WO2005052152A1 - マクロライド系化合物の水酸化に関与するｄｎａ - Google Patents

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WO2005052152A1
WO2005052152A1 PCT/JP2004/017906 JP2004017906W WO2005052152A1 WO 2005052152 A1 WO2005052152 A1 WO 2005052152A1 JP 2004017906 W JP2004017906 W JP 2004017906W WO 2005052152 A1 WO2005052152 A1 WO 2005052152A1
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hydrogen atom
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Kazuhiro Machida
Takashi Nakashima
Yasuhide Aritoku
Toshio Tsuchida
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Mercian Corporation
Eisai Co., Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/08—Oxygen as only ring hetero atoms containing a hetero ring of at least seven ring members, e.g. zearalenone, macrolide aglycons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)

Definitions

  • the present invention relates to a DNA involved in hydroxylation of a macrolide compound, a method for isolating the same, a protein encoded by the DNA, a plasmid carrying the DNA, a transformant transformed with the plasmid, and The present invention also relates to a method for producing a 16-hydroxylated oxalate compound using the transformant.
  • Conventional technology relates to a DNA involved in hydroxylation of a macrolide compound, a method for isolating the same, a protein encoded by the DNA, a plasmid carrying the DNA, a transformant transformed with the plasmid.
  • 11-membered macrolide compound 11107D represented by 11 orchid (ii) is a 12-membered macrolide compound having excellent antitumor activity and is represented by the formula (I)
  • Macrolide compound 11107D is equivalent to the hydroxylated compound at position 16 of macrolide compound 11107B, but its productivity is lower than that of macrolide compound 11107B, and it is hoped that an efficient production method will be established. Had been rare. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to find DNA involved in hydroxylation of macrolide compound 11107B, and to provide a novel method for producing macrolide compound 11107D.
  • the present invention relates to the following [1] to [15].
  • Macrolide compound 11107B (i) Macrolide compound (hereinafter referred to as macrolide compound 11107B)
  • macrolide compound 16-hydroxylated macrolide compound (hereinafter referred to as macrolide compound)
  • (c) does not hybridize with the DNA shown in (a) under stringent conditions due to degeneracy of gene codons, but is encoded by the DNA shown in (a) or (b) DNA that encodes a protein that has the same amino acid sequence as the protein.
  • [3] A protein encoded by the DNA according to [2].
  • [5] A transformant transformed with the recombinant plasmid of [4].
  • [6] A DN encoding a protein having a 16-position hydroxylase activity of macrolide compound 11107B, wherein the DNA described in [2] or a DNA comprising a part thereof is used as a probe or primer.
  • a isolation method A DN encoding a protein having a 16-position hydroxylase activity of macrolide compound 11107B, wherein the DNA described in [2] or a DNA comprising a part thereof is used as a probe or primer.
  • F DNA encoding t-redoxin, consisting of 2564 bases of SEQ ID NO: 1 From base 1643 to base 1834 of SEQ ID NO: 2 and a base sequence from base 1399 to base 1593 of SEQ ID NO: 3 DNA.
  • (f) does not hybridize with the DNA shown in (d) under stringent conditions due to degeneracy of the gene codon, but is encoded by the DNA shown in (d) or (e) DNA encoding a protein having the same amino acid sequence as the protein.
  • [11] A method for isolating a DNA encoding a protein having a ferredoxin function, comprising using the DNA described in [7] or a DNA comprising a part thereof as a probe or a primer.
  • R 12 , R 16b , R 17a , R 17b , R 18 , R 20a , R 20b , R 21a and R 2 are the same or different,
  • R M represents a single bond or 110 CO—
  • R N1 and R N2 are identical
  • (X) represents a C 6 _ 14 arylsulfonyl group
  • R N1 and R N2 together with the nitrogen atom to form a 3- or 14-membered nitrogen-containing non-aromatic heterocyclic ring which may have a substituent);
  • R 22a , R 22b and R 22c are the same or different,
  • R 21a and R 21b and one of R 22a and R 22b together form a partial structure orR 21b ) May be formed;
  • R 2 and R 1 Q is to display the same or different connexion, hydrogen atom or C i _ 22 alkyl group
  • R 3a , R 3b , R 5a , R 5b , R 6a and R 6b are the same or different
  • R 6 a and R 6 b is MAY together form a connexion, spiro O carboxymethyl oxiranyl group or Ekisomechire emissions group; or,
  • R 7a and R 7b may be the same or different, a hydrogen atom or a ⁇ _R H (wherein, R H is a hydrogen atom, 22 alkyl or C 2 - represents a 22 Arukanoiru group)), (2) ( GM-II)
  • R 2 , R 5a , R 5b , R 6a , R 6b , R 7a , R 7b and R 10 are as defined in the formula ( GM -e)
  • R 2 R 3a , R 6a , R 6b and R 10 are as defined in the formula (GM-I)).
  • a method for producing a 16-position hydroxylated macrolide compound which comprises converting into a 16-position hydroxylated macrolide compound, and collecting the converted 16-position hydroxylated macrolide compound.
  • R 5 ′ represents a hydrogen atom or an acetyl group
  • R 6 ′ represents a hydrogen atom or a hydroxy group
  • R 7 ′ represents a hydrogen atom or an acetyl group
  • W ', R 5', R 6 ' and R 7' is a method for producing [12], wherein the converting to the reduction compounds of formula (III-a) is defined synonymous).
  • R 5 ′, R 6 ′ and R 7 ′ are hydrogen atoms
  • 1 5 'Pop 16 ' is a hydrogen atom
  • R 7 ' is a compound having an acetyl group
  • R 5 ′ is a hydrogen atom
  • R 6 ′ is a hydroxy group
  • R 7 ′ is an acetinol group
  • R 5 ′ is a hydrogen atom
  • R 6 ′ is a hydroxy group
  • R 7 ′ is an acetyl group, (11) 0 H
  • R 5 ′ is an acetyl group
  • R 6 ′ is a hydroxy group
  • R 7 ′ is a hydrogen atom
  • the present invention it is possible to isolate a DNA encoding a protein or ferredoxin having a 16-position hydroxylase activity of macrolide compound 11107B, determine its nucleotide sequence, and further carry the DNA.
  • a transformant transformed with the plasmid and the plasmid was prepared, and the transformant was used to efficiently produce a 16-hydroxylated chloride compound.
  • a protein or furedoxin having a 16-position hydroxylase activity is obtained from cells collected from a culture obtained by culturing a microorganism capable of converting macrolide compound 11107B to macrolide compound 11107D.
  • the partially or wholly encoding DNA can be isolated and sequenced.
  • an autonomously replicating or integrating replicating recombinant plasmid carrying the DNA is constructed, and a transformant is prepared using the plasmid.
  • the transformant prepared in this manner is cultured in a medium, and during or after culturing, Let '
  • the cultured transformant is brought into contact with the macrolide compound represented by the formula (III) to convert it into the 16-hydroxyl macrolide compound represented by the formula (IV).
  • the 16-position hydroxylated macrolide compound can be obtained by collecting the 16-position hydroxylated macrolide compound.
  • any microorganism having such an ability can be used regardless of species and strains.
  • Streptomyces sp. (Streptomyces sp.) Mer-11107 and A-1544 strains isolated from soil and unidentified actinomycetes A-1560 strain can be mentioned.
  • Streptomyces sp. Mer-11107 is referred to as FERM P-18144, Research Institute of Life Science and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-3-1, Tsukuba-Higashi, Ibaraki, 305-8566, Japan on December 19, 2000. And 1 November 1 Tsukuba East, Ibaraki 305-8566, Japan, November 27, 2001 1 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Patent Organism Depositary Center (IP0D) At FERM BP-7812.
  • the A-1544 strain is referred to as FERM P-18943 as of July 23, 2002 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan 305-8566 Japan, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Central No.
  • the bacteriological properties of the above strains are as follows.
  • a spore chain consisting of about 10 to 20 cylindrical spores is formed.
  • the size of the spores is about 0.7 X 1.0; um, and the surface of the spores is smooth, and there are no special organs such as spores, sclerotium, and flagella.
  • the following shows the culture characteristics after culturing on various media at 28 ° C for 2 weeks.
  • the description of the color tone is indicated by the name of the color of Tresner's color wheels and the sign in parentheses.
  • Salt tolerance (yeast / malt agar medium, cultured for 2 weeks): grows with salt content of 4% or less
  • Spira type aerial hyphae extend from the base hyphae. It forms a spore chain consisting of about 10 20 cylindrical spores in front of the mature aerial hyphae.
  • the size of the spores is about 1.0 1.2 1.4 111, and the surface of the spores is spiny, and there are no special organs such as spores, sclerotium, and flagella.
  • Table 1 shows the culture properties after culturing on various media at 28 ° C for about 2 weeks. Color notation is indicated by the color name of Tresner's color wheels and the sign in parentheses.
  • Optimum growth temperature (Yeast / malt agar medium, culture for 2 weeks): 20 ° C to 37 ° C
  • the present inventors have coded from the above microorganisms a DNA involved in hydroxylation at position 16 of a macrolide compound, that is, a DNA encoding a protein having a 16-hydroxylase activity and a protein having a ferredoxin function.
  • the DNA to be isolated and its base The sequence was determined.
  • DNA encoding a protein having a 16-hydroxyl enzyme activity and DNA encoding a protein having a ferredoxin function are collectively referred to as “DNAJ associated with 16-hydroxylase.
  • the DNA encoding the protein having the 16-position hydroxylase activity of the present invention is represented by the following (1-1), (1-2) or (3).
  • the “16-position hydroxylase activity” refers to hydroxylating the macrolide compound 11107B represented by the formula (I) at position 16 and converting it to the macrolide compound 11107D represented by the formula (II) Means enzyme activity.
  • the DNA encoding the protein having a ferredoxin function of the present invention is represented by the following (2-1), (2-2) or (2-3).
  • the “ferredoxin function” means a protein function that transfers electrons to the 16-hydroxylase and performs a hydroxylation reaction with the 16-hydroxylase.
  • base sequence that hybridizes under stringent conditions refers to a colony hybridizer that uses any one of the aforementioned DNAs (1-1) or (2-1) as a probe.
  • a DNA sequence obtained by using the method such as the seeding method, plaque hybridization method, or Southern plot hybridization method.For example, immobilization of colony or plaque-derived DNA or a fragment of the DNA.
  • 0.1 to 2 ⁇ SSC solution (1 ⁇ SSC solution is 150 raM sodium chloride, 15 mM DNA that can be identified by washing the filter 1 at 65 ° C with sodium citrate).
  • DNA that hybridizes under stringent conditions include DNA having a certain degree of homology with the base sequence of DNA used as a probe, for example, 80% or more, preferably 85% or more, and more preferably 90% or more. %, More preferably 95% or more, and most preferably 98% or more.
  • the method for obtaining the 16-position hydroxylase-related DNA of the present invention is not particularly limited. Based on the nucleotide sequence information set forth in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 in the sequence listing in this specification, appropriate probes and primers are prepared and used to belong to actinomycetes.
  • the DNA of the present invention can be isolated by screening a DNA library of a microorganism to be used.
  • the DNA library can be prepared by a conventional method from a microorganism expressing the 16-position hydroxylase activity.
  • the 16-position hydroxylase-related DNA of the present invention can also be obtained by PCR.
  • PCR was performed using a pair of primers designed to amplify any of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3.
  • Do. PCR reaction conditions can be set as appropriate. For example, a reaction consisting of 94 ° C for 30 seconds (denaturation), 55 ° C for 30 seconds to 1 minute (annealing), and 72 ° C for 2 minutes (extension) As one cycle of the process, for example, 30 cycles may be performed, followed by a reaction at 72 ° C. for 7 minutes.
  • the amplified DNA fragment can then be cloned into a vector that can be amplified in a suitable host.
  • the method for obtaining the protein of the present invention is not particularly limited, and may be a protein synthesized by chemical synthesis or a recombinant protein produced by a gene recombination technique.
  • a DNA encoding the protein described above in the present specification is obtained.
  • the protein of the present invention can be produced by introducing this DNA into an appropriate expression system. The expression of the protein in the expression system will be described later in this specification.
  • the DNA of the present invention can be used by inserting it into an appropriate vector.
  • the type of vector used in the present invention is not particularly limited.
  • an autonomously replicating vector for example, an autonomously replicating vector
  • the DNA of the present invention is operably linked to elements required for transcription (for example, a mouth motor).
  • a promoter is a DNA sequence that exhibits transcriptional activity in a host cell, and can be appropriately selected according to the type of host. Transformant of the present invention and production of recombinant protein using the same
  • a transformant can be prepared by introducing the DM or recombinant vector of the present invention into an appropriate host.
  • the host cell into which the DNA or recombinant vector of the present invention is introduced may be any cell as long as it can express the gene of the present invention, and includes bacteria, yeast, fungi, and higher eukaryotic cells.
  • bacterial cells include Gram-positive bacteria such as Bacillus or Streptomyces or Gram-negative bacteria such as Escherichia coli. Transformation of these bacteria may be carried out by using a competent cell by a protoplast method, an electoral poration method or other known methods.
  • the electroporation method can be performed as follows.
  • the plasmid containing the foreign gene is added to the suspension of the competent cells, and the suspension is placed in a cuvette dedicated to electroporation, and a high-voltage electric pulse is applied to the cuvette. . Thereafter, the cells are cultured in a selection medium, and the transformant is isolated on a plate agar medium.
  • yeast cells include cells belonging to Saccharomyces or Schizosaccharomyces, for example, Saccharomyces' Saccharomyces
  • Examples of a method for introducing a recombinant vector into a yeast host include an electrotrophic method, a spheroplast method, and a lithium acetate method.
  • Examples of other fungal cells are filamentous fungi, such as cells belonging to Aspergillus, Neurosbora, Fusarium; or Trichoderma. When a filamentous fungus is used as a host cell, transformation can be performed by integrating the DNA construct into the host chromosome to obtain a recombinant host cell.
  • Integration of the DNA construct into the host chromosome can be performed according to known methods, for example, by homologous recombination or heterologous recombination.
  • the above transformant is cultured in an appropriate nutrient medium under conditions allowing expression of the introduced gene.
  • a conventional protein isolation and purification method may be used. For example, if the protein of the present invention is expressed in a lysed state in the cells, after the culture is completed, the cells are collected by centrifugation, suspended in an aqueous buffer, and then sonicated by an ultrasonic crusher or the like. Crush to obtain a cell-free extract.
  • a normal protein isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method with ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation with an organic solvent, Method, anion exchange chromatography using a resin such as getylaminoethyl (DEAE) Sepharose, SP-
  • a purified sample can be obtained using a single or a combination of techniques such as filtration, affinity chromatography, chromatography, and electrophoresis such as isoelectric focusing.
  • the present invention uses a transformant into which a DNA encoding a protein having a 16-position hydroxylase activity or a DNA encoding a protein having a ferredoxin function has been introduced, and in the presence of the transformant, the above-mentioned formula (III)
  • the macrolide compound that can be hydroxylated by the transformant of the present invention is a macrolide compound represented by the above formula ( ⁇ ) (a macrolide compound represented by the above formula (IV)), preferably A macrolide compound represented by the formula ( ⁇ -a)
  • a macrolide compound represented by the above formula (IV-a) and more preferably a macrolide compound 11107B (macrolide compound 11107D).
  • the figures in parentheses are the hydroxylated macrolide compounds at the 16-position.
  • an inducer is added to the 16-hydroxylase-related DNA in the transformant to express it in the cells.
  • the bacterial cells expressing these DNAs are used as substrates for the above formula (III) And the conversion reaction.
  • the temperature of the conversion reaction can be appropriately determined in consideration of the optimal temperature of the transformant.
  • the reaction time can also be appropriately determined in consideration of the conversion rate to the 16-position hydroxylated macrolide compound (the degree of progress of the reaction) and the like. For example, 1 to 5 days at 20 to 31 ° C is suitable. Further, the reaction can be carried out in any of a batch mode and a continuous mode.
  • a separation and purification method generally used for isolating a microbial metabolite from its culture solution can be used.
  • organic solvent extraction using methanol, ethanol, acetone, butanol, ethyl acetate, butyl acetate, chloroform, toluene, etc. adsorption / desorption using a hydrophobic adsorption resin such as Diaion HP-20, SEPHADEX LH -Any known method such as gel filtration chromatography using -20, etc., adsorption chromatography using activated carbon, silica gel, etc., or adsorption / desorption treatment using thin-layer chromatography, or high-performance liquid chromatography using reversed phase chromatography, etc.
  • the method is not particularly limited to the method shown here.
  • the desired 16-position hydroxylated macrolide compound can be isolated and purified by using these methods singly or in any
  • the modified DNA means a DNA modified by deletion, conversion, addition, insertion or the like of a constituent base, or a derivative thereof, and a DNA exhibiting the same effect as the original DNA.
  • halogen atom used in the specification of the present application means a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom ”, and an iodine atom.
  • Ji 2 2 alkyl group Used herein as a "Ji 2 2 alkyl group", it has from 1 to carbon atoms shows two two linear or branched alkyl group such as methyl group, Echiru group, n- flop port propyl group, IS 0-propyl, n-butyl, iso-butyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, 1,1-dimethylpropyl, 1,2-dimethylpropyl, 2,2 —Dimethylpropyl group, 1-ethylpropyl group, n-hexyl group, 1-ethyl-2-methylpropyl group, 1,1,2—tri Methyl butyl group, 1-methylbutyl group, 2-methylbutyl group, 1,1-dimethylbutyl group, 1,2-dimethylbutyl group, 2,2-dimethylbutyl group, 1,3-dimethylbutyl group, 2,3 —Dimethylbutyl group
  • preferably represents a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, for example, a methyl group, an ethyl group,: n-propynole group, iso-propynole group, n-butyl group, iso- Butyl, sec-butynole, tert-butynole and the like.
  • C 6 _ 1 4 Ariru group 6 to mean 1 4 aromatic configured with charcoal atom hydrocarbon cyclic group, for example a monocyclic group, bicyclic And condensed rings such as tricyclic groups.
  • Examples include phenyl, indenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, azulenyl, heptalenyl, indacenyl, acenaphthyl, fluorenyl, phenenyl, phenanthrenyl, anthracenyl and the like.
  • phenyl 1-naphthyl, 2-naphthyl And the like.
  • the term "5- to 14-membered heteroaryl group” refers to a monocyclic or bicyclic ring containing at least one heteroatom selected from the group consisting of a nitrogen atom, a sulfur atom and an oxygen atom. Refers to a 5- or 14-membered aromatic heterocyclic group of the formula or tricyclic.
  • Preferable examples include, as nitrogen-containing aromatic heterocyclic groups, for example, pyrrolyl, pyridinyl, pyridazinyl, pyrimidinyl, pyrazuryl, triazolyl, tetrazolyl, benzotriazolyl, pyrazolyl, Imidazolyl group, benzimidazolyl group, indolinole group, isoindolyl group, indolizinyl group, prenyl group, indazolyl group, quinolinyl group, isoquinolinyl group, quinolizinyl group, phthalazinyl group, naphthyridinyl group, quinoxalinyl group, quinazolinyl group, quinazolinyl group, quinazolinyl group Group Group, imidazotriazinyl group, birazinopyridazinyl group, acridinyl group, phenanthridinyl group, carb
  • Ryl benzothiazolyl, benzothiadiazolyl, phenothiazidyl, isoxazolyl, furazanyl, phenoxazinyl, oxazolyl, isoxazolyl, benzoxazolyl, oxaziazolyl, virazoloxazolyl, Thiazolyl group, Chenofuranyl group, Flopi Lil groups, pyridinium Do Kisajiniru group and the like, preferably thienyl group, furyl group, pyridinyl group, pyridazinyl group, pyrimidinyl group, Birajiniru group.
  • the term “3- or 14-membered nitrogen-containing non-aromatic heterocycle” refers to a monocyclic, bicyclic or tricyclic 3- to 14-membered ring containing at least one nitrogen atom. Refers to a non-aromatic heterocycle.
  • Preferred examples include, for example, aziridinyl, azetidinole, pyrrolidinyl, pyrrolyl, piperidinyl, piperazinyl, homopyridinyl 6
  • Examples include a lysinyl group, a homopiperazinyl group, an imidazolyl group, a birazolidinyl group, an imidazolidinyl group, a morpholinyl group, a thiomorpholinyl group, an imidazolinyl group, an oxazolinini / re group, and a quinutalidinyl group.
  • the nitrogen-containing non-aromatic complex ring also includes a group derived from a pyridone ring and a non-aromatic condensed ring (for example, a group derived from a phthalimid ring, a succinimido ring, etc.). It is.
  • alkyl group "means the end is a carbonyl group group, e.g. Asechiru group, a propionyl group, Puchiriru group, iso- Puchiriru group, valeryl group, iso- valeryl group, Bibariru group, forces Puroiru group, Dekanoiru Group, lauroyl group, myristoyl group, palmitoyl group, stearoyl group, arachidoyl group and the like, and preferably an alkanoyl group having 2 to 6 carbon atoms, for example, acetyl group, propionyl group, butyryl group, iso-butyryl group And the like.
  • a carbonyl group group e.g. Asechiru group, a propionyl group, Puchiriru group, iso- Puchiriru group, valeryl group, iso- valeryl group, Bibariru group, forces Puroiru group, Dekanoiru Group, lauroy
  • C 7 15 Aroiru group Used herein - the "C 7 15 Aroiru group", "C 6 _ 14 Ariru group” defined above, in the "5-membered ring to Teroariru group to 14-membered ring” is a carbonyl group bound to the end A benzoyl group, a 11-naphthoyl group, a 2-naphthoyl group, a picolinoyl group, a nicotinoyl group, an isonicotinoyl group, a fluoryl group and the like.
  • the “C 3 _ 23 unsaturated alkanoyl group” used in the present specification means a group in which a carbonyl group is bonded to the terminal in the above-mentioned “unsaturated C 2 _ 22 alkyl group”, for example, an acryloyl group, Examples include a propioyl group, a crotonyl group, an iso-crotonyl group, an oleroyl group, a linolenoyl group, and the like, and preferably a C2 to C6 unsaturated alkanoyl group, such as an acryloyl group.
  • a substituted moiety is the definition of"
  • C 6 - means a 14 Ariru group 7 to be replaced by "to 22 amino configured group carbon atoms, downy For example specifically Njiru Group, phenyl group, 3-phenylpropyl group, 4-phenylbutyl group, 1-naphthylmethyl group, 2-naphthylmethyl group, and the like. 7 to 10 aralkyl groups, such as a benzyl group and a phenethyl group.
  • 2 alkyl group it means a group having an oxygen atom bonded to its terminal.
  • suitable groups include methoxy, ethoxy, n-propoxy, iso-propoxy, n-butoxy, and iso- -Butoxy, sec-butoxy, tert -butoxy, n-pentyloxy, iso-pentyloxy, sec-pentinoleoxy, n-hexyloxy, iso-hexyloxy, 1,1-dimethylpropoxy, 1,2-dimethylpropoxy group, 2,2-dimethylpropoxy group, 2-ethylpropoxy group, 1-ethyl-2-methylpropoxy group,
  • 1.2-trimethylpropoxy group 1,2,2-trimethylpropoxy group, 1,1-dimethylbutoxy group, 1,2-dimethylbutoxy group, 2,2-dimethylbutoxy group, 2,3-dimethylbutoxy group, Examples thereof include a 1,3-dimethylbutoxy group, a 2-ethylbutoxy group, a 1,3-dimethylbutoxy group, a 2-methylpentyloxy group, a 3-methylpentyloxy group, and a hexyloxy group.
