WO2005054299A1 - Polysaccharide, sa preparation et son utilisation - Google Patents

Polysaccharide, sa preparation et son utilisation Download PDF

Info

Publication number
WO2005054299A1
WO2005054299A1 PCT/CN2004/001398 CN2004001398W WO2005054299A1 WO 2005054299 A1 WO2005054299 A1 WO 2005054299A1 CN 2004001398 W CN2004001398 W CN 2004001398W WO 2005054299 A1 WO2005054299 A1 WO 2005054299A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polysaccharide
glucose
ycp
water
soil
Prior art date
Application number
PCT/CN2004/001398
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Xiangdong Gao
Renxiang Tan
Xiaobing Yang
Cheng Sun
Original Assignee
China Pharmaceutical University
Nanjing University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Pharmaceutical University, Nanjing University filed Critical China Pharmaceutical University
Publication of WO2005054299A1 publication Critical patent/WO2005054299A1/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a polysaccharide, in particular to a marine fungal charcoal bacterial polysaccharide YCP and its preparation method and use.
  • Fungal polysaccharides are a class of active polysaccharides isolated from fungal fruiting bodies, mycelia, and fermentation broths, which can control cell division and differentiation and regulate cell growth and aging. Fungal polysaccharides began to be researched as drugs in the 1950s, and became people's interest after the 1960s. Fungal polysaccharides are currently recognized as immune-enhancing agents with high effects. Many fungal polysaccharide preparations are widely used in clinical practice, and have achieved encouraging clinical effects in autoimmune diseases, immune dysfunction, and tumor treatment. However, the research on terrestrial organisms (animals, plants, microorganisms, etc.) polysaccharides has started earlier.
  • polysaccharides can be divided into primary, secondary, tertiary and quaternary structures. Its primary structure refers to the composition, arrangement sequence, and connection mode of its monosaccharide residues; secondary structure refers to various polymers formed by hydrogen bonding between polysaccharide backbone chains, which is only related to its molecular backbone The conformation does not involve the spatial arrangement of the side chains; the tertiary structure refers to the ordered, regular and coarse space caused by the non-covalent interaction between the hydroxyl, carboxyl, amino and other functional groups in the sugar residues in the polysaccharide Conformation; quaternary structure refers to aggregates formed by polysaccharide polychains bonded by noncovalent forces.
  • the purpose of the present invention is to provide a polysaccharide, a preparation method thereof and use in preparing a medicament.
  • a polysaccharide consisting of glucose and uronic acid, free of protein and nucleic acids, molecular weight 1.6x l0 a "2.6xl0 6 Da, end group carbon in ⁇ -configuration, optical rotation [a] D '-+131.7 "+159.
  • the basic skeleton of a polysaccharide is composed of glucose connected by 1 ⁇ 4 glycosidic bonds. Each 17 glucose residues have a side chain. The side chain is a glucose molecule or a uronic acid molecule. The ratio is 2: 1, both are connected to the main chain glucose through a 1 ⁇ 6 glycosidic bond, and the ratio of the amount of glucose to the uronic acid substance per mole of the polysaccharide is 53: 1, which has the following structural formula:
  • Step 1 Weigh 1000g of the wet fungus of marine fungus charcoal group fungus, and mash it in a tissue masher with water, make up water to 2 000 ⁇ 4 000 mL, 60 ⁇ 90 . C water bath extraction for 8-20 hours, intermittent stirring, gauze filter to remove residue, 2000 ⁇ 4000r. Pm centrifugation to precipitate,
  • Step 2 Concentrate the extract obtained in step 1 to 500-2000 mL, add the concentrated solution 1 / 4-1 / 7 volume of chloroform and 1 / 15-1 / 30 volume of n-butanol, shake vigorously, and leave to separate. , Remove the lower organic solvent layer and the middle layer, retain the water layer, and repeat the extraction 2 to 5 times.
  • Step 3 Dialyze the aqueous solution obtained in step 2 to tap water for 24-48 hours.
  • the dialysate is concentrated to 500 "2000mL.
  • the precipitate is sequentially dehydrated with absolute ethanol, Washed with acetone and ether and dried under vacuum to obtain crude polysaccharide YCP.
  • Step 4. Take 50mg of the crude YCP polysaccharide, dissolve it fully, and load it on an equilibrium ion exchange column (DEAE-32). Wash it with 5 (T300mL distilled water, then elute with a gradient of 0 ⁇ 2mol / L NaCl solution, and collect in parts).
  • the anthrone sulfate colorimetric method is used for tracking detection, and the same components are combined.
  • the polysaccharide component separated by the ion exchange column is subjected to molecular sieve column chromatography (Sephacryl S-400), which is collected in sections, and the anthrone sulfate colorimetric method is used for tracking detection and combined.
  • the components are freeze-dried to obtain the polysaccharide YCP of the present invention.
  • the polysaccharide YCP of the present invention has effect on mouse xenografts Heps and S 18 . It has obvious inhibitory effect, so the polysaccharide YCP of the present invention can be applied to the preparation of a medicine for treating tumors.
  • Figure 1 HPLC purity identification map of polysaccharide YCP
  • Figure 2 Thin layer chromatogram of the monosaccharide component of the polysaccharide YCP, where 1. mixed sugar 2. rhamnose 3. mannose 4. glucose 5. galactose 6. YCP 7. uronic acid;
  • Figure 3 Schematic diagram of methylation analysis steps for polysaccharide YCP
  • Figure 8 Maximum absorption wavelength curve of the polysaccharide YCP complexed with Congo red.
  • HPLC purity identification Shodex SUGAR KS-805 (8 strokes ID x 300mm) high performance liquid chromatography column and differential refractive index detector were used.
  • the mobile phase was 3 ⁇ 40, YCPlmg / ml injection was 20 ⁇ 1, and the flow rate was 1ml / min.
  • the dialysate was concentrated to 1000 mL, and 3 times the volume of ethanol was gradually added, and left at 4 ° C for 6 hours. After centrifugation, the precipitate was washed successively with absolute ethanol, acetone, and ether, and dried under vacuum to obtain a crude polysaccharide.
  • the ion exchange column has been equilibrated (DEAE-32), first washed with 200mL distilled water, and then to 0 - 2 mol / L NaCl solution gradient, fraction collection, sulfuric acid anthrone colorimetric
  • the polysaccharide YCP fraction obtained by ion exchange column separation is subjected to molecular sieve column chromatography (Sephacryl S-400), which is collected in sections, followed by detection by anthrone sulfate colorimetric method.
  • the same components are combined and freeze-dried to obtain the polysaccharide YCP of the present invention.
  • the purity was the same as in Example 1.
  • the dialysate was concentrated to 2000raL, and 4 times the volume of ethanol was gradually added, and left at 4 ° C for 10 hours. After centrifugation, the precipitate was washed successively with absolute ethanol, acetone, and ether, and dried under vacuum to obtain a crude polysaccharide.
