅氧烷基质PS化学性质的特征、平均流体动力学直径、螯合基团Ch以及每个纳米颗粒的螯合基团的数量，即n+m+p，内在地关联前部分所述方法中前体纳米颗粒的选择。因此，它们也适用于由该方法获得的，或者能够由该方法获得的纳米颗粒。
所述纳米颗粒优选地具有非常小的直径，例如1-10nm，优选2-8nm。
所述纳米颗粒也可以优选地为包含聚硅氧烷基质的纳米颗粒。
在一个优选实施方案中，所述螯合基团Ch为以下化学式(I)的DOTAGA[化学式1]
更特别地，金属阳离子M1和M2独立地选自重金属，优选选自下组：Pt、Pd、Sn、Ta、Zr、Tb、Tm、Ce、Dy、Er、Eu、La、Nd、Pr、Lu、Yb、Bi、Hf、Ho、Sm、In、Gd。优选地，金属阳离子M1和M2(或M2和M1)分别为Gd和Bi。
在一个具体实施方案中，纳米颗粒包含3-100个，优选5-50个金属阳离子M1和M2，例如10-30个，特别是Gd和Bi。
在另一个实施方案中，M1选自如上所述的重金属，M2选自放射性同位素，特别地用于闪烁扫描成像或放射治疗。
本领域技术人员将根据所需效果，特别地根据所需治疗、患者类型、所用剂量和/或待治疗患者来选择摩尔比n/(n+m+p)和m/(n+m+p)。例如，在一个具体实施方案中，(n+m)/(n+m+p)的比值大于或等于80％；尤其为90-100。
在一个优选实施方案中，具有以下化学式(2)的纳米颗粒的特征在于，
(i)PS为聚硅氧烷基质，
(ii)Ch1为以下化学式(I)的DOTAGA螯合基团[化学式1]
且由Si-C键接枝到聚硅氧烷基质上，
(iii)M1为钆阳离子Gd3+，M2为铋阳离子Bi3+，
(iv)n+m+p为5-50，优选10-30，
(v)n/(n+m+p)为10％-90％，优选45％-55％，
(vi)m/(n+m+p)为10％-90％，优选45％-55％，
(vii)p基本上为0，且(viii)平均流体动力学直径为2-8nm。
在一个优选实施方案中，具有以下化学式(2)的纳米颗粒的特征在于，(i)PS为聚硅氧烷基质，
(ii)Ch1为以下化学式(I)的DOTAGA螯合基团[化学式1]
且由Si-C键接枝到聚硅氧烷基质上，
(iii)M1为钆阳离子Gd3+，M2为铋阳离子Bi3+，
(iv)n+m+p为5-50，优选10-30，
(v)n/(n+m+p)为25％-35％，
(vi)m/(n+m+p)为65％-75％，
(vii)p基本上为0，且(viii)平均流体动力学直径为2-8nm。
在一个优选实施方案中，具有上述化学式(2)的纳米颗粒的特征在于，(i)PS为聚硅氧烷基质，
(ii)Ch1为以下化学式(I)的DOTAGA螯合基团[化学式1]
且由Si-C键接枝到聚硅氧烷基质上，
(iii)M1为钆阳离子Gd3+，M2为铋阳离子Bi3+，
(iv)n+m+p为5-50，优选10-30，
(v)n/(n+m+p)为65％-75％，
(vi)m/(n+m+p)为25％-35％，
(vii)p基本上为0，且
(viii)平均流体动力学直径为2-8nm。
根据本公开的纳米颗粒的药物制剂
包含根据本公开的纳米颗粒的组合物以纳米颗粒的胶体悬液的形式施用。它们可以如本文所述或根据本领域技术人员已知的其他方法来制备，并根据治疗方法和待治疗区域由不同的途径(局部或全身)施用。
而且，本公开涉及如前部分所述的化学式(2)的纳米颗粒的胶体悬液和包含这些胶体悬液的药物组合物，适当情况下还组合一种或多种药学可接受的赋形剂。
特别地，该药物组合物可配制成冻干粉剂或用于静脉注射的水溶液剂的形式。在一个优选实施方案中，该药物组合物包含胶体溶液，其中包含有效治疗量的如前部分所述的化学式(2)的纳米颗粒，特别地为与钆以及至少一种其他金属阳离子(例如铋)螯合的基于聚硅氧烷的纳米颗粒，且更具体地，如从如上所述的AGuIX纳米颗粒获得的纳米颗粒。
在一些实施方案中，其为冻干粉剂，每瓶包含200mg-15g、优选250-1250mg的纳米颗粒。该粉剂也可包含其他赋形剂，特别地CaCl2。
该冻干粉剂可以在水溶液中，典型地在用于注射的无菌水中重构。因此，本公开涉及作为注射液使用的药物组合物，其包括例如前部分所述的化学式(2)的纳米颗粒作为活性成分，特别地为基于聚硅氧烷的钆螯合的纳米颗粒，更特别地，为由如前所述的AGuIX纳米颗粒获得的纳米颗粒。
纳米颗粒的用途
由于存在游离或与金属阳离子M1和(适当情况下)阳离子M2络合的螯合基团Ch1，当M1和/或M2合理选作放射增敏剂时，根据本公开的纳米颗粒可用作放射增敏剂，且该方法包括在施用该组合物后，对受试者进行有效剂量照射的步骤，用于放射疗法治疗肿瘤。
