FR2934955A1 - Encapsulation d'agents therapeutiques lipophiles ou amphiphiles dans des nanoemulsions - Google Patents

Abstract

La présente invention vise une formulation d'agent thérapeutique sous forme de nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase huileuse dispersée, dans laquelle la phase huileuse comprend outre l'agent thérapeutique au moins un lipide amphiphile et au moins un lipide solubilisant et dans laquelle la phase aqueuse comprend au moins un co-tensioactif polyalkoxylé. Elle vise également un procédé de préparation et l'utilisation de cette formulation.

Description

ENCAPSULATION D'AGENTS THERAPEUTIQUES LIPOPHILES OU AMPHIPHILES DANS DES NANOEMULSIONS

La présente invention concerne une composition de type nanoémulsion utile notamment pour la délivrance d'agents thérapeutiques lipophiles ou amphiphiles, un procédé pour sa préparation ainsi que son utilisation pour le traitement et le diagnostic de pathologies, notamment du cancer.

[Etat de la technique] 1 o La nanomédecine constitue un champ nouveau créé par la fusion de la nanotechnologie et de la médecine, et est aujourd'hui l'une des voies les plus prometteuses pour le développement de thérapies ciblées efficaces, notamment pour l'oncologie. En effet, des nano-particules chargées d'agents thérapeutiques constituent 15 une solution idéale pour surmonter la faible sélectivité des médicaments, notamment des médicaments anticancéreux, en permettant grâce à un ciblage passif et/ou actif le ciblage des tissus cancéreux, et ainsi de réduire les effets secondaires sévères. Une grande variété de nanoparticules a été testée pour des applications 20 thérapeutiques et d'imagerie, aussi bien inorganiques (par exemple semi-conducteurs, silice ou oxydes), qu'organiques (polymères naturels ou synthétiques, liposomes, nanosphères, nanocapsules, microsphères). On a constaté que les nanoparticules polymériques présentent une cytotoxicité potentielle, liée notamment aux résidus de solvants organiques, ainsi 25 que des difficultés de production reproductible à grande échelle et des problèmes de durée de vie au stockage. Les liposomes sont limités en termes de stabilité et de taux d'encapsulation de composés lipophiles et leur procédé de fabrication est complexe. A titre d'alternative aux nanoparticules polymériques, l'attention s'est 30 focalisée depuis 1990 sur les nanoparticules lipidiques comprenant un coeur lipidique, le plus souvent à base de triglycérides biodégradables, entouré d'une coque de polymère. Le choix de lipides biocompatibles ainsi que la possibilité de leur fabrication sans solvants permet de réduire notablement leur toxicité (Muller, R. H., Eur J Pharm Biopharm 2000, 50, 161-177; Mehnert, W., et al., Advanced Drug Delivery Reviews 2001, 47, 165ù196). Le plus souvent, il s'agit de particules lipidiques solides (SLN, acronyme anglais pour Solid Lipid Nanoparticle ) dans lesquels le coeur lipidique est solide à température ambiante. Il peut également s'agir d'émulsions, dans lesquelles les nano-particules sont formées par une phase lipidique dispersée en solution aqueuse et stabilisée par des surfactants. Cependant, la technologie des SLN ne permet pas encore d'en maîtriser la croissance, et on observe une tendance imprévisible de gélation et une dynamique inattendue de transitions polymorphiques. Par ailleurs, les SLN possèdent une capacité d'incorporation limitée par la structure cristalline du lipide solide (Mehnert, W., et al., Advanced Drug Delivery Reviews 2001, 47, 165ù196; Westesen, K., et al. International Journal of Pharmaceutics 1997, 151, 35 45; Westesen, K., et al., Journal of Controlled Release 1997, 48, 223-236). Le document WO 01/64328 décrit des nanocapsules lipidiques constituées d'un coeur liquide ou semi-liquide entouré d'une coque solide d'une épaisseur de quelques nanomètres qui peuvent encapsuler un principe actif pharmaceutique. Les nano-capsules sont obtenues par un procédé thermique dans lequel le mélange des composants huileux et aqueux est soumis à des cycles de température (entre 60 et 85°C) autour de la température d'inversion de phase (TIP) de l'émulsion formée. La microémulsion obtenue est ensuite soumise à un trempage par ajout d'eau froide. Ce procédé nécessite un équipement spécifique afin de détecter l'inversion de phase de l'émulsion et est incompatible avec de nombreux agents thérapeutiques du fait de la température élevée atteinte. Par ailleurs, la formation d'une coque solide en surface complique l'ancrage subséquent de ligands biologiques de ciblage. De plus, le trempage nécessite l'ajout de grands volumes d'eau froide (dilution de 3 à 10 fois) et réduit donc considérablement le rendement en nano-capsules. Par ailleurs, la nature chimique des triglycérides d'acides gras a un effet marqué sur la température d'inversion de phase, ce qui restreint leur choix. Le document US 2006/0292186 décrit une formulation anhydre auto-nanoémulsifiante pour l'administration de principes actifs peu hydrosolubles comme le paclitaxel. Ces formulations contiennent une forte proportion de Tyloxapol et de TPGS, des surfactants polymériques synthétiques. Le document WO 2008/042841 décrit des pré-concentrés d'émulsion de paclitaxel comportant un phospholipide anionique. Dispersé en phase aqueuse, la formulation forme une émulsion huile dans l'eau dont les gouttelettes portent une charge négative. Ces émulsions sont toutefois peu stables et doivent donc être préparée juste avant administration. Par ailleurs, Tarr et al. (1987) Pharm. Res. 4:162-165, rapporte une formulation de paclitaxel dans du Intralipid, une émulsion pour usage parentéral 1 o mais la faible solubilité du paclitaxel dans l'huile de soja (0.3 mg/ml) rend cet excipient inadapté. L'administration efficace d'agents thérapeutiques de type photo-sensibilisateurs constitue également un enjeu important dans la thérapie photo-dynamique, une technique prometteuse pour traiter différents cancers. Le principe 15 de cette technique est basé sur l'introduction d'un photo-sensibilisateur dans le tissu tumoral et la conversion de cet agent thérapeutique à l'aide d'une irradiation lumineuse à la longueur d'onde appropriée en un composé hautement cytotoxique. Il a été postulé que l'effet cytotoxique des photo-sensibilisateurs est du à la formation d'oxygène singulet après irradiation lumineuse. 20 La sélectivité de cette méthode dépend de l'accumulation sélective du photo-sensibilisateur dans le tissu tumoral par rapport aux tissus sains et plus particulièrement au sein même des cellules tumorales. Aujourd'hui, la faible sélectivité tumorale des agents après leur injection systémique engendre pour les patients une période prolongée de photosensibilité cutanée d'au moins 6 à 8 25 semaines. Le perfectionnement des systèmes d'administration de photosensibilisateurs constitue donc également un enjeu important pour le développement de la thérapie photo-dynamique. Le document WO 00/28971 décrit des formulations pour l'administration 30 topique de l'acide 5-aminolaevulinique (5 ALA) pour la photothérapie et le diagnostic contenant une nanoémulsion. Afin de réduire la période photosensibilité cutanée, le document US 2005/0215524 propose d'administrer une émulsion de phospholipides avant, pendant ou après le traitement photo-thérapeutique par photo-sensibilisateurs. Dans les exemples, le photo-sensibilisateur est solubilisé directement dans les phospholipides injectés ce qui favorise sa clairance rapide dans le plasma et dans la peau. [Problème technique] La formulation de fortes doses d'agents thérapeutiques lipophiles et amphiphiles dans des nanoémulsions stables permettant une délivrance efficace et ciblée demeure donc un challenge.

Nous proposons dans la présente invention une formulation dans laquelle l'agent thérapeutique se trouve encapsulé dans une nanoémulsion présentant une phase huileuse de composition spécifique.