  • unsaturated C 2 - 2 2 alkoxy group is a, in the “unsaturated c 2 _ 2 2 alkyl group” defined above, and meaning taste group having an oxygen atom attached to its end, preferably
  • suitable groups include vinyloxy, aryloxy, 1-propenyloxy, isopropenyloxy, 2-methyl-1-propenyloxy, 2-methyl-2-propenyloxy, 1-butenyloxy, 2 —Butenyloxy, 3-butenyloxy, 1-pentyloxy, 1-hexenyloxy,
  • the above-defined - in the "C 6 1 4 Ariru group” means a group having an oxygen atom attached to its end, specifically, for example phenoxy Group, indenyloxy group, 1-naphthyloxy group, 2-naphthyloxy group, azulenyloxy group, heptalenyloxy group, indenyloxy group, acenaphthyloxy group, fluorenyloxy group, phenalenylo Xy, phenanthrenyloxy, anthracenyloxy and the like.
  • phenoxy Group indenyloxy group, 1-naphthyloxy group, 2-naphthyloxy group, azulenyloxy group, heptalenyloxy group, indenyloxy group, acenaphthyloxy group, fluorenyloxy group, phenalenylo Xy, phenanthrenyloxy, anthracenyl
  • the term "5- to 14-membered heteroaryloxy group” refers to the "5- to 14-membered heteroaryl group” defined by Mitsumi and has an oxygen atom at its terminal. And specifically includes, for example, a pyrrolyloxy group, a pyridinyloxy group, a pyridazi-loxy group, a pyrimidinyloxy group, a pyrazinyloxy group, a triazolyloxy group, a tetrazolyloxy group, a benzotriazolyloxy group.
  • pyrazolyloxy imidazolyloxy, benzimidazolyloxy, indolyloxy, isoindolyloxy, indolizinyloxy, prinyloxy, indazolyloxy, quinolinyloxy, isoquinolinyloxy , Quinolidinyloxy, phthaladuloxy, naphthyridinyloxy Si, quinoxalinyloxy, quinazolinyloxy, cinnolinyloxy, pteridinyloxy, imidazotriazinyloxy, birazinopyridazinyloxy, ataridinyloxy, phenanthrini Roxy, carbazolyloxy, rivazolinyloxy, perimidinyloxy, phenantophyllinoxy, phenacinyloxy, imidazopyridinyloxy, imidazopyridimidinyloxy, villa Zolopyridinyloxy group, pyrazo
  • sulfo the " ⁇ 22 alkyl group” defined bound - means group, specifically, for example, methane Sno Reho group, Examples include an ethanesulfonyl group, an n-prononsulfonyl group, an iso-propanesulfonyl group, and the like.
  • C 4 ⁇ reel sulfonyl group the above-defined - means "C 6 14 Ariru group” bonded to sulfonyl group, specifically, for example, benzenesulfonyl group, 1-naphthalene Examples include a sulfonyl group and a 2-naphthalenesulfonyl group.
  • 22 alkylsulfonyloxy group refers to a group in which an oxygen atom is bonded to the terminal in the "Ci- 22 alkylsulfonyl group" defined above, for example, methylsulfonyloxy.
  • examples thereof include a xy group, an ethylsulfonyloxy group, an n-propinolesnorephonyloxy group, and an iso-propylsulfonyloxy group.
  • C 2 — 23 alkanoyl group (E.g., acetyl, propioyl, butyryl, iso-butyryl, valeryl, iso-valeryl, bivalyl, forceproyl, decanoyl, radioyl, myristoyl, palmitoyl, stearoyl Group, arachidoyl group, etc.)
  • 0.1 ml of this culture was inoculated into a 500 ml triangular flask containing 100 ml of the same seed culture medium, and cultured at 28 ° C. for 1 day to obtain a second stage seed culture.
  • 800 ml of the second-stage seed culture obtained in this manner was used in a production medium [soluble starch 5%, pharmamedia 0.8 °, gluten meal 0.8%, yeast extract 0.5%, calcium carbonate 0.1 %, PH 6.8 before sterilization] Inoculate into a 200 L tank containing 100 L, culture at 28 ° C with agitation of 90 rpm, aeration rate 1. Ovvm, aeration and agitation culture for 5 days at an internal pressure of 20 kPa A liquid was obtained.
  • the column was eluted with a mixture (2 L) of n-hexane and ethyl acetate (l: 9; v / v). The fractions eluted from 468 ml to 1260 ml were collected and concentrated under reduced pressure. 25 mg of a crude active fraction was obtained. .
  • Example 1 Determination of the nucleotide sequence of a gene derived from Streptomyces sp. A-1544 strain (FERM BP-8446)
  • A-1544 strain was inoculated into a medium consisting of glucose 1%, malt extract 0.4%, and yeast extract 1%, and cultured at 28 ° C for 3 days. The obtained culture was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to collect the cells. Chromosomal DNA was prepared from the cells using a Blood & Cell Culture kit (QIAGEN).
  • a PCR reaction was performed using the two primers (5Dm-3F and 5Dm-3R) and the chromosomal DNA of the A-1544 strain obtained in (1) above as a template.
  • the PCR reaction was performed using Takara LA Taq (Takara Shusha) and a PCR amplifier (Biometra T Gradient), denaturation at 98 ° C for 20 seconds, annealing at 50 ° C for 2 minutes, and elongation at 68 ° C for 30 minutes.
  • a three-step reaction of 35 seconds was repeated 35 seconds.
  • DNA fragment-A1 a DNA fragment having a size of about 500 bp (hereinafter referred to as DNA fragment-A1) was amplified.
  • This DNA fragment-A1 is likely to be a part of DNA encoding a protein having hydroxylic activity.
  • the DNA fragment-A1 amplified by the PCR reaction was recovered from the reaction solution by SUPREC PCR (Takara Shuzo).
  • DNA ligation kit ver. 2 (Takara Shuzo) was added to plasmid vector pT7Blue T (Novagen).
  • pT7Blue T Novagen
  • Escherichia coli JM109 strain was transformed.
  • Plasmid DNA was separated and purified from the transformed transformed E. coli cells using a plasmid purification kit (QIAfilter Plasmid Midi Kit, QIAGEN) to obtain a fixed amount of DNA fragment-A1.
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment-A1 obtained in (2) above was analyzed using a DNA nucleotide sequence analyzer (PE
  • the partial sequence of the DNA encoding the protein having hydroxylic activity derived from the A-1544 strain was determined, it was determined by inverse PCR (Cell Engineering Vol. 14, p. 591-593, 1995).
  • the base sequence of the peripheral region extending upstream and downstream of the Clawing fragment was amplified, cloned, and sequenced. 'That is, the chromosomal DNA of the A-1544 strain (see (1)) was digested with restriction enzymes Pstl and Sail in H buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl 2 , 10 mM diteositol, 100 mM NaCl), respectively. Digested. Each of the obtained restriction enzyme-cleaved DNA fragments was subjected to self-circulation using DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo).
  • primers (6PIN-2F (SEQ ID NO: 6) and 6PIN-2R (SEQ ID NO: 7)) were designed and prepared from the base sequence of DNA fragment-A1.
  • PCR was carried out using these two primers (6PIN-2F and 6PIN-2.R) and the self-circularized A-1544 strain chromosomal DNA as a template.
  • the PCR reaction was performed using Takara LA Taq (Takara Shuzo) and a PCR amplifying device (Biometra T Gradient).
  • the two-step reaction was performed in which denaturation was performed at 98 ° C for 20 seconds and annealing and extension were performed at 68 ° C for 5 minutes for 35 minutes. Repeated several times.
  • DNA fragment-B1 with a size of about 3.5 kbp
  • DNA fragment-C1 with a size of about 2.8 kbp were amplified.
  • co one de to DNA and DNA is a potential force ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ Rere having the DNA sequence containing the upstream and downstream regions.
  • DNA fragment-B1 and DNA fragment-C1 were recovered from this PCR amplification reaction solution by SUPREC PCR (Takara Shuzo).
  • SUPREC PCR Takara Shuzo
  • the plasmid vector pT7Blue T Novagen
  • DNA Ligation kit ver. 2 Takara Shuzo
  • E. coli JM109 strain E. coli JM109 strain
  • a plasmid purification kit QIAfilter Plasmid Midi Kit, QIAGEN
  • the nucleotide sequences of DNA fragment-B1 and DNA fragment-C1 obtained in (4) above were analyzed using a DNA sequence analyzer (PE Biosystems 377XL) according to the dye terminator-'cycle 'sequence method.
  • the nucleotide sequence was analyzed, and information on the 3793 bp nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 was obtained from the DNA fragment-B1 and DNA fragment-C1 sequences.
  • psmA encodes a protein consisting of 409 amino acids with high homology to cytochrome P450 from base 1322 to base 2548 of SEQ ID NO: 1. There was). PsmA is most likely to be found in the amino acid sequence estimated to be cytochrome P450 (CYP105D5) in Streptomyces-cericala A3 (2) and the amino acid sequence estimated to be cytochrome P450 (CYP105D4) in Streptomyces lividans. It had high homology (72.6% homology) and relatively high homology to the cytochrome P450soy (SoyC) of Streptomyces griseus (Homology)
  • psmA may be a gene encoding a cytochrome P450-type hydroxylase and that 1 "is likely to be produced.
  • psmB 0RF encoding a protein having high homology to 3F-4S type ferredoxin .
  • the protein encoded by psmB consists of 66 amino acids, and is a cytochrome of Streptomyces. Ferredoxin immediately downstream of the putative amino acid sequence of 450 (?
  • Example 2 Construction of a transformant having psmA and psmB
  • a primer DM-NdeF (SEQ ID NO: 8) having an Ndel site added at the 5 ′ end and a primer DM-NDM having an Spel site added at the 5 ′ end SpeR (SEQ ID NO: 9) was designed and created.
  • a PCR reaction was performed using these two primers (DM-NdeF and DM-SpeR) and the chromosomal DNA of the A-1544 strain obtained in Example 1 (1) as a template.
  • PCR reaction is Takara LA
  • DNA fragment-D1 a DNA fragment of about 1.5 kbp including psmA and psmB (hereinafter referred to as DNA fragment-D1) was widened.
  • DNA fragment -D1 was recovered from this PCR amplification reaction solution by SUPREC PCR (Takara Shuzo).
  • H buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM
  • DNA fragment-D1 obtained in the previous section (1) is digested with restriction enzymes Ndel and Spel, and the obtained DNA fragment-D1 digest and plasmid digest are combined with DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo) Were connected. Yotsute thereto, DNA fragments containing therein both psmA and PSMB - and D1, plasmid pT7NS - (referred to as plasmid P TC- DM) about the CamAB are connected 9. size 5kbp plasmid is It was constructed.
  • Escherichia coli BL21 (DE3) competent cells were transformed with the plasmid pTC-DM prepared in (2) above.
  • E. coli BL21 (DE3) / pTC-DM strain transformed with the plasmid pTODM was obtained.
  • Example 3 Conversion of ME-265 represented by the following formula into ME-282 by a transformant of Escherichia coli having psmA and psmB
  • L-Broth medium 1.0% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl
  • the cells were inoculated into a 15 mL test tube and shake-cultured at 37 ° C for 20 hours. Add 500 ⁇ L of this seed culture to a 250 mL volume of 50 mL of L-Broth medium (1.0% batatotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl) containing 50 g / mL of ampicillin.
  • Example 4 Conversion of macrolide-based compound 11107B to macrolide-based compound 11107D by Escherichia coli transformant having psmA and psmB
  • Example 3 a test was performed using the macrolide compound 11107B as a substrate.
  • the frozen seeds of the transformed bacteria BL21 (DE3) / pTC-DM strain and BL21 (DE3) / pT7NS-CamAB strain obtained in Example 2 (3) containing ampicillin 50 / g / mL were used.
  • a 500 mL L-broth medium (50% ampicillin, 1.0% batatotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl) containing 50 g / mL of this seed culture was added to a 250 mL volume. After inoculating in an Erlenmeyer flask and culturing with shaking at 28 ° C for 5 hours, lOOraM IPTG usopropyl-] 3-D-thiogalactopyranoside) ⁇ The cells were cultured with shaking at 25 ° C for 20 hours. The resulting culture was centrifuged (5000 rpm, 10 minutes) to collect the cells. Add this to lOOmM phosphate buffer
  • a primer DM-BglF (SEQ ID NO: 10) having a Bglll site added to the 5 ′ end and a primer DM-BglR having a Bglll site added to the 5 ′ end (SEQ ID NO: 11) was designed and created.
  • a PCR reaction was performed using these two primers (DM-BglF and DM-BglR) and the chromosomal DNA of the A-1544 strain obtained in Example 1 (1) as a template.
  • the PCR reaction was performed using Takara LA Taq (Takara Shuzo) and a PCR amplification device (Biometra T Gradient) at 98 ° C for 20 seconds for denaturation, 63 ° C for 30 seconds for annealing, and 68 ° C for 4 minutes for elongation. The three-step reaction was repeated 30 times.
  • DNA fragment-E1 a DNA fragment of about 3.5 kbp including psmA and psmB (hereinafter, referred to as DNA fragment-E1) was amplified.
  • This PCR amplification reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis to fractionate.
  • the above-mentioned DNA fragment-E1 having a size of about 3.5 kbp was cut out from the agarose gel and recovered by SUPREC 01 (Takara Shuzo).
  • PIJ702 was digested with the restriction enzyme Bglll in H buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl 2 , 10 mM dithiositol, 100 NaCl) to obtain a plasmid digest.
  • the DNA fragment-E1 obtained in (1) above is digested with the restriction enzyme Bglll, and the obtained DNA fragment-E1 digest and the plasmid digest are digested with DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo). And connected.
  • plasmid pIJDMG A plasmid having a size of about 8.5 kbp linked to rasmid pIJ702 was constructed.
  • Transformants were obtained in Example 5 (3) A- 1544 / pIJDMG strain, A- 1544 / pIJ702 strain, and frozen species mother original A- 1544 strains, SMN containing Chio thiostrepton 25 mu g / mL Medium (Stabilose 2%, glucose 2%, essanmeat 2%, yeast extract 0.5%, NaCl 0.25%, CaC03 0.32% pH 7.4) Inoculated in a 250 mL Erlenmeyer flask containing 50 mL The cells were cultured with shaking at 28 ° C for 48 hours (seed culture, except that A-1544 strain was not supplemented with thiostrepton :).
  • 0.5 mL of the obtained seed culture was inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 50 mL of SMN medium containing 25 ⁇ g / mL of thiostrepton, and cultured with shaking at 28 ° C for 72 hours (however, A- 1544 strain does not contain thiostrepton).
  • 2 mL of the obtained culture was dispensed, and 100 L of 1 M phosphate buffer (pH 6.5) and 50 L of 100 rag / mL 11107B were added thereto.
  • the converted culture solution thus obtained was reacted at 28 ° C for 12 hours.
  • the reaction solution was extracted with 1 mL of acetonitrile, and the amounts of 11107B and 11107D were measured by HPLC. Table 5 shows the measurement results. The detailed conditions of HPLC are shown below.
  • the A-1544 / pIJDMG strain transformed with the plasmid containing psmA and psmB showed about 2.7 times the conversion activity in a 12-hour reaction as compared to the original A-1544 strain. This suggests that self-cloning of the psmA protein psmB can contribute to the conversion of the macrolide compound 11107B to 11107D.
  • Example 7 Determination of the nucleotide sequence of a gene derived from Streptomyces' SP Mer-11107 strain (FE BP-7812)
  • the medium consisting of glucose 1%, malt extract 0.4% and yeast extract 1% was inoculated with Mer-11107 strain and cultured at 28 ° C for 3 days. The obtained culture was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to collect the cells. Chromosomal DNA was prepared from the cells using a Blood & Cell Culture kit (QIAGEN).
  • a PCR reaction was performed using the two primers (5Dm-3F and 5D-1R) and the chromosomal DNA of the Mer-11107 strain obtained in (1) above as a template.
  • the PCR reaction was performed using Takara LA Taq (Takara Shuzo) and a PCR amplifying device (Biometra T Gradient) at 98 ° C for 20 seconds for denaturation, 50 ° C for 2 minutes for annealing, and 68 ° C for 30 minutes for elongation.
  • a three-step reaction of 35 seconds was repeated 35 seconds.
  • DNA fragment-A2 a DNA fragment having a size of about 300 bp (hereinafter referred to as DNA fragment-A2) was amplified.
  • This DNA fragment-A2 is likely to be a part of the DNA encoding the protein having hydroxylation activity.
  • the DNA fragment-A2 amplified by the PCR reaction was recovered from the reaction solution by SUPREC PCR (Takara Shuzo).
  • a DNA ligation kit ver. 2 (Takara Shuzo) was added to the plasmid vector pT7Blue T (Novagen).
  • pT7Blue T Novagen
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment-A2 obtained in (2) above was analyzed using a DNA nucleotide sequence analyzer (PE
  • Biosystems 377XL was used to analyze the dye terminator using the 'cycle' sequence method.
  • the DNA fragment-A2 amplified by the PCR reaction was measured to be about 300 bp by electrophoresis, but the nucleotide sequence analysis revealed that it was exactly 325 bp (SEQ ID NO: Bases 237 to 1161).
  • SEQ ID NO: Bases 237 to 1161 At both ends of the cloned 325 bp DNA sequence, DNA sequences corresponding to the two kinds of primers used in the PCK reaction were found, so that the DNA fragment -A2 was Kind of It was revealed that the DNA was specifically amplified by the primers (5Dm-3F and 5D-1R).
  • the partial sequence of the DNA encoding the protein having hydroxylation activity derived from the Mer-11107 strain was determined, it was determined by inverse PCR (Cell Engineering, Vol. 14, p. 591-593, 1995).
  • the base sequence of the peripheral region extending upstream and downstream of the cloned fragment was extensively cloned and sequenced. That is, the chromosome DNA of the liter-11107 strain (see (1)) was digested with a restriction enzyme BamHI in a K buffer (50 mM Tris-HC1, pH 8.5, 10 mM MgCl 2 , ImM dithioslate, 100 mM KC1) using H buffer.
  • Each solution was digested with a restriction enzyme Sail in a solution (50 mM Tris-HC1, pH 7.5, 10 mM MgCl 2 , ImM dithiothreitol, 100 mM NaCl).
  • a restriction enzyme Sail 50 mM Tris-HC1, pH 7.5, 10 mM MgCl 2 , ImM dithiothreitol, 100 mM NaCl.
  • Each of the obtained restriction enzyme-cleaved DNA fragments was self-cyclized using DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo).
  • primers (7PIN-2F (SEQ ID NO: 13) and 6PIN-2R (SEQ ID NO: 7)) were designed and prepared from the base sequence of DNA fragment-A2.
  • PCR reaction was performed using these two primers (7PIN-2F and 6PIN-2R) and the chromosomal DNA of the self-circularized Mer-11107 strain as a template.
  • the PCR reaction was performed using Takara LA Taq (Takara Shuzo) and a PCR amplifier (Biometra T Gradient), denaturation at 98 ° C for 20 seconds, annealing and extension at 68 ° C for 5 minutes 35 two-step reactions 35 times Repeated.
  • DNA fragment-B2 with a size of about 1.3 kbp
  • DNA fragment-C2 with a size of about 1.4 kbp
  • the DNA is a DNA encoding a DNA and a DNA having a DNA sequence including upstream and downstream regions thereof.
  • DNA fragment-B2 and DNA fragment-C2 were recovered from the PCR amplification reaction solution by SUPREC PCR (Takara Shuzo). Next, for the obtained DNA fragment-B2 and DNA fragment-C2, a plasmid vector pT7Blue T (Novagen Inc.), DNA Ligation kit ver. 2 (Takara Shuzo), Escherichia coli, 109 strains, and a plasmid purification kit (QIAfilter Plasmid Midi Kit, QIAGEN). As a result, a certain amount of each DNA fragment was obtained. .
  • the nucleotide sequences of DNA fragment-B2 and DNA fragment-C2 obtained in (4) above were solved by a DNA terminator one cycle cycle sequence method using a DNA sequence analyzer (PE Biosystems 377XL). The nucleotide sequence was analyzed in this manner, and information on the nucleotide sequence of 2329 bp shown in SEQ ID NO: 2 was obtained from the DNA fragment-B2 and DNA fragment-C2 sequences.
  • bpmA has the highest homology to the amino acid sequence of psmA isolated from the A-1544 strain (67.4% homology), and relatively high homology to Streptomyces griseus cytochrome P450soy (SoyC). (Homology 64.8%). This suggests that bpmA is likely to encode cytochrome P45Q-type hydroxylase.
  • bpmB 0RF (hereinafter referred to as bpmB) encoding a protein having high homology to 3Fe-4S type ferredoxin was present.
  • the protein encoded by bpmB consists of 64 amino acids and has the highest homology (81.0% homology) with the amino acid sequence of psmB isolated from A-1544 strain.
  • DNA fragment-D2 was amplified.
  • DNA fragment-D2 was recovered from this PCR amplification reaction solution by SUPREC PCR (Takara Shuzo).
  • the plasmid was digested with restriction enzymes Ndel and Spel in MgCl 2 , ImM dithiothreitol, lOOmM NaCl) to obtain a plasmid digest.
  • the DNA fragment-D2 obtained in the previous section (1) is digested with restriction enzymes Ndel and Spel, and the obtained DNA fragment-D2 digest and plasmid digest are digested with DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo). And ligated.
  • plasmid pTC-D07 a plasmid having a size of about 9.5 kbp in which the DNA fragment -D2 containing both bpmA and bpmB and the plasmid pT7NS-CamAB were ligated was constructed. .
  • Escherichia coli BL21 (DE3) competent cells were transformed using the plasmid pTC-D07 prepared in (2) above.
  • Escherichia coli BL21 (DE3) / pTC-D07 strain transformed with plasmid pTC-D07 was obtained.
  • Example 9 Conversion of macrolide-based compound 11107B to 11107D by Escherichia coli transformant having bpmA and bpmB
  • the conversion reaction solution thus obtained was reacted at 28 ° C. for 24 hours. 400 of the reaction solution was extracted with 600 ⁇ L of methanol, and the amounts of macrolide compounds 11107B and 11107D were measured by HPLC. Table 6 shows the measurement results. The detailed conditions of HPLC are shown below.
  • Example 10 Determination of base sequence of gene derived from A-1560 strain (FERM BP-10102)
  • A-1560 strain was inoculated into a medium consisting of glucose 1%, malt extract 0.4%, and yeast extract 1%, and cultured at 28 ° C for 3 days. The obtained culture was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to collect the cells. Chromosomal DNA was prepared from the cells using a Blood & Cell Culture kit (QIAGEN).
  • Mix 'primers (5Dm-3F (SEQ ID NO: 4) and 5Dm-2R (SEQ ID NO: 16)) were designed and prepared with reference to the amino acid sequence estimated to be 450 (10-50).
  • a PCR reaction was performed using these two primers (5Dm-3F and 5Dm-2R) and the chromosomal DNA of the A-1560 strain obtained in the above (1) as a template.
  • the PCR reaction was performed using Takara LA Taq (Takara Shuzo) and a PCR amplifier (Biometra T Gradient) for denaturation at 98 ° C for 20 seconds, annealing at 50 ° C for 2 minutes, and elongation at 68 ° C for 30 seconds.
  • the three-step reaction was repeated 35 times, and as a result, a DNA fragment of about 750 bp in size (hereinafter, DNA fragment-A3) was amplified.
  • This DNA fragment-A3 is likely to be part of the DNA encoding a protein having hydroxylic activity.
  • the DNA fragment-A3 amplified by the PCR reaction was recovered from the reaction solution by SUPREC PCR (Takara Shuzo).