在一些实施方案中，当M1和/或M2被合理选作成像剂时，例如MRI造影剂，根据本公开的纳米颗粒可以用作成像剂，用于医学成像，例如用于核磁共振成像(MRI)，特别地用于检测受试者体内的肿瘤，且该方法包括在施用该组合物后，用有效剂量对受试者成像的步骤，用于对目的区域成像，特别地对受试者进行MRI成像，用于检测肿瘤。
“患者”或“受试者”优选地指哺乳动物或人，包括例如患有肿瘤的受试者。
术语“治疗”、“疗法”是指任何旨在改善患者健康状况的行为，例如治疗、防止、预防和减缓疾病。在某些情况下，这些术语是指疾病或疾病相关症状的改善或根除。在其他实施方案中，这些术语是指向患有此类疾病的受试者施用一种或多种治疗剂而使疾病的发展或恶化得到缓解。在肿瘤治疗中，术语“治疗”典型地可包括用于使肿瘤停止生长、减小肿瘤大小和/或消除肿瘤的治疗。
特别地，纳米颗粒用于检测和/或治疗实体瘤，例如脑癌(原发性和继发性、胶质母细胞瘤等)、肝癌(原发性和继发性)、盆腔肿瘤(宫颈癌、前列腺癌、肛门直肠癌、结直肠癌)、上呼吸消化道癌、肺癌、食道癌、乳腺癌、胰腺癌。
纳米颗粒的“有效量”是指施用于患者的如上所述的纳米颗粒的量，该量足以在肿瘤中定位且可通过放射增敏作用并结合放射疗法治疗来检测和/或治疗肿瘤。
该数量根据诸如受试者的年龄、性别和体重等因素确定和调整。
如前所述的纳米颗粒施用可以通过肿瘤内、皮下、肌肉内、静脉内、皮内、腹膜内、口服、舌下、直肠、阴道、鼻内途径、由吸入或由经皮施用来进行。优选地，肿瘤内和/或静脉内施用。
施用纳米颗粒作为放射增敏剂后，用于治疗肿瘤的照射方法为本领域技术人员所熟知的，且在以下公开中进行了具体描述。WO2018/224684,WO2019/008040和C.Verry,etal.,Science Advances,2020,6,eaay5279；以及C.Verry,et al,NANO-RAD,a phase Istudy protocol,BMJ Open,2019,9,e023591。
放射治疗时的总照射剂量将根据癌症类型、阶段和待治疗受试者进行调整。对于治愈剂量，针对实体瘤的典型的总剂量在20-120Gy的数量级。也可考虑其他因素，例如化学疗法治疗、合并发病率和/或放疗是在手术之前还是之后进行。总剂量通常为分次的。根据本公开的方法中的放射疗法步骤可包括例如每天2-6Gy的分次治疗，例如每周5天，特别地为连续2-8周，总剂量可以为20-40Gy，例如30Gy。
而且，本公开还涉及用于在有需要的受试者中治疗肿瘤，特别是实体瘤的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如上所述的化学式(2)的纳米颗粒，且其中M1和M2选自核磁共振成像剂和放射增敏剂，特别地为钆或铋。
根据本公开的纳米颗粒可以单独施用，或与一种或多种其他活性成分组合施用，特别地与其他药物组合施用，例如细胞毒性剂或抗增殖剂或其他抗癌剂，特别是免疫检查点抑制剂。组合施用是指同时或顺序施用(在不同时间)。
具体实施方式
材料和方法
Acidix产品为通过将Nh TherAguix(France)提供的起始物加入到强酸介质中获得，所述强酸介质获自来自CarlRoth的37％超纯盐酸。
过滤步骤使用蠕动泵和来自Sartorius Stedim Biotech(France)的Vivaflow–5kDa盒进行，按照Vivaflow/>产品附带的说明中描述的条件使用。
流体动力学直径测量以及等电点滴定用Malvern Instruments(USA)的ZetasizerNano-S(633nmHe-Ne激光器)进行。测量等电点时，该仪器与来自Malvern Instruments(USA)的MPT-2自动滴定仪相连。
HPLC-UV用带有DAD检测器的Agilent 1200进行。所用的反相层析柱为来自Jupiter的C4，5μm、150x 4.6mm。通过波长为295nm的UV检测器进行检测。A相(H2O/ACN/TFA：98.9/1/0.1)和B相(H2O/ACN/TFA：10/89.9/0.1)的梯度如下：95/5下持续5分钟，接着在线性梯度下持续10分钟，从而可达到10/90的比例，并维持15分钟。15分钟结束时，A相的比例在1分钟内恢复到95％，然后为7分钟的95/5平台期。洗脱相的组合物中使用的产品均经过HPLC级认证。