[Résumé de l'invention] La présente invention décrit une nouvelle formulation d'agents thérapeutiques par encapsulation dans une nanoémulsion d'huile dans l'eau. Grâce à une formulation spécifique, la nanoémulsion selon l'invention est stable et permet d'atteindre un fort taux d'encapsulation en agent thérapeutique. La nanoémulsion permet par ailleurs un fort taux d'internalisation dans les cellules, liée au faible diamètre moyen de la phase dispersée. Sa formulation supporte une concentration élevée de surfactant dans la phase continue et est étonnamment robuste, puisqu'elle reste stable et présente une biodistribution de l'agent thérapeutique qui dépend peu de la composition. Enfin, elle est intéressante car elle peut être formulée de manière à ce que la surface de la phase dispersée présente un potentiel zéta faible, voire nul. Le potentiel zéta est un paramètre clé qui influe sur la bio-distribution de la nano-émulsion. Ainsi, au contact des cellules, un potentiel zéta positif favorise l'endocytose. Les nanoémulsions présentent comme avantage notamment une excellente stabilité colloïdale au stockage (> 3 mois) et une forte capacité d'encapsulation d'agent thérapeutique ainsi qu'une concentration élevée en phase dispersée. Lors de l'application, on constate par ailleurs une longue durée de vie plasmatique après injection intraveineuse des nano-particules dans l'organisme (caractère furtif).

Ainsi, selon un premier aspect, l'invention vise une formulation d'un agent thérapeutique sous forme de nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase huileuse dispersée, dans laquelle la phase huileuse comprend outre l'agent thérapeutique au moins un lipide amphiphile et au moins un lipide solubilisant et dans laquelle la phase aqueuse comporte au moins un co-tensioactif polyalkoxylé. De préférence, le lipide amphiphile est un phospholipide. Avantageusement, le lipide solubilisant comprend au moins un glycéride d'acides gras, par exemple un glycéride d'acides gras saturés comportant 12 à 18 1 o atomes de carbone. La phase huileuse peut comporter en outre au moins une huile, de préférence une huile présentant une balance hydrophile-lipophile (HLB) comprise entre 3 et 6, notamment une huile choisie parmi l'huile de soja et l'huile de lin. De préférence, le co-tensioactif comporte au moins une chaîne composée 15 de motifs d'oxyde d'éthylène ou d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène. Il peut être choisi en particulier parmi les composés conjugués polyéthylèneglycol /phosphatidyl-éthanolamine (PEG-PE), les éthers d'acide gras et de polyéthylèneglycol, les esters d'acide gras et de polyéthylèneglycol et les copolymères blocs d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène. 20 L'agent thérapeutique peut être notamment un principe actif pharmaceutique ou un photosensibilisateur.. Selon un deuxième aspect, l'invention vise un procédé de préparation d'une formulation d'agent thérapeutique sous forme de nanoémulsion, comprenant au moins une phase aqueuse continue et au moins une phase huileuse dispersée, 25 comportant les étapes consistant à : (i) préparer la phase huileuse comprenant au moins un lipide solubilisant, un lipide amphiphile et l'agent thérapeutique ; (ii) préparer une phase aqueuse comprenant un co-tensioactif polyalkoxylé ; 30 (iii) disperser la phase huileuse dans la phase aqueuse sous l'action d'un cisaillement suffisant pour former une nano-émulsion; et (iv) récupérer la nano-émulsion ainsi formée.

De préférence, l'action de cisaillement est exercée par sonification. Avantageusement, la phase huileuse est préparée par mise en solution de tout ou partie des constituants dans un solvant approprié et évaporation subséquente du solvant.

Selon un troisième aspect, l'invention vise enfin l'utilisation d'une formulation selon l'invention pour l'administration d'un agent thérapeutique à l'homme ou à l'animal en vue du traitement d'une maladie.. Le procédé de fabrication selon l'invention permet d'obtenir des nanoémulsions comprenant une phase dispersée de très faible taille de façon 1 o simple, rapide et peu coûteuse. Le procédé est également robuste et peut être facilement réalisé à l'échelle industrielle. Par ailleurs, il n'utilise pas ou très peu de solvants organiques et peut être mis en oeuvre avec des produits autorisés pour l'injection chez l'homme. Enfin, il ne nécessite qu'un chauffage modéré et est donc envisageable pour des principes actifs fragiles. 15 [Description de l'invention] [Définitions] Dans le cadre de cet exposé, on entend par le terme nanoémulsion une composition présentant au moins deux phases, généralement une phase huileuse 20 et une phase aqueuse, dans laquelle la taille moyenne de la phase dispersée est inférieure à 1 micron, de préférence de 10 à 500 nm et en particulier de 20 à 100 nm, et tout préférentiellement 20 et 70 nm (voir article C. Solans, P. Izquierdo, J. Nolla, N. Azemar and M. J. Garcia-Celma, Curr Opin Colloid in, 2005, 10, 102-110). 25 On entend par le terme agent thérapeutique désigner tout composé utile pour le traitement d'une pathologie, qu'il agisse par voie chimique comme les principes actifs pharmaceutiques, par voie physique ou par voie biologique, mais à l'exception des agents de diagnostic. Le terme gouttelette englobe à la fois les gouttelettes d'huile liquide 30 proprement dites ainsi que les particules solides issues d'émulsions de type huiledans-eau dans lesquelles la phase huileuse est solide. Dans ce dernier cas, on parle souvent aussi d'émulsion solide. Le terme lipide désigne dans le cadre de cet exposé l'ensemble des corps gras ou des substances contenant des acides gras présents dans les graisses d'origine animales et dans les huiles végétales. Ce sont de molécules hydrophobes ou amphiphiles principalement constituées de carbone, d'hydrogène et d'oxygène et ayant une densité inférieure à celle de l'eau. Les lipides peuvent être à l'état solide à température ambiante (25°C), comme dans les cires, ou liquide, comme dans les huiles. Le terme phospholipide vise des lipides possédant un groupe phosphate, notamment les phosphoglycérides. Le plus souvent, les phospholipides comportent une extrémité hydrophile formée par le groupe 1 o phosphate éventuellement substitué et deux extrémités hydrophobes formées par des chaînes d'acides gras. Parmi les phospholipides, on citera en particulier la phosphatidylcholine, la phosphatidyl éthanolamine, la phophatidyl inositol, la phosphatidyl sérine et la sphingomyéline. Le terme lécithine désigne la phosphatidylcholine, c'est-à-dire un lipide 15 formé à partir d'une choline, d'un phosphate, d'un glycérol et de deux acides gras. Il couvre de manière plus large les phospholipides extraits du vivant, d'origine végétale ou animale, dans la mesure où ils sont majoritairement constitués de phosphatidylcholine. Ces lécithines constituent généralement des mélanges de lécithines portant différents acides gras. 20 On entend par le terme acide gras désigner des acides carboxyliques aliphatiques présentant une chaîne carbonée d'au moins 4 atomes de carbone. Les acides gras naturels possèdent une chaîne carbonée de 4 à 28 atomes de carbone (généralement un nombre pair). On parle d'acide gras à longue chaîne pour une longueur de 14 à 22 carbones et à très longue chaîne s'il y a plus de 22 25 carbones. On entend par le terme tensioactif des composés à structure amphiphile qui leur confère une affinité particulière pour les interfaces de type huile/eau et eau/huile ce qui leur donne la capacité d'abaisser l'énergie libre de ces interfaces et de stabiliser des systèmes dispersés.