  • DNA ligation kit ver. 2 (Takara Shuzo) was added to plasmid vector pT7Blue T (Novagen). Ligated DNA fragment-A3 using E. coli and transformed E. coli JM109 strain (Stratagene) Changed.
  • ampicillin 50 ⁇ g / mL
  • X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-j3-D-galactoside; 40 ⁇ g / mL
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • Select transformed Escherichia coli using L-Broth agar medium (100% / iM) (1.0% batatotributone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 1.5% agar did.
  • Plasmid DNA was separated and purified from the grown cells of the transformed Escherichia coli using a plasmid purification kit (QIAfilter Plasmid Midi Kit, QIAGEN) to obtain a certain amount of DNA fragment-A3.
  • the DNA sequence of the DNA fragment-A3 obtained in (2) above was analyzed using a DNA sequence analyzer (PE).
  • the analysis was carried out by the dye terminator-cycle method.
  • the DNA fragment-A3 amplified by the PCR reaction was measured to be approximately 750 bp by electrophoresis.
  • the nucleotide sequence analysis revealed that the DNA fragment-A3 was correctly 741 bp (SEQ ID NO: 3, bases 616 to 1356). Since DNA sequences corresponding to the two types of primers used in the above PCR reaction were found at both ends of the cloned 741 bp DNA sequence, the DNA fragment-A3 was It was revealed that the primers were specifically amplified by the different types of primers (5Dra-3F and 5Dm-2R).
  • the partial sequence of the DNA encoding the protein having hydroxylation activity derived from the A-1560 strain was determined, it was cloned by inverse PCR (Cell Engineering, Vol. 14, p. 591-593, 1995). We amplified, cloned, and sequenced the base sequence in the peripheral region extending upstream and downstream of the fragment. That is, the chromosomal DNA of the A-1560 strain (see (1)) was subjected to L-buffering with the restriction enzyme BaraHI in K buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.5, 10 mM MgCl 2 , ImM dithiothreitol, lOOmM KC1).
  • primers (5PIN-2F (SEQ ID NO: 17) and 6PIN-2R (SEQ ID NO: 7)) were designed and prepared from the nucleotide sequence of DNA fragment-A3.
  • PCR was carried out using these two primers (5HN-2F and 6PIN-2R) and the chromosomal DNA of the self-cyclized A-1560 strain as a template.
  • the PCR reaction was performed using Takara LA Taq (Takara Shuzo) and a PCR amplifier (Biometra T Gradient), denaturing at 98 ° C for 20 seconds, annealing and elongation at 68 ° C for 5 minutes, two-step reaction 35 times Repeated.
  • DNA fragment-B3 DNA fragment of about 4.5 kbp
  • DNA fragment-C3 DNA fragment of about 3.
  • DNA fragment- D3 DNA fragment of about 1.7 kbp
  • DNA fragment-B3 Collected by SUPREC PCR (Takara Shuzo).
  • DNA fragment-C3 and DNA fragment-D3 plasmid vector pT7Blue was obtained in the same manner as in the above (2), in order to obtain sufficient DNA fragments for nucleotide sequence analysis.
  • T Novagen
  • DNA Ligation kit ver. 2 (Takara Shuzo)
  • E. coli JM109 strain E. coli JM109 strain
  • a plasmid purification kit QIAfilter Plasmid Midi Kit, QIAGEN
  • DNA fragment-B3 (about 4.-bp size), DNA fragment-C3 (about 3. Okbp size) and DNA fragment-D3 (about 1.7 kbp size) nucleotide sequence analysis
  • tpmA a cytochrome of Streptomyces sericolor 3 (2)? 4500 ⁇ ? 10505) with the highest homology (77.4% homology) and also with the amino acid sequence of psmA isolated from A-1544 strain ( Nematode same sex 76.6%). This suggests that tpmA is likely to be a gene encoding cytochrome P450-type hydroxylase.
  • tpmB 0RF (hereinafter referred to as tpmB) ′ encoding a protein having high homology to 3Fe-4S type ferredoxin was present.
  • the protein encoded by tpmB consists of 65 amino acids, has the highest homology to the amino acid sequence of psmB isolated from strain A-1544 (81.0% homology), and has Streptomyces' Sericolor 3 (2 ) cytochrome 1 5 4500 ⁇ ? 10505) and had a high homology to Amino acid sequence deduced immediately downstream of ferredoxin Amino acid sequence deduced (82.5%). Therefore, tpmB was thought to encode ferredoxin, which is responsible for electron transfer and hydroxylates with tpmA.
  • Example 11 1 Preparation of Transformant Having tpmA and tpmB
  • a primer tpm-NdeF (SEQ ID NO: 18) to which an Ndel site was added and a primer tpm-SpeR (SEQ ID NO: 19) to which an Spel site was added at the 5 'end were designed and prepared.
  • a PCR reaction was performed using these two primers (tpm-NdeF and tpm-SpeR) and the chromosomal DNA of the A-1560 strain obtained in Example 10 (1) as a template.
  • the PCR reaction was performed using Takara LA Taq (Takara Shuzo) and a PCR amplification device (Biometra T Gradient). Denaturation was performed at 98 ° C for 20 seconds and annealing and extension were performed at 68 ° C for 2 minutes. I turned around again.
  • DNA fragment-E3 a DNA fragment of about 1.5 kbp including tpmA and tpmB (hereinafter, referred to as DNA fragment-E3) was amplified.
  • DNA fragment-E3 was recovered from this PCR amplification reaction solution by SUPREC PCR (Takara Shuzo).
  • DNA fragment-E3 obtained in (1) above is digested with restriction enzymes Ndel and Spel, and the obtained DNA fragment-E3 digest and plasmid digest are combined with DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo) Were connected.
  • plasmid pTC-tpmAB a plasmid of about 9.5 kbp in which the DNA fragment containing both tpmA and tpmB-E3 and the plasmid pT7NS-CamAB were linked was constructed.
  • E. coli BL21 (DE3) competent cells (Novagen) were transformed using the plasmid pTC-tpmAB prepared in Example 11 (2).
  • Escherichia coli BL21 (DE3) / pTC-tpmAB strain transformed with plasmid pTC-tpmAB was obtained.
  • BL21 (DE3) / pT7NS-CamAB frozen seeds were grown on 3 mL of L-Broth medium (1.0% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl) containing 50 ⁇ g / mL ampicillin.
  • the cells were inoculated into a 15 mL test tube and shake-cultured at 37 ° C for 20 hours.
  • Add 500 L of this seed culture to a 250 mL volume of 50 mL of L-Broth medium (1.0% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl) containing 50 ⁇ g / raL of ampicillin.
  • BL21 in E. coli BL21 (DE3) / P T7NS- CamAB strain as a control includes whereas not obtained peak of 11107D, a tpmA and tpmB (DE3) / pTC - In tpmAB strain, the peak of 11107D was gotten. This suggests that tpmA and tpmB are involved in the conversion of 11107B to 11107D.
  • Example 1 ⁇ 3 Conversion of 11107H into 11107CB represented by the following formula using a self-cloning strain
  • Stabilizer rose 2.0%, glucose 2 ⁇ 0 ° / ⁇ , soy flour (Honen Soipuro) 2.0% yeast extract 0.5%, to prepare a medium pH 7. 4 consisting of CaC0 3 0. 32% Then, 25 mL of the medium was placed in a 250-raL triangular flask, and sterilized by heating at 121 ° C for 20 minutes. After adding thiostrepton to this medium to a final concentration of 25 mg / L, the A-1544 / pIJOMG strain was inoculated at 1% from the frozen seed mother, and the seed mother was cultured at 28 ° C and 220 rpm for 3 days.
  • 1% of this seed culture was added to a medium having the same composition, and main culture was performed at 28 ° C and 220 rpm for 2 days. After completion of the main culture, the cells were collected from the culture by centrifugation, and suspended in 20 mL of a pH 6.5 phosphate buffer. Substrate 11107H (100 g / L DMS0 solution) was added to the cell suspension to a final concentration of 2000 mg / L, and a conversion reaction was performed at 28 ° C and 220 rpm for 16 hours.
  • Example 14 Using a self-cloning strain, 11107L represented by the following formula:
  • transformant reaction solution Prepare a pH 7.4 culture medium consisting of 2.0% Stabilose, 2.0% glucose ⁇ / ⁇ , 2.0% soybean flour (Honen Soypro), 0.5% yeast extract, and 0.32% CaC03, and add 25mL of medium to a 250mL triangular flask. And heat sterilized at 121 ° C for 20 minutes. After adding thiostrepton to this medium to a final concentration of 25 mg / L, the A-1544 / pIJDMG strain was inoculated at 1% from the frozen seed, and the seed was cultured at 28 ° C, 220 rpm for 3 days. .
  • 1% of this seed culture was added to a medium having the same composition, and main culture was performed at 28 ° C and 220 rpm for 2 days. After completion of the culture, the cells were collected from the culture broth by centrifugation, and suspended in 20 mL of a pH 6.5 phosphate buffer. To this cell suspension was added 11107 L of a substrate (100 g / L DMS0 solution) so as to have a final concentration of 1600 mg / L, and a conversion reaction was performed at 28 ° C. and 220 rpm for 16 hours.
  • a substrate 100 g / L DMS0 solution

Abstract

本発明は、マクロライド系化合物11107Bの水酸化に関与するＤＮＡおよびマクロライド系化合物11107Dの新規な生産方法を提供する。詳しくは、本発明は、式（Ｉ）で示されるマクロライド系化合物11107Bの、式（II）で示される16位水酸化マクロライド系化合物11107Dへの生物学的変換に関与するＤＮＡであって、16位水酸化酵素活性を有するタンパク質またはフェレドキシンをコードするＤＮＡ、その単離方法、そのＤＮＡによりコードされるタンパク質、そのＤＮＡを担持するプラスミド、そのプラスミドで形質転換した形質転換体およびその形質転換体を用いた１６位水酸化マクロライド系化合物の生産方法に関する。

Description

マクロライド系化合物の水酸化に関与する D N A 技術分野
本発明はマクロライド系化合物の水酸化に関与する D N A、 その単離方法、 そ の D NAによりコードされるタンパク質、 その D NAを担持するプラスミ ド、 そ のプラスミドで形質転換した形質転換体およびその形質転換体を用いた 1 6位水 酸化マク口ライド系化合物の生産方法に関する。 従来技術
式 (Π)
Figure imgf000003_0001
11蘭 (ii) で表される 12員環マク口ライド系化合物 11107Dは、 優れた抗腫瘍活性を有する 12員環マクロライド系化合物であり、 式 （I )
Figure imgf000003_0002
11107B (I) 7906
で表される 12員環マクロライド系化合物 11107Bとともにス トレプトミセス ェ スピー（Streptomyces sp. ) Mer- 11107株の培養物より見出されている（W0
02/060890)。 マクロライド系化合物 11107Dは、 マクロライド系化合物 11107Bの 16位水酸ィ匕体に相当するが、 その生産性はマクロライド系化合物 11107Bの生産 性よりも低く、 効率的な製造方法の確立が望まれていた。 発明の開示
本発明の課題は、 マクロライド系化合物 11107Bの水酸化に関与する DNAを 見出し、 マクロライド系化合物 11107D の新規な生産方法を提供することにある。 本発明は、 以下の [1] 〜 [15] に関する。
[1] ：式 （I)
Figure imgf000004_0001
11107B (i) で示されるマクロライド系化合物 （以下マクロライド系化合物 11107Bという） の、
式 （II)
Figure imgf000004_0002
で示される 16位水酸化マク口ライド系化合物 （以下マクロライド系化合物
11107Dという） への生物学的変換に関与する DNAであって、 16位水酸化酵素 活性を有するタンパク質もしくはフェレドキシンを一部にもしくは全体としてコ 一ドする DN Aまたはその改変体を含んでなる単離された純粋な DNA。
[2] ：下記の（a)、 （b)または（c)で示される [1] 記載の DNA。
(a) マクロライド系化合物 11107Bの 16位水酸化酵素活性を有するタンパク 質をコードする DN Aであって、 配列番号 1の塩基 1322から塩基 2548までの連 続した塩基配列、 配列番号 2の塩基 420から塩基 1604までの連続した塩基配列 および配列番号 3の塩基 172から塩基 1383までの連続した塩基配列からなる群 より'選択される DNA。
(b) 前記（a)で示される DNAの改変体であって、
(i) 前記（a)で示される DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダイズし、 かつ、
(ii) マクロライド系化合物 11107Bの 16位水酸化酵素活性を有するタンパク質 をコードする DNA。
(c) 遺伝子コドンの縮重のため、 前記 (a)に示される DNAとストリンジェン トな条件下でハイブリダイズしないが、 前記 (a)または（b)で示される DNAによ りコードされるタンパク質と同じアミノ酸酉己列を有するタンパク質をコードする DNA。
[3] ： [2] 記載の DNAによりコードされるタンパク質。
[4] ： [2] の DNAを担持する自立複製性または組み込み複製性の組み換 えプラスミド。
[5] ： [4] の組み換えプラスミ ドで形質転換した形質転換体。
[6] ： [2] に記載された DNAまたはその一部からなる DNAをプローブ またはプライマーとして用いることを特徴とする、 マクロライド系化合物 11107B の 16位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする DN Aの単離方法。
[7] ：下記の（d)、 （e)または (f)で示される [1] 記載の DNA。
(d) フ: tレドキシンをコードする DNAであって、 配列番号 1の塩基 2564カ ら塩基 2761までの連続した塩基配列、 配列番号 2の塩基 1643から塩基 1834ま での連続した塩基配列および配列番号 3の塩基 1399から塩基 1593までの連続し た塩基配 からなる群より選択される DNA。
(e) 前記（d)で示される DNAの改変体であって、
(i) 前記（d)で示される DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、 かつ、
(ii) フェレドキシン機能を有するタンパク質をコードする DNA。
(f) 遺伝子コドンの縮重のため、 前記 (d)に示される DNAとストリンジェン 卜な条件下でハイプリダイズしないが、 前記 (d)または（e)で示される DNAによ りコードされるタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする DNA。
[8] ： [7] 記載の DNAによりコードされるタンパク質。
[9] ： [7] 記離の DN Aを担持する自立複製性または組み込み複製性の組 み換えプラスミ ド。
[10] ： [9] 記載の組み換えプラスミ ドで形質転換した形質転換体。
[1 1] ： [7] に記載された DNAもしくはその一部からなる DNAをプロ ーブまたはプライマーとして用いることを特徴とする、 フェレドキシン機能を有 するタンパク質をコードする DN Aの単離方法。
[12] ： [5] または [10] 記載の形質転換体を培地で培養し、 培養中又 は培養後に、 増殖した形質転換体と、 式 （ΙΠ)
Figure imgf000006_0001
〔式中、 Wは を表す；
Figure imgf000007_0001
R12、 R16b、 R17a、 R17b、 R18、 R20a、 R20b、 R21aおよび R2 同一または異なって、
(1) 水素原子、
(2) 置換基を有していても良い 22アルキル基、
(3) -OR (式中、 Rは
• 1) 水素原子、
置換基を有していても良い、
2) C 22アルキル基、
3) C 7一 22ァラルキル基、
4) 5員環ないし 14員環へテロァリールォキシアルキル基、
5) C2— 22アルカノィル基、
6) C7— 1 5ァロイノレ基、
7) C3_ 23不飽和アルカノィル基、
8) —CORc。 （式中、 Rc。は置換基を有していても良い、
8-1) 5員環ないし 14員環へテロアリール基、
8-2) C卜 22アルコキシ基、
8-3)不飽和 C 2— 22アルコキシ基、
8-4) C 6 _ 4ァリールォキシ基、
8-5) 5員環ないし 14員環へテロアリールォキシ基、
もしくは
8-6) 3員環ないし 14員環含窒素非芳香族複素環を表す） 、
9) C卜 22アルキルスルホニル基、
10) c6— 14ァリールスルホニル基
または 2004/017906
1 1) 一 S i Rs lRs 2Rs3 (式中、 Rs l、 Rs 2および Rs 3は同一または異 なって、 じ ^ァルキル基またはじ ァリール基を表す） を表す） 、
(4) ハロゲン原子
または
Figure imgf000008_0001
{式中、 RMは単結合または一〇一 CO—を表す；
RN1および RN2は
1) 同一または異なって、
1 - 1)水素原子もしくは
• 1 - 2)置換基を有していても良い、
ω 22アルキル基、
(ii) 不飽和 C2_22アルキル基、
(iii) C 2ー22アルカノィル基
(iv) C7— 15ァロイル基、
(v) 不飽和 C 3一 23アルカノィル基、
(vi) 〇6_14ァリール基、
(vii) 5員環ないし 14員環へテロアリール基、
(viii) C7_22ァラルキル基、
(ix) C — 22アルキルスルホニル基もしくは
(X) C6_14ァリールスルホニル基を表すか、
または
2) RN1.および RN2は結合する窒素原子と一緒になって置換基を有していて も良い 3員環ないし 14員環含窒素非芳香族複素環を形成する） を表す；
ただし、
R21 aおよび R21bは一緒になつて、 （i)ケトン構造 （=0) または（ii)ォキシ ム構造 {=NOR。x (式中、 R。xは置換基を有していても良い、 C — 22アルキ ル基、 不飽和 C2— 22アルキル基、 C6— 14ァリール基、 5員環ないし 14員環へ テロアリール基または C7_。2ァラルキル基を表す） } を形成しても良い； R16aは水素原子を表す；
R21 cは
(1) 水素原子または
(2)
Figure imgf000009_0001
(式中、 R22a、 R22bおよび R22cは同一または異なって、
• 1 ) 水素原子、
2) Ci— 6アルキル基、
3) —OR (式中、 Rは前記の意味を有する） 、
4) 一 RM— NRN1RN2 (式中、 RM、 RN1および RN2は前記の意味を有す る） または
5) ハロゲン原子
を表す；
あるいは、
R21aおよび R21bのどちらか一方と R22aおよび R22bのどちらか一方とが一 緒になって部分構造 orR21b)
Figure imgf000009_0002
を形成しても良い；
Gmは
(1) 式 （GM- 1) で示される基 P T/JP2004/017906
Figure imgf000010_0001
{式中、
R 2および R 1 Qは同一または異なつて、 水素原子または C i _ 22アルキル基を表 す；
R3a、 R3b、 R5a、 R5b、 R6aおよび R6bは同一または異なって、
1) 水素原子、
2) ヒドロキシ基、 .
