CN109223808B - 分子量≦5 000Da的党参寡糖在制备清除DPPH自由基的抗氧化活性药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了分子量≦5000Da的党参寡糖在制备清除DPPH自由基的抗氧化活性药物中的应用，并细化了党参寡糖的制备方法。本发明的有益效果为：本发明提供的党参寡糖在制备清除DPPH自由基的抗氧化活性药物中的应用，验证发现党参寡糖具有可以与Vc相媲美的体外抗氧化活性，通过对党参寡糖的单糖组成研究发现党参寡糖主要是由葡萄糖、果糖组成，另外还有极少量的甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖等。党参寡糖是由分子量173～1384的糖类化合物组成的糖混合物。采用PLS法进一步研究党参寡糖的单糖组成与其DPPH自由基清除活性的关联发现，鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖对DPPH自由基清除活性呈正相关，木糖、甘露糖、半乳糖对DPPH自由基清除活性呈负相关。

Description

分子量≦5 000Da的党参寡糖在制备清除DPPH自由基的抗氧 化活性药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及党参寡糖在制备清除DPPH自由基的抗氧化活性药物中的应用。
背景技术
党参为桔梗科植物党参Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.，素花党参Codonopsis pilosula Nannf.var.modesta(Nann.f)L.T.Shen或川党参Codonopsistangshen Oliv.的干燥根，具有“补中益气、健脾益肺”之功效。糖类化合物是党参中的重要化学成分，可分为单糖、多糖和低聚糖，但是对于党参糖类化合物的研究主要集中在多糖，多糖可抗氧化，抗肿瘤及提高免疫力。对于党参中寡糖类成分(分子量≦5 000Da)却鲜有报道。
前期研究发现17批不同产地的党参药材中粗寡糖含量为8.10～33.92g/100g；Sephadex G-25洗脱得率为(81.9～89.2)％，糖含量较高，说明党参寡糖类成分是党参中的重要组分；通过抗氧化活性实验发现党参各组分的DPPH自由基清除活性强弱依次为：寡糖>粗寡糖>95％乙醇提取物>醇提后水提取物>粗多糖，说明党参寡糖类成分是党参中重要的活性组分。因此对党参寡糖类化合物的深入研究是十分必要的。
糖类化合物的单糖组成是研究其结构、性质及构效关系的一项基本内容，很多研究表明同种生物中的糖类化合物，由于其单糖组成不同，活性之间有着巨大的差异。张培等人研究发现党参多糖对HepG2的细胞毒活性与其单糖的种类存在相关性，含有半乳糖醛酸相对较高的党参多糖的细胞毒活性较强。邬澄飞等人研究发现低聚糖单糖构成种类增加，乳杆菌群增殖，短链脂肪酸含量提高，半乳糖比例的提高增强了短链脂肪酸中乙酸、丙酸含量。
因此，系统的研究糖类化合物的单糖组成与活性之间的相关性对于糖类化合物构效关系的研究具有重要意义。但目前尚未文献报道党参寡糖的单糖组成与其抗氧化之间的相关性。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了党参寡糖在制备清除DPPH自由基的抗氧化活性药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：党参寡糖在制备清除DPPH自由基的抗氧化活性药物中的应用。
进一步的，上述的党参寡糖在制备体外抗氧化活性药物中的应用，所述党参寡糖的制备方法，包括以下步骤：
1)取10g党参粗粉，10倍量95％乙醇回流提取2次，1h/次，药渣晾干后，以10倍量水煎煮三次，45min/次，合并水煎液，50℃,60rpm减压浓缩至原体积的1/2～1/4，加95％乙醇至终浓度为80％，静置过夜，离心力10 600×g,离心15min()，上清液回收乙醇，即得到粗寡糖；
