WO2005082923A1

WO2005082923A1 - 塩基部無保護法による新規核酸合成法

Info

Publication number: WO2005082923A1
Application number: PCT/JP2005/003053
Authority: WO
Inventors: Mitsuo Sekine; Kohji Seio; Akihiro Ohkubo
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2004-03-01
Filing date: 2005-02-24
Publication date: 2005-09-09
Also published as: CA2558581A1; EP1721908A4; EP1721908A1; US7807821B1; JPWO2005082923A1

Abstract

　本発明の目的は、これまでの塩基部無保護法においては１２量体の合成が限界であったが、本発明により、塩基部位を全く保護しないで、少なくとも１０量体の核酸分子オリゴマー、例えば、２０量体程度のＤＮＡオリゴマーを固相法において極めて高純度で合成することができる、新たな核酸オリゴマーの合成方法を提供することである。　本発明は、ホスホロアミダイト法においてアルコール型活性化剤、又は、アルコール型活性化剤及び酸触媒の組み合わせを用いることを特徴とする、核酸オリゴマーの合成方法等に関する。

Description

明細書

塩基部無保護法による新規核酸合成法

技術分野

[0001] 本発明は、塩基部無保護法による新規核酸合成方法、特に、ホスホロアミダイト法にお、てアルコール型化合物を活性化剤として用いることを特徴とする、核酸オリゴマーの合成方法に関する。

関する。

背景技術

[0002] 従来、塩基部位を保護しな!、で DNAをィ匕学合成する方法としては、ホスホ-ゥム型縮合剤 BOMPを用いて水酸基選択的な縮合反応を行う H-ホスホネート法が知られている（非特許文献 1)。この反応では、縮合反応中に生成する活性なホスファイト中間体が、塩基部のアミノ基よいも水酸基に対して優先的に反応することを利用している。

[0003] 非特許文献 1： Wada.T.; Sato, Y.; Honda, F.; Kawahara, S.; Sekine, M., Journal of the American Chemical Society 1997, 119, 12710—12821

特許文献 2 : Gryaznov, S. M.; Letsinger, R. L., Journal of the Americanし hemical Society 1991, 113, 5876-5877

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] しかしながら、上記の H-ホスホネート法では、鎖長が長くなるにつれて、 DNA合成において分子内環化反応のような塩基部位での副反応が指数関数的に増えるため、 12量体を過ぎると主生成物として目的の DNAオリゴマーを得ることは極めて困難であった。また、シトシン塩基を含む DNAは副反応が多ぐこれを防ぐよい方法は知られていなかった。

課題を解決するための手段

[0005] そこで、本発明者は、長鎖オリゴマーの合成が容易なホスホロアミダイト法 (非特許文献 2)において、活性なホスファイト中間体を形成することによって、水酸基選択的なリン酸ィ匕を利用した DNA合成法が可能になるのでな、かと考え、鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成した。

[0006] 即ち、本発明は、ホスホロアミダイト法においてアルコール型活性化剤、好ましくは、アルコール型活性化剤及び酸触媒の組み合わせを用いることを特徴とする、核酸オリゴマーの合成方法に係る。

発明の効果

[0007] これまでの塩基部無保護法においては 12量体の合成が限界であった力本発明により、塩基部位を全く保護しないで、少なくとも 10量体の核酸分子オリゴマー、例えば、 20量体程度の DNAオリゴマーを固相法にぉ、て極めて高純度で合成することが可能となる。力かる DNAオリゴマーは DNAチップ用に有利に使用することが出来る。

発明を実施するための最良の形態

[0008] 本明細書にぉ、て、「アルコール型活性化剤」とは、ホスホロアミダイト法にお!、て活性なホスファイト中間体の形成を可能にする化合物であり、脂肪族炭化水素んいおける水素原子が水酸基に置換されたィヒ合物を意味するものではな、。アルコール型活性化剤としては当業者に公知の任意の化合物を使用することができるが、高い縮合効率 (例えば、 95%以上）を得る為には、特に、ヒドロキシベンゾトリアゾール -1 -オール (HOBt)、 HOBt誘導体、及びフノール類縁体力もなる群力も選択される化合物が好ましい。 HOBt誘導体としては、ニトロ、ブロモ、ョード、トリフロメチル基等の置換基が 1一 4個導入されたもの、例えば、 6—トリフロメチルベンゾトリアゾール—1 オール、 6—二トロべンゾトリァゾールー 1 オール、又は 4一二トロー 6 トリフロメチルべンゾトリァゾールー 1 オールのような HOBt誘導体が好ましぐ 4及び Z又は 6位にトリフロメチル及び-トロ基のような各種置換基を有する HOBt誘導体が特に好ましい。

[0009] フエノール類縁体としても当業者に公知の任意の化合物を使用することが出来るが、同様に高い縮合効率を得る為には、 2, 4ージニトロフエノール、 3, 4—ジシァノフエノール及び 2—-トロー 4 トリフルォロメチルフエノールが好適である。