3) 置換基を有していても良い、
3- -1) — アルキル基、
3- -2) 22アルコキシ基、
3- -3) C 4ァリールォキシ基
3- -4) 5員環ないし 14員環へテロァリールォキシ基、
3- -5) C 2 22アルカノィルォキシ基、
3- -6) c 7— 15ァロイルォキシ基
3- -7) C3-23不飽和アルカノィルォキシ基、
3- -8) -OCORco (式中、 Rc。は前記の意味を有する）
3- -9) C 1- 22アルキルスルホニルォキシ基、
3-10) C6 14ァリールスルホニルォキシ基
もしくは
3-11) -OS i Rs lRs2Rs 3 (式中、 Rs l、 R s 2および R s 3は前記の意味 を有する） 、
4) ハロゲン原子 または
5) 一 RM— NRN1RN2 (式中、 RM、 RN1および RN2は前記の意味を有す る） を表す；
あるいは、
R5aおよび R5bは一緒になつてケトン構造 （=〇） を形成しても良い； あるいは、
R 6 aおよび R 6 bは一緒になつて、 スピロォキシラニル基またはェキソメチレ ン基を形成しても良い；あるいは、
R7aおよび R7bは同一または異なって、 水素原子または一〇RH (式中、 RH は水素原子、 22アルキル基または C2— 22アルカノィル基を表す） を表す） 、 (2) 式 （GM-II) で示される基
Figure imgf000011_0001
(式中、 R2、 R3a、 R3b、 R6a、 R6b、 R7a、 尺 ぉょぴ！^ ま式 （GM- 1) の定義と同義である） 、
(3) 式 （GM- III) で示される基
(GM-ΙΠ)
Figure imgf000011_0002
(式中、 R2、 R5a、 R5b、 R6a、 R6b、 R7a、 R7bおよび R10は式 （GM—ェ) の定義と同義である） 、
(4) 式 （GM - IV) で示される基
Figure imgf000012_0001
(式中、 R2、 R6a、 R7a、 R7bおよび R10は式 （GM - 1) の定義と同義であ る）
または
(5) 式 （GM-V) で示される基
Figure imgf000012_0002
(式中 R2 R3a、 R6a、 R6bおよび R10は式 （GM-I) の定義と同義であ る） を表す〕 ' '
で示されるマクロライド系化合物とを接触させ、 式 （IV)
Figure imgf000012_0003
(式中、 w、 R12、 R16b、 R17a、 R17b、 R20a、 R20b、 R2l a、 R21 b、 R21 cおよぴ&∞は式 （III) の定義と同義を表す）
で示され ¾16位水酸化マク口ライド系化合物に変換し、 こうして変換された 16位 水酸化マクロライド系化合物を採取することを特徴とする 16位水酸化マクロライ ド系化合物の生産方法。
[13] ：形質転換体が、 [ 5 ] 記載の形質転換体であり、 かつフュレドキシ ンをコードする DNAを有する形質転換体である [12] 記載の生産方法。
[14] ：式 (III— a)
Figure imgf000013_0001
R5'は水素原子またはァセトキシ基、 R6'は水素原子またはヒドロキシ基、 R 7'は水素原子またはァセチル基を表す） で示される化合物を、 式 (IV-a)
Figure imgf000013_0002
(式中、 906
^4 、
W' 、 R5'、 R6 'および R7'は式 （III- a) の定義と同義である） で示される化 合物に変換することを特徴とする [12] 記載の生産方法。
[1 5] ：式 （III- a) の化合物の、 式（IV- a)の化合物への変換において、 (1)
Figure imgf000014_0001
R5'、 R6'および R7'が水素原子である化合物、
(2)
が単結合、 w' が
Figure imgf000014_0002
1 5'ぉょぴ1 6'が水素原子、 R7'がァセチル基である化合物、
(3)
HL 八
5—4 が単結合、 W' が
R5'および R7'が水素原子、 R6'がヒドロキシ基である化合物、
(4)
H / Q H
が単結合、 w' が y^
R5'が水素原子、 R6'がヒドロキシ基、 R7'がァセチノレ基である化合物、
(5)
5-4 が単結合、 W が二重結合、 R5'、 R6'および R7'が水素原子である化合物、 (6) が単結合、
W' が二重結合、 R5'および R6'が水素原子、 R7'がァセチル基である化合物、 (7)
5-4 が単結合、
W' が二重結合、 R5'および R7'が水素原子、 R6'がヒドロキシ基である化合 物、'
(8)
5-4 が単結合、
W' が二重結合、 R5'が水素原子、 R6'がヒドロキシ基、 R7'がァセチル基で ある化合物、
(9)
Hゝ八 H
5 4 が二重結合、 W， が 1 、
R5'および R7'が水素原子、 R6'がヒドロキシ基である化合物、
(10)
Ή 八 H
5 4 が二重結合、 W， が 、
R5'が水素原子、 R6'がヒドロキシ基、 R7'がァセチル基である化合物、 (11) 0 H
5—4 が単結合、 W' が
R5'がァセトキシ基、 R6'がヒドロキシ基、 R7'が水素原子である化合物およ び
(12)
Figure imgf000016_0001
R5'がァセトキシ基、 R6'がヒドロキシ基、 R7'がァセチル基である化合物 からなる群から選択される化合物を対象とする [14] 記載の生産方法。
[16] ： [5] または [10] 記載の形質転換体を、 16位水酸化マクロラ ィド系化合物の生産に用いる用途。
本発明により、 マクロライド系化合物 11107Bの 16位水酸化酵素活性を有するタ ンパク質またはフェレドキシンをコードする DN Αを単離して、 その塩基配列を 決定することができ、 更に、 その DNAを担持するプラスミ ド、 そのプラスミド で形質転換した形質転換体を作成し、 その形質転換体を用いて、 16位水酸化マ クロライド系化合物を効率よく生産することができた。
以下、 本発明の実施の形態について詳細に説明する。
マクロライド系化合物 11107Bからマクロライド系化合物 11107Dへ変換する能力を 有する微生物
本発明に.おいては、 マクロライド系化合物 11107Bからマクロライド系化合物 11107Dへ変換する能力を有する微生物を培養した培養液から集めた菌体から、 16 位水酸化酵素活性を有するタンパク質またはフュレドキシンを一部にまたは全体 としてコードする DN Aを単離し、 塩基配列を決定することができる。 そして、 この D N Aを担持する自立複製性または組み込み複製性の組み換えブラスミドを 構築し、 そのプラスミドを用いて形質転換体を調製する。
このようにして調製した形質転換体を培地で培養し、 培養中又は培養後に、 増 せ '
殖した形質転換体と、 前記式 （III) で表されるマクロライド系化合物を接触さ せることにより、 式 (IV)で表される 16位水酸ィヒマクロライド系化合物に変換し、 変換された 16位水酸化マク口ライド系化合物を採取することにより、 16位水酸化 マクロライド系化合物を得ることができる。
マクロライド系化合物 11107Bからマクロライド系化合物 11107Dへ変換する能 力を有する微生物としては、 このような能力を有するものであれば、 種および株 の種類を問うことなく使用できるが、 好ましい微生物として、 いずれも土壌から 分離されたストレプトミセス エスピー（Streptomyces sp. ) Mer - 11107、 A- 1544 株や、 未同定の放線菌 A-1560株を挙げることができる。
尚、 Streptomyces sp. Mer - 11107は、 FERM P - 18144として平成 12年 12月 19 日付で日本国 305-8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号在の工業技術院生命ェ 学工業技術研究所に寄託され、さらに平成 13年 11月 27日付で日本国 305-8566 茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6在の独立行政法人産業技術総合研究所、 特許生物寄託センター（IP0D)において、国際寄託 FERM BP-7812に移管された。 A- 1544株は、 FERM P - 18943として平成 14年 7月 23日付で日本国 305 - 8566茨城県 つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許 生物寄託センターに寄託され、 さらに平成 15年 7月 30日付で日本国 305 - 8566 茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6在の独立行政法人産業技術総合研究所、 特許生物寄託センター（IP0D)において、国際寄託 FERM BP- 8446に移管された。 A- 1560株は、 FERM P- 19585として平成 15年 11月 13日付で日本国 305-8566茨城 県つくば市東 1丁目 1番 3号在の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、 さらに平成 16年 8月 19日付で日本国 305-8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター (IP0D)に おいて、国際寄託 FERM BP-10102に移管された。
上記菌株の菌学的性状は次のとおりである。
[Mer-11107株の菌学的性状]
(1) 形態
基生菌糸より螺旋状 （Spirales) の気中菌糸を伸長する。 成熟した気中菌糸の
15 訂 -された用紙 (規爾 91) 先に 10〜20個程度の円筒形の胞子からなる胞子鎖を形成する。 胞子の大きさは 0. 7 X 1. 0 ;u m位で、 胞子の表面は平滑 （smooth) を示し、 胞子のう、 菌核、 鞭毛 などの特殊な器官は認められない。
(2) 各種培地における生育状態
各種培地上で 28°C、 2週間培養後の培養性状を以下に示す。 色調の記載はトレ ズナ一のカラー ·ホイールズ （Tresnerの Color wheels)の色標名と括弧内に示 す符号で表杀する。
1) イース ト '麦芽寒天培地
生育は良好で、 その表面に気中菌糸を着生し、 灰色の胞子 (Light gray ； が 見ちれる。 培養裏面は Light melon yellow (3ea)である。 溶解性色素は産生しな い。
2) オートミール寒天培地
生育は中程度で、 その表面に気中菌糸を僅かに着生し、 灰色の胞子 (Gray ； g) が見られる。 培養裏面は Nude tan (4gc)または Putty (1 1/2 ec)である。 溶解 性色素は産生しない。
3) スターチ '無機塩寒天培地
生育は良好で、 その表面に気中菌糸を着生し、 灰色の胞子（Gray ； e)が見られ る。 培養裏面は Fawn (4ig)または Gray (g)である。 溶解性色素は産生しない。
4) グリセリン. ァスパラギン寒天培地
生育は良好で、 その表面に気中菌糸を着生し、 白色の胞子 (White ； a)が見ら れる。 培養裏面は Pearl pink (3ca)である。 溶解性色素は産生しない。
5) ペプトン 'イースト '鉄寒天培地
生育は悪く、 その表面に気中菌糸を着生しない。 培養裏面は Light melon yellow (3ea)である。 溶解性色素は産生しない。
6) チロシン寒天培地
生育は良好で、 その表面に気中菌糸を着生し、 白色の胞子 (White ； a)が見ら れる。 培養裏面は Pearl pink (3ca)である。 溶角性色素は産生しない。
(3) 各種炭素源の同化性 プリ一ドハム ' ゴトリーブ寒天培地に各種の炭素源を加え、 28°C、 培養 2週間 後の生育状況を以下に示す。
1) L—ァラビノース 土
2) D-キシロース ±
3) D-グルコース +
4) D—フノレクトース +
5) シユークロース +
6) イノシトール +
7) L—ラムノース 一
8) D—マンニトール +
9) ラフイノース +
(+は同化する、 土は多少同化する、 一は殆ど同化しない。 ）
(4) 生理学的諸性質
本菌の生理学的諸性質は以下の通りである。
(a)生育温度範囲 （イース ト '麦芽寒天培地、 2週間培養） ： 12°C〜37°C
(b)最適温度範囲 （イース ト '麦芽寒天培地、 2週間培養） ： 21°C~33°C
(c)ゼラチンの液化 （グルコース 'ペプトン 'ゼラチン培地） ：陰性
(d)ミルクの凝固 （スキムミルク培地） ：陰性
(e)ミルクのぺプトン化 （スキムミルク培地） ：陰性
(f)スターチの加水分解 （スターチ ·無機塩寒天培地） ：陽性
(g)メラニン様色素の産生 （ぺプトン 'イース ト '鉄寒天培地） ：陰性
(チロシン培地） ：陰性
(h)硫化水素の産生 （ぺプトン 'イースト '鉄寒天培地） ：陰性
(i)硝酸塩の還元 （0. 1%硝酸カリ含有ブロス） ：陰性
(j)食塩の耐性 （イース ト ·麦芽寒天培地、 2週間培養） ：食塩含有量 4%以下で 生育
(5) 菌体成分 一
本菌の細胞壁から LL -ジァミノピメリン酸及びグリシンが検出された。 [A- 1544株の菌学的性状]
(1) 形態
基生菌糸より螺旋状 (Spira type)の気中菌糸を伸長する。 成熟した気中菌糸の 先に 10 20個程度の円筒形の胞子からなる胞子鎖を形成する。 胞子の大きさは 1.0 1.2 1.4 111位で、 胞子の表面はトゲ状 （spiny)を示し、 胞子のう、 菌核、 鞭毛などの特殊な器官は認められない。
(2) 各種培地における生育状態
各種培地上で 28°C、 約 2週間培養後の培養性状を表 1に示す。 色調の記载はトレ ズナ一のカラー .ホイールズ （Tresnerの Color wheels) の色標名と括弧内に示す 符号で表示する。
表 1
Figure imgf000020_0001
(3) 各種炭素源の同化性 ·
プリードハム . ゴトリーブ寒天培地に各種の炭素源を加え、 28°C、 培養 2週間 後の生育状況を表 2に示す,
表 2
Figure imgf000021_0001
+ :同化する、 ± :多少同化する、一：殆ど同化しない
(4) 生理学的諸性質
本菌の生理学的諸性質は以下の通りである。
(a)生育温度範囲 (ィースト ·麦芽寒天培地、 2週間培養） ： 15°C〜41°C
(b)生育至適温度 (ィースト ·麦芽寒天培地、 2週間培養） ： 20°C〜37°C
(c)ゼラチンの液化（グルコース ·ペプトン ·ゼラチン培地） ：陽性
(d)ミルクの凝固（スキムミルク培地） ：陽性
(e)ミルクのぺプトン化（スキムミルク培地） ：陽性
(f)スターチの加水分解 (スターチ ·無機塩寒天培地） ：陽性
(g)メラニン様色素の産生 (ぺプトン ·イースト '鉄寒天培地） ：陽性
(チロシン培地） ：陰性
(h)硫化水素の産生 (ペプトン ·イース ト '鉄寒天培地） ：陽性
(i)硝酸塩の還元 (0. 1%硝酸カリゥム含有ブロス） ：陰性
(j)食塩の耐性 (ィースト ·麦芽寒天培地、 2週間培養） ：食塩 有量 7 %以下で 生育
(5) 菌体成分
本菌の細胞壁から LL型のジァミノピメリン酸が検出された。
本発明の DNA
本発明者らは、 上記微生物からマクロライド系化合物の 16位水酸ィ匕に関与す る DNA、 すなわち 16位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする DNAおよ びフェレドキシン機能を有するタンパク質をコードする DNAを単離し、 その塩基 配列を決定した。 以下、 16位水酸ィヒ酵素活性を有するタンパク質をコードする DNAおよびフェレドキシン機能を有するタンパク質をコードする DNA を総称して、 「16位水酸化酵素関連 DNAJ ということもある。
本発明の 16位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコ一ドする DNAは、 下記 (1-1)、 (1-2)またはひ- 3)で示されるものである。
(1-1) 配列番号 1の塩基 1322から塩基 2548までの連続した塩基配列、 配列 番号 2の塩基 420から塩基 1604までの連続した塩基配列および配列番号 3の塩 基 172から塩基 1383までの連続した塩基配列からなる群より選択される DNA。
(1-2) 前記（1 - 1)で示される DNAの改変体であって、
(i)前記（1-1)で示されるいずれかの DNAとストリンジェントな条件下でハイブリ ダイズする塩基配列であり、 かつ、
(ii) マクロライド系化合物の 16位水酸ィヒ酵素活性を有するタンパク質をコード する DNA。
(1-3) 遺伝子コドンの縮重のため、 前記 （1-1) に示されるいずれの DNAとも ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、 前記（1-1)または （1-2) で示される DNAによりコードされるタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタン パク質をコードする DNA。
なお、 「16位水酸化酵素活性」 とは、 前記式 （I ) で示されるマクロライド系 化合物 11107Bの 16位を水酸化し、 前記式 (II)で示されるマクロライド系化合物 11107Dへ変換する酵素活性を意味する。
また本発明のフェレドキシン機能を有するタンパク質をコードする DNAは、 下 記（2-1)、 （2 - 2)または（2-3) で示されるものである。
(2-1) フェレドキシンをコードする DNAであって、 配列番号 1の塩基 2564か ら塩基 2761までの連続した塩基配列、 配列番号 2の塩基 1643から塩基 1834ま での連続した塩基配列および配列番号 3の塩基 1399から塩基 1593までの連続し た塩基配列からなる群より選択される DNA。
(2-2) 前記（2-1)で示される DNAの改変体であって、
(i)前記 (2-1)で示される DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつ、
(ii) フェレドキシン機能を有するタンパク質をコードする DNA。
(2-3) 遺伝子コドンの縮重のため、 前記（2-1)に示される DNAとストリンジェ ントな条件下でハイブリダイズしないが、 前記（2 - 1)または（2-2)で示される DNA によりコードされるタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコード する DNA。
なお、 「フェレドキシン機能」 とは、 前記 16位水酸化酵素へ電子を伝達し、 前記 16位水酸化酵素とともに水酸化反応を担うタンパク質機能を意味する。
また前記 DNAの説明における 「ストリンジェントな条件下でハイプリダイズす る塩基配列」 とは、 前記（1-1)または（2-1)のいずれかの DNAをプローブとして使 用し、 コロニーハイプリダイゼーシヨン法、 プラークハイプリダイゼーシヨン法, あるいはサザンプロットハイブリダィゼーション法等を用いることにより得られ る DNAの塩基配列を意味し、 例えば、 コロニーあるいはプラーク由来の DNA又は 該 DNAの断片を固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜1· 0Mの NaCl存在下、 65°Cでハイブリダイゼーションを行つた後、 0. 1〜 2 X SSC溶液（1 X SSC溶液は、 150raM塩化ナトリウム、 15mMクェン酸ナトリゥム）を用い、 65°C条件下でフィルタ 一を洗浄することにより同定できる DNA等を挙げることができる。 ハイプリダイ でーシヨンは、 Molecular Cloning: A laboratory Mannua丄, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. , 1989 (以下、 モレキユラ 一.クローニング第 2版と略す） 等に記載されている方法に準じて行うことができ る。
ストリンジ ントな条件下でハイプリダイズする DNAとしては、 プローブとし て使用する DNAの塩基配列と一定以上の相同性を有する DNAが挙げられ、 例えば 80%以上、 好ましくは 85%以上、 より好ましくは 90%以上、 さらに好ましくは 95%以上、 最も好ましくは 98%以上の相同性を有する DNAが挙げられる。
本発明の 16位水酸化酵素関連 DNAの取得方法は特に限定されない。 本明細書 中の配列表の配列番号 1、 配列番号 2または配列番号 3に記載した塩基配列の情 報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、 それらを用いて放線菌に属 する微生物の DNAライブラリーをスクリーニングすることにより本発明の DNAを 単離することができる。 DNAライブラリ一は、 前記の 16位水酸化酵素活性を発現 している微生物から常法により作製することができる。
また PCR法により本発明の 16位水酸化酵素関連 DNAを取得することもできる。 上記した微生物由来の DNAライブラリーを铸型として使用し、 配列番号 1、 配列 番号 2または配列番号 3に記載したいずれかの塩基配列を増幅できるように設計 した 1対のプライマーを用いて PCRを行う。 PCRの反応条件は適宜設定すること ができ、 例えば、 94°Cで 30秒間 （変性） 、 55°Cで 30秒〜 1分間 （ァニーリン グ） 、 72°Cで 2分間 （伸長） からなる反応工程を 1サイクルとして、 例えば 30 サイクル行った後、 72°Cで 7分間反応させる条件などを挙げることができる。 次 いで、 増幅された DNA断片を、 適当な宿主中で増幅可能なベクター中にクロー二 ングすることができる。
上記したプローブ又はプライマーの調製、 DNAライブラリーの構築、 DNAライ ブラリーのスクリーニング、 並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業 者に既知であり、 例えば、 モレキュラークローニング第 2版、 Current
Protocols in Molecular Biology, supplement 1〜 8, John Wiley & Sons (1987 - 1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。
本発明のタンパク質の取得方法は特に制限されず、 化学合成により合成したタ ンパク質でもよいし、 遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質で もよい。 組み換えタンパク質を作製する場合には、 先ず、 本明細書の上記に記载 した当該タンパク質をコードする DNAを取得する。 この DNAを適当な発現系に導 入することにより、 本発明のタンパク質を産生することができる。 発現系でのタ ンパク質の発現については本明細書中後記する。
本発明の組み換えベクター
本発明の DNAは適当なベクター中に挿入して使用することができる。 本発明で 用いるベクターの種類は特に限定されず、 例えば、 自立的に複製するベクター
(例えばプラスミ ド等） でもよいし、 あるいは、 宿主細胞に導入された際に宿主 細胞のゲノムに組み込まれ、 組み込まれた染色体と共に複製されるものであって JP2004/017906
もよい。 発現ベクターにおいて本発明の DNAは、 転写に必要な要素 （例えば、 プ 口モーター等） が機能的に連結されている。 プロモーターは宿主細胞において転' 写活性を示す DNA配列であり、 宿主の種類に応じて適宜選択することができる。 本発明の形質転換体及びそれを用いた組み換えタンパク質の製造
本発明の DM又は組み換えべクターを適当な宿主に導入することによって形質 転換体を作製することができる。 本発明の DNAまたは組み換えベクターが導入さ れる宿主細胞は、 本発明の遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、 細菌、 酵母、 真菌および高等真核細胞等が挙げられる。 細菌細胞の例としては、 バチルスまた はストレブトミセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。 これら細菌の形質転換は、 プロトプラスト法、 エレク ト口ポレーシヨン法または その他の公知の方法でコンビテント細胞を用いることにより行えばよい。 例えば、 エレクトロポレーシヨン法は以下のように行うことができる。 外来遺伝子が揷入 されたプラスミ ドをコンビテント細胞の懸濁液に加え、 この懸濁液をエレクトロ ポレーシヨン法専用のキュべットに入れ、 そのキュべットに高電圧の電気パルス をかける。 その後選択培地で培養し、 平板寒天培地上で形質転換体を単離する。 酵母細胞の例としては、 サッカロミセスまたはシゾサッカロミセスに属する細 胞が挙げられ、 例えば、 サッカロミセス 'セレビシェ（Saccharomyces
