WO2005049857A1 - 糖化蛋白質の測定方法 - Google Patents

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WO2005049857A1 PCT/JP2004/017195 JP2004017195W WO2005049857A1 WO 2005049857 A1 WO2005049857 A1 WO 2005049857A1 JP 2004017195 W JP2004017195 W JP 2004017195W WO 2005049857 A1 WO2005049857 A1 WO 2005049857A1
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amino acid
peptide
lysines
enzyme
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Yuriko Taniguchi
Hiroyuki Ebinuma
Kazunari Saito
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Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.
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    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring a glycated protein, a sugar-containing peptide or a sugar-containing amino acid in a sample, and a measuring reagent used in the method.
  • a sugar-dried protein is a protein in which a protein is non-enzymatically saccharified.
  • An amide compound formed through an Amadori transfer after an aldehyde group on the sugar side and an amino group on the protein side form a Schiff base. It is.
  • the sugar-dang protein is widely present in the living body. Among them, the concentration of sugar-dang protein in blood depends on the concentration of monosaccharides such as glucose dissolved in blood serum.
  • the sugar-bound protein include a protein in which the ⁇ -amino group at the amino terminal of the protein is sugar-bound (eg, sugar-bound hemoglobin) and a protein in which the ⁇ -amino group of the internal lysine residue of the protein is bound.
  • sugar-shadow albumin and the concentration of sugar-shadow albumin in serum and the ratio of sugar-shadow hemoglobin to non-sugar-shadow hemoglobin in red blood cells are determined over a certain period in the past. It is used as an index for clinical diagnosis, such as the diagnosis of diabetes, the management of medical conditions, and the evaluation of therapeutic effects, because it reflects the average blood glucose level of the disease.
  • an enzymatic method which has a simple procedure and can be applied to an automatic analyzer commonly used in a clinical laboratory (for example, see Patent Document 1). .
  • the enzymatic method consists of a pretreatment step in which a glycated protein in a sample is allowed to act on a proteolytic enzyme to release a glycated peptide or a glycated amino acid as a substrate in the next step, and then the glycated peptide-specific enzyme or glycated amino acid is added to the released substrate.
  • a detectable product for example, hydrogen peroxide
  • a specific enzyme for example, oxidase
  • the reported enzymatic method is based on the fact that proteolytic enzymes in the pretreatment step and specific enzymes in the measurement step include glycated proteins, glycated peptides, and glycated amino acids (hereinafter collectively referred to as glycated proteins, etc.). Since it is not possible to strictly recognize the difference between the individual molecules, it may be difficult to determine whether or not the measurement target sugar-protein and the non-measurement protein coexist. In this case, there is a problem that the specific enzyme also reacts with a sugar-containing protein and the like that are not subject to the measurement, and the specificity of the measurement method is reduced.
  • glycated peptide-specific enzymes or glycated amino acid-specific enzymes used in the measurement step include oxidases produced by Corynebacterium spp. (For example, see Patent Document 2) and oxidases produced by Aspergillus spp. (For example, see Patent Document 3) These enzymes are enzymes that act well on sugar amino acids, and hardly act on glycated peptides.
  • Patent Document 4 an enzyme modified from fructosyl amino acid oxidase (Patent Document 4) or a fructosyl peptide oxidase derived from a filamentous fungus (Patent Document 5) has been reported, and these oxidases are synthesized under the condition of pH 8.0. , Especially fructosyl valyl histidine.
  • fructosyl amino acid oxidase In the measurement of sugarcane hemoglobin using fructosyl amino acid oxidase as described above, one more test is performed with fructosylvalin and fructosylvaline in which the amino-terminal palin of the hemoglobin 13-subunit is sugarcane.
  • fructosyl lysine derived from hemoglobin or other plasma proteins for example, glycated albumin, etc.
  • foods or drugs hereinafter sometimes referred to as “fructosyl lysines”.
  • Patent Document 1 JP-A-11-127895
  • Patent Document 2 Japanese Patent Publication No. 5-33997
  • Patent Document 3 JP-A-3-155780
  • Patent Document 4 JP 2001-95598 A
  • Patent Document 5 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-235585
  • the present invention provides a simple and efficient glycated protein, fructosyl peptide or fructosyl that can be applied to various automatic analyzers by reducing the effects of fructosyl lysines.
  • An object of the present invention is to provide a method for measuring an amino acid and a reagent for measuring the amino acid.
  • the inventors of the present invention have conducted intensive studies in view of the powerful circumstances, and as a result, have found that the enzyme for measurement of fructosyl peptide or fructosyl amino acid specifically acts at pH 4.0-7.0. In the measurement of glycated protein, fructosyl peptide or fructosyl amino acid, the present inventors have found that the effect of fructosyl lysines present in the reaction solution can be reduced, and the present invention has been completed.
  • the present invention specifically provides a fructosyl peptide or fructosyl amino acid at pH 4.0-7.0 by allowing a fructosyl peptide or fructosyl amino acid measurement enzyme to act on the fructosyl peptide or fructosyl amino acid, and converting the resulting product to pH 4 It is intended to provide a method for reducing the influence of fructosyl lysines on the measurement of fructosyl peptide or fructosyl amino acid, characterized by measuring at 0-7.0.
  • the present invention also relates to a method for measuring a fructosyl peptide or fructosyl amino acid at pH 4.0-7.0 by treating a glycated protein-containing sample with a proteolytic enzyme and releasing the fructosyl peptide or fructosyl amino acid at pH 4.0-7.0.
  • a method for reducing the influence of fructosyl lysines on the measurement of sugarcane protein in a sample characterized in that the enzyme is specifically actuated and the resulting product is measured at pH 4.0-7.0. Is what you do.
  • the present invention also provides at least (A) a protease, and (B) a specific enzyme which acts on fructosyl peptides or fructosyl amino acids at pH 4.0-7.0 to produce hydrogen peroxide.
  • An object of the present invention is to provide a reagent for measuring glycated protein, which has reduced effects of fructosyl lysines, including a reagent for measuring xidase and (C) hydrogen peroxide.
  • the present invention also relates to a method for measuring fructosyl peptide or fructosyl amino acid at pH 4.0-7.0, at least (A) an enzyme for measuring fructosyl peptide or fructosyl amino acid, and (B) measuring hydrogen peroxide. And a method for reducing the influence of fructosyl lysines on the measurement of fructosyl peptides or fructosyl amino acids, characterized by reacting a reagent for carrying out the reaction and (C) sugar oxidase.