  • the polysaccharide YCP fraction obtained by ion exchange column separation was subjected to molecular sieve column chromatography (Sephacryl S-400), collected in sections, followed by detection by anthracene sulfate colorimetry, combined with the same components, and freeze-dried to obtain the polysaccharide YCP of the present invention,
  • the purity was the same as in Example 1.
  • the chromatographic column is a special gel column for measuring polysaccharides Shodex SUGAR KS-805 (8mmID x 300mm), the upper limit of the separation range is 500> ⁇ 10 4 Daltons, and the detector is differential Refraction detection Device.
  • the mobile phase was water: column temperature 35'C: flow rate 1mL / min. Take appropriate amounts of dextran molecular weight standards with different molecular weights, and use mobile phases to make standard solutions containing about 1 mg per mL. Take 100 ⁇ of the above standard solutions and inject them into the liquid chromatograph, and record the chromatogram.
  • the measurement results are shown in Table 1.
  • the weight average molecular weight of YCP polysaccharide is 1.6 X 10 6 Da "2.6 ⁇ 10 6 Da.
  • Determination of uronic acid content Accurately measure the standard uronic acid solution (6 ( ⁇ g / mL) 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5mL in a stoppered test tube, make up for distilled water to 0.5mL, in ice cream After pre-cooling, add 1.5 mL of a 0.0125 mol / L sodium tetraborate-concentrated sulfuric acid solution dropwise. Mix by shaking, and boil in a boiling water bath for 5 min. Cool to room temperature with ice cream, and add 25 ⁇ 0.15% m-hydroxybiphenyl per tube -0.5% sodium hydroxide solution.
  • the ratio of glucose to uronic acid in the side chain is 2: 1, and the molar ratio of glucose to uronic acid in each polysaccharide molecule is 53: 1, which is in accordance with the ratio of glucose to uronic acid in the aforementioned YCP polysaccharide Fit.
  • NaI0 4 was prepared as a 15 mmol / L solution, diluted 250 times, and then diluted to 10 different concentrations. The absorption value was measured at 223 nm to prepare a standard curve.
  • bromocresol purple was used as an indicator, and the 0.006576 mol / L NaOH solution calibrated above was used to measure the formic acid release amount.
  • YCP was oxidized by periodic acid, and the reaction was complete in 144 hours.
  • the consumption of periodic acid reached a stable value.
  • the amount of 03mol periodate and 0.055mol of formic acid were generated, and the results basically coincided with the theoretical values of 1.06 and 0.06 calculated from the methylation result, indicating that the molar ratio between the residues obtained by the methylation reaction result was correct. .
  • the main product of Smi th degradation products is erythritol and a small amount of glycerol, which indicates that YCP uses 1 ⁇ 4 glycosidic bonds as the main connection mode and a small amount of 1-6 connected glucose side chains.
  • the results of chemical reaction and periodic acid coincide.
  • the measurement results are shown in Table 4.
  • the polysaccharide YCP has a higher positive specific rotation (+131. 7 "+159. 4s;), indicating that the terminal carbon of YCP is a-configuration.
  • the polysaccharide YCP was weighed to 1 mg, and was compressed on a Nicolet-170X infrared spectrometer using a potassium bromide tablet method.
  • the infrared spectrum of the polysaccharide YCP is shown in FIG. 5.
  • a group of peaks at 3000-2800 cm- 1 are sugar stretching vibrations of CH, and some peaks of 1400-1200 cnf 1 are variable-angle vibrations of CH. These two sets of peaks are characteristic absorptions of carbohydrates.
  • the absorption peak between 1000 and 1200 cnf 1 is caused by the stretching vibration of C-0.
  • the absorption of 930cm- 1 is caused by the asymmetric ring stretching vibration of the D-grapepyran ring.
  • the absorption of 850cm- 1 is the characteristic absorption of the a-terminal epimerized CH variable angle vibration, indicating that the end carbon of the polysaccharide YCP is in the a-configuration, which is consistent with the results of specific rotation measurement.
  • the absorption of 761cm- 1 is caused by the symmetrical ring stretching vibration of the D-grapepyran ring.
  • the polysaccharide YCP reacted negatively with the iodine reagent. UV detection at 500 nm without UV absorption indicates that the polysaccharide does not have the ⁇ -helical structure of starch and that the polysaccharide conformation is different from amylose.
  • the polysaccharide solution (concentration: 2mg / mL) and Congo red solution (concentration: 12.2 mol / L) were mixed in equal volumes, and the mixture was allowed to stand for 15 minutes, and then the maximum absorption wavelength of the mixed solution in the (TO. 4mol / L NaOH solution) was measured. Change of ⁇ max. Using pure Congo red solution as a reference, manual wavelength scanning.
  • mice (18-22 g, male and female) were inoculated with Heps solid type according to the transplantation tumor research method.
  • the rats were weighed 24 hours after inoculation and randomly divided into 6 groups.
  • the blank control group and Tiandixin (5mg / kg) ) group, cyclophosphamide (20m g / kg) group were negative and positive control group, high polysaccharide YCP group funeral, medium and low three-dose groups (9, 3, l mg / kg).