cerevisiae)またはサッカロ ^セス · クノレイへリ ( S accharomyces kluyveri)等力 Λ 挙げられる。 酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、 例えば、 エレ タ トロポレーシヨン法、 スフエロプラスト法、 酢酸リチウム法等を挙げることが できる。 他の真菌細胞の例は、 糸状菌、 例えばァスペルギルス、 ニューロスボラ、 フザリゥム； またはトリコデレマに属する細胞である。 宿主細胞として糸状菌を 用いる場合、 DNA構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることに より形質転換を行うことができる。 DNA構築物の宿生染色体への組み込みは、 公 知の方法に従い、 例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。 上記の形質転換体は、 導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄 養培地中で培養する。 形質転換体の培養物から、 本発明のタンパク質を単離精製 するには、 通常のタンパク質の単離、 精製法を用いればよい。 例えば、 本努明のタンパク質が、 細胞内に溶解状態で発現した場合には、 培養 終了後、 細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、 超音波破碎機等によ り細胞を破碎し、 無細胞抽出液を得る。 該無細胞抽出液を遠心分離することによ り得られた上清から、 通常のタンパク質の単離精製法、 即ち、 溶媒抽出法、 硫安 等による塩析法、 脱塩法、 有機溶媒による沈殿法、 ジェチルアミノエチル (DEAE) セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィ一法、 SP -
Sepharose FF (アマシャムバイォサイェンス社製）等のレジンを用いた陽ィオン交 換クロマトグラフィー法、 プチノレセファロース、 フエニノレセファロース等のレジ ンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフィ二 ティークロマトグラフィー法、 クロマトフォーカシング法、 等電点電気泳動等の 電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、 精製標品を得ることがで きる。
16位水酸化マクロライド系化合物の生産方法
本発明は、 16位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする DNA または フェレドキシン機能を有するタンパク質をコードする DNAを導入した形質転換体 を用い、 この形質転換体の存在下で前記式 (III)で表されるマクロライド系化合 物を水酸化させることを含む、 前記式 (IV)で表される 16位水酸ィヒマクロライド 系化合物の生産方法を包含する。
本発明の形質転換体で水酸化できるマクロライド系化合物は、 前記式 （ΙΠ) で表されるマクロライド系化合物 （前記式 （IV) で表されるマクロライド系化合 物） であり、 好ましくは、 前記式 （ΠΙ - a) で表されるマクロライド系化合物
(前記式 （IV - a) で表されるマクロライド系化合物） であり、 さらに好ましくは マクロライド系化合物 11107B (マクロライド系化合物 11107D) である。 なお、 括弧内は水酸化生成物である 16位水酸化マクロライド系化合物である。
形質転換体の存在下でマクロライド系化合物を水酸化させる条件は、 以下の通 りである。
まず形質転換体中の 16位水酸化酵素関連 DNAを必要により誘導物質を添加し 菌体内で発現させる。 これらの DNAが発現した菌体を基質である前記式 （III) で表されるマクロライド系化合物と接触させ、 変換反応をさせる。 変換反応の温 度は、 形質転換体の至適温度を考慮して、 適宜決定できる。 また反応時間も、 16 位水酸化マクロライド系化合物への変換率 （反応の進行度合い） 等を考慮して、 適宜決定することができる。 例えば、 20〜31°Cで、 1 〜 5日が好適である。 さら に、 反応様式は、 バッチ式でも連続式でも、 いずれの形式でも実施することがで きる。
生成した 16位水酸化マク口ライド系化合物の単離及び精製は、 一般に微生物 代謝産物をその培養液から単離するために用いられる分離、 精製の方法が利用で きる。 例えば、 メタノール、 エタノール、 アセトン、 ブタノール、 酢酸ェチル、 酢酸プチル、 クロ口ホルム、 トルエン等を用いた有機溶媒抽出、 ダイヤイオン HP- 20などの疎水性吸着樹脂を用いた吸脱着処理、 セフアデックス LH- 20等を用 いたゲル濾過クロマトグラフィー、 活性炭、 シリカゲル等による吸着クロマトグ ラフィー、 もしくは薄層クロマトグラフィーによる吸脱着処理、 あるいは逆相力 ラム等を用いた高速液体ク口マトグラフィ一等の公知のあらゆる方法がこれにあ たる。 また、 ここに示した方法に特に限定されるものではない。 これらの方法を 単独あるいは任意の順序に組み合わせ、 また反復して用いることにより、 目的の 16位水酸化マクロライド系化合物を単離精製することができる。
尚、 本発明において、 D NAの改変体とは、 構成塩基の削除、 変換、 付加、 揷 入などにより修飾されたもの、 あるいはその誘導体を意味し、 もとのものと同じ 効果を発現する D N Aを意味する。 '
また、 本願明細書において用いる 「ハロゲン原子」 とは、 フッ素原子、 塩素原 子、 臭素原^"、 ヨウ素原子を意味する。
本願明細書において用いる 「じ 2 2アルキル基」 とは、 炭素数が 1ないし 2 2個の直鎖または分枝状アルキル基を示し、 例えばメチル基、 ェチル基、 n—プ 口ピル基、 i s 0—プロピル基、 n—ブチル基、 i s o—ブチル基、 s e c—ブ チル基、 t e r t—ブチル基、 n—ペンチル基、 1 , 1—ジメチルプロピル基、 1 , 2—ジメチルプロピル基、 2 , 2—ジメチルプロピル基、 1一ェチルプロピ ル基、 n—へキシル基、 1—ェチルー 2—メチルプロピル基、 1 ， 1 , 2—トリ メチルプ口ピル基、 1―メチルブチル基、 2—メチルブチル基、 1 , 1—ジメチ ルプチル基、 1 , 2—ジメチルプチル基、 2， 2—ジメチルブチル基、 1 , 3— ジメチルブチル基、 2 , 3—ジメチルブチル基、 1—ェチルプチル基、 2—ェチ ルプチル基、 2—メチルペンチル基、 3—メチルペンチル基、 n —へプチル基、 n—ォクチル基、 n—ノニル基、 n—デシル基等があげられ、 好ましくは炭素数 が 1ないし 6個の直鎖または分枝状アルキル基を示し、 例えばメチル基、 ェチル 基、 ： n—プロピノレ基、 i s o—プロピノレ基、 n—ブチル基、 i s o—ブチル基、 s e c—プチノレ基、 t e r tーブチノレ基等である。
本願明細書において用いる 「不飽和 C 2_2 2アルキル基」 とは、 炭素数 2ない し 2 2個の直鎖または分枝状アルケニル基、 あるいは炭素数が 2ないし 2 2個の 直鎖または分枝状アルキニル基を示し、 例えばビニル基、 ァリル基、 1一プロぺ ニル基、 イソプロぺニル基、 2—メチルー 1一プロぺニル基、 2—メチルー 2— プロぺニル基、 1—ブテニル基、 2—プテニル基、 3—プテニル基、 1一ペンテ ニル基、 1—へキセニル基、 1 ， 3 —へキサンジェニル基、 1 , 5 —へキサンジ ェニノレ基、 ェチェル基、 1—プロピニル基、 2—プロピニル基、 1—プチニル基、 2—プチ二ル基、 3—プチ二ル基、 1—ェチェル一 2—プロピニル基、 2—メチ ノレ一 2—プロピニル基、 1—ペンチニル基、 1—へキシニル基、 1 , 3 —へキサ ンジインィル基、 1 ， 5 —へキサンジインィル基等があげられ、 好ましくは炭素 数 2ないし 1 0個の直鎖または分枝状アルケニル基、 あるいは炭素数が 2ないし 1 0個の直鎖または分枝状アルキニル基を示し、 例えばビエル基、 ァリル基、 1 一プロぺニル基、 イソプロぺニル基、 ェチニル基、 1—プロピニル基、 2—プロ ピニル基、 .1—プチニル基、 2—プチ二ル基、 3—プチニル基等である。
本願明細書において用いる 「C 6 _ 1 4ァリール基」 とは、 6ないし 1 4個の炭 素原子で構成された芳香族炭化水素環式基を意味し、 例えば単環式基、 二環式基、 三環式基等の縮合環も含まれる。 例えばフエニル基、 インデニル基、 1一ナフチ ル基、 2—ナフチル基、 ァズレニル基、 ヘプタレニル基、 インダセニル基、 ァセ ナフチル基、 フルォレ -ル基、 フエナレニル基、 フエナントレニル基、 アントラ セニル基等があげられ、 好ましくはフエニル基、 1一ナフチル基、 2—ナフチル 基等である。
本願明細書における 「5員環ないし 1 4員環へテロァリール基」 とは、 窒素原 子、 硫黄 子および酸素原子からなる群より選ばれるヘテロ原子を 1個以上含ん でなる単環式、 二環式または三環式の 5ないし 1 4員芳香族複素環式基等をいう。 好適な例をあげると、 含窒素芳香族複素環式基としては、 例えばピロリル基、 ピ リジニル基、 ピリダジニル基、 ピリミジニル基、 ピラジュル基、 トリアゾリル基、 テトラゾリル基、 ベンゾトリァゾリル基、 ピラゾリル基、 イミダゾリル基、 ベン ツイミダゾリル基、 インドリノレ基、 イソインドリル基、 インドリジニル基、 プリ ニル基、 ィンダゾリル基、 キノリニル基、 イソキノリニル基、 キノリジニル基、 フタラジニル基、 ナフチリジニル基、 キノキサリニル基、 キナゾリニル基、 シン ノリニル基、 プテリジニル基、 ィミダゾトリアジニル基、 ビラジノピリダジニル 基、 ァクリジニル基、 フエナントリジニル基、 カルバゾリル基、 力ルバゾリニル 基、 ペリミジニル基、 フエナント口リニル基、 フエナシニル基、 イミダゾピリジ ニル基、 イミダゾピリミジニル基、 ピラゾ口ピリジニル基、 ピラゾ口ピリジニル 基等；含硫黄芳香族複素環式基としては、 例えばチェニル基、 ベンゾチェニル基 等'；含酸素芳香族複素環式基としては、 例えばフリル基、 ビラ二ル基、 シクロぺ ンタビラ二ル基、 ベンゾフリル基、 イソべンゾフリル基等； 2個以上の異種複素 原子を含んでなる芳香族複素環式基としては、 例えばチアゾリル基、 ィソチアゾ リル基、 ベンゾチアゾリル基、 ベンズチアジアゾリル基、 フエノチアジ二ル基、 イソキサゾリル基、 フラザニル基、 フエノキサジニル基、 ォキサゾリル基、 イソ キサゾィル基、 ベンゾォキサゾリル基、 ォキサジァゾリル基、 ビラゾロォキサゾ リル基、 ィミダゾチアゾリル基、 チェノフラニル基、 フロピロリル基、 ピリ ドォ キサジニル基等があげられ、 好ましくはチェニル基、 フリル基、 ピリジニル基、 ピリダジニル基、 ピリミジニル基、 ビラジニル基等である。
本願^細書において用いる 「3員環ないし 1 4員環含窒素非芳香族複素環」 と は、 窒素原子を 1個以上含む単環式、 二環式または三環式の 3ないし 1 4員環非 芳香族複素環をいう。 好適な例をあげると、 例えばアジリジニル基、 ァゼチジノレ 基、 ピロリジニル基、 ピロリル基、 ピペリジニル基、 ピペラジニル基、 ホモピぺ' 6
リジニル基、 ホモピペラジニル基、 イミダゾリル基、 ビラゾリジニル基、 イミダ ゾリジニル基、 モルホリニル基、 チオモルホリ -ル基、 ィミダゾリニル基、 ォキ サゾリニ/レ基、 キヌタリジニル基等があげられる。 また、 当該含窒素非芳香族複 素環には、 ピリ ドン環から誘導される基や、 非芳香族性の縮合環 （例えばフタル イミ ド環、 スクシンイミ ド環等から誘導される基） も含まれる。
本願明細書において用いる 「c2_22アルカノィル基」 とは、 前記定義の 「じ
_22アルキル基」 において、 その末端がカルボニル基である基を意味し、 例えば ァセチル基、 プロピオニル基、 プチリル基、 i s o—プチリル基、 バレリル基、 i s o—バレリル基、 ビバリル基、 力プロィル基、 デカノィル基、 ラウロイル基、 ミリストイル基、 パルミ トイル基、 ステアロイル基、 ァラキドイル基等があげら れ、 好ましくは炭素数 2ないし 6個のアルカノィル基であり、 例えばァセチル基、 プロピオニル基、 プチリル基、 i s o—ブチリル基等である。
本願明細書において用いる 「C7― 15ァロイル基」 とは、 前記定義の 「C6_14 ァリール基」 、 「5員環ないし 14員環へテロァリール基」 において、 その末端 にカルボニル基が結合した基を意味し、 例えばベンゾィル基、 1一ナフトイル基、 2—ナフトイル基、 ピコリノィル基、 ニコチノィル基、 イソニコチノィル基、 フ ロイル基等があげられる。
本願明細書において用いる 「C3_23不飽和アルカノィル基」 とは、 前記定義 の 「不飽和 C2_22アルキル基」 において、 その末端にカルボニル基が結合した 基を意味し、 例えばァクリロイル基、 プロピオロイル基、 クロトノィル基、 i s o—クロトノィル基、 ォレロイル基、 リノレノィル基等があげられ、 好ましくは 炭素数 2なレ、し 6個の不飽和アルカノィル基であり、 例えばァクリロイル基等で ある。
本願明細書において用いる 「C7_22ァラルキル基」 とは、 前記定義の 「じ卜 2
2アルキル基」 において、 置換可能な部分が前記定義の 「C6— 14ァリール基」 で 置換される 7ないし 22個の炭素原子で構成された基を意味し、 具体的には例え ばべンジル基、 フエネチル基、 3—フエニルプロピル基、 4一フエニルブチル基、 1一ナフチルメチル基、 2—ナフチルメチル基等があげられ、 好ましくは炭素数 7ないし 1 0個のァラルキル基であり、 例えばべンジル基、 フエネチル基等であ る。
本願明細書において用いる 「じ卜^アルコキシ基」 とは、 前記定義の 「じ 2
2アルキル基」 において、 その末端に酸素原子が結合した基を意味し、 好適な基 としては、 例えばメ トキシ基、 エトキシ基、 n—プロポキシ基、 i s o—プロボ キシ基、 n—ブトキシ基、 i s o—ブトキシ基、 s e c—ブトキシ基、 t e r t —ブトキシ基、 n—ペンチルォキシ基、 i s o—ペンチルォキシ基、 s e c—ぺ ンチノレオキシ基、 n—へキシルォキシ基、 i s o—へキシルォキシ基、 1 , 1— ジメチルプロポキシ基、 1 , 2—ジメチルプロポキシ基、 2 , 2—ジメチルプロ ポキシ基、 2—ェチルプロポキシ基、 1一ェチル— 2—メチルプロポキシ基、 1，
1 . 2—トリメチルプロポキシ基、 1 ， 2， 2—トリメチルプロポキシ基、 1 , 1ージメチルブトキシ基、 1， 2—ジメチルブトキシ基、 2 , 2—ジメチルブト キシ基、 2 , 3—ジメチルブトキシ基、 1 , 3—ジメチルブトキシ基、 2—ェチ ルブトキシ基、 1， 3—ジメチルブトキシ基、 2—メチルペンチルォキシ基、 3 一メチルぺンチルォキシ基、 へキシルォキシ基等があげられる。
本願明細書において用いる 「不飽和 C 2— 2 2アルコキシ基」 とは、 前記定義の 「不飽和 c 2_2 2アルキル基」 において、 その末端に酸素原子が結合した基を意 味し、 好適な基としては例えばビニロキシ基、 ァリロキシ基、 1一プロぺニルォ キシ基、 イソプロぺニルォキシ基、 2—メチルー 1一プロぺニルォキシ基、 2— メチルー 2—プロぺニルォキシ基、 1—ブテニルォキシ基、 2—ブテニルォキシ 基、 3—ブテニルォキシ基、 1一ペンテュルォキシ基、 1—へキセニルォキシ基、
1 . 3—へキサンジェニノレオキシ基、 1， 5—へキサンジェニノレオキシ基、 プロ パルギルォキシ基、 2—プチニルォキシ基等があげられる。
本願明細書において用いる 「〇6—1 4ァリールォキシ基」 とは、 前記定義の 「C 6— 1 4ァリール基」 において、 その末端に酸素原子が結合した基を意味し、 具体的には例えばフエノキシ基、 インデニルォキシ基、 1一ナフチルォキシ基、 2—ナフチルォキシ基、 ァズレニルォキシ基、 ヘプタレニルォキシ基、 インダセ ニルォキシ基、 ァセナフチルォキシ基、 フルォレニルォキシ基、 フエナレニルォ キシ基、 フエナントレニルォキシ基、 アントラセニルォキシ基等があげられる。 本願明細書において用いる 「5員環ないし 1 4員環へテロァリールォキシ基」 とは、 前貢己定義の 「5員環ないし 1 4員環へテロァリール基」 において、 その末 端に酸素原子が結合した基を意味し、 具体的には例えばピロリルォキシ基、 ピリ ジニルォキシ基、 ピリダジ -ルォキシ基、 ピリミジニルォキシ基、 ピラジニルォ キシ基、 トリァゾリルォキシ基、 テトラゾリルォキシ基、 ベンゾトリアゾリルォ キシ基、 ピラゾリルォキシ基、 イミダゾリルォキシ基、 ベンツイミダゾリルォキ シ基、 インドリルォキシ基、 イソインドリルォキシ基、 インドリジニルォキシ基 プリニルォキシ基、 インダゾリルォキシ基、 キノリニルォキシ基、 イソキノリニ ルォキシ基、 キノリジニルォキシ基、 フタラジュルォキシ基、 ナフチリジニルォ キシ基、 キノキサリニルォキシ基、 キナゾリニルォキシ基、 シンノリニルォキシ 基、 プテリジニルォキシ基、 イミダゾトリアジニルォキシ基、 ビラジノピリダジ ニルォキシ基、 アタリジニルォキシ基、 フエナントリジニルォキシ基、 カルバゾ リルォキシ基、 力ルバゾリニルォキシ基、 ペリミジニルォキシ基、 フエナント口 リニルォキシ基、 フエナシニルォキシ基、 イミダゾピリジニルォキシ基、 イミダ ゾピリミジニルォキシ基、 ビラゾロピリジニルォキシ基、 ピラゾ口ピリジニルォ キシ基、 チェニルォキシ基、 ベンゾチェエルォキシ基、 フリルォキシ基、 ビラ二 ルォキシ基、 シクロペンタビラニルォキシ基、 ベンゾフリルォキシ基、 イソベン ゾフリルォキシ基、 チアゾリルォキシ基、 イソチアゾリルォキシ基、 ベンゾチア ゾリルォキシ基、 ベンズチアジアゾリルォキシ基、 フエノチアジニルォキシ基、 イソキサゾリルォキシ基、 フラザニルォキシ基、 フエノキサジニルォキシ基、 ォ キサゾリル^"キシ基、 イソキサゾィルォキシ基、 ベンゾォキサゾリルォキシ基、 ォキサジァゾリルォキシ基、 ビラゾロォキサゾリルォキシ基、 ィミダゾチアゾリ ルォキシ基、 チェノフラニルォキシ基、 フロピロリルォキシ基、 ピリ ドォキサジ ニルォキシ基等があげられ、 好ましくはチェニルォキシ基、 フリルォキシ基、 ピ リジルォキシ基、 ピリダジルォキシ基、 ピリミジルォキシ基、 ビラジルォキシ基 である。
本願明細書において用いる 「 5員環ないし 1 4員環へテロァリールォキシアル キル基」 とは、 前記の C アルキル基に前記の 「5員環ないし 14員環へテロ ァリールォキシ基」 が置換した基を示す。
本願明細書において用いる 「。^22アルキルスルホ-ル基」 とは、 前記定義 の 「〇 22アルキル基」 が結合したスルホ -ル基を意味し、 具体的には例えば メタンスノレホニル基、 エタンスルホニル基、 n—プロノ ンスルホニル基、 i s o 一プロパンスルホニル基等があげられる。
本願明細書において用いる 「 C 4ァリールスルホニル基」 とは、 前記定義 の 「C6— 14ァリール基」 が結合したスルホ二ル基を意味し、 具体的には例えば ベンゼンスルホニル基、 1—ナフタレンスルホニル基、 2—ナフタレンスルホニ ル基等があげられる。
本願明細書において用いる 「じ 22アルキルスルホニルォキシ基」 とは、 前 記定義の 「Ci一 22アルキルスルホニル基」 において、 その末端に酸素原子が結 合した基を意味し、 例えば、 メチルスルホニルォキシ基、 ェチルスルホニルォキ シ基、 n—プロピノレスノレホニルォキシ基、 i s o—プロピルスルホニルォキシ基 等があげられる。
本願明細書において用いる 「置換基を有していても良い」 の置換基とは、
(1) ハロゲン原子、
(2) 水酸基、
(3) チオール基、
(4) ニトロ基、
(5) ニトロソ基、
(6) シァノ基、
(7) カルボキシル基、
(8) スルホニルォキシ基、
(9) アミノ基、
(10) Ci— 22アルキル基
(例えば、 メチル基、 ェチル基、 n—プロピル基、 i s o—プロピル基、 n—ブ チル基、 i s o—ブチル基、 s e c—プチル基、 t e r t一ブチル基等） 、 (1 1) 不飽和 C 2— 22アルキル基
(例えば、 ビニル基、 ァリル基、 1ープ eぺニル基、 イソプロぺニル基、 ェチニ ル基、 1一プロピニル基、 2—プロピニル基、 1—プチニル基、 2—プチニル基、 3—プチニル基等） 、
(12) C6— 1 4ァリール基
(例えば、 フエニル基、 1一ナフチル基、 2—ナフチル基等） 、
(13) 5員環ないし 14員環へテロァリール基
(例えば、 チェニル基、 フリル基、 ピリジニル基、 ピリダジニル基、 ピリミジニ ル基、 ピラジュル基等） 、
(14) 3員環ないし 14員環含窒素非芳香族複素環
(例えば、 アジリジニル基、 ァゼチジル基、 ピロリジニル基、 ピロリル基、 ピぺ リジニル基、 ピペラジニル基、 イミダゾリル基、 ビラゾリジニル基、 イミダゾリ ジニル基、 モルホリニル基、 ィミダゾリニル基、 ォキサゾリニル基、 キヌクリジ ル基等）
(15) C — 2 2アルコキシ基
(例えば、 メ トキシ基、 エトキシ基、 n—プロポキシ基、 i s o—プロポキシ基、 s e c—プロポキシ基、 II—ブトキシ基、 i s o—ブトキシ基、 s e c—プトキ シ基、 t e r t—ブトキシ基等） 、
(16) C6— 14ァリールォキシ基
(例えば、 フエノキシ基、 1一ナフチルォキシ基、 2—ナフチルォキシ基等） 、
(1 7) C7— 22ァラルキルォキシ基
(例えば、 'ベンジルォキシ基、 フエネチルォキシ基、 3—フエエルプ口ピルォキ シ基、 4—フエニルブチルォキシ基、 1一ナフチルメチルォキシ基、 2—ナフチ ルメチルォキシ基等）
(18) . 5員環ないし 14員環へテロァリールォキシ基
(例えば、 チェニルォキシ基、 フリルォキシ基、 ピリジニルォキシ基、 ピリダジ ニルォキシ基、 ピリミジニルォキシ基、 ビラジニルォキシ基等） 、
(19) C2— 23アルカノィル基 (例えば、 ァセチル基、 プロピオ-ル基、 プチリル基、 i s o—プチリル基、 バ レリル基、 i s o—バレリル基、 ビバリル基、 力プロィル基、 デカノィル基、 ラ ゥロイル基、 ミリストイル基、 パルミ トイル基、 ステアロイル基、 ァラキドイル 基等） 、
(20) C7— 15ァロイル基
(例えば、 ベンゾィル基、 1一ナフトイル基、 2—ナフトイル基等） 、
(21) C3_23不飽和アルカノィル基
(例えば、 アタリロイル基、 プロピオロイル基、 クロ トノィル基、 i s o—クロ トノィル基、 ォレロイル基、 リノレノィル基等） 、
(22) C2一 23アルカノィルォキシ基
(例えば、 ァセトキシ基、 プロピオニルォキシ基、 アクリルォキシ基等） 、 (23) C2一 22アルコキシカルボニル基
(例えば、 メ トキシカルボニル基、 エトキシカルボニル基、 n—プロポキシカル ポニノレ基、 i s 0—プロポキシカノレポニル基、 n—ブトキシカノレボニノレ基、 i s 0—ブトキシカルボニル基、 s e c—プトキシカルボニル基、 t e r t—プトキ シカルボニル基等）
(24) 不飽和 C3— 22アルコキシカルボニル基
(ビニロキシカルボニル基、 ァリロキシカルボニル基、 1一プロぺニルォキシ力 ルポ二ル基、 イソプロぺニノレオキシカルボニル基、 プロパルギルォキシ力ルポ二 ル基、 2—プチニルォキシカルボニル基） 、
(25) C，— 22アルキルスルホニル基
(例えば、 メタンスルホニル基、 エタンスルホニル基、 n—プロパンスルホニル 基、 i s 0—プロパンスノレホニル基等） 、
(26) C6— 14ァリールスルホニル基
(例えば、 ベンゼンスルホニル基、 1—ナフタレンスルホニル基、 2—ナフタレ ンスルホ-ノレ基等） および
(27) C^ 22アルキルスルホニルォキシ基
(例えば、 メタンスルホニルォキシ基、 エタンスルホニルォキシ基、 n—プロパ 04 017906
ンスルホニルォキシ基、 i S 0—プロパンスルホニルォキシ基等）
からなる群から選ばれる基が挙げられる。 実施例
参考例 1 (原料であるマク口ライド系化合物 11107Bの製造）
ストレプトミセス エスピー（Streptomyces sp. ) Mer- 11107株（FERM BP-7812) の斜面培養（ISP- 2培地）から 1白金耳を 50mlの種母培地 [グルコース 2 %、 エス サンミート（味の素 （株） 製） 1 %、 酵母エキス（オリエンタル酵母工業 （株） 製） 0. 5%、 塩ィ匕ナトリウム 0. 25%、 炭酸カルシウム 0. 32%、 殺菌前 pH6. 8]を入 れた 500ml容の三角フラスコに接種し、 28°Cで 2日間培養して第一段種母培養液 を得た。 この培養液 0. lmlを同じ種母培地 100mlを入れた 500ml容の三角フラス コに接種し、 28°Cで 1日間培養して第二段種母培養液を得た。 このようにして得 た第二段種母培養液 800mlを生産培地 [可溶性澱粉 5 %、 フアルマメディア 0. 8°ん グルテンミール 0. 8%、 酵母エキス 0. 5%、 炭酸カルシウム 0. 1%、 殺菌前 pH6. 8] 100 Lを入れた 200 Lタンクに接種し、 培養温度 28°Cで攪拌数 90rpm、 通気 量 1. Ovvm, 内圧 20kPaの条件で 5日間通気攪拌培養を行つて培養液を得た。
このようにして得た培養液の一部（10 L)を 10 Lの 1—ブタノールにて抽出後、 ブタノール層を減圧乾固し、 100 gの粗活性画分を得た。 この粗活性画分をセフ アデックス LH - 20 (フアルマシア社製、 1500 ml)上に添加し、 テトラヒドロフラン —メタノール（1 : 1)の溶媒で溶出した。 540 mlから 660 mlまでに溶出した画分を 減圧下で濃縮乾固し、 残渣 (660 mg)を得た。 さらにこの残渣を酢酸ェチルおよぴ メタノール (9 : 1 ;v/v)の混液に溶解し、 シリカゲルカラムク口マトグラフィー（ヮ コーゲル 0200、 50 g)に付した。 このカラムを n—へキサンおよび酢酸ェチル (l : 9 ;v/v)の混液（2 L)で溶出し、 468 mlから 1260 mlまでに溶出した画分を集 め、 減圧下で濃縮し、 粗活性画分を 25mg得た。 .
