CN110025622A - 一种党参寡糖的分离纯化方法及应用 - Google Patents

一种党参寡糖的分离纯化方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供党参寡糖的分离纯化方法及应用。本申请发明人通过实验发现，党参寡糖CPO在体内可以通过MAPK信号通路调节免疫活性，在体外也可以通过MAPK信号通路调节巨噬细胞免疫活性。

Description

一种党参寡糖的分离纯化方法及应用
技术领域
本发明涉及党参寡糖的分离纯化方法及应用。
背景技术
党参作为最受欢迎的传统中药之一，具有补中益气、健脾益肺的功效；糖类是党参中重要的组分，包括多糖、低聚糖和单糖；目前对党参糖类物质的结构及活性研究主要集中在党参多糖；党参自古以味甜者为“佳”。《百草镜》中记载“党参……总以净软壮实味甜者佳“。《药笼小品》中记载“西产为上，体糯味甜、嚼之少渣者佳”。目前研究较多的党参多糖是没有甜味的；党参的主要甜味来源单糖和低聚糖的研究甚少。那么“佳”仅仅指的是口感佳还是同时也指疗效佳呢？现有技术中并未记载。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明提供了党参寡糖的分离纯化方法及应用。本申请发明人提出假说：党参味甜者“佳”不仅仅指的是口感佳，同时也指疗效佳。且低聚糖应该具有免疫增强作用。
本申请提供党参寡糖的制备方法，将党参进行醇提，收集药渣，将药渣进行水提后浓缩，将得到的浓缩液进行醇沉，收集上清液并减压浓缩，得到党参粗寡糖RCPO，将党参粗寡糖RCPO进行纯化，得到党参寡糖。
作为优选，将党参粗粉和50-95％乙醇混合，回流提取2次，每次0.5-1小时，收集药渣，在收集的药渣中加入8-12倍重量的水，煎煮3次，每次30-60分钟，收集并合并水提液，将水提液减压浓缩至1/4-1/2体积，得浓缩液；在浓缩液中加乙醇至终浓度为50-80％进行醇沉，收集上清液；将上清液减压浓缩，得到RCPO，将RCPO进行Sephadex凝胶层析纯化，得到PCPO。
作为优选，所述将RCPO进行Sephadex凝胶层析纯化的具体方法为：将RCPO溶于水中，上Sephadex G-25纯化，蒸馏水洗脱，洗脱流速为1mL/min，以苯酚硫酸法在490nm下测定吸光度，以试管号为横坐标，糖含量为纵坐标，作曲线，根据曲线合并洗脱液，减压浓缩至快干，用少量水从浓缩瓶中溶出后，置于-80℃冰箱中4h，冷冻干燥24h即得。
本申请提供上述党参寡糖在制备体内免疫调节活性的制剂中的应用。
作为优选，党参寡糖在制备通过MAPK信号通路调节免疫活性的制剂中的应用。
本申请提供上述党参寡糖在制备体外免疫调节活性的制剂中的应用。
作为优选，党参寡糖在制备调节巨噬细胞免疫活性的制剂中的应用。
作为优选，党参寡糖在制备通过MAPK信号通路调节巨噬细胞免疫活性的制剂中的应用。
本申请发明人通过实验发现，党参寡糖CPO在体内可以通过MAPK信号通路调节免疫活性，也可以通过MAPK信号通路调节巨噬细胞免疫活性。可以用来制备相应的制剂。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为党参寡糖的提取分离方法。
图2为党参寡糖的结构解析。
图3为党参寡糖体外抗氧化活性初探。
图4为党参寡糖PCPO的体内免疫调节活性实验结果。
图5为党参寡糖PCPO对巨噬细胞RAW264.7细胞免疫调节活性实验结果。
图6为党参寡糖PCPO调节巨噬细胞免疫活性的机制。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本申请发明人从党参主产地采集药典中规定的三个党参品种共40批：党参(其中甘肃省产区10批、山西长治地区10批)、素花党参(甘肃文县产区10批)、川党参(四川省天宁地区10批)，通过测定不同品种和不同产区党参的多糖和粗寡糖的得率可知，各地党参粗寡糖(RCPO)的含量在13.83-33.92g/100g范围之间，说明寡糖部分也是党参中的重要组分。比较同一产地的党参不同提取物的体外抗氧化活性可知(图3)，在0.00-5.00mg/mL浓度范围内，在药典规定的三个品种党参中的各提取物的DPPH自由基清除活性强弱依次是：党参粗寡糖(RCPO)>党参水提取物(CPWE)>党参多糖(CPP)，即在不同品种党参的各提取物中，党参粗寡糖(RCPO)的体外抗氧化活性最强。
