KR102100060B1

KR102100060B1 - 약물 전달용 에멀산 나노입자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102100060B1
Application number: KR1020180136788A
Authority: KR
Inventors: 구희범; 이가원
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2018-11-08
Filing date: 2018-11-08
Publication date: 2020-04-10

Abstract

본 발명은 에멀산(Emulsan)으로 이루어진 쉘(shell) 및 상기 에멀산 쉘 내부에 봉입된 약물을 포함하는 약물 전달용 나노입자, 상기 에멀산 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물, 및 상기 에멀산 나노입자의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 약물 전달용 나노입자는 생체내 수용성 특성과 혈액내 잔류 특성이 크게 향상되어, 우수한 약물 전달 효과를 얻을 수 있으며, 특히 항암제 약물을 봉입하여 사용하는 경우 종양 선택성이 향상되어 우수한 항암 치료 효과를 얻을 수 있다. 본 발명의 약물 전달용 나노입자는 종양 또는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물의 활성 성분으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

약물 전달용 에멀산 나노입자 및 이의 용도{Emulsan Nanoparticle for Drug Delivery and Use of the Same}

본 발명은 에멀산(emulsan)으로 이루어진 나노입자의 내부에 약물을 포함하는 약물 전달용 나노입자, 상기 약물 전달용 나노입자의 용도 및 상기 약물 전달용 나노입자의 제조방법에 관한 것이다.

나노입자는 표적조직에 약물을 효율적으로 전달하기 위해 약물운반체로서 폭발적인 관심을 받았다. 나노입자는 수성 조건(aqueous condition)에서 소수성 약물을 용해시킬 수 있고, 응집없이 장기간의 안정성을 제공할 수 있다. 특히 정맥 주사 후, 나노입자는 혈류내부에서 장기간 순환을 가능하게 하고, 체내로부터 약물분비를 지연시켜 약물의 효능이 증가시킬 수 있다. 나노입자는 종양과 같은 혈관 생성조직에서 새로운 유창구조(fenestrate vessels)을 통과하고 약한 림프 배출의 도움으로 그곳에 축적될 수 있는데, 이러한 현상을 EPR(enhanced permeation and retention) 효과라고 한다. 항체(anibody), 압타머(aptamers) 및 펩티드(peptide)를 포함한 생물학적 리간드로 나노입자의 표면을 코팅함으로써, 표적 질병 세포에 대한 그들의 특이적인 결합을 더 증가시킬 수 있다. 이러한 특성으로 인해 나노입자는 자유 약물(free drugs)에 비해 동물 연구에서 유망한 결과를 보여주었다. 그러나 지금까지 개발되고 보고된 거대한 양의 나노입자를 고려할 때, 극히 일부의 나노입자만이 FDA에 의해 승인되고, 임상적으로 사용된다는 것은 매우 실망스럽다. 이러한 현실은 나노입자 연구에서 안전성 문제는 매우 중요하다는 것을 보여 주고 있고, 이러한 관점에서 나노입자에 대한 새로운 물질을 찾는 노력이 지속적으로 시도될 필요가 있다.

생물 계면활성제는 생물적 기원인 양친매성 계면활성제 분자이며, 친환경 성질 때문에 많은 연구자들에게 매력적이다. 생물 계면활성제는 제약, 식품, 화장품 및 농업 분야에 응용되고 있다. 그 중에서도 에멀산(emulsan)은 Acinetobacter calcoaceticus RAG-1에서 얻은 대표적인 생체 고분자이다. 에멀산은 지방산 가지를 갖는 음이온성 다당체이므로, 양친매성을 나타낸다.

대한민국 등록특허 제10-1501286호는 에멀산(Emulsan)을 포함하는 컨디셔닝 샴푸 조성물을 개시하고 있다. 에멀산의 다양한 적용에도 불구하고, 아직까지 나노입자 연구에 대한 적용은 거의 시도되지 않았다.

본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.

대한민국 등록특허 제10-1501286호 (공개일자 : 2009. 11. 12.)