  • the present invention further provides a fructosyl peptide or a fructosyl amino acid obtained by treating a glycated protein-containing sample with a proteolytic enzyme, at pH 4.0-7.0, at least (A) fructosyl. Measurement of a sugar-containing protein, characterized by reacting an enzyme for measuring a silpeptide or a fructosyl amino acid, (B) a reagent for measuring hydrogen peroxide, and (C) a saccharidinidase.
  • the present invention provides a method for reducing the effects of fructosyl lysines in the present invention.
  • glycated proteins, fructosyl peptides or fructosyl amino acids can be accurately measured by reducing the influence of fructosyl lysines. Since the measurement method of the present invention can be measured by simple operations, it can be applied to various analysis methods and is extremely useful in the field of clinical examination.
  • FIG. 1 is a view showing a correlation between hemoglobin Ale value (%) according to the method of the present invention (Example 5) and hemoglobin Ale value (%) according to Comparative Example 5 and a reference example.
  • the sugar cane protein may be any protein as long as the protein is non-enzymatically bound to an aldose such as glucose or the like.
  • an aldose such as glucose or the like.
  • sugar cane hemoglobin, sugar cane albumin, and the like can be mentioned, and sugar cane hemoglobin, particularly hemoglobin Ale (HbAlc) is suitably used as a measurement target.
  • HbAlc hemoglobin Ale
  • Examples of the sample containing a glycated protein include whole blood, blood cells, serum, plasma, cerebrospinal fluid, sweat, urine, tears, saliva, skin, mucous membrane, and hair as biological samples. Glycated proteins are also contained in general foods such as uses and seasonings. Of these, the sample is preferably whole blood, blood cells, serum, or plasma. These samples may be used for measurement as it is, or may be used for measurement after filtration or dialysis treatment. Also, the protein to be measured may be appropriately concentrated and extracted, and further, water or a buffer solution described below. May be diluted.
  • fructosyl peptides or fructosyl amino acids are released from a sugar-containing protein using a protease.
  • the proteolytic enzyme is not particularly limited as long as it has proteolytic activity and peptidolytic activity, but is preferably one that efficiently releases fructosyl peptide or fructosyl amino acid, preferably fructosyl noryl peptide or fructosyl valine, in a short time.
  • the origin of the protease is not particularly limited and may be derived from microorganisms, animals or plants.
  • Inase 1 ⁇ trypsin, bromelain, canoleboxypeptidase, papain, pepsin, aminopeptidase, etc., which are easily available as commercial products for research use, neutral proteinase, Toyozyme NEP (Toyobo), acid protease, Anorekari protease, morsin, AO protease, peptidase (above, manufactured by Kikkoman Co., Ltd.), Sumiteam CP, Sumiteam TP, Sumiteam LP50D (above, manufactured by Nippon Chemical Co., Ltd.), samoase PC10F, protin PC, protin PC10F, protin PS10 , Protin NY10, Protin NL10, Protin NC25 (above, manufactured by Daiwa Kasei), Actinase AS (manufactured by Kaken Pharmaceutical), Pronase E (manufactured by Roche), Mami
  • proteases can be confirmed by allowing them to act on fructosyl peptide or the like, analyzing the samples before and after the action using capillary electrophoresis and comparing them.
  • the above protease may be used alone or in combination of two or more. Among these, those derived from microorganisms of the genus Bacillus, Aspergillus or Streptomyces or produced by their genes, or those belonging to meta-oral proteinases, neutral proteases, acidic proteases or basic proteases are preferred.
  • Enzymes derived from Bacillus include Protin PC10F, Protin NC25 (manufactured by Daiwa Kasei), Toyoteam NEP (manufactured by Toyobo), and Aspergillus-derived enzymes include Morcin (manufactured by Kikkoman) and Streptomyces Examples of the enzyme include Actinase AS, Actinase AF, Actinase E (Kaken Pharmaceutical), and Protease Type-XIV (manufactured by Sigma). These can be used alone, or Toyoteam NEP and the like can be used in combination with proteinase K.
  • the concentration of the protease used is not particularly limited as long as the target fructosyl peptide or fructosyl amino acid can be efficiently released.
  • the concentration to be used can be appropriately set experimentally in consideration of the specific activity and the like of the enzyme to be used. For example, 0.001 to 50 mgZmL, preferably 0.001 to 20 mgZmL, of a protease which is derived from Aspergillus sp. (For example, Morcin, manufactured by Kikkoman Co., Ltd.) is added.
  • the pH when treating with proteolytic enzymes does not need to be particularly adjusted, but it will be the optimum pH for the action of the enzyme used. As described above, the pH may be adjusted to 3.0 to 11.0 with an appropriate pH adjuster, for example, a buffer described below.
  • the processing temperature is preferably 10-40 ° C.
  • Examples of the buffer include, but are not limited to, buffers of phosphoric acid, phthalic acid, citric acid, tris, maleic acid, succinic acid, oxalic acid, tartaric acid, acetic acid, and good (MES, PIPES, ADA, etc.). Can be used.
  • the concentration of the buffer is not particularly limited, either, but is 0.000001 to 2 mol ZL, more preferably 0.001 to 1 mol / L.
  • Examples of the free fructosyl peptide or fructosyl amino acid obtained by treating a sample with a protease include fructosylnorylhistidine, fructosyl valine and the like.
  • fructosyl peptides or glycan produced by the Amadori transfer after glucose is bound to peptides and amino acids released by the degradation of glycated proteins before the action of proteolytic enzymes Fructosyl amino acids are also included, and these are also included in free fructosyl peptides or fructosyl amino acids.
  • the released fructosyl peptide or fructosyl amino acid can be determined by allowing an enzyme for measuring fructosyl peptide or fructosyl amino acid to act and measuring the product resulting from the action.
  • the enzyme for measuring the fructosyl peptide or fructosyl amino acid is not particularly limited as long as it can metabolize the released fructosyl peptide or fructosyl amino acid. — 79386 and WO 97Z20039 pamphlet), ketoamine oxidase (JP-A-5-19219), fructosyl peptide oxidase (JP-A-2001-95598 and JP-A-2003-235585). And the like. Of these, fructosyl peptide oxidase is preferred. These enzymes may be of microbial origin, animal origin, plant origin, etc., or may be those produced by genetic engineering. Furthermore, the presence or absence of chemical modification does not matter. These enzymes can be used alone or in combination of two or more, whether in a solution state or a dry state, whether they are held or bound to an insoluble carrier.