2)取粗寡糖溶于少量水中，上适宜规格的Sephadex G-25纯化，蒸馏水洗脱，洗脱流速为1mL/min～10mL/min，每管收集5mL-40mL；以苯酚硫酸法490nm进行检测，以试管号为横坐标，糖含量为纵坐标，作曲线，根据曲线合并洗脱液，50℃、60rpm减压浓缩近干状态，-80℃冰箱中4h，取出置冷冻干燥(24h)，得干燥的粉末，为党参寡糖成分(分子量≦5000Da)。
本发明的第二个目的是提供了一种清除DPPH自由基的抗氧化活性药物，由有效量做为活性成分的党参寡糖和助剂组成。
进一步的，上述的一种清除DPPH自由基的抗氧化活性药物，所述党参寡糖的制备方法，包括以下步骤：
1)取10g党参粗粉，10倍量95％乙醇回流提取2次，1h/次，药渣晾干后，以10倍量水煎煮三次，45min/次，合并水煎液并在50℃,60rpm减压浓缩至原体积的1/2～1/4，加95％乙醇至终浓度为80％，静置过夜，离心(10 600×g,15min)上清液回收乙醇，即得到粗寡糖；
2)取适量粗寡糖溶于水中，上Sephadex G-25(2.6×70cm)纯化，蒸馏水洗脱，洗脱流速为1mL/min，每管收集5mL；以苯酚硫酸法490nm进行检测，以试管号为横坐标，糖含量为纵坐标，作曲线，根据曲线合并洗脱液，减压浓缩(50℃、60rpm)近干状态，-80℃冰箱中4h，取出置冷冻干燥(24h)，得干燥的粉末，为党参寡糖成分(分子量≦5 000Da)。
本发明的有益效果为：本发明提供的党参寡糖在制备清除DPPH自由基的抗氧化活性药物中的应用，验证发现党参寡糖具有可以与Vc相媲美的体外抗氧化活性，通过对党参寡糖的单糖组成研究发现党参寡糖主要是由葡萄糖、组成。采用PLS法进一步研究党参寡糖的单糖组成与其抗氧化活性的关联发现，鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖对DPPH自由基清除活性呈正相关，木糖、甘露糖、半乳糖对DPPH自由基清除活性呈负相关。为以后对党参寡糖的抗氧化活性研究打下基础。
附图说明
图1显示为党参粗寡糖经Sephadex G-25纯化洗脱曲线。
图2显示为苯酚-硫酸法测定葡萄糖含量标准曲线。
图3显示为不同产地党参寡糖的单糖组成气相比较图(a鼠李糖，b阿拉伯糖，c木糖，d甘露糖，e葡萄糖，f半乳糖；混标：各单糖混合标准品，1,3,10,11,12,13,15为产地编号)。
图4显示为17批党参寡糖及Vc的DPPH自由基清除活性。
图5显示为PLS法分析党参寡糖的单糖组成与其DPPH自由基清除活性的相关性。
图6显示为党参寡糖的提取、纯化流程。
图7显示为寡糖的分子量分布图。
图8显示为寡糖单糖组成测定气相图。(a鼠李糖，b阿拉伯糖，c木糖，d甘露糖，e葡萄糖，f半乳糖；1为混合标准品，2为寡糖)
图9显示为单糖标品的糖腈乙酸酯衍生化测定气相图。(1为Fru标品，2为Fru和Glc混合标品，3为Glc标品)
图10显示为1Seliwanoff试剂快速测定果糖有无。(1为果糖对照品，2为葡萄糖对照品，3为党参寡糖)
图11显示为果糖和葡萄糖混标的三甲基硅醚衍生物的GC-MS总离子流图。(1,2为Fru，3,4为Glc)
图12显示为党参寡糖的三甲基硅醚衍生物的GC-MS总离子流图。(1,2为Fru，3,4为Glc)
图13显示为果糖标品120℃水解后GC-MS的总离子流图。
图14显示为果糖标品50℃水解后GC-MS的总离子流图。
图15显示为寡糖GC-MS的总离子流图。
图16显示为党参寡糖的红外光谱图。
图17显示为党参寡糖的13CNMR。
图18显示为党参寡糖的HSQC。
图19显示为党参寡糖的HMBC。
具体实施方式
实施例1：
1材料：
1.1仪器与试剂：
