FR2956320A1

FR2956320A1 - Nanoemulsion pour la delivrance d'au moins deux agents d'interet

Info

Publication number: FR2956320A1
Application number: FR1051134A
Authority: FR
Inventors: Thomas Delmas; Anne-Claude Couffin
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2010-02-17
Filing date: 2010-02-17
Publication date: 2011-08-19
Anticipated expiration: 2030-02-17
Also published as: WO2011101602A1; FR2956320B1; US20130251629A1

Abstract

La présente invention concerne une nanoémulsion sous forme de gel comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase huileuse dispersée, dans laquelle : - la phase aqueuse comprend : - au moins un co-tensioactif polyalcoxylé, et - au moins un agent d'intérêt hydrophile, et - la phase huileuse comprend : - au moins un lipide amphiphile, - au moins un lipide solubilisant, - au moins un agent d'intérêt lipophile. Elle a également pour objet un procédé de préparation et l'utilisation de cette nanoémulsion pour la délivrance d'au moins deux agents d'intérêt.

Description

NANOEMULSION POUR LA DELIVRANCE D'AU MOINS DEUX AGENTS D'INTERET

La présente invention concerne une nanoémulsion pour l'administration simultanée d'au moins deux agents d'intérêt de solubilité différente. [Etat de la technique] La nanomédecine constitue un champ nouveau créé par la fusion de la nanotechnologie et de la médecine, et est aujourd'hui l'une des voies les plus prometteuses pour le développement de thérapies ciblées efficaces, notamment pour l'oncologie. En effet, des nanoparticules chargées d'agents d'intérêt constituent une solution idéale pour surmonter la faible sélectivité des médicaments, notamment des médicaments anticancéreux, en permettant grâce à un ciblage passif et/ou actif le ciblage des tissus cancéreux, et ainsi de réduire les effets secondaires sévères.

La demande FR 08 55589 décrit une formulation d'un agent thérapeutique sous forme de nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase huileuse dispersée, dans laquelle la phase aqueuse comporte au moins un co-tensioactif polyalcoxylé et dans laquelle la phase huileuse comprend outre l'agent thérapeutique au moins un lipide amphiphile et au moins un lipide solubilisant consistant en un mélange de glycérides d'acides gras saturés et son utilisation pour l'administration de cet agent thérapeutique, chez l'homme ou chez l'animal. Toutefois, un seul agent thérapeutique est administré. Certains traitements nécessitent l'administration de plusieurs agents d'intérêt, parfois de solubilités différentes, ce qui implique alors plusieurs administrations, une gêne et une perte de temps accrue pour les patients. En outre, il est souvent préférable que les différents agents d'intérêt ne soient pas tous libérés au même moment, voire pas tous au même endroit. Le développement de formulations permettant la délivrance de plusieurs agents d'intérêt est donc souhaitable. [Problème technique] La présente invention concerne une formulation pour la délivrance en une seule application d'au moins un agent d'intérêt hydrophile et d'au moins un agent d'intérêt lipophile. 1 [Résumé de l'invention] La présente invention concerne une nanoémulsion sous forme de gel comprenant au moins un agent d'intérêt hydrophile essentiellement présent dans la phase aqueuse continue et au moins un agent d'intérêt lipophile essentiellement présent dans la phase huileuse dispersée de la nanoémulsion. Ainsi, selon un premier aspect, l'invention concerne une nanoémulsion sous forme de gel comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase huileuse dispersée, dans laquelle : la phase aqueuse comprend : - au moins un co-tensioactif polyalcoxylé, et - au moins un agent d'intérêt hydrophile, et la phase huileuse comprend : - au moins un lipide amphiphile, au moins un lipide solubilisant, - au moins un agent d'intérêt lipophile. De préférence, le lipide amphiphile est un phospholipide. Avantageusement, le lipide solubilisant comprend au moins un glycéride d'acides gras, par exemple un glycéride d'acides gras saturés comportant 12 à 18 atomes de carbone.

La phase huileuse peut comporter en outre au moins une huile, de préférence une huile présentant une balance hydrophile-lipophile (HLB) comprise entre 3 et 10, notamment une huile d'origine naturelle biocompatible, telle que l'huile de soja. De préférence, le co-tensioactif comporte au moins une chaîne composée de motifs d'oxyde d'éthylène ou d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène. Il peut être choisi en particulier parmi les composés conjugués polyéthylèneglycol /phosphatidyléthanolamine (PEG-PE), les éthers d'acide gras et de polyéthylèneglycol, les esters d'acide gras et de polyéthylèneglycol et les copolymères blocs d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène. Les agents d'intérêt peuvent être notamment des agents thérapeutiques, tel que des principes actifs pharmaceutiques ou des photosensibilisateurs. La nanoémulsion selon l'invention permet de fournir en une seule application deux agents d'intérêts ou plus, généralement à des temps de libération différents. Au moins un agent d'intérêt hydrophile est libéré à un temps thydrophile et au moins un agent d'intérêt lipophile est libéré à un temps tiipophile différent de thydrophile.

En effet, l'agent d'intérêt hydrophile est essentiellement situé dans la phase aqueuse continue de la nanoémulsion. Il est piégé entre les gouttelettes de la phase 2 huileuse dispersée. Lorsque la nanoémulsion est administrée, la nanoémulsion entre en contact avec des fluides physiologiques (sang, plasma...) et va alors se désagréger progressivement, c'est-à-dire que le réseau tridimensionnel formé par les gouttelettes de la phase dispersée se désagrège, les gouttelettes s'éloignant les unes des autres, libérant ainsi l'agent d'intérêt hydrophile. Le temps de libération de l'agent d'intérêt hydrophile thydrophile est lié au temps de désintégration du réseau tridimensionnel de la nanoémulsion, c'est-à-dire au temps de libération des gouttelettes tgouttelette, mais aussi au temps de diffusion de l'agent d'intérêt hydrophile à travers la nanoémulsion. Par ailleurs, l'agent d'intérêt lipophile est essentiellement situé dans la phase 1 o huileuse dispersée de la nanoémulsion, soit à l'intérieur des gouttelettes, soit en surface des gouttelettes. Le temps de libération de l'agent d'intérêt lipophile tlipophile est lié au temps de diffusion de l'agent d'intérêt lipophile vers l'extérieur de la gouttelette, au temps de dégradation des gouttelettes et parfois au temps de libération des gouttelettes tgouttelette. Les localisations de libération des agents d'intérêt hydrophiles Lhydrophile et 15 lipophiles 1ùlipophile peuvent également être différentes, notamment lorsque la désintégration de la nanoémulsion liée à la libération de l'agent d'intérêt hydrophile n'a pas lieu au même endroit que la libération de l'agent d'intérêt lipophile hors des gouttelettes. En particulier, lorsque la nanoémulsion se désagrège à l'endroit où elle a été administrée, l'agent d'intérêt hydrophile étant alors libéré à la localisation d'administration et les gouttelettes 20 libérées de la nanoémulsion sont emportées par le fluide physiologique (sang, plasma), vers un autre endroit du sujet, où sera libéré l'agent thérapeutique lipophile. Ainsi, en adaptant la composition de la nanoémulsion selon l'invention (nature des constituants, fraction massique des constituants, taille des gouttelettes...) en fonction des propriétés physicochimiques des agents, comme explicité ci-après, il est 25 avantageusement possible de modifier ces temps de libération thydrophile et tlipophile et localisations Lhydrophile et 1-lipophile. Bien sûr, si la nanoémulsion comporte plus d'un agent d'intérêt hydrophile et/ou plus d'un agent d'intérêt lipophile, il est possible d'adapter la composition de la nanoémulsion pour ajuster les temps de libération de chaque agent, et que ceux-ci 30 diffèrent les uns des autres. On pourra notamment agir sur les paramètres de la composition de la nanoémulsion influençant la diffusion de l'agent d'intérêt à travers le réseau tridimensionnel de la nanoémulsion (pour un agent d'intérêt hydrophile) ou à travers les gouttelettes (pour un agent d'intérêt lipophile) pour que thydrophile 1 diffère de thydrophile 2 et/ou que tljpophjle 1 diffère de tlipophile 2, comme explicité ci-dessous. Les différentes 35 localisations des libérations des agents peuvent également être influencées et différer les unes des autres. 3 Grâce à sa formulation, la nanoémulsion selon l'invention est stable. Les nanoémulsions présentent comme avantage notamment une excellente stabilité au stockage (> 3 mois voire 8 mois). Selon un deuxième aspect, l'invention concerne un procédé de préparation de cette nanoémulsion, comportant les étapes consistant à : (i) préparer la phase huileuse comprenant l'agent d'intérêt lipophile, au moins un lipide amphiphile et au moins un lipide solubilisant; (ii) préparer une phase aqueuse comprenant un co-tensioactif polyalcoxylé et un agent d'intérêt lipophile; (iii) disperser la phase huileuse dans la phase aqueuse sous l'action d'un cisaillement suffisant pour former une nanoémulsion; et (iv) récupérer la nanoémulsion ainsi formé. De préférence, l'action de cisaillement est exercée par sonification. Le procédé de fabrication selon l'invention permet d'obtenir des nanoémulsions comprenant une phase dispersée dont les gouttelettes sont de très faible taille et monodisperse de façon simple, rapide et peu coûteuse. Le procédé peut être facilement réalisé à l'échelle industrielle. Par ailleurs, il n'utilise pas ou très peu de solvants organiques et peut être mis en oeuvre avec des produits autorisés pour un usage chez l'homme. Enfin, il ne nécessite qu'un chauffage modéré et est donc envisageable pour des agents d'intérêt fragiles. Par chauffage modéré, on entend un chauffage à une température inférieure à 80°C, et préférentiellement inférieure à 70°C voire 60°C. Selon un troisième aspect, l'invention concerne une nanoémulsion dans laquelle l'agent d'intérêt hydrophile est un agent thérapeutique hydrophile et l'agent d'intérêt lipophile est un agent thérapeutique lipophile pour son utilisation pour l'administration d'au moins un agent thérapeutique hydrophile et d'au moins un agent thérapeutique lipophile à l'homme ou à l'animal pour traiter ou prévenir une maladie.

