FR2934953A1 - Nanoemulsions de nanocristaux - Google Patents

Abstract

L'invention vise une formulation de nanocristaux sous forme de nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase huileuse dispersée, dans laquelle la phase huileuse comprend au moins un lipide amphiphile et au moins un lipide solubilisant et dans laquelle la phase aqueuse comporte un co-tensioactif. Elle vise également un procédé pour sa fabrication ainsi que des utilisations dans le domaine de l'imagerie médicale, la thermothérapie ou la photothérapie.

Description

NANOEMULSION DE NANOCRISTAUX

La présente invention concerne une formulation de nanocristaux sous forme de nanoémulsion, utile pour les applications en biologie et en médecine.

Elle concerne également un procédé de préparation de ces formulations ainsi que leur utilisation, notamment pour l'imagerie médicale.

[Etat de la technique] Les nanocristaux, tels que les nanocristaux semiconducteurs luminescents, aussi appelés particules ou boîtes quantiques, présentent des propriétés photochimiques et photophysiques remarquables couplée à une grande stabilité, ce qui rend leur utilisation très intéressante dans la biologie et la médecine. Il est donc envisagé de remplacer avantageusement les composés organiques habituellement utilisés par des nanocristaux dans de nombreuses applications, comme notamment : - l'imagerie par résonance magnétique (IRM) employant des nanocristaux d'oxydes de fer (Wagner, V., et al., The emerging nanomedicine landscape. Nat Biotechnol., 2006. 24(10): p. 1211-12171), - l'imagerie de fluorescence, photothérapie employant des nanocristaux semi-conducteurs luminescents (Azzazy, H.M.E., M.M.H. Mansour, and S.C. Kazmierczak, From diagnostics to therapy: propects of quantum dots. Clinical Biochemistry, 2007. 40: p. 917-927), - la thermothérapie et/ou imagerie optique (Loo, C., et al., Immunotargeted nanoshells for integrated cancer imaging and therapy. Nano Lett., 2005. 5(4): p. 709-711) ou par rayons X (Kim, D., et al., Antibiofouling polymercoated gold nanoparticles as a contrast agent for in vivo X-ray computed tomography imaging. J. Am. Chem. Soc., 2007. 129: p. 7661-7665), employant des nanocristaux d'or. Ces applications impliquent généralement l'administration des nanocristaux au patient, par exemple par injection. Il est donc nécessaire de disposer d'une formulation de ces nanocristaux qui soit stable et adaptée pour l'injection, notamment biocompatible.

Après la synthèse, les nanocristaux sont généralement obtenus sous forme stabilisée par des ligands organiques qui permettent de contrôler leur croissance. Les nanocristaux peuvent être solubilisés en milieu aqueux biocompatible en remplaçant les ligands par des ligands bifonctionnels présentant à une extrémité une affinité pour la surface du nanocristal et à l'autre extrémité une affinité pour le milieu aqueux. Les formulations aqueuses obtenues sont toutefois encore peu stables. En effet, les ligands se trouvent en compétition avec les autres molécules présentes dans le milieu et toute modification de pH, de température, ou même la présence d'oxygène peut déstabiliser la solution et provoquer la floculation des nanocristaux. Par ailleurs, on observe avec ces nanocristaux une adsorption non spécifique gênante de protéines ou d'ADN. Enfin, les propriétés intrinsèques des nanocristaux peuvent se dégrader dans de telles formulations, affectant par exemple le rendement quantique des nanocristaux semiconducteurs luminescents. Afin de mieux stabiliser les nanocristaux et de préserver leurs propriétés, il a été proposé de les encapsuler dans différents systèmes, par exemple une couche de ligands amphiphiles, une coque inorganique, ou encore dans un nanosystème de dimension plus importante.

Ainsi, l'encapsulation de nanocristaux semi-conducteurs luminescents dans des micelles lipidiques est décrite dans (Schroeder et al. Folate mediated tumor celle uptake of quantum dots entrapped in lipid nanoparticles. J. Control. Release, 2007. 124 :p.28-34). Les nanoparticules, appelés lipodots, sont obtenues par centrifugation, après mélange des constituants dans le chloroforme, évaporation du solvant, et re-suspension dans l'eau. La distribution en taille de ces nanoparticules est très large : de 60 à 200 nm. Il est supposé que les nanocristaux semi-conducteurs luminescents seraient en fait encapsulés dans des micelles qui formeraient ensuite des agrégats plus gros, ce qui expliquerait l'importante inhibition de la fluorescence observée (-98.5 %).