On entend par le terme co-tensioactif un tensioactif agissant en plus d'un tensioactif pour abaisser davantage l'énergie de l'interface. On entend par le terme ligand biologique toute molécule qui reconnaît de façon spécifique un récepteur généralement situé à la surface des cellules. [Emulsion] Selon un premier aspect, l'invention porte sur une formulation d'un agent thérapeutique sous forme de nanoémulsion, comprenant au moins une phase aqueuse et au moins une phase huileuse, dans laquelle la phase huileuse 1 o comprend outre l'agent thérapeutique au moins un lipide amphiphile et au moins un lipide solubilisant et dans laquelle la phase aqueuse comprend un cotensioactif polyalkoxylé. L'émulsion est donc une émulsion de type huile dans l'eau. Elle peut être simple ou multiple, notamment en comportant dans la phase dispersée une 15 seconde phase aqueuse. Les agents thérapeutiques susceptibles d'être encapsulés dans la nanoémulsion selon l'invention comprennent en particulier les principes actifs agissant par voie chimique, biologique ou physique. Ainsi, il peut s'agir de principes actifs pharmaceutiques ou d'agents biologiques tels que de l'ADN, des 20 protéines, peptides ou anticorps encore des agents utiles pour des thérapies physiques tels que des composés utiles pour la thermothérapie, les composés relarguant de l'oxygène singulet lorsqu'ils sont excités par une lumière utiles pour la photothérapie et des agents radioactifs. De préférence, il s'agit de principes actifs administrés par voie d'injection. 25 Selon son affinité lipophile ou amphiphile, l'agent thérapeutique sera encapsulé par la phase dispersée ou se situera à l'interface des deux phases. La nature des agents thérapeutiques encapsulés dans la nanoémulsion n'est pas particulièrement limitée. Cependant, la nanoémulsion est particulièrement intéressante pour des composés peu solubles, qui sont difficiles à formuler dans 30 les systèmes d'administration classiques et pour les principes actifs luminescents utiles pour la photothérapie, dont le rendement quantique peut être préservé.

Du fait des conditions douces du procédé de préparation, la formulation décrite est particulièrement intéressante pour l'encapsulation d'agents thérapeutiques qui se dégradent à température élevée. Parmi les principes actifs pharmaceutiques intéressants comme agents thérapeutiques, on peut citer en particulier les agents utilisés dans le traitement du SIDA, les agents utilisés dans le traitement des maladies cardiaques, les analgésiques, les anesthésiques, les anorexigènes, les anthelmintiques, les antiallergiques, les antiangineux, les antiarythmisants, les anticholinergiques, les anticoagulants, les antidépresseurs, les antidiabétiques, les antidiurétiques, les antiémétiques, les anticonvulsivants, les antifongiques, les antihistaminiques, les antihypertenseurs, les anti-inflammatoires, les anti-migraineux, les antimuscariniques, les antimycobactériens, les anticancéreux y compris les antiparkinsoniens, les antithyroïdiens, les antiviraux, les astringents, les agents bloquants, les produits sanguins, les substituts sanguins, les agents inotropes cardiaques, les agents cardiovasculaires, les agents du système nerveux central, les chélateurs, les agents de chimiothérapie, les facteurs de croissance hématopoïétiques, les corticostéroïdes, les antitussifs, les agents dermatologiques, les diurétiques, les dopaminergiques, les inhibiteurs de l'élastase, les agents endocrines, les alkaloïdes de l'ergot, les expectorants, les agents gastro-intestinaux, les agents génito-urinaires, le facteur de déclenchement de l'hormone de croissance, les hormones de croissance, les agents hématologiques, les agents hématopoïétiques, les hemostatiques, les hormones, les agents immunologiques, les immunosuppresseurs, les interleukines, les analogues d'interleukines, les agents de régulation des lipides, la gonadolibérine, les myorelaxants, les antagonistes narcotiques, les nutriments, les agents nutritifs, les thérapies oncologiques, les nitrates organiques, les vagomimétiques, les prostaglandines, les antibiotiques, les agents rénaux, les agents respiratoires, les sédatifs, les hormones sexuelles, les stimulants, les sympathomimétiques, les anti-infectieux systémiques, le tacrolimus, les agents thrombolytiques, les agents thyroïdiens, les traitements pour les troubles de l'attention, les vaccins, les vasodilatateurs, les xanthines, les agents diminuant le cholestérol. Particuliièrement visés sont les anticancéreux tels que le taxol (paclitaxel), la doxorubicine et le cisplatine.

Parmi les agents physiques, on peut citer notamment les isotopes radioactifs et les photo-sensibilisateurs. Parmi les photo-sensibilisateurs, on peut citer notamment ceux appartenant à la classe des tétrapyrroles comme les porphyrines, les bactériochlorines, les phtalocyanines, les chlorines, les purpurines, les porphycènes, les phéophorbides, ou encore ceux appartenant à la classe des texaphyrines ou des hypericines. Parmi les photo-sensibilisateurs de première génération, on peut mentionner l'hémato-porphyrine et un mélange de dérivés d'hémato-porphyrine (HpD) (vendu sous la marque commerciale Photofrin par Axcan Pharma). Parmi les photo- 1 o sensibilisateurs de seconde génération, on peut mentionner le méta-tetrahydroxyphenyl chlorine (mTHPC ; nom commercial Foscan , Biolitec AG) et le dérivé monoacide du cycle A de la benzoporphyrine (BPD-MA vendu sous la marque commerciale Visudyne par QLT et Novartis Opthalmics). Les formulations des photo-sensibilisateurs de seconde génération qui associent à ces 15 photo-sensibilisateurs une molécule (lipide, peptide, sucre etc..) qualifiée de transporteur qui permet leur acheminement sélectif au niveau du tissu tumoral sont appelées photo-sensibilisateurs de troisième génération. Parmi les agents biologiques, on peut mentionner les oligonucléotides, de l'ADN, de l'ARN, des SiRNA, les peptides et les protéines. 20 Bien entendu, l'agent thérapeutique peut être formulé directement sous sa forme active ou sous forme d'un prodrug. Par ailleurs, il est envisagé que plusieurs agents thérapeutiques puissent être formulés en association dans la nanoémulsion. La quantité d'agent thérapeutique dépend de l'application visée ainsi que de 25 la nature de l'agent. Toutefois, on cherchera généralement à formuler la nanoémulsion avec une concentration maximale en agent thérapeutique, notamment lorsqu'il s'agit d'agents thérapeutiques peu solubles, afin de limiter le volume et/ou la durée d'administration au patient. Or il a été constaté que la présence du lipide solubilisant dans la phase 30 huileuse permet d'incorporer une quantité importante de composés mêmes hydrophobes ou amphiphiles.

La formulation selon l'invention contiendra le plus souvent une quantité de 0,001 à 30% en poids, de préférence 0,01 à 20% en poids, et encore préférée 0,1 à 10% en poids d'agent thérapeutique. Avantageusement, les agents thérapeutiques sont incorporés dans l'émulsion sous forme de solution, et le solvant est ensuite séparé, par exemple par évaporation. La solution contient l'agent thérapeutique en une quantité variable pouvant aller jusqu'à sa limite de solubilité. Le choix du solvant dépend de la solubilité de chaque agent thérapeutique. Les solvants employés peuvent être par exemple le méthanol, l'éthanol, le chloroforme, le dichlorométhane, l'hexane, le cyclohexane, le DMSO, le DMF ou encore le toluène. De préférence, il s'agit de solvants volatils, de préférence non toxiques pour l'homme.

Selon l'invention, la phase huileuse de la nanoémulsion comporte au moins un lipide amphiphile et au moins un lipide solubilisant.