  • Example 16 Polysaccharide YCP iv on transplanted tumor S 18 in mice. Inhibitory effect
  • mice Sixty ICR mice (18-22 g, male and female) were inoculated with S IS according to the transplantation tumor research method. Solid, Rats were weighed 24 hours after inoculation and randomly divided into 6 groups. The blank control group, the Tiandixin (5mg / k g ) group, and the cyclophosphamide (20mg / kg) group were the negative and positive control groups, respectively. The YCP group was set high. Three dose groups (9, 3, 1 mg / kg). 24 hours after inoculation, iv administration, once every 2 days, a total of 4 times, tumor-bearing mice were sacrificed on the second day after discontinuation, and tumor masses were separated and weighed. The obtained data were statistically processed. (T test).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

一种多糖及其制法和用途
技术领域
本发明涉及一种多糖， 具体地说是涉及一种海洋真菌炭团菌多糖 YCP及它的制法 和用途。
背景技术
真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出的、 可以控制细胞分裂分化， 调节细胞生长衰老的一类活性多糖。 真菌多糖作为药物研究始于 50年代， 在 60年代 以后成为免疫促进剂而引起人们的兴趣。 真菌多糖是目前公认的有较高效应的免疫增 强剂， 许多真菌多糖制剂巳广泛应用于临床， 在自身免疫性疾病、 免疫功能低下症以 及肿瘤的治疗等方面取得了令人鼓舞的临床效果。 但目前对陆生生物 （动物、 植物、 微生物等）多糖的研究开始的较早， 已从这些生物中分离纯化得到了多种多糖， 并对 它们的结构与功能进行了比较广泛的研究， 例如目前已用于临床的香菇多糖、 茯苓多 糖、 云芝多糖以及裂褶菌多糖等真菌多糖均来源于陆生， 而对海洋生物多糖的研究多 局限于巳能规模养殖或易于采集的海洋生物的多糖。 另外， 海洋天然产物的研究目前 多见于结构类型各异的中小分子， 对绝大多数海洋生物富含的多糖尚未给予足够的重 视， 主要集中于甲壳素、 藻类多糖等 [参见 Noda H, Amano H, Arashima K et a l. Nippon Suisan Gakkaishi, 1989， 55: 1265; Zhang EX, Yu LJ, XiaoX. Chinese J Mar Drugs, 1994, 13: 1 ; Xue CH, Yu GL, Hi rata T et al. Biosci Biotechnol Biochem, 1998, 62: 206; 刘晓梅， 张洪泉. 螺旋藻多糖对荷瘤小鼠化疗后造血细胞增殖、 凋亡及 Bcl-2表达的 影响. 药学学报、 2002, 37: 616. ] , 而对海洋微生物产生的新活性多糖的研究报道极 少。
多糖的结构可分为一级、 二级、 三级和四级结构。 它的一级结构是指其单糖残基 的组成、 排列序列和连接方式等； 二级结构是指多糖骨架链间以氢键结合形成的各种 聚合体， 这只关系到其分子主链的构象， 不涉及侧链的空间排布； 三级结构是指由多 糖中糖残基中的羟基、 羧基、 氨基及其它官能团间通过非共价作用而导致的有序、 规 则而粗大的空间构象； 四级结构是指多糖多聚链间以非共价作用力而结合形成的聚集 体。 多糖的结构分析完整的多糖结构分析包括对多糖的一级结构和高级结构的分析。 目前在多糖一级结构的分析中大多采用传统的化学方法与物理方法相结合,可基本阐 明某一多糖的一级结构的大致特征 [参见 Stroop CJ, Xu Q, Retzlaff M et a l. Carbohydra te research, 2002, 337: 335; Shashkov AS, Torgov VI, Nazarenko EL 确 认 本 et al. Carbohydrate research, 2002, 337: 1119; Kolender AA, Matulewicz MC. Carbohydra te research, 2002, 337: 57. Yang BY, Ding Q , Montgomery R. Carbohydrate research, 2002, 337: 731]。
近年来我们从一株海洋真菌 ffypoxylo )菌丝体中经提取纯化获得了一种多 糖（简称 YCP)并对其理化性质、 化学结构、 生物学活性进行了比较广泛的深入研究。 发明内容
本发明的目的在于提供一种多糖， 它的制法及在制备药物中的用途。
本发明的具体的技术方案如下：
一种多糖， 它由葡萄糖和糖醛酸构成， 不含蛋白质和核酸， 分子量为 1.6x l0 a "2.6xl06Da, 端基碳为 α-构型， 旋光度 [a]D'- +131.7 "+159. , 多糖的基本骨架 由 1→4糖苷键连接的葡萄糖构成， 每 17个葡萄糖残基有一个侧链， 侧链为一个葡萄 糖分子或一个糖醛酸分子， 葡萄糖和糖醛酸的比例为 2： 1, 均通过 1→6糖苷键与主 链葡萄糖相连接， 每摩尔多糖中葡萄糖与糖醛酸的物质的量之比为 53 : 1, 它有如下 结构式：
- 4>a-D-Glc/?-(l -" (→► 4 a-D-Glc -(l' 4>a-D-Glcjr<l ~~ ·
15 6
水 α-Ε 1ςρατ -D-GlcA*
ftJ¾±GlcpA： Glc ^bb¾l： 2 一种上述多糖的制法， 它由下列步骤组成：
步骤 1. 称取海洋真菌炭团菌湿菌体 1000g, 加水置组织捣碎器中捣碎， 补足水 至 2000 ~ 4000mL, 60~ 90。C水浴提取 8 -20 小时， 间歇搅拌， 纱布滤去残渣， 2000~4000r. p. m.离心去沉淀，
步骤 2. 将步骤 1所得的提取液浓缩至 500—2000mL, 加入浓缩液 1/4—1/7体积的 氯仿及 1/15—1/30体积的正丁醇， 剧烈振荡， 静置分层， 除去下层有机溶剂层及中间 层， 保留水层， 反复萃取 2一 5次，
步骤 3. 将步骤 2 所得的水溶液对自来水透析 24—48 小时， 透析液浓缩至 500"2000mL, 逐步加入 Γ4倍量乙醇, 4。C放置 2一 10小时， 离心， 沉淀依次以无水乙 醇、 丙酮、 乙醚洗涤， 真空干燥得多糖 YCP粗品， 步骤 4. 取多糖 YCP粗品 50mg, 充分溶解， 上已平衡好的离子交换柱（DEAE-32 ), 先以 5(T300mL蒸馏水洗涤， 再以 0 ~ 2mol/L NaCl溶液梯度洗脱， 分部收集， 硫酸蒽 酮比色法跟踪检测， 合并相同组分。 离子交换柱分离所得多糖组分上分子筛柱层析 ( Sephacryl S-400 ), 分部收集， 硫酸蒽酮比色法跟踪检测， 合并相同組分， 冷冻干 燥， 即得本发明的多糖 YCP。
