CN111135206A

CN111135206A - 党参低聚糖在制备抗贫血药物中的应用

Info

Publication number: CN111135206A
Application number: CN202010134418.7A
Authority: CN
Inventors: 胡芳弟; 张菊; 白瑞斌; 闫巧; 李雪; 樊精敏; 孙伯禄; 王燕萍; 张淹
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2020-03-02
Filing date: 2020-03-02
Publication date: 2020-05-12

Abstract

本发明公开了党参低聚糖在制备抗贫血药物中的应用，党参低聚糖在抗贫血药物中是做为促红细胞生成素调节剂使用的；并提供了党参低聚糖的制备方法。本发明的有益效果为：本发明提供的党参低聚糖作为促红细胞生成素调节剂在制备抗贫血药物中的应用，其制备的药物，具有很好的效果，其药物本身安全有效，没有毒副作用；经实验验证可知，含有党参低聚糖的药物作为促红细胞生成素调节剂可以调节缺氧诱导因子HIF‑1α的表达；改善缺铁性贫血、铁利用障碍贫血、再生性障碍贫血、肾功能障碍所致的贫血和骨髓造血功能损伤等多种原因导致的贫血。

Description

党参低聚糖在制备抗贫血药物中的应用

技术领域

本发明涉及贫血药物筛选技术领域，具体涉及党参低聚糖在制备抗贫血药物中的应用。

背景技术

促红细胞生成素(EPO)是一种主要由肾脏产生的红细胞特异性造血生长因子，在低氧胁迫下可循环EPO的量降低会导致贫血。EPO表达的转录调控受缺氧诱导因子(HIF)的控制。缺氧刺激后，活化的HIF结合位于EPO启动子上的低氧应答元件(HRE)，随后启动基因表达，调节EPO的表达。

贫血的特征是血液运载氧的能力减少，并因而伴有类似体征与症状，包括皮肤及粘膜苍白、虚弱、头晕、易疲劳和嗜睡,导致生活质量的下降。贫血通常与血液中缺乏红细胞或血红蛋白的病况有关。贫血的普遍原因包括铁、维生素B12和叶酸缺乏,也会与慢性疾病并发,例如炎性疾病,包括具有继发骨髓炎性抑制的疾病等。贫血也与肾功能障碍有关,经常透析的大多数肾衰竭患有慢性贫血。

党参作为一种重要的传统中药，具有养血生津的功效，党参低聚糖是党参中的重要活性组分，党参低聚糖的抗贫血研究至今仍是空白。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了党参低聚糖在制备抗贫血药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：党参低聚糖在制备抗贫血药物中的应用。

本发明所述贫血是指导致血液中氧含量降低的血红蛋白或红细胞的任何异常或不足。贫血可能与红细胞和/或血红蛋白的异常产生、加工或性能有关。贫血是指血液中红血细胞的数目和/或血红蛋白的含量相对于正常血液含量的任何降低。

进一步的，上述的应用，所述党参低聚糖在抗贫血药物中是做为促红细胞生成素调节剂使用的。

进一步的，上述的应用，所述党参低聚糖中包含有聚合度为1～10的由葡萄糖和果糖组成的低聚糖。

进一步的，上述的应用，所述党参低聚糖的制备方法，是党参进行醇提，收集药渣，将药渣进行水提后浓缩，将得到的浓缩液进行醇沉，收集上清液并减压浓缩，得到党参粗低聚糖RCPO，将党参粗低聚糖RCPO进行纯化，得到党参低聚糖CPO。

进一步的，上述的应用，所述党参低聚糖的制备方法，具体包括以下步骤：按照质量体积比将党参粗粉和10倍量95％乙醇混合，水浴90℃回流提取2次，每次1小时，收集药渣，分别在收集的药渣中加入药渣10倍、8倍、8倍量的水，沸水煎煮3次，每次45分钟，收集并合并水提液，50℃、60rpm将水提液减压浓缩至1/4体积，得浓缩液；在浓缩液中加乙醇至乙醇终浓度为80％进行醇沉，收集上清液；50℃,60rpm将上清液减压浓缩至挥干乙醇，得到党参粗低聚糖RCPO，将党参粗低聚糖RCPO进行Sephadex凝胶层析纯化，得到党参低聚糖CPO。

进一步的，上述的应用，所述党参粗低聚糖RCPO进行Sephadex凝胶层析纯化的具体方法，包括以下步骤：将党参粗低聚糖RCPO溶于水中，上Sephadex G-25(2.6×70cm)纯化，蒸馏水洗脱，洗脱流速为1mL/min，以苯酚硫酸法在490nm下测定吸光度，以试管号为横坐标，糖含量为纵坐标，作曲线，根据曲线合并洗脱液，50℃、60r/min减压浓缩至快干，用少量水从浓缩瓶中溶出后，置于-80℃冰箱中4h，冷冻干燥24h，即得到党参低聚糖CPO。