中性单糖对照品葡萄糖(Glu，批号110833-201205)、鼠李糖(Rha，批号111683-200401)、阿拉伯糖(Ara，批号111506-200001)、半乳糖(Gal，批号100226-201105)、甘露糖(Man，批号140651-200602)、木糖(Xyl，批号111508-200404)、均购自中国食品药品检定研究院；
三氟乙酸(郑州阿尔法化工有限公司)，盐酸羟胺(天津化学试剂厂)，肌醇六乙酰酯(上海洽姆仪器科技有限公司)，吡啶、乙酸酐(北京化工厂)；
分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；Shimadzu GC-2014气相色谱仪(Shimadzu，日本)；
1.2药材来源：
17批党参药材Codonopsis Radix(见表1)。1-14号党参为白条党参，16号为潞党参，它们都属于桔梗科植物党参Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.的干燥根；15号为纹党参，是桔梗科植物素花党参Codonopsis pilosula Nannf.var.modesta(Nannf.)L.T.Shen的干燥根；17号为桔梗科植物川党参Codonopsis tangshen O liv.的干燥根。表1显示为党参药材信息。
表1
Figure BDA0001816893560000041
Figure BDA0001816893560000051
2方法：
2.1党参寡糖样品的制备：
1)取10g党参粗粉，10倍量95％乙醇回流提取2次，1h/次，药渣晾干后，以10倍量水煎煮三次，45min/次，合并水煎液，减压浓缩(50℃,60rpm)至原体积的1/4，加95％乙醇至终浓度为80％，静置过夜，离心(10 600×g,15min)，上清液回收乙醇，即得到粗寡糖。
2)取粗寡糖溶于少量水中，上Sephadex G-25(2.6×70cm)纯化，蒸馏水洗脱，洗脱流速为1mL/min，每管收集5mL；以苯酚硫酸法490nm进行检测，以试管号为横坐标，糖含量为纵坐标，作曲线，根据曲线合并洗脱液，减压浓缩(50℃、60rpm)近干状态，-80℃冰箱中4h，取出置冷冻干燥(24h)，得干燥的粉末，为党参寡糖成分(分子量≦5 000Da)。
2.2样品中糖含量的测定：
2.2.1葡萄糖对照品溶液的配制精密称取经105℃干燥至恒定质量的无水葡萄糖对照品1.04mg，置10mL量瓶中，蒸馏水溶解并定容，摇匀，得0.104mg/mL葡萄糖对照品溶液，4℃保存备用。
2.2.2标准曲线的制备分别精密移取葡萄糖对照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.5、0.7、0.9、1.0、1.2mL于试管中，加蒸馏水补至2.0mL。加入5％苯酚溶液(称取5.07g重蒸苯酚用蒸馏水定容于100mL棕色量瓶中)1mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5mL，摇匀，放置10min。沸水浴中30min，取出，于冷水中冷却至室温，于490nm处测吸光度(A)值。以A490nm值为纵坐标(Y)，葡萄糖浓度(mg/mL)为横坐标(X)，绘制得到标准曲线为Y＝13.582X-0.0022(R2＝0.9997)(图2)。
2.2.3样品溶液的制备及测定精密称取寡糖12.00mg加蒸馏水溶解并定容于25mL量瓶中。精密移取0.2mL样品溶液，加水补至2.0mL。按“2.2.2”项下方法，自“加入5％苯酚溶液1mL”起，进行余下操作，测定A值，按照标准曲线计算样品中的糖含量。17批党参制得的寡糖得率与糖含量结果见表2。由结果可知，17批党参制得的小分子样品中的糖含量均有不同。其中，10号党参寡糖的糖含量最低，为40.02％；16号党参寡糖的糖含量最高，为99.13％。
表2
Figure BDA0001816893560000061
2.3党参寡糖的单糖组成分析：