本发明的多糖 YCP对小鼠移植瘤 Heps和 S18。有明显的抑制作用， 因此本发明的多 糖 YCP可以应用于制备治疗肿瘤的药物。
附图说明
图 1: 多糖 YCP的高效液相色谱纯度鉴定图谱；
图 2: 多糖 YCP的单糖组分的薄层层析图谱， 其中 1. 混合糖 2. 鼠李糖 3. 甘 露糖 4. 葡萄糖 5. 半乳糖 6. YCP 7. 糖醛酸；
图 3: 多糖 YCP的甲基化分析步骤示意图；
图 4: 多糖 YCP高碘酸消耗-时间曲线；
图 5: 多糖 YCP的红外光谱分析图谱；
图 6: 多糖 YCP的氢核磁共振光谱图；
图 7: 多糖 YCP的碳核磁共振光谱图；
图 8: 多糖 YCP与刚果红络合实验最大吸收波长曲线。
具体实施方式
实施例 1.多糖 YCP的提取、 分离纯化、 鉴定
称取湿菌体 lOOOg, 加水置组织捣碎器中捣碎， 补足水至 2000mL, 60°C水浴提取
20小时。 间歇搅拌， 纱布滤去残渣， 2000r. p. m.离心去沉淀。 提取液浓缩至 500mL, 加入浓缩液 1/4体积的氯仿及 1/15体积的正丁醇， 剧烈振荡， 静置分层， 除去下层 有机溶剂层及中间层， 保留水层。 反复萃取 2次。 所得溶液对自来水透析 24小时。 透析液浓缩至 500mL, 逐步加入等体积的乙醇， 4 °C放置 2小时。 离心， 沉淀依次以无 水乙醇、 丙酮、 乙醚洗涤， 真空干燥得多糖 YCP粗品。
取多糖 YCP粗品 50mg, 充分溶解， 上已平衡好的离子交换柱（DEAE-32 ), 先以 50mL蒸馏水洗涤， 再以 0 ~ 2mol/L NaCl溶液梯度洗脱， 分部收集， 硫酸蒽酮比色法 跟踪检测， 合并相同组分。 离子交换柱分离所得多糖组分上分子筛柱 （Sephacryl S - 400 )层析， 分部收集， 硫酸蒽酮比色法跟踪检测， 合并相同组分， 冷冻干燥， 即 得本发明的多糖 YCP。 W
HPLC纯度鉴定： 采用 Shodex SUGAR KS-805 (8画 ID x 300mm)高效液相色谱柱和示 差折光检测器， 流动相为¾0， YCPlmg/ml进样 20μ1 , 流速 lml/min。
结果见图 1。 HPLC纯度鉴定结果为一个对称峰， 表明所得的多糖为单一组分。 实施例 2.多糖 YCP的提取、 分离纯化、 鉴定
称取湿菌体 l OOOg, 加水置组织捣碎器中捣碎， 补足水至 3000mL， 80'C水洛提 取 12小时。间歇搅拌，纱布滤去残渣， 3000r. p. ra.离心去沉淀。提取液浓缩至 l OOOmL, 加入浓缩液 1/5体积的氯仿及 1/25体积的正丁醇， 剧烈振荡， 静置分层， 除去下层 有机溶剂层及中间层， 保留水层。 反复萃取 4次。 所得溶液对自来水透析 36小时。 透析液浓缩至 l OOOmL, 逐步加入 3倍体积的乙醇， 4 °C放置 6小时。 离心， 沉淀依次 以无水乙醇、 丙酮、 乙醚洗涤， 真空干燥得多糖粗品。
取粗品 50mg, 充分溶解， 上已平衡好的离子交换柱（DEAE-32 ), 先以 200mL蒸馏 水洗涤， 再以 0 - 2mol/L NaCl溶液梯度洗脱， 分部收集， 硫酸蒽酮比色法跟踪检测， 合并相同组分。 离子交换柱分离所得多糖 YCP 组分上分子筛柱层析 （Sephacryl S-400 ), 分部收集， 硫酸蒽酮比色法跟踪检测， 合并相同组分， 冷冻干燥， 即得本发 明的多糖 YCP, 纯度与实施例 1的相同。
实施例 3.多糖 YCP的提取、 分离纯化、 鉴定
称取湿菌体 l OOOg, 加水置组织捣碎器中捣碎， 补足水至 4000mL, 90°C水洛提 取 8小时。间歇搅拌，纱布滤去残渣， 4000r. p. m.离心去沉淀。提取液浓缩至 2000mL， 加入浓缩液 1 /7体积的氯仿及 1/30体积的正丁醇， 剧烈振荡， 静置分层， 除去下层 有机溶剂层及中间层， 保留水层。 反复萃取 5次。 所得溶液对自来水透析 48小时。 透析液浓缩至 2000raL, 逐步加入 4倍体积的乙醇， 4 °C放置 10小时。 离心， 沉淀依次 以无水乙醇、 丙酮、 乙醚洗涤， 真空干燥得多糖粗品。
取粗品 50rag， 充分溶解， 上巳平衡好的离子交换柱（DEAE-32 ), 先以 300mL蒸馏 水洗涤， 再以 0 ~ 2mol /L NaCl溶液梯度洗脱， 分部收集， 硫酸蒽酮比色法跟踪检测， 合并相同组分。 离子交换柱分离所得多糖 YCP 组分上分子筛柱层析 （Sephacryl S-400 ), 分部收集， 硫酸蒽酮比色法跟踪检测， 合并相同组分，冷冻干燥， 即得本发 明的多糖 YCP, 纯度与实施例 1的相同。
实施例 4. YCP重均分子量测定
釆用高效液相色谱仪， GPC专用软件，色谱柱为测多糖的专用凝胶柱 Shodex SUGAR KS-805 (8mmID x 300mm) , 分离范围上限为 500 >< 104道尔顿， 检测器为示差折光检测 器。 流动相为水： 柱温 35'C: 流速 lmL/min。 取分子量不同的右旋糖酐分子量标准品 适量， 分别用流动相制成每 mL中约含 lmg的标准溶液， 分别取上述标准溶液 100 μΐ 注入液相色谱仪， 记录色谱图。 由 GPC 专用软件绘制标准曲线， 得线性回归方程： lgti=8.948 - 0.4333tR(Mw为标样的已知重均分子量； 为标样的保留时间）。 取 YCP多 糖 lmg， 溶于 lmL水， 上样 lOOyL, 记录色谱图。 取 3批样品分别进行测定。
测定结果见表 1。 YCP多糖的重均分子量为 1.6 X 106Da "2.6 χ 106Da。
表 1. YCP分子量测定
批次 1 2 3
分子量（ x lO a) 1.6 1.9 2.6 单糖组分分析
实施例 5. 多糖 YCP的薄层层析 (TLC)
称取多糖样品 5mg, 置于干净的安瓿中， 加入 2mol/l 三氟乙酸 2mL， 封管。 100 °C水解 12小时后， 将三氟乙酸蒸干， 用甲醇洗 4—5次后， 用蒸馏水溶解， 备用。 精 密称取鼠李糖、 甘露糖、 葡萄糖、 半乳糖、 葡萄糖醛酸各 20mg, 分别溶于 IraL蒸镏水 中， 从中各吸取 0.2mL溶液混合均匀作为混合糖。 量取 0.75 %CMC-Na溶液 16mL于研 钵中， 分次加入 6g硅胶 G以及终浓度为 0.3mol/L的 NaH2P04, 研磨均匀后均匀涂铺在 干净的玻璃板上 U0x20cm )。 静置晾干， 使用前在 105°C活化 1小时。 按正丁醇： 丙 酮： 水 =4: 3: 1配成展开剂置于层析缸中， 放入已活化好的板， 饱和 10分钟后， 上 行展开。 展开完毕后， 取出， 以苯胺-邻苯二甲酸溶液为显色剂显色后， 于 110°C加 热 10min。
结果见图 2。 YCP完全酸水解后进行薄层层析， 结果只显示清晰的葡萄糖斑点。 实施例 6. 多糖 YCP中糖醛酸和葡萄糖含量的测定
糖醛酸含量的测定： 精密量取标准糖醛酸溶液（6(^g/mL) 0, 0.1, 0.2， 0.3, 0.4, 0.5mL 于带塞试管中， 补足蒸馏水至 0.5mL, 在冰洛中预冷后逐滴加入 1.5mL 0.0125mol/L的四硼酸钠-浓硫酸溶液。 振摇混合， 在沸腾水浴中煮沸 5min。 以冰洛 冷却至室温，每管加入 25μί 0.15%的间羟联苯 -0.5%氢氧化钠溶液。摇匀后在 530nm 处测定光吸收， 以 "0" 管作空白对照， 绘制标准曲线。 为避免样品中非己糖醛酸成 份与四硼酸钠硫酸溶液反应的干扰， 可作一样品对照， 即以 25μΙ 5%氢氧化钠代替 间羟联苯溶液； 测得光吸收值从样品吸收值中扣除。 取 YCP多糖配成 ltng/mL的溶液， 吸取 O.lmL, 补足蒸馏水至 0.5mL, 余操作同标准曲线的制备， 再由回归方程算出相 应浓度。