本发明的第二个目的是提供了一种含有党参低聚糖的抗贫血药物，所述药物中的党参低聚糖是按照上述方法制备得到的。

进一步的，上述的药物，所述药物的给药方式为：口服给药、经鼻递药、皮下或肌肉注射、静脉注射或者静脉滴注。

进一步的，上述的药物，所述药物的剂型为：丸剂、胶囊剂、片剂，糖浆、缓释制剂、控释制剂、注射制剂、栓剂、凝胶剂、微丸、微乳、口服液、喷剂。

本发明的有益效果为：本发明提供的党参低聚糖作为促红细胞生成素调节剂在制备抗贫血药物中的应用，其制备得到的药物，具有很好的效果，其药物本身安全有效，没有毒副作用；经实验验证可知，含有党参低聚糖的药物作为促红细胞生成素调节剂可以调节缺氧诱导因子HIF-1α的表达；改善缺铁性贫血、铁利用障碍贫血、再生性障碍贫血、肾功能障碍所致的贫血和环磷酰胺所致红细胞数目降低等多种原因导致的贫血。

附图说明

图1显示为CPO对HEK293T细胞中促红细胞生成素mRNA表达的影响(*p<0.05，**p<0.01vs.模型组)。

图2显示为CPO对HEK293T细胞中缺氧诱导因子-1αmRNA表达的影响。

图3显示为CPO对HEK293T细胞中缺氧诱导因子-1α蛋白表达的影响。

图4显示为各组大鼠血清中促红细胞生成素含量(与正常组相比：#P<0.05；与模型组想比：*P<0.05)。

具体实施方式

实施例1：

党参低聚糖在制备抗贫血药物中的应用，其中，党参低聚糖中包含有聚合度为1～10的由葡萄糖和果糖组成的低聚糖。

党参低聚糖的制备方法，具体包括以下步骤：按照质量体积比将党参粗粉和10倍量95％乙醇混合，水浴90℃回流提取2次，每次1小时，收集药渣，分别在收集的药渣中加入药渣10倍、8倍、8倍量的水，沸水煎煮3次，每次45分钟，收集并合并水提液，50℃、60rpm将水提液减压浓缩至1/4体积，得浓缩液；在浓缩液中加乙醇至乙醇终浓度为80％进行醇沉，收集上清液；50℃,60rpm将上清液减压浓缩至挥干乙醇，得到党参粗低聚糖RCPO，将党参粗低聚糖RCPO进行Sephadex凝胶层析纯化，得到党参低聚糖CPO。

党参粗低聚糖RCPO进行Sephadex凝胶层析纯化的具体方法，包括以下步骤：将党参粗低聚糖RCPO溶于水中，上Sephadex G-25纯化，蒸馏水洗脱，洗脱流速为1mL/min，以苯酚硫酸法在490nm下测定吸光度，以试管号为横坐标，糖含量为纵坐标，作曲线，根据曲线合并洗脱液，50℃、60r/min减压浓缩至快干，用少量水从浓缩瓶中溶出后，置于-80℃冰箱中4h，冷冻干燥24h，即得到党参低聚糖CPO；Sephadex G-25的规格为2.6×70cm。

实施例2：

对人胚胎肾成纤维细胞促红细胞生成素和缺氧诱导因子-1α的影响：

1.细胞培养

人胚胎肾成纤维细胞系HEK293T购自ATCC细胞库中心。细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，在温度为37℃，CO₂为5％的加湿培养箱中孵育。

2.促红细胞生成素和缺氧诱导因子-1α的mRNA表达

采用Q-PCR实验检测CPO(1mg/mL)对HEK293T细胞中促红细胞生成素和缺氧诱导因子-1α的mRNA表达的影响。将矿物油覆盖到HEK293T细胞上面造成低氧环境，作为阳性对照。CPO对HEK293T细胞中促红细胞生成素mRNA表达的影响如图1所示。CPO对HEK293T细胞中缺氧诱导因子-1αmRNA表达的影响如图2所示。

采用Trizol试剂提取HEK293T细胞中的总mRNA，使用EPO和HIF-1αmRNA的特异性引物进行实时定量PCR分析，以空白对照组的mRNA表达量作为对照。加入矿物油在培养物顶部分层(以阻止气体交换以模仿缺氧)，作为EPO诱导的阳性对照，使EPO mRNA的水平增加了9.03倍。党参低聚糖提取物也将EPO mRNA增加6.57倍。

3.HIF-1α的蛋白表达

如图3所示，Western blot实验结果表明，党参低聚糖可以增加HEK293T细胞HIF-1α蛋白的表达。HIF-1的蛋白质水平在处理后2小时开始积累，此后又进一步增加：矿物油作为阳性对照也可以提高培养物中HIF-1蛋白的水平。

实施例3：

对缺铁性贫血小鼠的抗贫血作用：

将初断乳雌性Wista大鼠在实验环境下适应5d后，除正常对照组外，其余大鼠开始饲喂低铁饲料和去离子水，采用不锈钢笼和食罐，实验过程防止铁污染。自第2周开始，每3天对造模大鼠尾根静脉进行放血，放血量约1mL/次，造模28天，测定血常规和血清中促红细胞生成素含量和血细胞数。