[0010] 一方、酸触媒としては当業者に公知の任意の化合物を使用することが出来るが、特に、イミダゾール、テトラゾール、及びそれらの誘導体が好ましい。これらの好適な具体例として、ベンズイミダゾールトリフラート（BIT)、 4ーェチルチオテトラゾール、ィミダゾリゥムトリフラート、及び 4, 5—ジシァノイミダゾール等を挙げることが出来る。

[0011] アルコール型活性化剤及び酸触媒の組み合わせにおいて、その量比は、各化合物の種類、反応溶媒等の諸条件に応じて当業者が適宜選択することができる。通常

、 1 : 10— 10 : 1の当量比である。

[0012] 本発明の合成反応は固相又は液相等の任意の系で実施することが出来るが、ェ業的にオリゴマーを合成するような場合には固相担体を用いる合成方法が好ましい。固相担体は当業者に公知の任意の物質、例えば、 CPG又は HCPを使用することが出来る。

[0013] 本発明にお、て、核酸は DNA又は RNAであり、それを構成する塩基は天然構造以外に、糖部位にシクロヌクレオシド骨格を有するもの、その 2'及び Z又は 4'に各種置換基を有するもの等の各種修飾体及び変異体も含まれる。更に、リン酸基に関しても、例えば、ホスホロチォエートまたはメチルホスホネートのような骨格を有するものち含まれる。

[0014] ホスホロアミダイト法において、本明細書中に特記されていない各種反応条件は、本発明の実施に際して、当業者が適宜選択することが出来るものである。

実施例

[0015] 以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。

[0016] 実施例 1 : 2量体の固相合成

末端にチミジンを導入した HCP固相担体を使用して、本発明方法における水酸基選択性を検討した。 HCP固相担体上の末端水酸基に対して各塩基 (A, C, G, T) を含むアミダイトユニット 20当量と各種活性化剤 40当量を用いて、 1分間リン酸化反応を行った後、 0. 1Mヨウ素溶液 (ピリジン:水 = 9 : 1)で酸ィ匕した (室温で 2分間）。次に、 3%トリクロ口酢酸- CH C1溶液により DMTr基を脱保護し (室温、 1分間）、続

2 2

いてアンモニアによるリン酸保護基（2—シァノエチル基)の切り出し '脱保護（室温、 1 2時間）を行った。

活性化剤として従来の IMTを活性化剤として使用した場合には、 d [ApT]及び d [ CpT]が夫々、 77%及び 83%の水酸基選択性で得られた。これに対して、活性化剤として、 HOBt活性化剤としてを使用した場合には、 d[ApT]及び d[CpT]が夫々、 9 9. 7%及び 99. 9%の水酸基選択性で得られた。ここで、水酸基選択性は、 HPLC チャートに現れる目的化合物のピークと N—リン酸体のピークの面積比から産出した値である。

[0017] 実施例 2 : 3量体の固相合成

更に、塩基部無保護 DNA合成における HOBtの有用性を確認する為に、各種の 3量体を合成した。まず、実施例 1の方法において HOBtを活性化剤として使用して、各種 2量体を合成し、その後、さらに縮合反応を行い、各種 3量体を合成した。 d[T pApT]及び d [TpCpT]の合成にお!/、て、 IMTを使用したときにはかなりの量の副反応生成物が観察された。

以上の結果を表 1に示す。尚、表 1には、 CH3CN— NMP混合溶媒系でプロトンブロック法の活性化剤である NBTを使用した場合の結果も併せて記載されて!、る。

[0018] [表 1]

% ratio of the desired product

ljio₂

compd polymer final product f、> OTf

H J

OH OH 5：

OH

IMT HO^tfBt HOⁿBt HO^ntBt DNP

2-1 la T-HCP ApT 77.0% 99.2% 99.7% 99.3% 98.8% 96.1% 97.1 %

2-1 lc T-HCP CpT 82.9% 99.0% 99.9% 98.9% 99.8% 92.4% 99.5%

2-Π g T-HCP GpT >99.9% >99.9% >99.9% >99.9% >99.9% >99.9% >99.9%

2-4 diApTl-HCP TpApT 90.5% >99.9% >99.9% 99.1% 97.5% 96.7% 99.6%

2-4 d[CpT]-HCP TpCpT 9.7% 99.8% >99.9% 98.7% 97.2% 64.7% 99.4%

2-4 d[GpT]-HCP TpGpT >99.9% z >99.9% >99.9% >99.9% >99.9% >99.9% >99.9

I舌

[0019] 実施例 3： DNA合成機を用いる長鎖オリゴマーの合成

d[CCCCCTTTTCTCTCTCTCT]と [TTAAAAATTAT

成は Applied Biosystem Inc.(ABI)の DNA/RNA Synthesizer 392を使用した。 DNAオリゴマーの自動合成機による合成は、末端にチミジンを導入した HCP固相担体（1 μ mol, 28 μ mo/g,サクシ-ルリンカー)、また活性化剤として 0.2M HO^tfBt (6-トリフルォロメチルベンゾトリアゾール -1-オール：アルコール型活性化剤)及び 0.2M BIT (ベンズイミダゾールトリフラート：酸触媒)の混合物の CH CN - N-メチル 2-ピロリドン（15:1,