称取党参寡糖10mg于特弗伦管中，准确移入新鲜配制的2mol/L三氟乙酸2mL，密封好，置于120℃完全酸水解3h。3h后，取出，减压旋干(50℃,60rpm)。反复加入甲醇(1-2mL)，继续旋干(50℃,60rpm)，以达到将三氟乙酸完全除去的目的。向上述含有残渣的圆底烧瓶中继续加入盐酸羟胺10mg，吡啶0.5mL，同时加入肌醇六乙酰酯4mg(作为内标)，充分混合后，置于90℃条件下继续反应半小时。放至室温后，移取乙酸酐0.5mL于上述圆底烧瓶中，充分混合，置于90℃条件下继续反应半小时，减压旋干(50℃,60rpm)。将残渣溶于1mL氯仿溶液中，用0.45μm有机滤膜进行过滤后，采用GC法对样品进行分析。各单糖的混合对照品(包含有Rha、Ara、Xyl、Man、Glu、Gal)按照上述处理样品的方法进行相同操作。
(2)GC条件：
色谱柱：OV-101(50m 0.25mm i.d.)；进样量：1μL；程序升温：以15℃/min从175℃升到190℃，保留5min；再以5℃/min升到250℃，保留1.5min。党参寡糖的单糖组成气相比较图如图3所示。17批党参寡糖的单糖组成摩尔比如表3所示。
表3
Figure BDA0001816893560000062
Figure BDA0001816893560000071
2.4党参寡糖对DPPH自由基的清除活性：
采用DPPH法测定样品清除自由基的活性。DPPH是一种稳定的以氮为中心的自由基，其乙醇溶液显紫色，最大吸收波长为517nm。当DPPH溶液中加入自由基清除剂，其孤对电子被配对时，吸收消失或减弱，导致溶液颜色变浅，显黄色或淡黄色，在517nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，故该法可用于表示清除率，清除率越大，表明该物质清除能力越强。
DPPH溶液的配置：精密称取DPPH 20mg，用无水乙醇溶解并定容至500mL棕色容量瓶中，得质量分数为0.004％的DPPH溶液，避光保存，备用。
样品及对照品溶液的配置：称取17批不同产地党参寡糖适量，用水溶解，定容至10mL，稀释，分别配制成5.00,2.50,1.25,0.63,0.31mg/mL，制成样品溶液。对照品溶液：Vc也按上述方法配置。
测定方法:在1mLDPPH醇溶液中加入1mL样品溶液(0.31-5.00mg/mL)或对照品Vc溶液,混匀器混匀后避光反应，测定A570nm，重复测定3次，求平均值。党参各组分对DPPH自由基的清除率用下面的公式表示：
DPPH清除率(100％)＝1-[(Ai-Aj)/A0]×100
其中：A0为1mLDPPH醇溶液+1mL超纯水后的吸光值；Ai：1mLDPPH醇溶液+1mL样品溶液后的吸光值；Aj：1mL样品溶液+1mL超纯水后的吸光值；
图4显示为17批党参寡糖及Vc的DPPH自由基清除活性。
2.5党参寡糖的单糖组成与其DPPH自由基清除活性的相关分析：
党参寡糖主要由葡萄糖组成，但不同产地的党参寡糖，其单糖的种类、量及对DPPH自由基清除活性均有所不同。为明确单糖种类及量与DPPH自由基清除活性间是否有关联，利用Simca-p 11.5软件采用PLS分析法对党参多糖的单糖种类及量与其对DPPH自由基清除活性活性进行相关性分析，探讨两者的关系。
以17批不同产地党参寡糖的单糖组成与其对应的EC50值的乘积为独立变量(X)，以不同产地党参寡糖对应的DPPH自由基清除活性作为因变量(Y)，采用PLS进行相关分析，得到各单糖的回归系数。其中系数绝对值反映单糖种类及量对贡献的大小，回归系数绝对值越大，说明相关性越大；回归系数的符号反映单糖与DPPH自由基清除活性相关性(正相关或负相关)。表4显示为17批党参寡糖的EC50值及其对应的活性。
表4
Figure BDA0001816893560000081