[Description de l'invention] [Définitions] La nanoémulsion selon l'invention est sous forme de gel. On entend par le terme « gel »habituellement un système biphasique solide-liquide thermodynamiquement stable, constitué d'un double réseau interpénétré continu tridimensionnel, l'un solide et le second liquide. Un tel gel est un système biphasique liquide-solide dont le réseau solide retient une phase liquide. 4 Bien que les gels puissent être considérés comme solides, ils présentent des propriétés propres aux solides (rigidité structurelle, élasticité à la déformation) comme aux liquides (pression de vapeur, de compressibilité et conductivité électrique). On distingue généralement deux grandes familles de gels: les gels chimiques et les gels physiques. La cohésion des gels dits chimiques est assurée par des liaisons covalentes entre les unités du réseau tridimensionnel. Les gels dits physiques reposent quant à eux sur des interactions plus faibles de type forces de Van der Waals, liaisons hydrogène, interactions électrostatique, rapprochements de zones hydrophobes ou encore des enchevêtrements de chaînes polymériques avec éventuellement des zones 1 o de cristallisation. Dans le cas d'une nanoémulsion sous forme de gel, le réseau tridimensionnel est formé par les gouttelettes les interstices entre gouttelettes étant remplis de phase continue. Les liaisons entre les unités du réseau, à savoir les gouttelettes, reposent généralement sur des interactions non covalentes de type liaison hydrogène, interactions 15 de Van der Waals ou encore interactions électrostatiques (paires d'ions). Ces interactions existent principalement entre les co-tensioactifs de gouttelettes adjacentes. Ces nanoémulsions sous forme de gel peuvent donc être rapprochées des gels physiques. Une nanoémulsion sous forme de gel montre donc une résistance à la pression et est capable de maintenir une forme définie. 20 Pour mettre en évidence que la nanoémulsion est sous forme de gel, on peut réaliser des études rhéologiques permettant d'évaluer les propriétés viscoélastiques, et/ou des études plus structurelles montrant les liaisons entre les gouttelettes formant le réseau tridimensionnel (diffraction aux rayons X, neutrons...). En effet, une nanoémulsion sous forme de gel possède une viscosité et un 25 coefficient d'élasticité plus important qu'une nanoémulsion liquide. La viscosité et le coefficient d'élasticité peuvent être mesurés par un rhéomètre cône-plan ou par un rhéomètre Couette. La viscosité d'une nanoémulsion liquide est généralement inférieure à 1 Poise, voire même souvent inférieure à 0.01 Poise. La nanoémulsion selon l'invention a généralement une viscosité supérieure à 1 poise, et pourra avoir une viscosité allant 30 jusqu'à celle d'un solide (plus de 1000 Poises). La nanoémulsion de la présente invention a généralement une viscosité de 1 à 1000 poises, préférentiellement de 1 à 500 poises et encore plus préférentiellement entre 1 et 200, ces valeurs étant données à 25°C. Une viscosité supérieure à 1 poise est en effet adaptée pour que les gouttelettes de la phase dispersée forment un réseau tridimensionnel à l'intérieur de la phase continue. En effet, il 35 a été constaté que en dessous de 1 poise, les gouttelettes ne sont généralement pas assez proches les unes des autres, l'agent d'intérêt hydrophile n'est pas suffisamment 5 piégé entre les gouttelettes et sa libération hors de la nanoémulsion est trop rapide. Au dessus de 1000 poises, on obtient un système quasi-solide. La nanoémulsion est alors trop visqueuse ce qui rend son utilisation difficile. De même, alors que le coefficient d'élasticité est généralement inférieur à 10 dans le cas d'une nanoémulsion liquide, le coefficient d'élasticité d'une nanoémulsion sous forme de gel est généralement supérieur à 10. Les études structurelles, notamment les diffractions aux rayons X ou aux neutrons, permettent également de différencier l'organisation d'une nanoémulsion liquide, de l'organisation d'une nanoémulsion sous forme de gel. En effet, les pics du diffractogramme obtenu pour une nanoémulsion liquide sont caractéristiques de la structure des gouttelettes de phase dispersée (grand angles de diffraction caractéristiques de distances courtes), alors que les pics du diffractogramme d'une nanoémulsion sous forme de gel sont caractéristiques non seulement de la structure des gouttelettes (grand angles de diffraction caractéristiques de distances courtes) mais aussi de l'organisation de ces gouttelettes en réseau tridimensionnel (faibles angles de diffraction caractéristiques de distances plus grandes). La nanoémulsion selon l'invention est avantageusement sous forme de gel dispersible, c'est-à-dire que les gouttelettes formant le réseau tridimensionnel peuvent être relarguées dans la phase continue sous certaines conditions par « dégélification » du système gel, également dénommée « désagrégation » dans la présente demande. La désagrégation est observée par ajout de phase continue au gel ou par augmentation de la température. En effet, ajouter de la phase continue entraîne une différence de pression osmotique entre l'intérieur du gel et la phase continue. Le système tendra donc à diminuer, jusqu'à annuler, cette différence de pression osmotique en libérant les gouttelettes dans l'excès de phase continue, jusqu'à obtenir une concentration en gouttelettes homogène dans l'ensemble du volume de phase continue. De même augmenter suffisamment la température du système revient à donner aux différentes gouttelettes une énergie thermique supérieure aux énergies mises en jeu dans les liaisons, par exemple les liaisons hydrogène, et ainsi à rompre ces liaisons et libérer les gouttelettes du réseau tridimensionnel. Pour une nanoémulsion sous forme de gel selon la présente invention, des températures de transition sol-gel (passage nanoémulsion sous forme de gel à une nanoémulsion liquide) supérieures à 60°C sont observées. Ces températures dépendent de la composition du gel et plus particulièrement de la taille des gouttelettes et de la longueur des chaînes polyalcoxylées du co-tensioactif. 6 La désagrégation de la nanoémulsion sous forme de gel peut être suivie par diffraction aux rayons X, par calorimétrie différentielle à balayage (DSC) ou par résonance magnétique nucléaire (RMN). En suivant par diffraction aux rayons X la désagrégation de la nanoémulsion sous forme de gel, on observe une évolution du spectrogramme, c'est-à-dire une diminution de l'intensité des angles faibles (caractéristiques de l'organisation des gouttelettes en réseau tridimensionnel) (comme décrit dans Matija Tomsic, Florian Prossnigg, Otto Glatter `Journal of Colloid and Interface Science' Volume 322, Issue 1, 1 June 2008, Pages 41-50). 1 o La désagrégation peut également être suivie par DSC. Un pic apparaît sur le thermogramme lors de la transition nanoémulsion sous forme de gel / nanoémulsion liquide en montée en température. Enfin, une étude RMN peut aussi permettre de suivre la désagrégation par mesure du coefficient de diffusion associé à chaque gouttelette en distinguant une nanoémulsion 15 liquide d'une nanoémulsion sous forme de gel. En effet, le coefficient de diffusion est très significativement diminué dans le cas d'une nanoémulsion sous forme de gel (il est alors généralement inférieur à 0.01 µm2/s), où le système est figé. (WESTRIN B. A.; AXELSSON A.; ZACCHI G. `Diffusion measurement in gels' Journal of controlled release 1994, vol. 30, n°3, pp. 189-199). 20 La phase huileuse dispersée de la nanoémulsion (éventuelle huile/lipide solubilisant/lipide amphiphile/co-tensioactif/agent d'intérêt lipophile) représente entre 30 et 90% en poids par rapport au poids total de la nanoémulsion, c'est-à-dire par rapport au poids des phases aqueuse continue et huileuse dispersée. 25 Le terme « gouttelette » englobe à la fois les gouttelettes d'huile liquide proprement dites ainsi que les particules solides issues d'émulsions de type huile-danseau dans lesquelles la phase huileuse est solide. Les gouttelettes de la nanoémulsion sont avantageusement monodisperses. L'écart type entre les diamètres minimum et maximum des gouttelettes par rapport au 30 diamètre moyen est généralement inférieur ou égal à 30%, de préférence 15%. Le diamètre moyen des gouttelettes de la phase dispersée est de préférence de 20 à 200 nm, notamment de 40 à 150 nm et en particulier de 50 à 120 nm. Ces diamètres sont mesurés par diffusion de la lumière. On peut également obtenir la taille de gouttelettes par microscopie électronique en transmission (TEM), par cryomicroscopie électronique en 35 transmission (cryoTEM) ou encore par microscopie à force atomique (AFM). Des diamètres inférieurs à 20 nm et supérieurs à 200 nm sont difficiles à atteindre en pratique. 7 En effet, plus le diamètre des gouttelettes est faible, plus la surface spécifique des gouttelettes est élevée, plus l'agent d'intérêt hydrophile compris entre les gouttelettes est piégé dans le réseau tridimensionnel de la nanoémulsion et plus le temps de libération de l'agent d'intérêt hydrophile augmente.

La nanoémulsion permet donc une excellente libération de l'agent d'intérêt lipophile dans les cellules, notamment grâce au faible diamètre moyen des gouttelettes de la phase dispersée comprenant l'agent thérapeutique lipophile, qui pénètrent facilement les membranes cellulaires. De plus, la nanoémulsion peut être formulée de manière à ce que la surface de la phase dispersée présente un potentiel zéta faible, idéalement compris entre -25 mV et + 25 mV, voire nul. En effet, les chaînes polyalcoxylées du co-tensioactif, hydratées et non chargées, couvrant la surface des gouttelettes, écrantent les charges apportées par les lipides amphiphiles à la surface solide des gouttelettes (figure 2). On se trouve donc dans le cas d'une stabilisation stérique des gouttelettes, et non une stabilisation électrostatique. Le potentiel zéta est un paramètre clé qui influe sur les interactions avec les milieux biologiques Les nanoparticules possédant une charge de surface très positive, c'est-à-dire supérieure à 25 mV, sont généralement plus cytotoxiques que des nanoparticules de potentiel zeta négatif ou neutre. Le terme « lipide » désigne dans le cadre de cet exposé l'ensemble des corps gras ou des substances contenant des acides gras présents dans les graisses d'origine animales et dans les huiles végétales. Ce sont de molécules hydrophobes ou amphiphiles principalement constituées de carbone, d'hydrogène et d'oxygène et ayant une densité inférieure à celle de l'eau. Les lipides peuvent être à l'état solide à température ambiante (25°C), comme dans les cires, ou liquide, comme dans les huiles. Le terme «amphiphile» désigne une molécule possédant une partie hydrophobe et une partie hydrophile, par exemple une partie apolaire hydrophobe et une partie polaire hydrophile. Le terme « phospholipide » vise des lipides possédant un groupe phosphate, notamment les phosphoglycérides. Le plus souvent, les phospholipides comportent une extrémité hydrophile formée par le groupe phosphate éventuellement substitué et deux extrémités hydrophobes formées par des chaînes d'acides gras. Parmi les phospholipides, on citera en particulier la phosphatidylcholine, la phosphatidyl éthanolamine, la phophatidyl inositol, la phosphatidyl sérine et la sphingomyéline. Le terme « lécithine » désigne la phosphatidylcholine, c'est-à-dire un lipide formé à partir d'une choline, d'un phosphate, d'un glycérol et de deux acides gras. Il couvre de manière plus large les phospholipides extraits du vivant, d'origine végétale ou animale, dans la mesure où ils sont majoritairement constitués de phosphatidylcholine. Ces 8 lécithines constituent généralement des mélanges de lécithines portant différents acides gras. On entend par le terme « acide gras » désigner des acides carboxyliques aliphatiques présentant une chaîne carbonée d'au moins 4 atomes de carbone. Les acides gras naturels possèdent une chaîne carbonée de 4 à 28 atomes de carbone (généralement un nombre pair). On parle d'acide gras à longue chaîne pour une longueur de 14 à 22 carbones et à très longue chaîne s'il y a plus de 22 carbones. On entend par le terme « tensioactif » des composés à structure amphiphile qui leur confère une affinité particulière pour les interfaces de type huile/eau et eau/huile ce 1 o qui leur donne la capacité d'abaisser l'énergie libre de ces interfaces et de stabiliser des systèmes dispersés. On entend par le terme « co-tensioactif » un tensioactif agissant en plus d'un tensioactif pour abaisser davantage l'énergie de l'interface. On entend par le terme « agent d'intérêt », une molécule organique ou inorganique, 15 une macromolécule organique ou inorganique, un composé métallique organique ou inorganique ou un nanocristal organique ou inorganique de diamètre inférieur ou égal à 10 nm ayant une propriété : - thérapeutique (agent thérapeutique), - bactéricide, tel qu'un antibiotique, un antimicrobien, un antiseptique, un 20 antiparasitaire, par exemple des métaux Cu, Zn, Ag sous forme particulaire ou moléculaire, ou encore des molécules organiques telles que les quinolones, les aminosides ou encore les betalactamides. - optique tel que un colorant, un chromophore, un fluorophore, par exemple le perchlorate 1,1'-dioctadecyl 3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine (DiD), le 25 iodure de 1,1'-dioctadecyl 3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyanine (DiR), vert d'indocyanine (ICG) , ou encore des composants ayant des propriétés optoélectronique, tels que les saturants ou les absorbants optiques. - phytosanitaire, tel qu'une substance minérale (ex : sulfate de cuivre) ou organique (ex : carbamate de type carbofuran, furadan... ), naturelle( ex : Bt) ou issue de la 30 chimie de synthèse (ex : glyphosate). - de masquage de goût/odeur, tel qu'une substance gustative et/ou odorante, comme le menthol ou la cinnamaldéhyde, pour un usage pharmaceutique (galénique) ou agroalimentaire. - de catalyse, tel qu'un catalyseur métallique ou organométallique. 35 On entend par le terme « agent thérapeutique » désigner tout composé utile pour le traitement d'une pathologie, qu'il agisse par voie chimique comme les principes actifs 9 pharmaceutiques, par voie physique ou par voie biologique, mais à l'exception des agents de diagnostic. On entend par agent d'intérêt « lipophile », un agent d'intérêt qui se situe majoritairement, de préférence totalement, dans la phase huileuse dispersée, à l'intérieur ou en surface des gouttelettes. Un agent d'intérêt lipophile a des affinités pour des composés huileux (graisses, huiles, cires...) et solvants apolaires (toluène, hexane...). Les forces permettant la solubilisation de l'agent d'intérêt lipophile sont majoritairement des forces de London (interactions de Van der Waals). Un agent d'intérêt lipophile présente un coefficient de partage huile/eau élevé. 1 o On entend par agent d'intérêt « hydrophile », un agent d'intérêt qui se situe majoritairement, de préférence totalement, dans la phase aqueuse continue. Sa solubilité dans l'eau est généralement supérieure à 1% en poids. La solubilisation dans l'eau des agents d'intérêt hydrophile provient généralement de liaisons hydrogène et/ou ioniques entre les agents d'intérêt hydrophile et l'eau. 15 On entend par le terme « ligand biologique » toute molécule qui reconnaît de façon spécifique un récepteur généralement situé à la surface des cellules.