实验结果表明，与正常对照组相比，模型对照组外周血红细胞数、血红蛋白、红细胞比容显著降低(P<0.05)，血小板数显著增加(P<0.05)。与模型组相比，党参低聚糖组(100mg/kg)外周血红细胞数、血红蛋白、红细胞压积显著增加(P<0.05)，血小板计数显著降低(P<0.05)。表1显示为党参低聚糖对缺铁性大鼠血常规的影响。

表1党参低聚糖对缺铁性大鼠血常规的影响

注：与正常组相比：^#P<0.05；与模型组想比：^*P<0.05。

与正常对照组相比，模型组中血清促红细胞生成素的含量显著升高(P<0.05)。与模型对照组相比，党参低聚糖组(100mg/kg)血清促红细胞生成素的含量显著降低(P<0.05)。

各组大鼠血清中促红细胞生成素含量如图4所示。

实施实例4：

对苯所致再生性障碍贫血的抗贫血作用：

雄性昆明小数适应性培养结束后，随机分为空白组，模型组和党参低聚糖组。党参低聚糖组：灌胃200mg/kg党参低聚糖；空白组和模型组:灌胃同体积的生理盐水(20mL/kg)；。每天给药1次,连续给药14d。造模组和党参低聚糖组每周三次于小鼠背侧皮下注射苯油混合液致小鼠再生障碍性贫血模型,每鼠皮下注射体积分数0.25的苯的玉米油溶液4mL/kg,空白组皮下注射同体积玉米油。实验结束后，评价党参低聚糖对再障小鼠血细胞的影响。

实验结果表明，与空白组比,模型组小鼠血红胞计数、白细胞计数、血小板数和血红蛋白水平均显性降低(P<0.05)。党参低聚糖(200mg/kg)给药后对再生障碍性贫血模型小鼠的血细胞有一定的改善作用。

表2.党参低聚糖对再生性障碍小鼠的血常规影响

注：与正常组相比：^#P<0.05,^##P<0.01；与模型组想比：^*P<0.05,^**P<0.01。

实施实例5：

对环磷酰胺所致的骨髓造血功能损伤的改善作用

雄性昆明小数适应性培养结束后，随机分为空白组，模型组和党参低聚糖组。党参低聚糖组：灌胃200mg/kg党参低聚糖；空白组和模型组:灌胃同体积的生理盐水(20mL/kg)；。每天给药1次,连续给药10d。从第10天开始，造模组和党参低聚糖腹腔注射环磷酰胺(80mg/kg)，连续3天。空白组注射生理盐水。实验结束后，评价党参低聚糖对环磷酰胺所致造血功能损伤小鼠的保护作用。

表3.党参低聚糖对再生性障碍小鼠的血常规影响

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.党参低聚糖在制备抗贫血药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述党参低聚糖在抗贫血药物中是做为促红细胞生成素调节剂使用的。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述党参低聚糖中包含有聚合度为1～10的由葡萄糖和果糖组成的低聚糖。

4.根据权利要求1-3所述的应用，其特征在于，所述党参低聚糖的制备方法，是党参进行醇提，收集药渣，将药渣进行水提后浓缩，将得到的浓缩液进行醇沉，收集上清液并减压浓缩，得到党参粗低聚糖RCPO，将党参粗低聚糖RCPO进行纯化，得到党参低聚糖CPO。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述党参低聚糖的制备方法，具体包括以下步骤：按照质量体积比将党参粗粉和10倍量95%乙醇混合，水浴90℃回流提取2次，每次1小时，收集药渣，分别在收集的药渣中加入药渣10倍、8倍、8倍量的水，沸水煎煮3次，每次45分钟，收集并合并水提液，50℃、60rpm将水提液减压浓缩至1/4体积，得浓缩液；在浓缩液中加乙醇至乙醇终浓度为80%进行醇沉，收集上清液；50℃,60rpm将上清液减压浓缩至挥干乙醇，得到党参粗低聚糖RCPO，将党参粗低聚糖RCPO进行Sephadex凝胶层析纯化，得到党参低聚糖CPO。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述党参粗低聚糖RCPO进行Sephadex凝胶层析纯化的具体方法，包括以下步骤：将党参粗低聚糖RCPO溶于水中，上规格为2.6×70cm的Sephadex G-25柱纯化，蒸馏水洗脱，洗脱流速为1mL/min，以苯酚硫酸法在490nm下测定吸光度，以试管号为横坐标，糖含量为纵坐标，作曲线，根据曲线合并洗脱液，50℃、60r/min减压浓缩至快干，用少量水从浓缩瓶中溶出后，置于-80℃冰箱中4h，冷冻干燥24h，即得到党参低聚糖CPO。

7.一种含有党参低聚糖的抗贫血药物，其特征在于，所述药物中的党参低聚糖是按照权利要求4-6的方法制备得到的。

8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物的给药方式为：口服给药、经鼻递药、皮下或肌肉注射、静脉注射或者静脉滴注。

9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为：丸剂、胶囊剂、片剂，糖浆、缓释制剂、控释制剂、注射制剂、栓剂、凝胶剂、微丸、微乳、口服液、喷剂。