JPH0468320B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0468320B2 JPH0468320B2 JP59232941A JP23294184A JPH0468320B2 JP H0468320 B2 JPH0468320 B2 JP H0468320B2 JP 59232941 A JP59232941 A JP 59232941A JP 23294184 A JP23294184 A JP 23294184A JP H0468320 B2 JPH0468320 B2 JP H0468320B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- compound
- group
- synthesis
- reaction
- oligonucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 14
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 claims description 7
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 6
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 4
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 claims description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 126
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 29
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 description 27
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 26
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 20
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 20
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 13
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 9
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 8
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 8
- 125000004182 2-chlorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(Cl)=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 7
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 125000002103 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)(C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H])C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N Pentane Chemical compound CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 6
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 6
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 5
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- -1 dimethoxytrityl group Chemical group 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 4
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 4
- WDCYWAQPCXBPJA-UHFFFAOYSA-N 1,3-dinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC([N+]([O-])=O)=C1 WDCYWAQPCXBPJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SFYDWLYPIXHPML-UHFFFAOYSA-N 3-nitro-1-(2,4,6-trimethylphenyl)sulfonyl-1,2,4-triazole Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)N1N=C([N+]([O-])=O)N=C1 SFYDWLYPIXHPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical group OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 3
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical class O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M tetraethylammonium bromide Chemical compound [Br-].CC[N+](CC)(CC)CC HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 3
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YNLDQVCMNAWSMS-UHFFFAOYSA-N 8-amino-1,1,1-trifluoro-3-hydroxyoctan-2-one Chemical compound NCCCCCC(O)C(=O)C(F)(F)F YNLDQVCMNAWSMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZLZUNCWDVNGVAQ-UHFFFAOYSA-N C1(=C(C(=CC(=C1)C)C)S(=O)(=O)N1N=N[C-]=C1[N+](=O)[O-])C Chemical compound C1(=C(C(=CC(=C1)C)C)S(=O)(=O)N1N=N[C-]=C1[N+](=O)[O-])C ZLZUNCWDVNGVAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 description 2
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 description 2
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007810 chemical reaction solvent Substances 0.000 description 2
- 229960001701 chloroform Drugs 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N methyl cyanide Natural products CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- YAHHPOUXPBUKTL-DXKBKMAZSA-N thymidine dimer Chemical class CC12C(C3N([C@H]4C[C@H](O)[C@@H](CO)O4)C(=O)NC(=O)C13C)N([C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1)C(=O)NC2=O YAHHPOUXPBUKTL-DXKBKMAZSA-N 0.000 description 2
- AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N triethylammonium acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN(CC)CC AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 1-methylsulfonylpiperidin-4-one Chemical compound CS(=O)(=O)N1CCC(=O)CC1 RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- FKEKCYXKBMKFGI-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methylpropylamino)-3,7-dihydropurin-6-one Chemical compound N1C(NCC(C)C)=NC(=O)C2=C1N=CN2 FKEKCYXKBMKFGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 1
- VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexanenitrile Chemical compound CCCCC(O)C#N VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-ULQXZJNLSA-N 4-amino-1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-tritiopyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C([3H])=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-ULQXZJNLSA-N 0.000 description 1
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 1