Afin de former une nanoémulsion stable, il est généralement nécessaire d'inclure dans la composition au moins un lipide amphiphile à titre de tensioactif. La nature amphiphile du tensioactif assure la stabilisation des gouttelettes d'huile au sein de la phase continue aqueuse. Les lipides amphiphiles comportent une partie hydrophile et une partie lipophile. Ils sont généralement choisis parmi les composés dont la partie lipophile comprend une chaîne saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, ayant de 8 à 30 atomes de carbone. Ils peuvent être choisis parmi les phospholipides, les cholestérols, les lysolipides, les sphingomyélines, les tocophérols, les glucolipides, stéarylamines, les cardiolipines d'origine naturelle ou synthétique ; les molécules composées d'un acide gras couplé à un groupement hydrophile par une fonction éther ou ester tels que les esters de sorbitan comme par exemple les monooléate et monolaurate de sorbitan vendus sous les dénominations Span par la société Sigma; les lipides polymérisés ; les lipides conjugués à de courtes chaînes d'oxyde de polyéthylène (PEG) tels que les tensioactifs non-ioniques vendus sous les dénominations commerciales Tween par la société ICI Americas, Inc. et Triton par la société Union Carbide Corp.; les esters de sucre tels que les mono-et di-laurate, mono- et di-palmitate, mono- et distéarate de saccharose; lesdits tensioactifs pouvant être utilisés seuls ou en mélanges.

La lécithine est le lipide amphiphile préféré. Selon un mode de réalisation particulier, tout ou partie du lipide amphiphile peut posséder une fonction réactive, telle qu'un groupe maléimide, thiol, amine, ester, oxyamine ou aldéhyde. La présence de fonctions réactives permet le greffage de composés fonctionnels au niveau de l'interface. Le lipide amphiphile réactif est incorporé dans la couche formée à l'interface stabilisant la phase dispersée, où il est susceptible de se coupler par exemple avec un composé réactif présent dans la phase aqueuse. Généralement, la phase huileuse comportera de 0.01 à 99% en poids, de 1 o préférence de 5 à 75% en poids, en particulier de 20 à 60% et tout particulièrement de 33 à 45% en poids de lipide amphiphile. La quantité de lipide amphiphile contribue avantageusement à contrôler la taille de la phase dispersée de la nanoémulsion obtenue. L'émulsion selon l'invention comprend par ailleurs un lipide solubilisant. Ce 15 composé a pour mission principale de solubiliser le lipide amphiphile, peu soluble, dans la phase huileuse de la nanoémulsion. Le lipide solubilisant est un lipide présentant une affinité avec le lipide amphiphile suffisante pour permettre sa solubilisation. De préférence, le lipide solubilisant est solide à température ambiante. 20 Dans le cas où le lipide amphiphile est un phospholipide, il peut s'agir notamment de dérivés du glycérol, et en particulier de glycérides obtenues par estérification de glycérol avec des acides gras. Le lipide solubilisant utilisé est avantageusement choisi en fonction du lipide amphiphile utilisé. Il présentera généralement une structure chimique proche, afin 25 d'assurer la solubilisation recherchée. Il peut s'agir d'une huile ou d'une cire. De préférence, le lipide solubilisant est solide à température ambiante (20°C), mais liquide à la température du corps (37°C). Les lipides solubilisants préférés, en particulier pour les phospholipides, sont les glycérides d'acides gras, notamment d'acides gras saturés, et en particulier 30 d'acides gras saturés comportant 8 à 18 atomes de carbone, encore préféré 12 à 18 atomes de carbone. Avantageusement, il s'agit d'un mélange de différents glycérides.

De préférence, il s'agit de glycérides d'acides gras saturés comportant 0% à 20% en poids d'acides gras en C8, 0% à 20% en poids d'acides gras en C10, 10% à 70% en poids d'acides gras en C12, 5% à 30% en poids d'acides gras en C14, 5% à 30% en poids d'acides gras en C16 et 5% à 30% en poids d'acides gras en C18. Particulièrement préférés sont les mélanges des glycérides semisynthétiques solides à température ambiante vendus sous la dénomination commerciale Suppocire NC par la société Gattefossé et approuvé pour l'injection chez l'homme. Les Suppocire de type N sont obtenues par estérification directe 1 o d'acides gras et de glycérol. Il s'agit de glycérides hémi-synthétiques d'acides gras saturés de C8 à C18, donc la composition quali-quantitative est indiquée dans le tableau ci-dessous. La quantité de lipide solubilisant peut varier largement en fonction de la nature et de la quantité de lipide amphiphile présent dans la phase huileuse. 15 Généralement, la phase huileuse comportera de 1 à 99% en poids, de préférence de 5 à 80% en poids et tout particulièrement de 40 à 75% en poids de lipide solubilisant.

Tableau 1 : Composition en acides gras du Suppocire NC de Gattefossé Longueur de chaînes [% en poids] C8 0,1 à 0,9 C10 0,1 à 0,9 C12 25 à 50 C14 10 à 24,9 C16 10 à 24,9 C18 10 à 24,9 20 La phase huileuse peut comporter par ailleurs une ou plusieurs autres huiles. Les huiles utilisées présentent de préférence une balance hydrophile- lipophile (HLB) inférieure à 8 et encore plus préférentiellement comprise entre 3 et 6. Avantageusement, les huiles sont utilisées sans modification chimique ou 25 physique préalablement à la formation de l'émulsion.

Selon les applications envisagées, les huiles peuvent être choisies parmi les huiles biocompatibles, et en particulier parmi les huiles d'origine naturelle (végétale ou animale) ou synthétique. Parmi de telles huiles, on peut notamment citer les huiles d'origine naturelle végétale parmi lesquelles figurent notamment les huiles de soja, de lin, de palme, d'arachide, d'olives, de pépin de raisins et de tournesol ; les huiles synthétiques parmi lesquelles figurent notamment les triglycérides, di glycérides et les mono glycérides. Ces huiles peuvent être de premières expressions, raffinées ou inter-estérifiées. Les huiles préférées sont l'huile de soja et l'huile de lin. 1 o Généralement, si présente, l'huile sera contenue dans la phase huileuse dans une proportion allant de 1 à 80% en poids, de préférence entre 5 et 50 % en poids et tout particulièrement 10 à 30% en poids. La phase huileuse peut contenir en outre d'autres additifs tels que des colorants, stabilisants, conservateurs, fluorophores, agents de contraste pour 15 l'imagerie, nanocristaux inorganiques (ex : nanocristaux d'or, d'oxyde de fer ou de semi-conducteurs) ou d'autres principes actifs, en quantité appropriée. La phase huileuse pour la phase dispersée de l'émulsion peut être préparée par simple mélange des constituants, si nécessaire en chauffant jusqu'à fusion de l'ensemble des constituants. 20 La phase aqueuse mise en oeuvre dans le procédé selon l'invention est de préférence constituée d'eau et/ou d'un tampon tel qu'un tampon phosphate comme par exemple du PBS ("Phosphate Buffer Saline") ou d'une solution saline, notamment de chlorure de sodium. En outre, elle comporte éventuellement d'autres ingrédients, dont un co- 25 tensioactif. Le co-tensioactif permet de stabiliser la nanoémulsion. Le co-tensioactif peut par ailleurs présenter d'autres effets dans l'application envisagée de la nanoémulsion. En particulier, il peut être greffé pour porter un ligand de ciblage. Les co-tensioactifs utilisables dans les émulsions conformes à la présente 30 invention sont de préférence des tensioactifs hydrosolubles. Les tensioactifs hydrosolubles sont de préférence alkoxylés et comportent de préférence au moins une chaîne composée de motifs d'oxyde d'éthylène (PEO ou PEG) ou d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène. De préférence, le nombre de motifs dans la chaîne varie entre 2 et 500. A titre d'exemple de co-tensioactifs, on peut en particulier citer les composés conjugués polyéthylèneglycol/phosphatidyl-éthanolamine (PEG-PE), les éthers d'acide gras et de polyéthylèneglycol tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Brij (par exemple Brij 35, 58, 78 ou 98) par la société ICI Americas Inc., les esters d'acide gras et de polyéthylèneglycol tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Myrj par la société ICI Americas Inc. (par exemple Myrj 45, 52, 53 ou 59) et les copolymères blocs 1 o d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Pluronic par la société BASF AG (par exemple Pluronic F68, F127, L64, L61, 10R4, 17R2, 17R4, 25R2 ou 25R4 ) ou les produits vendus sous la dénomination commerciale Synperonic par la société Unichema Chemie BV (par exemple Synperonic PE/F68, PE/L61 ou PE/L64). 15 La phase aqueuse comporte de 0.01 à 50% en poids, de préférence de 1 à 30% en poids et tout particulièrement de 5 à 20% en poids de co-tensioactif. Selon un mode de réalisation préféré, la phase continue comporte également un agent épaississant tel qu'un glycérol, un saccharide, oligosaccharide ou polysaccharide, une gomme ou encore une protéine, de préférence du glycérol. 20 En effet, l'utilisation d'une phase continue de viscosité plus élevée facilite l'émulsification et permet de ce fait de réduire le temps de sonication. La phase aqueuse comporte avantageusement de 0 à 50% en poids, de préférence de 1 à 30% en poids et tout particulièrement de 5 à 20% en poids d'agent épaississant. 25 Bien entendu, la phase aqueuse peut contenir en outre d'autres additifs tels que des colorants, stabilisants et conservateurs en quantité appropriée. La phase aqueuse pour la phase continue de l'émulsion peut être préparée par simple mélange des différents constituants avec le milieu aqueux choisi.