Par ailleurs, S.K. Mandai et al. décrit l'encapsulation conjointe de nanocristaux d'oxyde de fer et de nanocristaux de semi-conducteurs fluorescents dans des nanoémulsions d'octane (Langmuir 2005, 21, 4175-4179). Une telle émulsion n'est cependant pas biocompatible en raison de la présence d'octane. [Problème technique] Il existe donc un besoin de disposer d'une formulation de nanocristaux qui soit adaptée aux besoins spécifiques de la biologie et de la médecine, notamment de l'imagerie médicale. Plus spécifiquement, il est recherché une formulation biocompatible et stable qui préserve les propriétés intrinsèques des nanocristaux. Enfin, il serait intéressant de disposer d'une formulation permettant une biodistribution ciblée in vivo vers la zone à imager ou à traiter. [Résumé de l'invention] Selon l'invention, il est proposé d'encapsuler les nanocristaux dans la phase dispersée huileuse d'une nanoémulsion de formulation spécifique stable et pouvant être préparée qu'avec des constituants approuvés pour l'injection chez l'homme. Aussi, selon un premier aspect, l'invention vise une formulation de nanocristaux sous forme de nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase huileuse dispersée, dans laquelle la phase huileuse comprend au moins un lipide amphiphile et au moins un lipide solubilisant et dans laquelle la phase aqueuse comporte un co-tensioactif. Les nanocristaux peuvent être formés notamment de métaux ou d'oxydes et être conducteurs ou semi-conducteurs. Particulièrement visés sont les nanocristaux luminescents. Le lipide amphiphile est de préférence un phospholipide. Le lipide solubilisant comprend avantageusement au moins un glycéride d'acides gras et de préférence au moins un glycéride d'acides gras saturés comportant 12 à 18 atomes de carbone. Par ailleurs, la phase huileuse de la formulation de nanocristaux peut comporter en outre au moins une huile. Le cotensioactif comporte de préférence au moins une chaîne composée de motifs d'oxyde d'éthylène ou d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène. Avantageusement, le co-tensioactif est choisi parmi les composés conjugués polyéthylèneglycol / phosphatidyl-éthanolamine (PEG/PE), les éthers d'acides gras et de polyéthylèneglycol et les esters d'acides gras et de polyéthylèneglycol et les copolymères blocs d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène. Selon un mode de réalisation, la formulation de nanocristaux comporte une phase dispersée fonctionnalisée, par exemple par greffage du lipide amphiphile ou du co-tensioactif avec un ligand biologique. Selon un deuxième aspect, l'invention vise un procédé de préparation d'une formulation de nanocristaux, comprenant au moins une phase aqueuse continue et au moins une phase huileuse dispersée, comportant les étapes consistant à : (i) préparer la phase huileuse comprenant au moins un lipide solubilisant, un lipide amphiphile et une quantité appropriée de nanocristaux; (ii) préparer la phase aqueuse contenant un co-tensioactif; (iii) disperser la phase huileuse dans une phase aqueuse sous l'action d'un cisaillement suffisant pour former une nanoémulsion; et (iv) récupérer la nano-émulsion ainsi formée. De préférence, l'action de cisaillement est exercée par sonification. Avantageusement, la phase huileuse est préparée par mise en solution de tout ou partie des constituants dans un solvant approprié et évaporation subséquente du 20 solvant. Selon un dernier aspect, l'invention vise l'utilisation d'une formulation de nanocristaux selon l'invention pour l'imagerie médicale, la thermothérapie ou la photothérapie. Les nanoémulsions présentent comme avantage notamment une excellente 25 stabilité colloïdale au stockage (> 3 mois) et une forte capacité d'encapsulation de nanocristaux ainsi qu'une concentration élevée en phase dispersée. Lors de l'application, on constate par ailleurs une longue durée de vie plasmatique après injection intraveineuse des nano-particules dans l'organisme (caractère furtif). De façon générale, la nanoémulsion selon l'invention est adaptée à une 30 utilisation dans la biologie et la médecine, notamment par injection, car elle peut être préparée avec des composants autorisés pour l'injection chez l'homme. Dans cette application, la nanoémulsion permet de gouverner la biodistribution des nanocristaux en contrôlant la biodistribution de la nano- 15 émulsion servant de vecteur. Ainsi, on évite la reconnaissance rapide des nanocristaux par le système immunitaire, et une durée de vie réduite dans la circulation sanguine qui en résulterait. Les nanoparticules formées par la phase dispersée ont une longue durée de vie plasmatique après injection intraveineuse. Ce dernier point peut résulter du faible potentiel zêta des nano-émulsions. Le potentiel zéta est un paramètre qui influe sur la bio-distribution de la nano-émulsion. Ainsi, au contact des cellules, un potentiel zéta positif favorise l'endocytose. La phase dispersée de la nanoémulsion peut être aisément fonctionnalisée en surface par des ligands biologiques afin de cibler encore davantage le transport des nanocristaux vers les tissus à imager ou à traiter. Grâce à une concentration élevée en co-surfactant dans la phase aqueuse continue, la nanoémulsion présente en outre une phase dispersée de très faible diamètre. Ainsi, une nanoémulsion encapsulant des nanocristaux de diamètre moyen de 3 à 12 nm présente typiquement un diamètre moyen inférieur à 50 nm, et de préférence compris entre 30 et 40 nm. Avantageusement, la nanoémulsion décrite comporte une concentration élevée en phase dispersée, par exemple plus de 10%, et notamment 20 à 40% en poids par rapport au poids de la nanoémulsion.

Enfin, la nanoémulsion proposée est accessible par un procédé de fabrication simple, peu coûteux et rapide à mettre en oeuvre, et qui est robuste car peu sensible à des variations de la formulation utilisée.

[Description de l'invention] [Définitions] Dans le cadre de cet exposé, on entend par le terme nanoémulsion une composition présentant au moins deux phases, généralement une phase huileuse et une phase aqueuse, dans laquelle la taille moyenne de la phase dispersée est inférieure à 1 micron, de préférence de 10 à 500 nm et en particulier de 20 à 100 nm, et tout préférentiellement 20 et 70 nm (voir article C. Solans, P. Izquierdo, J. Nolla, N. Azemar and M. J. Garcia-Celma, Curr Opin Colloid ln, 2005, 10, 102-110). Le terme lipide désigne dans le cadre de cet exposé l'ensemble des corps gras ou des substances contenant des acides gras présents dans les graisses d'origine animales et dans les huiles végétales. Ce sont de molécules hydrophobes ou amphiphiles principalement constituées de carbone, d'hydrogène et d'oxygène et ayant une densité inférieure à celle de l'eau. Les lipides peuvent être à l'état solide à température ambiante (25°C), comme dans les cires, ou liquide, comme dans les huiles. Le terme phospholipide vise des lipides possédant un groupe phosphate, notamment les phosphoglycérides. Le plus souvent, les phospholipides comportent une extrémité hydrophile formée par le groupe phosphate éventuellement substitué et deux extrémités hydrophobes formées par des chaînes d'acides gras. Parmi les phospholipides, on citera en particulier la phosphatidylcholine, la phosphatidyl éthanolamine, la phophatidyl inositol, la phosphatidyl sérine et la sphingomyéline. Le terme lécithine désigne la phosphatidylcholine, c'est-à-dire un lipide formé à partir d'une choline, d'un phosphate, d'un glycérol et de deux acides gras. Il couvre de manière plus large les phospholipides extraits du vivant, d'origine végétale ou animale, dans la mesure où ils sont majoritairement constitués de phosphatidylcholine. Ces lécithines constituent généralement des mélanges de lécithines portant différents acides gras.