- QQJXZVKXNSFHRI-UHFFFAOYSA-N 6-Benzamidopurine Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NC(=O)C1=CC=CC=C1 QQJXZVKXNSFHRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010750 Metalloproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010063312 Metalloproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BLAKAEFIFWAFGH-UHFFFAOYSA-N acetyl acetate;pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1.CC(=O)OC(C)=O BLAKAEFIFWAFGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000000397 acetylating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012445 acidic reagent Substances 0.000 description 1
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 1
- 125000004202 aminomethyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N anhydrous glutaric acid Natural products OC(=O)CCCC(O)=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- LDFVINFJZGUOAZ-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine;hydrochloride Chemical compound [Cl-].NCCCCCC[NH3+] LDFVINFJZGUOAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N hydrogen carbonate;triethylazanium Chemical compound OC(O)=O.CCN(CC)CC AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 108700020942 nucleic acid binding protein Proteins 0.000 description 1
- 102000044158 nucleic acid binding protein Human genes 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003854 p-chlorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C([H])=C1Cl 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 125000003356 phenylsulfanyl group Chemical group [*]SC1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- OENLEHTYJXMVBG-UHFFFAOYSA-N pyridine;hydrate Chemical compound [OH-].C1=CC=[NH+]C=C1 OENLEHTYJXMVBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 238000007514 turning Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
- C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
発明の背景
技術分野
本発明は、新規ヌクレオチド誘導体に関する。
さらに具体的には、本発明は、デオキシシチジン
の3′−リン酸延長上にアルキレン基を介して一級
アミノ基を導入し、かつシトシンのアミノ基にス
ペーサーを介して担体と結合させたヌクレオチド
誘導体に関するものである。 先行技術 本発明者らは、先に5′−未端にアミノアルキル
基を導入したオリゴヌクレオチド誘導体(以下、
5′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドという)お
よびその製造法について提案した(特開昭59−
93098号、同59−93099号および同59−93100号各
公報)。この5′−末端アミノ化オリゴヌクレオチ
ドは導入されたアミノ基を介して種々の標識物質
や担体との結合が可能である。 この場合の標識物質としてはビオチン、2,4
−ジニトロベンゼン、蛍光物質(ローダミン、フ
ルオレセインなど)、酵素タンパク(ワサビパー
オキシダーゼ、アルカリフオスフアターゼ、β−
ガラクトシダーゼ)および金属タンパク(フエリ
チンなど)などが考えられる。このうち、ビオチ
ンおよび2,4−ジニトロベンゼンに関し、これ
らを結合したオリゴヌクレオチド誘導体およびそ
の製造法について本発明者らは既に提案している
(特開昭59−148798号公報および特開昭59−
204200号公報)。また、担体としてはセフアロー
スなどが考えられるが、担体を結合させたオリゴ
ヌクレオチド誘導体(以下固定化ヌクレオチドと
いう)およびその製造法についても本発明者らに
よつて既に提案済みである(特開昭59−27900号
公報)。 固定化ヌクレオチドの用途としては、一般的な
mRNAの単離、精製、特異的な塩基配列をもつ
mRNAの単離〔J.Biochem.,81,941(1977)〕、
二本鎖DNAの分離、一本鎖DNAの単離精製、長
鎖オリゴヌクレオチドの合成および核酸関酵素の
単離精製などが考えられる。 また、ビオチンや2,4−ジニトロベンゼンな
どの標識物質を結合したオリゴヌクレオチド誘導
体は、非放射性アフイニテイプローブとして標的
遺伝子の検出、核酸結合性タンパクの検出などに
供され、ビオチン−アビジン法〔DNA,3,269
−277(1984)、Nucleic Acids Research,5,
363−384(1978)など〕、酵素免疫法〔Nucleic
AcidsResearch,10,6789−6796(1982)など〕、
蛍光抗体法〔Nucleic Acids Research,12,
1791−1810(1984)など〕、電子顕微鏡法〔上記
Nucleic Acids Researchなど〕などに利用され
る。 Nature,306,5941(1983)、DNA,2,72
(1983)など〕。 このようにアミノ化オリゴヌクレオチドおよび
その誘導体は潜在的利用価値が非常に大きい(雑
誌「BIOTECHNOLOGY」AUGUST(1983)
NATURE PUBLISHING COMPANY刊)と
ころから、その合成手段の確立および新規な誘導
体の造成が望まれているところである。 そこで本発明者らは、上記5′−末端アミノ化オ
リゴヌクレオチドに続き、3′−末端にアミノアル
キル基を導入したオリゴヌクレオチド誘導体(以
下、3′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドとい
う)についても提案を行つた(特開昭60−166694
号公報および特開昭60−166695号公報)。この
3′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドは、上記
5′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドと同様に
種々の用途が考えられ、また対をなす化合物とし
て5′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドと組み合
せて利用することも可能である。しかしながら、
この3′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドは液相
法でしか合成できなかつたため、下記のような問
題点を抱えていた。 (1) 反応ケースが大きくなる。 (2) オリゴヌクレオチド合成の各段階(脱保護、
縮合など)において中間体の精製が必要であ
り、そのうえオリゴヌクレオチドの合成操作に
熟練も必要である。その結果、合成時間、労力
がかかる。 従つて、これらの諸問題を解決する方法の開発
が望まれているところであつた。 発明の概要 要 旨 本発明は上記問題点に解決を与えることを目的
とし、3′−末端アミノ化オリゴヌクレオチド合成
に際して有用な出発化合物を提供し、さらに本化
合物を利用して該化合物を製造する方法をも提供
することにより本目的を達成するものである。 したがつて本発明によるヌクレオチド誘導体
は、下式〔〕で示されるものであること、を特
徴とするものである。 〔ただし、mおよびnはそれぞれ自然数であ
り、R0はリン酸基の保護基であり、R1は水素、
または5′水酸基の保護基であり、R2は水素、また
はアミノ基の保護基であり、R3はアミノ基を官
能基として具備する担体であり、Yは酸素原子
(−O−)またはイミノ基(−NH−)である。〕 効 果 本発明によるヌクレオチド誘導体は、デオキシ
シチジンのアミノ基延長上にスペーサーを介して
担体と結させているので、3′−末端アミノ化オリ
ゴヌクレオチドを固相法により合成するための出
発物質、すなわち樹脂(ここで樹脂は担体に過ぎ
ないが、樹脂に担持された本発明の化合物は外観
的には樹脂そのものと変らないので樹脂に担持さ
れた化物を以下において単に「樹脂」と呼ぶこと
がある)として使用することができる。従つて、
本発明の化合物を用いて3′−アミノアルキル化オ
リゴヌクレオチドを合成するに際しては下記のよ
うな効果が得られる。 (1) 反応スケールを小さくすることができるので
経済的である。すなわち非放射性アフイニテイ
プローブなどに利用されるオリゴヌクレオチド
は微量(数マイクログラム程度)で十分である
ので、反応スケールを小さくすることによつ
て、無駄がなくなる。 (2) オリゴヌクレオチドの各合成段階で中間体の
精製の必要がないため合成操作が簡単であり、
また、合成操作に熟練の必要もない。従つて、
短時間で3′−末端アミノ化オリゴヌクレオチド
が合合成可能であつて、省力化、コスト低減が
できる。 なお、このような樹脂によれば、それを固体支
持体とする固相法オリゴヌクレオチド合成が可能
であつて、そのような可能性が得られることも本
発明の効果の一つである。この場合のオリゴヌク
レオチドの合成は操作が簡単なので、自動化(機
械化)も可能であろう。 発明の具体的説明 ヌクレオチド誘導体(化合物〔〕) 本発明によるヌクレオチド誘導体は、前記の式
〔〕で示されるものである(以下、このヌクレ
オチド誘導体を化合物〔〕という)。 式中、(CH2)nはアルキレン基を示し、mは任
意の自然数である。その場合のmは実用的には2
〜20であり、特に2〜8が好ましい。また、式中
CO(CH2)oCOはスペーサーを示し、nは任意の
自然数である。その場合nは実用的には2〜20で