  • the amount of the enzyme used varies depending on the type of the enzyme, and is preferably 0.001 to 1000 units ZmL, particularly preferably 0.1 to 500 units ZmL. In consideration of the specific activity of the enzyme to be used, the concentration to be used can be appropriately set experimentally. PH when acting Is adjusted using a buffer so as to obtain a pH of 4.0-7.0, preferably 4.0-6.7, at which the effect of the present invention can be obtained, in consideration of the optimum pH of the enzyme to be used.
  • the working temperature is, for example, 10 to 40 ° C., and a temperature used for a usual enzyme reaction can be appropriately selected.
  • buffers such as phosphoric acid, phthalic acid, citric acid, tris, maleic acid, succinic acid, oxalic acid, tartaric acid, acetic acid and good buffers can be used.
  • phosphoric acid, citrate, and ADA N- (2-acetamido) iminoniacetic acid
  • concentration of the buffer solution is not particularly limited, either, but is 0.000001 to 2 mol ZL, more preferably 0.001 to 1 mol ZL.
  • the above-mentioned enzyme for measurement can be used in combination with another enzyme, a coenzyme, an oxidizable color reagent or the like, if necessary.
  • Other enzymes include peroxidase, diaphorase or amino acid metabolizing enzymes that do not use fructosyl valine as a substrate.
  • enzymes for treating contaminant components in blood such as ascorbic acid oxidase and pyrylrubin oxidase, can also be used.
  • the coenzymes include nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), nicotinamide adenine dinucleotide reduced form (NADH), nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP), nicotinamide adenine dinucleotide reduced form phosphate (NADPH), and Tio NAD And NADP.
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • NADH nicotinamide adenine dinucleotide reduced form
  • NADP nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • NADPH nicotinamide adenine dinucleotide reduced form phosphate
  • any reagent can be used as long as it reacts with hydrogen peroxide and forms a color.
  • a combination of 4-aminoantipyrine with a phenol-based, naphthol-based or varin-based compound, a combination of 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone with an ar-line-based compound, and the like can be mentioned.
  • phenolic compounds that can be combined with 4-aminoantipyrine include phenol, p-chlorophenol, 2,4-dichlorophenol, 2,4-dibromophenol, and 2,4,6-trichlorophenol.
  • a-line compounds examples include N, N-dimethyla-line, N, N getyl-a-line, N, N dimethyl-m-toluidine, N, N-ethyl-m-toluidine, N-ethyl-N-sulfopropyl m -Toluidine, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3sulfopropyl) m-Toluidine (TOOS), N-ethyl-N- (3-methylphenyl) N, acetylethylenediamine, 3-methyl-N-ethyl- N (Hydroxyethyl) aline, N-ethyl-N- (2-H Droxy—3-sulfopropyl) a-line (ALOS), N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -arline (ALPS), N, N dimethyl-m-cidin, N-ethyl-N— (2-hydroxy
  • Examples of the product obtained by the action of the enzyme for measurement include peptides, hydrogen peroxide, sugar oson, and the like.
  • the measurement of the released fructosyl peptide or fructosylamino acid is performed by measuring these products.
  • it is preferable to measure hydrogen peroxide because it can be easily measured in a short time.
  • Examples of the method for measuring hydrogen peroxide include an electrical method using an oxygen electrode and an enzymatic method using peroxidase or diaphorase and the above-described coloring agent. The latter enzymatic method is preferable.
  • the measurement of hydrogen peroxide is usually performed by using a buffer solution as a measuring solution of hydrogen peroxide, which is performed continuously to the step of generating hydrogen peroxide by the action of the enzyme for measurement. Adjust ⁇ 4.0-7.0, preferably ⁇ 4.0-6.7.
  • the degree of color development (absorbance change) is measured with a spectrophotometer and compared with the absorbance of a standard known concentration of fructosyl peptide or fructosyl amino acid, and the glycated protein, fructosyl peptide contained in the sample is measured. Alternatively, fructosyl amino acids can be measured.
  • the step of releasing fructosyl peptide or fructosyl amino acid and the step of measuring the released fructosyl peptide or fructosyl amino acid are separately performed to measure sugarcane protein.
  • the measurement can be performed by performing these steps continuously in one step.
  • the reaction solution or the measurement solution is adjusted to ⁇ 4.0-7.0, preferably ⁇ 4.0-6.7, so that fructosyl peptide or fructosyl amino acid can be measured.
  • the effect of the routine enzyme on fructosyl lysines can be reduced. Therefore, in the step of measuring the released fructosyl peptide or fructosyl amino acid, it is essential to adjust the pH to the above.
  • the reagent for measuring saccharidation protein of the present invention comprises at least (A) a protease, and (B) a fructosyl peptide or fructosyl at pH 4.0-7.0.
  • the oxidase described in the above (B) is allowed to act on a fructosyl peptide or a fructosyl amino acid, and then glucosidase is further acted on darcosone to generate peroxidase, thereby increasing the sensitivity.
  • the saccharidinidase is preferably at least one selected from the group consisting of glucose oxidase, / 3-galatatosidase and vilanose oxidase.
  • the specific description of each enzyme and reagent is as described above.
  • a pretreatment agent or the like for extracting red blood cell hemoglobin and subjecting it to a reaction can be used, and an enzyme or a reaction for treating contaminant components in blood can be used.
  • Conditioning agents, stabilizers for reagents, salts such as sodium salt sodium, potassium salt sodium, potassium potassium salt, tetrazolium salts for avoiding the effects of reducing substances, antibiotics as preservatives, Sodium can also be added.
  • the pretreatment agent for taking out the erythrocyte force hemoglobin and subjecting it to the reaction includes a non-ionic surfactant (for example, Triton X-100, etc.) whose polyoxyethylene derivative power is also selected, and an anionic surfactant. Agents and the like can be used.
  • the use amount of these surfactants is 0.0001 to 10%, preferably 0.001 to 1%, in the sample which has been subjected to filtration, dialysis, and the like, if necessary.
  • the reagent for measuring sugar cane protein of the present invention can be provided not only in a solution state but also in a dried state or a gel state. Further, in addition to filling in a glass bottle, a plastic container, or the like, it can be provided in a form of application to an insoluble carrier, impregnation or the like.
  • the insoluble carrier include particles and spherical carriers such as latex, glass and colloid, flat carriers such as semiconductors and glass, membrane carriers such as paper and trocellulose, and fibrous carriers.