On entend par le terme acide gras désigner des acides carboxyliques aliphatiques présentant une chaîne carbonée d'au moins 4 atomes de carbone. Les acides gras naturels possèdent une chaîne carbonée de 4 à 28 atomes de carbone (généralement un nombre pair). On parle d'acide gras à longue chaîne pour une longueur de 14 à 22 carbones et à très longue chaîne s'il y a plus de 22 carbones. On entend par le terme tensioactif des composés à structure amphiphile qui leur confère une affinité particulière pour les interfaces de type huile/eau et eau/huile ce qui leur donne la capacité d'abaisser l'énergie libre de ces interfaces et de stabiliser des systèmes dispersés.30 On entend par le terme co-tensioactif un tensioactif agissant en plus d'un tensioactif pour abaisser davantage l'énergie de l'interface. On entend par le terme ligand biologique toute molécule qui reconnaît de façon spécifique un récepteur généralement situé à la surface des cellules.

On entend par le terme nanocristal un monocristal dont au moins une des dimensions est inférieure à 100 nm. Les nanocristaux disponibles aujourd'hui sont le plus souvent des matériaux inorganiques, on peut toutefois envisager également des nanocristaux organiques. Les nanocristaux peuvent être formés par des corps purs ou des composés. Il peut s'agir notamment de métaux ou d'oxydes de métaux. Les nanocristaux peuvent être conducteurs ou semi-conducteurs. Pour les matériaux semi-conducteurs, on parle souvent aussi de particule quantique (ou quantum dot, ou encore qdot). Due à sa petite taille, le nanocristal se comporte comme un puits de potentiel qui confine les électrons dans trois dimensions à une région dont la taille correspond à la longueur d'onde des électrons selon de Broglie, soit quelques nanomètres dans un semi-conducteur. En raison de ce confinement, les électrons du nanocristal ont des niveaux d'énergie discrets et quantifiés, lesquels peuvent être contrôlés par le changement de la taille et de la forme du nanocristal. [Emulsion] Selon un premier aspect, l'invention vise une formulation spécifique de nanocristaux sous forme de nanoémulsion. L'émulsion est une émulsion de type huile dans l'eau. Elle peut être simple ou multiple, notamment en comportant dans la phase dispersée une seconde phase aqueuse. Etant donné leur affinité généralement lipophile, les nanocristaux seront encapsulés par la phase dispersée huileuse de la nanoémulsion. Comme indiqué ci-dessus, les nanocristaux intéressants aujourd'hui pour les applications en biologie et médecine sont essentiellement des nanocristaux inorganiques. Parmi les matériaux inorganiques, on peut mentionner notamment les métaux comme l'or et l'argent, les oxydes comme l'oxyde de fer, dont en particulier la magnétite, maghémite, l'oxyde de gadolinium et l'oxyde de hafnium.

Particulièrement visés sont les nanocristaux semi-conducteurs et parmi ceux-ci tout particulièrement les nanocristaux luminescents, en particulièrement les nanocristaux fluorescents. En effet, les derniers constituent des marqueurs très utiles pour l'imagerie.

La longueur d'onde de la lumière absorbée et/ou émise par les nanocristaux semi-conducteurs luminescents dépend outre de la taille du nanocristal également de l'énergie de gap du nanocristal semi-conducteur. Aussi, on choisira un composé dont l'énergie de gap correspond à la longueur d'onde d'intérêt dans l'application visée, par exemple le visible ou le proche infrarouge.

A titre de semi-conducteurs intéressant pour les nanocristaux, on peut mentionner en particulier le CdS, CdSe, CdTe, InP, PbS, Si, CuInS et Inca. Les matériaux peuvent être présents sous forme pure ou en mélange, sous forme dopée ou sous forme de nanocristaux de type coeur/coque, dans lesquels le nanocristal coeur est revêtu d'une coque, par exemple en ZnS.

Ils peuvent être synthétisés par différentes méthodes (voie organométallique, radiolytique, hydrothermale, co-précipitation, décomposition thermique, sol-gel...) et sont également disponibles dans le commerce. Les nanocristaux disponibles dans le commerce sont généralement stabilisés par une couche de ligands portant au moins une chaîne hydrophobe, de préférence une chaîne hydrocarbonée en C8 ou plus. Ces ligands à chaîne hydrophobe peuvent être par exemple des acides gras, des thiols, des phosphines, des oxydes de phosphine, des phosphates, des phosphonates ou des amines avec une chaîne grasse. Ils peuvent comporter un ou plusieurs groupes fonctionnels permettant de les lier au nano-cristal (par exemple acide lipoïque, phosphines oligomériques...). Parmi les ligands utilisés, on peut citer notamment l'oxyde de trioctylphosphine (TOPO) possédant trois chaînes hydrocarbonées en C8. En alternative, on peut également utiliser des ligands possédant une seule chaîne grasse hydrophobe, généralement plus longue, par exemple en C14 à C22, notamment en C16 ou en C18.