あり、特に3〜8が好ましい。 R0 はリン酸基を保護する置換基であつて、オ
ルトまたはパラクロロフエニル基、フエニルチ
オ基、5−クロロ−8−オキシキノリル基など
を例示することができる。通常は、オルトクロ
ロフエニル基が用いられる。 R1 水素または5′−末端水酸基の保護基であつ
て、これが保護基である場合はトリチル基、モ
ノまたはジメトキシトリチル基、トリメチルア
セチル基、トリチルオキシアセチルなどを例示
することができる。保護基としては、通常ジメ
トキシトリチル基が用いられる。 R2 水素またはアミノ基の保護基であつて、こ
れが保護基である場合はトリフロロアセチル
基、オルトニトロフエニルスルフエニル基など
を例示することができる。保護基としては、通
常トリフロロアセチル基が用いられる。 R3 アミノ基を官能基として具備する担体であ
り、通常アミノメチル化ポリスチレン、アミノ
プロピル化シリカゲルおよび部分アミノ化ポリ
アクリルモルフオリドなどが用いられる。 化合物〔〕の合成 化合物〔〕、すなわち本発明によるヌクレオ
チド誘導体、は合目的的な任意の方法によつて合
成することができる。 一つの好ましい方法は、第1図のフローチヤー
トに示した通りのものである。R0〜R3は前記し
た意味を有するものであり、BZはベンゾイル基
を示す。 第1図に従つて、化合物〔〕合成の好ましい
方法を述べれば下記の通りである。 まず、通常のヌクレオチド合成に適用される方
法あるいは本発明者らが先に提案した方法〔特開
昭60−166695号〕に従つて完全に保護されたシチ
ジン誘導体〔〕を合成する。ついで化合物
〔〕において、塩基部分のアミノ基の保護基を
選択的に除去して化合物〔〕を得る。塩基部分
の保護基の選択的除去は、例えば、Tetrahedron
Letters,22,991−994(1981)の方法に従つて行
うことができる。すなち、化合物〔〕を反応溶
媒中においてエチレンジアミン処理することによ
り化合物〔〕を得る。反応溶媒としては、ジク
ロロメタン、トリクロロメタン、N,N−ジメチ
ルホルムアミドなども考えられるが、R0として
賞用されるオルトクロロフエニル基の分解が最も
少ないという点でエチレンジアミン−フエノール
〔1:4(v/v)〕が好ましい。 上記操作で遊離した化合物〔〕の塩基部分の
アミノ基にスペーサーを導入して化合物〔〕を
造成したのち、これを担体に固定化することによ
つて、化合物〔〕を得る。すなわち、スペーサ
ー(炭素数2〜20のジカルボン酸であればよく、
特にアジピン酸、グルタル酸が好ましい)の導入
をピリジン中で縮合剤〔例えばジシクロヘキシル
カルボジイミド(以下DCC)〕を用いて行つて化
合物〔〕とする。ついで、化合物〔〕のシト
シン部分のアミノ基延長上に導入されたスペーサ
ーを介して担体と結合させることによつて、化物
()を得る。すなわち、化合物〔〕とアミノ
基を官能基として有する担体(例えば、アミノメ
チル化ポリスチレン)とををピリジン中で縮合剤
(例えばDCC)を用いて結合させることによつ
て、化合物〔〕を得ることができる。なお、一
般的なヌクレオチド合成法は既に公知であつて、
保護基の種類およびその導入ないし除去ならびに
縮合その他についての詳細は核酸の化学合成に関
する成書や総説、例えば(ヌクレオシド・ヌクレ
オチドの合成」(丸善1977年)、「核酸有機化学」
(化学同人1979年)、「核酸」(朝倉書点1979年)、
Tetrahedron,34,31(1978)、有合化、34,723
(1978)および化学の領域、33,566(1979)など、
を参照されたい。また、化合物〔〕の合成操作
の詳細は後記実験例を参照されたい。 化合物〔〕の利用/オリゴヌクレオチド誘導
体の合成 本発明の化合物(一般式〔〕)は、前記した
ように、3′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドを
固相法で合成するための出発物質として有用であ
る。 本発明の化合物〔〕を用いた3′−末端アミノ
化オリゴヌクレオチドの合成は、この化合物
〔〕を固相合成法に使用する樹脂として用い、
この樹脂に核酸試薬としてヌクレオチドダイマ
ー、トリマーあるいはオリゴマーを順次縮合させ
る合目的的な任意の方法によつて行うことができ
る。 一つの好ましい方法を示せば、第2図のフロー
チヤートに示す通りである。なお、フローチヤー
トの記号は下記の意味をもつ。 CE シアノエチル基を示す。 DMTr ジメトキシトリチル基を示す。 P 任意の自然数。 q 任意の自然数。 B′ 保護された塩基を示すが、通常はN6−ベン
ゾイルアデニン、N−イソブチルグアニン、
N6−ベンゾイルシトシンおよびチミン(すな
わち、保護不要)より選択される。 B 塩基を示すが、通常はアデニン、グアニン、
シトシンおよびチミンより選択される。 R0、R1、R2、R3、Y、mおよびnは、前記した
通りである。 3′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドの合成法
について述べれば、下記の通りである。 化合物〔〕のDMTrを除去したものと、通
常のオリゴヌクレオチド合成法で合成した化合物
〔O′〕のCEを除去したものとを縮合剤〔例えばメ
シチレンスルホニルニトロトリアゾリド(以下
MSNT)〕存合下で結合して、化合〔V〕を得
る。この操作を適度に繰り返すことにより所望の
鎖長とし、ついでこの化合物〔〕を担体から脱
離〔担体からの脱離操作はアルカリ処理で行うこ
とができ、通常は濃アンモニアを用いる。なお、
本発明の実験例においても濃アンモニア処理を行
つたが、この処理で担体からの脱離とともに塩基
部分やリン酸の保護基およびトリフルオロアセチ
ル基も除去される〕することによつて化合物
〔〕を得たのち、ついで5′−水酸基の保護基を
除去〔保護基の除去は酸処理、例えば0.1N塩酸
処理、80%酢酸処理などがあり、通常は後者であ
る〕することによつて、化合物〔〕を得る。 また、上記と同様にして5′−および3′−未端に
アミノアルキル基を導入した化合物〔〕を得る
こともできる。化合物〔〕合成の好ましい一例
を示せば、第3図のフローチヤートに示す通りで
ある。なお、同図中の記号の意味は前記した通り
である。 すなわち、化合物〔〕の合成は通常のオリゴ
ヌクレオチド合成法により造成した化合物〔O′〕
を脱シアノエチルしたものと本発明の化合物
〔〕のR1(DMTr)を除去したものと結合を縮
合剤存在下で行つて所望の鎖長の化合物〔〕を
得る。ついで、特開昭59−93098号公報記載の方
法に従つて合成した化合物〔〕を脱シアノエチ
ルしたものと化合物〔〕のR1(DMTr)を除去
したものとの結合を縮合剤存在下で行うことによ
り、化物〔〕を得る。最後に、化合物〔〕の
脱保護および担体からの脱離を行うことにより、
化合物〔〕を得る。なお、オリゴヌクレオチド
の固相合成法に関しては成書や文献が種々ある
が、例えば下記の文献や公開特許公報および後記
実験例を参照することができる。 Tetrahedron Letters1979、3635(1979) Nucleic Acids Research8、5473(1980) Nucleic Acids Research8、5491(1980) Nucleic Acids Research8、5507(1980) Ncleic Acids Research Symposium Series7 、281(1980) 特開昭59−27900号、同59−93098号、 同59−93099号および同59−93100号各公報 また、このようにして合成された3′−末端アミ
ノ化オリゴヌクレオチドは、一級アミノ基を介し
て標識物質などを結合することも可能である(特
開昭59−148798号公報、特開昭59−204200号公報
など参照)。 実験例 A 化合物〔〕の合成 本発明の化合物〔〕の合成を以下の手順に従
つて行つた。 化合物〔〕(Y=O)の合成 化合物〔〕(Y=O)の合成を第4図のフロ
ーチヤートに従つて行つた(なお、図中の記号X
はハロゲン、トリアゾールまたはオキシベンゾト
リアゾールを示し、他の記号の意味は前記した通
りである)。すなわち、ピリジン共沸により無水
にした化合物〔O〕(890mg、1.4mmol)に、オ
ルトクロロフエニルスルホジベンゾトリアゾリド
(Xがオキシベンゾトリアゾールである化合物)
のジオキサン溶液(7ml/mM、12.6ml)を加え
て2時間反応を行つた。薄層クロマトグラフイー
(以下TLC)により反応の終了を確認した後、ピ
リジン共沸およびトルエン共沸により無水にした
トリフロロアセチル−6−アミノヘキサノール
〔Y=0、R2=CF3CO〕(530mg、2.5mM)およ
び1−メチル−イミダゾール(200μ1、2.5mM)
を加えて、室温で一夜反応を行つた。反応終了
後、溶媒を留去し、クロロホルム(以下CHCl3)
30mlに溶解し、水、0.5Mリン酸二水素ナトリウ
ム(下NaH2PO4)、および5%炭酸水素ナトリ
ウム(以下NaHCO3)で洗浄を行つたのち、無
水硫酸ナトリウム(以下Na2SO4)で乾燥を行つ
た。CHCl3層を濃縮し、シリカゲルシヨートカラ
ムで精製を行つて、目的化物〔〕(Y=O)を
得た〔収量910mg(1.14mM)、81%〕。 なお、シリカゲルカラムでの目的物の溶出は、
0〜4%のメタノール含有CHCl3のグラデイエン
トで行つた〔以下この表現を「MeOH/CHl3(0
→4%)」とする〕。 この化合物の確認は、核磁気共嗚スペクトル
(以下NMR)によつて行つた。 NMR(CDCl3):δ= 8.12(dd 1H)、6.30(m 1H) 5.30(t 1H)、4.20(m 2H) 3.78(s 6H)、3.33(m 2H) 1.40(m 4H) 化合物〔〕(Y=NH)の合成 上記と同様にして化物〔〕(Y=NH)の合
成を行つた。すなわち、化合物〔O〕(1.32g、
2mmol)を無水とした後、オルトクロロフエニ
ルホスホジベンゾトリアゾリドのジオキサン溶液
(6ml/mM、16.8ml)を加えて2時間反応を行
つた。これに、無水にしたモノトリフロロアセチ
ル−1,6−ジアミノヘキサン〔Y=NH、R2=
CF3CO〕塩酸塩(900mg、3.6mM)および1−メ
チル−イミダゾール(440mg、5.6mM)を加えて
一夜反応を行つた。以下上記と同様にして目的の
化合物〔〕(Y=NH)を得た〔収量710mg(44
%)〕。なお、本化合物の確認もNMRで行つた。 NMR(CDCl3):δ= 8.13(dd 1H)、6.34(t 1H)、5.28(m 1H) 3.77(s 6H)、3.32(m 2H)、3.00(m 2H) 1.34(m 4H) 化合物〔〕(Y=O〕の合成 化合物〔〕(Y=O〕(550mg、0.7mM)をエ
チレンジアミン−フエノール(1:4(V/V))
15mlに溶解し、40℃で30分間反応を行つた。
TLCで反応の終了を確認した後、溶液の濃縮を
行つた。残留物をCHCl3に溶解し、ついで0.5M
NaH2PO4、5%NaHCO3、5%塩化ナトリウム
(以下NaCl)、および水で洗浄したのち、無水
Na2SO4で乾燥を行つた。CHCl3を留去したの
ち、シリカゲルシヨートカラム〔MeOH/
CHCl3(O→3%)〕で精製を行つた。ついで、こ
れをペンタンに滴下することによつて、化合物
〔〕の粉末を得た(収量、360mg、収率54%)。