본 발명자들은 생물학적 원천으로부터 유래하는 계면활성제를 이용하여 약물 전달용 나노입자를 제조하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과 미생물 생산 계면활성제인 에멀산(emulsan)을 이용하여 내부에 약물을 포함하는 나노입자를 성공적으로 제조하였고, 이의 우수한 약물 전달 효과 및 표적 질환 치료 활성을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 에멀산(emulsan)으로 이루어진 쉘(shell) 및 상기 에멀산 쉘 내부에 봉입된 약물(drug)을 포함하는 약물 전달용 나노입자를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 에멀산으로 이루어진 쉘 및 상기 에멀산 쉘 내부에 봉입된 항암 약물을 포함하는 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 약물 전달용 나노입자의 제조방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, (i) 에멀산(emulsan)으로 이루어진 쉘(shell); 및 (ⅱ) 상기 에멀산 쉘 내부에 봉입된 약물(drug)을 포함하는 약물 전달용 나노입자를 제공한다.

본 발명의 나노입자의 쉘은 에멀산으로 이루어져 있다.

본 발명의 나노입자의 에멀산 쉘의 내부에는 약물이 봉입되어 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 에멀산 쉘 내부는 오일(oil)이 채워진 오일 코어(oil core) 형태일 수 있다.

본 발명에서 에멀산 쉘의 내부에 봉입되는 약물은 특별히 한정되지 않는다.

예를 들어, 상기 약물은 항암제, 항염증제, 항혈전제, 항생제, 항부정맥제, 아토피피부염 치료제, 인플루엔자 치료제, 류마티즘관절염 치료제, 협심증 치료제, 혈소판 응집억제제, 혈전치료제, 호흡흥분제, 항우울제, 항간질제, 파킨슨병 치료제, 항결핵제, 고혈압 치료제, 고지혈증 치료제, 지혈제, 심부전 치료제, 당뇨병 치료제, 알레르기비혐 치료제, 항균제, 정신분열병 치료제, 갑상선 기능장애 치료제, 승압제, 치매 치료제, 골다공증 치료제, 중증근무력증 치료제, 소화관 운동조절제, 조혈제, 배뇨장애 치료제, 만성 신장염 치료제, 면역 억제제, 이뇨제, 천식치료제 및 근이완제 약물 군 중의 어느 하나일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기 약물은 화합물 약물이거나, 단백질, 펩타이드, 핵산, PNA, 앱타머, 항체, 및 소분자의 생물학적 약물일 수 있다.

구체적으로는 상기 약물은 항암제이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 약물은 소수성 약물이다.

본 발명의 약물 전달용 나노입자는 에멀산으로 이루어진 쉘, 상기 에멀산 쉘 내부의 오일코어, 및 상기 오일코어에 분산되어 존재하는 소수성 항암 약물로 구성된다.

본 명세서에서 용어 "약물 전달용"은 약물을 생체 내 특정 부위에 전달시키기 위한 용도를 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노입자는 1nm 내지 1㎛, 10nm 내지 900nm, 10nm 내지 800nm, 100nm 내지 900nm 또는 100nm 내지 500nm 크기 일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용하는 용어 "에멀산" 은 Acinetobacter venetianus RAG-1에 의해 분비된 생체 고분자이다. 또한, D-galactosamine, D-galactosaminouronic acid 및 deoxyaminohexose의 삼당체 골격으로 구성된 A. venetianus에 의해 생성된 생체 고분자 물질인 리포다당체이다.

상기 에멀산은 다당체 및 지방산으로 구성되는 리포다당체로서, C₁₀ ~ C₂₂의 지방산 그룹은 에스테르 및 아미드 결합을 통해 다당체와 연결되어 있다.

에멀산은 지방산 가지를 갖는 음이온성 다당체이므로, 양친매성을 나타낸다.

상기 에멀산은 성장 조건에 따라 지방 아실 성분과 탄수화물 골격의 분지화정도가 달라져 조성이 다양하지만, 에멀산의 분자량은 대략 1,000 kDa이다.

상기 에멀산은 양친매성 분자로서 자기-조립(self-assembly) 특성을 이용하여 에멀산 쉘로 이루어지는 나노입자를 형성할 수 있다. 상기 에멀산 화합물의 구체적인 예로는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 들 수 있으나, 본 발명의 에멀산이 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약물 전달용 에멀산 나노입자는 나노입자의 내부에 오일코어(oil core)를 갖는다. 상기 오일코어는 소수성 약물이 나노입자의 내부에 안정적으로 존재하도록 유지시키는 역할을 한다. 따라서, 상기 오일은 소수성 약물을 안정적으로 유지시킬 수 있는 역할을 하는 한도 내에서 가능한 물질을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, (i) 에멀산으로 이루어진 쉘; 및 (ⅱ) 상기 에멀산 쉘 내부에 봉입된 항암 약물을 포함하는 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 나노입자의 쉘은 에멀산으로 이루어져 있다.