3

v/v)溶媒を用いて行った。合成各鎖伸長サイクルは、以下の表 2に示すとおりである

[0020] [表 2]

step operation reagent(s time

(min

1 washing

0.2 2 detritylatio 3% C1₃CC00H / CH₂C1₂ 1.5 n

3 washing CH,CN 0.4 4 coupling O. lM amidite + 0.2M H0^tfBt + 0.2M BIT in CH₃CN-NMP 1.0

( 15 : 1, v/v)

5 washing CH₃CN 0.2 6 coupling O. lM amidite + 0.2M H0^tfBt + 0.2M BIT in C¾CN-N P 1.0

( 15 : 1, v/v) ·

7 washing

0.2 8 oxidation 0. 1M I₂ in Py-H₂0-THF (20:2:78, v/v/v) 0.5 9 washing CH₃CN 0.4

[0021] 続いて、 DMTr基を 1分間の CH CI (2 mL)中の 3%トリクロ口酢酸で除去し、 CH CI (1

2 2 2 2 mL x 3), CH CN (1 mL x 3)で固相担体を洗浄した。最後に、固相担体を 40分間の

3

濃アンモニア水 (500 μ L)処理で切り出し、脱保護を行って目的物を得た。

d[CCCCCTTTTCTCTCTCTCT] , Mass (M+H) calcd 5868.23, found 5869.92;

Enzyme Assay dC:T = 1.00:0.99, isolated yield 79%.

[TTAAAAATTATTAAATTATT] , Mass (M+Na) calcd 6130.31, found 6132.69; Enzyme Assay dA:T =1.00:0.94, isolated yield 31%. 産業上の利用可能性

20量体程度の DNAフラグメントは遺伝子診断で汎用されているァフィメトリック社型の DNAチップで必要とされて!/、る鎖長であり、この長さの DNAが塩基部位無保護で合成が可能になったことは，きわめてコストパホーマンスのよい DNAチップのハイスループト調製への糸口を切り開くもので、バイオ分野に与える影響は大きい。本発明は、塩基部無保護法で初めての実用的レベルに達した合成法であり、本発明方法で合成された核酸オリゴマーの SNP解析などの遺伝子診断への応用が期待される

Claims

請求の範囲

[I] ホスホロアミダイト法にお!、てアルコール型化合物を活性化剤として用いることを特徴とする、核酸オリゴマーの合成方法。

[2] ホスホロアミダイト法において、アルコール型活化合物及び酸触媒の混合物を活性ィ匕剤として用いることを特徴とする、核酸オリゴマーの合成方法。

[3] アルコール型化合物がヒドロキシベンゾトリァゾールー 1 オール（HOBt)、 HOBt誘導体、及びフノール類縁体力なる群力選択される、請求項 1又は 2記載の合成方法。

[4] HOBt誘導体が 4及び Z又は 6位に置換基を有する、請求項 1又は 2記載の合成方法。

[5] HOBt誘導体が、 6—トリフロメチルベンゾトリァゾールー 1 オール、 6—-トロベンゾトリァゾールー 1 オール、又は 4一二トロー 6 トリフロメチルベンゾトリァゾールー 1 オールである、請求項 4記載の合成方法。

[6] フエノール類縁体が 2, 4—ジニトロフエノール、 3, 4—ジシァノフエノール及び 2—-トロ

4 トリフルォロメチルフエノールカ成る群力選択される、請求項 3記載の合成方法。

[7] 酸触媒が、イミダゾール、テトラゾール、及びそれらの誘導体から成る群から選択される、請求項 2— 6のいずれか一項に記載の合成方法。

[8] 酸触媒が、ベンズイミダゾールトリフラート（BIT)、 4ーェチルチオテトラゾール、イミダゾリゥムトリフラート、又は 4, 5—ジシァノイミダゾールである、請求項 7記載の合成方法。

[9] アルコール型活化合物及び酸触媒を等量含む混合物を活性化剤として使用する、請求項 1一 8のいずれか一項に記載の合成方法。

[10] 固相担体を用いる、請求項 1一 9のいずれか一項に記載の合成方法。

[II] 請求項 1一 10のいずれか一項に記載の合成方法によって調製された、少なくとも 10 量体の核酸分子オリゴマー。

[12] 20量体の DNAオリゴマーである、請求項 11記載の核酸分子オリゴマー。

[13] DNAチップ用の請求項 11又は 12に記載の核酸分子オリゴマー。