葡萄糖含量的测定：
精确配置 lOO g/mL的标准糖醛酸溶液， 分别吸取 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. OmL标准溶液置带塞试管中， 补足蒸馏水至 lmL， 加入 2mg/mL蒽酮试剂 4mL, 混匀， 沸水洛煮 10min。 冷却后测定 620nra处的吸光度。 以 "0"管作空白对照， 以吸光度对 葡萄糖浓度作图得标准曲线。
精确配置 lOO g/mL的标准葡萄糖溶液， 分别吸取 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. OraL标准溶液置带塞试管中， 补足蒸馏水至 lmL, 加入 2mg/mL蒽酮试剂 ¼L, 混匀， 沸水洛煮 10min。 冷却后测定 620nm处的吸光度。 以 "0"管作空白对照， 以吸光度对 葡萄糖浓度作图得标准曲线。
取 YCP多糖配成 lmg/mL的溶液， 吸取 0. lmL, 补足蒸馏水至 lmL, 余操作同标准 曲线的制备。
由于糖醛酸的存在对硫酸蒽酮法测定葡萄糖的含量存在一定的干扰， 为此首先采 用间羟联苯法 (y=0.0064x— 0.0006, Y =0.9997)测定糖醛酸的含量， 再根据糖醛酸一硫 酸蒽酮标准曲线 (y-0.0013x— 0.0003, y =0.9998)得到糖醛酸吸光度值的贡献， 总糖的 吸光度与之的差值即为葡萄糖显色所致， 再根据葡萄糖一硫酸蒽酮标准曲线 (y=0.0069x-0.0028, Y =0.9993)计算出总糖中葡萄糖的含量。 由实验可得总糖中 葡萄糖为 975 g/mgYCP， 糖醛酸为 12.7 g/mgYCP。
实施例 7. 多糖 YCP的糖醇乙酰化衍生物的气相分析
称取多糖 10mg加 2mol/L的三氟乙酸， 于安瓿中封口， 于 100°C水解 8h, 水解产 物于蒸发皿中蒸干后加入甲醇 5-6次反复蒸干后溶于 2mL水中， 加入 5mg硼氢化钠 还原， 3mg 内标物肌醇， 充分溶解后， 65°C放置 30min， 水解液减压蒸干。 然后加少 量强酸型离子交换树脂 732H+搅拌数分钟后， 检查溶液呈酸性时过滤， 树脂用少量水 反复洗 3次， 合并滤液在水浴上蒸干， 所得残余物加 3mL甲醇溶解并蒸干， 反复 4次 以上以除去硼化物， 最后使还原产物于小安瓿管中彻底干燥。 在上述还原产物中加入 醋酐和无水吡啶各 0.3mL,封口， 于 100°C水浴乙酰化 20min,冷却， 转移至蒸发皿中， 加入 0.5mL水， 浓缩后反复加水 2-3次直至蒸干， 残渣用 lmL三氯甲烷提取， 提取液 用 lmL水洗， 三氯甲烷溶液减压蒸干后， 再用 0.2mL三氯甲烷重溶。 标准单糖（D-鼠 李糖、 D-阿拉伯糖、 D-甘露糖、 D-葡萄糖、 D-半乳糖）按相同方法处理。 气相条件为： 惠普 6890 气相色谱仪， HP-5 5%苯甲基硅垸毛细管柱（30.0cm>< 0.25ramx0.25μηι)0 分流-不分流进样口， 进样口温度 260°C。 程序升温 110'C至 190 °C, 3°C/min; 190°C至 206。C, 2°C/min; 206°C至 280。C, 20°C/min, 保留 2min。 FID 检测器， 载气为 N2, 流速 25. OmL/min, 检测器温度 300°C。
结果见表 2。 YCP酸水解产物的还原乙酰化产物进行气相色谱分析， YCP仅出现 一个单峰， 与标准单糖的保留时间对比， 可认为 YCP由葡萄糖组成。 在气相色谱中未 检出糖醛酸， 这是因为糖醛酸含有羧基， 在一般条件下不易被还原、 乙酰化、 气化出 峰。 表 2. G YCP气相色谱分析
保留时间 （min)
23.981 24.358 31.807 32.128 32.339
D-鼠李糖
D -阿拉伯糖
D -甘露糖 +
D-葡萄糖
D -半乳糖 +
YCP
相邻单糖基连接方式分析
实施例 8.甲基化分析
称取 20mg彻底干燥糖样， 溶于 6mL无水二甲亚砜（DMS0)充氮气封管， 超声波振 荡 10分钟，加入 200mg精细研磨的 NaOH，充氮气密封，超声波振荡 90min，放置 90min, 逐滴加入 CHJ 2mL, 超声波振荡 30min, 放置 30min, 减压蒸馏除去剩余的 CH3I。
后续步骤见图 3。
重复上述甲基化步骤一次， 经红外光谱分析， 在 3500 cm—1附近无吸收峰， 表明多 糖上的羟基已经完全甲基化。
上述甲基化样品中加入 90% (V/V) 甲酸 3mL, 封口， 水解 6h, 减压蒸发至干， 加入 2mol/L的三氟乙酸， 封口， 于 100'C水解 8h, 乙酰化， 进行气相 -质谱联用分 析。
结果见表 3。
表 3. YCP甲基化反应气质联用结果
摩 尔
甲基化糖 质谱主要碎片 (m/z) 连接方式
比
, 3， 4, 6-Tetra-O-Me-Glc 0.66 43, 45, 71， 87, 101, 117， 129, 145, 161, 205 Glc- (1→ , 3, 6-Tri-O-Me-Glc 16 43, 45, 99, 101, 113, 117, 233 →4) -Glc-(1→ ， 3-Di-0-Me-Glc 1 43, 101, 117， 205 →4, 6) -Glc- (1→
根据 GC保留时间（tR)及MS主要碎片（m/z)， 显示反应产物中有 1， 5 -二乙酰基 -2, 3, 4, 6 -四甲基葡萄糖、 1， 4, 5 -三乙酰基 -2, 3, 6-三甲基葡萄糖以及 1,4, 5, 6- 四乙酰基 -2, 3-二甲基葡萄糖， 其摩尔比为 0.66: 16: 1, 表明 1→4连接葡萄糖构成 了多糖的基本骨架， 每 17个葡萄糖残基有一个 6-0位分支， 根据此结果还可以推断 侧链上还存在因不易被还原、 乙酰化而气化出峰的糖醛酸， 并且侧链中的葡萄糖与糖 醛酸的比例为 2: 1， 每摩尔多糖分子中葡萄糖与糖醛酸的摩尔比为 53: 1, 这与前 述 YCP多糖中葡萄糖与糖醛酸的比例相吻合。
实施例 9过碘酸氧化与 Smith降解
将 NaI04配成 15mmol/L溶液， 稀释 250倍， 再稀释成 10个不同浓度， 于 223nm 处测吸收值， 作标准曲线。
精确称取多糖 YCPlOmg, 加 lOoiL NaI04置 4°C暗处， 间或振摇， 间隔时间取样， 稀释 250倍， 在 223nm处测吸收值， 直至数值不再下降为止。 由标准曲线查出 NaI04 消耗量。
量取 0. lmol/L的 NaOH储备液 25ml加新煮沸过的冷蒸馏水定容至 250ml。 精密 称取三份干燥恒重的邻苯二甲酸氢钾， 每份 3(kg， 分别加 20ml新煮沸过的冷蒸馏水 溶解， 冷却后加酚酞指示液 2滴， 用 NaOH标准溶液滴定至微红色为终点。
高碘酸反应终止后， 以溴甲酚紫作为指示剂， 用上述标定过的 0.006576mol/L的 NaOH溶液测定甲酸释放量。
YCP多糖经 15mM高碘酸完全氧化后，加入适量乙二醇搅拌 30min以还原剩余的高 碘酸。 装入透析袋， 对流水透析 48h, 蒸馏水透析 12h, 于 70-8(TC减压浓缩至最小体 积， 用 ¾8 于室温暗处还原 l2h, 用 0. lmol/L乙酸调节至 pH5.5, 以分解剩余的硼 氢化物， 对蒸馏水透析 24h后冷冻干燥。将所得的多糖醇用 2mol /L的三氟乙酸于 100 °C水解 8h, 水解液减压蒸干， 进行薄层层析。