  • fructosyl valine fV
  • fructosylnoryl histidine fVH
  • fK ⁇ fructosyl lysine
  • Example 1 ⁇ 5.5, pH6.0, pH6.5, pH7.0
  • Example 1 ⁇ 5.5, pH6.0, pH6.5, pH7.0
  • the ratio of the measured value of ⁇ fructosyl lysine to the measured value of fructosyl valine (fKZfV), and the ratio of the measured value of ⁇ fructosyl lysine to the measured value of fructosyl valyl histidine (fK fKZfVH) was calculated.
  • the ratio of the measured values of fKZfV and fKZfVH under the pH 8.0 condition was set to 100%, and the ratio of the measured values under each pH condition was also compared. The results are shown in Table 1.
  • fructosyl valyl histidine (fVH) (manufactured by Biotaest) and ⁇ -fructosyl lysine (fK) (manufactured by Kikkoman) were dissolved in a 0.02 mol / L phosphate buffer (pH 7.0). By force, a sample having a concentration of 0.3 mmol ZL was obtained.
  • the first reagent of Example 1 was used. ⁇ Second reagent>
  • a second reagent having the same composition as in Example 1 was used except that 5 units of ZmL fructosyl peptide oxidase (FPOX-CE) was replaced with 5 units of ZmL fructosyl peptide oxidase (FPOX-EE).
  • Example 1 Among the first reagents of Example 1, those of pH 5.5 and pH 6.5 and Comparative Example 1 of pH 8.0 was used.
  • Example 1 Among the second reagents of Example 1, those of pH 5.5 and pH 6.5 and those of Comparative Example 1 having pH 8.0 were used.
  • Example 2 The same operation as in Example 1 was performed, and the ratio of the measured value of the mixed sample of fructosyl valine and ⁇ -fructosyl lysine to the measured value of the fructosyl valine sample ((fV + fK) ZfV) The ratio ((fVH + fK) / fVH) of the measured value of the mixed sample of fructosyl valyl histidine and ⁇ -fructosyl lysine to the measured value of the ctucosyl valyl histidine sample was calculated and evaluated. Table 3 shows the results.
  • Example 3 As is clear from Table 3, in Example 3, the effect of ⁇ -fructosyl lysine was significantly reduced as compared with Comparative Example 3.
  • Absorbance V Absorbance IV-(Absorbance ⁇ X (20 + 240) / (20 + 240 + 80))
  • Absorbance ⁇ ⁇ above is proportional to total hemoglobin concentration, so hemoglobin Ale value (%)
  • the hemolysed blood (haemoglobin Ale value 8.6%) was compared with the absorbances ⁇ and V when the same operation was performed as described above, and the hemoglobin Ale value (%) of each sample was calculated.
  • the hemoglobin Ale value obtained in Example 4 and Comparative Example 4 was measured using a sales kit “Lapidia Alc” (manufactured by Fujirebio) based on the latex method. Example). Table 4 shows the results.
  • the measurement method of the present invention can measure the hemoglobin A1c value (%) in a sample without being affected by hemoglobin-derived ⁇ -fructosyl lysine or frucsyl lysyl peptide.
  • a hemolyzed blood sample was prepared from 35 human blood cell samples in the same manner as in Example 4.
  • Each Toyozyme NEP is 100,000 units ZmL against 2 OmmolZL phosphate buffer (pH 5.5, 6.0, 7.0, 8.0) containing 500 mmol ZL NaCl. C dialyzed for 4 hours before use.
  • the hemoglobin Ale value (%) according to Example 5 and Comparative Example 5 and the hemoglobin Ale value (%) according to the reference example were measured using a commercially available kit “Ravidia A lcj (manufactured by Fuji Rebione Earth)”.
  • Fig. 1 shows the correlation between the measured value of the reference example and the correlation coefficient of the method of the present invention and the comparative example with respect to the measured value of the reference example.