[Nanoémulsion] Selon un premier aspect, l'invention concerne une nanoémulsion sous forme de 20 gel comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase huileuse dispersée, dans laquelle : - la phase aqueuse comprend : - au moins un co-tensioactif polyalcoxylé, et au moins un agent d'intérêt hydrophile, et 25 - la phase huileuse comprend : - au moins un lipide amphiphile, au moins un lipide solubilisant, au moins un agent d'intérêt lipophile. La nanoémulsion est donc une émulsion de type huile dans l'eau. Elle peut être 30 simple ou multiple, notamment en comportant dans la phase dispersée une seconde phase aqueuse. De préférence, les agents d'intérêt sont des agents thérapeutiques. Les agents thérapeutiques susceptibles d'être encapsulés dans la nanoémulsion selon l'invention comprennent en particulier les principes actifs agissant par voie 35 chimique, biologique ou physique. Ainsi, il peut s'agir de principes actifs pharmaceutiques ou d'agents biologiques tels que de l'ADN, des protéines, peptides ou anticorps encore10 des agents utiles pour des thérapies physiques tels que des composés utiles pour la thermothérapie, les composés relarguant de l'oxygène singulet lorsqu'ils sont excités par une lumière utiles pour la photothérapie et des agents radioactifs. De préférence, il s'agit de principes actifs à administrer par voie d'injection.

Le au moins un agent d'intérêt hydrophile est situé dans la phase aqueuse continue. Le au moins un agent d'intérêt lipophile est situé dans la phase huileuse dispersée. Il peut notamment être encapsulé dans les gouttelettes de la phase dispersée ou se situer à l'interface des phases aqueuses et huileuses sur la surface des gouttelettes, selon son affinité lipophile ou amphiphile. Outre la nécessité d'être soluble ou dispersable dans la phase considérée, la nature des agents d'intérêt dans la nanoémulsion n'est pas particulièrement limitée. L'agent d'intérêt hydrophile et/ou lipophile de la nanoémulsion est typiquement un agent thérapeutique hydrophile et/ou lipophile, tel qu'un principe actif pharmaceutique ou un photosensibilateur. Du fait des conditions douces du procédé de préparation, la nanoémulsion décrite est particulièrement intéressante pour des agents d'intérêt qui se dégradent à température élevée. Parmi les principes actifs pharmaceutiques intéressants comme agents thérapeutiques, on peut citer en particulier les agents utilisés dans le traitement du SIDA, les agents utilisés dans le traitement des maladies cardiaques, les analgésiques, les anesthésiques, les anorexigènes, les anthelmintiques, les antiallergiques, les antiangineux, les antiarythmisants, les anticholinergiques, les anticoagulants, les antidépresseurs, les antidiabétiques, les antidiurétiques, les antiémétiques, les anticonvulsivants, les antifongiques, les antihistaminiques, les antihypertenseurs, les anti-inflammatoires, les anti-migraineux, les antimuscariniques, les antimycobactériens, les anticancéreux y compris les antiparkinsoniens, les antithyroïdiens, les antiviraux, les astringents, les agents bloquants, les produits sanguins, les substituts sanguins, les agents inotropes cardiaques, les agents cardiovasculaires, les agents du système nerveux central, les chélateurs, les agents de chimiothérapie, les facteurs de croissance hématopoïétiques, les corticostéroïdes, les antitussifs, les agents dermatologiques, les diurétiques, les dopaminergiques, les inhibiteurs de l'élastase, les agents endocrines, les alkaloïdes de l'ergot, les expectorants, les agents gastro-intestinaux, les agents génito-urinaires, le facteur de déclenchement de l'hormone de croissance, les hormones de croissance, les agents hématologiques, les agents hématopoïétiques, les hemostatiques, les hormones, les agents immunologiques, les immunosuppresseurs, les interleukines, 11 les analogues d'interleukines, les agents de régulation des lipides, la gonadolibérine, les myorelaxants, les antagonistes narcotiques, les nutriments, les agents nutritifs, les thérapies oncologiques, les nitrates organiques, les vagomimétiques, les prostaglandines, les antibiotiques, les agents rénaux, les agents respiratoires, les sédatifs, les hormones sexuelles, les stimulants, les sympathomimétiques, les anti-infectieux systémiques, le tacrolimus, les agents thrombolytiques, les agents thyroïdiens, les traitements pour les troubles de l'attention, les vaccins, les vasodilatateurs, les xanthines, les agents diminuant le cholestérol, les cicatrisants. Particulièrement visés sont les anticancéreux tels que le paclitaxel, la doxorubicine et le cisplatine. 1 o Parmi les agents physiques, on peut citer notamment les isotopes radioactifs et les photo-sensibilisateurs. Parmi les photo-sensibilisateurs, on peut citer notamment ceux appartenant à la classe des tétrapyrroles comme les porphyrines, les bactériochlorines, les phtalocyanines, les chlorines, les purpurines, les porphycènes, les phéophorbides, ou encore ceux 15 appartenant à la classe des texaphyrines ou des hypericines. On peut également citer les dérivés de l'acide 5-aminolévulique et ses dérivés d'esters, ces composants étant connus comme précurseurs métabolique de la Protoporphyrine IX. Parmi les photo-sensibilisateurs de première génération, on peut mentionner l'hémato-porphyrine et un mélange de dérivés d'hémato-porphyrine (HpD) (vendu sous la marque commerciale 20 Photofrin® par Axcan Pharma). Parmi les photo-sensibilisateurs de seconde génération, on peut mentionner le méta-tetra-hydroxyphenyl chlorine (mTHPC ; nom commercial Foscan®, Biolitec AG) et le dérivé monoacide du cycle A de la benzoporphyrine (BPD-MA vendu sous la marque commerciale Visudyne® par QLT et Novartis Opthalmics). Les formulations des photo-sensibilisateurs de seconde génération qui associent à ces photo- 25 sensibilisateurs une molécule (lipide, peptide, sucre etc..) qualifiée de transporteur qui permet leur acheminement sélectif au niveau du tissu tumoral sont appelées photo-sensibilisateurs de troisième génération. Parmi les agents biologiques, on peut mentionner les oligonucléotides, de l'ADN, de l'ARN, les SiRNA, les microRNA, les peptides et les protéines. 30 Bien entendu, les agents thérapeutiques peuvent être formulés directement sous leur forme active ou sous forme de prodrug. Les quantités d'agent d'intérêt dépendent de l'application visée ainsi que de la nature des agents. Toutefois, lorsque les agents d'intérêt sont des agents thérapeutiques, on cherchera généralement à formuler la nanoémulsion avec une concentration maximale 35 en agent d'intérêt, afin de limiter le volume et/ou la durée d'application, notamment le volume et/ou la durée d'administration au patient. 12 Or, il a été constaté que la présence du lipide solubilisant dans la phase huileuse permet d'incorporer une quantité importante d'agent d'intérêt. Le lipide solubilisant facilite en effet l'incorporation dans le coeur des gouttelettes des agents d'intérêt liposolubles. Les agents d'intérêt amphiphiles sont principalement incorporés dans la membrane des gouttelettes. La formulation selon l'invention contiendra le plus souvent une quantité de 0,001 à 30% en poids, de préférence 0,01 à 20% en poids, et encore préférée 0,1 à 10% en poids d'agents d'intérêt. Selon l'invention, la phase huileuse de la nanoémulsion comporte au moins un lipide amphiphile et au moins un lipide solubilisant. Afin de former une nanoémulsion stable, il est généralement nécessaire d'inclure dans la nanoémulsion au moins un lipide amphiphile à titre de tensioactif. La nature amphiphile du tensioactif assure la stabilisation des gouttelettes d'huile au sein de la phase continue aqueuse.