La taille des nanocristaux susceptibles d'être encapsulés dans la nanoémulsion selon l'invention n'est pas particulièrement limitée et sera choisie en fonction de la disponibilité dans le commerce et des autres contraintes de l'application. Typiquement, les nanocristaux présentent un diamètre moyen de l'ordre de 1 nm à 100 nm, préférentiellement de 2 nm à 20 nm. Grâce à l'utilisation d'un lipide solubilisant dans la phase dispersée, laquelle permet d'augmenter la concentration en lipide amphiphile, la nanoémulsion proposée permet d'encapsuler une concentration élevée de nanocristaux. Il est ainsi possible d'obtenir une nanoémulsion encapsulant plusieurs nanocristaux identiques ou différents dans une même nanogouttelette. L'encapsulation de nanocristaux différents permet d'envisager des nanoémulsions multifonctionnelles. Ainsi, l'encapsulation de nanocristaux semi-conducteurs luminescents émettant à différentes longueurs d'onde en quantités différentes permet l'accès à une nanoparticule présentant un code barre optique. La concentration de nanocristaux recherchée dépend généralement de l'application envisagée. Typiquement, la phase huileuse contient 0,1 à 20 nmoles/g de nanocristaux pour une concentration finale dans l'émulsion par exemple comprise de 0,01 à 2 nmoles/g. Les nanocristaux stabilisés par la couche de ligands hydrophobes et dispersés dans un solvant organique peuvent être incorporés dans la phase huileuse de l'émulsion, puis le solvant organique est évaporé. Les solvants organiques employés peuvent être par exemple le méthanol, l'éthanol, le chloroforme, le dichlorométhane, l'hexane, le cyclohexane, le DMSO, le DMF. Afin d'éviter toute trace de solvant toxique, les nanocristaux peuvent être au préalable être transférés dans un solvant mieux toléré comme le hexane. La phase huileuse de la nanoémulsion comporte par ailleurs au moins un lipide amphiphile et au moins un lipide solubilisant.

Afin de former une nanoémulsion stable, il est généralement nécessaire d'inclure dans la composition au moins un lipide amphiphile à titre de tensioactif. La nature amphiphile du tensioactif assure la stabilisation des gouttelettes d'huile au sein de la phase continue aqueuse. Les lipides amphiphiles comportent une partie hydrophile et une partie lipophile. Ils sont généralement choisis parmi les composés dont la partie lipophile comprend une chaîne saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, ayant de 8 à 30 atomes de carbone. Ils peuvent être choisis parmi les phospholipides, les cholestérols, les lysolipides, les sphingomyélines, les tocophérols, les glucolipides, stéarylamines, les cardiolipines d'origine naturelle ou synthétique ; les molécules composées d'un acide gras couplé à un groupement hydrophile par une fonction éther ou ester tels que les esters de sorbitan comme par exemple les monooléate et monolaurate de sorbitan vendus sous les dénominations Span par la société Sigma; les lipides polymérisés ; les lipides conjugués à de courtes chaînes d'oxyde de polyéthylène (PEG) tels que les tensioactifs non-ioniques vendus sous les dénominations commerciales Tween par la société ICI Americas, Inc. et Triton par la société Union Carbide Corp.; les esters de sucre tels que les mono-et di-laurate, mono- et di-palmitate, mono- et distéarate de saccharose; lesdits tensioactifs pouvant être utilisés seuls ou en mélanges. La lécithine est le lipide amphiphile préférée. Selon un mode de réalisation particulier, tout ou partie du lipide amphiphile peut posséder une fonction réactive, telle qu'un groupe maléimide, thiol, amine, ester, oxyamine ou aldéhyde. La présence de fonctions réactives permet le greffage de composés fonctionnels au niveau de l'interface. Le lipide amphiphile réactif est incorporé dans la couche formée à l'interface stabilisant la phase dispersée, où il est susceptible de se coupler par exemple avec un composé réactif présent dans la phase aqueuse. Généralement, la phase huileuse comportera de 0.01 à 99% en poids, de préférence de 5 à 75% en poids, en particulier de 20 à 60% et tout particulièrement de 33 à 45% en poids de lipide amphiphile. La quantité de lipide amphiphile contribue avantageusement à contrôler la taille de la phase dispersée de la nanoémulsion obtenue. L'émulsion selon l'invention comprend par ailleurs un lipide solubilisant. Ce composé a pour mission principale de solubiliser le lipide amphiphile, peu soluble, dans la phase huileuse de la nanoémulsion. Le lipide solubilisant est un lipide présentant une affinité avec le lipide amphiphile suffisante pour permettre sa solubilisation. De préférence, le lipide solubilisant est solide à température ambiante.

Dans le cas où le lipide amphiphile est un phospholipide, il peut s'agir notamment de dérivés du glycérol, et en particulier de glycérides obtenues par estérification de glycérol avec des acides gras.