其中，党参寡糖的提取分离方法为：
将党参粗粉和50-95％乙醇混合，回流提取2次，每次0.5-1小时，分别收集滤液和药渣，将滤液减压浓缩，得到党参醇提取物(CPEE)；在收集的药渣中加入8-12倍重量的水，煎煮3次，每次30-60分钟，收集并合并水提液，将水提液减压浓缩至1/4-1/2体积，得浓缩液；将浓缩液分为两部分，一部分浓缩液再次减压浓缩，得到党参水提取物(CPWE)；另一部分浓缩液加乙醇至体积终浓度为50-80％进行醇沉，将沉淀冷冻干燥，得到党参多糖(CPP)；将上清液减压浓缩，得到粗党参低聚糖(RCPO)。
将粗党参低聚糖RCPO进行Sephadex凝胶层析纯化，纯化条件为：取适量RCPO溶于少量水中，上2.6×70cm的Sephadex G-25纯化，蒸馏水洗脱，洗脱流速为1mL/min，每管收集5mL；以苯酚硫酸法在490nm下测定吸光度，以试管号为横坐标，糖含量为纵坐标，作曲线，根据曲线合并洗脱液，50℃、60r/min减压浓缩至快干，用少量水从浓缩瓶中溶出后，置于-80℃冰箱中4h，冷冻干燥24h后即得到精制党参低聚糖，标记为PCPO，得率为40-87.3％。
实施例1
本申请发明人从党参主产地采集药典中规定的三个党参品种共40批：党参(其中甘肃省产区10批、山西长治地区10批)、素花党参(甘肃文县产区10批)、川党参(四川省天宁地区10批)，通过测定不同品种和不同产区党参的多糖和粗寡糖的得率可知，各地党参粗寡糖(RCPO)的含量在13.83-33.92g/100g范围之间，说明寡糖部分也是党参中的重要组分。比较同一产地的党参不同提取物的体外抗氧化活性可知(图3)，在0.00-5.00mg/mL浓度范围内，在药典规定的三个品种党参中的各提取物的DPPH自由基清除活性强弱依次是：党参粗寡糖(RCPO)>党参水提取物(CPWE)>党参多糖(CPP)，即在不同品种党参的各提取物中，党参粗寡糖(RCPO)的体外抗氧化活性最强。
其中，党参寡糖的提取分离方法为：
将党参粗粉和95％乙醇混合，回流提取2次，每次1小时，分别收集滤液和药渣，将滤液减压浓缩，得到党参醇提取物(CPEE)；在收集的药渣中加入10倍重量的水，煎煮3次，每次45分钟，收集并合并水提液，将水提液减压浓缩至1/4体积，得浓缩液；将浓缩液分为两部分，一部分浓缩液再次减压浓缩，得到党参水提取物(CPWE)；另一部分浓缩液加乙醇至体积终浓度为80％进行醇沉，将沉淀冷冻干燥，得到党参多糖(CPP)；将上清液减压浓缩，得到粗党参低聚糖(RCPO)。
将粗党参低聚糖RCPO进行Sephadex凝胶层析纯化，纯化条件为：取适量粗党参低聚糖RCPO溶于少量水中，上2.6×70cm的Sephadex G-25纯化，蒸馏水洗脱，洗脱流速为1mL/min，每管收集5mL；以苯酚硫酸法在490nm下测定吸光度，以试管号为横坐标，糖含量为纵坐标，作曲线(图2A)，根据曲线合并洗脱液，50℃、60r/min减压浓缩至快干，用少量水从浓缩瓶中溶出后，置于-80℃冰箱中4h，冷冻干燥24h后即得到精制党参低聚糖，标记为PCPO，得率为87.3％。
根据GC-MS，IR，ESI-MS，NMR等手段分析PCPO的结构。实验结果表明，三甲基硅醚衍生化法结合GC-MS可知，PCPO的单糖组成为葡萄糖和果糖(图2B)，ESI-MS实验结果表明PCPO主要是由单糖、二糖、三糖、四糖组成的混合物(图2C)，IR实验结果表明PCPO含有糖类化合物的特征吸收(图2D)，甲基化实验结合NMR实验结果表明PCPO的糖链的连接方式为terminal-α-D-Glcp,terminal-β-D-Fruf和→2)-β-D-Fruf-(1→(图2E,F,G,H)。
图1为党参寡糖的提取分离方法。
图2为党参寡糖的结构研究。
图3为党参寡糖体外抗氧化活性初探。
一、党参寡糖(PCPO)的体内免疫活性研究
为了评价党参寡糖的体内免疫调节活性，本申请发明人检测了党参寡糖对环磷酰胺(CTX)诱导的免疫低下小鼠的免疫调节活性。昆明小鼠随机分为6个组，提供12h昼夜循环及常温环境，保证充足的饲料及饮用水，适应性培养7天后，空白对照组和模型组每天灌胃生理盐水，阳性对照组灌胃胸腺肽(10mg/kg)，PCPO组分别灌胃高(150mg/kg)、中(100mg/kg)、低剂量(50mg/kg)的上述提取分离的党参寡糖，连续灌胃15天。第16-18天，所有小鼠(除了空白对照组的正常小鼠)腹腔注射免疫抑制剂CTX(40mg/kg)，第19天处死小鼠，进行脏器指数、脾淋巴细胞增殖活性、吞噬指数、迟发型变态反应、细胞因子测定和蛋白表达测定等实验，实验结果见图4。