Les lipides amphiphiles comportent une partie hydrophile et une partie lipophile. Ils sont généralement choisis parmi les composés dont la partie lipophile comprend une chaîne saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, ayant de 8 à 30 atomes de carbone. Ils peuvent être choisis parmi les phospholipides, les cholestérols, les lysolipides, les sphingomyélines, les tocophérols (non estérifiés), les glucolipides, stéarylamines, les cardiolipines d'origine naturelle ou synthétique ; les molécules composées d'un acide gras couplé à un groupement hydrophile par une fonction éther ou ester tels que les esters de sorbitan comme par exemple les monooléate et monolaurate de sorbitan vendus sous les dénominations Span® par la société Sigma; les lipides polymérisés ; les lipides conjugués à de courtes chaînes d'oxyde de polyéthylène (PEG) tels que les tensioactifs non- ioniques vendus sous les dénominations commerciales Tween® par la société ICI Americas, Inc. et Triton® par la société Union Carbide Corp.; les esters de sucre tels que les mono- et di-laurate, mono- et di-palmitate, mono- et distéarate de saccharose; lesdits tensioactifs pouvant être utilisés seuls ou en mélanges. Les phospholipides sont des lipides amphiphiles particulièrement préférés, notamment les phospholipides choisies parmi la phosphatidylcholine, la phosphatidylethanolamine, la phosphatidylsérine, le phosphatidylglycérol, le phosphatidylinositol, le phosphatidyl-acide phosphatidique non-hydrogéné ou hydrogéné, notamment vendu par la société Lipoid. La lécithine est le lipide amphiphile préféré. 13 Généralement, la phase huileuse comportera de 0.01 à 99% en poids, de préférence de 5 à 75% en poids, en particulier de 10 à 60% et tout particulièrement de 20 à 45% en poids de lipide amphiphile. La quantité de lipide amphiphile contribue avantageusement à contrôler la taille de la phase dispersée de la nanoémulsion obtenue. L'émulsion selon l'invention comprend par ailleurs un lipide solubilisant. Ce composé a pour mission principale de solubiliser l'agent d'intérêt lipophile. L'utilisation d'un lipide solubilisant permet aussi d'augmenter la stabilité physicochimique de la nanoémulsion et d'améliorer le contrôle du relargage des agents d'intérêt lipophiles 1 o encapsulés dans les gouttelettes. De préférence, le lipide solubilisant est solide à température ambiante (20°C). Le liquide solubilisant peut notamment être constitué de dérivés du glycérol, et en particulier de glycérides obtenues par estérification de glycérol avec des acides gras, notamment dans le cas où le lipide amphiphile est un phospholipide. 15 Les lipides solubilisants préférés, en particulier pour les phospholipides, sont les glycérides d'acides gras, notamment d'acides gras saturés, et en particulier d'acides gras saturés comportant 8 à 18 atomes de carbone, encore préféré 12 à 18 atomes de carbone. Avantageusement, le lipide solubilisant est constitué d'un mélange complexe de différents glycérides. Par « mélange complexe », on entend un mélange de mono, di et 20 triglycérides, comprenant des chaînes grasses de différentes longueurs, les dites longueurs s'étendant préférentiellement de C8 à C18, par exemple, en association, des chaînes en C8, C10, C12, C14, C16 et C18, ou de C10 à C18, comprenant par exemple en association, chaînes en C10, C12, C14, C16 et C18. Selon un mode de réalisation, lesdites chaînes grasses peuvent contenir une ou 25 plusieurs insaturations. De préférence, le lipide solubilisant est constitué d'un mélange de glycérides d'acides gras saturés comportant au moins 10% en poids d'acides gras en C12, au moins 5% en poids d'acides gras en C14, au moins 5% en poids d'acides gras en C16 et au moins 5% en poids d'acides gras en C18. 30 De préférence, le lipide solubilisant est constitué d'un mélange de glycérides d'acides gras saturés comportant 0% à 20% en poids d'acides gras en C8, 0% à 20% en poids d'acides gras en C10, 10% à 70% en poids d'acides gras en C12, 5% à 30% en poids d'acides gras en C14, 5% à 30% en poids d'acides gras en C16 et 5% à 30% en poids d'acides gras en C18. 35 Les mélanges des glycérides semi-synthétiques solides à température ambiante vendus sous la dénomination commerciale Suppocire®NC par la société Gattefossé et 14 approuvé pour un usage chez l'homme sont des lipides solubilisants particulièrement préférés. Les Suppocire® de type N sont obtenues par estérification directe d'acides gras et de glycérol. Il s'agit de glycérides hémi-synthétiques d'acides gras saturés de C8 à C18, donc la composition quali-quantitative est indiquée dans le tableau ci-dessous.

Tableau 1 : Composition en acides gras du Suppocire® NC de Gattefossé Longueur de chaînes [% en poids] C8 0,1 à 0,9 C10 0,1 à 0,9 C12 25à50 C14 10 à 24,9 C16 10 à 24,9 C18 10 à 24,9 Les lipides solubilisants précités permettent d'obtenir une nanoémulsion avantageusement stable. Sans vouloir être lié à une théorie particulière, il est supposé que les lipides solubilisants précités permettent d'obtenir des gouttelettes dans la nanoémulsion présentant un coeur amorphe. Le coeur ainsi obtenu présente une viscosité interne élevée sans pour autant présenter de cristallinité. Or, la cristallisation est néfaste pour la stabilité de la nanoémulsion car elle conduit généralement à une agrégation des gouttelettes et/ou à une expulsion de l'agent d'intérêt lipophile à l'extérieur des gouttelettes. Ces propriétés physiques favorisent la stabilité physique de la nanoémulsion. La quantité de lipide solubilisant peut varier largement en fonction de la nature et de la quantité de lipide amphiphile présent dans la phase huileuse. Généralement, la phase huileuse comportera de 1 à 99% en poids, de préférence de 5 à 80% en poids et tout particulièrement de 30 à 75% en poids de lipide solubilisant. La phase huileuse peut comporter par ailleurs une ou plusieurs autres huiles. Les huiles utilisées présentent de préférence une balance hydrophile-lipophile (HLB) inférieure à 10 et encore plus préférentiellement comprise entre 3 et 9 Avantageusement, les huiles sont utilisées sans modification chimique ou physique préalablement à la formation de l'émulsion. Selon les applications envisagées, les huiles peuvent être choisies parmi les huiles biocompatibles, et en particulier parmi les huiles d'origine naturelle (végétale ou animale) ou synthétique. Parmi de telles huiles, on peut notamment citer les huiles d'origine naturelle végétale parmi lesquelles figurent notamment les huiles de soja, de lin, de palme, d'arachide, d'olives, de sésame, de pépin de raisins et de tournesol ; les huiles synthétiques parmi lesquelles figurent notamment les triglycérides, di glycérides et les 15 mono glycérides. Ces huiles peuvent être de premières expressions, raffinées ou inter-estérifiées. L'huile préférée est l'huile de soja. Généralement, si présente, l'huile sera contenue dans la phase huileuse dans une proportion allant de 1 à 80% en poids, de préférence entre 5 et 50 % en poids et tout particulièrement 10 à 30% en poids par rapport au poids total de la phase huileuse. Par ailleurs, la phase huileuse peut également comporter des agents d'imagerie, notamment pour l'IRM (imagerie par résonance magnétique), le PET (en anglais Positron Emission Tomography), le SPECT (Single Photon Emission Computed Tomography), l'échographie ultrasonore, la radiographie, la tomographie X et l'imagerie optique (fluorescence, bioluminescence, diffusion...). La phase aqueuse mise en oeuvre dans le procédé selon l'invention est de préférence constituée d'eau et/ou d'un tampon tel qu'un tampon phosphate comme par exemple du PBS ("Phosphate Buffer Saline") ou d'une solution saline, notamment de chlorure de sodium. Généralement, le pH de la phase aqueuse est de l'ordre du pH physiologique. La phase aqueuse comporte au moins un agent d'intérêt hydrophile et au moins un co-tensioactif polyalcoxylé. Ce co-tensioactif permet de stabiliser la nanoémulsion. Les co-tensioactifs utilisables dans les nanoémulsions selon la présente invention sont de préférence des co-tensioactifs hydrophiles. Les co-tensioactifs comportent de préférence au moins une chaîne polyalcoxylée composée de motifs d'oxyde d'éthylène (PEO ou PEG) ou d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène. Dans la nanoémulsion, les chaînes polyalcoxylées du co-tensioactif sont situées majoritairement à la surface des gouttelettes et s'orientent vers l'extérieur de la gouttelette. Des interactions par liaisons hydrogène existent : d'une part entre les chaines polyalcoxylée des co-tensioactifs et l'eau de la phase aqueuse continue, ces interactions favorisant la dispersion des gouttelettes et la désagrégation de la nanoémulsion, et - d'autre part entre chaines polyalcoxylée des co-tensioactifs de gouttelettes adjacentes, ces interactions favorisant la cohésion de la nanoémulsion. La chaîne polyalcoxylée du co-tensioactif de la nanoémulsion comprend généralement de 10 à 200, notamment de 20 à 100, de préférence de 30 à 80, motifs oxyde d'éthylène/oxyde de propylène. En dessous de 10 motifs, la nanoémulsion est inhomogène car la phase dispersée comprend des gouttelettes polydisperses, ne permettant pas le contrôle du temps de libération de l'agent d'intérêt lipophile. Au-delà de 16 200 motifs, d'une part la nanoémulsion est inhomogène car la phase dispersée comprend des gouttelettes polydisperses, ne permettant pas le contrôle du temps de libération de l'agent d'intérêt lipophile, d'autre part le temps de libération de l'agent d'intérêt lipophile est très court et l'administration d'une telle nanoémulsion n'est donc pas intéressante.

A titre d'exemple de co-tensioactifs, on peut en particulier citer les composés conjugués à base de polyéthylèneglycol/phosphatidyl-éthanolamine (PEG-PE), les éthers d'acide gras et de polyéthylèneglycol tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Brij® (par exemple Brij® 35, 58, 78 ou 98) par la société ICI Americas Inc., les esters d'acide gras et de polyéthylèneglycol tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Myrj® par la société ICI Americas Inc. (par exemple Myrj® s20, s40 ou s100, anciennemnent nommés 49, 52 ou 59) et les copolymères blocs d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Pluronic® par la société BASF AG (par exemple Pluronic® F68, F127, L64, L61, 10R4, 17R2, 17R4, 25R2 ou 25R4) ou les produits vendus sous la dénomination commerciale Synperonic® par la société Unichema Chemie BV (par exemple Synperonic® PE/F68, PE/L61 ou PE/L64). La phase aqueuse comporte de 0.01 à 50% en poids, de préférence de 1 à 30% en poids et tout particulièrement de 5 à 20% en poids de co-tensioactif. Généralement, la fraction massique de l'ensemble [co-tensioactif/lipide amphiphile] par rapport au poids total du coeur des gouttelettes [huile éventuelle/lipide solubilisant/ cotensioactif/lipide amphiphile/agent(s) d'intérêt lipophile(s)] est inférieur ou égal 2, de préférence inférieure ou égale à 1. Ceci permet d'obtenir un système physiquement stable, ne subissant pas les effets de la destabilisation due au mûrissement d'Ostwald ou à la coalescence (séparation des phases aqueuse et huileuse) Généralement, la fraction massique de lipide amphiphile par rapport au poids de cotensioactif est de 0,005 % à 10 %, notamment de 0,01 % à 2 %, de préférence de 0,1 0/0 à 0,6 %. En effet, en dessous de 0,005 % et au delà de 10 %, les gouttelettes de la phase dispersée ne sont souvent pas suffisamment stables et coalescent en quelques heures et il est souvent difficile d'obtenir des gouttelettes de diamètre inférieur à 200 nm.