본 발명의 나노입자의 에멀산 쉘의 내부에는 항암 약물이 봉입되어 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 항암 약물은 소수성 항암 약물이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 항암 약물은 상기 오일 코어상에 분산되어 있다.

본 발명의 구체적인 일 구현예에 따르면, 상기 항암 약물은 광감작제 (photosensitizer)일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "광감작제(photosensitizer)"란 광의적으로 광화학적 반응에서의 촉매로 사용되는 물질을 의미하며, 광을 흡수하여 여기상태가 된 후 들뜬 에너지의 이동으로 근접하게 존재하는 기질분자를 들뜬 상태로 만들거나 기질분자와의 전자이동으로 라디칼 이온종을 만들 수 있는 물질을 의미한다. 보다 구체적으로는 상기 광감작제는 악성 종양이 의심되는 사람에게 조기 암과 전암 진단, 암 치료, 즉 광역학 치료(photodynamic therapy, PDT)를 목적으로 인체 내에 투여하는 약물을 의미한다. 광감작제는 암을 추적하여 암 조직에 고농도로 축적되도록 하고, 암이 의심되는 광감작제가 축적된 부위에 특정 파장의 빛(예를 들어 레이저 광)을 조사하게 되면 강한 형광이 발생하고 암 조직만을 특이적으로 괴사시키게 된다.

상기 광감작제는 예를 들어, 포르피린계(phorphyrins) 화합물, 클로린계(chlorins) 화합물, 박테리오클로린계(bacteriochlorins) 화합물, 프탈로시아닌계(phtalocyanine) 화합물, 나프탈로시아닌계(naphthalocyanines) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계(5-aminoevuline esters) 화합물 등의 다양한 화합물들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구제척인 일 구현예에 따르면, 상기 포르피린계 화합물의 광감작제는 페어포비드 에이(Pheophorbide a)일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노입자는 1nm 내지 1㎛, 10nm 내지 900nm, 10nm 내지 800nm, 100nm 내지 900nm 또는 100nm 내지 500nm 크기 일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 에멀산 나노입자에 관한 내용은 상기 본 발명의 다른 일 양태인 에멀산 나노입자에서 설명된 내용과 동일하므로 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 양 발명 사이에 동일한 내용은 중복하여 설명하지 않는다.

본 발명의 에멀산 나노입자는 종양 또는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물의 유효성분으로 이용된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 치료 대상 종양 또는 암은 편평상피세포암, 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 혈액암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 종양 또는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물의 적용 대상은 특별히 한정된 것은 아니나, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 인간을 포함한 포유동물에게 투여함으로써 종양 또는 암을 치료 또는 예방할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 설명된 유효성분인 에멀산 나노입자의 "약학적 유효량"을 포함한다.

본 명세서에서 용어 "약학적 유효량"은 상술한 에멀산 나노입자의 효능 또는 활성(예컨대, 항암 효능, 항종양 효능, 광역학적 치료 효능 등)을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 "약제학적으로 허용되는 담체"를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 당업자는 다양한 투여 방식 중에서 적합한 방식을 선택할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑기스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 약물 전달용 나노입자의 제조방법을 제공한다: (a) 에멀산을 유기용매-물 용액에 용해시키는 단계; (b) 약물을 유기용매에 용해시키는 단계; 및 (c) 상기 (a)단계에서 제조된 용액과, 상기 (b)단계에서 제조된 용액을 서로 혼합하여 반응시키는 단계.

본 발명의 상술한 약물 전달용 나노입자는 에멀산을 유기용매-물 용액에 용해시키는 단계; 약물을 유기용매에 용해시키는 단계; 및 상기 제조된 두 용액을 서로 혼합하여 반응시키는 단계로 제조된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 약물을 유기용매에 용해시키는 단계에서, 오일을 약물과 함께 유기용매에 용해시킬 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 에멀산을 유기용매-물 용액에 용해시키는 단계에서의 유기용매는 글리세롤(Glycerol)이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 약물을 유기용매에 용해시키는 단계에서의 유기용매는 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide: DMSO), 포름아마이드(Formamide) 및 디메틸포름아마이드(Dimethylformamide: DMF)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명의 약물 전달용 나노입자는 에멀산(Emulsan)으로 이루어진 쉘(shell) 및 상기 에멀산 쉘 내부에 봉입된 약물을 포함한다.