30 [Procédé de préparation] La nanoémulsion telle que décrite peut être préparée aisément par dispersion de quantités appropriées de phase huileuse et de phase aqueuse sous l'effet d'un cisaillement.

Dans le cadre du procédé selon l'invention, on mélange d'abord les différents constituants huileux et l'agent thérapeutique pour préparer un pré-mélange huileux pour la phase dispersée de l'émulsion. Le mélange peut éventuellement être facilité par mise en solution d'un des constituants ou du mélange complet dans un solvant organique approprié. Le solvant organique est ensuite évaporé, pour obtenir un pré-mélange huileux homogène pour la phase dispersée. Par ailleurs, il est préféré de réaliser le pré-mélange à une température à laquelle l'ensemble des ingrédients est liquide. Selon un mode de réalisation préféré, la phase dispersée de la nanoémulsion 1 o est greffée en surface avec des molécules d'intérêts tels que des ligands biologiques. Un tel greffage permet une reconnaissance spécifique de certaines cellules (par exemple de cellules tumorales comme décrit par exemple dans l'article de S. Achilefu, Technology in Cancer Research & Treatment, 2004, 3, 393-408) ou de certains organes. 15 De préférence, le greffage en surface est réalisé par couplage des molécules ou de leurs précurseurs avec un composé amphiphile, notamment avec le cotensioactif. Dans ce cas, le composé amphiphile joue le rôle d'un espaceur permettant d'accommoder les molécules de ciblage en surface. Le couplage peut être réalisé avant ou après l'émulsification. Le dernier cas peut être préconisé 20 lorsque les réactions chimiques employées sont compatibles avec la stabilité colloïdale des émulsions, notamment en termes de pH. De préférence, le pH lors de la réaction de couplage est compris entre 5 et 11. Les molécules d'intérêt peuvent être par exemple : des ligands biologiques de ciblage tels que des anticorps, peptides, saccharides, aptamères, oligonucléotides ou des composés comme l'acide folique ; un agent de furtivité : une entité ajoutée afin de conférer à la nanoémulsion une furtivité vis-à-vis du système immunitaire, d'augmenter son temps de circulation dans l'organisme, et de ralentir son élimination. Par ailleurs, il est possible d'introduire à l'intérieur des nanoparticules, en surface, ou adsorbé sur, par lien covalent ou non : 25 30 des agents d'imagerie, notamment pour l'IRM (imagerie par résonance magnétique), le PET (en anglais Positron Emission Tomography), le SPECT (Single Photon Emission Computed Tomography), l'échographie ultrasonore, la radiographie, la tomographie X et l'imagerie optique (fluorescence, bioluminescence, diffusion...) ; et/ou d'autres agents thérapeutiques tels que décrit ci-dessus. La proportion de phase huileuse et de phase aqueuse est très variable. Cependant, le plus souvent, les nanoémulsions seront préparées avec 1 à 50%, de préférence 5 à 40% et tout particulièrement 10 à 30% en poids de phase 1 o huileuse et 50 à 99%, de préférence 60 à 95% et tout particulièrement 70 à 90 0/0 en poids de phase aqueuse. Avantageusement, la phase huileuse est dispersée dans la phase aqueuse à l'état liquide. Si l'une des phases se solidifie à température ambiante, il est préférable de réaliser le mélange avec l'une ou de préférence les deux phases 15 chauffées à une température supérieure ou égale à la température de fusion. L'émulsification sous l'effet de cisaillement est de préférence réalisée à l'aide d'un sonificateur ou d'un microfluidiseur. De préférence, la phase aqueuse puis la phase huileuse sont introduites dans les proportions souhaitées dans un récipient cylindrique approprié puis le sonificateur est plongé dans le milieu et mis en 20 marche pendant une durée suffisante pour obtenir une nanoémulsion, le plus souvent quelques minutes. On obtient alors une nanoémulsion homogène dans laquelle le diamètre moyen des gouttelettes d'huile est supérieur à 10 nm et inférieur à 200 nm, de préférence entre 20 et 50 nm. 25 De préférence, le potentiel zêta est inférieur à 20 mV en valeur absolue, c'esà-dire compris entre -20 mV et 20 mV. Avant conditionnement, l'émulsion peut être diluée et/ou stérilisée, par exemple par filtration ou dialyse. Cette étape permet d'éliminer les éventuels agrégats qui pourraient s'être formés au cours de la préparation de l'émulsion. 30 L'émulsion ainsi obtenue est prête à l'emploi, le cas échéant après dilution. [Méthodes d'utilisation] La formulation selon l'invention peut être utilisée telle qu'elle, ou adaptée à l'application visée, par exemple par dilution, pour l'administration du ou des agents thérapeutiques, chez l'homme ou chez l'animal.

Du fait qu'elle peut être préparée exclusivement à partir de constituants approuvés pour l'homme, elle est particulièrement intéressante pour une administration par voie parentérale. Cependant, il est également possible d'envisager une administration par d'autres voies, notamment par voie orale ou par voie topique.

La formulation décrite permet ainsi l'accès à un moyen simple pour l'administration d'agents thérapeutiques nécessaires pour le traitement de maladies comme le cancer, par voie de chimiothérapie ou photothérapie notamment. L'invention sera décrite plus en détail au moyen des exemples et figures en annexe, lesquelles montrent :

Fig. 1: la densité optique à 650 nm des nanoémulsions de mTHPP et de mTPC selon l'exemple 2A et 2C avec un taux de charge respectif de 0 à 1000 M de mTHPP et de 0 à 2000 pM de mTPC, avant et après dialyse, déterminée sur un spectrophotomètre CARY 300 SCAN et représentée respectivement en A et B Les équations des droites de corrélation linéaire avant dialyse sont pour le mTHPP : y=0,0042x+0,2331 (R=0,99) et pour le mTPC : y=0,0049x+0,023 (R=0,99), celles des droites après dialyse sont pour le mTHPP : y=0,0056x+0,1503 (R=0,99) et pour le mTPC : y=0,0059x+0,0584 (R=0,99);