Généralement, la nanoémulsion ne comporte pas de tensioactifs supplémentaires : les seuls tensioactifs de la nanoémulsion sont le lipide amphiphile et le co-tensioactif. De même, la viscosité du système est conférée directement par les composants de la nanoémulsion et il n'est généralement pas nécessaire des agents rhéoépaississants supplémentaires dans la phase continue.

Dans un mode de réalisation, le co-tensioactif polyalcoxylé comporte un groupe terminal capable de former des liaisons non covalentes, par exemple une liaison 17 hydrogène, hydrophobe (interaction de Van der Waals) ou électrostatique, notamment ionique. De préférence le co-tensioactif polyalcoxylé comporte un groupe terminal capable de former des liaisons hydrogène.

Par « terminal », on entend que le groupe se situe à une extrémité de la ou des chaînes polyalcoxylée(s) du co-tensioactif. Le groupe capable de former des liaisons hydrogène avec l'eau est un groupe comprenant un ou plusieurs hydrogène acide, par exemple les hydrogènes d'une fonction amine ou alcool, et/ou une plusieurs groupes accepteur d'hydrogène acide, tel qu'un atome de fluor, d'oxygène, de soufre ou d'azote. 1 o Typiquement, le groupe terminal de la chaîne polyalcoxylée du co-tensioactif est un groupe hydroxyle. Un co-tensioactif polyalcoxylé comportant un autre groupe terminal, tel qu'un groupe N-hydroxysuccinimide, maléimide, -NH2, -0O0H ou ûSH, peut être utilisé. Par exemple, des co-tensioactif de formule : DSPE-PEG-X 15 dans laquelle DSPE représente un distéarylphosphatidyléthanolamine, PEG représente une chaîne poly(oxyde d'éthylène), comportant généralement de 10 à 200 motifs oxyéthylène, de préférence de 20 à 100 motifs oxyéthylène, et X représente un groupe choisi parmi un groupe N-hydroxysuccinimide, maléimide, -OH, -NH2, -0O0H ou ûSH, de préférence N-hydroxysuccinimide ou maléimide (figure 2). Ce groupe capable de former 20 des liaisons hydrogène favorise les interactions par liaisons hydrogène entre chaines polyalcoxylée des co-tensioactifs de gouttelettes adjacentes, et favorise la cohésion de la nanoémulsion. Les temps de libération des agents d'intérêt hydrophile et lipophile sont donc augmentés. Dans un mode de réalisation, le co-tensioactif polyalcoxylé comporte un composé 25 d'intérêt greffé. Typiquement, le composé d'intérêt a été greffé par liaison chimique, généralement covalente, au co-tensioactif tel que défini ci-dessus. Le greffage peut être réalisé avant ou après la formation de la nanoémulsion. Le dernier cas peut être préconisé lorsque les réactions chimiques employées sont compatibles avec la stabilité de la nanoémulsion, notamment en termes de pH. De préférence, le pH lors de la réaction 30 de greffage est compris entre 5 et 11. Généralement, ce greffage a été effectué à une extrémité de la ou des chaînes polyalcoxylée(s) du co-tensioactif, et le composé d'intérêt est ainsi situé à la surface des gouttelettes de la phase huileuse dispersée de la nanoémulsion. Les composés d'intérêt peuvent être par exemple : 35 - des ligands biologiques de ciblage tels que des anticorps, peptides, saccharides, aptamères, oligonucléotides ou des composés comme l'acide folique ; lors de la 18 libération des gouttelettes de la nanoémulsion, ce ligand biologique sera reconnu de manière spécifique par certaines cellules (par exemple de cellules tumorales comme décrit par exemple dans l'article de S. Achilefu, Technology in Cancer Research & Treatment, 2004, 3, 393-408) ou de certains organes que l'on souhaite cibler, ce qui permet de contrôler la localisation de la libération de l'agent d'intérêt lipophile ; un agent de furtivité : une entité ajoutée afin de conférer à la nanoémulsion une furtivité vis-à-vis du système immunitaire, d'augmenter son temps de circulation dans l'organisme, et de ralentir son élimination. Selon un mode de réalisation préféré, la phase continue comporte également un 1 o agent épaississant tel qu'un glycérol, un saccharide, oligosaccharide ou polysaccharide, une gomme ou encore une protéine, de préférence du glycérol. En effet, l'utilisation d'une phase continue de viscosité plus élevée facilite l'émulsification et permet de ce fait de réduire le temps de sonication. La phase aqueuse comporte avantageusement de 0 à 50% en poids, de préférence 15 de 1 à 30% en poids et tout particulièrement de 5 à 20% en poids d'agent épaississant. Bien entendu, la phase aqueuse peut contenir en outre d'autres additifs tels que des colorants, stabilisants et conservateurs en quantité appropriée. La phase huileuse dispersée de la nanoémulsion (éventuelle huile/lipide solubilisant/lipide amphiphile/co-tensioactif/agent d'intérêt lipophile) représente entre 30 et 20 90% en poids, notamment entre 35 et 65% en poids, de préférence entre 45 et 64% en poids par rapport au poids total de la nanoémulsion, c'est-à-dire par rapport au poids des phases aqueuse continue et huileuse dispersée. La formation d'une nanoémulsion dépend bien sûr de la composition des phases aqueuse et huileuse. Toutefois, pour la plupart des compositions en phases aqueuse/huileuse (mais pas pour toutes), il est 25 difficile d'obtenir une nanoémulsion sous forme de gel lorsque la phase huileuse dispersée représente moins de 30% en poids. De plus, plus la fraction massique en phase huileuse dispersée augmente, plus la viscosité de la nanoémulsion augmente. Il a en effet été constaté qu'augmenter la fraction massique de phase dispersée revient à augmenter la densité des gouttelettes, favorisant ainsi le rapprochement entre 30 gouttelettes et donc les interactions entre-elles. Des fractions massiques en phase huileuse inférieures à 90%, voire inférieures à 65%, sont préférées. Généralement, une augmentation de la fraction massique en phase huileuse dispersée est corrélée à une augmentation du diamètre des gouttelettes de la phase dispersée.

35 [Procédé de préparation] 19 La nanoémulsion telle que décrite peut être préparée aisément par dispersion de quantités appropriées de phase huileuse et de phase aqueuse sous l'effet d'un cisaillement. Ainsi, l'invention concerne un procédé de préparation de la nanoémulsion précitée, comportant les étapes consistant à : (i) préparer la phase huileuse comprenant l'agent d'intérêt lipophile, au moins un lipide amphiphile et au moins un lipide solubilisant; (ii) préparer une phase aqueuse comprenant un co-tensioactif polyalcoxylé et un agent d'intérêt lipophile; (iii) disperser la phase huileuse dans la phase aqueuse sous l'action d'un cisaillement suffisant pour former une nanoémulsion; et (iv) récupérer la nanoémulsion ainsi formé. Ce procédé permet avantageusement la fabrication directe d'une nanoémulsion sous forme de gel sans nécessiter, à la suite de l'étape de dispersion décrite dans l'étape (iii) ci-dessus, une étape intermédiaire de concentration ou d'ajout d'agent rhéoépaississant Dans le cadre du procédé selon l'invention, on mélange d'abord les différents constituants huileux et l'agent d'intérêt lipophile pour préparer un pré-mélange huileux pour la phase dispersée de la nanoémulsion. Le mélange des différents constituants huileux et de l'agent d'intérêt lipophile peut éventuellement être facilité par mise en solution d'un des constituants ou du mélange complet dans un solvant organique approprié et évaporation subséquente du solvant, pour obtenir un pré-mélange huileux homogène pour la phase dispersée. Le choix du solvant organique dépend de la solubilité de chaque agent d'intérêt lipophile. Les solvants employés peuvent être par exemple le méthanol, l'éthanol, le chloroforme, le dichlorométhane, l'hexane, le cyclohexane, le DMSO, le DMF ou encore le toluène. Lorsqu'il s'agit d'une émulsion pour l'administration d'agents thérapeutiques, il s'agit de préférence de solvants organiques volatils et/ou non toxiques pour l'homme. Par ailleurs, il est préféré de réaliser le pré-mélange à une température à laquelle l'ensemble des ingrédients est liquide. Avantageusement, la phase huileuse est dispersée dans la phase aqueuse à l'état liquide. Si l'une des phases se solidifie à température ambiante, il est préférable de réaliser le mélange avec l'une ou de préférence les deux phases chauffées à une température supérieure ou égale à la température de fusion, les deux phases étant chauffées à une température de préférence inférieure à 80°C, et encore préférentiellement inférieure à 70°C, et encore préférentiellement inférieure à 60°C. 20 L'émulsification sous l'effet de cisaillement est de préférence réalisée à l'aide d'un sonificateur ou d'un microfluidiseur. De préférence, la phase aqueuse puis la phase huileuse sont introduites dans les proportions souhaitées dans un récipient cylindrique approprié puis le sonificateur est plongé dans le milieu et mis en marche pendant une durée suffisante pour obtenir une nanoémulsion, le plus souvent quelques minutes. On obtient alors une nanoémulsion homogène dans laquelle le diamètre moyen des gouttelettes est supérieur à 20 nm et inférieur à 200 nm, notamment de 50 à 120 nm. De préférence, le potentiel zêta de la nanoémulsion est inférieur à 25 mV en valeur absolue, c'es-à-dire compris entre --25mV et 25 mV. 1 o Avant conditionnement, l'émulsion peut être diluée et/ou stérilisée, par exemple par filtration ou dialyse. Cette étape permet d'éliminer les éventuels agrégats qui pourraient s'être formés au cours de la préparation de l'émulsion. La nanoémulsion ainsi obtenue est prête à l'emploi, le cas échéant après dilution.