Le lipide solubilisant utilisé est avantageusement choisi en fonction du lipide amphiphile utilisé. Il présentera généralement une structure chimique proche, afin d'assurer la solubilisation recherchée. Il peut s'agir d'une huile ou d'une cire. De préférence, le lipide solubilisant est solide à température ambiante (20°C), mais liquide à la température du corps (37°C). Les lipides solubilisants préférés, en particulier pour les phospholipides, sont les glycérides d'acides gras, notamment d'acides gras saturés, et en particulier d'acides gras saturés comportant 8 à 18 atomes de carbone, encore préféré 12 à 18 atomes de carbone. Avantageusement, il s'agit d'un mélange de différents glycérides. De préférence, il s'agit de glycérides d'acides gras saturés comportant 0% à 20% en poids d'acides gras en C8, 0% à 20% en poids d'acides gras en Cl 0, 10% à 70% en poids d'acides gras en C12, 5% à 30% en poids d'acides gras en C14, 5% à 30% en poids d'acides gras en C16 et 5% à 30% en poids d'acides gras en C18. Particulièrement préférés sont les mélanges des glycérides semisynthétiques solides à température ambiante vendus sous la dénomination commerciale Suppocire NC par la société Gattefossé et approuvé pour l'injection chez l'homme. Les Suppocire de type N sont obtenues par estérification directe d'acides gras et de glycérol. Il s'agit de glycérides hémi-synthétiques d'acides gras saturés de C8 à C18, donc la composition quali-quantitative est indiquée dans le tableau ci-dessous. La quantité de lipide solubilisant peut varier largement en fonction de la nature et de la quantité de lipide amphiphile présent dans la phase huileuse.

Généralement, la phase huileuse comportera de 1 à 99% en poids, de préférence de 5 à 80% en poids et tout particulièrement de 40 à 75% en poids de lipide solubilisant30 Tableau 1 : Composition en acides gras du Suppocire NC de Gattefossé Longueur de chaînes [% en poids] C8 0,1 à 0,9 C10 0,1 à 0,9 C12 25 à 50 C14 10 à 24,9 C16 10 à 24,9 C18 10 à 24,9 La phase huileuse peut comporter par ailleurs une ou plusieurs autres huiles. Les huiles utilisées présentent de préférence une balance hydrophile- lipophile (HLB) inférieure à 8 et encore plus préférentiellement comprise entre 3 et 6. Avantageusement, les huiles sont utilisées sans modification chimique ou physique préalablement à la formation de l'émulsion. Selon les applications envisagées, les huiles peuvent être choisies parmi les huiles biocompatibles, et en particulier parmi les huiles d'origine naturelle (végétale ou animale) ou synthétique. Parmi de telles huiles, on peut notamment citer les huiles d'origine naturelle végétale parmi lesquelles figurent notamment les huiles de soja, de lin, de palme, d'arachide, d'olives, de pépin de raisins et de tournesol ; les huiles synthétiques parmi lesquelles figurent notamment les triglycérides, di glycérides et les mono glycérides. Ces huiles peuvent être de premières expressions, raffinées ou inter-estérifiées. Les huiles préférées sont l'huile de soja et l'huile de lin. Généralement, si présente, l'huile sera contenue dans la phase huileuse dans une proportion allant de 1 à 80% en poids, de préférence entre 5 et 50 % en poids et tout particulièrement 10 à 30% en poids.

La phase huileuse peut contenir en outre d'autres additifs tels que des colorants, stabilisants, conservateurs, fluorophores, agents de contraste pour l'imagerie ou d'autres principes actifs, en quantité appropriée. La phase huileuse pour la phase dispersée de l'émulsion peut être préparée par simple mélange des constituants, si nécessaire en chauffant jusqu'à fusion de l'ensemble des constituants.

La phase aqueuse mise en oeuvre dans le procédé selon l'invention est de préférence constituée d'eau et/ou d'un tampon tel qu'un tampon phosphate comme par exemple du PBS ("Phosphate Buffer Saline") ou d'une solution saline, notamment de chlorure de sodium.

En outre, elle comporte d'autres ingrédients, dont un co-tensioactif. Le cotensioactif permet de stabiliser la nanoémulsion. Le co-tensioactif peut par ailleurs présenter d'autres effets dans l'application envisagée de la nanoémulsion. En particulier, il peut être greffé pour porter un ligand de ciblage.

Les co-tensioactifs utilisables dans les émulsions conformes à la présente invention sont de préférence des tensioactifs hydrosolubles. Les tensioactifs hydrosolubles sont de préférence alkoxylés et comportent de préférence au moins une chaîne composée de motifs d'oxyde d'éthylène (PEO ou PEG) ou d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène. De préférence, le nombre de motifs dans la chaîne varie entre 2 et 500. A titre d'exemple de co-tensioactifs, on peut en particulier citer les composés conjugués polyéthylèneglycol/phosphatidyl-éthanolamine (PEG-PE), les éthers d'acide gras et de polyéthylèneglycol tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Brij (par exemple Brij 35, 58, 78 ou 98) par la société ICI Americas Inc., les esters d'acide gras et de polyéthylèneglycol tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Myrj par la société ICI Americas Inc. (par exemple Myrj 45, 52, 53 ou 59) et les copolymères blocs d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Pluronic par la société BASF AG (par exemple Pluronic F68, F127, L64, L61, 10R4, 17R2, 17R4, 25R2 ou 25R4 ) ou les produits vendus sous la dénomination commerciale Synperonic par la société Unichema Chemie BV (par exemple Synperonic PE/F68, PE/L61 ou PE/L64). La phase aqueuse comporte de préférence de 2 à 50% en poids, de préférence de 5 à 30% en poids et tout particulièrement de 10 à 20% en poids de co-tensioactif. Selon un mode de réalisation préféré, la phase continue comporte également un agent épaississant tel qu'un glycérol, un saccharide, oligosaccharide ou polysaccharide, une gomme ou encore une protéine, de préférence du glycérol.

En effet, l'utilisation d'une phase continue de viscosité plus élevée facilite l'émulsification et permet de ce fait de réduire le temps de sonication. La phase aqueuse comporte avantageusement de 0 à 50% en poids, de préférence de 1 à 30% en poids et tout particulièrement de 5 à 20% en poids d'agent épaississant. Bien entendu, la phase aqueuse peut contenir en outre d'autres additifs tels que des colorants, stabilisants et conservateurs en quantité appropriée. La phase aqueuse pour la phase continue de l'émulsion peut être préparée par simple mélange des différents constituants avec le milieu aqueux choisi.