Fig. 2 : des histogrammes du diamètre moyen de la phase dispersée des émulsions selon l'exemple 2A - 2C mesuré après dialyse sur le Zetasizer (Malvern Instruments) (échantillons dilués au 1/1000edans du PBS 0,1X) ; 25 30 Fig. 3:Des clichés de cellules obtenues à l'exemple 3 observées en microscopie confocale dans le proche infrarouge. Les grains noirs représentent la fluorescence émise par le mTHPP; Fig. 4:Souris porteuses d'une tumeur sous-cutanée de type Ts/Apc (10 millions de cellules). Observation 24 h après injection iv sur souris anesthésiées de 200 L d'une solution de nanoémulsion à 50 M en fluorophore (A : nanoémulsions encapsulant DiD ; B : nanoémulsions encapsulant ICG); Fig. 5:L'évolution du rapport du signal de fluorescence émis par la tumeur sur le signal de fluorescence émis par la peau en fonction du temps pour des nanoémulsions fonctionnalisées par des cRGD et des nanoémulsions non-fonctionnalisées; et Fig. 6:Le diamètre moyen de la phase dispersée de différentes nanoémulsions en fonction de la molécule incorporée dans le coeur lipophile. 20 EXEMPLES EXEMPLE 1 Préparation d'une nanoémulsion encapsulant du paclitaxel Une charge de 2mL de nanoémulsion encapsulant du paclitaxel (charge 25 initiale en paclitaxel de 1 mM, soit 850 pg/mL) a été préparée de manière suivante. La phase huileuse a été préparée en introduisant dans un récipient approprié chauffé à 50°C, 190 mg de glycérides semi-synthétiques vendus sous la dénomination commerciale Suppocire NC (Gattefossé) et 138 mg de lécithine de soja (L-a-Phosphatidylcholine, vendue par Fluka), >_30% de phosphatidyl choline). 30 A ce mélangea été ajouté 17 mg de paclitaxel (vendu par Sigma-Aldrich) dissous dans 1 mL de chloroforme (soit 0.002 mmol de paclitaxel) puis le mélange a été homogénéisé par agitation au vortex. Le solvant a été ensuite évaporé sous vide à 40-45°C à l'évaporateur rotatif en abaissant progressivement la pression.15 La phase aqueuse a été préparée en introduisant dans un tube Via] de 2 mL 228 mg de Myrj 53 (surfactant polyéthoxylé vendu par Sigma-Aldrich) puis on a ajouté 1,38 mL (1444 mg) de solution saline ([NaCI] = 154 mM). Le mélange a été chauffé à 50°C afin de faire fondre le surfactant puis la solution obtenue a été homogénéisée par agitation au vortex. La solution aqueuse a été maintenue à 50°C. Dans un flacon trempant dans un bain d'eau à 50 °C, on a introduit la phase huileuse puis la phase aqueuse (à 50°C). Puis la solution bi-phasique est mise en contact avec un sonificateur équipé d'une sonde conique (Vibra-cell 75115 vendu 1 o par Bioblock Scientific) plongeant environ 1 cm dans le mélange. Le mélange a été soniqué pendant 5 minutes avec le sonicateur réglé sur 25 % de la puissance maximale, avec une séquence de pulses suivante : 10 secondes de sonication / 30 secondes de repos. La nanoémulsion obtenue est ensuite filtré sur un filtre 0.2 m afin de 15 séparer tout taxol non encapsulé. La concentration en nano-particules lipidiques dans la nanoémulsion obtenue est d'environ 25% en poids. La nanoémulsion est alors prête pour une utilisation pharmaceutique : elle est concentrée à une dose de 612 g/mL en paclitaxel (soit 50 mL de solution à injecter pour une dose thérapeutique de 30 mg), dans un tampon salin prêt à 20 l'injection thérapeutique (NaCl 154 mM). La formulation est résumée dans le tableau 2 ci-dessous.

Tableau 2 : Composition de la formulation de l'exemple 1 Constituants Masse mg Phase Suppocire 190 dispersée NC Phase Solution 1444 continue saline Surfactants Lécithine 138 Myrj 53 228 Dopant Paclitaxel 1.7 Dosage du taxol encapsulé Le paclitaxel encapsulé dans la nanoémulsion obtenue a été dosé par HPLC selon la méthode mise au point d'après l'étude de S. C. Kim et al (S. C. Kim, J. Yu, J. W. Lee, E.-S. Park, S.-C. Chi, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2005, 39, 170-176). Au préalable, la bonne tenue physico-chimique de taxol dans les conditions de préparation de la nanoémulsion et d'analyse a été confirmée, en vérifiant l'absence de dégradation après passage aux ultrasons, traitement thermique (4 h à 60°C) et dans les conditions d'analyse (dans un mélange acétonitrile/eau). L'appareillage HPLC (Chromatographie Liquide Haute Performance) utilisé est le suivant : Module de détection : Dual Absorbance Detector WATERS 2487 détection UV à 227nm Module de séparation : Separations Module WATERS 269 Colonne : SUPELCO phase Supelcosil C18 250x4.6mm, 5 m, Débit 1 mL/min, Volume injecté : 20 L de solution (1 mg/mL de taxol dans le méthanol soit 1.17mM), Phase mobile: CH3CN / H2O.

Le temps de rétention du taxol est de tR = 14,64 min pour un gradient d'élution indiqué dans le tableau 3 ci-dessous:

Tableau 3 : Gradient d'élution utilisé temps (min) % H2O % ACN 0 66 34 2 66 34 15 30 70 19 66 34 44 66 34 Pour le dosage quantitatif, on a utilisé un étalon interne, l'éthyl 4-25 diméthylaminobenzoate (El) (C11H15NO2, vendu par Sigma-Aldrich) lequel a un temps de rétension de tR(El) = 15.256 min dans les conditions détaillées ci-dessus. Le taxol encapsulé est extrait de la nanoémulsion par cassage de l'émulsion, extraction du taxol du mélange, et ajout d'une quantité connue de l'étalon interne pour le dosage par HPLC. Le résultat obtenu est comparé à une courbe d'étalonnage précédemment réalisée représentant le ratio des aires A des pics entre le taxol et l'étalon interne. On trouve une concentration de taxol de 0.597mM (concentration théorique 0.83mM), donc un taux d'encapsulation d'au moins 72%.