(ⅱ) 본 발명의 약물 전달용 나노입자는 생체내 수용성 특성과 혈액내 잔류 특성이 크게 향상되어 우수한 약물 전달 효과를 얻을 수 있으며, 특히 항암제 약물을 봉입하여 사용하는 경우 종양 선택성이 향상되어 우수한 항암 치료 효과를 얻을 수 있다.

(ⅲ) 본 발명의 약물 전달용 나노입자는 종양 또는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물의 활성 성분으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1a는 본 발명의 방법에 따라 제조된 약물 전달용 나노입자의 모식도이다.
도 1b는 에멀산의 농도에 따라 변화하는 Pba-Em-NP의 크기를 보여주는 그래프이다.
도 1c는 Pba-Em-NP의 크기와 제타 전위 분포 그래프이다. 실험결과는 평균±s.e. (n = 3)으로 나타냈다.
도 1d는 Pba-Em-NP의 투과 전자 현미경(TEM)로 관찰한 이미지와 크기 분포 그래프이다. 스케일 바는 100㎛ 크기를 나타낸다.
도 1e는 1주일 후 PBS(pH 7.4) 내의 Free Pba와 Pba-Em-NP 용액의 이미지이다. 각 이미지에서 왼쪽이 Free Pba이 포함된 용액이고 오른쪽은 Pba-Em-NP이 포함된 용액이다.
도 1f는 미리 결정된 시간 동안 레이저를 조사한 후 Free Pba 및 Pba-Em-NP에 의해 생성된 일중항 산소의 발생을 보여주는 그래프이다. (n = 3)
도 2a는 Free Pba 또는 Pba-Em-NP를 처리하고 2시간 동안 배양된 SCC7 마우스 편평 상피 암 세포의 형광 이미지이다. 스케일 바는 20㎛ 크기를 나타낸다.
도 2b는 Pba를 농도별로 처리된 SCC7 세포에서 Pba의 형광 강도를 보여주는 그래프이다. 실험결과는 평균±s.e.(n = 10)으로 나타냈다.
도 2c는 암조건에서 Pba를 농도별로 처리된 SCC7 세포에서 XTT 분석을 통한 세포 생존률 그래프이다. 실험결과는 평균±s.e.(n = 5)으로 나타냈다.
도 2d는 레이저 조사(671nm, 0.3W, 1J) 후에 XTT 분석을 통한 세포 생존률 그래프이다. 레이저 조사 전, SCC7 세포에 Free Pba 또는 Pba-Em-NP를 2시간 동안 처리하였다. 실험결과는 평균±s.e. (n = 5)으로 나타냈다.
도 3a는 SCC7 종양 보유 마우스에 Free Pba 또는 Pba-Em-NP를 정맥 주사한 후 촬영한 전신 분포의 실시간 NIRF 이미지이다.
도 3b는 평균 근적외선 형광(NIRF) 방사 효율([p/s/cm²/sr)/(mW/cm²)]에 근거한 종양 부위의 시간-의존 형광 강도 분석 그래프이다. 실험결과는 평균±s.e. (n = 3)으로 나타냈다.
도 3c는 Free Pba 또는 Pba-Em-NP를 처리한 마우스에서 추출한 혈액 샘플의 형광 이미지이다.
도 3d는 근적외선 형광(NIRF) 방사 효율을 기준으로 한 혈액 형광 강도를 정량화한 그래프이다.
도 4a는 SCC7 종양 보유 마우스에 Free Pba 또는 Pba-Em-NP를 주사하고 24시간 후에 해부된 종양 및 주요 장기 (심장, 폐, 간, 비장 및 신장)의 생체 외(Ex vivo) NIRF 이미지이다.
도 4b는 평균 근적외선 형광(NIRF) 방사 효율을 기준으로 한 종양 조직 및 주요 장기(심장, 폐, 간, 비장 및 신장)의 형광 강도 분석 그래프이다.
도 4c는 Free Pba 또는 Pba-Em-NP를 주사하고 24시간 후, 해부된 종양 조직의 형광 이미지이다. 스케일 바는 200㎛ 크기를 나타낸다.