なお、本発明の化合物の確認もNMRで行つた。 NMR(CDCl3):δ= 7.77(t 1H)、6.34(q 1H)、5.45(dd 2H) 5.26(m 1H)、4.19(m 2H)、3.77(s 6H) 3.31(t 2H)、1.37(m 4H) 化合物〔〕(Y=O)の合成 化合物〔〕(Y=O〕(100mg、0.11mmol)を
無水ピリジン(2ml)に溶解し、アジピン酸(50
mg、0.34mmol)およびジシクロヘキシルカルボ
ジイミド(以下DCC)(140mg、0.68mmol)を加
えて、室温で反応を行つた。TLCで反応の終了
を確認後、反応液過し、液の濃縮を行つたの
ち、濃縮物をCHCl3に溶解し、水、5%
NaHCO3、および5%NAClで洗浄を行つた。つ
いで、CHCl3層を濃縮し、少量のベンゼンに溶解
したのち、ペンタンに滴下して粉末として、化合
物〔〕(Y=O)の粗精製物を得た(収量90mg、
80%)。粗精製物は、このまま次の反応に用いた。 化合物〔〕(Y=O)の合成 化物〔〕(Y=O)(90mg、0.086mmol)を、
アミノメチル化ポリスチレン樹脂(0.12mmol/
g、400mg)(市販品)を懸濁したピリジン溶液
(4ml)に加えたのち、DCC(60mg、0.3mmol)
を加えて、室温で一夜反応を行つた。反応終了
後、樹脂をピリジンで洗浄し、無水酢酸−ピリジ
ン(1:9(v/v))5mlを加えて1時間反応を
行つて、未反応のアミノ基をアセチル基で保護し
た、メタノールで洗浄後、乾燥して、化物〔〕
を得た(420mg)。ここで、化合物〔〕を少量採
つてトリチル基の定量によりシチジン含量を計算
すると、0.046mmol/gであつた。 また、精製した化合物〔〕(Y=O)〔10mg、
9μmol〕、アミノメチルポリスチレン樹脂
(0.13mmol/g、40mg)およびDCC(20mg、
100μmol)を用いて上記方法に従つて化合物
〔〕(Y=O)を合成した。なお、この場合のシ
チジン含量は、上記と同様にトリチル基の定量に
よれば0.096mmol/gであつた。 一方、化合物〔〕(Y=NH)も、上記方法
に従つて得ることができた。 B オリゴヌクレオチドの合成 本発明の化合物(一般式〔〕を用いて、オリ
ゴヌクレオチドの合成を行つた。 (a) 化合物〔〕(Y=O、B=T、P=12)の
合成 上記化合物〔〕の合成を第2図のフローチヤ
ートにしたがつて行つた。すなわち、樹脂〔〕
(Y=O)20mg、0.096mmol/g、1.9μmol(ここ
で樹脂は担体に過ぎないが、樹脂に担持された本
発明の化合物は外観的には樹脂そのものと変らな
いので、樹脂に担持された当該化合物を以下にお
いて単に樹脂と呼ぶことにする)を○イジクロロメ
タン(以下CH2Cl2)1mlで5回洗浄したのち、
○ロ3%トリクロロ酢酸含有CH2Cl2(以下3%
TCA/CH2Cl2)1mlを用いる20秒間の反応を計
6回行つた。このようにして脱トリチル化した化
合物〔〕を○ハCH2Cl21mlおよびピリジン1mlで
5回ずつ洗浄し、さらにCH2Cl21mlで5回洗浄
後、真空乾燥を行つた。ついで○ニ縮合剤メシチレ
ンスルホニルニトロトリアゾリド(以下MSNT)
25mgおよび脱シアノエチル化したチミジンダイマ
ー(化合物〔O′〕においてP=2、B′=T)25
mgの無水ピリジン300μlを加えて、40分間反応を
行つた。反応終了後、樹脂を○ホピリジン1mlで5
回洗浄し、○ヘ無水酢酸−ピリジン−ジメチルアミ
ノピリジン(以下DMAP)〔100μ1−900μ1−10
mg〕1mlを加えて5分間反応を行つて未反応5′−
水酸基をアセチル化したのち、○トピリジン1mlで
5回洗浄を行つた(以上で1回の縮合操作終了)。
引き続き、脱シアノエチル化したチミジンダイマ
ーを用い、上記○イ〜○トの縮合操作を5回くり返す
ことにより、化合物〔〕(Y=O、B=T、P
=12)を得た〔トリチル基の定量による収率は通
算57%(平均91%)であつた〕。 ついで、化合物〔〕を0.5Mテトラメチルグ
アニジン−ピリジン−2−カルボアルドキシムの
ピリジン−水(9:1(v/v))溶液300μlに溶
解し、室温で一夜処理後、濃アンモニア水(3
ml)を加え、密栓して50℃で一夜処理を行つた。
処理後、樹脂を別し、液の濃縮を行い、残渣
を50mMトリエチルアンモニウムバイカーボネー
ト(以下TEAB)PH7.5、1mlに溶解し、エーテ
ル1mlで3回洗浄した。水層を濃縮後、TEAB
に溶解し、その半量をセフアデツクス G−50
(直径1.5cm×長さ120cm、溶出液50mM TEAB)
にかけて粗精製を行つて化合物〔〕(Y=O、
B=T、P=12)の粗精製物6.0〜9.0ODを得た。
ついでこれを逆相カラムを用いた高速液体クロマ
トグラフイー(以下HPLC)で分離精製した(そ
のときの溶出パターンを第5図に示す)。HPLC
で分取した化合物〔〕を80%酢酸で10分間処理
したのち、再びHPLCで分離精製を行つて化合物
〔〕(Y=O、B=T、P=12)を得た(そのと
きの溶出パターンを第6図に示す)。第5図およ
び第6図において、溶出パターンはいずれも単一
ピークを示し、従つてそれぞれ化合物〔〕およ
び〔〕を純粋に得ることができた。 また、化合物〔〕の確認は32Pでラベル化し
たのち、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行な
うことによつても行つた。 なお、上記のHPLCの条件は、下記の通りであ
る。 カラム:μBondapak C18 温 度:50℃ 流 速:2ml/分 溶出液A:50mMトリエチルアンモニウムアセ
テート(以下TEAA)PH7.2 B:50mM TEAA(PH7.2)−アセトニト
リル(CH3CN)=(1:1(v/v)) 化合物〔〕の場合は、溶液Bの20−60%の直
線濃度勾配とし、溶出時間は16分であつた。以下
このような内容の表現を(20−60%緩衝液/16
分)とする。また、化合物〔〕の場合は、(0
−40%B緩衝液/16分)である。 (b) 化合物〔〕(Y=O、B=A、P=12)の
合成 樹脂〔〕(40mg、0.046mmol/g、1.8μmol)
と核酸試薬としてアデノシンダイマー(25mg)を
無水ピリジン(400μl)に溶解したものを用い、
上記実験(a)の○イ〜○トの操作に従つて化合物〔〕
の合成を行つた(平均収率90%)。第7図は、本
実験(b)の化合物〔〕をHPLC(0→40%B緩衝
液/16分)で分離精製したときの溶出パターンで
ある。 (c) 化合物〔〕(Y=O、P=14、Bは第1表
参照)の合成 樹脂〔〕(100mg、0.046mmol/g、4.6μmol)
と核酸試薬として種々のダイマー(GC、TA、
TG、GA、CC、CAおよびTTをこの順に縮合)
を無水ピリジン(800μl)に溶解したものを用い、
他の操作は前記実験(a)の○イ〜○トに従つて化合物
〔〕の合成を行つた。第8図は、本実験(c)の化
合物〔〕をHPLCで(0→40%B緩衝液/16
分)で分離精製したときの溶出パターンである。 なお、上記実験(a)〜(c)で合成した化合物の内容
を示せば第1表の通りである。
さらに具体的には、本発明は、デオキシシチジン
の3′−リン酸延長上にアルキレン基を介して一級
アミノ基を導入し、かつシトシンのアミノ基にス
ペーサーを介して担体と結合させたヌクレオチド
誘導体に関するものである。 先行技術 本発明者らは、先に5′−未端にアミノアルキル
基を導入したオリゴヌクレオチド誘導体(以下、
5′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドという)お
よびその製造法について提案した(特開昭59−
93098号、同59−93099号および同59−93100号各
公報)。この5′−末端アミノ化オリゴヌクレオチ
ドは導入されたアミノ基を介して種々の標識物質
や担体との結合が可能である。 この場合の標識物質としてはビオチン、2,4
−ジニトロベンゼン、蛍光物質(ローダミン、フ
ルオレセインなど)、酵素タンパク(ワサビパー
オキシダーゼ、アルカリフオスフアターゼ、β−
ガラクトシダーゼ)および金属タンパク(フエリ
チンなど)などが考えられる。このうち、ビオチ
ンおよび2,4−ジニトロベンゼンに関し、これ
らを結合したオリゴヌクレオチド誘導体およびそ
の製造法について本発明者らは既に提案している
(特開昭59−148798号公報および特開昭59−
204200号公報)。また、担体としてはセフアロー
スなどが考えられるが、担体を結合させたオリゴ
ヌクレオチド誘導体(以下固定化ヌクレオチドと
いう)およびその製造法についても本発明者らに
よつて既に提案済みである(特開昭59−27900号
公報)。 固定化ヌクレオチドの用途としては、一般的な
mRNAの単離、精製、特異的な塩基配列をもつ
mRNAの単離〔J.Biochem.,81,941(1977)〕、
二本鎖DNAの分離、一本鎖DNAの単離精製、長
鎖オリゴヌクレオチドの合成および核酸関酵素の
単離精製などが考えられる。 また、ビオチンや2,4−ジニトロベンゼンな
どの標識物質を結合したオリゴヌクレオチド誘導
体は、非放射性アフイニテイプローブとして標的
遺伝子の検出、核酸結合性タンパクの検出などに
供され、ビオチン−アビジン法〔DNA,3,269
−277(1984)、Nucleic Acids Research,5,
363−384(1978)など〕、酵素免疫法〔Nucleic
AcidsResearch,10,6789−6796(1982)など〕、
蛍光抗体法〔Nucleic Acids Research,12,
1791−1810(1984)など〕、電子顕微鏡法〔上記
Nucleic Acids Researchなど〕などに利用され
る。 Nature,306,5941(1983)、DNA,2,72
(1983)など〕。 このようにアミノ化オリゴヌクレオチドおよび
その誘導体は潜在的利用価値が非常に大きい(雑
誌「BIOTECHNOLOGY」AUGUST(1983)
NATURE PUBLISHING COMPANY刊)と
ころから、その合成手段の確立および新規な誘導
体の造成が望まれているところである。 そこで本発明者らは、上記5′−末端アミノ化オ
リゴヌクレオチドに続き、3′−末端にアミノアル
キル基を導入したオリゴヌクレオチド誘導体(以
下、3′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドとい
う)についても提案を行つた(特開昭60−166694
号公報および特開昭60−166695号公報)。この
3′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドは、上記
5′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドと同様に
種々の用途が考えられ、また対をなす化合物とし
て5′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドと組み合
せて利用することも可能である。しかしながら、
この3′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドは液相
法でしか合成できなかつたため、下記のような問