得られた粗活性画分を下記の HPLC分取条件 (A)で分取高速液体ク口マトグラフ ィー (HPLC)に付し、 保持時間 34分に溶出される画分を集め、 ァセトニトリノレを 留去後、 下記 HPLC分取条件 (B)にてその画分を HPLCによる脱塩を行うことによ 7906
りマクロライド系化合物 11107B (保持時間： 37分）を 6 mg得た。
HPLC分取条件 (A)
カラム ： YMC- PACK ODS-A SH-343-5AM, ψ 20膽 X 250mm (ヮイエムシ一社製） 温度：室温
流速： 10ml/分
検出： 240nm
溶出液：ァセトニトリル /0. 15%リン酸ニ水素力リゥム（pH3. 5) (2 :8〜8 :2， v/v, 0〜50分， リニアグラジェント）
HPLC分取条件 (B)
カラム ： YMC- PACK ODS-AM SH-343-5AM, φ 20mm X 250mm (ヮイエムシ一社製） 温 &_二至 <显
流速： 10ml/分
検出： 240nm '
溶出液：メタノール/水（2:8〜10 : 0, v/v, 0〜40分， リニアグラジェント）。
実施例 1 ： ストレプトミセス 'エスピー A-1544株 （FERM BP- 8446) 由来遺伝子 の塩基配列の決定
(1) ストレプトミセス 'エスピー A- 1544株染色体の DNAの調製
グルコース 1%、 麦芽エキス 0. 4%、 酵母エキス 1%からなる培地に A - 1544株を 接種し、 28°C、 3日間培養した。 得られた培養液を 3000rpm、 10分間遠心して菌体 を集めた。 その菌体から Blood & Cell Culture kit (QIAGEN社）を用いて染色体 DNAを調製した。
(2) マクロライド系化合物 11107の 16位水酸化活性を有するタンパク質をコー ドする DNAの部分的配列のクローニング
ストレプトミセス 'セリカラー 3 (2)のチトクロム？450 ( ¥?10505)と推定され るアミノ酸配列を参考にして、 ミックス 'プライマー（5Dm- 3F (配列番号 4 ) お よび 5Dm- 3R (配列番号 5 ) )を設計し作成した。
コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために、 混合塩基 S (=C+G)、 Y (=C+ T)を使用した。 次に、 この 2種のプライマー（5Dm-3Fおよび 5Dm-3R)と前項（1)で得た A-1544株染 色体 DNAをテンプレートとして用いて PCR反応を行った。 PCR反応は、 Takara LA Taq (宝酒 社）と PCR増幅装置 (Biometra社 T Gradient)を用い、 変性を 98°C、 20 秒間、 アニーリングを 50°C、 2分間、 伸長を 68°C、 30秒間行う 3段階の反応を 35回 繰り返した。 その結果、 約 500bpの大きさの DNA断片（以下、 DNA断片 -A1という）が 増幅された。 この DNA断片- A1は水酸ィヒ活性を有するタンパク質をコードする DNA の一部分である可能性が高い。 PCR反応にて増幅した DNA断片- A1を、 反応液から SUPREC PCR (宝酒造社）によつて回収した。
次に得られた DNA断片 - A1の塩基配列を解析するに足る量の DNA断片- A1を得るた めに、 プラスミ ドベクター pT7Blue T (Novagen社）に DNA Ligation kit ver. 2 (宝 酒造社）を用いて DNA断片- A1を連結し、 大腸菌 JM109株を形質転換した。 その後、 アンピシリン (50 IX g/mL)、 X - gal (5 - bromo - 4-chlofo - 3 - indolyト β - D - galactoside； 40 β g/raL) ^ IPTG Usopropyl- β -D-thiogalactopyranoside； 100 Μ)を含む L- Broth寒天培地（1. 0%バクトトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5% NaCl、 1. 5%寒天）を用いて、 形質転換された大腸菌を選択した。 こうして分離し た形質転換大腸菌のコロニーをアンピシリン（50 g/mL)を含む L- Broth液体培地 (1%パクトトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%NaCl)で培養した。 増殖した形 質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（QIAfilter Plasmid Midi Kit，QIAGEN社）を用いてプラスミ ド DNAの分離精製を行い、 一定量の DNA断片- A1を 得た。
(3) クローニングされた DNA断片- A1の塩基配列の解析
前項 (2)で得られた DNA断片- A1の塩基配列を DNA塩基配列解析装置 (PE
Biosystems 377XL)を用い、 ダイターミネータ一 ·サイクル ·シークェンス法で 解析した。 塩基配列解析の結果、 PCR反応で增幅された DNA断片- A1は電気泳動で 約 500bpと測定されたが、 塩基配列分析の結果、 正確には 528bpであることが明ら かとなった（配列番号 1の塩基 1775〜塩基 2302参照）。 クローニングされた前記の 528bpの DNA配列の両端には前記の PCR反応の時に使用した 2種類のプライマーに対 応する DNA配列が見出されたので、 前記の PCR反応では DNA断片- A1がこの 2種類の ブラィマー（5Dm-3Fおよぴ 5Dm - 3R)により特異的に増幅されたことが明らかとなつ た。
(4) DNA断片- Mの周辺領域の解析
前記のとおり、 A - 1544株由来の水酸ィヒ活性を有するタンパク質をコードする DNAの部分的配列が決定されたのでィンバース PCR法（細胞工学 14巻、 p. 591- 593, 1995年）によって、 クローユング断片の上流、 下流域に広がる周辺領域の塩 基配列を増幅、 クローニング、 配列解析した。'すなわち、 A- 1544株染色体 DNA ( (1)参照）を H緩衝液（50mM Tris-HCl, pH7. 5, lOmM MgCl2, lOmMジテオスレイト一 ル， lOOmM NaCl)中において制限酵素 Pstlと Sailでそれぞれ消化した。 得られた各 制限酵素切断 DNA断片を DNA Ligation Kit ver. 2 (宝酒造社）を用いて自己環状ィ匕 させた。
他方、 DNA断片 - A1の塩基配列から、 プライマー（6PIN - 2F (配列番号 6 ) および 6PIN-2R (配列番号 7 ) )を設計し作成した。
次にこの 2種のプライマー（6PIN - 2Fおよび 6PIN-2.R)と前記の自己環状化させた A - 1544株染色体 DNAをテンプレートとして用いて PCR反応を行った。 PCR反応は、 Takara LA Taq (宝酒造社）と PCR増幅装置 (Biometra社 T Gradient)を用い、 変性 を 98°C、 20秒間、 アニーリングと伸長を 68°C、 5分間行う 2段階の反応を 35回繰り 返した。
この結果、 約 3. 5kbpの大きさの DNA断片（DNA断片 - B1)と約 2· 8kbpの大きさの DNA 断片 (DNA断片- C1)が増幅したが、 これらは、 水酸化活性を有するタンパク質をコ 一ドする DNAおよびその上流と下流領域を含む DNA配列を有する DNAである可能性 力 §ι¾·レヽ。
この PCR増幅反応液から DNA断片- B1および DNA断片- C1を SUPREC PCR (宝酒造社） によって回収した。 次に得られた DNA断片- B1および DNA断片- C1について、 塩基配 列を解析するに足る量の各 DNA断片を得るために、 前記（2)と同様にプラスミ ドべ クタ一 pT7Blue T (Novagen社）、 DNA Ligation kit ver. 2 (宝酒造社）、 大腸菌 JM109株およびプラスミ ド精製キット（QIAfilter Plasmid Midi Kit, QIAGEN社）を 用いて、 一定量の各 DNA断片を得た。 6
(5) DNA断片- Bl (約 3. 5kbpのサイズ）および DNA断片- C1 (約 2. 8kbpのサイズ）の 塩基配列の解析
前項 (4〉で得られた DNA断片- B1および DNA断片- C1の塩基配列を DNA塩基配列解析 装置（PE Biosystems 377XL)を用い、 ダイターミネータ一 'サイクル'シークェ ンス法で解析した。 このように塩基配列の解析を行い、 DNA断片- B1および DNA断 片- C1配列から、 配列番号 1に示された 3793bpの塩基配列の情報を得た。
この 3793bp中のオープン ' リーディング · フレーム（0RF)を検索したところ、 2 種類のタンパク質がコードされていることが判明した。 これらのタンパク質のァ ミノ酸配列を BLAST searchにて検索した結果、 配列番号 1の塩基 1322〜塩基 2548 にチトクロム P450と高い相同性を有する 409個のアミノ酸からなるタンパク質を コードする 0RF (以下、 psmAという）が存在した。 そして psmAは、 ストレプトミセ ス -セリカラ一 A3 (2)のチトク口ム P450 (CYP105D5)と推定されるァミノ酸配列と、 ストレプトミセス · リビダンスのチトクロム P450 (CYP105D4)と推定されるァミノ 酸配列に最も高い相同性を有し（相同性 72. 6%)、 きらにストレプトミセス ·グリ セウスのチトクロム P450soy (SoyC)にも比較的高い相同性を有した（相同性
69. 4%)。 このことから psmAはチトクロム P450タイプの水酸化酵素をコードする 遺伝子である可能 1"生が高いと考えられた。
また psmAのすぐ下流（配列番号 1の塩基 2564〜塩基 2761)には 3F- 4Sタイプのフ エレドキシンに高い相同性を有するタンパク質をコードする 0RF (以下、 psmBとい う）が存在した。 psmBがコードするタンパク質は 66個のアミノ酸からなり、 スト レプトミセス .セリカラー八3 (2)のチトクロム？450 ( ？10505)と推定されるァミ ノ酸配列のすぐ下流のフェレドキシンと推定されるァミノ酸配列に最も高い相同 性を有し（83. 3%)、 さらにストレプトミセス · グリセウスのフェレドキシン 307 (3(^8)にも比較的高ぃ相同性を有した（相同性57. 6°/0)。 そのため、 psmBは電 子伝達を担レ、、 psmAと共に水酸化を行うフェレドキシンをコードしていると考え られた。
実施例 2 ： psmAおよび psmBをもつ形質転換体の作成
(1) A- 1544株由来の psmAおよび psmBの両方を含有する DNA断片の調製 T JP2004/017906
実施例 1において解析した配列番号 1の塩基配列を参考にして、 5' 末端に Ndelサイトを付加したプライマー DM- NdeF (配列番号 8 ) および 5' 末端に Spelサ ィトを付加したプライマー DM- SpeR (配列番号 9 ) を設計し作成した。 次に、 こ の 2種のプライマー（DM- NdeFおよび DM- SpeR)と実施例 1 (1)で得た A- 1544株染色体 DNAをテンプレートとして用いて PCR反応を行った。 PCR反応は、 Takara LA
Taq (宝酒造社）と PCR増幅装置 (Biometra社 T Gradient)を用い、 変性を 98°C、 20 秒間、 アニーリングと伸長を 68°C、 2分間行う 2段階の反応を 30回繰り返した。
この結果、 psmAおよび psmBを含む約 1. 5kbpの大きさの DNA断片（以下、 DNA断片- D1という）が增幅された。 この PCR増幅反応液から DNA断片 -D1を SUPREC PCR (宝酒 造社）によって回収した。
(2) プラスミ ド pTC-DMの構築
pT7NS-CamAB (W003/087381参照）を H緩衝液（50mM Tris-HCl, pH7. 5, lOmM
MgCl2, lOmMジチォスレイ トール， lOOmM NaCl)中で制限酵素 Ndelと Spelにより消化 してプラスミ ド消化物を得た。 同様に前項（1)で得た DNA断片- D1を制限酵素 Ndel と Spelで消化し、 得られた DNA断片- D1の消化物とプラスミ ド消化物とを、 DNA Ligation Kit ver. 2 (宝酒造）を用いて連結した。 これによつて、 psmAおよび psmB の両方を内部に含有する DNA断片 - D1と、 プラスミ ド pT7NS - CamABとが連結された 約 9. 5kbpのサイズのプラスミ ド（プラスミド PTC- DMと称する）が構築された。
(3) 大腸菌形質転換株 BL21 (DE3) /pTC- DMの調製
前項（2)で調製したプラスミド pTC- DMを用いて、 大腸菌 BL21 (DE3)コンビテント セル（Novagen社）を形質転換した。 こうして、 プラスミド pTODMで形質転換され た大腸菌 BL21 (DE3) /pTC- DM株を得た。
実施例 3 ： psmAおよび psmBをもつ大腸菌形質転換体による下記式で表される ME - 265の ME- 282への変換
Figure imgf000042_0001
ME-265
Figure imgf000042_0002
ME-282
(1) 形質転換体反応液の調製
実施例 2 (3)で得た形質転換大腸菌 BL21 (DE3) /PTC- DM株およぴ
BL21 (DE3) /pT7NS- CamAB株の凍結種母をアンピシリン 50 μ g/mLを含む L- Broth培地 (1. 0%バクトトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%NaCl) 3mLの入った 15mL容の試 験管に植菌し 37°Cで 20時間振とう培養した。 この種母培養液の 500 μ Lをアンピシ リン 50 g/mLを含む L - Broth培地（1. 0%バタトトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%NaCl) 50mLの入った 250mL容の三角フラスコに植菌し 32°Cで 3時間振とう培養 した後、 lOOmM IPTG(isopropyl- β -D-thiogalactopyranoside) ¾r50 μ 80mg/mL 5-ァミノレブリン酸を 50 β L順次添加し、 32°Cで 6時間振とう培養した。 得られた 培養液を遠心分離（5000rpm、 10分間）し、 菌体を集めた。 これを lOOmMリン酸緩衝 液 (pH6. 1) 1. 75mLに懸濁し、 これに 80%グリセロールを 250 レ 8mg/mL ME- 265を 50 /_t L添加した。 こうして得られた変換反応液を 28°C、 24時間反応させた。 反応 液 200 しをァセトニトリル lmLで抽出し、 HPLCで ME- 265および ME- 282量を測定し た。 測定結果を表 3に示す。
また、 HPLCの詳しい条件を以下に示す。 P T/JP2004/017906 分析装置： Shimadzu HPLC ΙΟΑνρ
カラム： CAPCELL PAK C18 SG120 ( φ 4· 6mm X 250mm)
移動相： 45% ァセトニトリル（0〜15分）
60% ァセトニトリノレ（15〜30分）
45% ァセトニトリル（30~45分）
流速： lmL/分
検出： UV240nm
ィンジェクション容量：
カラム温度： 40°C
分析時間： 45分
保持時間： ME- 265 24.8分
ME - 282 12.7分
表 3
Figure imgf000043_0001
(2) 形質転換体反応液からの ME- 282の取得 .
24時間反応した反応液 1.8mLに水 4mLを加え、 酢酸ェチル 8mLで 1回、 4mLで 2回抽 出した。 酢酸ェチル層を合わせ、 無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、 溶媒を除去し た。 得られた残渣を薄層クロマトグラフィー（MERCK Silicagel 60 F254 0.25mm 展開液；へキサン：酢酸ェチル =1： 2)により精製し、 ME- 282を 0· 2mg得た。
-丽 Rスぺク トル (CD30D, 500MHz) ： δ ppm (積分，多重度，結合定数 J (Hz) ) ：
0.87 (3H, d, J=7.0Hz), 0.90 (3H, d, J=7.0Hz) , 0.94 (3H, t, J=7.3Hz),
0.97(3H d, J=6.6Hz), 1.21-1.26 (1H, m), 1.29 - 1.37 (3H， m), 1.34 (3H, s), 1.44- 1.52 (2H, m), 1.60-1.64(1H, m), 1.65(1H, dd, J=6.2, 13.9Hz),
1.77(3H，d,J=l.1Hz), 1.86(1H, dd, J=5.4, 13.9Hz), 1.89-1.94(1H, m),
2.00 (3H, s), 2.43 (1H, dd, J=5.5,13.9Hz), 2.50— 2.60 (1H, m)， 2. 56 (1H, dd， J=3. 3, 13. 9Hz) , 2. 66 (1H， dd, J=2. 2, 7. 7Hz) ,
2. 89 (1H， dt, J=2. 2, 6. 2Hz) , 3. 52 (1H, dt， J=4. 8, 8. 4Hz)， 3. 75-3. 80 (1H, m) ,
4. 90 (1H, overlapped with D20)， 5. 01 (1H, d, J=10. 6Hz)，
5. 42 (1H， dd, J=9. 2， 15. 0Hz) , 6. 13 (1H, d，. J=10. 6Hz) , 6. 52 (1H， dd, J=ll. 0, 15. 0Hz)。 この結果、 コント口ールである大腸菌 BL21 (DE3) 了7^" 311^8株では¾©-282と みられるピークは得られなかったのに対して、 psmAおよび psmBを含む
BL21 (DE3) /pTC - DM株では、 ME- 265をほとんど消費して ME - 282とみられるピークが 得られた。 このことより、 psmAおよび psmB力 Ε - 265から ME-282への変換に関与し ていることを示唆している。
実施例 4： psmAおよび psmBをもつ大腸菌形質転換体によるマクロライド系化合 物 11107Bのマクロライド系化合物 11107Dへの変換
(1) 形質転換体反応液の調製
実施例 3と同様にマクロライド系化合物 11107Bを基質とした試験を行った。 実 施例 2 (3)で得た形質転換大 菌 BL21 (DE3) /pTC- DM株、 およぴ BL21 (DE3) /pT7NS- CamAB株の凍結種母をアンピシリン 50 / g/mLを含む L- Broth培地（1. 0%バクトトリ プトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%NaCl) 3mLの入った 15mL容の試験管に植菌し 30°C で 20時間振とう ±咅養した。 この種母培養液の 500 / Lをアンピシリン 50 g/mLを含 む L- Broth培地（1. 0%バタ トトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%NaCl) 50mLの入 つた 250mL容の三角フラスコに植菌し 28°Cで 5時間振とう培養した後、 lOOraM IPTG usopropyl- ]3 -D-thiogalactopyranoside) ¾·50 μ 80mg/mL 5 -/ミノレブ リン酸を 50 M L順次添カ卩し、 25°Cで 20時間振とう培養した。 得られた培養液を遠 心分離（5000rpm、 10分間）し、 菌体を集めた。 これを lOOmMリン酸緩衝液
(PH6. l) 1. 75mLに懸濁し、 これに 80%グリセロールを 250 μ L、 40mg/mL 11107Bを 50 μ ί添加した。 こうして得られた変換反応液を 28°C、 24時間反応させた。 反応 液 200 /i.Lをァセトニトリル lmLで抽出し、 HPLCでマク口ライド系化合物 11107Bお ょぴ 11107Dの量を測定した。 その測定結果を表 4に示す。 また、 HPLCの詳しい条 件を以下に示す。
分析装置： Shimadzu HPLC ΙΟΑνρ カラム： CAPCELL PAK C18 SG120 ( φ 4. 6mm X 250mm)
移動相： 35% ァセトニトリル (0〜10分）
. 35%〜65% ァセトニトリル（10〜12分）
65% ァセトニトリル（12〜15分）
35% ァセトニトリル（15〜20分）
流速： lmL/分
検出： UV240nm
ィンジェクシヨン容量： IO L
カラム温度： 40°C
分析時間： 20分
保持時間： 11107B 14. 3分
11107D 7· 9分
表 4
Figure imgf000045_0001
(2) 形質転換体反応液からのマクロライド系化合物 11107Dの取得
24時間反応した反応液 1. 8mLに水 4mLを加え、 酢酸ェチル 8mLで 1回、 4mLで 2回抽 出した。 酢酸ェチル層を合わせ、 無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、 溶媒を除去し た。 得られた残渣を薄層クロマトグラフィー（MERCK Silicagel 60 F254 0. 25mm 展開液；酢酸ェチル）により精製し、 11107Dを 0. lmg得た。
-匪 Rスぺク トル (CD30D, 500MHz) ： δ ppm (積分，多重度，結合定数 J (Hz) ) ： 0. 87 (3H, d, J=7. 0Hz) , 0. 88 (3H, d, J=7. 0Hz) , 0. 93 (3H, t, J=7. 0Hz) , 1. 18 (3H，s)， 148-1. 69 (8H, m) , 1. 33 (3H, s)， 1. 77 (3H, d, J=l. 1Hz) , 1. 82— 1. 90 (1H， m) , 2. 05 (3H, s)， 2. 49-2. 60 (3H, m) , 2. 66 (1H, dd, J=2. 2, 8. 2Hz) ,
2. 89 (1H, dt, J=2. 4, 5. 7Hz) , 3. 52 (1H, dt， J=4. 8， 8. 3Hz) , 3. 73—3. 82 (1H, m) , 5. 04 (1H, d, J=9. 8Hz) , 5. 05 (1H, d, J=10. 6Hz) , 5. 56 (1H, dd, J=9. 8， 15. 2Hz) , T/JP2004/017906
5. 70 (1H, dd, J=9. 8, 15. 2Hz) , 5. 86 (1H, d, J=15. 2Hz) , 6. 3 (1H， d, J=10. 8Hz) ,
6. 52 (1H, dd, J=10. 8, 15. 2Hz)。
この結果、 コント口ールである大腸菌 BL21 (DE3) /pT7NS- CamAB株ではマクロラ ィド系化合物 11107Dとみられるピークは得られなかったのに対して、 psmAおよび psmBを含む BL21 (DE3)/PTC- DM株では、 マクロライド系化合物 11107Dとみられるピ ークが得られた。 このことより、 psmAおよび psmBがマクロライド系化合物 11107B から 11107Dへの変換に関与していることを示唆している。
実施例 5： A- 1544セルフク口一二ング株での変換試験
(1) A- 1544株由来の psmAおよび psmBの両方を含有する DNA断片の調製（セルフ ク 'ローニング用）
実施例 1において解析した配列番号 1の塩基配列を参考にして、 5' 末端に Bglllサイトを付加したプライマー DM- BglF (配列番号 1 0 ) および 5' 末端に Bglllサイトを付加したプライマー DM- BglR (配列番号 1 1 ) を設計し作成した。 次に、 この 2種のプライマー（DM- BglFおよぴ DM- BglR)と実施例 1 (1)で得た A- 1544株染色体 DNAをテンプレートとして用いて PCR反応を行った。 PCR反応は、 Takara LA Taq (宝酒造社）と PCR増幅装置 (Biometra社 T Gradient)を用い、 変性 を 98°C、 20秒間、 アニーリングを 63°C、 30秒間、 伸長を 68°C、 4分間行う 3段階の 反応を 30回繰り返した。
この結果、 psmAおよび psmBを含む約 3. 5kbpの大きさの DNA断片（以下、 DNA断片- E1という）が増幅された。 この PCR増幅反応液を、 ァガロースゲル電気泳動にかけ て分画した。 上記の約 3. 5kbpの大きさの DNA断片- E1をァガロースゲルから切り出 して、 SUPREC 01 (宝酒造社）によって回収した。
(2) プラスミ ド pIJDMGの構築
PIJ702を H緩衝液（50mM Tris-HCl, pH7. 5， lOmM MgCl2, lOmMジチォスレイト一 ル， 100 NaCl)中で制限酵素 Bglllにより消化してプラスミド消化物を得た。 同 様に前項（1)で得た DNA断片- E1を制限酵素 Bglllで消化し、 得られた DNA断片- E1の 消化物とプラスミ ド消化物とを、 DNA Ligation Kit ver. 2 (宝酒造）を用いて連結 した。 これによつて、 psmAおよび psmBの両方を内部に含有する DNA断片 - E1と、 プ ラスミ ド pIJ702とが連結された約 8. 5kbpのサイズのプラスミ ド（プラスミド pIJDMGと称する）が構築された。
(3) セルフクロー-ング株 Α-1544/pIJDMG株の調製
前項（2)で調製したプラスミ ド pIJDMGを用レ、、 A- 1544株を、 Genetic
Manipulation of Streptomyces -'A Laboratory Mamia丄 · John 丄 nnes
Foundation, Norwich, 1985に記載された方法に従い形質転換した。 こうして、 プ ラスミ ド pIJDMGで形質転換された Α-1544/pIJDMG株を得た。
実施例 6 ：セルフクローニング株による 11107Bから 11107Dへの変換