拟合出党参寡糖的单糖种类及量与DPPH自由基清除活性之间的回归方程为Y＝0.163XRha+0.177XAra-0.059XXyl－0.277XMan+0.086XGlu-0.022XGal。由此方程可知，各单糖对DPPH自由基清除活性的贡献大小为甘露糖＞阿拉伯糖＞鼠李糖＞葡萄糖＞木糖＞半乳糖。其中，鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖对DPPH自由基清除活性呈正相关，木糖、甘露糖、半乳糖对DPPH自由基清除活性呈负相关。
党参性甘、平，是著名的补益药。《百草镜》中曰“以净软壮实味甜者佳”。《药笼小品》中以“西产为上，体糯味甜、嚼之少渣者佳”。因此申请人认为，党参中寡糖类成分一方面作为党参中甜味来源，另一方面也有可能是党参中重要的活性成分。目前尚未见对党参中寡糖成分(分子量≦5 000Da)活性关注的研究报道。
实施例2：
党参寡糖的结构解析：
1.仪器与试药：
1.1仪器
Shimadzu GC-2014气相色谱仪(Shimadzu，日本)；Agilent 1260 InfinityⅡ高效液色谱仪及RID检测器；岛津GC-MS QP 2010 Ultra
1.2试药
潞党参药材采自山西省晋城市，经兰州大学周印所教授检定为Codonopsispilosula(Franch)Nannf的干燥根。
中性单糖对照品葡萄糖(Glu，批号110833-201205)、鼠李糖(Rha，批号111683-200401)、阿拉伯糖(Ara，批号111506-200001)、半乳糖(Gal，批号100226-201105)、甘露糖(Man，批号140651-200602)、木糖(Xyl，批号111508-200404)、均购自中国食品药品检定研究院；三氟乙酸(郑州阿尔法化工有限公司)，盐酸羟胺(天津化学试剂厂)，肌醇六乙酰酯(上海洽姆仪器科技有限公司)，吡啶、乙酸酐(北京化工厂)；
2.实验方法：
2.1党参药材各部分的提取及寡糖的制备
党参药材粗粉100g中加入10倍量体积的乙醇(95％)，回流提取2次，1h/次，过滤，合并提取液，减压浓缩，蒸干至恒重，即为醇提取物(16.84±0.51g)。将上述所得药渣晾干，加入10倍量水，煮沸提取三次，45min/次，合并滤液，减压浓缩至一定体积，向水提浓缩液中缓慢加入乙醇(95％)至终浓度为80％，放置过夜后离心，上清液即为二级醇溶液，二级醇溶液减压浓缩，蒸干即为二级醇溶物(33.92±0.62g)。沉淀即为粗多糖(17.40±0.61g)。
取50mg二级醇溶物上Sephadex G-25(2.6×70cm)纯化，脱气水平衡过夜后，洗脱，洗脱流速为1mL/min，每管收集5mL。以苯酚硫酸法(490nm)进行检测，以管号为横坐标，糖质量分数(％)为纵坐标，作曲线，根据曲线合并洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，即得寡糖(16.96mg)。制备过程见图6。
2.2寡糖的糖含量测定
采用苯酚硫酸法测定寡糖部分的糖含量，以葡萄糖为对照。
2.3分子量分布测定
以系列不同分子量的标准葡聚糖右旋糖酐(Detran)(180,342,505,1200,3650,4300，20000,41400,55500)为对照品，用0.05MNa2SO4溶液溶解后(浓度均为3mg/mL)，采用SEC-GPC测其保留时间，并做保留时间与标准品相对分子量之间的回归曲线。将样品用流动相溶解后(浓度均为3mg/mL)，按相同的方法测其保留时间，并根据回归曲线，计算其相对分子量。仪器为Angilent 1260，检测器为RID检测器；色谱柱为TSKPWxl3000及TSKPWxl2500色谱柱串联；流动相为0.05MNa2SO4溶液；流速为0.8mL/min；柱温为40℃；进样量为30μl。
2.4单糖组成分析