題点を抱えていた。 (1) 反応ケースが大きくなる。 (2) オリゴヌクレオチド合成の各段階(脱保護、
縮合など)において中間体の精製が必要であ
り、そのうえオリゴヌクレオチドの合成操作に
熟練も必要である。その結果、合成時間、労力
がかかる。 従つて、これらの諸問題を解決する方法の開発
が望まれているところであつた。 発明の概要 要 旨 本発明は上記問題点に解決を与えることを目的
とし、3′−末端アミノ化オリゴヌクレオチド合成
に際して有用な出発化合物を提供し、さらに本化
合物を利用して該化合物を製造する方法をも提供
することにより本目的を達成するものである。 したがつて本発明によるヌクレオチド誘導体
は、下式〔〕で示されるものであること、を特
徴とするものである。 〔ただし、mおよびnはそれぞれ自然数であ
り、R0はリン酸基の保護基であり、R1は水素、
または5′水酸基の保護基であり、R2は水素、また
はアミノ基の保護基であり、R3はアミノ基を官
能基として具備する担体であり、Yは酸素原子
(−O−)またはイミノ基(−NH−)である。〕 効 果 本発明によるヌクレオチド誘導体は、デオキシ
シチジンのアミノ基延長上にスペーサーを介して
担体と結させているので、3′−末端アミノ化オリ
ゴヌクレオチドを固相法により合成するための出
発物質、すなわち樹脂(ここで樹脂は担体に過ぎ
ないが、樹脂に担持された本発明の化合物は外観
的には樹脂そのものと変らないので樹脂に担持さ
れた化物を以下において単に「樹脂」と呼ぶこと
がある)として使用することができる。従つて、
本発明の化合物を用いて3′−アミノアルキル化オ
リゴヌクレオチドを合成するに際しては下記のよ
うな効果が得られる。 (1) 反応スケールを小さくすることができるので
経済的である。すなわち非放射性アフイニテイ
プローブなどに利用されるオリゴヌクレオチド
は微量(数マイクログラム程度)で十分である
ので、反応スケールを小さくすることによつ
て、無駄がなくなる。 (2) オリゴヌクレオチドの各合成段階で中間体の
精製の必要がないため合成操作が簡単であり、
また、合成操作に熟練の必要もない。従つて、
短時間で3′−末端アミノ化オリゴヌクレオチド
が合合成可能であつて、省力化、コスト低減が
できる。 なお、このような樹脂によれば、それを固体支
持体とする固相法オリゴヌクレオチド合成が可能
であつて、そのような可能性が得られることも本
発明の効果の一つである。この場合のオリゴヌク
レオチドの合成は操作が簡単なので、自動化(機
械化)も可能であろう。 発明の具体的説明 ヌクレオチド誘導体(化合物〔〕) 本発明によるヌクレオチド誘導体は、前記の式
〔〕で示されるものである(以下、このヌクレ
オチド誘導体を化合物〔〕という)。 式中、(CH2)nはアルキレン基を示し、mは任
意の自然数である。その場合のmは実用的には2
〜20であり、特に2〜8が好ましい。また、式中
CO(CH2)oCOはスペーサーを示し、nは任意の
自然数である。その場合nは実用的には2〜20で
あり、特に3〜8が好ましい。 R0 はリン酸基を保護する置換基であつて、オ
ルトまたはパラクロロフエニル基、フエニルチ
オ基、5−クロロ−8−オキシキノリル基など
を例示することができる。通常は、オルトクロ
ロフエニル基が用いられる。 R1 水素または5′−末端水酸基の保護基であつ
て、これが保護基である場合はトリチル基、モ
ノまたはジメトキシトリチル基、トリメチルア
セチル基、トリチルオキシアセチルなどを例示
することができる。保護基としては、通常ジメ
トキシトリチル基が用いられる。 R2 水素またはアミノ基の保護基であつて、こ
れが保護基である場合はトリフロロアセチル
基、オルトニトロフエニルスルフエニル基など
を例示することができる。保護基としては、通
常トリフロロアセチル基が用いられる。 R3 アミノ基を官能基として具備する担体であ
り、通常アミノメチル化ポリスチレン、アミノ
プロピル化シリカゲルおよび部分アミノ化ポリ
アクリルモルフオリドなどが用いられる。 化合物〔〕の合成 化合物〔〕、すなわち本発明によるヌクレオ
チド誘導体、は合目的的な任意の方法によつて合
成することができる。 一つの好ましい方法は、第1図のフローチヤー
トに示した通りのものである。R0〜R3は前記し
た意味を有するものであり、BZはベンゾイル基
を示す。 第1図に従つて、化合物〔〕合成の好ましい
方法を述べれば下記の通りである。 まず、通常のヌクレオチド合成に適用される方
法あるいは本発明者らが先に提案した方法〔特開
昭60−166695号〕に従つて完全に保護されたシチ
ジン誘導体〔〕を合成する。ついで化合物
〔〕において、塩基部分のアミノ基の保護基を
選択的に除去して化合物〔〕を得る。塩基部分
の保護基の選択的除去は、例えば、Tetrahedron
Letters,22,991−994(1981)の方法に従つて行
うことができる。すなち、化合物〔〕を反応溶
媒中においてエチレンジアミン処理することによ
り化合物〔〕を得る。反応溶媒としては、ジク
ロロメタン、トリクロロメタン、N,N−ジメチ
ルホルムアミドなども考えられるが、R0として
賞用されるオルトクロロフエニル基の分解が最も
少ないという点でエチレンジアミン−フエノール
〔1:4(v/v)〕が好ましい。 上記操作で遊離した化合物〔〕の塩基部分の
アミノ基にスペーサーを導入して化合物〔〕を
造成したのち、これを担体に固定化することによ
つて、化合物〔〕を得る。すなわち、スペーサ
ー(炭素数2〜20のジカルボン酸であればよく、
特にアジピン酸、グルタル酸が好ましい)の導入
をピリジン中で縮合剤〔例えばジシクロヘキシル
カルボジイミド(以下DCC)〕を用いて行つて化
合物〔〕とする。ついで、化合物〔〕のシト
シン部分のアミノ基延長上に導入されたスペーサ
ーを介して担体と結合させることによつて、化物
()を得る。すなわち、化合物〔〕とアミノ
基を官能基として有する担体(例えば、アミノメ
チル化ポリスチレン)とををピリジン中で縮合剤
(例えばDCC)を用いて結合させることによつ
て、化合物〔〕を得ることができる。なお、一
般的なヌクレオチド合成法は既に公知であつて、
保護基の種類およびその導入ないし除去ならびに
縮合その他についての詳細は核酸の化学合成に関
する成書や総説、例えば(ヌクレオシド・ヌクレ
オチドの合成」(丸善1977年)、「核酸有機化学」
(化学同人1979年)、「核酸」(朝倉書点1979年)、
Tetrahedron,34,31(1978)、有合化、34,723
(1978)および化学の領域、33,566(1979)など、
を参照されたい。また、化合物〔〕の合成操作
の詳細は後記実験例を参照されたい。 化合物〔〕の利用/オリゴヌクレオチド誘導
体の合成 本発明の化合物(一般式〔〕)は、前記した
ように、3′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドを
固相法で合成するための出発物質として有用であ
る。 本発明の化合物〔〕を用いた3′−末端アミノ
化オリゴヌクレオチドの合成は、この化合物
〔〕を固相合成法に使用する樹脂として用い、
この樹脂に核酸試薬としてヌクレオチドダイマ
ー、トリマーあるいはオリゴマーを順次縮合させ
る合目的的な任意の方法によつて行うことができ
る。 一つの好ましい方法を示せば、第2図のフロー
チヤートに示す通りである。なお、フローチヤー
トの記号は下記の意味をもつ。 CE シアノエチル基を示す。 DMTr ジメトキシトリチル基を示す。 P 任意の自然数。 q 任意の自然数。 B′ 保護された塩基を示すが、通常はN6−ベン
ゾイルアデニン、N−イソブチルグアニン、
N6−ベンゾイルシトシンおよびチミン(すな
わち、保護不要)より選択される。 B 塩基を示すが、通常はアデニン、グアニン、
シトシンおよびチミンより選択される。 R0、R1、R2、R3、Y、mおよびnは、前記した
通りである。 3′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドの合成法
について述べれば、下記の通りである。 化合物〔〕のDMTrを除去したものと、通
常のオリゴヌクレオチド合成法で合成した化合物
〔O′〕のCEを除去したものとを縮合剤〔例えばメ
シチレンスルホニルニトロトリアゾリド(以下
MSNT)〕存合下で結合して、化合〔V〕を得
る。この操作を適度に繰り返すことにより所望の
鎖長とし、ついでこの化合物〔〕を担体から脱
離〔担体からの脱離操作はアルカリ処理で行うこ
とができ、通常は濃アンモニアを用いる。なお、
本発明の実験例においても濃アンモニア処理を行
つたが、この処理で担体からの脱離とともに塩基
部分やリン酸の保護基およびトリフルオロアセチ
ル基も除去される〕することによつて化合物
〔〕を得たのち、ついで5′−水酸基の保護基を
除去〔保護基の除去は酸処理、例えば0.1N塩酸
処理、80%酢酸処理などがあり、通常は後者であ
る〕することによつて、化合物〔〕を得る。 また、上記と同様にして5′−および3′−未端に
アミノアルキル基を導入した化合物〔〕を得る
こともできる。化合物〔〕合成の好ましい一例
を示せば、第3図のフローチヤートに示す通りで
ある。なお、同図中の記号の意味は前記した通り
である。 すなわち、化合物〔〕の合成は通常のオリゴ
ヌクレオチド合成法により造成した化合物〔O′〕
を脱シアノエチルしたものと本発明の化合物
〔〕のR1(DMTr)を除去したものと結合を縮
合剤存在下で行つて所望の鎖長の化合物〔〕を
得る。ついで、特開昭59−93098号公報記載の方
法に従つて合成した化合物〔〕を脱シアノエチ
ルしたものと化合物〔〕のR1(DMTr)を除去
したものとの結合を縮合剤存在下で行うことによ
り、化物〔〕を得る。最後に、化合物〔〕の
脱保護および担体からの脱離を行うことにより、
化合物〔〕を得る。なお、オリゴヌクレオチド
の固相合成法に関しては成書や文献が種々ある
が、例えば下記の文献や公開特許公報および後記
実験例を参照することができる。 Tetrahedron Letters1979、3635(1979) Nucleic Acids Research8、5473(1980) Nucleic Acids Research8、5491(1980) Nucleic Acids Research8、5507(1980) Ncleic Acids Research Symposium Series7 、281(1980) 特開昭59−27900号、同59−93098号、 同59−93099号および同59−93100号各公報 また、このようにして合成された3′−末端アミ
ノ化オリゴヌクレオチドは、一級アミノ基を介し
て標識物質などを結合することも可能である(特
開昭59−148798号公報、特開昭59−204200号公報
など参照)。 実験例 A 化合物〔〕の合成 本発明の化合物〔〕の合成を以下の手順に従
つて行つた。 化合物〔〕(Y=O)の合成 化合物〔〕(Y=O)の合成を第4図のフロ
ーチヤートに従つて行つた(なお、図中の記号X
はハロゲン、トリアゾールまたはオキシベンゾト
リアゾールを示し、他の記号の意味は前記した通
りである)。すなわち、ピリジン共沸により無水
にした化合物〔O〕(890mg、1.4mmol)に、オ
ルトクロロフエニルスルホジベンゾトリアゾリド