実施例 5 (3)で得た形質転換体 A- 1544/pIJDMG株、 A- 1544/pIJ702株、 および元 の A- 1544株の凍結種母を、 チォストレプトン 25 μ g/mLを含む SMN培地（スタビロー ズ 2%、 グルコース 2%、 エスサンミート 2%、 酵母エキス 0. 5%、 NaCl 0. 25%、 CaC03 0. 32% pH7. 4) 50mLの入つた 250mL容の三角フラスコに植菌し 28°Cで 48時間 振とう培養した（種母培養、 但し、 A- 1544株にはチォストレプトンを加えなレ、：)。 得られた種母培養液の 0. 5mLをチォストレプトン 25 μ g/mLを含む SMN培地 50mLの入 つた 250mL容の三角フラスコに植菌し 28°Cで 72時間振とう培養した（但し、 A- 1544 株にはチォストレプトンを加えない）。 得られた培養液 2mLを分注し、 これに 1Mリ ン酸緩衝液 (pH6. 5)を 100 ^レ 0rag/mL 11107Bを 50 L添加した。 こうして得られ た変換培養液を 28°C、 12時間反応させた。 反応液 をァセトニトリル lmLで 抽出し、 HPLCで 11107Bおよび 11107D量を測定した。 測定結果を表 5に示す。 また、 HPLCの詳しい条件を以下に示す。
分析装置： Shimadzu HPLC ΙΟΑνρ
カラム： CAPCELL PAK C18 SG120 ( (i) 4. 6mraX 250mm)
移動相： 35% ァセトニトリル（0〜10分）
35%〜65% ァセトニトリノレ（10〜12分）
65% ァセトニトリル（12~15分）
35% ァセトニトリル（15〜20分）
流速： lmL/分
検出： UV240nm P T/JP2004/017906
インジェクション容量： IO I L
力ラム温度： 40°C
分析時聞： 20分
保持時間： 11107B 14. 3分
11画 7. 9分
表 5
Figure imgf000048_0001
この結果、 psmAおよび psmBを含むプラスミドが形質転換された A- 1544/pIJDMG 株は、 元の A- 1544株に比べ、 12時間の反応で約 2. 7倍の変換活性を示した。 この ことは、 psmAぉょぴ psmBのセルフクローニングが、 マクロライド系化合物 11107B から 11107Dへの変換に貢献できることを示唆している。
実施例 7 ：ストレプトミセス 'エスピー Mer-11107株 （FE BP- 7812) 由来遺 伝子の塩基配列の決定
(1) ストレプトミセス 'エスピー Mer- 11107株染色体の0 の調製
グルコース 1%、 麦芽エキス 0. 4%、 酵母エキス 1%からなる培地に Mer - 11107株 を接種し、 28°C、 3日間培養した。 得られた培養液を 3000rpm、 10分間遠心して菌 体を集めた。 その菌体から Blood & Cell Culture kit (QIAGEN社）を用いて染色体 DNAを調製した。
(2) マクロライド系化合物 11107の 16位水酸化活性を有するタンパク質をコー ドする DNAの部分的配列のクローニング
ストレプトミセス ·セリカラー 3 (2)のチトクロム？450 (じ¥?10505)と推定され るアミ/酸配列を参考にして、 ミックス 'プライマー（5Dm- 3F (配列番号 4 ) お ょぴ 5D- 1R (配列番号 1 2 ) )を設計し作成した。
コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために、 混合塩基 S (=C+ G)、 Y (=C+ T)を使用した。 ― 次に、 この 2種のプライマー（5Dm- 3Fおよび 5D- 1R)と前項（1)で得た Mer-11107株 染色体 DNAをテンプレートとして用いて PCR反応を行った。 PCR反応は、 Takara LA Taq (宝酒造社）と PCR増幅装置（Biometra社 T Gradi ent)を用い、 変性を 98°C、 20 秒間、 アニーリングを 50°C、 2分間、 伸長を 68°C、 30秒間行う 3段階の反応を 35回 繰り返した。 その結果、 約 300bpの大きさの DNA断片（以下、 DNA断片 -A2という）が 増幅された。 この DNA断片- A2は水酸化活性を有するタンパク質をコードする DNA の一部分である可能性が高い。 PCR反応にて增幅した DNA断片- A2を、 反応液から SUPREC PCR (宝酒造社）によって回収した。
次に得られた DNA断片 - A2の塩基配列を解析するに足る量の DNA断片 - A2を得るた めに、 プラスミ ドベクター pT7Blue T (Novagen社）に DNA Ligation kit ver. 2 (宝 酒造社）を用いて DNA断片- A2を連結し、 大腸菌 JM109株を形質転換した。 その後、 アンピシリン（50 g/mL)、 X- gal (5- bromo- 4- chloro- 3- indoly卜 β - D - galactos ide； 40 μ g/mL) IPTG (i sopropyl- β -D-thiogalactopyranos ide ； 100 μ Μ)を含む L - Broth寒天培地（1. 0%バタトトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5% NaCl、 1. 5%寒天）を用いて、 形質転換された大腸菌を選択した。 こうして分離し た形質転換大腸菌のコロニーをアンピシリン（50 μ g/mL)を含む L- Broth液体培地 (1 %ノくクトトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%NaCl)で培養した。 増殖した形 質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（QIAfi lter Plasmid Mi di Kit, QIAGEN社）を用いてプラスミ ド DNAの分離精製を行い、 一定量の DNA断片- A2を 得た。
(3) クローニングされた DNA断片- A2の塩基配列の解析
前項（2)で得られた DNA断片- A2の塩基配列を DNA塩基配列解析装置 (PE
Biosystems 377XL)を用い、 ダイターミネータ一 'サイクル 'シークェンス法で 解析した。 塩基配列解析の結果、 PCR反応で増幅された DNA断片- A2は電気泳動で 約 300bpと測定されたが、 塩基配列分析の結果、 正確には 325bpであることが明ら かとなつた（配列番号 2の塩基 837〜塩基 1161参照）。 クローニングされた前記の 325bpの DNA配列の両端には前記の PCK反応の時に使用した 2種類のプライマーに対 応する DNA配列が見出されたので、 前記の PCR反応では DNA断片 - A2がこの 2種類の プライマー（5Dm-3Fおよび 5D-1R)により特異的に増幅されたことが明らかとなつ た。
(4) DNA断片 -A2の周辺領域の解析 ，
前記のとおり、 Mer- 11107株由来の水酸化活性を有するタンパク質をコードす る DNAの部分的配列が決定されたのでィンバース PCR法（細胞工学 14卷、 p. 591 - 593, 1995年）によって、 クローニング断片の上流、 下流域に広がる周辺領域の塩 基配列を增幅、 クローニング、 配列解析した。 すなわち、 liter - 11107株染色体 DNA ( (1)参照）を、 K緩衝液（50mM Tris- HC1, pH8. 5, 10mM MgCl2, ImMジチォスレイト 一ノレ， lOOmM KC1)中で制限酵素 BamHIで、 H緩衝液（50mM Tris - HC1, pH7. 5, lOmM MgCl2， ImMジチォスレイトール， lOOmM NaCl)中で制限酵素 Sailでそれぞれ消化した。 得られた各制限酵素切断 DNA断片を DNA Ligation Kit ver. 2 (宝酒造社）を用いて 自己環状化させた。
他方、 DNA断片- A2の塩基配列から、 プライマー（7PIN - 2F (配列番号 1 3 ) およ び 6PIN- 2R (配列番号 7 ) )を設計し作成した。
次にこの 2種のプライマー（7PIN - 2Fおよび 6PIN - 2R)と前記の自己環状化させた Mer- 11107株染色体 DNAをテンプレートとして用いて PCR反応を行った。 PCR反応は、 Takara LA Taq (宝酒造社）と PCR増幅装置 (Biometra社 T Gradient)を用い、 変性 を 98°C、 20秒間、 アニーリングと伸長を 68°C、 5分間行う 2段階の反応 35回繰り返 した。
この結果、 約 1. 3kbpの大きさの DNA断片（DNA断片- B2)と約 1. 4kbpの大きさの DNA 断片 (DNA断片- C2)が増幅したが、 これらは、 水酸化活性を有するタンパク質をコ 一ドする DNAおよびその上流と下流領域を含む DNA配列を有する DNAである可能性 が咼い。
この PCR増幅反応液から DNA断片- B2および DNA断片- C2を SUPREC PCR (宝酒造社） によって回収した。 次に得られた DNA断片- B2および DNA断片- C2について、 塩基配 列を解析するに足る量の各 DNA断片を得るために、 前記 (2)と同様にプラスミ ドべ クタ一 pT7Blue T (Novagen社）、 DNA Ligation kit ver. 2 (宝酒造社）、 大腸菌 ，109株およびプラスミ ド精製キット（QIAfilter Plasmid Midi Kit, QIAGEN社）を 用いて、 一定量の各 DNA断片を得た。 .
(5) DNA断片- B2 (約 1· 3kbpのサイズ）および DNA断片- C2 (約 1. 4kbpのサイズ）の 塩基配列の解析
前項 (4)で得られた DNA断片- B2および DNA断片- C2の塩基配列を DNA塩基配列解析 装置 (PE Biosystems 377XL)を用い、 ダイターミネータ一 ·サイクル'シークェ ンス法で解折した。 このように塩基配列の解析を行い、 DNA断片- B2および DNA断 片 -C2配列から、 配列番号 2に示されだ 2329bpの塩基配列の情報を得た。
この 2329bp中のオープン ' リーディング' フレーム（0RF)を検索したところ、 2 種類のタンパク質がコードされていることが判明した。 これらのタンパク質のァ ミノ酸配列を BLAST searchにて検索した結果、 配列番号 2の塩基 420〜塩基 1604 にチトクロム P450と高い相同性を有する 395個のアミノ酸からなるタンパク質を コードする 0RF (以下、 bpmAという）が存在した。 そして bpmAは、 A - 1544株から単 離した psmAのアミノ酸配列に最も高い相同性を有し（相同性 67. 4%)、 さらにスト レプトミセス .グリセウスのチトクロム P450soy (SoyC)にも比較的高い相同性を 有した（相同性 64. 8%)。 このことから bpmAがチトク口ム P45Qタイプの水酸化酵素 をコードする可能性が高いと考えられた。
また bpmAのすぐ下流 (配列番号 2の塩基 1643〜塩基 1834)には 3Fe- 4Sタイプのフ エレドキシンに高い相同性を有するタンパク質をコードする 0RF (以下、 bpmBとい う）が存在した。 bpmBがコードするタンパク質は 64個のアミノ酸からなり、 A- 1544株から単離した psmBのァミノ酸配列に最も高レ、相同性を有し（相同性 81. 0%)、 さらにストレプトミセス .セリカラー 3 (2)のチトクロム？450 ¥?10505)と推定 されるァミノ酸配列のすぐ下流のフエレドキシンと推定されるァミノ酸配列にも 比較的高い相同性を有した（76. 2%)。 そのため、 bpmBは電子伝達を担い、 bpmAと 共に水酸化を行うものと考えられた。
実施例 8 ： bpmAおよび bpmBをもつ形質転換体の作成
(1) Mer- 11107株由来の bpmAおよび bpmBの両方を含有する DNA断片の調製 実施例 7において解析した配列番号 2の塩基配列を参考にして、 5' 末端に Ndelサイトを付加したプライマー 07-NdeF (配列番号 1 4 ) および 5， 末端に Spel サイ トを付加したプライマー 07-SpeR (配列番号 1 5 ) を設計し作成した。 次に、 この 2種のプライマー（07-NdeFぉょび07-SpeR)と実施例 7 (1)で得た Mer- 11107株 染色体 DNAをテンプレートとして用いて PCR反応を行った。 PCR反応は、 Takara LA Taq (宝酒造社）と PCR増幅装置 (Bioraetra社 T Gradient)を用い、 変性を 98°C、 20 秒間、 アニーリングと伸長を 68°C、 2分間行う 2段階の反応を 30回繰り返した。 この結果、 bpmAおよび bpmBを含む約 1. 5kbpの大きさの DNA断片（以下、 DNA断片- D2という）が増幅された。 この PCR増幅反応液から DNA断片 - D2を SUPREC PCR (宝酒 造社）によって回収した。
(2) プラスミ ド pTC- D07の構築
pT7NS - CamAB (W003/087381参照）を H緩衝液（50mM Tris - HC1, pH7. 5, 10mM
MgCl2， ImMジチォスレイトール， lOOmM NaCl)中で制限酵素 Ndelと Spelにより消化し てプラスミド消化物を得た。 同様に前項（1)で得た DNA断片- D2を制限酵素 Ndelと Spelで消化し、 得られた DNA断片- D2の消化物とプラスミド消化物とを、 DNA Ligation Kit ver. 2 (宝酒造）を用いて連結した。 これによつて、 bpmAおよび bpmB の両方を内部に含有する DNA断片 - D2と、 プラスミド pT7NS-CamABとが連結された 約 9. 5kbpのサイズのプラスミド（プラスミド pTC - D07と称する）が構築された。
(3) 大腸菌形質転換株 BL21 (DE3) /pTC- D07の調製
前項（2)で調製したプラスミ ド pTC- D07を用いて、 大腸菌 BL21 (DE3)コンビテン トセル (Novagen社）を形質転換した。 こうして、 プラスミ ド pTC- D07で形質転換さ れた大腸菌 BL21 (DE3) /pTC-D07株を得た。
実施例 9 ： bpmAおよび bpmB をもつ大腸菌形質転換体によるマクロライド系化 合物 11107Bの 11107Dへの変換
実施例 8 (3)で得た形質転換大腸菌 BL21 (DE3) /pTC- D07株および
BL21 (DE3) /pT7NS- CamAB株の凍結種母をアンピシリン 50 g/mLを含む L- Broth培地 (1. 00/。バタトトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%NaCl) 3mLの入った 15mL容の試 験管に植菌し 37°Cで 20時間振とう培養した。 この種母培養液の 500 Lをアンピシ リン 50 μ g/mLを含む L-Broth培地（1. 0%バタトトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%NaCl) 50mLの入つた 250mL容の三角フラスコに植菌し 32°Cで 4時間振とう培養 した後、 lOOmM IPTG (isopropyl- -D-thiogalactopyranoside) ¾f 50 μ 80mg/mL 5 -ァミノレブリン酸を 50 I L順次添加し、 32°Cで 5時間振とう培養した。 得られた 培養液を遠心分離 (5000rpm、 10分間）し、 菌体を集めた。 これを lOOmMリン酸緩衝 液（pH6. 1) 1. 75mLに懸濁し、 これに 80%グリセ口ールを 250 μ L、 40mg/mLマクロ ライ ド系化合物 11107Bを 12. 5 μ ί添加した。 こうして得られた変換反応液を 28°C、 24時間反応させた。 反応液 400 しをメタノール 600 ^ Lで抽出し、 HPLCでマクロラ ィド系化合物 11107Bおよび 11107Dの量を測定した。 その測定結果を表 6に示す。 また'、 HPLCの詳しい条件を以下に示す。
分析装置： Shimadzu HPLC ΙΟΑνρ
カラム： Develosil 0DS UG - 3 ( φ 4. 6匪 X 250mm 3 β η)
移動相： 45%〜55% メタノール（0〜5分）
55% メタノール（5〜 13分）
55%〜70% メタノール（13〜17分）
70% メタノール（17〜21分）
45% メタノール（21〜25分）
流速： 1. 2mL/分
検出： UV240nm
ィンジェクション容量： 5 L
カラム温度： 40°C
分析時間： 25分
保持時間： 11107B 12. 2分
. 11107D 4· 2分
表 6
Figure imgf000053_0001
この結果、 コントロールである大腸菌 BL21 (DE3) /pT7NS- CamAB株ではマク口ラ ィド系化合物 11107Dのピークは得られなかったのに対して、 bpmAおよび bpmBを含 む BL21 (DE3) /pTC-D07株では、 マクロライド系化合物 11107Dのピークが得られた。 このことより、 bpmAおよび bpmBがマクロライド系化合物 11107Bから 11107Dへの変 換に関与していることを示唆している。
実施例 1 0 ： A-1560株 （FERM BP-10102) 由来遺伝子の塩基配列の決定
(1) A- 1560株染色体の DNAの調製
グルコース 1%、 麦芽エキス 0. 4%、 酵母エキス 1%からなる培地に A- 1560株を 接種し、 28°C、 3日間培養した。 得られた培養液を 3000rpm、 10分間遠心して菌体 を集めた。 その菌体から Blood & Cell Culture kit (QIAGEN社）を用いて染色体 DNAを調製した。
(2) マクロライド系化合物 11107の 16位水酸化活性を有するタンパク質をコー ドする DNAの部分的配列のクローニング
ストレプトミセス ·セリカラー 3 (2)のチトクロム？450 (じ¥?10505)と推定され るァミノ酸配列を参考にして、 ミックス 'プライマー（5Dm- 3F (配列番号 4 ) お よび 5Dm - 2R (配列番号 1 6 ) )を設計し作成した。
コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために、 混合塩基 S (=C+G)、 Y (=C+ T)を使用した。
次に、 この 2種のプライマー（5Dm- 3Fおよび 5Dm- 2R)と前項（1)で得た A- 1560株染 色体 DNAをテンプレートとして用いて PCR反応を行った。 PCR反応は、 Takara LA Taq (宝酒造社）と PCR増幅装置 (Biometra社 T Gradient)を用い、 変性を 98°C、 20 秒間、 アニーリングを 50°C、 2分間、 伸長を 68°C、 30秒間行う 3段階の反応を 35回 繰り返した その結果、 約 750bpの大きさの DNA断片（以下、 DNA断片- A3という）が 増幅された。 この DNA断片 - A3は水酸ィヒ活性を有するタンパク質をコ一ドする DNA の一部分である可能性が高い。 PCR反応にて増幅した DNA断片- A3を、 反応液から. SUPREC PCR (宝酒造社）によって回収した。
次に得られた DNA断片- A3の塩基配列を解析するに足る量の DNA断片- A3を得るた めに、 プラスミ ドベクター pT7Blue T (Novagen社）に DNA Ligation kit ver. 2 (宝 酒造社）を用いて DNA断片- A3を連結し、 大腸菌 JM109株 （Stratagene社） を形質転 換した。 その後、 アンピシリン（50 μ g/mL)、 X- gal (5- bromo- 4- chloro-3 - indolyl- j3 - D - galactoside； 40 μ g/mL)、 IPTG (isopropyl- β - D - thiogalactopyranoside； 100 /i M)を含む L - Broth寒天培地（1. 0%バタトトリブト ン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%NaCl、 1. 5%寒天）を用いて、 形質転換された大腸菌 を選択した。 こうして分離した形質転換大腸菌のコロニーをアンピシリン（50 μ g/mL)を含む L- Broth液体培地（1%バクトトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5% NaCl)で培養した。 増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キ Vト (QIAf ilter Plasmid Midi Kit, QIAGEN社）を用いてプラスミド DNAの分離精製を行 レ、、 一定量の DNA断片- A3を得た。
(3) ク口一二ングされた DNA断片 - A3の塩基配列の解析
前項 (2)で得られた DNA断片- A3の塩基配列を DNA塩基配列解析装置 (PE
Biosystems 377XL)を用い、 ダイターミネータ一 ·サイクノレ 'シークェンス法で 解析した。 塩基配列解析の結果、 PCR反応で増幅された DNA断片- A3は電気泳動で 約 750bpと測定されたが、 塩基配列分析の結果、 正確には 741bpであることが明ら かとなつた（配列番号 3の塩基 616〜塩基 1356参照）。 クローニングされた前記の 741bpの DNA配列の両端には前記の PCR反応の時に使用した 2種類のプライマーに対 応する DNA配列が見出されたので、 前記の PCR反応では DNA断片- A3がこの 2種類の プライマー（5Dra - 3Fおよび 5Dm- 2R)により特異的に增幅されたことが明らかとなつ た。
(4) DNA断片- A3の周辺領域の解析
前記のとおり、 A- 1560株由来の水酸化活性を有するタンパク質をコードする DNAの部分的配列が決定されたのでィンバース PCR法 (細胞工学 14卷、 p. 591 - 593, 1995年）によって、 クローニング断片の上流、 下流域に広がる周辺領域の塩 基配列を増幅、 クローニング、 配列解析した。 すなわち、 A- 1560株染色体 DNA ( (1)参照）を、 K緩衝液（50mM Tris-HCl, pH8. 5, 10mM MgCl2, ImMジチォスレイト ール， lOOmM KC1)中において制限酵素 BaraHIで、 L緩衝液（10mM Tris- HCl, PH7. 5, 10mM MgCl2, ImMジチオスレィトール）中において制限酵素 Kpnlで、 Η緩 衝液（50raM Tris-HCl, pH7. 5, 10mM MgCl2, ImMジチォスレイ トール， lOOtnM NaCl)中に おいて制限酵素 Sailでそれぞれ消化した。 得られた各制限酵素切断 DNA断片を DNA Ligation Kit ver. 2 (宝酒造社）を用いて自己環状化させた。
他方、 DNA断片 - A3の塩基配列から、 プライマー（5PIN-2F (配列番号 1 7 ) およ び 6PIN - 2R (配列番号 7 ) )を設計し作成した。
次にこの 2種のプライマー（5HN - 2Fおよび 6PIN- 2R)と前記の自己環状化させた A - 1560株染色体 DNAをテンプレートとして用いて PCR反応を行った。 PCR反応は、 Takara LA Taq (宝酒造社）と PCR増幅装置 (Biometra社 T Gradient)を用い、 変性 を 98°C、 20秒間、 アニーリングと伸長を 68°C、 5分間行う 2段階の反応 35回繰り返 した。
この結果、 約 4. 5kbpの大きさの DNA断片（DNA断片 - B3)と約 3. Okbpの大きさの DNA 断片（DNA断片- C3と約 1. 7kbpの大きさの DNA断片 (DNA断片 - D3)が増幅したが、 これ らは、 水酸化活性を有するタンパク質をコードする DNAおよびその上流と下流領 域を含む DNA配列を有する DNAである可能性が高 V、。
この PCR増幅反応液から DNA断片- B3および DNA断片- C3および DNA断片- D3を
SUPREC PCR (宝酒造社）によって回収した。 次に得られた DNA断片- B3および DNA断 片- C3および DNA断片- D3について、 塩基配列を解析するに足る量の各 DNA断片を得 るために、 前記（2)と同様にプラスミドベクター pT7Blue T (Novagen社）、 DNA Ligation kit ver. 2 (宝酒造社）、 大腸菌 JM109株およびプラスミ ド精製キット (QIAf ilter Plasmid Midi Kit, QIAGEN社）を用いて、 一定量の各 DNA断片を得た。
(5) DNA断片- B3 (約 4. ¾bpのサイズ）、 DNA断片- C3 (約3. Okbpのサイズ）および DNA断片- D3 (約 1. 7kbpのサイズ）の塩基配列の解析
前項（4)で得られた DNA断片- B3、 DNA断片- C3および DNA断片- D3の塩基配列を DNA 塩基配列解析装置 (PE Biosystems 377XL)を用い、 ダイターミネータ一 ·サイク ル.シークェンス法で解析した。 このように塩基配列の解析を行い、 DNA断片 - B3、 DNA断片- C3および DNA断片 - D3の配列の中から、 配列番号 3に示された 1860bpの塩 基配列の情報を得た。
この 1860bp中のオープン' リーディング 'フレーム（0RF)を検索しだところ、 2 種類のタンパク質がコードされていることが判明した。 これらのタンパク質のァ P T/JP2004/017906
ミノ酸配列を BLAST searchにて検索した結果、 配列番号 3の塩基 172〜塩基 1383 にチトクロム P450と高い相同性を有する 404個のアミノ酸からなるタンパク質を コードす ¾0RF (以下、 tP という）が存在した。 そして tpmAは、 ストレプトミセ ス ·セリカラー 3 (2)のチトクロム？4500^?10505)と推定されるアミノ酸配列に 最も高い相同性を有し（相同性 77. 4%)、 A - 1544株から単離した psmAのアミノ酸配 列にも高い相同性を有した（ネ目同性 76. 6%)。 このことから tpmAはチトクロム P450 タイプの水酸化酵素をコードする遺伝子である可能性が高いと考えられた。