15 [Utilisation de la nanoémulsion] Selon un troisième aspect, l'invention concerne la nanoémulsion précitée dans laquelle l'agent d'intérêt hydrophile est un agent thérapeutique hydrophile et l'agent d'intérêt lipophile est un agent thérapeutique lipophile, pour son utilisation pour l'administration d'au moins un agent thérapeutique hydrophile et d'au moins un agent 20 thérapeutique lipophile à l'homme ou à l'animal pour traiter ou prévenir une maladie. Comme la nanoémulsion peut être préparé exclusivement à partir de constituants approuvés pour l'homme, il est particulièrement intéressant pour une administration par voie parentérale. Cependant, il est également possible d'envisager une administration par d'autres voies, notamment par voie orale ou par voie topique. 25 Les temps de libération de l'agent thérapeutique hydrophile thydrophile et de libération de l'agent thérapeutique lipophile tiipophiie sont liés au temps de libération des gouttelettes tgouttelette, qui correspond au temps de désintégration du réseau tridimensionnel de la nanoémulsion. Le temps de libération de l'agent thérapeutique hydrophile thydrophile est lié au temps 30 de désintégration du réseau tridimensionnel de la nanoémulsion, c'est-à-dire au temps de libération des gouttelettes tgouttelette, mais aussi au temps de diffusion de l'agent thérapeutique hydrophile à travers la nanoémulsion. Le temps de libération de l'agent thérapeutique hydrophile thydrophile dépend de la composition de la nanoémulsion, en particulier: 35 - de la fraction massique de la phase huileuse dispersée par rapport au poids total de la nanoémulsion, 21 du nombre d'unités alcoxylées du co-tensioactif alcoxylé (et donc de la longueur de la chaîne alcoxylée du co-tensioactif alcoxylé), du diamètre des gouttelettes, et/ou de la présence de groupes capables de former des liaisons hydrogène avec l'eau sur le co-tensioactif polyalcoxylé. Le temps de libération de l'agent thérapeutique lipophile tiipophiie est lié au temps de diffusion de l'agent thérapeutique lipophile vers l'extérieur de la gouttelette et au temps de libération des gouttelettes tgouttelette• Le temps de libération de l'agent thérapeutique lipophile tiipophiie dépend : 1 o du diamètre moyen des gouttelettes, comme décrit notamment dans Williams, Y. et al. Small (2009); 5(22):2581-8, Choi, H. S. et al. Nanoletters (2009) 9(6):2354-9 et Massignani, M. et al. Small. (2009) 5(21):2424-32. Les gouttelettes de la nanoémulsion selon l'invention sont avantageusement monodisperses pour permettre une libération homogène dans le temps de l'agent thérapeutique lipophile. 15 de la nature des composants de la phase huileuse, notamment du lipide solubilisant, des caractéristiques physicochimiques de l'agent thérapeutique lipophile (Nel, A. E. et al. Nature Materials 8 (2009) pp543-557), notamment de son log P, qui influe sur la localisation de l'agent thérapeutique lipophile à l'intérieur ou en surface de la gouttelette. 20 Un agent thérapeutique très lipophile reste dans la gouttelette et n'est libéré que lorsque celle-ci est dégradée par dégradation chimique (par hydrolyse des composants des gouttelettes suite à une augmentation ou diminution importante du milieu, par exemple si les gouttelettes sont internalisées à l'intérieur des cellules en passant par les lysosomes) ou par dégradation enzymatique par des lipases (Olbrich, C. et al. International Journal of 25 Pharmaceutics 237 (2002) pp 119-128 et Olbrich, C. International Journal of Pharmaceutics 180 (1999) pp31-39). Généralement, le temps de l'agent thérapeutique hydrophile thydrophile est inférieur au temps de libération de l'agent thérapeutique lipophile tiipophile• La localisation de la libération de l'agent thérapeutique hydrophile Lhydrophile est 30 généralement la localisation d'administration de la nanoémulsion. La localisation de la libération de l'agent thérapeutique lipophile Liipophiie est soit la localisation d'administration (dans ce cas, Lhydrophile et Llipophile sont généralement identiques), soit un autre endroit du corps de l'homme / de l'animal, notamment lorsque les gouttelettes libérées de la nanoémulsion sont emportées par le fluide physiologique 35 (liquide interstitiel, liquide lymphatique, sang) vers un autre endroit, ce qui est généralement observé lorsque les gouttelettes de la phase dispersée de la nanoémulsion 22 ont un diamètre inférieur à 150 nm. Bien sûr, la localisation de la libération de l'agent thérapeutique lipophile dépend également des propriétés physicochimiques de la zone d'administration de la nanoémulsion, notamment de la densité des tissus et de la présence ou non de barrières physiologiques, et de la nature et des propriétés physicochimiques de l'agent thérapeutique lipophile lui même. Ainsi, lorsque plus d'un agent thérapeutique lipophile est utilisé dans la nanoémulsion, chaque agent thérapeutique lipophile a une localisation de la libération qui lui est propre. Il est notamment possible de moduler Liipophile en utilisant dans la nanoémulsion un co- l o tensioactif polyalcoxylé comporte un ligand biologique de ciblage greffé, qui va permettre que les gouttelettes, et donc l'agent thérapeutique lipophile, soient dirigées vers la cible désirée. La nanoémulsion selon l'invention a donc de nombreuses applications. Par exemple, un des agents thérapeutique peut être un principe actif 15 pharmaceutique pour le traitement de la maladie visée, et l'autre peut être un agent thérapeutique permettant de diminuer les effets secondaires, notamment ceux associés audit principe actif pharmaceutique. Une nanoémulsion selon l'invention dans laquelle l'agent thérapeutique hydrophile est un agent cicatrisant, antibactérien ou anti-inflammatoire et l'agent thérapeutique 20 lipophile est un anticancéreux peut notamment être utilisé pour le traitement post-exérèse d'une tumeur. Cette nanoémulsion est appliquée suite à une opération d'exérèse de tumeur sur le site d'excision de la tumeur. L'agent thérapeutique cicatrisant, antibactérien ou anti-inflammatoire hydrophile est libéré rapidement pour diminuer les effets secondaires de l'exérèse et favoriser la 25 cicatrisation. L'agent thérapeutique anticancéreux lipophile est libéré plus tardivement, généralement durant les premières heures suivant l'application de la nanoémulsion, et traite les amas de cellules tumorales restants n'ayant pas été excisés. Il est en effet souvent difficile de curer complètement l'ensemble de la tumeur lors de l'exérèse. La 30 nanoémulsion permet ainsi un traitement complet de la zone tumorale. Les gouttelettes comprenant l'agent anticancéreux lipophile de la phase dispersée peuvent également rejoindre la circulation lymphatique et sanguine et traiter les éventuelles cellules cancéreuses circulant dans le système circulatoire et étant à l'origine de métastases. 23 En particulier, le co-tensioactif de la nanoémulsion peut comporter un ligand biologique de ciblage des cellules cancéreuses pour pouvoir cibler plus efficacement les cellules cancéreuses. De plus, une nanoémulsion selon l'invention dans laquelle l'agent thérapeutique hydrophile est un agent stimulant le système immunitaire et l'agent thérapeutique lipophile est un anticancéreux peut notamment être utilisé pour le traitement post-cryogénie d'une tumeur. La cryogénie de tumeur consiste en l'injection d'un liquide cryogénique dans un tumeur à l'aide d'une seringue. Les cellules tumorales sont tuées par ce traitement, et 1 o restent à l'intérieur du corps du sujet traité. La nanoémulsion précitée peut augmenter l'efficacité du traitement. L'agent hydrophile stimulant le système immunitaire est libéré rapidement pour activer le système immunitaire et l'agent anticancéreux lipophile est libéré plus tardivement, et permet d'éliminer les cellules tumorales encore vivantes. Là encore, les gouttelettes comprenant 15 l'agent anticancéreux lipophile de la phase dispersée peuvent rejoindre la circulation lymphatique et sanguine et traiter les éventuelles cellules cancéreuses circulant dans le système circulatoire et étant à l'origine de métastases. De plus, le co-tensioactif de la nanoémulsion peut comporter un ligand biologique de ciblage des cellules cancéreuses pour pouvoir cibler plus efficacement les cellules cancéreuses. 20 L'administration de la nanoémulsion peut être effectuée selon toute méthode connue. Par exemple, la nanoémulsion peut être administré par l'intermédiaire d'une seringue ou d'un timbre transdermique (« patch » en anglais), cette formulation étant particulièrement adaptée car la nanoémulsion présente un caractère collant. Après diffusion dans la peau de l'agent thérapeutique hydrophile puis des gouttelettes de la phase dispersée, la 25 nanoémulsion perd ce caractère et le timbre transdermique comprenant la nanoémulsion se décolle tout seul à la fin du traitement. Une méthode de traitement thérapeutique comprenant l'administration chez un mammifère, de préférence un humain, qui en a besoin d'une quantité efficace sur le plan thérapeutique de la nanoémulsion telle que définie ci-dessus est également un des objets 30 de la présente invention.

L'invention sera décrite plus en détail au moyen des exemples et figures en annexe, lesquelles montrent : Figure 1 : Schéma de principe de la libération d'un agent d'intérêt hydrophile (3) et 35 d'un agent d'intérêt hydrophile (4). (1) : libération des gouttelettes de la phase huileuse 24 dispersée de la nanoémulsion, liée à la libération des agents d'intérêt hydrophiles (3) ù (2) : libération des agents d'intérêt lipophiles (4) des gouttelettes. Figure 2 : Schéma représentatif d'une gouttelette de la phase dispersée. 1 : lipide solubilisant et éventuelle huile ù 2 : lipide amphiphile ù 3 : co-tensioactif ù 4 : chaîne polyalcoxylée du co-tensioactif ù 5: groupement capable de former des liaisons hydrogène. Figure 3 : Intensité de fluorescence (en UA) en fonction du temps (en minutes) d'une solution aqueuse placée en contact avec la nanoémulsion de l'exemple 1. La courbe avec les carrés correspond à la libération de la molécule hydrophile fluorescéine. 1 o La courbe avec les losanges correspond à la libération des gouttelettes de phase dispersé comprenant la molécule lipophile Nile Red. Figure 4: Temps de libération des gouttelettes de la phase dispersée des nanoémulsions de l'exemple 2a en minutes en fonction de la fraction massique en phase dispersée par rapport au poids total de la nanoémulsion. La courbe avec les triangles 15 correspond à une nanoémulsion comprenant un co-tensioactif Myrj® s20. La courbe avec les carrés correspond à une nanoémulsion comprenant un co-tensioactif Myrj® s100. La courbe avec les losanges correspond à une nanoémulsion comprenant un co-tensioactif Myrj® s40. Figure 5: Temps de libération des gouttelettes de la phase dispersée des 20 nanoémulsions de l'exemple 2b en minutes en fonction de la fraction massique en phase dispersée par rapport au poids total de la nanoémulsion. La courbe avec les triangles correspond à une nanoémulsion comprenant des gouttelettes de diamètre de 120 nm lorsque la fraction massique en phase dispersée est de 40%. La courbe avec les carrés correspond à une nanoémulsion comprenant des gouttelettes de diamètre de 80 nm 25 lorsque la fraction massique en phase dispersée est de 40%. La courbe avec les losanges correspond à une nanoémulsion comprenant des gouttelettes de diamètre de 50 nm lorsque la fraction massique en phase dispersée est de 40%. Figure 6: Temps de libération des gouttelettes de la phase dispersée des nanoémulsions de l'exemple 3 en minutes en fonction de la fraction massique de co- 30 tensioactif comportant un groupe maléimide terminal par rapport à la masse de cotensioactif Myrj® s40. Figure 7 : Deux spectres RMN 1H des nanoémulsions après fabrication pour des températures de T= 10°C et de T=60°C (exemple 4). Figure 8 : Thermogramme (flux de chaleur (W/g) en fonction de la température en 35 °C) obtenu par calorimétrie différentielle à balayage (en anglais, Differential Scanning 25 Calorimetry ou DSC) des nanoémulsions après fabrication avec un appareil Universal V3.8B TA (exemple 4). Figure 9 : Thermogramme (flux de chaleur (W/g) en fonction de la température en °C) obtenu par calorimétrie différentielle à balayage (en anglais, Differential Scanning Calorimetry ou DSC) des nanoémulsions après 4 mois de stockage à température ambiante (b) avec un appareil Universal V3.8B TA (exemple 4). Figure 10 : L'évolution de la taille des gouttelettes (en nm) de la nanoémulsion en fonction du temps (en jours) pour trois nanoémulsions à 40°C. Les losanges représentent une nanoémulsion exempte de lipide solubilisant et comprenant de l'huile, les triangles représentent une nanoémulsion comprenant un mélange 50/50 de lipide solubilisant et d'huile et les ronds représentent une nanoémulsion exempte d'huile et comprenant du lipide solubilisant (exemple 4).