(Xがオキシベンゾトリアゾールである化合物)
のジオキサン溶液(7ml/mM、12.6ml)を加え
て2時間反応を行つた。薄層クロマトグラフイー
(以下TLC)により反応の終了を確認した後、ピ
リジン共沸およびトルエン共沸により無水にした
トリフロロアセチル−6−アミノヘキサノール
〔Y=0、R2=CF3CO〕(530mg、2.5mM)およ
び1−メチル−イミダゾール(200μ1、2.5mM)
を加えて、室温で一夜反応を行つた。反応終了
後、溶媒を留去し、クロロホルム(以下CHCl3)
30mlに溶解し、水、0.5Mリン酸二水素ナトリウ
ム(下NaH2PO4)、および5%炭酸水素ナトリ
ウム(以下NaHCO3)で洗浄を行つたのち、無
水硫酸ナトリウム(以下Na2SO4)で乾燥を行つ
た。CHCl3層を濃縮し、シリカゲルシヨートカラ
ムで精製を行つて、目的化物〔〕(Y=O)を
得た〔収量910mg(1.14mM)、81%〕。 なお、シリカゲルカラムでの目的物の溶出は、
0〜4%のメタノール含有CHCl3のグラデイエン
トで行つた〔以下この表現を「MeOH/CHl3(0
→4%)」とする〕。 この化合物の確認は、核磁気共嗚スペクトル
(以下NMR)によつて行つた。 NMR(CDCl3):δ= 8.12(dd 1H)、6.30(m 1H) 5.30(t 1H)、4.20(m 2H) 3.78(s 6H)、3.33(m 2H) 1.40(m 4H) 化合物〔〕(Y=NH)の合成 上記と同様にして化物〔〕(Y=NH)の合
成を行つた。すなわち、化合物〔O〕(1.32g、
2mmol)を無水とした後、オルトクロロフエニ
ルホスホジベンゾトリアゾリドのジオキサン溶液
(6ml/mM、16.8ml)を加えて2時間反応を行
つた。これに、無水にしたモノトリフロロアセチ
ル−1,6−ジアミノヘキサン〔Y=NH、R2=
CF3CO〕塩酸塩(900mg、3.6mM)および1−メ
チル−イミダゾール(440mg、5.6mM)を加えて
一夜反応を行つた。以下上記と同様にして目的の
化合物〔〕(Y=NH)を得た〔収量710mg(44
%)〕。なお、本化合物の確認もNMRで行つた。 NMR(CDCl3):δ= 8.13(dd 1H)、6.34(t 1H)、5.28(m 1H) 3.77(s 6H)、3.32(m 2H)、3.00(m 2H) 1.34(m 4H) 化合物〔〕(Y=O〕の合成 化合物〔〕(Y=O〕(550mg、0.7mM)をエ
チレンジアミン−フエノール(1:4(V/V))
15mlに溶解し、40℃で30分間反応を行つた。
TLCで反応の終了を確認した後、溶液の濃縮を
行つた。残留物をCHCl3に溶解し、ついで0.5M
NaH2PO4、5%NaHCO3、5%塩化ナトリウム
(以下NaCl)、および水で洗浄したのち、無水
Na2SO4で乾燥を行つた。CHCl3を留去したの
ち、シリカゲルシヨートカラム〔MeOH/
CHCl3(O→3%)〕で精製を行つた。ついで、こ
れをペンタンに滴下することによつて、化合物
〔〕の粉末を得た(収量、360mg、収率54%)。
なお、本発明の化合物の確認もNMRで行つた。 NMR(CDCl3):δ= 7.77(t 1H)、6.34(q 1H)、5.45(dd 2H) 5.26(m 1H)、4.19(m 2H)、3.77(s 6H) 3.31(t 2H)、1.37(m 4H) 化合物〔〕(Y=O)の合成 化合物〔〕(Y=O〕(100mg、0.11mmol)を
無水ピリジン(2ml)に溶解し、アジピン酸(50
mg、0.34mmol)およびジシクロヘキシルカルボ
ジイミド(以下DCC)(140mg、0.68mmol)を加
えて、室温で反応を行つた。TLCで反応の終了
を確認後、反応液過し、液の濃縮を行つたの
ち、濃縮物をCHCl3に溶解し、水、5%
NaHCO3、および5%NAClで洗浄を行つた。つ
いで、CHCl3層を濃縮し、少量のベンゼンに溶解
したのち、ペンタンに滴下して粉末として、化合
物〔〕(Y=O)の粗精製物を得た(収量90mg、
80%)。粗精製物は、このまま次の反応に用いた。 化合物〔〕(Y=O)の合成 化物〔〕(Y=O)(90mg、0.086mmol)を、
アミノメチル化ポリスチレン樹脂(0.12mmol/
g、400mg)(市販品)を懸濁したピリジン溶液
(4ml)に加えたのち、DCC(60mg、0.3mmol)
を加えて、室温で一夜反応を行つた。反応終了
後、樹脂をピリジンで洗浄し、無水酢酸−ピリジ
ン(1:9(v/v))5mlを加えて1時間反応を
行つて、未反応のアミノ基をアセチル基で保護し
た、メタノールで洗浄後、乾燥して、化物〔〕
を得た(420mg)。ここで、化合物〔〕を少量採
つてトリチル基の定量によりシチジン含量を計算
すると、0.046mmol/gであつた。 また、精製した化合物〔〕(Y=O)〔10mg、
9μmol〕、アミノメチルポリスチレン樹脂
(0.13mmol/g、40mg)およびDCC(20mg、
100μmol)を用いて上記方法に従つて化合物
〔〕(Y=O)を合成した。なお、この場合のシ
チジン含量は、上記と同様にトリチル基の定量に
よれば0.096mmol/gであつた。 一方、化合物〔〕(Y=NH)も、上記方法
に従つて得ることができた。 B オリゴヌクレオチドの合成 本発明の化合物(一般式〔〕を用いて、オリ
ゴヌクレオチドの合成を行つた。 (a) 化合物〔〕(Y=O、B=T、P=12)の
合成 上記化合物〔〕の合成を第2図のフローチヤ
ートにしたがつて行つた。すなわち、樹脂〔〕
(Y=O)20mg、0.096mmol/g、1.9μmol(ここ
で樹脂は担体に過ぎないが、樹脂に担持された本
発明の化合物は外観的には樹脂そのものと変らな
いので、樹脂に担持された当該化合物を以下にお
いて単に樹脂と呼ぶことにする)を○イジクロロメ
タン(以下CH2Cl2)1mlで5回洗浄したのち、
○ロ3%トリクロロ酢酸含有CH2Cl2(以下3%
TCA/CH2Cl2)1mlを用いる20秒間の反応を計
6回行つた。このようにして脱トリチル化した化
合物〔〕を○ハCH2Cl21mlおよびピリジン1mlで
5回ずつ洗浄し、さらにCH2Cl21mlで5回洗浄
後、真空乾燥を行つた。ついで○ニ縮合剤メシチレ
ンスルホニルニトロトリアゾリド(以下MSNT)
25mgおよび脱シアノエチル化したチミジンダイマ
ー(化合物〔O′〕においてP=2、B′=T)25
mgの無水ピリジン300μlを加えて、40分間反応を
行つた。反応終了後、樹脂を○ホピリジン1mlで5
回洗浄し、○ヘ無水酢酸−ピリジン−ジメチルアミ
ノピリジン(以下DMAP)〔100μ1−900μ1−10
mg〕1mlを加えて5分間反応を行つて未反応5′−
水酸基をアセチル化したのち、○トピリジン1mlで
5回洗浄を行つた(以上で1回の縮合操作終了)。
引き続き、脱シアノエチル化したチミジンダイマ
ーを用い、上記○イ〜○トの縮合操作を5回くり返す
ことにより、化合物〔〕(Y=O、B=T、P
=12)を得た〔トリチル基の定量による収率は通
算57%(平均91%)であつた〕。 ついで、化合物〔〕を0.5Mテトラメチルグ
アニジン−ピリジン−2−カルボアルドキシムの
ピリジン−水(9:1(v/v))溶液300μlに溶
解し、室温で一夜処理後、濃アンモニア水(3
ml)を加え、密栓して50℃で一夜処理を行つた。
処理後、樹脂を別し、液の濃縮を行い、残渣
を50mMトリエチルアンモニウムバイカーボネー
ト(以下TEAB)PH7.5、1mlに溶解し、エーテ
ル1mlで3回洗浄した。水層を濃縮後、TEAB
に溶解し、その半量をセフアデツクス G−50
(直径1.5cm×長さ120cm、溶出液50mM TEAB)
にかけて粗精製を行つて化合物〔〕(Y=O、
B=T、P=12)の粗精製物6.0〜9.0ODを得た。
ついでこれを逆相カラムを用いた高速液体クロマ
トグラフイー(以下HPLC)で分離精製した(そ
のときの溶出パターンを第5図に示す)。HPLC
で分取した化合物〔〕を80%酢酸で10分間処理
したのち、再びHPLCで分離精製を行つて化合物
〔〕(Y=O、B=T、P=12)を得た(そのと
きの溶出パターンを第6図に示す)。第5図およ
び第6図において、溶出パターンはいずれも単一
ピークを示し、従つてそれぞれ化合物〔〕およ
び〔〕を純粋に得ることができた。 また、化合物〔〕の確認は32Pでラベル化し
たのち、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行な
うことによつても行つた。 なお、上記のHPLCの条件は、下記の通りであ
る。 カラム:μBondapak C18 温 度:50℃ 流 速:2ml/分 溶出液A:50mMトリエチルアンモニウムアセ
テート(以下TEAA)PH7.2 B:50mM TEAA(PH7.2)−アセトニト
リル(CH3CN)=(1:1(v/v)) 化合物〔〕の場合は、溶液Bの20−60%の直
線濃度勾配とし、溶出時間は16分であつた。以下
このような内容の表現を(20−60%緩衝液/16
分)とする。また、化合物〔〕の場合は、(0
−40%B緩衝液/16分)である。 (b) 化合物〔〕(Y=O、B=A、P=12)の
合成 樹脂〔〕(40mg、0.046mmol/g、1.8μmol)
と核酸試薬としてアデノシンダイマー(25mg)を
無水ピリジン(400μl)に溶解したものを用い、
上記実験(a)の○イ〜○トの操作に従つて化合物〔〕
の合成を行つた(平均収率90%)。第7図は、本
実験(b)の化合物〔〕をHPLC(0→40%B緩衝
液/16分)で分離精製したときの溶出パターンで
ある。 (c) 化合物〔〕(Y=O、P=14、Bは第1表
参照)の合成 樹脂〔〕(100mg、0.046mmol/g、4.6μmol)
と核酸試薬として種々のダイマー(GC、TA、
TG、GA、CC、CAおよびTTをこの順に縮合)
を無水ピリジン(800μl)に溶解したものを用い、
他の操作は前記実験(a)の○イ〜○トに従つて化合物
〔〕の合成を行つた。第8図は、本実験(c)の化
合物〔〕をHPLCで(0→40%B緩衝液/16
分)で分離精製したときの溶出パターンである。 なお、上記実験(a)〜(c)で合成した化合物の内容
を示せば第1表の通りである。
【表】
上表および上記文中において、Tはチミン、A
はアデニン、Gはグアニン、Cはシトシンを示す
ものとして本発明の技術分野において了承されて
いる暗号である。 (d) 化合物〔〕(Y=O、B=第2表に記載、
m=6p+q=14)の合成 第3図のフローチヤートに従つて化合物〔〕
(Y=O、B=第2表に記載、p+q=14)を合
成した。(イ)化合物〔〕の合成 まず、上記実験(a)〜(c)と同様の方法で化合物
〔〕(R1=DMTr、R2=CF3CO−、Y=O、B
=CACCGA TGTAGC、P=12、m=6、n=
4)の合成を行つた。 (ロ) 化合物〔〕の合成 化合物〔O′〕(R1=H、B′=T、R0=オルトク
ロロフエニル、P=2)〔450mg、0.5mmol〕をピ
リジン共沸して無水とし、これにオルトクロロフ
エニルホスホジベンゾトリアゾリドのジオキサン
溶液(0.7mmol)を加えて、2時間反応を行つ
た。TLCで反応の進行を確認したのち、トリフ
ロロアセチル−6−アミノヘキサノール(190mg、
0.9mmol)および1−メチル−イミダゾール