在分析科学研究所[Institute of Analytical Sciences],UMR 5280,PoleIsotopes&Organique,5rue de la Doua 69100Villeurbanne进行了元素分析。
HPLC-ICP/MS使用Perkin-Elmer(USA)的Nexion 2000完成。介质中游离元素的测量为在等度模式下进行的，其中洗脱相的组成如下：95％的A相和5％的B相。HPL-UV法中A相和B相的组成相同。所用的反相层析柱为来自Jupiter的C4，5μm、150x 4.6mm。洗脱相的组合物中使用的产品均经过HPLC级认证。
颗粒冻干使用来自Christ(Germany)的Alpha 2-4LSC冻干机，按照“初级干燥”程序完成。
游离DOTA的测量通过向确定量产品中添加增量的Cu2+来进行。铜来自15mM的Cu2+溶液，该溶液通过利用溶于超纯水的CuCl2(Sigma Aldrich，99％，粉末，25g)事先制备。然后，利用pH＝5的乙酸盐缓冲液调节样品体积，以确保全部络合。样品制备完成后，按前所述在295nm处进行HPLC-UV测量。通过对得到的层析图在0-15min段内进行积分，测量总吸光度。由于吸光信号的增强基于DOTA(Cu)络合物的形成，当达到游离DOTA和所添加的Cu2+的化学计量点时，可得到介质中游离DOTA的量。该点使得所得图上斜率突然改变。
实施例1：介质的酸化和Gd3+离子的释放
为获得根据该方法的纳米颗粒，将产品置于酸性介质中以使DOTA基团质子化，并因此释放一部分最初络合的Gd3+离子。
首先，通过将10g产品溶于50ml超纯水中，制备200g/L的溶液。将溶液在室温搅拌1小时。同时，通过将10ml的37％盐酸(37％超纯盐酸，2.5L，塑料包装，CarlRoth)加入到50ml超纯水中，制备2M盐酸溶液。
搅拌1小时后，将50ml的2M盐酸溶液加入到50ml中。然后，测量pH值并小于0.5。所得溶液呈棕橙色。将合并的混合物在预先加热至50℃的恒温箱中放置4小时。每小时取样一次，从而通过HPLC-ICP/MS观察钆离子的释放。观察到保留时间Tr＝2.3min时，介质中游离Gd3+的峰值随着反应时间而升高。
实施例2：获得无钆纳米颗粒
通过将5g产品溶于50ml超纯水中，制备100g/L的溶液。将溶液在室温搅拌1小时。同时，通过将10ml的37％盐酸(37％超纯盐酸，2.5L，塑料包装，CarlRoth)加入到50ml超纯水中，制备2M盐酸溶液。
搅拌1小时后，将50ml的2M盐酸溶液加入到50ml含的溶液中。将合并的混合物在50℃下加热1小时。使用蠕动泵和Sartorius Vivaflow 50R-5kDa盒纯化由此获得的100ml溶液，从而将颗粒与释放的Gd3+离子分离，并从而将平衡推向仍然络合的Gd3+的释放。因此，将初始溶液浓缩至50ml。通过ICP-MS直接分析滤液，以估计介质中仍然存在的Gd3+量。AGuIX溶液用50ml的1M盐酸溶液再稀释。同样地，将溶液在50℃下放置1小时，然后再浓缩至50mL。重复该方法直到测得的Gd3+量为0。达到该水平后，使用超纯水对溶液进行10000倍净化，以除去由于使用浓盐酸而产生的过量盐。该过程结束时，对终产物进行ICP-MS测量可以确认其不含任何Gd3+。
终产物回收后，将其装瓶，在-80℃下冷冻，然后冻干。然后，将获得的粉末再分散到超纯水中，以获得100g/L的溶液。游离DOTA的测量为通过铜络合和295nm处的吸光度测量来完成的。该测量表明新产物的游离DOTA含量为71μmol/mg产物。作为对照，用于本实验的批次含有12.7％(wt％)Gd3+，即DOTA(Gd)的含量为81μmol/mg AGuIX。
另外，将终产物的样品送至专业实验室以确认样品中仍然存在的Gd含量，结果表明Gd的质量含量为0.19％(wt％)(表1)，而上述初始批次为12.7％(wt％)。所得纳米颗粒的粒度通过DLS测量，且平均流体动力学直径为5.2nm±2.6nm，与原始产品数量级相同。此外，测量了终产物的等电点，因此终产物在pH值为5.2时的带电性为中性。该pH值低于/>的等电点，该等电点在7左右。这种减少与表面上的游离DOTA的产生一致。
表1和终产物中的Gd元素分析
实施例3：80％的络合Gd的释放：72小时
上述实施例中提出的方法已被调整为仅部分地且可控地释放钆。首先，通过将10g产品溶于50ml超纯水中，制备200g/L的溶液。将溶液在室温搅拌1小时。同时，通过将10ml的37％盐酸(37％超纯盐酸，2.5L，塑料包装，CarlRoth)加入到50ml超纯水中，制备2M盐酸溶液。