结果见图 4。
YCP经高碘酸氧化， 144h可反应完全， 高碘酸的消耗达到稳定由 NaI04标准曲线 ( y=0. 0975x - 0. 0064, γ = 0. 9997 )测得每 niol 多糖消耗为 1. 03mol 高碘酸量并有 0. 05mol 甲酸生成， 其结果与由甲基化结果计算的理论值 1. 06和 0. 06基本吻合， 说 明甲基化反应结果所得各残基间的摩尔比正确。
Smi th降解产物经薄层层析主要产物为赤藓醇并有少量甘油， 说明 YCP以 1→4糖 苷键为主要连接方式， 并有少量 1— 6连接的葡萄糖侧链， 这也与甲基化和高碘酸反 应结果相吻合。
端基碳构型分析
实施例 10. 多糖 YCP比旋测定
将多糖 YCP干燥失重后， 精密称取 25mg, 定容至 25mL, 用 0. 8 的滤膜过滤， 取续 滤液依法测定旋光度， 由公式 [a] D l-a/l c计算比旋 [α: 旋光度； L: 玻管长度（dm) ; c: 溶液浓度 (g/mL) ]。 取 5批样品分别进行测定。
测定结果见表 4。 多糖 YCP具有较高的正性比旋（+131. 7 "+159. 4s ；),表明 YCP 的端基碳为 a-构型。
表 4. YCP比旋测定
批次 1 2 3 4 5
比旋 ( ° ) +151. 4 +131. 7 +142. 9 +156. 9 +159. 4
Figure imgf000010_0001
多糖 YCP 经干燥后称取 lmg， 用溴化钾压片法在 Nicolet- 170X 型红外光谱仪上于
4000 ~ 400cm区间扫描。
多糖 YCP的红外光谱图如图 5所示。 在 3600 - 3200 cm—1出现一种宽峰， 是 0-H 的伸缩振动。 在 3000 - 2800 cm— 1的一组峰是糖类 C-H伸缩振动， 1400 - 1200 cnf1的 一些峰是 C-H的变角振动。 这两组峰是糖类化合物的特征吸收。 1000 - 1200 cnf1间的 吸收峰是由 C-0的伸缩振动所引起。 930cm—1的吸收是由 D-葡萄吡喃环的非对称环伸缩 振动所引起。 850cm—1的吸收是 a-端基差向异构的的 C-H变角振动的特征吸收，表明多 糖 YCP的端基碳为 a-构型， 这与比旋测定结果一致。 761cm—1的吸收是由 D-葡萄吡喃 环的对称环伸缩振动所引起。 实施例 12 核磁共振分析
取纯化的多糖 YCP 15mg, 溶于氘代水（D20 ), 60'C于 Varian 500兆核磁共振仪 上进行分析。
结果见图 6, 图 7。 多糖 YCP所测得的核磁共振信号如下：
'H-NMR: δ 5.37 brs, 4.98 brs 3.97 m, 3.87 m, 3.70 m, 3.66 m, 3.43 t (J=8.6 Hz) . 13C-NMR: δ 185.8* (C)， 100.1-100.3 (CH), 77.9-78.2 (CH), 75.3-75.5* (CH), 73.6-74.0 (CH), 73.1-73.4* (CH), 71.8-72.1 (CH), 70.2-70.5* (CH2) , 70.0-70.2* (CH2)， 61.4-61.8 ({¾)。 (*： 弱峰）。 归属见表 5。 表 5. YCP 的 "C-NMR and Ή-NMR信号归属
化学位移 (ppm)
残基 C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6
H-1 H-2 H-3 H-4 H-5 H-6
Glc- (1→ -100. 3 71.8- -72. 1 73.6- -74. 0 70.2- -70. 5 71.8-72. 1 61.4-61.8
3.66 3.97 3.70 3.87 3.87
-Glc- (1 100.1- -100. 3 71.8- -72. 1 73.6- -74. 0 77.9- -78. 2 71.8-72. 1 61.4-61.8
5.37 3.66 3.97 3.70 3.87 3.87
-100. 3 71.8- -72. 1 73.6- -74. 0 77.9- -78. 2 70.2-70. 5 70.0-70.2
4,6)- -Glc- (1
3.66 3.97 3.70 3.87 overlap
100.1- -100. 3 71.8- -72. 1 73.6- -74. 0 70.2- -70. 5 73.1-73. 4 185.8
GlcA- -(1→
4.98 3.66 3.97 3.70 overlap 根据以上结果推断多糖 YCP的重复单元如下:
4>a-D-Glc^-(l- -D-Glq>(l → 4> -Μ -(1
·」 15 a
a-D-Glcp or a-D-GlqpA*
'侧 ¾|±GlcpA:Glc摩尔比为 1: 2
构象分析 实施例 13 KI- 12反应
配制浓度为 lmg/raL的多糖 YCP溶液 lmL, 加入嶼试剂 （含 0. 02 % 12的 0. 2 % Π 溶液 ) 0. 6raL, 测定 200~700nm的电子吸收光谱。
多糖 YCP与碘试剂呈阴性反应， UV检测于 500nm以上无紫外吸收， 说明该多糖不 具有淀粉的 α-螺旋结构， 说明该多糖构象不同于直链淀粉。
实施例 14 刚果红实验
将多糖溶液 (浓度为 2mg/mL)和刚果红溶液 （浓度为 12. 2 mol/L) 等体积混合， 静置 15min, 依次测定混合液在（TO. 4mol/L的 NaOH溶液中最大吸收波长 λ max的变 化。 以纯刚果红溶液为参比， 手控波长扫描。
结果见图 9。 多糖 YCP在刚果红实验中， 与刚果红配合物的最大吸收波长没有发 生红移， 也未出现亚稳区， 表明多糖 YCP分子并不存在多股螺旋构象， 提示多糖 YCP 在水溶液中可能以无规线团构象存在。
实施例 15. 多糖 YCP iv对小鼠移植瘤 Heps的抑制作用
取 ICR小白鼠（18_22g,雌雄各半） 60只，按移植性肿瘤研究法接种 Heps实体型， 接种后 24小时称鼠重， 并随机分为 6组， 空白对照组与天地欣（5mg/kg )组、 环磷 酰胺（20mg/kg )组分别为阴、 阳性对照组， 多糖 YCP组丧高、 中、 低三个剂量组（9, 3， l mg/kg )。 接种 24小时后给药， iv给药， 每 2天一次， 共给药 4次， 于停药后第 2天处死荷瘤小鼠称重， 并分离瘤块称重， 所得数据进行统计学处理（t检验)。 结果见表 6。 与生理盐水对照组相比， 多糖 YCP ( 9, 3 mg/kg )组、 天地欣组及 Cy iil 皆有显著抑制 Heps的肿瘤生长作用， 其中多糖 YCP组与天地欣组对小鼠体重增长无 明显影响， 而 Cy组有显著的抑制小鼠体重增长作用。 实验重复 3次， 结果相近。
表 6 YCP iv对小鼠移植瘤 Heps的抑制作用 （ ±SD ) (n=10)
剂量 小鼠体重 （g) 瘤重 抑瘤率 批次 组别
(mg/kg) 给药前 给药后 (g) (%)
1 空白对照 19.50 土
27.9 ±2. 47 1· 92±0· 29 0 1.28
YCP 19,40 土 27.80 土
1 1· 55 ±0. 53 18.98
1.02 2.23
20.00 土 27.90 土 1.29 土
3 32.59
1.61 2.70 0.44**
19.20 土 25.70 土 1.13 土