1 o EXEMPLE 2A Préparation d'une nanoémulsion encapsulant un photosensibilisateur (mTHPP) Une nanoémulsion encapsulant la 5,10,15,20 tetrakis (4 hydroxyphenyl) 21 H,23H porphyrine (mTHPP, vendue par Sigma-Aldrich) a été préparé comme 15 Suit. Dans un récipient approprié, on introduit 0,05 g d'huile de soja (Sigma-Aldrich), 0,150 g de glycérides semi-synthétiques (vendus sous la dénomination commerciale Suppocire NC (Gattefossé)), et 0,100 g de lécithine de soja (enrichie à 75 % de phosphatidylcholine, vendue par la société Lipoïd sous la 20 dénomination commerciale Lipoïde S75). On ajoute à ce pré-mélange une quantité de 5, 10, 15, 20 tetrakis (4 hydroxyphenyl) 21H,23H porphyrine (mTHPP, vendu par Sigma-Aldrich) en solution dans le diméthylsulfoxide (DMSO) comprise entre 0,27 mg et 1,37 mg. Après évaporation du solvant sous vide, le résidu est chauffé à 50-60°C et le mélange liquide est maintenu à cette température pour 25 l'émulsification. Dans un autre récipient, on mélange 0,05 g de glycérol, 0,331 g de stéarate de polyoxyéthylène à 50 moles d'oxyde d'éthylène (vendu sous la dénomination commerciale Myrj 53 par la société ICI Americas Inc) et du chlorure de sodium en solution aqueuse à 154 mM pour compléter à 1,7 g. La solution aqueuse obtenue 30 a été maintenue à chaud (50-60°C). Dans un flacon trempant dans un bain d'eau à 50 °C, on introduit la phase huileuse puis la phase aqueuse, chauffées à 50°C. Puis la solution bi-phasique est mise en contact avec un sonificateur AV505 équipé d'une sonde conique de 3 mm de diamètre (Sonics, Newtown) plongeant d'environ 1 cm dans la solution. La solution a été soniquée pendant 5 minutes avec le sonicateur réglé sur 25 % de la puissance maximale, avec une séquence de pulses suivante : 10 secondes de sonication / 30 secondes de repos. Durant la sonication, la solution a été maintenue à 50°C dans un bain marie. L'émulsion obtenue est dialysée contre une solution de chlorure de sodium à 154 mM avec une membrane de dialyse Spectra/Por ayant un seuil de coupure égal à 12000 de manière à éliminer les réactifs n'ayant pas réagi. L'émulsion obtenue est ensuite filtrée sur un filtre de 0,22 pm de façon à la stériliser et à éliminer les agrégats et le photo-sensibilisateur en excès. Cette émulsion peut être conservée telle quelle puis ensuite être directement utilisée après dilution éventuelle pour l'application thérapeutiques, sans traitement particulier préalable comme une resuspension. Le tableau 4 ci-dessous résume la composition de la formulation obtenue 15 avant dialyse. Le taux d'incorporation moyen de la mTHPP dans la nanoémulsion, calculé à partir de la densité optique, est d'environ 75% (figure 1). Tableau 4 : Composition de la formulation des exemples 2A-2C Constituants Masse mg % en poids Phase dispersée Huile de soja 50 2,5 Suppocire NC 150 7,5 Photo-sensibilisateurs 0,24-2,4 0,012-0,12 Surfactants Lécithine 100 5 Myrj 53 331 16,55 Phase aqueuse Glycérol 50 2,5 Solution NaCl 154 1319 65,95 mM Total 2000 100 Les émulsions ainsi obtenues présentent un diamètre moyen de la phase 20 dispersée, déterminé par diffusion de lumière (ZeitaSizer Nano, Malvern Instrument), de 29 nm, comme l'illustre la figure 2. De plus, cette formulation de photo-sensibilisateurs est très stable pendant au moins 40 jours comme l'atteste la stabilité du diamètre moyen de la phase dispersée au cours du temps illustrée en figures 3A et 3B.

Au regard de toutes ces propriétés, la formulation selon l'invention pourrait donc être commercialisée sous forme prête à l'emploi.

EXEMPLE 2B Préparation d'une nanoémulsion encapsulant un photosensibilisateur (mT2OM2P) L'exemple 2A est répété à l'identique, sauf à remplacer le photosensibilateur par une quantité de 2,3 mg de 5,10,15,20 tetrakis (4 octadecyloxymethylphenyl) 21 H,23H porphyrine (mT2OM2P, vendue par Porphyrin Systems) directement dans le pré-mélange.

Le tableau 4 ci-dessus résume la composition de la formulation obtenue avant dialyse. Le taux d'incorporation moyen de la mT2OM2P dans la nanoémulsion obtenue, calculé à partir de la densité optique, est d'envitron 89%.

EXEMPLE 2C Préparation d'une nanoémulsion encapsulant un photosensibilisateur (mTPC) L'exemple 2A est répété mais en remplaçant le photosensibilisateur par une quantité comprise entre 0,24 mg et 2,4 mg de meso-tetraphenylchlorine (mTPC, vendue par Porphyrin Systems), ajouté sous forme de solution 10 mM dans le toluène. Le tableau 4 ci-dessus résume la composition de la formulation obtenue avant dialyse. Le taux d'incorporation moyen de la mTPC dans la nanoémulsion, calculé à partir de la densité optique, est d'environ 83% (figure 1).

Mesure du rendement quantique de fluorescence Les rendements quantiques de fluorescence des différents photo-sensibilisateurs formulés en nanoémulsions et en solvant ont été mesuré par référence au Nile Blue perchlorate dans l'éthanol, Àexc 605 nm (Fref= 0,27). Les résultats sont résumés dans le tableau 5. On constate que les rendements sont sensiblement ceux des photo-sensibilisateurs dans leurs solvants respectifs. La formulation en nanoémulsion n'affecte donc pas le rendement quantique de fluorescence des photo-sensibilisateurs testés. Tableau 5 : Rendement quantique de fluorescence F Photo-sensibilisateurs F mTHPP dans éthanol 0,23 mTHPP (nanoémulsion, taux de charge 800 PM) 0,23 mT2OM2P (nanoémulsion, taux de charge 660 0,16 PM) mTPC dans toluène 0,38 mTPC (nanoémulsion, taux de charge 800 PM) 0,40 EXEMPLE 3 Internalisation des nanoémulsions dans des cellules tumorales 10 L'internalisation des nanoémulsions encapsulant le mTHPP (taux de charge 600 PM) obtenues selon l'exemple 2 A dans des cellules tumorales de la lignée U373 a été suivie in vitro par microscopie de fluorescence. Les cellules tumorales U373, placées dans des chambres de culture sur lames (Labtek, Nunc) sont incubées 24h dans une atmosphère contrôlée 15 contenant 5% de CO2 en présence de mTHPP formulé en nanoémulsion selon l'exemple 2 à la concentration finale de 2 pM dans du milieu de culture DMEM (fourni par Gibco, Invitrogen]. Après une série de rinçage à l'aide de DMEM et une fixation à 37°C dans une solution de paraformaldéhyde 4%, les cellules sont placées dans un milieu de montage spécial pour la fluorescence (Prolong anti- 20 fade, Invitrogen) et les lames sont recouvertes de lamelles. La microscopie confocale (Leica TS2) des échantillons montre une fluorescence à l'intérieur des cellules tumorales, comme l'illustre la figure 3, mettant en évidence le passage du mTHPP formulé en nanoémulsion de l'extérieur de la cellule tumorale vers l'intérieur. 25 EXEMPLE 4 Accumulation passive dans différents modèles tumoraux La biodistribution des nanoémulsions selon l'invention a été étudiée chez la souris porteuse de tumeurs en utilisant l'imagerie non invasive de fluorescence.

Pour ces besoins, des nanoémulsions ont été préparées selon l'exemple 1 et 2, sauf que l'on a utilisé à titre d'agent thérapeutique encapsulé un fluorophore organique lipophile ou amphiphile adapté à l'imagerie de fluorescence non invasive in vivo (le fluorophore DiD ou DiR, Invitrogen, et l'ICG, Sigma), tel que décrit dans la demande de brevet PCT FR2007/000269.

Les cellules servant de modèle tumoral sont les cellules Ts/Apc qui sont issue d'un cancer murin du sein. (Ts/Apc) (Lollini, P. L.; Degiovanni, C.; Landuzzi, L.; Nicoletti, G.; Frabetti, F.; Cavallo, F.; Giovarelli, M.; Forni, G.; Modica, A.; Modesti, A.; Musiani, P.; Nanni, P., Human Gene Therapy 1995, 6, (6), 743-752). Les cellules Ts/Apc sont cultivées dans un milieu de culture RPMI 1640 comportant 10% de FCS, 50 U/mL de pénicilline, 50 g/mL de streptomycine, de 2-mercaptoéthanol à 2.5 10-5 M (vendus par Sigma-Aldrich). Les cellules sont maintenues à 37°C sous atmosphère humide avec 5% de CO2. 106 cellules ont été injectées en sous-cutané dans le dos des souris nude femelles de 5-6 semaines (IFFA-Credo, Marcy l'Etoile, France) 2 semaines avant l'injection des nanoémulsions. Toutes les injections et acquisitions d'images ont été réalisées alors que les souris sont maintenues sous anesthésie générale par voie gazeuse (isoflurane). Les animaux anesthésiés ont été imagés avec des dispositifs d'imagerie de fluorescence par réflectance (FRI = "Fluorescence Reflectance Imaging") adaptés aux propriétés spectrales des fluorophores encapsulés.