실시예

실험 재료 및 방법

1. 재료

에멀산(Em)은 Salandis GbR (Greifswald, Germany) 에서 구입했다. 페어포비드 에이(Pba, Pheobphorbid a)는 Frontier Scientific Inc (Logan, UT, USA) 에서 구입했다. 아마씨오일은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)의 제품을 구입했다. Triton X-100 와 99.0% 디메틸설폭시드(DMSO)는 Samchun(서울, 강남구, 한국)으로부터 구입하였다. 99.9% 에틸알콜은 Duksan (성남, 경기도, 한국)으로부터 구입하였다. 최적 절삭 온도 (O.C.T, Optimal cutting temperature) 화합물은 Sakuraㄾ Finetek (동경, 일본)로부터 구입하였다. 일중항 산소 녹색 시약(SOSG) 과 Hoechst 33342는 Thermo fisher scientific (Waltham, Massachusetts, USA)으로부터 구입하였다. XTT(2,3-비스-(2-메 톡시-4-니트로-5-설포 페닐)-2H-테트라 졸륨-5-카르복실아닐리드)는 Invitrogen社(Carlsbad, CA)에서 구입하였다. PMS(Phenazine Methyl Sulfate)는 Tokyo chemical industry(동경, 일본)에서 구입하였다. 4% 파라 포름알데히드는 Biosesang(성남, 경기도, 한국)에서 구입하였다. DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline), RPMI(Roswell park memorial institute) 배지 및 FBS (Fetal Bovine Serum)는 Biowest (Nuaille, France)에서 구입했다. 항생제-항진균제 용액과 0.05% 트립신-EDTA는 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다.

2. 나노입자 제조

페어포비드에이(Pba)를 포함하는 에멀산 나노입자(Pba-Em-NP)는 수중유(O/W) 에멀젼 방법으로 제조하였다. 페어포비드에이(Pba, 3mg)와 아마씨 오일(50mg)을 DMSO 100㎕에 녹였다. 또한, 2.4 ml의 2%(v/v) 글리세롤-물 용액에 에멀산 Ⅱ(10 mg)를 60℃에서 용해시켰다. 상기 제조한 2개의 용액, 즉 Pba 포함 용액과 에멀산Ⅱ 용액을 혼합하고 혼합물을 10분 동안 프로브 초음파기(SONIC&MATERIAL INC, Newtown, CT, USA)에 의한 초음파 처리 하에 분산시켰다. 입자에 포함(로딩)되지 못한 Pba는 투석(MWCO:13KD)에 의해 증류수에서 1시간 동안 제거하였다.

3. 나노입자의 특성 측정

Zetasizer(Nano ZS90, Malvern Instruments, Malvern, UK)을 사용하여 Pba-Em-NPs의 크기와 제타 전위를 25℃ 온도의 PBS(pH 7.4)에서 측정했다. Pba-Em-NPs의 이미지를 얻기 위해, 2%(w/v) 우라닐 아세테이트 용액을 사용하여 음성 염색을 한 투과 전자 현미경(TEM)을 사용했다. 나노입자에 포함된(로딩된) Pba의 양을 측정하기 위해, 시너지 H1 하이브리드 다중-모드 리더(Biotek Instruments, Inc., Winooski, YT, USA)를 사용하여 Pba(415/668nm)의 형광을 분석했다. Pba의 형광은 세제 용액(DMSO:PBS:DW=5:4:1, 1% Triton X-100)에 의해 완전히 용해한 후에 측정하였다. Free Pba와 Pba-Em-NP의 일중항 산소 발생은 SOSG으로 측정하였다. 각 샘플 (1μg/ml)을 DPBS (0.06ug/ml)안에서 SOSG와 혼합하고 671nm 레이저로 여러 다른 시점에서 조사하였다. 그 다음, 모든 샘플로부터의 SOSG 형광(λex/λem = 488/525nm)을 시너지 H1 하이브리드 다중-모드 판독기(Biotek Instruments, Inc., Winooski, YT, USA)로 측정하였다.

4. 세포 흡수 분석

시험관 내(in vitro) 연구는 SCC7 세포주(마우스 편평상피 암세포주)로 수행하였다. SCC7 세포는 American Type Culture Collection(Rockville, MD)으로부터 얻었다. 세포주를 10% FBS와 1% 항생제-항진균제가 함유된 RPMI 배지에서 37℃의 온도 및 5% CO₂조건에서 배양하였다. 먼저 SCC7 세포를 각 웰당 2×10⁴ 세포 수로 24-웰 플레이트에 분주하고 2일 동안 성장시켰다. 다음으로 DPBS 2회 세척 후, 무혈청 배지 내에서 세포에 다양한 농도의 Free Pba 또는 Pba-Em-NP(1-4㎍/ml)를 처리하고 2시간 동안 배양하였다. 세포를 DPBS로 2번 세척하고, 4% 파라 포름 알데히드로 4℃에서 30분간 고정시켰다. 이후 세포를 Hoechst 33342(2㎍/ml)로 15분간 염색한 후 DPBS로 세척하였다. 세포 영상화를 형광 도립 현미경 IX 71(Olympus, Tokyo, Japan)으로 검사하였다.