9 40.98
1.17 2.61 0.34**
天地欣 19.30 土 26.40 土 1.22 士
5 36.65
1.27 2.24 0.44**
19.30 土 23.00 土 0.62 土
Cy 20 67.94
1.10 1.34** 0.19**
2 空白对照 19.30 士 27.60 土
1. A iO- 32 0 1.10 1.50
YCP 19.40 土 27.70 +
1 47 17.59
1.20 1.49
19.20 土 28.00 土 0.97 土
3 33.81
1.60 1.26 0.37**
19.40 土 27.70 土 0.83 +
9 43.29
1.11 1.10 0.35**
天地欣 19.50 ± 27.80 土 0.91 土
5 37.90
1.02 1.25 0.30**
19.30 士 23.10 土 0.55 土
Cy 20 62.78
1.10 1.04** 0.16**
3 空白对照 20.32 土 27.70 土
1.78 + 0. 27 0 1.12 2.10
YCP 19.78 士 27.80 土 1.36 士
1 23.92
1.06 1.25 0.33**
19.54 + 27.30 + 1.10 土
3 38.07
1.04 1.10 0.24**
19.75 ± 27.40 ± 0.99 士
9 44.58
1.09 1.11 0.35**
天地欣 19.75 土 27.00 + 1.08 土
5 39.53
1.21 1.00 0.46**
19.60 + 23.30 + 0.59 土
Cy 20 67.15
1.20 1.42** 0.17**
*P<0.05, **P<0.01 与空白组比较
实施例 16 多糖 YCP iv对小鼠移植瘤 S18。的抑制作用
取 ICR小白鼠（18—22g, 雌雄各半） 60只, 按移植性肿瘤研究法接种 SIS。实体型, 接种后 24小时称鼠重， 并随机分为 6组， 空白对照组与天地欣（5mg/kg)组、 环磷 酰胺（20mg/kg)组分别为阴、 阳性对照组， YCP组设高、 中、 低三个剂量组（9, 3, 1 mg/kg)。 接种 24小时后给药， iv给药， 每 2天一次， 共给药 4次， 于停药后第 2天 处死荷瘤小鼠称重， 并分离瘤块称重， 所得数据进行统计学处理（t检验)。
结果见表 7。 与生理盐水对照组相比， 多糖 YCP (9， 3 mg/kg)组、 天地欣组及 Cy组 皆有显著抑制 S18。的肿瘤生长作用， 其中多糖 YCP组与天地欣组对小鼠体重增长无明 显影响， 而 Cy组有显著的抑制小鼠体重增长作用。 实验重复 3次， 结果相近。
表 7. YCP iv对小鼠移植瘤 S18。的抑制作用 （f±5D ) (n=10)
剂量 小鼠体重 (g) 瘤重 抑瘤率 批次 组别
(mg/kg) 给药前 给药后 (g) ( % )
1 空白对照 19.40 ±
27.50 ±1. 69 1.88 ±0. 75 0 0.92
YCP 土
1 28.20 ±2. 99 1.61土 0. 52 14.53
Figure imgf000015_0001
19.90 土
3 27.50 ± 3. 04 1.29 ±0· 28* 31.40
1.37
土
9 26.80 ±2. 32 1.14 ±0. 58* 39.49 o
天地欣 19.70 土
5 26.90 ±2. 74 1.20±0. 35* 36.24
1.42
19.60 土 土
Cy 20 67.27
1.20
2 空白对照 土
25.40 * ±2. 84 1.11 ±0. 30 0
YCP 19.90 土
1 26.50 ±2. 05 0.98 ± 0. 28 12.08
1.30
土 o 0.75 土
3 26.70 ±1· 27 32.10
0.14 o**
± * * * * * * * * 士
9 27.20 ±0. 87 43.10 天地欣 土
5 27.10±1. 45 37.33 土 22.00 + ±
Cy 20 63.21
1.18**
3 空白对照 20.00 士
27.80 ±1. 83 1.64 ±0. 44 0 1.26
YCP 土
1 27.50 ±1· 63 1.24 ±0. 47 24.34 土 土
3 27.70±1. 62 35.35 土 土
9 27.80±1. 94 46.97 天地欣 士
5 27.50±1. 63 37.80 土 + 土
cy 20 68.68
*P<0.05, **P<0.01 与空白组比较

Claims

杈利 要 求
1.一种多糖， 其特征是： 它由葡萄糖和糖醛酸构成， 不含蛋白质和核酸， 分子量 为 1. 6 x l 06Da ~2. 6 x l06Da, 端基碳为 α-构型， 旋光度 [a] D'- +131. 7 "+159. 4°- , 多糖的基本骨架由 1→4糖苷键连接的葡萄糖构成， 每 17个葡萄糖残基有一个侧链， 侧链为一个葡萄糖分子或一个糖醛酸分子， 葡萄糖和糖醛酸的比例为 2： 1 , 均通过 1 →6 糖苷键与主链葡萄糖相连接， 每摩尔多糖中葡萄糖与糖醛酸的物质的量之比为 53： 1。
2.—种权利要求 1所述的多糖的制法， 其特征是它由下列步骤组成：
步骤 1. 称取海洋真菌炭团菌湿菌体 lOOOg, 加水置组织捣碎器中捣碎， 补足水 至 2000 ~ 4000mL , 60 ~ 9(TC水浴提取 8 - 20 小时， 间歇搅拌， 纱布滤去残渣， 2000~4000r. p. m.离心去沉淀，
步骤 2. 将步骤 1所得的提取液浓缩至 50(T20()()mL, 加入浓缩液 1/4—1/7体积的 氯仿及 1/15一 1/30体积的正丁醇， 剧烈振荡， 静置分层， 除去下层有机溶剂层及中间 层， 保留水层， 反复萃取 2一 5次， '
步骤 3. 将步骤 2 所得的水溶液对自来水透析 24—48 小时， 透析液浓缩至 500"2000mL, 逐步加入 1一4倍质量的乙醇， 4 °C放置 2一 10小时， 离心， 沉淀依次以无 水乙醇、 丙酮、 乙醚洗涤， 真空干燥得本发明的多糖粗品，
步骤 4. 取本发明的多糖粗品 50mg , 充分溶解， 上巳平衡好的离子交换柱 ( DEAE-32 ), 先以 50一 300mL蒸馏水洗涤， 再以 0 ~ 2mol/L NaCl溶液梯度洗脱， 分部 收集， 硫酸蒽酮比色法跟踪检测， 合并相同组分。 离子交换柱分离所得多糖组分上分 子筛柱层析（Sephacryl S-400 ), 分部收集， 硫酸蒽酮比色法跟踪检测， 合并相同组 分， 冷冻干燥， 即得本发明的多糖 YCP。
3. 根据权利要求所述的多糖在制备治疗肿瘤药物中的应用。
PCT/CN2004/001398 2003-12-04 2004-12-01 Polysaccharide, sa preparation et son utilisation WO2005054299A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200310106520.2 2003-12-04
CNB2003101065202A CN1273492C (zh) 2003-12-04 2003-12-04 一种多糖及其制法和用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005054299A1 true WO2005054299A1 (fr) 2005-06-16

Family

ID=34334218