称取10mg样品于特弗伦管中，准确移入新鲜配制的2mol/L三氟乙酸2mL，密封好，置于120℃完全酸水解3h。3h后，取出，减压旋干。反复加入甲醇(1-2mL)，继续旋干，以达到将三氟乙酸完全除去的目的。向上述含有残渣的圆底烧瓶中继续加入盐酸羟胺10mg，吡啶0.5mL，同时加入肌醇六乙酰酯4mg(作为内标)，充分混合后，置于90℃条件下继续反应半小时。放至室温后，移取乙酸酐0.5mL于上述圆底烧瓶中，充分混合，同样置于90℃条件下继续反应半小时，减压旋干。将残渣溶于1ml氯仿溶液中，用0.45m有机滤膜进行过滤后，采用GC法对样品进行分析。各单糖的混合对照品(包含有Rha、Ara、Xyl、Man、Glu、Gal)按照上述处理样品的方法进行相同操作。GC条件：色谱柱：OV-101(50m 0.25mm i.d.)；进样量：1μL；程序升温：以15℃/min从175℃升到190℃，保留5min；再以5℃/min升到250℃，保留1.5min。
2.5 Seliwanoff试剂法快速测定果糖有无
酮糖在间苯二酚(resorcinol)存在下与强酸作用可以生成颜色反应。
溶解50mg间苯二酚于100mL盐酸中(盐酸：水＝1:2，V/V)。临用前配制，盐酸浓度不宜超过12％，否则导致糖形成糠醛或其他衍生物。
取3支试管，加入Seliwanoff试剂1mL，再分别加果糖、葡萄糖对照品和党参低聚糖样品4滴，放入沸水中，比较颜色变化。
2.6果糖和葡萄糖含量测定
称取样品10.00mg于特弗伦管中，加5mL 2mol/L TFA溶液，120℃水解2h，水解液转入10mL圆底烧瓶中减压蒸干，向残渣中加入0.5mL 2.5％盐酸羟胺的吡啶溶液，封口后，于70℃烘箱中加热反应30min，然后加入0.9mL六甲基二硅胺烷和0.1mL三氟乙酸，于100℃烘箱中加热反应60min，即得标准单糖的三甲基硅醚衍生物，进行GC-MS分析。葡萄糖、果糖对照品及二者混合对照品按同样方法处理。
色谱条件：
色谱柱：HP-5MS毛细管柱(60m×0.32mm i.d.)；进样体积：1μL；色谱条件：进样口、传输线和离子源温度均为250℃，柱温箱采用程序升温，起始温度140℃，2℃/min至198℃，保温4min，4℃/min升温至214℃，1℃/min升温至217℃，保温4min，5℃/min升温至250℃，保温18min，载气流速1mL/min，质谱扫描范围40-650。
2.7甲基化实验及GC-MS分析
2.7.1甲基化反应
取10mgG16样品，加入甲醇溶解后，减压旋干，准确移入干燥的DMSO溶液2.5mL，在氮气的保护作用下，将样品充分溶解。准确称取研磨均匀的氢氧化钠粉末250mg，在氮气保护作用下，于25℃超声1.5h，并放置1.5h。在冰浴的条件下，逐渐向上述溶液中滴加碘甲烷(1.875mL)，约在1min内加完。在氮气保护作用下，于25℃超声0.5h，并放置0.5h，加入2.5mL水终止反应，并用CH2Cl2(2.5mL)萃取三次后，将CH2Cl2层合并，并用7.5mL蒸馏水分3次对其进行水洗，透析后，冷冻干燥。按上述操作将样品甲基化三次后，红外光谱检测后，若无-OH峰的存在，表明样品已被完全甲基化；否则，继续甲基化。
2.7.2水解、还原、乙酰化
向上述已被甲基化的样品中加入88％甲酸5.0mL，密封后，于100℃烘箱中反应3h后，减压旋干。向上述残渣中，加入新鲜配制的TFA溶液(2mol/L)2.0mL，密封后，于50℃中反应3min，取出，减压旋干。反复加入甲醇(1-2mL)，继续旋干，以达到将三氟乙酸完全除去的目的。向上述残渣中加入2.5mL新鲜配制的0.5mol/L的NaBH4的氨水溶液，于60℃烘箱中反应60min后，加入1.25mL丙酮终止反应，并于40℃条件下，减压旋干。加入0.5mL乙酸(18mol/L)使上述残渣溶解后，相继加入乙酸乙酯(2.5mL)、乙酸酐(7.5mL)、70％高氯酸(0.25mL)，将其充分混合，并反应5min，冰浴冷却。相继滴加蒸馏水(25mL)及作为催化剂的1-甲基咪唑(0.5mL)，充分混合后，继续反应5min。用CH2Cl2(1.5mL)对反应后的溶液进行萃取，取CH2Cl2层，过0.45μm有机膜后，GC-MS分析样品。
2.7.3 GC-MS分析