  • Table 5 shows the average value of (% bias).
  • the measurement method of the present invention was found to be in good agreement with the reference example.
  • the hemoglobin Ale value (%) in a sample can be measured without being affected by ⁇ -fructosyl lysine or frucsyl lysyl peptide derived from hemoglobin.
  • buffering agents potassium phosphate, sodium citrate and N- (2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA)
  • the enzyme activity in the enzyme solution was measured using the Hitachi 7170 automatic analyzer by the following procedure.
  • Each of the three enzyme solutions was diluted twice with a 100 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5) and used for measurement.

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Abstract

　フルクトシルリジン類の影響を軽減し、かつ簡便で効率の良い糖化蛋白質、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸を測定する方法及び測定用試薬を提供する。 　フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸にｐＨ４．０～７．０でフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素を特異的に作用させ、得られる生成物をｐＨ４．０～７．０にて測定することを特徴とする、試料中のフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定におけるフルクトシルリジン類の影響の軽減方法、及びそれを用いた糖化蛋白質の測定方法。

Description

明 細 書
糖化蛋白質の測定方法
技術分野
[0001] 本発明は、試料中の糖化蛋白質、糖ィ匕ペプチド又は糖ィ匕アミノ酸の測定方法、及 びその測定方法に用いられる測定用試薬に関するものである。
背景技術
[0002] 糖ィ匕蛋白質は、蛋白質が非酵素的に糖化された蛋白質で、糖側のアルデヒド基と 蛋白質側のアミノ基がシッフ塩基を形成した後、アマドリ転移を経て形成されるアマド リ化合物である。糖ィ匕蛋白質は生体内に広く存在しており、このうち血液中の糖ィ匕蛋 白質の濃度は、血清中に溶解して 、るグルコースなどの単糖の濃度に依存して 、る 。糖ィ匕蛋白質としては、蛋白質のァミノ末端の α—ァミノ基が糖ィ匕されたもの（例えば 、糖ィ匕ヘモグロビン）、蛋白質の内部リジン残基の ε—ァミノ基が糖ィ匕されたもの（例 えば、糖ィ匕アルブミン)を挙げることができ、血清中の糖ィ匕アルブミンの濃度や赤血 球中の糖ィ匕ヘモグロビンと非糖ィ匕ヘモグロビンとの存在比は、過去の一定期間の平 均血糖値を反映することから、糖尿病の診断、病状の管理、治療効果の判定など臨 床診断の指標として使用されている。
[0003] 糖ィ匕蛋白質の測定方法としては、手技が簡単で、臨床検査室で繁用される自動分 析装置にも適応可能な酵素法が知られている (例えば、特許文献 1参照)。酵素法は 、試料中の糖化蛋白質に蛋白質分解酵素を作用させて次工程の基質となる糖化べ プチド又は糖化アミノ酸を遊離させる前処理工程、次いで、遊離した基質に糖化べ プチド特異酵素又は糖化アミノ酸特異酵素（例えば、ォキシダーゼ)を作用させて検 出可能な生成物 (例えば、過酸化水素）を生成させ、該検出可能な生成物を測定す る測定工程力 なる方法である。
[0004] し力しながら、報告されている酵素法は、前処理工程における蛋白質分解酵素及 び測定工程における特異酵素が糖化蛋白質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸 (以下、総 称して糖化蛋白質等と ヽぅことがある)個々の分子の違 、を厳密に認識することがで きないため、測定対象の糖ィ匕蛋白質等と測定対象外の糖ィ匕蛋白質等が共存する場 合、前記特異酵素が該測定対象外の糖ィ匕蛋白質等とも反応してしまい、測定方法と しての特異性が低下するという問題がある。
[0005] 前記測定工程に用いられる糖化ペプチド特異酵素又は糖化アミノ酸特異酵素とし ては、従来、コリネバクテリウム属菌の生産するォキシダーゼ (例えば、特許文献 2参 照）、ァスペルギルス属菌の生産するォキシダーゼ (例えば、特許文献 3参照）等が 知られている力 これらの酵素は糖ィ匕アミノ酸にはよく作用する力 糖化ペプチドには 作用しにくい。最近、フルクトシルアミノ酸ォキシダーゼを改変した酵素（特許文献 4) 、あるいは糸状菌由来フルクトシルペプチドォキシダーゼ (特許文献 5)が報告され、 これらのォキシダーゼは、 pH8. 0の条件下で糖ィ匕ペプチド、特にフルクトシルバリル ヒスチジンに対して特異的に作用するとされている。
[0006] 前記の様なフルクトシルアミノ酸ォキシダーゼを用いた糖ィ匕ヘモグロビンの測定で は、ヘモグロビン 13—サブユニットのァミノ末端のパリンが糖ィ匕されたフルクトシルバリ ンゃ、フルクトシルバリンに更に一アミノ酸が付カ卩しているフルクトシルノ リルヒスチジ ンと、蛋白質中のリジン残基が糖化された ε フルクトシルリジンに対する反応性の違 いが、ォキシダーゼの特異性を決定する。しかし、ヘモグロビン分子には 44個のリジ ン残基が存在しており、 ε フルクトシルリジンに対する反応性が低くとも、その影響 を無視できない。また、ヘモグロビンや他の血漿蛋白質由来 (例えば、糖化アルブミ ンなど)又は食品、薬剤由来のフルクトシルリジンを含む化合物（以下「フルクトシルリ ジン類」と 、う場合がある）による正誤差を従来の方法では回避できな 、。
特許文献 1：特開平 11-127895号公報
特許文献 2：特公平 5 - 33997号公報
特許文献 3 :特開平 3— 155780号公報
特許文献 4 :特開 2001— 95598号公報
特許文献 5：特開 2003— 235585号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 従って、本発明は、フルクトシルリジン類の影響を軽減して種々の自動分析装置に 適用できる簡便で効率の良い、糖化蛋白質、フルクトシルペプチド又はフルクトシル アミノ酸を測定する方法及びその測定用試薬を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、力かる実情に鑑み鋭意研究を行った結果、 pH4. 0-7. 0でフルク トシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素を特異的に作用させることによ り、糖化蛋白質、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定において、反 応液中に存在するフルクトシルリジン類の影響を軽減できることを見出し、本発明を 兀成し 7こ。