搅拌1小时后，将50ml的2M盐酸溶液加入到50ml溶液中。然后，测量pH值并且pH值小于0.5。将合并的混合物在预先加热至50℃的恒温箱中放置72小时。在反应4小时后以及反应结束时取样，以通过HPLC-ICP/MS观察Gd3+离子的最终释放。保留时间Tr＝2.3min时，介质中游离Gd3+的峰值随着反应时间而升高。72小时的峰值覆盖了12ppm Gd3+参照峰值的77.2％，这对应于我们使用的AGuIX溶液的总Gd浓度。因此，最初存在的DOTAGA(Gd)络合物中有22.7％留在我们的颗粒中。
实施例4：Gd/Bi纳米颗粒的形成和络合监控
为制备具有特定Gd/Bi比的纳米颗粒，测量了游离DOTA的量。因此，颗粒形成的起始物为纳米颗粒，其中80％的DOTA为游离的，且其余20％与Gd3+络合。
为制备以下3批次(30/70、50/50和70/30)的Gd/Bi(nGd/nBi)，首先进行Bi络合。Bi3+的络合为一个漫长的过程。因此，在添加必要量的BiCl3(Sigma-Aldrich，试剂级，＞98％)以达到所需比例后，用1M的NaOH溶液将pH值调节至7，并将混合物在80℃下放置48小时。每次Bi3+络合步骤后，通过铜络合对剩余的游离DOTA的数量进行测量，以确认络合的进度(图1)。剩余的游离DOTA含量符合比例后，则添加必要量的GdCl3.6H2O(Merck，99％)以络合其余的DOTA，从而形成所需颗粒。添加GdCl3后，将pH值再调整为7并在80℃下放置24小时。然后，对颗粒冻干。获得产物后，将每批样品发送给我们的合作伙伴以进行元素分析，从而验证不同批次中每种元素的实际含量(表2)。
表2最终颗粒的元素分析结果
产业应用
特别地，本技术方案可以应用于药物领域，尤其是用于治疗肿瘤。
本公开不限于仅作为示例的上述实施例，而是涵盖本领域技术人员在所主张的保护范围内可以采用的所有变体。

Claims (10)

1.用于制备纳米颗粒的胶体溶液的方法，每个纳米颗粒包含接枝到聚合物基质上的螯合基团，所述螯合基团只有一部分与金属阳离子络合，另一部分未络合，所述方法包括：
(1)合成或提供前体纳米颗粒的胶体溶液，所述前体纳米颗粒具有以下化学式[Ch-M1]n-PS，其中：
-PS为有机或无机的聚合物基质，例如聚硅氧烷基质，
-[Ch-M1]为与金属阳离子M1络合的螯合基团，所述M1具有大于40，优选大于50的高原子序数Z，
-Ch共价接枝到聚合物基质表面，例如聚硅氧烷基质，
-n为5-100，且
-所述纳米颗粒的平均流体动力学直径为1-50nm，优选2-20nm，更优选2-8nm，
(2)在酸性介质中处理所述胶体溶液的步骤，例如通过添加盐酸溶液，从而获得优选低于2.0、优选低于1.0的pH值，持续时间足以获得所述金属阳离子M1的部分释放；
(3)适当情况下，稀释所述胶体溶液的步骤，例如用水；
(4)纯化步骤，将步骤(2)中获得的所述纳米颗粒与释放的所述金属阳离子M1分离；
(5)适当情况下，浓缩步骤(4)中获得的所述纳米颗粒溶液的步骤；
(6)适当情况下，重复步骤(3)、(4)和(5)；及
(7)适当情况下，冷冻和/或冻干步骤(4)、(5)和(6)之一获得的所述纳米颗粒溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，M1选自金属阳离子，所述金属阳离子选自放射增敏剂和/或用于核磁共振成像(MRI)的造影剂，例如M1选自钆或铋。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述螯合基团Ch选自大环试剂，优选选自1,4,7-三氮杂环壬烷三乙酸(NOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-l-戊二酸-4,7-二乙酸(NODAGA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷,1-(戊二酸)-4,7,10-三乙酸(DOTAGA)、2,2’,2”,2”’-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四基)四乙酰胺(DOTAM)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷(Cyclam)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷(Cyclen)和去铁胺(DFO)。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述螯合基团Ch为以下化学式(I)的DOTAGA：