De préférence, le potentiel zêta de la phase dispersée est inférieur à 20 mV en valeur absolue, c'est-à-dire compris entre -20 et 20 mV. En effet, le potentiel zéta élevé en valeur absolue des nanoparticules a pour effet l'accumulation dans le corps, notamment dans le foie, la rate, les poumons, en plus des reins. Or pour les applications d'imagerie, on recherche l'inverse une formulation furtive, qui présente une longue durée de vie plasmatique après injection intraveineuse.

[Procédé de préparation] La nanoémulsion telle que décrite peut être préparée aisément par dispersion de quantités appropriées de phase huileuse et de phase aqueuse sous l'effet d'un cisaillement. Dans le cadre du procédé selon l'invention, on mélange d'abord les différents constituants huileux et les nanocristaux inorganiques pour préparer un prémélange huileux pour la phase dispersée de l'émulsion. Le mélange peut éventuellement être facilité par mise en solution d'un des constituants ou du mélange complet dans un solvant organique approprié. Le solvant organique est ensuite évaporé, pour obtenir un prémélange huileux homogène pour la phase dispersée. Par ailleurs, il est préféré de réaliser le prémélange à une température à laquelle l'ensemble des ingrédients est liquide.

Selon un mode de réalisation préféré, la phase dispersée de la nanoémulsion est greffée en surface avec des molécules d'intérêts tels que des ligands biologiques. Un tel greffage permet une reconnaissance spécifique de certaines cellules (par exemple de cellules tumorales comme décrit par exemple dans l'article de S. Achilefu, Technology in Cancer Research & Treatment, 2004, 3, 393-408) ou de certains organes. De préférence, le greffage en surface est réalisé par couplage des molécules ou de leurs précurseurs avec un composé amphiphile, notamment avec le co- tensioactif. Dans ce cas, le composé amphiphile joue le rôle d'un espaceur permettant d'accommoder les molécules de ciblage en surface. Le couplage peut être réalisé avant ou après l'émulsification. Le dernier cas peut être préconisé lorsque les réactions chimiques employées sont compatibles avec la stabilité colloïdale des émulsions, notamment en termes de pH. De préférence, le pH lors de la réaction de couplage est compris entre 5 et 11. Les molécules d'intérêt peuvent être par exemple : - des ligands biologiques de ciblage tels que des anticorps, peptides, saccharides, aptamères, oligonucléotides ou des composés comme l'acide folique ; - un agent de furtivité : une entité ajoutée afin de conférer à la nanoémulsion une furtivité vis-à-vis du système immunitaire, d'augmenter son temps de circulation dans l'organisme, et de ralentir son élimination. Par ailleurs, il est possible d'introduire à l'intérieur des nanoparticules, en surface, ou adsorbé sur, par lien covalent ou non : des agents d'imagerie, notamment pour l'IRM (imagerie par résonance magnétique), le PET (en anglais Positron Emission Tomography), le SPECT (Single Photon Emission Computed Tomography), l'échographie ultrasonore, la radiographie, la tomographie X et l'imagerie optique (fluorescence, bioluminescence, diffusion...) ; et/ou des agents thérapeutiques. La proportion de phase huileuse et de phase aqueuse est très variable. Cependant, le plus souvent, les nanoémulsions seront préparées avec 1 à 50%, de préférence 5 à 40% et tout particulièrement 10 à 30% en poids de phase huileuse et 50 à 99%, de préférence 60 à 95% et tout particulièrement 70 à 90 0/0 en poids de phase aqueuse. Avantageusement, la phase huileuse est dispersée dans la phase aqueuse à l'état liquide. Si l'une des phases se solidifie à température ambiante, il est préférable de réaliser le mélange avec l'une ou de préférence les deux phases chauffées à une température supérieure ou égale à la température de fusion. L'émulsification sous l'effet de cisaillement est de préférence réalisée à l'aide d'un sonificateur ou d'un microfluidiseur. De préférence, la phase aqueuse puis la phase huileuse sont introduites dans les proportions souhaitées dans un récipient cylindrique approprié puis le sonificateur est plongé dans le milieu et mis en marche pendant une durée suffisante pour obtenir une nanoémulsion, le plus souvent quelques minutes. On obtient alors une nanoémulsion homogène dans laquelle le diamètre moyen des gouttelettes d'huile est supérieur à 10 nm et inférieur à 200 nm, de préférence de 20 à 50 nm. Avant conditionnement, l'émulsion peut être diluée et/ou stérilisée, par exemple par filtration ou par dialyse. Cette étape permet d'éliminer les éventuels agrégats qui pourraient s'être formés au cours de la préparation de l'émulsion.

L'émulsion ainsi obtenue est prête à l'emploi, le cas échéant après dilution.

[Méthodes d'utilisation] La formulation selon l'invention peut être utilisée telle qu'elle, ou adaptée à l'application visée, par exemple par dilution, pour l'administration du ou des nanocristaux, chez l'homme ou chez l'animal. Du fait qu'elle peut être préparée exclusivement à partir de constituants approuvés pour l'homme, elle est particulièrement intéressante pour une administration par voie parentérale. Cependant, il est également possible d'envisager une administration par d'autres voies, notamment par voie orale ou par voie topique. La formulation décrite permet ainsi l'accès à une formulation utile pour l'administration de nanocristaux pour les applications en biologie et en médecine, notamment l'imagerie médicale.