[0009] すなわち、本発明は、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸に、 pH4. 0— 7. 0でフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素を特異的に作用 させ、得られる生成物を pH4. 0-7. 0にて測定することを特徴とする、フルクトシル ペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定におけるフルクトシルリジン類の影響の軽減 方法を提供するものである。
[0010] 本発明はまた、糖化蛋白質含有試料を蛋白質分解酵素で処理し、遊離するフルク トシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸に、 pH4. 0—7. 0でフルクトシルペプチド又 はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素を特異的に作用させ、得られる生成物を pH4. 0-7. 0にて測定することを特徴とする、試料中の糖ィ匕蛋白質の測定におけるフルク トシルリジン類の影響の軽減方法を提供するものである。
[0011] 本発明はまた、少なくとも、（A)蛋白質分解酵素、 (B) pH4. 0-7. 0でフルクトシ ルペプチド又はフルクトシルアミノ酸に特異的に作用して過酸ィ匕水素を生成するォキ シダーゼ及び (C)過酸ィ匕水素を測定するための試薬を含むフルクトシルリジン類の 影響を軽減した糖化蛋白質測定用試薬を提供するものである。
[0012] 本発明はまた、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸に、 pH4. 0-7. 0で 、少なくとも (A)フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素、（B)過 酸化水素を測定するための試薬及び (C)糖酸化分解酵素を作用させることを特徴と する、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定におけるフルクトシルリジ ン類の影響の軽減方法を提供するものである。
[0013] 本発明は更に、糖化蛋白質含有試料を蛋白質分解酵素で処理して得られるフルク トシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸に、 pH4. 0-7. 0で、少なくとも（A)フルクト シルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素、（B)過酸化水素を測定するた めの試薬及び (C)糖酸ィ匕分解酵素を作用させることを特徴とする、糖ィ匕蛋白質の測 定におけるフルクトシルリジン類の影響の軽減方法を提供するものである。
発明の効果
[0014] 本発明によれば、フルクトシルリジン類の影響を軽減して正確に糖化蛋白質、フル クトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸を測定することができる。本発明の測定方 法は、簡便な操作で測定が可能であるため、種々の分析方法に適用でき、臨床検査 の領域においても極めて有用である。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]本発明の方法によるヘモグロビン Ale値（％) (実施例 5)及び比較例 5によるへ モグロビン Ale値（％)と参照例との相関関係を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 糖ィ匕蛋白質は、蛋白質がグルコース等のアルド一スと非酵素的に結合し、生成した ものであれば如何なるものでもよい。例えば、糖ィ匕ヘモグロビン、糖ィ匕アルブミン等が 挙げられ、このうち糖ィ匕ヘモグロビン、特にヘモグロビン Ale (HbAlc)が測定対象と して好適に用いられる。
[0017] 糖化蛋白質を含有する試料としては、生体試料として、全血、血球、血清、血漿、 髄液、汗、尿、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪が挙げられる。また、糖化蛋白質は、ジ ユース、調味料等の食品一般にも含有されている。これらのうち試料としては、全血、 血球、血清、血漿が好ましい。これらの試料は、そのまま測定に供することはもちろん 、ろ過や透析処理の後に測定に供してもよぐまた測定すべき糖ィ匕蛋白質を適宜、濃 縮、抽出、更には水もしくは後記する緩衝液で希釈してもよい。
[0018] 本発明においては、先ず、蛋白質分解酵素を用い、糖ィ匕蛋白質よりフルクトシルぺ プチド又はフルクトシルアミノ酸を遊離させる。蛋白質分解酵素は、蛋白質分解活性 、ペプチド分解活性を有していれば特に制限されないが、短時間で効率よくフルクト シルペプチド又はフルクトシルアミノ酸、好ましくはフルクトシルノ リルペプチド又はフ ルクトシルバリンを遊離させるものが良い。該蛋白質分解酵素の起源は、微生物由来 、動物由来、植物由来など何れでもよぐ特に限定はされない。具体的には、プロテ イナ一ゼ1^、トリプシン、ブロメライン、カノレボキシぺプチダーゼ、パパイン、ペプシン、 アミノぺプチダーゼなど研究用途の市販品として容易に入手できるもの、ニュートラル プロティナーゼ、トヨチーム NEP (以上、東洋紡社製）、酸性プロテアーゼ、ァノレカリ プロテアーゼ、モルシン、 AOプロテアーゼ、ぺプチダーゼ（以上、キッコ一マン社製） 、スミチーム CP、スミチーム TP、スミチーム LP50D (以上、新日本化学工業社製）、 サモアーゼ PC10F、プロチン PC、プロチン PC10F、プロチン PS10、プロチン NY1 0、プロチン NL10、プロチン NC25 (以上、大和化成社製）、ァクチナーゼ AS (科研 製薬社製）、プロナーゼ E (ロシュ社製）、ゥマミザィム、プロテアーゼ S「ァマノ」 G、プ 口テアーゼ A「ァマノ」 G、プロテアーゼ P「ァマノ」 3G (以上、アマノエンザィム社製）な ど工業用として市販されているものが挙げられる。これら蛋白質分解酵素は、フルクト シルペプチド等に作用させ、作用の前後の試料をキヤピラリー電気泳動を用いて分 析、比較することにより効果を確認できる。上記蛋白質分解酵素は、単独で用いても 、また二種以上を組み合わせて用いてもよい。これらのなかで、バチルス属、ァスぺ ルギルス属もしくはストレプトマイシス属の微生物由来、あるいはその遺伝子により産 生されるもの、又はメタ口プロティナーゼ、中性プロテアーゼ、酸性プロテアーゼもしく は塩基性プロテアーゼに属するものが好ましい。バチルス属由来の酵素としては、プ ロチン PC10F、プロチン NC25 (大和化成社製）、トヨチーム NEP (東洋紡社製）など 、ァスペルギルス属由来の酵素としては、モルシン（キッコーマン社製）、ストレプトマ シシス属由来の酵素としては、ァクチナーゼ AS、ァクチナーゼ AF、ァクチナ一ゼE ( 科研製薬）、プロテアーゼ Type— XIV (シグマ社製)などが挙げられる。これらは単独 で使用できるほか、トヨチーム NEPなどはプロティナーゼ Kと混合して併用することも できる。
蛋白質分解酵素の使用濃度は、 目的とするフルクトシルペプチド又はフルクトシル アミノ酸を効率よく遊離できる濃度であれば特に制限はない。使用する酵素の比活 性などを考慮し、実験的に使用濃度を適宜設定することができる。例えば、ァスペル ギルス属菌由来の蛋白質分解酵素（例えば、モルシン、キッコ一マン社製）を 0. 000 1一 50mgZmL、好ましくは 0. 001— 20mgZmL加える。蛋白質分解酵素で処理 するときの pHは、特に調整しなくてもよいが、使用する酵素の作用に至適な pHとな るように、適当な pH調整剤、例えば後記の緩衝液によって pH3. 0— 11. 0に調整し てもよい。処理温度は、 10— 40°Cが好ましい。
[0020] 緩衝液としては特に制限はなぐリン酸、フタル酸、クェン酸、トリス、マレイン酸、コ ハク酸、シユウ酸、酒石酸、酢酸、グッド（MES、 PIPES, ADAなど）の緩衝液等が 使用できる。緩衝液の濃度も特に制限はないが、 0. 00001— 2molZL、より好まし くは 0. 001— lmol/Lである。