また tpmAのすぐ下流（配列番号 3の塩基 1399〜塩基 1593)には 3Fe- 4Sタイプのフ エレドキシンに高い相同性を有するタンパク質をコードする 0RF (以下、 tpmBとレヽ う）'が存在した。 tpmBがコードするタンパク質は 65個のアミノ酸からなり、 A - 1544株から単離した psmBのァミノ酸配列に最も高い相同性を有し（相同性 81. 0%) , ストレプトミセス 'セリカラー 3 (2)のチトクロム154500^?10505)と推定される ァミノ酸配列のすぐ下流のフェレドキシンと推定されるァミノ酸配列にも高い相 同性を有した（82. 5%)。 そのため、 tpmBは電子伝達を担い、 tpmAと共に水酸化を 行うフェレドキシンをコードしていると考えられた。
実施例 1 1 ： tpmAおよび tpmBをもつ形質転換体の作成
(1) A- 1560株由来の tpmAおよび tpmBの両方を含有する DNA断片の調製
実施例 1 0において解析した配列番号 3の塩基配列を参考にして、 5' 末端に
Ndelサイトを付加したプライマー tpm- NdeF (配列番号 1 8 )および 5' 末端に Spel サイトを付加したプライマー tpm - SpeR (配列番号 1 9 )を設計し作成した。 次に、 この 2種のプライマー（tpm- NdeFおよび tpm-SpeR)と実施例 1 0 (1)で得た A- 1560株 染色体 DNAをテンプレートとして用いて PCR反応を行った。 PCR反応は、 Takara LA Taq (宝酒造社）と PCR増幅装置 (Biometra社 T Gradient)を用い、 変性を 98°C、 20 秒間、 アニーリングと伸長を 68°C、 2分間行う 2段階の反応を 30回操り返した。
この歸果、 tpmAおよび tpmBを含む約 1. 5kbpの大きさの DNA断片（以下、 DNA断片 - E3という）が増幅された。 この PCR増幅反応液から DNA断片- E3を SUPREC PCR (宝酒 造社）によって回収した。
(2) プラスミ ド pTC - tpmABの構築 7906 pT7NS- CamAB (W003/087381参照）を H緩衝液（50mM Tris- HC1, pH7. 5, 10mM
MgCl2) ImMジチォスレイトール， lOOmM NaCl)中で制限酵素 Ndelと Spelにより消化し てプラスミ ド消化物を得た。 同様に前項 (1)で得た DNA断片- E3を制限酵素 Ndelと Spelで消化し、 得られた DNA断片 -E3の消化物とプラスミ ド消化物とを、 DNA Ligation Kit ver. 2 (宝酒造）を用いて連結した。 これによつて、 tpmAおよび tpmB の両方を内部に含有する DNA断片 - E3と、 プラスミ ド pT7NS- CamABとが連結された 約 9. 5kbpのサイズのブラスミド（プラスミ ド pTC - tpmABと称する）が構築された。
(3) 大腸菌形質転換株 BL21 (DE3) /pTC- tpmABの調製
実施例 1 1 (2)で調製したプラスミ ド pTC-tpmABを用いて、 大腸菌 BL21 (DE3)コ ンピテントセル (Novagen社）を形質転換した。 こうして、 プラスミ ド pTC- tpmABで 形質転換された大腸菌 BL21 (DE3) /pTC - tpmAB株を得た。
実施例 1 2 ： tpmAおよび tpmBをもつ大腸菌形質転換体による 11107Bの 11107Dへ の変換
前項（3)で得た形質転換大腸菌 BL21 (DE3) /pTC- tpmAB株、 および
BL21 (DE3) /pT7NS- CamAB株の凍結種母をアンピシリン 50 μ g/mLを含む L-Broth培地 (1. 0%バクトトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0· 5%NaCl) 3mLの入った 15mL容の試 験管に植菌し 37°Cで 20時間振とう培養した。 この種母培養液の 500 Lをアンピシ リン 50 μ g/raLを含む L- Broth培地（1. 0%バクトトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%NaCl) 50mLの入った 250mL容の三角フラスコに植菌し 32°Cで 4時間振とう培養 した後、 lOOmM IPTG (isopropyl- β -D-thiogalactopyranoside) ¾r50 μ 80mg/mL 5-ァミノレブリン酸を 50 μ L順次添加し、 32°Cで 5時間振とう ±咅養した。 得られた 培養液を遠心分離 (5000rpm、 10分間）し、 菌体を集めた。 これを lOOmMリン酸緩衝 液（pH6. 1) 1. 75mLに懸濁し、 これに 80%グリセロールを 250 i L、 40mg/mL 11107B を 12. 5 L添カ卩した。 こうして得られた変換反応液を 28°C、 24時間反応させた。 反応液 400 Lをメタノール 600 μ Lで抽出し、 HPLCで 11107Bおよび 11107Dの量を測 定した。 その測定結果を表 7に示す。 また、 HPLCの詳しい条件を以下に示す。
分析装置： Shimadzu HPLC ΙΟΑνρ
カラム ： Develosil 0DS UG-3 ( 4. 6mmx250mm 3 z m) 移動相： 45%〜55%メタノール (0〜5分）
55% メタノール (5〜13分）
55%〜70% メタノール（13〜1ァ分)
70% メタノール（17〜21分）
45% メタノール（21~25分）
流速： 1. 2mL/分
検出： UV240nm
ィンジェクション容量 5 L
カラム温度： 40°C
分析時間： 25分
保持時間： 11107B 12. 2分
11107D 4· 2分
表 7
Figure imgf000059_0001
この結果、 コントロールである大腸菌 BL21 (DE3) /PT7NS- CamAB株では 11107Dの ピークは得られなかったのに対して、 tpmAおよび tpmBを含む BL21 (DE3) /pTC - tpmAB株では、 11107Dのピークが得られた。 このことより、 tpmAおよび tpmBが 11107Bから 11107Dへの変換に関与していることを示唆している。
実施例 1 ·3 ：セルフクローニング株による下記式で表わされる 11107Hの 11107CBへの変換
Figure imgf000060_0001
11107CB
(1)形質転換体反応液の調製
スタビローズ 2. 0%、 グルコース 2· 0°/ο、 大豆粉 （豊年ソィプロ） 2. 0%、 酵母 エキス 0. 5% 、 CaC03 0. 32%からなる pH 7. 4の培地を調製し、 250raLの三角フラ スコに 25mLの培地を入れ、 121°Cで 20分間加熱滅菌した。 この培地にチォスト レプトンを終濃度 25mg/Lになるように添加した後、 A- 1544/pIJOMG株を凍結種母 より 1%接種し 28°C、 220rpmで 3日間、 種母培養を行った。 この種母培養液を同 様の組成の培地に 1 %添加し、 28°C、 220rpmで 2日間、 本培養を行った。 本培養 終了後、 培養液から菌体を遠心分離で集菌し、 pH 6. 5のリン酸緩衝液 20mLに懸 濁した。 この菌体懸濁液に基質 11107H (100g/L DMS0溶液） を終濃度 2000mg/L になる うに添カ卩し 28°C、 220rpmで 16時間変換反応を行った。
(2)形質転換体反応液からのマク口ライド系化合物 11107CBの取得
同様の操作を行った変換反応液 （フラスコ 6本分） から遠心分離により菌体を 分離し、 遠心上清を等量の酢酸ェチルで 2回抽出した。 抽出液を濃縮後、 薄層ク 4017906
ロマトグラフィー（MERCK Silicagel 60 F254' 0.5随 展開液； トルエン：ァ セトン =1':1)により精製し、 11107CBを 119.5mg得た。
ESI-MS m/z 573 (M+Na) +
-丽 Rスぺクトル (CD30D， 500MHz) ： δ ppm (積分，多重度，結合定数 J (Hz)) ：
0.81(3H, d, J=6.7Hz), 0.89 (3H, d, J=7.0), 0.94(3H, t， J=7.4Hz) , 1.25(3H, s), 1.30-1.20 (IH, m), 1.33(3H, s), 1.55 - 1.40 (2H, m) , 1.65(lH, dd, J=6.3, 14.0Hz), 1.75 (3H, s), 1.88(1H, dd, J=5.4, 14.0Hz), 2.07 (3H, s) , 2.68-2.40(4H,m),
2.89 (IH, m) , 3.5l(lH,m), 4.51(1H, m), 4.97(lH, d, J=8.6Hz),
4.99 (IH, d, J=9.3Hz)， 5.30 (IH, dd, J=9.7, 15.2Hz) , 5.52 (IH, dd, J=9.4, 15.2Hz) ,
5.58 (IH, dd, J=l.9， 15.5Hz) , 5.78 (IH, dd, J=2.8, 15.5Hz)， 5.85 (IH, d, J=15.3Hz) ,
6.07 (IH, d, J=ll.0Hz)， 6.51 (IH, dd, J=ll.0， 15.3Hz)
実施例 14 ：セルフクローニング株による下記式で表わされる 11107Lの
11107CGへの変換
Figure imgf000061_0001
11107CG
(1)形質転換体反応液の調製 スタビローズ 2.0%、 グルコース 2·0ο/ο、 大豆粉 （豊年ソィプロ） 2.0%、 酵母 エキス 0.5% 、 CaC03 0.32%からなる pH 7.4の培地を調製し、 250mLの三角フ ラスコに 25mLの培地を入れ、 121°Cで 20分間加熱滅菌した。 この培地にチォス トレプトンを終濃度 25mg/Lになるように添加した後、 A- 1544/pIJDMG株を凍結種 母より 1%接種し 28°C、 220rpmで 3日間、 種母培養を行った。 この種母培養液を 同様の組成の培地に 1%添加し、 28°C、 220rpmで 2日間、 本培養を行った。 本培 養終了後、 培'養液から菌体を遠心分離で集菌し、 pH 6.5のリン酸緩衝液 20mLに 懸濁した。 この菌体懸濁液に基質 11107L (100g/L DMS0溶液） を終濃度 1600mg/L になるように添カ卩し 28°C、 220rpmで 16時間変換反応を行つた。
(2)·形質転換体反応液からのマク口ライド系化合物 11107CGの取得
この変換反応液から遠心分離により菌体を分離し、 遠心上清を等量の酢酸ェチ ルで 2回抽出した。 抽出液を濃縮後、 薄層クロマトグラフィー （MERCK
Silicagel 60 F254' 0.25mm 展開液； トルエン： ァセトン = 1:1) により精製 し、 11107CGを 25mg得た。
ESI-MS m/z 633 (M+Na) +
-顧 Rスぺク トル (CD30D, 500MHz) ： δ ppm (積分，多重度,結合定数 J (Hz) ) ： 0.88 (3H, d, J=6.7Hz), 0.90 (3H, d, J=7.0Hz), 0.94 (3H, d, J=7.4Hz), 1.18 (3H, s), 1.30-1.20 (1H, m), 1.34, (3H, s), 1.56-1.40(2H, m), 1.66 (1H, dd, J=6.2, 14.0Hz) , 1.79- 169 (2H,m), 1.81(3H, d, J=1.0Hz), 1.86 (1H, dd， J=5.4， 14.0Hz) ,
2.05 (3H, s), 2.08 (3H, s) , 2.52 (1H, dd, J=4.2,15.2Hz), 2.64-2.55 (1H, m), 2.67 (1H, dd, J=2.2, 7.9Hz) ' 2.78 (1H, dd, J=3.0, 15.2Hz) ,
2.90 (1H, dt, J=2.2, 5.6Hz), 3.52 (1H, dt, J=4.4, 8.8Hz), 3.75 (1H, m),
4.98 (1H, dd, J=2.8, 11.3Hz) , 5.08 (1H， d, J=9.7Hz) , 5.13 (1H, d, J=9.6Hz)，
5.61 (1H, dd, J=9.9, 15.2Hz)， 5.75 (1H, dd, J=9.7, 15.2Hz) , 5.88 (1H, d, J=15.3Hz)， 6.13 (1H, d, J=ll.0Hz), 6.54 (1H, dd, J=11.0, 15.3Hz) 産業上の利用可能性
本発明の D N Aを担持するプラスミ ドで形質転換した形質転換体を用レ、ること により、 優れた抗腫瘍活性を有し、 水溶液中での安定性にも優れた 1 6位に水酸 基を有する 1 2員環マクロライ ド化合物を効率よく生産することができる。

Claims

請求の範囲 式. （I )
Figure imgf000064_0001
11107B (i) で示されるマクロライド系化合物 (以下マクロライド系化合物 11107Bという） の、
式 (II)
Figure imgf000064_0002
11107D (π) で示される 16位水酸化マクロライド系化合物への生物学的変換に関与する D N
Αであって、 16位水酸化酵素活 1·生を有するタンパク質もしくはフェレドキシンを 一部にもしくは全体としてコードする D NAまたはその改変体を含んでなる単離 された純粋な D NA。
2 . 下記の（a；)、 （b)または（c)で示される請求項 1記載の D NA。
(a) マクロライド系化合物 11107Bの 16位水酸化酵素活性を有するタンパク 質をコードする D N Aであって、 配列番号 1の塩基 1322から塩基 2548までの連 続した塩基配列、 配列番号 2の塩基 420から塩基 1604までの連続した塩基配列 および配列番号 3の塩基 172から塩基 1383までの連続した塩基配列からなる群 より選択される DNA。
(b) 前記 (a)で示される D N Aの改変体であって、
(i) 前記 (a)で示される DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、 かつ、
(ii) マクロライド系化合物 11107Bの 16位水酸化酵素活性を有するタンパク質 をコードする DNA。
(c) 遺伝子コドンの縮重のため、 前記（a)に示される DNAとストリンジェン トな条件下でハイブリダィズしないが、 前記 (a)または (b)で示される DNAによ りコードされるタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする DNA。
3. 請求項 2記載の DNAによりコードされるタンパク質。
4. 請求項 2記載の D N Aを担持する自立複製性または組み込み複製性の組み 換えプラスミド。
5. 請求項 4記載の組み換えプラスミドで形質転換した形質転換体。
6. 請求項 2に記載された DN Aまたはその一部からなる DN Aをプローブま たはプライマーとして用いることを特徴とする、 マクロライド系化合物 11107B の 16位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする DN Aの単離方法。
7. 下記の（d)、 （e)または (f)で示される請求項 1記載の DNA。
(d) フェレドキシンをコードする DNAであって、 配列番号 1の塩基 2564か ら塩基 2761までの連続した塩基配列、 配列番号 2の塩基 1643から塩基 1834ま での連続した塩基配列おょぴ配列番号 3の塩基 1399から塩基 1593までの連続し た塩基配列からなる群より選択される DNA。
(e) 前記（ で示される D N Aの改変体であって、
(i) 前記 (d)で示される D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつ、
(ii) フェレドキシン機能を有するタンパク質をコードする DNA。
(f) 遺伝子コドンの縮重のため、 前記（d)に示される DNAとストリンジェン トな条件下でハイブリダィズしないが、 前記 (d)または（e)で示される DNAによ りコードされるタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする DNA。 .
8. 請求項 7記載の DNAによりコードされるタンパク質。
9. 請求項 7記載の DN Aを担持する自立複製性または組み込み複製性の組み 換えプラスミ ド。
10. 請求項 9記載の組み換えプラスミ ドで形質転換した形質転換体。
1 1. 請求項 7に記載された DNAもしくはその一部からなる DN Aをプロ一 ブまたはプライマーとして用いることを特徴とする、 フェレドキシン機能を有す るタンパク質をコードする DN Aの単離方法。
12. 請求項 5または請求項 10記載の形質転換体を培地で培養し、 培養中又 は培養後に、 増殖した形質転換体と、 式 （ΙΠ)
〔式中、
Figure imgf000066_0001
R12、 R16b、 R17a、 R17b、 R18、 R20a、 R20b、 R21 aおよび R2 同一または異なって、
(1) 水素原子、
(2) 置換基を有していても良い C — アルキル基、
(3) 一 OR (式中、 Rは
1)水素原子、 置換基を有していても良い、
2) — アルキル基、
3) C7一 22ァラルキル基、
4) 5員環ないし 14員環へテロァリールォキシアルキル基、
5) C2一 22アルカノィル基、
6) 。7_15ァロイル基、
7 ) C 3— 23不飽和アルカノィル基、
8) _C〇RC。 （式中、 Rc。は置換基を有していても良い、
8-1) 5員環ないし 14員環へテロアリール基、
' 8- 2) — 22アルコキシ基、
8-3)不飽和 C 2— 22アルコキシ基、
8-4) C 6— 4ァリールォキシ基、
8-5) 5員環ないし 14員環へテロァリールォキシ基、
もしくは
8- 6) 3員環ないし 14員環含窒素非芳香族複素環を表す） 、
9)じ卜 22ァノレキルスルホニル基、
10) C6— 14ァリールスルホニル基
または
1 1)一 S i Rs lRs 2Rs 3 (式中、 Rs l、 Rs 2および Rs3は同一ま なって、 じェ^ァルキル基またはじ ァリール基を表す） を表す） 、
(4) ハロゲン原子
または
(5) 一 RM— NRN1RN2
{式中、 RMは単結合または— O— CO—を表す；
RN1および RN2は
1) 同一または異なって、
1 - 1)水素原子もしくは
1 - 2)置換基を有していても良い、 (i) アルキル基、
(ii) 不飽和 C 2— 22アルキル基、
(iii) C 2一 22アルカノィル基
(iv) C7— 15ァロイル基、
(v) 不飽和 C3_ 23アルカノィル基、
(vi) 06_14ァリール基、
(vii) 5員環ないし 14員環へテロァリール基、
(viii) C7— 22ァラルキル基、
(ix) 一 22アルキルスルホニル基もしくは
' (X) 〇6_14ァリールスルホニル基を表すか、
または
2) RN1および RN2は結合する窒素原子と一緒になつて置換基を有していて も良い 3員環ないし 14員環含窒素非芳香族複素環を形成する } を表す； ただし、
R21aおよび R21bは一緒になつて、 （i)ケトン構造 （-0) または（ii)ォキシ ム構造 { = NOR。x (式中、 R。xは置換基を有していても良い、 22アルキ ル基、 不飽和 C2— 22アルキル基、 C6— 14ァリール基、 5員環ないし 14員環へ テロアリーノレ基または C7— 22ァラルキル基を表す） } を形成しても良い；
R 16 aは水素原子を表す；
R21 cは
(1) 水素原子または
(2)
Figure imgf000068_0001
(式中、 R22a、 R22bおよび R22cは同一または異なって、
1) 水素原子、 2) C — 6アルキル基、
3) -OR (式中、 Rは前記の意味を有する） 、
4) — RM— NRN1RN2 (式中、 RM、 RN1および RN2は前記の意味を有す る） または
5) ハロゲン原子
を表す；
あるいは、
R21 aおよび R21bのどちらか一方と R22aおよび R22bのどちらか一方とがー 緒になって部分構造
Figure imgf000069_0001
を形成しても良い；
Gmは
(1) 式 （GM-I) で示される基
Figure imgf000069_0002
{式中、
R 2および R 1(3は同一または異なって、 水素原子または 2アルキル基を表 す；
R3a、 R3b、 R5a、 R5b、 R6aおよび R6bは同一または異なって、
1) 水素原子、 2) ヒ ドロキシ基、
3) 置換基を有していても良い、
3-1) じ 22アルキル基、
3-2) — 22アルコキシ基、
3-3) C 644ァリールォキシ基
3-4) 5員環ないし 14員環へテロァリールォキシ基、
3-5) C2_22アルカノィルォキシ基、
3-6) 〇7_15ァロイルォキシ基
3-7) C 3— 23不飽和アルカノィルォキシ基、
• 3-8) _OCORe° (式中、 Rc°は前記の意味を有する） 、
3-9) Ci— 22アルキルスルホニルォキシ基、
3 - 10) C6— 14ァリールスルホニルォキシ基
もしくは
3-11) -OS i RslRs 2Rs 3 (式中、 Rs R 52および R s 3は前記の意味 を有する） 、
4) ハロゲン原子
または
5) -RM-NRN1RN2 (式中、 RM、 RN1および RN2は前記の意味を有す る） を表す；
あるいは、
R5aおよび R5bは一緒になってケトン構造 （=0) を形成しても良い； あるいは
R 6 aおよび R 6 bは一緒になつて、 スピロォキシラニル基またはェキソメチレ ン基を形成しても良い；あるいは、
R7aおよび R7bは同一または異なって、 水素原子または一 ORH (式中、 RH は水素原子、 C^ アルキノレ基または C2_22アルカノィル基を表す） を表す } 、 (2) 式 （GM - II) で示される基
Figure imgf000071_0001
(式中、 R2、 R3a、 R3b、 R6a、 R6b、 R7a、 R7bおよび R10は式 （GM - 1) の定義と同義である） 、
(3) 式 （GM - III) で示される基
Figure imgf000071_0002
(式中、 R2、 R5a、 R5b、 R6a、 R6b、 R7a、 R7bおよび R10は式 （GM-I) の定義と同義である） 、
(4) 式 （GM - IV) で示される基
Figure imgf000071_0003
(式中、 R2、 R6a、 R7a、 R7bおよび R10は式 （GM- 1) の定義と同義であ る）
または
(5) 式 （GM-V) で示される基
Figure imgf000072_0001
(式中、 R2、 R3a、 R6a、 R6bおよび R1。は式 （GM- 1) の定義と同義であ る） を表す〕
で示されるマクロライド系化合物とを接触させ、 式 （IV)
Figure imgf000072_0002
(式中、 W、 R12、 R16b、 R17a、 R17b、 R20a、 R20b、 R21a、 R21b、 112 ぉょぴ0111は式 （III) の定義と同義を表す）
で示される 16位水酸ィヒマク口ライド系化合物に変換し、 こうして変換された 16位 水酸化マク口ライド系化合物を採取することを特徴とする 16位水酸ィヒマク口ライ ド系化合物の生産方法。
13. 形質転換体が、 請求項 5記載の形質転換体であり、 かつフ レドキシン をコードする DN Aを有する形質転換体である請求項 12記載の生産方法。
14. 式（ΙΠ - a)
Figure imgf000073_0001
(式中、
H. A H
5=-4 は二重結合または単結合、 W' は二重結合または
R5'は水素原子またはァセトキシ基、 R6'は水素原子またはヒドロキシ基、 R 7'は水素原子またはァセチル基を表す） で示される化合物を、 式 (IV- a)
C
Figure imgf000073_0002
(式中、
W' 、 R5'.、 R6'および R7'は式 （III - a) の定義と同義である） で示される化 合物に変換することを特徴とする請求項 12記載の生産方法。
15. 式 （III- a) の化合物の、 式（IV- a)の化合物への変換において、 (1)
Figure imgf000073_0003
R5'、 R6'および R7'が水素原子である化合物、
(2)
H、 Q H
5—4 が単結合、 W' が
R5'および R6'が水素原子、 R7'がァセチノレ基である化合物、
(3)
H. 八
5—4 が単結合、 W' が
R5'および R7'が水素原子、 R6'がヒドロキシ基である化合物、
(4)
5—4 が単結合、 W が
Figure imgf000074_0001
R5'が水素原子、 R6'がヒドロキシ基、 R7'がァセチル基である化合物、 (5)
5-4 が単結合、
W が二重結合、 R5'、 R6 'および R7'が水素原子である化合物、
(6)
5-4 が単結合、
W が二重結合、 R5'および R6'が水素原子、 R7'がァセチル基である化合物、 (7) .
5-4 が単結合、
W が二重結合、 R5 'および R7'が水素原子、 R6'がヒドロキシ基で る化合 物、
(8) が単結合、
W' が二重結合、 R5'が水素原子、 R6'がヒ ドロキシ基、 R7'がァセチル基で ある化合物、
(9)
Hゝ八 H
5 4 が二重結合、 W， が
R5'および R7'が水素原子、 R6'がヒドロキシ基である化合物、
(10)
Hゝ八 H
が二重結合、 w， が
R5'が水素原子、 R6'がヒドロキシ基、 R7'がァセチル基である化合物、 (11)
H、八 H
5-4 が単結合、 W' が >^
R5'がァセトキシ基、 R6'がヒドロキシ基、 R7'が水素原子である化合物およ び
(12)
H、八 H
. が単結合、 w' が ~^<^
R5'がァセトキシ基、 R6'がヒドロキシ基、 R7'がァセチル基である化合物 からなる群から選択される化合物を対象とする請求項 14記載の生産方去。
16. 請求項5または請求項 10記載の形質転換体を、 16位水酸化マクロラ ィド系化合物の生産に用いる用途。
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