图4为党参寡糖PCPO的体内免疫调节活性实验结果。
由图4的体内免疫实验结果可知，PCPO(50、100、150mg/kg/d)可显著提高环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠的吞噬指数(图4A)、增强小鼠的迟发型变态反应程度(图4B)；对抗环磷酰胺所致的小鼠胸腺指数、脾脏指数以及脾淋巴细胞增殖转化能力的降低(图4C,4D)；显著提高细胞因子(IL-2和IFN-γ)和NO的分泌水平以及血清免疫球蛋白的含量(图4E,4F,4G,4I)，根据蛋白表达含量初步推测PCPO在体内可以通过MAPK信号通路调节免疫活性。
二、党参寡糖(PCPO)对巨噬细胞RAW264.7细胞免疫调节活性的影响
为了研究党参寡糖(PCPO)对巨噬细胞RAW264.7细胞免疫调节活性的影响，本申请发明人进行了下述实验，实验过程为：
采用MTT实验检测PCPO对RAW264.7细胞增殖作用的影响。调整对数生长期的RAW264.7细胞浓度为10×104个/ml，接种于96孔培养板内，每孔100μL。细胞贴壁后，加入100μL用培养基配制的各梯度浓度的PCPO(2.5，5.0，7.5和10mg/mL)。于培养箱中培养24h后，每孔加入5mg/mL的MTT 10μL，继续培养4h后，小心吸去上清液后，每孔加入100μL DMSO，振荡后，用酶标仪于570nm处测吸光度(A)。
采用传统的中性红实验方法检测PCPO对RAW264.7细胞吞噬作用的影响。取对数生长期的RAW264.7细胞以50×104个/ml细胞浓度接种到96孔板上，每孔100ul，待细胞贴壁后，加入100ul不同浓度的PCPO(2.5，5.0，7.5和10mg/mL)和LPS(10ug/ml)，对照组中加空白培养基，培养24h，加入0.075％的中性红生理盐水溶液(100ul/孔)，放入培养箱中继续培养2h，培养结束后吸弃上清液，加入PBS洗涤4次，加入细胞裂解液(冰乙酸：乙醇＝1:1，V/V)，裂解2h，在570nm下测定吸光度。吞噬率％＝A/B×100％，其中A和B分别为给药组和对照组的吸光度值。
采用Griess试剂测定PCPO对RAW264.7细胞NO释放量的影响。取对数生长期的RAW264.7细胞以50×104个/ml细胞浓度接种到24孔板上，每孔500ul，待细胞贴壁后，加入100ul不同浓度的PCPO(2.5，5.0，7.5和10mg/mL)和LPS(10ug/ml)，对照组中加空白培养基，培养24h，取上清液加入NO反应试剂盒中，560nm处测定吸光度。
PCPO对RAW264.7细胞的细胞因子TNF-α,IL-6释放量的影响采用ELISA试剂盒检测。取对数生长期的RAW264.7细胞以50×104个/ml细胞浓度接种到24孔板上，每孔500ul，待细胞贴壁后，加入100ul不同浓度的PCPO(2.5，5.0，7.5和10mg/mL)和LPS(10ug/ml)，对照组中加空白培养基，培养24h，取上清液按照试剂盒要求测定细胞因子含量。
为了Western blot实验分析，细胞总蛋白通过在冰上加入含有PSMF和混合磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液来提取，蛋白浓度采用BCA试剂盒(索莱宝)按照说明书上的方法测定。对等量的蛋白质通过10％的SDS-PAGE分离胶分离。电泳后，将蛋白质电子转移到甲醇活化后的PVDF膜上，然后将膜在室温下用5％脱脂奶粉封闭2h，放入不同的抗体(p48,Erk1/2,JNK)中4℃孵育过夜，洗涤膜后，在室温下用辣根过氧化物酶缀合的二抗孵育1小时。膜最后用ECL显色剂显色。使用image J软件对条带进行分析。
通过检测党参寡糖PCPO对巨噬细胞RAW264.7细胞活力、吞噬作用、NO释放量、细胞因子释放和蛋白表达的影响评价党参寡糖PCPO的体外免疫调节活性。实验结果见图4。
图5为党参寡糖PCPO对巨噬细胞RAW265.7细胞免疫调节活性实验结果。
实验结果表明，PCPO(2.5-10mg/ml)对RAW265.7细胞没有任何毒性作用，可以刺激RAW265.7细胞增殖(图5A)，增强RAW265.7细胞的吞噬作用(图5B)；增加NO、IL-6和TNF-α等细胞因子分泌量(图5C,5D,5E)；下调P58,JNK和ERK1/2蛋白表达(图5F)。因此证实PCPO可以通过MAPK信号通路调节巨噬细胞免疫活性。
图6为党参寡糖PCPO调节巨噬细胞免疫活性的机制。
实施例2
党参寡糖的提取分离方法为：
将党参粗粉和50％乙醇混合，回流提取2次，每次0.5小时，分别收集滤液和药渣，将滤液减压浓缩，得到党参醇提取物(CPEE)；在收集的药渣中加入12倍重量的水，煎煮3次，每次60分钟，收集并合并水提液，将水提液减压浓缩至1/2体积，得浓缩液；将浓缩液分为两部分，一部分浓缩液再次减压浓缩，得到党参水提取物(CPWE)；另一部分浓缩液加乙醇至体积终浓度为80％进行醇沉，将沉淀冷冻干燥，得到党参多糖(CPP)；将上清液减压浓缩并和党参醇提取物合并，得到粗党参低聚糖(RCPO)。
将粗党参低聚糖RCPO进行Sephadex凝胶层析纯化，纯化条件与实施例1一致，得到精制党参低聚糖，标记为PCPO，得率为40％。
实施例3
党参寡糖的提取分离方法为：
将党参粗粉和95％乙醇混合，回流提取2次，每次1小时，分别收集滤液和药渣，将滤液减压浓缩，得到党参醇提取物(CPEE)；在收集的药渣中加入8倍重量的水，煎煮3次，每次30分钟，收集并合并水提液，将水提液减压浓缩至1/4体积，得浓缩液；将浓缩液分为两部分，一部分浓缩液再次减压浓缩，得到党参水提取物(CPWE)；另一部分浓缩液加乙醇至体积终浓度为80％进行醇沉，将沉淀冷冻干燥，得到党参多糖(CPP)；将上清液减压浓缩，得到粗党参低聚糖(RCPO)。
将粗党参低聚糖RCPO进行Sephadex凝胶层析纯化，纯化条件与实施例1一致，得到精制党参低聚糖，标记为PCPO，得率为87％。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.党参寡糖的制备方法，其特征在于：将党参进行醇提，收集药渣，将药渣进行水提后浓缩，将得到的浓缩液进行醇沉，收集上清液并减压浓缩，得到党参粗寡糖RCPO，将党参粗寡糖RCPO进行纯化，得到党参寡糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将党参粗粉和50-95％乙醇混合，回流提取2次，每次0.5-1小时，收集药渣，在收集的药渣中加入8-12倍重量的水，煎煮3次，每次30-60分钟，收集并合并水提液，将水提液减压浓缩至1/4-1/2体积，得浓缩液；在浓缩液中加乙醇至终浓度为50-80％进行醇沉，收集上清液；将上清液减压浓缩，得到RCPO，将RCPO进行Sephadex凝胶层析纯化，得到PCPO。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述将RCPO进行Sephadex凝胶层析纯化的具体方法为：将RCPO溶于水中，上Sephadex G-25纯化，蒸馏水洗脱，洗脱流速为1mL/min，以苯酚硫酸法在490nm下测定吸光度，以试管号为横坐标，糖含量为纵坐标，作曲线，根据曲线合并洗脱液，减压浓缩至快干，用少量水从浓缩瓶中溶出后，置于-80℃冰箱中4h，冷冻干燥24h即得。
4.权利要求1-3任一项所述的党参寡糖在制备体内免疫调节活性的制剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：党参寡糖在制备通过MAPK信号通路调节免疫活性的制剂中的应用。
6.权利要求1-3任一项所述的党参寡糖在制备体外免疫调节活性的制剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：党参寡糖在制备调节巨噬细胞免疫活性的制剂中的应用。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：党参寡糖在制备通过MAPK信号通路调节巨噬细胞免疫活性的制剂中的应用。
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