JPWO2005082923A1 - 塩基部無保護法による新規核酸合成法 - Google Patents
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Abstract
Description
関する。
末端にチミジンを導入したHCP固相担体を使用して、本発明方法における水酸基選択性を検討した。HCP固相担体上の末端水酸基に対して各塩基(A,C,G,T)を含むアミダイトユニット20当量と各種活性化剤40当量を用いて、1分間リン酸化反応を行った後、0.1Mヨウ素溶液(ピリジン:水=9:1)で酸化した(室温で2分間)。次に、3%トリクロロ酢酸―CH2Cl2溶液によりDMTr基を脱保護し(室温、1分間)、続いてアンモニアによるリン酸保護基(2−シアノエチル基)の切り出し・脱保護(室温、12時間)を行った。
活性化剤として従来のIMTを活性化剤として使用した場合には、d[ApT]及びd[CpT]が夫々、77%及び83%の水酸基選択性で得られた。これに対して、活性化剤として、HOBt活性化剤としてを使用した場合には、d[ApT]及びd[CpT]が夫々、99.7%及び99.9%の水酸基選択性で得られた。ここで、水酸基選択性は、HPLCチャートに現れる目的化合物のピークとN−リン酸体のピークの面積比から産出した値である。
更に、塩基部無保護DNA合成におけるHOBtの有用性を確認する為に、各種の3量体を合成した。まず、実施例1の方法においてHOBtを活性化剤として使用して、各種2量体を合成し、その後、さらに縮合反応を行い、各種3量体を合成した。d[TpApT]及びd[TpCpT]の合成において、IMTを使用したときにはかなりの量の副反応生成物が観察された。
以上の結果を表1に示す。尚、表1には、CH3CN−NMP混合溶媒系でプロトンブロック法の活性化剤であるNBTを使用した場合の結果も併せて記載されている。
d[CCCCCTTTTCTCTCTCTCT]と[TTAAAAATTATTAAATTATT]それぞれの合成はApplied Biosystem Inc.(ABI) のDNA/RNA Synthesizer 392を使用した。DNAオリゴマーの自動合成機による合成は、末端にチミジンを導入したHCP固相担体 (1 μmol, 28 μmo/g, サクシニルリンカー)、また活性化剤として0.2M HOtfBt (6-トリフルオロメチルベンゾトリアゾール-1-オール:アルコール型活性化剤)及び0.2M BIT (ベンズイミダゾールトリフラート:酸触媒)の混合物のCH3CN - N-メチル2-ピロリドン (15:1, v/v)溶媒を用いて行った。合成各鎖伸長サイクルは、以下の表2に示すとおりである。
d[CCCCCTTTTCTCTCTCTCT], Mass (M+H) calcd 5868.23, found 5869.92; Enzyme Assay dC:T = 1.00:0.99, isolated yield 79%.
[TTAAAAATTATTAAATTATT], Mass (M+Na) calcd 6130.31, found 6132.69; Enzyme Assay dA:T =1.00:0.94, isolated yield 31%.
Claims (13)
- ホスホロアミダイト法においてアルコール型化合物を活性化剤として用いることを特徴とする、核酸オリゴマーの合成方法。
- ホスホロアミダイト法において、アルコール型活化合物及び酸触媒の混合物を活性化剤として用いることを特徴とする、核酸オリゴマーの合成方法。
- アルコール型化合物がヒドロキシベンゾトリアゾール−1−オール(HOBt)、HOBt誘導体、及びフェノール類縁体からなる群から選択される、請求項1又は2記載の合成方法。
- HOBt誘導体が4及び/又は6位に置換基を有する、請求項1又は2記載の合成方法。
- HOBt誘導体が、6−トリフロメチルベンゾトリアゾール−1−オール、6−ニトロベンゾトリアゾール−1−オール、又は4−ニトロ−6−トリフロメチルベンゾトリアゾール−1−オールである、請求項4記載の合成方法。
- フェノール類縁体が2,4−ジニトロフェノール、3,4−ジシアノフェノール及び2−ニトロ−4−トリフルオロメチルフェノールから成る群から選択される、請求項3記載の合成方法。
- 酸触媒が、イミダゾール、テトラゾール、及びそれらの誘導体から成る群から選択される、請求項2〜6のいずれか一項に記載の合成方法。
- 酸触媒が、ベンズイミダゾールトリフラート(BIT)、4−エチルチオテトラゾール、イミダゾリウムトリフラート、又は4,5−ジシアノイミダゾールである、請求項7記載の合成方法。
- アルコール型活化合物及び酸触媒を等量含む混合物を活性化剤として使用する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の合成方法。
- 固相担体を用いる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の合成方法。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の合成方法によって調製された、少なくとも10量体の核酸分子オリゴマー。
- 20量体のDNAオリゴマーである、請求項11記載の核酸分子オリゴマー。
- DNAチップ用の請求項11又は12に記載の核酸分子オリゴマー。
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