L'invention sera expliquée plus en détail ci-après au moyen des exemples qui suivent et des figures, lesquelles montrent : Fig 1: les spectres de fluorescence des nanoémulsions P1, P2 et P3 diluées 10 fois dans du PBS ; Fig 2: des clichés en fluorescence par réflectance de souris nude saines ayant reçu une injection de nanoémulsion de nanocristaux (P3) indiqué à l'exemple 2 au cours du temps ; Fig. 3: les clichés de fluorescence par réflectance des organes d'une souris ayant reçu le traitement selon l'exemple 2 et sacrifiée 24 heures après (coeur (A), poumon (B), cerveau (C), peau (D), muscle (E), rein (F), surrénale (G), vessie (H), intestin (I), rate (J), pancréas (K), graisse (L) , estomac (M) et utérus-ovaire (N) ; et Fig. 4 : un histogramme de la fluorescence dans ces organes de la souris ayant reçu le traitement selon l'exemple 2 et sacrifiée 24 heures après.

EXEMPLES EXEMPLE 1 Préparation de nanoémulsions encapsulant des nanocristaux semi- 15 conducteurs fluorescents 1) Préparation du pré-mélange de la phase dispersée Une charge de 1 g de pré-mélange a été préparée de manière suivante. Dans un récipient adapté, on introduit 50mg d'huile de soja (Sigma-Aldrich), 450 mg de glycérides semisynthétiques (vendus par la société Gattefossé sous la 20 dénomination commerciale Suppocire NC) et 400 mg de lécithine de soja (enrichie à 75 % de phosphatidylcholine, vendue par la société Lipoïd sous la dénomination commerciale Lipoïd S75). Ces composés ont été dissous dans le chloroforme, lequel a ensuite été évaporé sous pression réduite. Le mélange subsistant a été séché à 50°C de manière à obtenir un pré-mélange se présentant 25 sous la forme d'une huile visqueuse qui se solidifie en refroidissant. 2) Préparation des nanocristaux semiconducteurs fluorescents Les nanocristaux coeur/coque à base de CdTe-ZnS émettant dans le proche infra-rouge (705 nm) et présentant un diamètre moyen de 10 2 nm (Qdots 705 ITK Organic, vendus par la société Invitrogen sous la référence Q21761 MP), 30 commercialisés en solution de 1 M dans le décane, sont transférés en solution de hexane comme suit. Quatre volumes (4X) d'une solution de méthanol/isopropanol (ratio volumique 75/25) ont été ajoutés à un volume (1X) de nanocristaux semi-conducteurs. Le mélange résultant a été mélangé par vortex puis centrifugé 10 pendant 5 minutes à 3000 rpm. Le surnageant a été ensuite éliminé puis les nanocristaux semi-conducteurs ont été redispersés dans 1 volume (1X) d'hexane. 3) Préparation de la phase dispersée On a prélevé, à une température d'environ 70°C, 0,334 g du pré-mélange préparé ci-dessus à l'étape précédente, auquel on a ajouté 0 L (P0), 125 L (0,125 nmoles) (P1), 250 L (0,250 nmoles) (P2) et 500 L (0,500 nmoles) (P3) de dispersion de nanocristaux semi-conducteurs obtenue comme décrit ci-dessus. Le solvant a ensuite été évaporé sous pression réduite et le mélange obtenu a été séché à 50°C de manière à obtenir une huile visqueuse qui se solidifie en refroidissant. La solution a été homogénéisée par vortex, et maintenue à 70°C en prévision de la phase d'émulsification. 4) Préparation de la phase continue Une charge de 1,666 g de phase continue a été préparée comme suit. La phase continue était composée de 0,050 g de glycérol, de 0,228 g de stéarate de polyoxyéthylène à 50 moles d'oxyde d'éthylène (vendu sous la dénomination commerciale Myrj 53 par la société ICI Americas Inc.) et d'une solution tampon phosphate (Phosphate Buffer Solution : PBS) pour compléter à 1,666 g. Cette solution a été chauffée à 50°C en prévision de l'émulsification.

Tableau 2 : Composition de la formulation de l'exemple 1 Constituants Masse mg Phase dispersée Suppocire NC 150 Huile de soja 50 Phase continue Solution saline 1389 Glycérol 50 Surfactants Lécithine 133 Myrj 53 228 Dopant nanocristaux 0 ; 0,125 ; 0,250 et CdTe-ZnS 0,500 nmoles 5) Emulsification La charge de phase continue obtenue ci-dessus a été ajoutée à 0,334 g de la charge de phase dispersée obtenue sous le point 3 et on obtient un mélange de composition indiquée dans le tableau 2 ci-dessus. Le mélange a été émulsionné avec un sonificateur AV505 équipé d'une sonde conique de 3 mm de diamètre (Sonics, Newtown) pendant 5 minutes pour une énergie totale de 6000 Joules. On obtient des nanoémulsions très stables (P0), (P1), (P2) et (P3) ayant un aspect limpide dont la coloration augmente avec la concentration en nanocristaux. 6) Caractérisation Le diamètre moyen de la phase dispersée des nanoémulsions obtenues, déterminée sur des échantillons dilués au 1/1000e dans du PBS 0,1 M au moyen d'un Zetasizer (Malvern Instruments), est de 30 10 nm. Le potentiel zêta des nanoémulsions préparées, déterminé au moyen du même appareil, est de -8,6 7,7 mV. Les nanoémulsions préparées présentent une excellente stabilité colloïdale (> 3 mois). Les spectres de fluorescence des nanoémulsions préparées, pris au moyen d'un spectrofluoromètre (PERKIN ELMER Modèle LS 50), mettent en évidence des propriétés optiques intéressantes même après encapsulation.