EXEMPLES 15 Pour démontrer la faisabilité de la libération d'agents d'intérêt par la nanoémulsion selon l'invention, des expériences ont été réalisées en encapsulant les agents d'intérêt de la nanoémulsion par deux molécules fluorescentes, l'une étant hydrophile (fluorescéine - log(P)=1) et donc située dans la phase aqueuse continue de la nanoémulsion, l'autre 20 étant hydrophobe (Nile Red - log(P)=4,5) et donc située dans les gouttelettes de la phase dispersée de la nanoémulsion.

EXEMPLE 1 : Méthode de détermination du temps de libération de l'agent d'intérêt hydrophile. 25 La nanoémulsion utilisé avait la composition suivante : Composant fournisseur quantités Phase Tampon phosphate PBS 1 X 900 pL aqueuse Molécule Fluorescéine 15 pL d'une hydrophile solution aqueuse 1 mM Co-tensioactif Myrj® s40** CRODA, 300 mg France Huile Super Refined Soybean oil CRODA, 102,5 mg France Lipide Suppocire® NC Gattefossé, 307,5 mg solubilisant France Lipide Lipoid s75 (comprenant plus de Lipoid, 50 mg amphiphile 75% de phophatidylcholine) Allemagne Molécule Nile Red 12 pL d'une lipophile solution aqueuse 10 mM 26 La nanoémulsion a été préparée en suivant le protocole suivant. La phase aqueuse a été préparée par dissolution du co-tensioactif du tampon phosphate à 60°C, puis ajout de la fluorescéine. La phase huileuse a été préparée par dissolution du Lipoid s75 et du Nile Red dans le mélange huile/ Suppocire® NC / chloroforme à 60°C. Le mélange obtenu a ensuite été évaporée sous pression réduite et séché à 50°C pour évaporer le chloroforme. La phase huileuse obtenue se présentait sous la forme d'une huile visqueuse qui se solidifie en refroidissant. La phase huileuse a alors été émulsifiée dans la phase aqueuse par ultrasonification pendant 20 min, en alternant des durées de 10 s de sonication et de 30 s de repos (soit 5 min de sonication réelle au total sur les 20 min) à une puissance de 25% sur sonicateur AV505 équipé d'une sonde conique de 3mm (Sonics, Newtown). Pour être utilisée, la nanoémulsion obtenue a été prélevée à chaud (T>40°C) à l'aide d'une seringue 1ml surmontée d'une aiguille (1,2 x 40mm). 300 µL de nanoémulsion ont été déposés au fond d'une cuvette spectroscopie en plastique transparent 4 faces. Un cache opaque a été monté sur le contour de la cuve à hauteur de 1 cm pour cacher la nanoémulsion. 3 mL d'une solution aqueuse (tampon phosphate PBS) ont alors été ajouté à la cuvette et ainsi mis en contact de la nanoémulsion. La libération dans la phase aqueuse de la molécule hydrophile d'une part et des gouttelettes comprenant la molécule lipophile d'autre part a été suivie par fluorescence. Les résultats sont représentés sur la figure 3. Le temps t = 0 correspond au moment où la solution aqueuse a été ajoutée à la cuvette. Lorsque les molécules fluorescentes sont libérées dans la solution aqueuse, l'intensité de fluorescence croît jusqu'à atteindre un palier maximum. Ce palier montre que le système (nanoémulsion / solution aqueuse) a atteint un équilibre : la nanoémulsion a été complètement désagrégée dans le tampon aqueux. La courbe avec les carrés correspond à la libération de la molécule hydrophile fluorescéine. Le temps de libération de la fluorescéine ttluorescélne est de 25 minutes. La courbe avec les losanges correspond à la libération des gouttelettes de phase dispersée comprenant la molécule lipophile Nile Red (et non pas à la libération du Nile Red). Le temps de libération des gouttelettes tgouttelettes est de 75 min.

EXEMPLE 2 : Influence de la composition de la nanoémulsion sur le temps de libération des gouttelettes tgouttelettes. Pour étudier l'influence de la composition de la nanoémulsion sur tgouttelettes, des nanoémulsions selon l'exemple 1 ont été préparées en variant la nature et la concentration de co-tensioactif. 27 Les nanoémulsions Ai (i = 1 à 9) diffèrent les uns des autres par la quantité de phase aqueuse et la nature du co-tensioactif. En conservant les quantités de composants de la phase dispersée mentionnées dans le tableau 1, une nanoémulsion comprenant 40 % de phase dispersée par rapport au poids total de la nanoémulsion comporte des gouttelettes de diamètre moyen de 120 nm. Tableau 1 : compositions des nanoémulsions Ai nanoémulsions Ai Al A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 Fraction massique en phase 43 43 43 52 52 52 59 59 59 dispersée (%) Phase aqueuse (pL) Tampon 1140 1140 1140 800 800 800 600 600 600 phosphate PBS 1X Co-tensioactif Myrj®s20* (mg) 215 - - 215 - - 215 - - Co-tensioactif Myrj® s40** (mq) - 215 - - 215 - - 215 - Co-tensioactif Myrj® s100*** - - 215 - - 215 - - 215 (mg) Huile Super Refined Soybean 150 150 150 150 150 150 150 150 150 oil (mg) Lipide solubilisant Suppocire® 450 450 450 450 450 450 450 450 450 NC (mg) Lipide amphiphile Lipoid s75 45 45 45 45 45 45 45 45 45 (mg) Molécule lipophile Nile Red (pL 20 20 20 12 12 12 12 12 12 d'une solution aqueuse 10 mM) tgouttelettes (min) ND* 25 - ND* 75 55 62 130 90 * stéarate de PEG possédant 20 unités PEG ** stéarate de PEG possédant 40 unités PEG *** stéarate de PEG possédant 100 unités PEG * nanoémulsion de viscosité inférieure à 1 poise formée. Les nanoémulsions Bi (i = 1 à 4) diffèrent les uns des autres par la quantité de phase aqueuse. La nanoémulsion B1 comprenant 40 % de phase dispersée par rapport au poids total de la nanoémulsion comporte des gouttelettes de diamètre moyen de 80 nm.

Tableau 2 : compositions des nanoémulsions Bi nanoémulsions Bi B1 B2 B3 B4 Fraction massique en phase dispersée (%) 40 50 55 60 Phase aqueuse (1L) Tampon phosphate PBS 1X 1140 760 622 507 Co-tensioactif Myrj s40** (mg) 300 300 300 300 Huile Super Refined Soybean oil (mg) 102.5 102.5 102.5 102.5 Lipide solubilisant Suppocire® NC (mq) 307.5 307.5 307.5 307.5 Lipide amphiphile Lipoid s75 (mg) 50 50 50 50 Molécule lipophile Nile Red (pL d'une solution aqueuse 10 20 12 12 12 mM) tgouttelettes (min) 48 82 120 * : nanoémulsion non redispersible de visccosité supérieure à 1000 poises 28 Les nanoémulsions Ci (i = 1 à 4) diffèrent les uns des autres par la quantité de phase aqueuse. La nanoémulsion Cl comprenant 40 % de phase dispersée par rapport au poids total de la nanoémulsion comporte des gouttelettes de diamètre moyen de 50 nm.

Tableau 3 : compositions des nanoémulsions Ci nanoémulsions Ci Cl C2 C3 Fraction massique en phase dispersée (%) 40 50 60 Phase aqueuse (pLL) Tampon phosphate PBS 1X 1125 750 500 Co-tensioactif Myrj s40** (mg) 345 345 345 Huile Super Refined Soybean oil (mg) 85 85 85 Lipide solubilisant Suppocire® NC (mg) 255 255 255 Lipide amphiphile Lipoid s75 (mg) 65 65 65 Molécule lipophile Nile Red (pL d'une solution aqueuse 10 mM) 20 12 12 tgouttelettes (min) 90 110 150 Exemple 2a : Influence de la fraction massique en phase dispersée et du nombre de motifs polyoxyéthylène du co-tensioactif sur tgouttelettes Les co-tensioactifs Myrj® s20, s40 et s100 utilisés dans les nanoémulsions Ai ont les 10 formules suivantes : O C17H35O_ ` n H n = 20, 40 ou 100 Les résultats sont regroupés sur la figure 4. Le temps de libération des gouttelettes tgouttelettes augmente lorsque la fraction massique en phase dispersée augmente. L'augmentation de la fraction massique de 15 phase dispersée provoque le rapprochement des gouttelettes entres-elles. Les interactions entre gouttelettes sont plus importantes, et la désagrégation de la nanoémulsion est plus difficile. Le temps de libération des gouttelettes tgouttelettes est également influencé par la nature du co-tensioactif utilisé. Ainsi, le temps de libération des gouttelettes est : 20 - le plus élevé lorsque le co-tensioactif Myrj®s40 est utilisé, intermédiaire lorsque le co-tensioactif Myrj® s100 est utilisé, le plus faible lorsque le co-tensioactif Myrj®s20 est utilisé. Lorsque la longueur de la chaîne polyoxyéthylène augmente, d'une part les interactions par liaison hydrogène entre cette chaîne polyoxyéthylène et l'eau de la phase 25 aqueuse continue augmentent, ce qui favorise la dispersion des gouttelettes et la désagrégation de la nanoémulsion, et d'autre part, les interactions par liaison hydrogène existant entre les chaines polyalkylène oxyde des co-tensioactifs de gouttelettes adjacentes sont plus nombreuses, ce qui défavorise la désagrégation de la nanoémulsion. 29 Le temps de libération des gouttelettes tgouttelettes le plus élevé est donc observé pour le cotensioactif ayant un nombre d'unités polyoxyéthylène (et donc une longueur de chaîne) intermédiaire. Il est donc possible d'ajuster le temps de libération des gouttelettes, lié au temps de libération des agents d'intérêt lipophiles et hydrophiles, en ajustant la fraction massique en phase dispersée et/ou la nature du co-tensioactif, plus précisément le nombre de motifs polyoxyéthylène. En effet, augmenter la fraction massique de phase dispersée revient à augmenter la densité des gouttelettes, favorisant ainsi le rapprochement entre gouttelettes et donc les interactions entre-elles. Au contraire, augmenter la longueur des 1 o chaînes polyalcoxylées en surface permet d'augmenter les interactions gouttelettes/phase continue (eau), et donc facilite la redispersion des gouttelettes depuis la nanoémulsion vers la phase continue sous forme de dispersion diluée.