5. XTT 분석

SCC7 세포의 생존력 시험은 XTT 분석으로 수행하였다. SCC7 세포를 각 웰 당 1×10⁴ 세포 수로 96-웰 플레이트에서 배양하고 하루 동안 성장시켰다. 이어서, 세포를 무혈청 배지에서 100㎕의 Free Pba 또는 Pba-Em-NPs(1-4㎍/ml)로 2시간 동안 처리하였다. DPBS로 세척 한 후, 배지를 완전 성장 배지로 교체하였다. 이어서 각 시료를 XTT 분석을 수행하여 암흑 독성을 관찰하였다. 시험관 내에서 광역학 효과를 시험하기 위해, 레이저(671nm, 0.3W, 1J)를 각 웰에 조사하고, 시료들에 웰 당 25㎕의 XTT 용액(7.5㎍/ml PMS를 함유하는 무혈청 배지 안에 1mg/ml)을 처리하였다. 2시간 동안 37℃에서 배양 한 후, 450nm에서의 흡광도를 다중-모드 리더(Multi-Mode Reader)로 측정하였다.

6. 생체 내(in vivo) 및 생체 외(ex vivo) 영상화

생체 내(in vivo) 영상화를 위해 C3H/HeN 생쥐(3 주령, OrientBio, 성남시, 한국)를 사용하였다. 종양 모델(각 그룹 당 n=3)을 확립하기 위해, 배양 배지(100㎕)에 포함된 2×10⁶ SCC7 세포를 마우스의 왼쪽 대퇴부 영역에 피하 주사하였다. 종양 크기가 약 150±30 mm³정도로 증가했을 때, Free Pba 또는 Pba-Em-NPs(100㎕ 생리 식염수 안에 2.5mg/kg의 Pba)를 꼬리 정맥을 통해 마우스에 주입하였다. 마우스를 이소플루레인으로 호흡기 마취시켰다. 시료 주입 후 1, 3, 6, 12 및 24 시간별로 여기상태 660nm, 들뜬상태 710nm(Cy5.5필터)에서 IVIS Lumina XRMS(PerkinElmer Inc, Waltham, Massachusetts, USA)로 각각의 마우스에 대해 전신 영상 이미지를 얻었다. 마우스의 꼬리를 절단하여 미리 결정한 시점(1, 3, 6, 12 및 24 시간)별로 혈액 샘플을 채취하였다. 384 HT 플레이트에서 수집된 혈액을 세제 용액(DMSO:DW=4:1, 2% Triton X-100)과 혼합하고 IVIS Lumina XRMS로 각각의 웰에 대한 형광 세기를 측정하였다. 샘플 주사 후 24 시간에, 종양 및 주요 장기(심장, 폐, 간, 비장 및 신장)를 해부하여 IVIS Lumina XRMS로 이미지(영상)을 얻었다.

마우스로부터 해부된 종양 샘플을 O.C.T 화합물로 몰드에 수집하고 -80℃에서 보관하였다. 종양을 7㎛ 두께로 절단한 후, 종양 절편을 DPBS로 3회 세척하고 Hoechst 33342 (2㎍/ml)로 10분간 염색하였다. 그 후, 형광 도립 현미경으로 형광 이미지를 얻었다.