EXEMPLE 2 Utilisation d'une nanoémulsion encapsulant des nanocristaux semi- conducteurs fluorescents pour l'imagerie de fluorescence Une charge de 100 L de la nanoémulsion (P3) préparée selon l'exemple 1 est diluée 2 fois par l'ajout de 100 L d'une solution tampon phosphate. La charge de 200 L (0,025 nM de nanocristaux) obtenue a été ensuite injectée par voie intraveineuse (veine caudale) dans la queue de souris nude femelles de 6 à 8 semaines maintenues sous conditions sans pathogènes (IFFA-Credo, Marcy l'Etoile, France). Les souris, maintenues sous anesthésie générale par voie gazeuse (isoflurane) tout le long de l'expérience, ont été imagés avec un dispositif d'imagerie de fluorescence par réflectance (FRI = "Fluorescence Reflectance lmaging"), comportant comme source d'excitation une couronne de LEDs munies de filtres interférentiels, émettant à 633 nm (puissance d'éclairement 50 11W.cm-2). Le dispositif est décrit plus en détail dans l'article de Texier, I. et al., "Luminescent probes for optical in vivo imaging", Proceedings of the SPIE, 2005, 5704, 16-22.

Les images ont été recueillies après filtration par un filtre coloré RG665 de densité optique >5 à la longueur d'onde d'excitation par une caméra CCD (Orca BTL, Hamamatsu) avec un temps d'exposition de 500 ms. Les signaux ont été quantifiés à l'aide d'un logiciel de traitement d'images. La figure 2 montre les clichés obtenus et met en évidence la bio-distribution de la nanoémulsion (P3) dans les souris pendant les 24 heures suivant l'injection de la nanoémulsion. On remarque une illumination de la souris avec une distribution homogène des nanocristaux sur tout le corps pendant les 15 premières minutes après l'injection. Au bout d'une heure, on observe une nette concentration du signal dans l'estomac, qui diminue ensuite avec le temps. On constate une faible accumulation dans le foie, indicative d'une bonne furtivité de l'émulsion après injection. La figure 3 montre les clichés des organes de la souris sacrifiée 24 heures après l'injection, obtenus dans le dispositif d'imagerie de fluorescence par réflectance. On constate que le signal observé dans le foie, la rate, les poumons et les reins est très faible comparé au signal observé dans l'estomac, la peau et la surrénale. Ces résultats mettent en évidence une durée de vie plasmatique après injection intra-veineuse d'au moins 1 heure, donc un caractère furtif des nanoémulsions selon l'invention. La durée de vie plasmatique est un paramètre d'importance pour le choix des formulations utilisables dans la biologie et la médecine, et notamment dans l'imagerie médicale, la thermothérapie et la photothérapie.

Claims (15)

1. REVENDICATIONS1. Formulation de nanocristaux sous forme de nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase huileuse dispersée, dans laquelle la phase huileuse comprend au moins un lipide amphiphile et au moins un lipide solubilisant et dans laquelle la phase aqueuse comporte un co-tensioactif.
2. 2. Formulation nanocristaux selon la revendication 1, dans laquelle les nanocristaux sont des métaux.
3. 3. Formulation de nanocristaux selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle les nanocristaux sont des semi-conducteurs.
4. 4. Formulation de nanocristaux selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle les nanocristaux sont luminescents.
5. 5. Formulation de nanocristaux selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle lipide amphiphile est un phospholipide.
6. 6. Formulation de nanocristaux selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle le lipide solubilisant comprend au moins un glycéride d'acides gras.
7. 7. Formulation de nanocristaux selon l'une des revendications 1 à 6, dans 25 laquelle le lipide solubilisant comprend au moins un glycéride d'acides gras saturés comportant 12 à 18 atomes de carbone.
8. 8. Formulation de nanocristaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle la phase huileuse comporte en outre au moins une huile.
9. 9. Formulation de nanocristaux selon l'une des revendications 1 à 8, dans laquelle le co-tensioactif comporte au moins une chaîne composée de motifs d'oxyde d'éthylène ou d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène. 30
10. 10. Formulation de nanocristaux selon la revendication 9, dans laquelle le co-tensioactif est choisi parmi les composés conjugués polyéthylèneglycol / phosphatidyl-éthanolamine (PEG/PE), les éthers d'acides gras et de polyéthylèneglycol et les esters d'acides gras et de polyéthylèneglycol et les copolymères blocs d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène.
11. 11. Formulation de nanocristaux selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la phase dispersée est fonctionnalisée.
12. 12. Procédé de préparation d'une formulation de nanocristaux, comprenant au moins une phase aqueuse continue et au moins une phase huileuse dispersée, comportant les étapes consistant à : (i) préparer la phase huileuse comprenant au moins un lipide solubilisant, un lipide amphiphile et une quantité appropriée de nanocristaux; (ii) préparer la phase aqueuse contenant un co-tensioactif ; (iii) disperser la phase huileuse dans une phase aqueuse sous l'action d'un cisaillement suffisant pour former une nano-émulsion; et (iv) récupérer la nano-émulsion ainsi formée.
13. 13. Procédé de préparation selon la revendication 12, dans lequel l'action de cisaillement est exercée par sonification.
14. 14. Procédé de préparation selon la revendication 12 ou 13, dans lequel la 25 phase huileuse est préparée par mise en solution de tout ou partie des constituants dans un solvant approprié et évaporation subséquente du solvant.
15. 15. Utilisation d'une formulation de nanocristaux selon l'une des revendications 1 à 11 pour l'imagerie médicale, la thermothérapie ou la 30 photothérapie. 15 20