Exemple 2b : Influence de la fraction massique en phase dispersée et de la taille des 15 gouttelettes de la phase dispersée sur tgouttelettes Les résultats sont regroupés sur la figure 5. La courbe avec les triangles correspond aux résultats obtenus avec les nanoémulsions Ai, c'est-à-dire des nanoémulsions comprenant des gouttelettes de diamètre de 120 nm lorsque la fraction massique en phase dispersée est de 40%. La courbe avec les carrés correspond aux 20 résultats obtenus avec les nanoémulsions Bi, c'est-à-dire des nanoémulsions comprenant des gouttelettes de diamètre de 80 nm lorsque la fraction massique en phase dispersée est de 40%. La courbe avec les losanges correspond aux résultats obtenus avec les nanoémulsions Ci, c'est-à-dire des nanoémulsions comprenant des gouttelettes de diamètre de 50 nm lorsque la fraction massique en phase dispersée est de 40%. Pour 25 une fraction massique en phase dispersée supérieure à 45%, les gouttelettes ont un diamètre qui augmente progressivement avec la fraction massique. Le temps de libération des gouttelettes tgouttelettes augmente lorsque la fraction massique en phase dispersée augmente, comme observé à l'exemple 2a. Le temps de libération des gouttelettes tgouttelettes est également influencé par le 30 diamètre moyen des gouttelettes de la phase dispersée. Plus le diamètre moyen des gouttelettes est faible, plus le temps de libération des gouttelettes tgouttelettes est élevé. En effet, à fraction massique en phase dispersée constante, lorsque le diamètre moyen des gouttelettes diminue, les surfaces des gouttelettes augmentent, et les effets de surface sont plus importants, notamment car les interactions existant entre les chaines 35 polyalkylène oxyde des co-tensioactifs de gouttelettes adjacentes sont plus nombreuses: la nanoémulsion se désagrège plus difficilement. 30 EXEMPLE 3 : Nanoémulsion comprenant un co-tensioactif polyalcoxylé à groupe terminal capable de former des liaisons hydrogène. Le co-tensioactif polyalcoxylé comportant un groupe terminal maléimide de formule suivante a été utilisé : o Les nanoémulsions Di (i=1-4) utilisées avaient les compositions suivantes : Tableau 4 : compositions des nanoémulsions Di nanoémulsions Di Dl D2 D3 D4 Fraction massique tensioactif modifié / co-tensioactif non 0 1 3 5 modifié (%) Co-tensioactif Myrj® s40** (mg) (CRODA) 345 341,5 334,6 327,8 Co-tensioactif modifié groupe terminal maléimide (Aventi 0 3,5 10,4 17,2 Polar) (mg) Phase aqueuse (pL) : Tampon phosphate PBS 1X 1250 1250 1250 1250 Huile Super Refined Soybean oil (mg) (CRODA) 85 85 85 85 Lipide solubilisant Suppocire® NC (mg) (Gattefossé) 255 255 255 255 Lipide amphiphile Lipoid s75 (mg) 65 65 65 65 Agent lipophile Nile Red (pL d'une solution aqueuse 10 10 10 10 10 mM) tgouttelettes (min) 80 90 110 150 Les nanoémulsions ont été préparés en suivant le même protocole que celui de l'exemple 1. 1 o Les résultats sont regroupés sur la figure 6. On constate que la présence d'un groupe maléimide capable de former des liaisons hydrogène sur la chaîne polyoxyalkylée du co-tensioactif engendre une augmentation du temps de libération des gouttelettes tgouttelettes. Ces exemples démontrent que la nanoémulsion permet la délivrance simultanée 15 d'un agent d'intérêt hydrophile et des gouttelettes comprenant un agent d'intérêt lipophile, et que les temps de libération des agents d'intérêt peuvent être modulés en ajustant la nature et les proportions des composants de la nanoémulsion.

EXEMPLE 4 : Mise en évidence de la stabilité de la nanoémulsion 20 Les expériences ci-après ont été réalisées pour démontrer la stabilité conférée aux nanoémulsions par le lipide solubilisant.

EXEMPLE4A : Mise en évidence de la haute viscosité du coeur des gouttelettes par RMN. 31 Une nanoémulsion comprenant 255 mg de Suppocire® NC (Gattefossé) (lipide solubilisant), 85 mg d'huile de soja (Sigma Aldrich) (huile), 345 mg de Myrj52® (ICI Americas Inc) (co-tensioactif), 65 mg de Lipoid® s75 (lécithine, lipide amphiphile) et un tampon phosphate (PBS) a été préparé en suivant le protocole de l'exemple 1.

Des analyses de la nanoémulsion à 10°C et à 60°C ont été réalisées par résonance magnétique nucléaire du proton. Les pics associés aux composants de coeur des gouttelettes de la nanoémulsion (huile / lipide solubilisant et lipide amphiphile) (0.9 ; 1.5 ; 1.6 ; 2.0 ; 2.2 ; 4.1 ; 4.2 ppm) observés sur les spectres RMN 1H sont élargis par rapport à la référence (acide 4,4-diméthyl-4-silapentane-1-sulfonique DSS à 0 ppm), et ce 1 o d'autant plus que la température est basse, ce qui met en évidence la haute viscosité interne des gouttelettes. Les pics associés au co-tensioactif Myrj53® (3.7 ppm) ne subissent quand à eux aucun élargissement, ce qui indique que le co-tensioactif reste en surface des gouttelettes, les chaînes polyoxyéthylène étant solubilisées dans le tampon aqueux (figure 7). 15 EXEMPLE4B : Mise en évidence de l'absence de cristallisation dans les gouttelettes par calorimétrie différentielle à balayage. Une nanoémulsion comprenant 150 mg de Suppocire® NC (Gattefossé) (lipide solubilisant), 50 mg d'huile de soja (Sigma Aldrich) (huile), 228 mg de Myrj53® (ICI 20 Americas Inc) (co-tensioactif), 100 mg de Lipoid® s75 (lécithine, lipide amphiphile) et un tampon phosphate (PBS) a été préparé en suivant le protocole de l'exemple 1. Les thermogrammes obtenus par analyse par calorimétrie différentielle à balayage de la nanoémulsion après préparation (figure 8) et après 4 mois de stockage à température ambiante (figure 9) montrent qu'aucun pic de fusion n'est observé après 25 fabrication, ni après stockage à température ambiante pendant 4 mois, ce qui indique que les gouttelettes ne sont pas cristallisées.

EXEMPLE4C : Mise en évidence de l'influence de la composition des nanoémulsions sur leur stabilité physique.

30 Trois nanoémulsions comprenant 228 mg de Myrj53® (ICI Americas Inc) (cotensioactif), 100 mg de Lipoid® s75 (lécithine, lipide amphiphile), 1600 pL de tampon phosphate (PBS), du Suppocire® NC (Gattefossé) (lipide solubilisant) et de l'huile de soja (Sigma Aldrich) (huile) dans les quantités précisées au tableau 6 ont été préparées en suivant le protocole de l'exemple 1.

35 Tableau 6: quantités de Suppocire® NC et d'huile de soja dans les nanoémulsions. 32 nanoémulsion NCO NC50 NC100 Suppocire® NC 0 100 mg 200 mg huile de soja 200 mg 100 mg 0 Un test de stabilité accélérée à 40°C a été réalisé sur les trois nanoémulsions obtenues. Le suivi de la taille/polydispersité des nanoémulsions au cours du temps a permis de mettre en évidence l'effet stabilisateur du lipide solubilisant. Alors que la taille des nanoémulsions exempte de lipide solubilisant augmente considérablement après près de 170 jours à 40°C, les nanoémulsions contenant du lipide solubilisant ne présente aucune déviation significative de la taille des gouttelettes (figure 10). Les résultats montrent que l'ajout de lipide solubilisant dans la composition des nanoémulsions permet de conférer aux gouttelettes et à la nanoémulsion une meilleure stabilité physique. 15 33

Claims

REVENDICATIONS1. Nanoémulsion sous forme de gel comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase huileuse dispersée, dans laquelle : la phase aqueuse comprend : - au moins un co-tensioactif polyalcoxylé, et - au moins un agent d'intérêt hydrophile, et la phase huileuse comprend : - au moins un lipide amphiphile, - au moins un lipide solubilisant, au moins un agent d'intérêt lipophile.
2. Nanoémulsion selon la revendication 1, dont la viscosité est de 1 poise à 1000 poises à 25°C.
3. Nanoémulsion selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle l'agent solubilisant consiste en un mélange de glycérides d'acides gras saturés comportant : - au moins 10% en poids d'acides gras en C12, - au moins 5% en poids d'acides gras en C14, - au moins 5% en poids d'acides gras en C16, et - au moins 5% en poids d'acides gras en C18.
4. Nanoémulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le lipide amphiphile est un phospholipide.
5. Nanoémulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle la phase huileuse dispersée représente de 30 à 90% en poids par rapport au poids total de la nanoémulsion. 30
6. Nanoémulsion selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle la phase huileuse comporte en outre au moins une huile.
7. Nanoémulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle le co-tensioactif comporte au moins une chaîne polyalcoxylée composée de motifs d'oxyde 35 d'éthylène ou d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène. 34
8. Nanoémulsion selon la revendication 7, dans laquelle le co-tensioactif est choisi parmi les composés conjugués polyéthylèneglycol / phosphatidyl-éthanolamine (PEGPE), les éthers d'acide gras et de polyéthylèneglycol, les esters d'acide gras et de polyéthylèneglycol et les copolymères blocs d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène.
9. Nanoémulsion selon la revendication 7 ou 8, dans laquelle la chaîne polyalcoxylée comprend de 10 à 200 motifs alcoxylé.
10. Nanoémulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans 10 laquelle le co-tensioactif polyalcoxylé comporte un groupe terminal capable de former des liaisons non covalentes, de préférence des liaisons hydrogène.
11. Nanoémulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans laquelle l'agent d'intérêt hydrophile est un agent thérapeutique hydrophile et l'agent d'intérêt 15 lipophile est un agent thérapeutique lipophile.
12. Procédé de préparation d'une nanoémulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, comportant les étapes consistant à : (i) préparer la phase huileuse comprenant l'agent d'intérêt lipophile, au moins un 20 lipide amphiphile et au moins un lipide solubilisant; (ii) préparer une phase aqueuse comprenant un co-tensioactif polyalcoxylé et un agent d'intérêt lipophile; (iii) disperser la phase huileuse dans la phase aqueuse sous l'action d'un cisaillement suffisant pour former une nanoémulsion; et 25 (iv) récupérer la nanoémulsion ainsi formé.
13. Nanoémulsion selon la revendication 11 pour son utilisation pour l'administration d'au moins un agent thérapeutique hydrophile et d'au moins un agent thérapeutique lipophile à l'homme ou à l'animal pour traiter ou prévenir une maladie.
14. Nanoémulsion pour son utilisation selon la revendication 13, dans laquelle l'agent thérapeutique hydrophile est un agent cicatrisant, antibactérien ou anti-inflammatoire et l'agent thérapeutique lipophile est un anticancéreux pour le traitement post-exérèse d'une tumeur. 30 35 35 5
15. Nanoémulsion pour son utilisation selon la revendication 13, dans laquelle l'agent thérapeutique hydrophile est un agent stimulant le système immunitaire et l'agent thérapeutique lipophile est un anticancéreux pour le traitement post-cryogénie d'une tumeur. 36