[0021] 試料を蛋白質分解酵素で処理して得られる遊離したフルクトシルペプチド又はフル クトシルアミノ酸としては、フルクトシルノ リルヒスチジン、フルクトシルバリン等が挙げ られる。また、生体試料や食品中には、蛋白質分解酵素を作用させる前に既に、糖 化蛋白質が分解されて遊離したペプチドやアミノ酸にグルコースが結合した後、アマ ドリ転移を経て生成したフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸も含まれており 、これらも遊離したフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸に含まれる。
[0022] 遊離したフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸は、フルクトシルペプチド又 はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素を作用させ、その作用による生成物を測定する こと〖こより柳』定できる。
[0023] 当該フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素としては、遊離し たフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸を代謝できるものであれば特に制限 されず、例えば、フルクトシルアミノ酸ォキシダーゼ（特開 2003— 79386号公報及び 国際公開第 97Z20039号パンフレット）、ケトアミンォキシダーゼ (特開平 5— 19219 号公報）、フルクトシルペプチドォキシダーゼ (特開 2001— 95598号公報及び特開 2 003— 235585号公報）等が挙げられる。これらのうちで、フルクトシルペプチドォキシ ダーゼが好ましい。これらの酵素は、微生物由来、動物由来、植物由来等のいずれ でもよぐまた遺伝子操作により作られたものでもよい。更に、化学修飾の有無も問わ ない。これらの酵素は、溶液状態でも乾燥状態でもよぐ不溶性担体に保持又は結 合されていてもよぐ単独で又は 2種以上を組み合わせて使用することができる。
[0024] これらの酵素の使用量は、酵素の種類によっても異なる力 好ましくは 0. 001— 10 00単位 ZmL、特に好ましくは 0. 1— 500単位 ZmLである。使用する酵素の比活性 などを考慮し、実験的に使用濃度を適宜設定することができる。作用させるときの pH は、使用する酵素の至適 pHを考慮しながら、本発明の効果が得られる pH4. 0-7. 0、好ましくは 4. 0-6. 7となるように緩衝液を用いて調整する。作用温度は、例えば 、 10— 40°Cであり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択できる。この場合 の緩衝液は、前記同様、特に制限なぐリン酸、フタル酸、クェン酸、トリス、マレイン 酸、コハク酸、シユウ酸、酒石酸、酢酸、グッドの緩衝液等が使用できる。これらのうち 、リン酸、クェン酸、 ADA (N— (2—ァセトアミド）イミノニ酢酸）がフルクトシルペプチド 又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素の保存安定性にもすぐれており好ま 、。緩 衝液の濃度も特に制限はないが、 0. 00001— 2molZL、より好ましくは 0. 001— 1 molZLである。
[0025] 上記測定用酵素は、必要に応じて、他の酵素、補酵素、被酸化性呈色試薬等と組 み合わせて使用することができる。他の酵素としては、パーォキシダーゼ、ジァホラー ゼ又はフルクトシルバリンを基質としないアミノ酸代謝酵素などが挙げられる。また、ァ スコルビン酸ォキシダーゼ、ピリルビンォキシダーゼ等の血液中の夾雑成分を処理 するための酵素も使用できる。補酵素としてはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ NAD)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（NADH)、ニコチンアミドアデ ニンジヌクレオチドリン酸 (NADP)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型リン 酸（NADPH)、チォ NAD、チォ NADP等が挙げられる。
[0026] 被酸ィ匕性呈色試薬としては、過酸ィ匕水素と反応して呈色するものであれば如何な るものでもよい。例えば、 4ーァミノアンチピリンと、フエノール系、ナフトール系又はァ 二リン系化合物との組み合わせ、 3—メチルー 2—べンゾチアゾリノンヒドラゾンとァ-リン 系化合物との組み合わせなどが挙げられる。 4ーァミノアンチピリンと組み合わせること ができるフエノール系化合物としては、フエノール、 p クロ口フエノール、 2, 4—ジクロ 口フエノール、 2, 4 ジブロモフエノール、 2, 4, 6—トリクロ口フエノールなどが挙げら れ、ァ-リン系化合物としては、 N, N—ジメチルァ-リン、 N, N ジェチルァ-リン、 N , N ジメチルー m—トルイジン、 N, N—ジェチルー m—トルイジン、 N—ェチルー N—スル ホプロピル m—トルイジン、 N—ェチルー N—（2—ヒドロキシー 3 スルホプロピル） m— トルイジン（TOOS)、 N—ェチルー N— (3—メチルフエ-ル） N，ーァセチルエチレンジ ァミン、 3—メチルー N—ェチルー N （ヒドロキシェチル）ァ-リン、 N—ェチルー N— (2—ヒ ドロキシ— 3—スルホプロピル）ァ-リン（ALOS)、 N—ェチルー N—( 3—スルホプロピル )ァ-リン (ALPS)、 N, N ジメチルー m ァ-シジン、 N—ェチルー N— (2—ヒドロキシ —3—スルホプロピル) m ァ-シジン (ADOS)などが挙げられる。その他、 N (カル ボシキメチルァミノカルボ-ル) 4, 4，—ビス（ジメチルァミノ）—ジフエ-ルァミン'ナト リウム塩（DA— 64)、 10— (カルボキシメチルァミノカルボ-ル)— 3, 7 ビス（ジメチル ァミノ）—フエノチアジン'ナトリウム塩（DA— 67)、 10— N—メチルカルバモイルー 3, 7— ジメチルァミノ— 10H—フエノチアジン（MCDP)、 N, N, Ν' , Ν' , Ν", Ν"—へキサ— 3—スルホプロピル 4, 4，， 4"—トリアミノトリフエ-ルメタン (TPM—PS)、ジァミノベン チジン、ヒドロキシフエニルプロピオン酸、テトラメチルベンチジン、オルトフエ二レンジ ァミンなどが挙げられる。
[0027] 前記測定用酵素を作用させて得られる生成物としては、例えば、ペプチド、過酸ィ匕 水素、糖ォソン等が挙げられる。遊離したフルクトシルペプチド又はフルクトシルァミノ 酸の測定は、これらの生成物を測定することによって行われるが、短時間で簡単に測 定できるため、過酸ィ匕水素を測定することが好ましい。過酸化水素の測定方法として は、例えば、酸素電極を用いる電気的方法、パーォキシダーゼ又はジァホラーゼと 上記の発色剤を用いる酵素的方法が挙げられるが、後者の酵素的方法が好ましい。
[0028] 過酸化水素の測定は、通常、前記測定用酵素を作用させて過酸化水素を発生さ せる工程に連続して行われる力 過酸ィ匕水素の測定溶液は、緩衝液を用いて ρΗ4. 0-7. 0、好ましくは ρΗ4. 0-6. 7に調整する。発色の程度（吸光度変化量）は、分 光光度計により測定し、標準とする濃度既知のフルクトシルペプチド又はフルクトシル アミノ酸等の吸光度と比較して、試料中に含まれる糖化蛋白質、フルクトシルぺプチ ド又はフルクトシルアミノ酸を測定することができる。