La figure 4 représente le signal de fluorescence obtenu 24h après injection. Le cliché met clairement en évidence l'accumulation du traceur fluorescent dans la tumeur, et ce pour les deux fluorophores différents.

EXEMPLE 5 Préparation de nanoémulsions fonctionnalisées Les nanoémulsions peuvent être fonctionnalisés en utilisant des surfactants fonctionnalisables afin d'augmenter leur accumulation dans la tumeur par un phénomène de ciblage actif. A titre d'exemple, une nanoémulsion encapsulant du DiD préparée selon l'exemple 4 a été fonctionnalisée par un cyclopeptide (le cRGD) capable de se fixer sur des récepteurs membranaires, les intégrines av133. Ces intégrines sont surexprimé lors du phénomène d'angiogénèse, c'est-à-dire la création de 1 o nouveaux vaisseaux sanguins accompagnant notamment la plupart des croissances tumorales. La fonctionnalisation peut être réalisée avant ou après émulsification. Ci-après est expliqué comment procéder pour fonctionnaliser un co-tensioactif avant émulsification. 15 Préparation d'un peptide de ciblage fonctionnalisé par un co-tensioactif de greffage Un peptide cyclique de ciblage des intégrines av33 surexprimées à la surface de cellules endothéliales, c(RGDf[c-S-acétylthioacétylK vendu par la société 20 Ansynth Service BV (Pays-Bas) et dénommé cRGD dans ce ui suit possédant un groupement thiol protégé sous la forme d'un acide mercaptoacétique, a été couplé à un co-tensioactif de greffage, le distéaroylphosphatidyléthanolamine poly(éthylène glycol) 5000-maléimide (DSPE-PEG(5000)-maléimide vendu par la société Avanti Polar Lipids, Inc.). celui-ci a été mélangé au cRGD avec un ratio 25 molaire 1 :1 dans une solution tampon acide sulfonique de (4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthane/acide éthylène-diaminetétraacétique (HEPES/EDTA) avec une concentration en hydroxylamine de 0,05 M. La solution a été agitée lentement sous un léger flux d'argon à température ambiante pendant 4 heures, évaporée sous pression réduite puis redissoute dans du chloroforme en vue de la deuxième 30 étape. La nanoémulsion fonctionnalisé a été ensuite préparée selon le protocole indiqué à l'exemple 2, sauf à remplacer 2% en poids d'huile par la quantité équivalente de peptide préparé comme indiqué ci-dessus.

Une solution de nanoémulsion dopée DiD fonctionnalisé par des cRGD et, à titre de comparaison, de nanoémulsion dopée DiD non fonctionnalisé ont été injectées à des souris porteuses de tumeur issue de cellules Hek 133. Ces cellules tumorales ont été implantés dans le dos de souris nude femelle selon un protocole similaire à celui décrit plus haut. La comparaison de l'évolution du rapport tumeur sur peau des souris traitées par une nanoémulsion fonctionnalisée par le cRGD et celles ayant reçu une nanoémulsion non fonctionnalisée met en évidence une accumulation privilégiée des nanoparticules fonctionnalisées par le cRGD dans la tumeur. Il est mis en 1 o évidence un ciblage actif pour la vectorisation de molécules d'intérêt. Ainsi, la nanoémulsion selon l'invention constitue une formulation d'agents thérapeutiques susceptible de permettre une administration plus ciblée, contribuant ainsi à diminuer la dose administrée et de ce fait la durée et les effets secondaires indésirés du traitement.

15 Par ailleurs, on constate que la charge d'agent thérapeutique modifie peu les propriétés des nanoémulsions préparées au niveau de la taille de la phase dispersée, la nature de l'interface et sa charge, les principaux facteurs jouant sur leur biodistribution in vivo. Enfin, les nanoémulsions encapsulant des principes actifs comme le paclitaxel ou les photosensibilisateurs s'accumulent de façon 20 passive dans les tumeurs, cette accumulation pouvant être renforcée par du ciblage actif par greffage d'un ligand biologique tel que par exemple le cRGD. Les nanoémulsions proposées selon l'invention constituent donc un moyen efficace de vectoriser de façon passive ou active des agents thérapeutiques vers des tumeurs et constituent donc un outil intéressant pour l'amélioration du 25 diagnostic et du traitement de pathologies comme le cancer, notamment par voie de chimiothérapie et photothérapie. 25 30

Claims (14)

1. REVENDICATIONS1. Formulation d'un agent thérapeutique sous forme de nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase huileuse dispersée, dans laquelle la phase huileuse comprend outre l'agent thérapeutique au moins un lipide amphiphile et au moins un lipide solubilisant et dans laquelle la phase aqueuse comporte au moins un co-tensioactif polyalkoxylé.
2. 2. Formulation d'agent thérapeutique selon la revendication 1, dans laquelle le lipide amphiphile est un phospholipide.
3. 3. Formulation d'agent thérapeutique selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le lipide solubilisant comprend au moins un glycéride d'acides gras.
4. 4. Formulation d'agent thérapeutique selon la revendication 3, dans laquelle le lipide solubilisant comprend au moins un glycéride d'acides gras saturés comportant 12 à 18 atomes de carbone. 20
5. 5. Formulation d'agent thérapeutique selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle la phase huileuse comporte en outre au moins une huile.
6. 6. Formulation d'agent thérapeutique selon la revendication 5, dans laquelle l'huile présente une balance hydrophile-lipophile (HLB) comprise entre 3 et 6.
7. 7. Formulation d'agent thérapeutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle le co-tensioactif comporte au moins une chaîne composée de motifs d'oxyde d'éthylène ou d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène.
8. 8. Formulation d'agent thérapeutique selon la revendication 7, dans laquelle le co-tensioactif est choisi parmi les composés conjugués polyéthylèneglycol /phosphatidyl-éthanolamine (PEG-PE), les éthers d'acide gras et de15polyéthylèneglycol, les esters d'acide gras et de polyéthylèneglycol et les copolymères blocs d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène.
9. 9. Formulation d'agent thérapeutique selon l'une des revendications 1 à 8, 5 dans laquelle l'agent thérapeutique est un principe actif pharmaceutique.
10. 10. Formulation d'agent thérapeutique selon l'une des revendications 1 à 8, dans laquelle l'agent thérapeutique est un photosensibilateur. 10
11. 11. Formulation d'agent thérapeutique selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'elle est fonctionnalisée.
12. 12. Procédé de préparation d'une formulation d'agent thérapeutique sous forme de nanoémulsion selon l'une des revendications 1 à 11, comprenant au 15 moins une phase aqueuse continue et au moins une phase huileuse dispersée, comportant les étapes consistant à : (i) préparer la phase huileuse comprenant au moins un lipide solubilisant, un lipide amphiphile et l'agent thérapeutique ; (ii) préparer une phase aqueuse comprenant un co-tensioactif 20 polyalkoxylé ; (iii) disperser la phase huileuse dans la phase aqueuse sous l'action d'un cisaillement suffisant pour former une nano-émulsion; et (iv) récupérer la nano-émulsion ainsi formée. 25
13. 13. Procédé de préparation selon la revendication 12, dans lequel l'action de cisaillement est exercée par sonification.
14. 14. Procédé de préparation selon la revendication 12 ou 13, dans lequel la phase huileuse est préparée par mise en solution de tout ou partie des 30 constituants dans un solvant approprié et évaporation subséquente du solvant.31 15 Formulation selon l'une des revendications 1 à 11 pour utilisation dans l'administration d'un agent thérapeutique à l'homme ou à l'animal en vue du traitement d'une maladie.