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2004/001398 WO2005054299A1 (fr) 2003-12-04 2004-12-01 Polysaccharide, sa preparation et son utilisation

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN1273492C (zh)
WO (1) WO2005054299A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011525550A (ja) * 2008-06-23 2011-09-22 広州康采恩医薬有限公司 肺癌治療用デキストラン
CN110174361A (zh) * 2019-05-05 2019-08-27 贵州中烟工业有限责任公司 一种总糖的测量方法
CN111662394A (zh) * 2019-03-05 2020-09-15 中国医学科学院药物研究所 硫酸软骨素多糖半合成制备方法和应用
CN112876576A (zh) * 2021-02-08 2021-06-01 河南农业大学 一种山药皮多糖及其制备方法与应用
CN115232221A (zh) * 2022-05-31 2022-10-25 海南医学院 具有防治肺部感染的薜荔多糖及其制备方法与应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106525727A (zh) * 2015-09-11 2017-03-22 华仁药业股份有限公司 艾考糊精腹膜透析液中艾考糊精含量的测定方法
CN112939016A (zh) * 2021-03-10 2021-06-11 成都理工大学 一种鸡蛋蛋白诱导形成的链状zsm-5微介孔分子筛及其合成方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0478061A1 (en) * 1990-09-25 1992-04-01 Merck & Co. Inc. Antiviral agent
CN1317495A (zh) * 2001-04-23 2001-10-17 南京大学 海洋真菌炭团菌多糖及其提取方法和用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0478061A1 (en) * 1990-09-25 1992-04-01 Merck & Co. Inc. Antiviral agent
CN1317495A (zh) * 2001-04-23 2001-10-17 南京大学 海洋真菌炭团菌多糖及其提取方法和用途

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011525550A (ja) * 2008-06-23 2011-09-22 広州康采恩医薬有限公司 肺癌治療用デキストラン
CN111662394A (zh) * 2019-03-05 2020-09-15 中国医学科学院药物研究所 硫酸软骨素多糖半合成制备方法和应用
CN110174361A (zh) * 2019-05-05 2019-08-27 贵州中烟工业有限责任公司 一种总糖的测量方法
CN112876576A (zh) * 2021-02-08 2021-06-01 河南农业大学 一种山药皮多糖及其制备方法与应用
CN115232221A (zh) * 2022-05-31 2022-10-25 海南医学院 具有防治肺部感染的薜荔多糖及其制备方法与应用
CN115232221B (zh) * 2022-05-31 2023-11-17 海南医学院 具有防治肺部感染的薜荔多糖及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN1546531A (zh) 2004-11-17
CN1273492C (zh) 2006-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hua et al. Structural characterization and DPPH· radical scavenging activity of a polysaccharide from Guara fruits
Wang et al. Structural characterization and in vitro antitumor activity of polysaccharides from Zizyphus jujuba cv. Muzao
CN109223808B (zh) 分子量≦5 000Da的党参寡糖在制备清除DPPH自由基的抗氧化活性药物中的应用
Zhang et al. Hypoglycemic activity in vitro of polysaccharides from Camellia oleifera Abel. seed cake
CN114163545B (zh) 一种枸杞多糖及其在降血糖中的应用
Wang et al. Structure analysis of a neutral polysaccharide isolated from green tea
CN116217745B (zh) 一种藤茶多糖、制备方法及应用
CN111793141A (zh) 一种榆黄蘑菌丝体多糖及其制备方法和用途
WO2005054299A1 (fr) Polysaccharide, sa preparation et son utilisation
CN114591448A (zh) 一种桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖及其制备和用途
CN112321742A (zh) 一种云芝胞外多糖的分离纯化及其结构表征
Nunn et al. Sulphated polysaccharides of the Solieriaceae family: Part I. A polysaccharide from Anatheca dentata
CN110862463A (zh) 具有生物活性的紫花苜蓿根部多糖及其硒化改性多糖的制备
CN1680571A (zh) 麦芽三糖的制备方法
CN115260328A (zh) 一种改性岩藻多糖化合物及其制备方法和应用
CN111320708B (zh) 一种芦根多糖及其制备方法和用途
CN115746161B (zh) 一种改性岩藻多糖化合物及其制备方法和应用
Ray et al. Structure of the capsular polysaccharide of Klebsiella serotype K40
CN113651896B (zh) 一种狄氏副拟杆菌胞外多糖及其提取方法与应用
CN116655820B (zh) 一种藤茶酸性多糖AGP-3a及其提取分离方法和在制备抗炎化妆品中的用途
CN113388046B (zh) 一种香橼果实多糖及其制备方法与应用
CN116425901B (zh) 苦笋多糖及其制备方法和用途
CN111647095B (zh) 一种白树多糖及其制备方法和应用
CN108623698B (zh) 瓜蒌皮寡/多糖glp-1-1、其制备方法及用途
CN115960274B (zh) 一种覆盆子多糖及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase