CN112876576A - 一种山药皮多糖及其制备方法与应用 - Google Patents

一种山药皮多糖及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种山药皮多糖及其制备方法与应用。本发明山药皮多糖的制备方法，包括如下步骤：(1)对山药皮进行酸提，收集酸提液；(2)将所述酸提液中和后进行醇沉，收集沉淀，干燥，得到山药皮多糖。本发明方法采用酸提取获得山药皮多糖，相比与水提法和酶提法，所得山药皮多糖粗糖的得率高；采用脱蛋白和透析的方法对所得粗多糖进一步纯化，所得山药皮多糖的纯度高；且经试验证明，本发明山药皮多糖具有更高的抗氧化活性和降血糖活性。

Description

一种山药皮多糖及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于植物多糖的提取方法，尤其涉及一种山药皮多糖及其制备方法与应用。
背景技术
怀山药(Dioscorea opposita Thunb)为薯蓣科多年生植物薯蓣的根状茎，是河南省著名的“四大怀药”之一，铁棍山药又为怀山药中的精品。山药加工生产过程中会产生大量的废料——山药皮，通常被当作饲料或者废弃物直接丢弃，造成环境污染的同时，也造成资源浪费。研究表明，山药皮中同样含有大量的活性成分，且其药理活性甚至高于山药肉中活性成分的药理活性，但其相关的研究相对薄弱。
发明内容
本发明的目的是提供一种山药皮多糖及其制备方法与应用；本发明采用酸提获得山药皮多糖，相比与水提法和酶提法，所得山药皮多糖的得率和纯度高，且具有抗氧化活性和降血糖活性。
本发明提供的一种山药皮多糖的制备方法，包括如下步骤：(1)对山药皮进行酸提，收集酸提液；(2)将所述酸提液中和后进行醇沉，收集沉淀，干燥，得到山药皮多糖。
上述的制备方法，步骤(1)中，所述山药皮与酸性试剂的质量体积比可为1g：(15～30)mL，具体可为1g：20mL；
所述酸性试剂的浓度为0.05～0.15mol/L，具体可为0.1mol/L；
所述酸性试剂可为盐酸、柠檬酸或乙酸。
上述的制备方法，步骤(1)中，所述酸提的温度可为75～95℃，具体可为80℃；时间可为1.5～6小时，具体可为3小时；提取次数可为1～3次，具体可为2次。
上述的制备方法，步骤(2)中，所述醇沉步骤中，醇沉体系中(即将所述酸提液中和后加入乙醇后得到的混合液中)乙醇的体积分数为65％～85％，具体可为70％。
所述醇沉的温度可为4～25℃，具体可为4℃；时间可为2～12小时，具体可为12小时。
上述的制备方法中，所述方法在步骤(2)中所述干燥后还可包括将干燥得到的粗糖溶于水中制成粗糖溶液，并将所述粗糖溶液旋蒸除去乙醇后进行脱蛋白处理的步骤。
所述脱蛋白处理可采用Sevage法。
所述粗糖与水的比例可为40～75mg:1mL，具体可为50mg：1mL。
上述的制备方法中，所述方法在所述脱蛋白处理后还可包括采用截留分子量为2000～50000Da的透析袋对所述脱蛋白处理后的粗糖溶液进行透析，收集截留液，干燥的步骤。
所述透析袋的截留分子量为2000～50000Da是指所述透析袋的截留分子量为2000～50000Da范围内任一截留分子量或该范围内任一范围的截留分子量，具体可为2000～20000Da、2000～10000Da、3500～20000Da、3500～10000Da、3500～8000Da、3500～7000Da、3500～5000Da、2000Da、3500Da、5000Da、7000Da或8000～10000Da、8000Da。
上述的制备方法中，所述透析的温度可为15～25℃，如25℃；时间为先在流动水中透析12～48小时(如24小时)，然后在蒸馏水中透析12～48小时(如48小时)，每4～8小时(如8小时)换一次水。
上述的制备方法中，所述干燥可为冻干。
本发明进一步提供了上述的制备方法制备得到的山药皮多糖。
本发明还提供了上述山药皮多糖在制备具有下述A1)-A3)中至少一种功能的产品中的应用：
A1)抗氧化；
A2)清除DPPH自由基；
A3)清除ABTS自由基。
本发明还提供了上述山药皮多糖在制备具有下述B1)-B3)中至少一种功能的产品中的应用：
B1)降血糖；
B2)抑制α-淀粉酶活性；
B3)抑制α-葡萄糖苷酶活性。
本发明具有如下有益效果：
本发明方法采用酸提获得山药皮多糖，相比与水提法和酶提法，所得山药皮多糖粗糖的得率高；采用脱蛋白和透析的方法对所得粗多糖进一步纯化，所得山药皮多糖的纯度高；经试验证明，本发明山药皮多糖具有更高的抗氧化活性和降血糖活性。
附图说明
图1为实施例1中酸提法获得山药皮多糖的照片。
图2为对比例1水提法获得的山药皮多糖的照片。
图3为对比例2酶提法获得的山药皮多糖的照片。
图4为实施例1、对比例1和对比例2获得的山药皮多糖在不同浓度下的DPPH自由基清除率曲线。
图5为实施例1、对比例1和对比例2获得的山药皮多糖在不同浓度下的ABTS自由基清除率曲线。
图6为还原力的测试中，实施例1、对比例1和对比例2获得的山药皮多糖在不同浓度下的吸光度曲线。
图7为实施例1、对比例1和对比例2获得的山药皮多糖在不同浓度下对α淀粉酶的抑制率曲线。
图8为实施例1、对比例1和对比例2获得的山药皮多糖在不同浓度下对α葡萄糖苷酶的抑制率曲线。
具体实施方式
本发明实施例中提供的山药皮多糖的制备方法，包括如下步骤：(1)对山药皮进行酸提，收集酸提液；(2)将酸提液中和后进行醇沉，收集沉淀，干燥，得到山药皮多糖。采用酸提获得山药皮多糖，所得山药皮多糖粗糖的得率可达15.9％，而水提和酶提所得粗糖得率仅为4.8％和9.6％。采用脱蛋白和透析的方法对所得粗多糖进一步纯化，所得山药皮多糖的纯度高，酸提所得山药皮多糖中总糖的含量可达85.1％，而水提和酶提仅分别为46.4％和58.3％。对山药皮多糖的抗氧化活性或降血糖活性做进一步检测发现，酸提获得的山药皮多糖的活性更高。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的山药皮均来自怀山药道地产区焦作武陟垆土铁棍山药。
透析袋购自上海源叶生物科技有限公司，产品名称为普通型透析袋(3500Da)，产品型号为MD3534-5m。
实施例1、酸提取法制备山药皮多糖
用酸提取法制备山药皮多糖，具体步骤如下：
(1)酸提法：取山药皮粉10g，按料液比1g:20mL加入0.1M HCl溶液，80℃水浴提取3小时，提取2次，在4000r/min下离心15min，收集上清液，得到酸提液。
(2)醇沉：将酸提液用0.1mol/L NaOH中和至pH＝7，用旋转蒸发仪，将中和后的上清液浓缩至起始体积的1/3左右。向上清浓缩液中加入无水乙醇至终浓度为70％(v/v)为止，于4℃下放置过夜(12小时)，离心，收集沉淀，冻干，得到粗多糖。
(3)脱蛋白：将步骤(3)得到粗多糖溶于蒸馏水(50mg:1mL(w/v))中，得到粗多糖溶液；将上述粗糖溶液旋蒸去除乙醇后，采用Sevage法(氯仿:正丁醇＝4:1，v/v)脱蛋白：按粗糖溶液与Sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4:1)体积比为5:1的比例，磁力搅拌(800r/min)30分钟，4000rpm离心15分钟后，取上层溶液，重复以上步骤6次，至两相界面处的蛋白质接近没有为止，最终将收集到的上层溶液经旋蒸，去除有机试剂。
(4)透析：采用截留分子量为3500Da的透析袋对上述脱蛋白处理后的粗糖溶液进行透析(流动水透析24h，室温25℃，蒸馏水透析48h，8h换一次蒸馏水)、收集截留液(袋内溶液)，浓缩、冻干，得到山药皮多糖。酸提法获得的山药皮多糖的照片见图1。
计算粗多糖得率并测定所得山药皮多糖中各成分的含量，结果如表1所示。
粗多糖含量的计算公式如下：酸提醇沉干燥获得的质量/山药皮粉质量×100％；
总糖含量的测定方法如下：
标准曲线的制备：将105℃干燥至恒重的葡萄糖配成浓度梯度为(0，0.02mg/mL，0.04mg/mL，0.08mg/mL，0.12mg/mL，0.16mg/mL，0.2mg/mL)的溶液。各精确移取1mL于试管中，加入1mL苯酚溶液，迅速滴加5mL的浓硫酸，摇匀后，至沸水浴中煮沸10min，取出以冷水浴冷却至室温，在490nm测定吸光度，以浓度吸光度建立标曲。
样品测定：精确吸取1mL 1mg/mL样品溶液，根据上述方法测定吸光度，再根据标准曲线方程计算出样品中总糖含量。
糖醛酸含量测定方法如下：
标准曲线的制备：将70℃干燥至恒重的半乳糖醛酸配成浓度梯度为(0，0.01mg/mL，0.02mg/mL，0.04mg/mL，0.06mg/mL，0.08mg/mL，0.12mg/mL，0.3mg/mL，0.5mg/mL，0.7mg/mL)的溶液。浓度梯度溶液在冰浴中预冷后，各精确移取0.3mL于10mL试管中，缓慢加入3mL硼砂-硫酸溶液(称取0.477g硼砂(四硼酸钠)加入浓硫酸100mL，超声溶解)，摇匀后，至沸水浴中煮沸25min，冷却至室温后，取出以冰浴冷却至室温，分别加入0.15％间羟联苯溶液80μL，摇匀室温放置40min，在525nm测定吸光度，以浓度吸光度建立标曲。
样品测定：精确吸取0.3mL 1mg/mL样品溶液，根据上述方法测定吸光度，再根据标准曲线方程计算出样品中糖醛酸含量。
蛋白质含量的测定方法如下：
标准曲线的制备：用移液枪分别吸取0.2mL标准溶液0、0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.06mg/ml、0.08mg/ml、0.10mg/ml的牛血清蛋白(BSA)溶液于2mL离心管中，再分别加入0.8mL的考马斯亮蓝(CBB)(100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95％乙醇，加入100mL85％的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000mL)。静置10min后，用酶标仪测595nm波长下的这组BSA溶液的吸光度，绘制标准曲线，并求得方程式。
样品测定：精确吸取0.2mL 1mg/mL样品溶液，根据上述方法测定吸光度，再根据标准曲线方程计算出样品中蛋白含量。
多酚含量的测定方法如下：
标准曲线的制备：用移液枪分别从标准溶液0、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的没食子酸溶液中吸取1mL，分别加去离子水5mL、福林酚试剂1mL，7.5％Na2CO3溶液3.5mL，室温静置2小时后，在765nm波长下测定系列标准溶液的吸光度，绘制标准曲线，并求得方程式。
样品测定：吸取1mL 1mg/mL样品溶液，根据上述方法测定吸光度，再根据标准曲线方程计算出样品中总多酚的浓度。
对比例1、水提法制备山药皮多糖
用水提法制备山药皮多糖，具体步骤如下：
(1)水提法：取山药皮粉10g，按料液比1g:20mL加入蒸馏水，80℃水浴提取3小时，提取2次，然后在4000r/min下离心15min，收集上清液，得到水提液。
(2)醇沉：利用旋转蒸发仪浓缩上清液，并向浓缩液中加入无水乙醇至终体积分数为70％(v/v)为止，于4℃下放置过夜(12小时)，离心，收集沉淀，冻干，得到粗多糖。
步骤(3)-步骤(4)同实施例1，得到水提山药皮多糖。水提法获得的山药皮多糖的照片见图2。
计算粗糖得率并测定所得山药皮多糖中各成分的含量，结果如表1所示。测定方法同实施例1。
对比例2、酶提法制备山药皮多糖
用酶提法制备山药皮多糖，具体步骤如下：
(1)酶提法：取山药皮粉10g，按料液比1g:20mL加入蒸馏水，α-淀粉酶和蛋白酶的加入量分别为水溶液的1％(质量比)(pH＝6.0)，50℃水浴80min进行提取，然后迅速升温至100℃，持续30min，使酶失活，冷却后在4000r/min下离心15min，收集上清液，得到酶提液。
(2)醇沉：利用旋转蒸发仪对酶提液进行浓缩，至体积为原来的1/4为止，之后向浓缩液中加入无水乙醇至终浓度为70％(v/v)为止，于4℃下放置过夜(12小时)，离心，收集沉淀，冻干，得到粗多糖。
步骤(3)-步骤(4)同实施例1，得到酶提山药皮多糖。酶提法获得的山药皮多糖的照片见图3。
计算粗多糖得率并测定所得山药皮多糖中各成分的含量，结果如表1所示。测定方法同实施例1。
表1、不同提取方法获得的粗多糖得率及山药皮多糖中各成分含量
提取方法 水提 酸提 酶提
粗多糖％(醇沉) 4.8 15.9 9.6
总糖含量％ 46.4 85.1 58.3
糖醛酸含量％ 13.2 12.1 6.4
蛋白含量％ 3.7 0.4 0.3
多酚含量％ 1.1 0.4 0.3
实施例2、山药皮多糖的活性
一、抗氧化活性
1、DPPH自由基清除能力
取不同浓度(0.05、0.1、0.5、1、2、4、6、8、10mg/mL)的多糖待测液各0.5mL，加入0.4mM的DPPH溶液0.5mL，摇匀，室温避光静置30min，以蒸馏水代替样品溶液作为空白，测定其在517nm处的吸光度，以Vc为对照品。按下式计算各个样品对DPPH自由基的清除率。
DPPH自由基清除率(％)＝[A0-(Ax-Ax0)]/A0*100％
式中：A0：蒸馏水+DPPH溶液的吸光值；
Ax：多糖样品液+DPPH溶液的吸光值；
Ax0：多糖样品液+无水乙醇(与DPPH溶液体积相同)的吸光值。
采用上述方法对实施例1及对比例1、对比例2制备得到的山药皮多糖的DPPH自由基清除能力进行测定，实验结果如图4所示。
2、ABTS自由基清除能力
将ABTS溶液用无水乙醇调至在734nm处吸光度为0.70±0.05。将0.2mL不同浓度(0.05、0.1、0.5、1、2、4、6、8、10mg/mL)的样品与1.2mL ABTS溶液混合。室温反应10min；在734nm处测定吸光度。采用Vc作为阳性对照。用下列公式计算ABTS自由基清除率。
ABTS自由基清除率(％)＝[A0-(Ax-Ax0)]/A0*100％
式中：A0：蒸馏水+ABTS溶液的吸光值；
Ax：多糖样品液+ABTS溶液的吸光值；
Ax0：多糖样品液+无水乙醇(与ABTS溶液体积相同)的吸光值。
采用上述方法对实施例1及对比例1、对比例2制备得到的山药皮多糖的ABTS自由基清除能力进行测定，实验结果如图5所示。
3、还原力测试
精密量取0.2mL不同浓度(0.05、0.1、0.5、1、2、4、6、8、10mg/mL)的多糖样品液至试管中，加入0.5mL磷酸盐缓冲液(0.2mol/L，pH6.8)，0.1mL铁氰化钾溶液(1.0％)，混合均匀后置于50℃恒温水浴中保温20min，冷却后加入0.5mL三氯乙酸溶液(10％)，混合均匀，于4000r/min离心10min，吸取上清液0.5mL于另一试管中，加入0.5mL蒸馏水和0.1mL三氯化铁溶液(0.1％)，混匀后静置10min，以同浓度的Vc为对照品于700nm处测定吸光度值，吸光度值越大，表明其还原能力越强。
采用上述方法对实施例1及对比例1、对比例2制备得到的山药皮多糖于700nm处测定吸光度值，实验结果如图6所示。
二、降血糖活性
1、α-淀粉酶抑制活性
不同浓度(0.1,0.5,1,2,4,6,8,10mg/mL)的多糖溶液100μL，分别加入磷酸盐缓冲液(0.1mol/L,pH＝6.8)200μL，α-淀粉酶溶液(20U/mL)100μL，混合液在37℃条件下恒温水浴10min，加入2％淀粉溶液100μL，37℃反应5min，加入DNS试剂100μL置于沸水浴中反应5min，冷水浴迅速冷却，再精确吸取100μL用蒸馏水稀释至1.5mL，在540nm波长下测定吸收度，阿卡波糖作为对照。公式如下：
α-淀粉酶抑制率(％)＝(1-(Ax-Ax0)/A0)×100％
式中：A0:表示没有多糖的混合物的吸光度
Ax:表示多糖的吸光度
Ax0:表示混合物(不加酶)的吸光度。
采用上述方法对实施例1及对比例1、对比例2制备得到的山药皮多糖对α-淀粉酶抑制活性进行测定，实验结果如图7所示。
2、α-葡萄糖苷酶抑制活性
不同浓度(0.1,0.5,1,2,4,6,8,10mg/mL)的多糖溶液200μL，分别加入磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH＝6.8)200μL，α-糖苷酶(0.2U/mL)80μL，混合液在37℃条件下恒温水浴15min。然后加入120μL 4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)，在37℃下恒温水浴20min。添加400μL Na2CO3溶液(0.2mol/L)终止该酶反应，在405nm条件下检测吸光度，阿卡波糖作为对照。公式如下：
α-葡萄糖苷酶抑制率(％)＝(1-(Ax-Ax0)/A0)×100％
式中：A0:表示没有多糖的混合物的吸光度
Ax:表示多糖的吸光度
Ax0:表示混合物(不加酶)的吸光度。
采用上述方法对实施例1及对比例1、对比例2制备得到的山药皮多糖对α-葡萄糖苷酶抑制活性进行测定，实验结果如图8所示。

Claims (10)

1.一种山药皮多糖的制备方法，包括如下步骤：(1)对山药皮进行酸提，收集酸提液；(2)将所述酸提液中和后进行醇沉，收集沉淀，干燥，得到山药皮多糖。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述山药皮与酸性试剂的质量体积比为1g:(15～30)mL；
所述酸性试剂的浓度为0.05～0.15mol/L；
所述酸性试剂为盐酸、柠檬酸或乙酸。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述酸提的温度为75～95℃，时间为1.5～6小时；提取次数为1～3次。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述醇沉步骤中，醇沉体系中的乙醇的体积分数为65％～85％；
所述醇沉的温度为4～25℃，时间为2～12小时。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述方法在步骤(2)中所述干燥后还包括将干燥得到的粗糖溶于水中制成粗糖溶液，并将所述粗糖溶液旋蒸除去乙醇后进行脱蛋白处理的步骤；和/或，
所述脱蛋白处理采用Sevage法。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述方法在所述脱蛋白处理后还包括采用截留分子量为2000～50000Da的透析袋对所述脱蛋白处理后的粗糖溶液进行透析，收集截留液，干燥的步骤。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述透析的温度为15～25℃，时间为先在流动水中透析12～48小时，然后在蒸馏水中透析12～48小时，每4～8小时换一次水。
8.权利要求1-7中任一项所述的制备方法制备得到的山药皮多糖。
9.权利要求8所述的山药皮多糖在制备具有下述A1)-A3)中至少一种功能的产品中的应用：
A1)抗氧化；
A2)清除DPPH自由基；
A3)清除ABTS自由基。
10.权利要求8所述的山药皮多糖在制备具有下述B1)-B3)中至少一种功能的产品中的应用：
B1)降血糖；
B2)抑制α-淀粉酶活性；
B3)抑制α-葡萄糖苷酶活性。
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