실험결과

1. Pba-Em-NP의 제조 및 특성 분석

자기-조립(self-assembly)을 통한 일반적인 수중유(O/W) 에멀젼 방법을 이용하여 에멀산 나노입자를 제조하였다. 에멀산 쉘에 의해 보호되는 아마씨 오일 코어안에, 모델 약물로서 근적외선 파장을 가진 광감작제 페어포비드 에이(Pba)를 로딩하여 사용하였다(도 1a). 제조과정에서, 에멀산의 농도를 증가시키면서 나노 입자의 크기를 측정한 결과, 나노입자는 1.5 mg/ml의 에멀산 농도부터 200nm 이하로 안정화 되었다(도 1b). Pba를 포함한 에멀산 나노입자(Pba-Em-NPs)의 크기와 제타 전위를 DLS를 통해 측정한 결과, 평균 입자 크기는 약 165.7nm 이었고, -29.4mV의 음성 표면 전하를 나타냈다(도 1c). 수성 조건하에서 투과 전자 현미경(TEM) 이미지를 확인한 결과 구형 모양을 나타내었다(도 1d). 또한, Pba-Em-NP는 PBS(pH 7.4)에서 0.5 mg/ml Pba의 농도에서 1주일 이상 저장하였을 때, 높은 안정성을 나타내며 응집을 보이지 않았지만, Free Pba는 동일한 조건에서 큰 응집체를 형성했다(도 1e). Pba-Em-NP에서의 약물 적재(로딩) 효율은 90.2±5.3%였다. Pba-Em-NP로부터 약물 방출 정도를 분석하기 위해, 1개월 이상의 방출된 Pba농도를 측정하였지만 방출된 Pba의 농도를 감지하기에는 충분하지 않았으며, 이것은 나노입자(NPs)에 포함된 페어포비드 에이(Pba)의 우수한 안정성을 의미한다. 레이저를 조사 후 생성된 일중항 산소를 측정하기 위해 일회용 산소 센서 녹색(SOSG)을 사용했다 (도 1f). Free Pba 및 Pba-Em-NP는 모두 레이저에 조사되었을 때 현저한 차이가 없이 비슷한 일중항 산소 생성율을 나타냈다.

2. Pba-Em-NP의 생체 외(in vitro) 세포 흡수

Pba-Em-NP의 세포 흡수를 비교 관찰하기 위해 SCC7 마우스 편평상피 암세포를 다양한 농도의 Pba-Em-NP 및 Free Pba와 함께 2 시간 동안 배양하였다(도 2a). 형광 이미지에서, Pba-Em-NP는 종양세포에서 빠른 세포 흡수를 나타내는 Free Pba의 경우보다는 조금 약하지만 강한 Pba형광 신호를 용량 의존적으로 나타냈다. 또한, 다양한 Pba(1~4㎍/ml)농도의 세포 흡수 분석에서 세포 흡수 이미지와 유사한 경향이 관찰되었다(도 2b).

3. Pba-Em-NPs의 세포 독성 시험 및 광역학 효과

Free Pba 및 Pba-Em-NP의 시험관 내(in vitro) 세포 독성 시험과 광역학 효과를 SCC7세포를 이용하여 XTT 테스트로 평가했다. 먼저, 암조건에서 상이한 Pba 농도별로 Free Pba 및 Pba-Em-NP를 처리한 후 세포 생존력을 평가했다(도 2c). Free Pba 및 Pba-Em-NP 처리된 세포는 4㎍/ml의 Pba 농도 까지 80% 이상의 생존력을 나타내어 암조건에서 Pba-Em-NP는 의미있는 세포 독성을 나타내지 않았다. 0.3W(1J)에서 671 nm 레이저 조사에 의해, 광역학 효과 때문에 Pba-Em-NP 처리된 세포의 생존능력은 Free Pba 처리된 세포의 생존 능력과 비슷하게 감소했다(도 2d). 세포 사멸 비율은 Pba 농도의 증가에 따라 증가하였고, Pba-Em-NP는 광역학 치료에 대한 가능성을 나타냈다.

4. SCC7 종양 보유 마우스에서 Pba-Em-NP의 생체 내 (In vivo) NIR 형광 이미지

생체 내 분포를 분석하기 위해, Free Pba 및 Pba-Em-NPs(2.5mg/kg Pba)를 SCC7 종양 보유 마우스에게 정맥 내 주사 하였다. 미리 결정된 주입 후 시간별로 획득한 형광 이미지를 IVIS Lumina XRMS 시스템을 이용하여 X선 영상과 중첩시켰다. Pba-Em-NP 처리된 마우스에서 종양 부위의 근적외선 형광(NIRF) 신호는 주사 후 24 시간까지 점진적으로 증가하여 EPR 효과를 통해 종양 부위에 Pba의 높은 축적을 나타냈다(도 3a).

Free Pba 처리된 마우스는 Pba-Em-NPs 처리된 그룹보다 종양 부위에서 NIRF 신호가 약했다.