气相色谱条件：色谱柱：HP-5(30m×0.320mm×0.25μm)；程序升温：初始温度50℃，保持3分钟，以5℃/min的速率升至100℃，再以10℃/min升至250℃/min，保持7min；载气：高纯氦气(纯度≥99.999％)；进样口温度：250℃；分流比：1：1；进样体积：1μL。
质谱条件：电子轰击离子源；电子能量：70eV；传输线温度200℃；离子源温度：200℃；溶剂延迟：3min；质量扫描范围：m/z30-450u。
2.8 IR
称取干燥的CPP1a样品，采用KBr压片法在4000-400cm-1波数范围内检测其红外特征。
2.9 NMR
称取20mg干燥的G16，反复用D2O(0.5mL)溶解并冷冻干燥三次后，进行1H NMR及13CNMR分析。
3.实验结果
3.1寡糖的分离及相对分子量测定
寡糖部分是党参药材经水提取，80％乙醇将多糖部分沉淀除去，经Sephadex G 25纯化得到的部分，苯酚-硫酸法测定该部分的糖含量达99.13％。
由该寡糖的GPC色谱图可知，该寡糖主要有5个分子量不同的糖组分组成，标记为1～5，其中每部分所占百分含量见表5。根据不同分子量标准右旋葡聚糖苷的保留时间与相对分子量做的标准曲线为Mw＝0.0073894t2-0.597191t+12.0336，r＝0.997。根据寡糖的色谱图，计算出其相对分子质量，可知该寡糖为173～1384分子量糖类化合物组成的混合物。
表5.寡糖各糖组分的面积比及相对分子量
Figure BDA0001816893560000121
3.2寡糖的单糖组成分析
3.2.1党参寡糖的单糖组成分析
由GC色谱图可知，党参低聚糖主要由Glc组成，但是由于糖腈乙酸酯衍生化测定单糖组成的方法不能测出Fru(图9)，因此要进一步测定Fru的有无。
3.3果糖有无测定
根据Seliwanoff试剂法测定果糖有无结果见图10。
其中，1,3号试管中加入糖溶液放于沸水浴中时，快速出现明显颜色变化，说明党参低聚糖中含有果糖。
3.4果糖含量测定
表6.低聚糖各峰的峰面积
Figure BDA0001816893560000131
因此，党参低聚糖的单糖组成主要为Glc和Fru，且二者的比例为1.21:1。
3.5甲基化分析
3.5.1水解条件的确定
甲基化后的样品加入2MTFA120℃水解3h时，果糖由于温度太高结构发生变化，不能检测出来。
参考文献条件，将水解条件变为2M TFA50℃水解30min[1]，此时可以检测出果糖。
因此寡糖的水解条件确定为2M TFA 50℃水解30min。
3.5.2党参低聚糖的甲基化分析
寡糖完全甲基化后，水解、衍生化，进行GC-MS分析。将所得结果与数据库(NIST)质谱图进行比对。
表7.糖链残基的连接方式
Figure BDA0001816893560000132
由此可知党参低聚糖中含有单糖种类为Glc,Fru，且低聚糖中糖链的连接方式包括→2)-Fruf-1(→，→1)-Glcp-6(→，terminal-Glcp和terminal-Fruf
3.6 IR
由红外光谱图可以看出，3375cm-1和2935cm-1处分别是-OH和-CH的伸缩振动峰，这两个峰是糖的特征吸收峰，1628.7cm-1处是结合水的吸收，1058cm-1处是-CO的伸缩振动，1000～800cm-1是呋喃型糖的特征峰，其中923.8,867.6和,818.6cm-1处有吸收表明党参低聚糖中果糖是β构型的糖苷键连接。
3.7 NMR
由13CNMR谱图可以看出，党参低聚糖的异头碳原子区域出现5个峰，说明党参低聚糖中有5种单糖残基连接方式。由HSQC谱图可以看出，1HNMR异头区域的3个化学位移分别为δ5.3，5.1，4.6的三个峰分别对应13CNMR异头区域的化学位移为δ92.17,92.17,95.93，说明葡萄糖有三种存在方式，分别为α-D-Glcp,→1-α-D-Glcp和β-D-Glcp。HMBC中H-1/C-2处的峰证明了党参低聚糖中存在→2)-β-D-Fruf-1(→。13CNMR中δ101.51和δ98.06处分别为β-D-Fruf和β-D-Frup的C2。