5.如权利要求1-4中一项所述的方法，其特征在于，所述PS为聚硅氧烷基质。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述前体纳米颗粒具有以下特征：
-硅与所述纳米颗粒总重量的重量比为5％-25％，
-接枝到聚合物上的所述螯合基团的总数n为每个纳米颗粒5-50个，优选10-30个，以及
-所述纳米颗粒的平均直径为2-8nm。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述前体纳米颗粒具有以下特征：
(i)PS为聚硅氧烷基质，
(ii)Ch为以下化学式的DOTAGA螯合基团[化学式1]
且由Si-C键接枝到所述聚硅氧烷基质上，
(iii)M1为钆阳离子Gd3+，
(iv)n为5-50，优选10-30，以及
(v)平均流体动力学直径为2-8nm。
8.用于制备纳米颗粒的胶体溶液的方法，每个所述纳米颗粒包含接枝到聚合物基质上的螯合基团，所述螯合基团的第一部分f1与金属阳离子M1络合，第二部分f2与阳离子M2络合，第三部分f3未络合，所述方法包括：
(1)合成或提供前体纳米颗粒的胶体溶液，所述前体纳米颗粒具有以下化学式[Ch-M1]n-PS，其中：
-PS为有机或无机的聚合物基质，
-Ch是与金属阳离子M1络合的螯合基团，所述M1具有大于40，优选大于50的高原子序数Z，
-Ch接枝到所述聚合物基质上，
-n为5-100，且
-所述纳米颗粒的平均流体动力学直径为1-50nm，优选2-20nm，更优选2-8nm，
(2)在酸性介质中处理所述胶体溶液的步骤，例如通过添加盐酸溶液，从而获得低于2.0、优选低于1.0的pH值，持续时间足以获得所述金属阳离子M1的部分释放；
(3)适当情况下，稀释所述溶液的步骤，例如用水；
(4)纯化步骤，将步骤(2)中获得的所述纳米颗粒与游离金属阳离子M1分离；
(5)适当情况下，浓缩步骤(4)中获得的所述纳米颗粒溶液的步骤；
(6)适当情况下，重复步骤(3)、(4)和(5)；
(7)适当情况下，用确定量的所述金属阳离子M1，部分再络合步骤(2)、(3)、(4)、(5)或(6)获得的所述纳米颗粒的步骤，从而获得确定量的与所述金属阳离子M1络合的螯合基团Ch；
(8)使步骤(4)、(5)、(6)或(7)获得的所述纳米颗粒溶液与足量阳离子M2接触，所述阳离子M2优选地具有大于40，优选大于50的高原子序数Z，例如不同于所述金属阳离子M1的金属阳离子或放射性同位素，以络合至少一部分在步骤(2)中游离的螯合基团Ch1；以及
(9)适当情况下，冷冻和/或冻干步骤(8)获得的所述纳米颗粒溶液。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，M1和/或M2选自金属阳离子，所述金属阳离子选自放射增敏剂和/或用于核磁共振成像(MRI)的造影剂，例如钆或铋。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述螯合基团Ch选自大环试剂，优选选自1,4,7-三氮杂环壬烷三乙酸(NOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-l-戊二酸-4,7-二乙酸(NODAGA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷,1-(戊二酸)-4,7,10-三乙酸(DOTAGA)、2,2’,2”,2”’-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四基)四乙酰胺(DOTAM)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷(Cyclam)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷(Cyclen)和去铁胺(DFO)。
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