주사 후 24 시간에서 Pba-Em-NP 처리된 마우스의 종양 부위에서 나타난 근적외선 형광 강도는 Free Pba 처리된 마우스보다 약 3.5배 높게 나타내며, Pba-Em-NP의 향상된 종양 표적화 능력을 의미한다(도 3b). 또한, Free Pba 또는 Pba-Em-NP 처리된 마우스에서 얻은 혈액에 대한 형광 이미지 및 강도를 관찰하였다(도 3c 및 도 3d). Pba-Em-NP 처리된 마우스에서 얻은 혈액 샘플은 모든 시간 범위에서 Free Pba 처리된 마우스보다 더 긴 혈액 순환을 나타냈다.

5. 해부된 기관 및 종양 조직의 생체 외(ex vivo) 분석

주사 후 24 시간에서 주요 장기 및 종양 조직을 해부하여 생체외 NIRF 이미지를 얻었다. Pba-Em-NP 처리된 마우스는 Free Pba 처리된 마우스 보다 모든 주요 장기(심장, 폐, 간, 비장 및 신장) 및 종양에서 더 높은 NIRF 강도를 나타냈다(도 4a). 또한 해부된 종양에서 NIRF 신호 강도는 생체 내 결과와 비슷하게 Pba-Em-NP 처리된 마우스가 Free Pba 처리 마우스보다 3.04 배 더 높았다 (그림 4b). 각 그룹의 종양 조직의 동결 절편을 현미경으로 관찰하였다 (도 4c). Pba-Em-NP로 처리된 종양은 Free Pba 처리된 종양보다 높은 Pba 형광 신호를 나타내어, Pba-Em-NP의 효율적인 전달에 의해 종양 부위에서 Pba가 높게 축적됨을 의미한다.

본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.

Claims

(i) 에멀산(emulsan)으로 이루어진 쉘(shell); 및 (ⅱ) 상기 에멀산 쉘 내부에 봉입된 약물(drug)을 포함하는 약물 전달용 나노입자.
제 1 항에 있어서, 상기 에멀산 쉘 내부는 오일(oil)이 채워진 오일 코어(oil core) 형태인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 나노입자.
제 2 항에 있어서, 상기 약물은 소수성(hydrophobic) 약물인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 나노입자.
제 3 항에 있어서, 상기 약물은 상기 오일 코어상에 분산되어 있는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 나노입자.
제 1 항에 있어서, 상기 나노입자의 평균 직경은 1 나노미터(nm) 내지 1 마이크로미터(㎛)인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 나노입자.
(i) 에멀산으로 이루어진 쉘; 및 (ⅱ) 상기 에멀산 쉘 내부에 봉입된 항암 약물을 포함하는 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 에멀산 쉘 내부는 오일이 채워진 오일 코어 형태인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 항암 약물은 소수성 항암 약물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 8 항에 있어서, 상기 항암 약물은 상기 오일 코어상에 분산되어 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 8 항에 있어서, 상기 항암 약물은 광감작제(photosensitizer)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 광감작제는 포르피린계(phorphyrins) 화합물, 클로린계(chlorins) 화합물, 박테리오클로린계(bacteriochlorins) 화합물, 프탈로시아닌계(phtalocyanine) 화합물, 나프탈로시아닌계(naphthalocyanines) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계(5-aminoevuline esters) 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 11 항에 있어서, 상기 포르피린계 화합물의 광감작제는 페어포비드 에이(Pheophorbide a) 인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 나노입자의 평균 직경은 1 나노미터(nm) 내지 1 마이크로미터(㎛)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 치료 대상 암은 편평상피세포암, 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 혈액암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
다음의 단계를 포함하는, 제 1 항의 약물 전달용 나노입자의 제조방법:
(a) 에멀산을 유기용매-물 용액에 용해시키는 단계;
(b) 약물을 유기용매에 용해시키는 단계; 및
(c) 상기 (a) 단계에서 제조된 용액과, 상기 (b)단계에서 제조된 용액을 서로 혼합하여 반응시키는 단계.
제 15 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 오일을 약물과 함께 유기용매에 용해시키는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 나노입자의 제조방법.
제 15 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 유기용매는 글리세롤(Glycerol)이고, 상기 단계 (b)에서의 유기용매는 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide: DMSO), 포름아마이드(Formamide) 및 디메틸포름아마이드(Dimethylformamide: DMF)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 약물전달용 나노입자의 제조방법.