(750mg、0.9mmol)を加えて、3時間反応を行つ
た。反応終了後、溶液の濃縮を行い、濃縮物を
CHCl3に溶解し、水、5%NaHCO3、0.5M
NaH2PO4および5%NaClで洗浄したのち、無水
Na2SO4で乾燥を行つた。ついで、CHCl3層を濃
縮し、シリカゲルシヨートカラムで精製して、化
合物〔〕(R0=オルトクロロフエニル、R2=
CF3CO、B′=T、q=2)を得た。なお、目的
物はn−ペンタンに滴下して粉末とした〔収量
460mg(72%)〕。(ハ) 化合物〔〕の合成 つぎに、化合物〔〕のDMTrを除去したも
のと化合物〔〕のCEを除去したものとを
MSNT存在下で縮合させて、化合物〔〕(R0=
オルトクロロフエニル、R2=CF3CO、R3=アミ
ノメチル化ポリスチレン、n=4、m=6、p+
q=14、Y=0)を得た。ついで、これを前記実
験(a)と同様に濃アンモニア処理してすべての保護
基をはずしたのち、HPLCで精製して、化合物
〔〕(Y=0、p+q=14、m=6)を得た。 なお、HPLCでの化合物〔〕の溶出パターン
は、第9図に示す通りであつた。不純物のピーク
がみられるが、HPLCでのメインークを分取する
ことにより目的物を純粋に得ることができた。 (e) 化合物〔〕(5′側のY=NH、3′側のY=
O、p+q=13、m=6)の合成 ピリジン共沸により無水にした化合物〔O′〕
(R0=オルトクロロフエニル、R′=H、B′=T、
p=1)(1mmol、480mg)オルトクロロフエニ
ルホスホジベゾトリアゾリドのジオキサン溶液
(1.4mmol)を加えて1時間反応を行つた。つい
で、これに無水にしたモノトリフロロアセチル−
1,6−ジアミノヘキサン塩酸塩(1.8mmol、
450mg)および1−メチルイミダゾール
(2.8mmol、220mg)を加えて2時間反応を行つ
た。以後、実験(d)の(ロ)と同様にして、化合物
〔〕を得た。つぎに、化合物〔〕と実験(d)の
(イ)で得た化合物〔〕とを用い上記実験(d)の(ハ)と
同様の操作で化合物〔〕(第2表参照)を得た。
第10図は、化合物〔〕をHPLCで精製した際
の溶出パターである。HPLCのピークを分取する
ことにより目的物を純粋に得ることができた。 なお、実験(d)および(e)に合成した化合物の内免
を示せば、第2表の通りである。
はアデニン、Gはグアニン、Cはシトシンを示す
ものとして本発明の技術分野において了承されて
いる暗号である。 (d) 化合物〔〕(Y=O、B=第2表に記載、
m=6p+q=14)の合成 第3図のフローチヤートに従つて化合物〔〕
(Y=O、B=第2表に記載、p+q=14)を合
成した。(イ)化合物〔〕の合成 まず、上記実験(a)〜(c)と同様の方法で化合物
〔〕(R1=DMTr、R2=CF3CO−、Y=O、B
=CACCGA TGTAGC、P=12、m=6、n=
4)の合成を行つた。 (ロ) 化合物〔〕の合成 化合物〔O′〕(R1=H、B′=T、R0=オルトク
ロロフエニル、P=2)〔450mg、0.5mmol〕をピ
リジン共沸して無水とし、これにオルトクロロフ
エニルホスホジベンゾトリアゾリドのジオキサン
溶液(0.7mmol)を加えて、2時間反応を行つ
た。TLCで反応の進行を確認したのち、トリフ
ロロアセチル−6−アミノヘキサノール(190mg、
0.9mmol)および1−メチル−イミダゾール
(750mg、0.9mmol)を加えて、3時間反応を行つ
た。反応終了後、溶液の濃縮を行い、濃縮物を
CHCl3に溶解し、水、5%NaHCO3、0.5M
NaH2PO4および5%NaClで洗浄したのち、無水
Na2SO4で乾燥を行つた。ついで、CHCl3層を濃
縮し、シリカゲルシヨートカラムで精製して、化
合物〔〕(R0=オルトクロロフエニル、R2=
CF3CO、B′=T、q=2)を得た。なお、目的
物はn−ペンタンに滴下して粉末とした〔収量
460mg(72%)〕。(ハ) 化合物〔〕の合成 つぎに、化合物〔〕のDMTrを除去したも
のと化合物〔〕のCEを除去したものとを
MSNT存在下で縮合させて、化合物〔〕(R0=
オルトクロロフエニル、R2=CF3CO、R3=アミ
ノメチル化ポリスチレン、n=4、m=6、p+
q=14、Y=0)を得た。ついで、これを前記実
験(a)と同様に濃アンモニア処理してすべての保護
基をはずしたのち、HPLCで精製して、化合物
〔〕(Y=0、p+q=14、m=6)を得た。 なお、HPLCでの化合物〔〕の溶出パターン
は、第9図に示す通りであつた。不純物のピーク
がみられるが、HPLCでのメインークを分取する
ことにより目的物を純粋に得ることができた。 (e) 化合物〔〕(5′側のY=NH、3′側のY=
O、p+q=13、m=6)の合成 ピリジン共沸により無水にした化合物〔O′〕
(R0=オルトクロロフエニル、R′=H、B′=T、
p=1)(1mmol、480mg)オルトクロロフエニ
ルホスホジベゾトリアゾリドのジオキサン溶液
(1.4mmol)を加えて1時間反応を行つた。つい
で、これに無水にしたモノトリフロロアセチル−
1,6−ジアミノヘキサン塩酸塩(1.8mmol、
450mg)および1−メチルイミダゾール
(2.8mmol、220mg)を加えて2時間反応を行つ
た。以後、実験(d)の(ロ)と同様にして、化合物
〔〕を得た。つぎに、化合物〔〕と実験(d)の
(イ)で得た化合物〔〕とを用い上記実験(d)の(ハ)と
同様の操作で化合物〔〕(第2表参照)を得た。
第10図は、化合物〔〕をHPLCで精製した際
の溶出パターである。HPLCのピークを分取する
ことにより目的物を純粋に得ることができた。 なお、実験(d)および(e)に合成した化合物の内免
を示せば、第2表の通りである。
第1図は、本発明の化合物〔〕を合成する方
法の一例を示すフローチヤートである。第2図
は、本発明の化合物〔〕を用いてオリゴヌクレ
オチド誘導体〔〕を合成する方法の一例を示す
フローチヤートである。第3図は、本発明の化合
物〔〕を用いてオリゴヌクレオチド誘導体
〔〕を合成する方法の一例を示すフローチヤー
トである。第4図は、本発明の化合物〔〕を合
成するために用いた化合物〔〕を合成する方法
の一例を示すフローチヤートである。第5図は、
実験(a)の化合物〔〕をHPLCで分離精製したと
きのクロマトグラムを模写したものである。第6
図は、実験(a)の化合物〔〕をHPLCで分離精製
したときのクロマトグラムを模写したものであ
る。第7図は、実験(b)の化合物〔〕をHPLCで
分離精製したときのクロマトグラムを模写したも
のである。第8図は、実験(c)の化合物〔〕を
HPLCで分離精製したときのクロマトグラムを模
写したものである。第9図は、実験(d)の化合物
〔〕をHPLCで分離精製したときのクロマトグ
ラムを模写したものである。第10図は、実験(e)
の化合物〔〕をHPLCで分離精製したときのク
ロマトグラムを模写したものである。
法の一例を示すフローチヤートである。第2図
は、本発明の化合物〔〕を用いてオリゴヌクレ
オチド誘導体〔〕を合成する方法の一例を示す
フローチヤートである。第3図は、本発明の化合
物〔〕を用いてオリゴヌクレオチド誘導体
〔〕を合成する方法の一例を示すフローチヤー
トである。第4図は、本発明の化合物〔〕を合
成するために用いた化合物〔〕を合成する方法
の一例を示すフローチヤートである。第5図は、
実験(a)の化合物〔〕をHPLCで分離精製したと
きのクロマトグラムを模写したものである。第6
図は、実験(a)の化合物〔〕をHPLCで分離精製
したときのクロマトグラムを模写したものであ
る。第7図は、実験(b)の化合物〔〕をHPLCで
分離精製したときのクロマトグラムを模写したも
のである。第8図は、実験(c)の化合物〔〕を
HPLCで分離精製したときのクロマトグラムを模
写したものである。第9図は、実験(d)の化合物
〔〕をHPLCで分離精製したときのクロマトグ
ラムを模写したものである。第10図は、実験(e)
の化合物〔〕をHPLCで分離精製したときのク
ロマトグラムを模写したものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 下式〔〕で示されるものであることを特徴
とするヌクレオチド誘導体。 〔ただし、mおよびnはそれぞれ自然数であ
り、R0はリン酸基の保護基であり、R1は水素、
または5′水酸基の保護基であり、R2は水素、また
はアミノ基の保護基であり、R3はアミノ基を官
能基として具備する担体であり、Yは酸素原子
(−O−)またはイミノ基(−NH−)である。〕
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59232941A JPS61112093A (ja) | 1984-11-05 | 1984-11-05 | ヌクレオチド誘導体 |
US06/792,824 US4816569A (en) | 1984-11-05 | 1985-10-30 | Nucleotide derivative |
CA000494505A CA1260930A (en) | 1984-11-05 | 1985-11-04 | Nucleotide derivative |
EP85113988A EP0180945B1 (en) | 1984-11-05 | 1985-11-04 | Nucleotide derivative |
DE8585113988T DE3570440D1 (en) | 1984-11-05 | 1985-11-04 | Nucleotide derivative |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59232941A JPS61112093A (ja) | 1984-11-05 | 1984-11-05 | ヌクレオチド誘導体 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61112093A JPS61112093A (ja) | 1986-05-30 |
JPH0468320B2 true JPH0468320B2 (ja) | 1992-11-02 |
Family
ID=16947246
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59232941A Granted JPS61112093A (ja) | 1984-11-05 | 1984-11-05 | ヌクレオチド誘導体 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4816569A (ja) |
EP (1) | EP0180945B1 (ja) |
JP (1) | JPS61112093A (ja) |
CA (1) | CA1260930A (ja) |
DE (1) | DE3570440D1 (ja) |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4818681A (en) * | 1985-02-22 | 1989-04-04 | Molecular Diagnostics, Inc. | Fast and specific immobilization of nucleic acids to solid supports |