表8.单糖残基的化学位移归属
Figure BDA0001816893560000141
4.总结
由以上实验结果可知，党参寡糖是由分子量173～1384的糖类化合物组成的混合物，其中单糖部分主要由α-D-Glcp，β-D-Glcp，β-D-Fruf和β-D-Frup组成，寡糖的糖链主要连接方式为terminal-α-D-Glcp,terminal-β-D-Fruf和→2)-β-D-Fruf-(1→。
通过对党参寡糖的单糖组成研究发现党参寡糖主要是由葡萄糖、果糖组成，另外还有极少量的甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖等，党参寡糖的主要两种单糖Glc和Fru的比例为1.21:1。党参寡糖是由分子量173～1384的糖类化合物组成的糖混合物，其中单糖部分主要有α-D-Glcp，β-D-Glcp，β-D-Fruf和β-D-Frup组成，寡糖的糖链主要连接方式为terminal-α-D-Glcp,terminal-β-D-Fruf和→2)-β-D-Fruf-(1→。采用PLS法进一步研究党参寡糖的单糖组成与其DPPH自由基清除活性的关联发现，鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖对DPPH自由基清除活性呈正相关，木糖、甘露糖、半乳糖对DPPH自由基清除活性呈负相关。
由此推测党参寡糖中可能有的糖的结构为：
(1)单糖
Figure BDA0001816893560000151
(2)双糖
Figure BDA0001816893560000152
(3)三糖、四糖、八糖
Figure BDA0001816893560000153
其中，n＝1,2,6.
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.分子量≤5 000Da的党参寡糖在制备清除DPPH自由基的抗氧化活性药物中的应用，其特征在于，所述党参寡糖的制备方法，包括以下步骤：
1)取10g党参粗粉，10倍量95%乙醇回流提取2次，1h/次，药渣晾干后，以10倍量水煎煮三次，45min/次，合并水煎液，50℃,60rpm减压浓缩至原体积的1/2～1/4，加95%乙醇至终浓度为80%，静置过夜，离心，离心转速为10 600×g，离心时间为15min，上清液回收乙醇，即得到粗寡糖；
2)取粗寡糖溶于少量水中，上适宜规格的Sephadex G-2纯化，蒸馏水洗脱，洗脱流速为1mL/min～10mL/min，每管收集5mL～40mL；以苯酚硫酸法490nm进行检测，以试管号为横坐标，糖含量为纵坐标，作曲线，根据曲线合并洗脱液，50℃、60rpm减压浓缩近干状态，-80℃冰箱中4h，取出置冷冻干燥24h，得干燥的粉末，为分子量≤5 000Da的党参寡糖成分。
2.一种清除DPPH自由基的抗氧化活性药物，其特征在于，由有效量作为活性成分的党参寡糖和助剂组成；
所述党参寡糖的制备方法，包括以下步骤：
1)取10g党参粗粉，10倍量95%乙醇回流提取2次，1h/次，药渣晾干后，以10倍量水煎煮三次，45min/次，合并水煎液，50℃,60rpm减压浓缩至原体积的1/4，加95%乙醇至终浓度为80%，静置过夜，离心，离心转速为10 600×g，离心时间为15min，上清液回收乙醇，即得到粗寡糖；
2)取粗寡糖溶于少量水中，上适宜规格的Sephadex G-25纯化，蒸馏水洗脱，洗脱流速为1mL/min～10mL/min，每管收集5mL～40mL；以苯酚硫酸法490nm进行检测，以试管号为横坐标，糖含量为纵坐标，作曲线，根据曲线合并洗脱液，50℃、60rpm减压浓缩近干状态，-80℃冰箱中4h，取出置冷冻干燥24h，得干燥的粉末，为分子量≤5 000Da的党参寡糖成分。
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