EP0289619B1 (en) * | 1986-10-30 | 1995-08-16 | Daicel Chemical Industries, Ltd. | Process for synthesizing oligonucleotides and compounds for forming high-molecular protective group |
US4994558A (en) * | 1986-12-24 | 1991-02-19 | Eli Lilly And Company | Immunoglobulin conjugates |
CA1327358C (en) * | 1987-11-17 | 1994-03-01 | Morio Fujiu | Fluoro cytidine derivatives |
JPH084519B2 (ja) * | 1987-12-25 | 1996-01-24 | エフ・ホフマン―ラ ロシュ アーゲー | ハイブリッド形成用担体およびその調整方法 |
DE3916871A1 (de) * | 1989-05-24 | 1990-11-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Modifiziertes phosphoramidit-verfahren zur herstellung von modifizierten nukleinsaeuren |
US6358931B1 (en) | 1990-01-11 | 2002-03-19 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for modulating RNA |
US5359051A (en) * | 1990-01-11 | 1994-10-25 | Isis Pharmaceuticals | Compounds useful in the synthesis of nucleic acids capable of cleaning RNA |
JPH07200714A (ja) * | 1993-12-28 | 1995-08-04 | Nec Corp | 光学記号読取装置 |
CA2370478A1 (en) | 1999-03-24 | 2000-09-28 | Serge L. Beaucage | N-acylphosphoramidites and their use in oligonucleotide synthesis |
AU2002353001A1 (en) * | 2001-12-03 | 2003-06-17 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary Of The Department Of He | Thermolabile hydroxyl protecting groups and methods of use |
WO2006065751A2 (en) * | 2004-12-13 | 2006-06-22 | Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Cpg oligonucleotide prodrugs, compositions thereof and associated therapeutic methods |
EP2028272B1 (en) | 2006-06-06 | 2014-01-08 | Panasonic Corporation | Method of modifying nucleotide chain |
JP6237237B2 (ja) * | 2012-02-17 | 2017-11-29 | 味の素株式会社 | 塩基部保護オリゴヌクレオチド |
US8846885B2 (en) | 2012-02-17 | 2014-09-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Oligonucleotide with protected base |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2287910A1 (fr) * | 1974-10-15 | 1976-05-14 | Asahi Chemical Ind | Derives nucleotidiques et procede de preparation de ceux-ci |
GB2037289B (en) * | 1978-10-31 | 1983-05-05 | Katsunuma N | Nucleoside derivatives and an antileukemial agent containing the same as an active ingredient |
US4415732A (en) * | 1981-03-27 | 1983-11-15 | University Patents, Inc. | Phosphoramidite compounds and processes |
US4417046A (en) * | 1981-08-24 | 1983-11-22 | Eli Lilly And Company | Process for isolating oligonucleotide product from a coupling reaction mixture |
JPS5927900A (ja) * | 1982-08-09 | 1984-02-14 | Wakunaga Seiyaku Kk | 固定化オリゴヌクレオチド |
-
1984
- 1984-11-05 JP JP59232941A patent/JPS61112093A/ja active Granted
-
1985
- 1985-10-30 US US06/792,824 patent/US4816569A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-11-04 CA CA000494505A patent/CA1260930A/en not_active Expired
- 1985-11-04 EP EP85113988A patent/EP0180945B1/en not_active Expired
- 1985-11-04 DE DE8585113988T patent/DE3570440D1/de not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0180945A3 (en) | 1987-02-04 |
EP0180945B1 (en) | 1989-05-24 |
DE3570440D1 (en) | 1989-06-29 |
US4816569A (en) | 1989-03-28 |
CA1260930A (en) | 1989-09-26 |
EP0180945A2 (en) | 1986-05-14 |
JPS61112093A (ja) | 1986-05-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0135587B2 (en) | Defined sequence single strand oligonucleotides incorporating reporter groups, process for the chemical synthesis thereof, and nucleosides useful in such synthesis | |
US4667025A (en) | Oligonucleotide derivatives | |
US5580731A (en) | N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith | |
US5013830A (en) | Compounds for the cleavage at a specific position of RNA, oligomers employed for the formation of said compounds, and starting materials for the synthesis of said oligomers | |
JPH0468320B2 (ja) | ||
US20110245327A1 (en) | Oligonucleotide Analogues | |
EP0090789A1 (en) | Chemical DNA synthesis | |
EP0466773A4 (en) | Coumarin derivatives for use as nucleotide crosslinking reagents | |
JP2000044590A (ja) | オリゴヌクレオチド合成用担体 | |
JPS60500717A (ja) | リポ−タ−グル−プを含んでいる一定配列の1本鎖オリゴヌクレオチド、およびその化学的合成法 | |
WO1999000402A1 (en) | Purification of oligomers | |
JPH0665280A (ja) | 蛍光標識化合物、その調製法および使用 | |
JPH03505209A (ja) | 標的付与されたオリゴヌクレオチド類の合成に使用できるヌクレオシド誘導体類、これ等誘導体類から得たオリゴヌクレオチド類及びそれ等の合成 | |
US5864031A (en) | Process for preparing 5-dithio-modified oligonucleotides | |
WO1997029116A1 (en) | Sulphur containing dinucleotide phosphoramidites | |
US5352578A (en) | Method of separating oligonucleotides from a mixture | |
JPH07188278A (ja) | オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドおよび酵素的に切断可能な保護基を有するヌクレオシド誘導体 | |
US7098326B2 (en) | Methods for the integrated synthesis and purification of oligonucleotides | |
WO2005080404A1 (ja) | 核酸固相合成用シリルリンカー | |
JPH0374239B2 (ja) | ||
US5559221A (en) | Method of separating oligonucleotides from a mixture | |
JP6429264B2 (ja) | ボラノホスフェート化合物、及び核酸オリゴマー | |
Hwang et al. | Transcription inhibition using modified pentanucleotides | |
JP5105404B2 (ja) | 水素結合性置換基を有する8−置換グアノシン誘導体及びそれを含むオリゴヌクレオチド | |
JPH0551599B2 (ja) |