[0029] 本発明の測定方法では、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸を遊離させ る工程と遊離したフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸を測定する工程とを 別々に行って糖ィ匕蛋白質を測定することもできるし、これらの工程を連続的に一段階 で行って測定することもできる。
また、本発明の測定方法では、反応液又は測定液を ρΗ4. 0-7. 0、好ましくは ρΗ 4. 0— 6. 7に調整することにより、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測 定用酵素のフルクトシルリジン類に対する影響を軽減することができる。従って、遊離 したフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸を測定する工程では、上記 pHに 調整することが必須である。
[0030] 本発明のフルクトシルリジン類の影響を軽減した糖ィ匕蛋白質測定用試薬は、少なく とも（A)蛋白質分解酵素、 (B) pH4. 0-7. 0でフルクトシルペプチド又はフルクトシ ルアミノ酸に特異的に作用して過酸ィ匕水素を生成するォキシダーゼ、及び (C)過酸 化水素を測定するための試薬、を含む。更に、前記 (B)記載のォキシダーゼをフルク トシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸に作用させた結果生じるダルコソンにさらに 糖酸化分解酵素を作用させ、過酸ィ匕水素を生成させて感度増加を図ることができる（ 特開 2000— 333696号公報)。前記糖酸ィ匕分解酵素としては、グルコースォキシダ ーゼ、 /3 -ガラタトシダーゼ及びビラノースォキシダーゼ力 なる群力 選択された少 なくとも一つの酸ィ匕酵素であることが好ましい。それぞれの酵素及び試薬の具体的な 説明は前記の通りである。この他に、糖ィ匕ヘモグロビン、特にヘモグロビン Aleを測 定する際には赤血球力 ヘモグロビンを取り出して反応に供するための前処理剤な どが使用でき、血液中の夾雑成分を処理する酵素、反応調整剤、試薬の安定化剤、 また塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、フ ロシアンィ匕カリウムなどの塩、還元性物質の影 響回避のためのテトラゾリゥム塩、防腐剤としての抗生物質、アジィ匕ナトリウムなども添 加できる。
[0031] 上記の赤血球力 ヘモグロビンを取り出して反応に供するための前処理剤としては 、ポリオキシエチレン誘導体力も選ばれる非イオン系界面活性剤（例えばトリトン X— 1 00など)、陰イオン系界面活性剤等を用いることができる。これら界面活性剤の使用 量は、必要に応じて濾過、透析処理等を行った試料中、 0. 0001— 10%、好ましく は 0. 001— 1%である。
[0032] 本発明の糖ィ匕蛋白質測定用試薬は、溶液状態だけでなぐ乾燥状態やゲル状態 でも提供できる。また、ガラスビン、プラスチック容器等への充填の他、不溶性担体へ の塗布、含浸などの形態で提供できる。不溶性担体としては、例えば、ラテックス、ガ ラス、コロイドなどの粒子 ·球状担体、半導体やガラスなどの平板状担体、紙や-トロ セルロースなどの膜状担体、繊維状担体が挙げられる。 実施例
[0033] 以下実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定され るものではない。
[0034] [実施例 1] フルクトシルアミノ酸の測定
(1)試料の調製
フルクトシルバリン（fV)、フルクトシルノ リルヒスチジン（fVH) (以上、バイオタエスト 社製）、 ε フルクトシルリジン (fK) (キッコーマン社製）を量り、それぞれ 20mmolZ L リン酸緩衝液 (pH7. 0)に溶力して 0. 3mmol/L濃度の試料とした。
[0035] (2)試料の測定
日立 7150形自動分析装置を用いて、以下の操作により各試料の測定を行った。 <第一試薬 >
0. lmol/L リン酸緩衝液
実施例 1 ;ρΗ5. 5、 pH6. 0、 pH6. 5、 pH7. 0
比較例 1 ;ρΗ7. 5、 pH8. 0
<第二試薬 >
5単位 ZmL フルクトシルペプチドォキシダーゼ（FPOX CE、キッコ一マン社製） 20単位 ZmL パーォキシダーゼ (III) (東洋紡社製）
lmmol/L N—ェチルー N— (2—ヒドロキシー 3 スルホプロピル） m—トルイジン（TO OS)
lmmol/L 4ーァミノアンチピリン
0. lmol/L リン酸緩衝液
実施例 1 ;ρΗ5. 5、 pH6. 0、 pH6. 5、 pH7. 0
比較例 1 ;ρΗ7. 5、 pH8. 0
(第一試薬と第二試薬は同一の pHの組み合わせで使用した。）
[0036] 試料 20 μ Lに第一試薬 240 μ Lをカ卩え、 37°Cで 5分間加温後の吸光度を測定した
(吸光度 1)。次いで第二試薬 80 Lを加え、 37°Cで 5分間加温後の吸光度を測定し た（吸光度 Π)。吸光度の測定は主波長 546nm (副波長 800nm)で行い、試料の代 わりに生理食塩水を用いて同様に操作したもの (試薬ブランク)を対照とした。 各試料の吸光度 I及び吸光度 IIから式 Aを用いて各試料の吸光度変化量 (測定値) を算出した。
式 A：吸光度変化量 (測定値） =吸光度 II (吸光度 I X (20 + 240) 7 (20 + 240 + 80) )
得られた各測定値を用いて、フルクトシルバリンの測定値に対する ε フルクトシル リジンの測定値の比（fKZfV)、及びフルクトシルバリルヒスチジンの測定値に対する ε フルクトシルリジンの測定値の比 (fKZfVH)を算出した。また、 pH8. 0条件に おける fKZfV及び fKZfVHそれぞれの測定値の比を 100%として、各 pH条件の 測定値の比も比較した。結果を表 1に示した。
[0037] [表 1]
Figure imgf000012_0001
[0038] 表 1から明らかなように、 fK/fV, fKZfVHのいずれの場合でも、実施例の測定 値の比は比較例と比べて、大幅に低値であった。本発明の方法は、 fV、 fVHに対す る特異性が高ぐフルクトシルリジン類との反応性は低いことがわ力つた。
[0039] [実施例 2] フルクトシルアミノ酸の測定
( 1)試料の調製
実施例 1と同様、フルクトシルバリルヒスチジン (fVH) (バイオタエスト社製）、 εーフ ルクトシルリジン (fK) (キッコーマン社製）を 0. 02mol/Lのリン酸緩衝液 (pH7. 0) に溶力して 0. 3mmolZL濃度の試料とした。
[0040] (2)試料の測定
日立 7150形自動分析装置を用いて、以下の操作により各試料の測定を行った。 <第一試薬 >
実施例 1の第一試薬を使用した。 <第二試薬 >
5単位 ZmL フルクトシルペプチドォキシダーゼ（FPOX— CE)を 5単位 ZmL フ ルクトシルペプチドォキシダーゼ (FPOX— EE)に代える以外は実施例 1と同組成の 第二試薬を使用した。
(第一試薬と第二試薬は同一の pHの組み合わせで使用した。）
[0041] 実施例 1と同一の操作を行った。結果を表 2に示した。
[0042] [表 2]
Figure imgf000013_0001
[0043] 表 2から明らかなように、実施例 1とは異なるフルクトシルペプチドォキシダーゼ (FP OX— EE)を用いた場合においても、比較例と比べて、 fKZfVHが大幅に減少して おり、フルクトシルバリルヒスチジンに対する特異性が高ぐフルクトシルリジン類との 反応性が低 、ことがわ力つた。
[0044] [実施例 3] フルクトシルアミノ酸及びフルクトシルペプチドの測定
( 1)試料の調製
フルクトシルバリン、フルクトシルノ リルヒスチジン（以上、バイオタエスト社製）、 ε フルクトシルリジン（キッコーマン社製）をそれぞれ量り、 0. 02molZLリン酸緩衝液（ pH7. 0)〖こ溶力して 0. 6mmolZL濃度の溶液とした。 0. 6mmolZLフルクトシルバ リン溶液及び 0. 6mmolZLフルクトシルノ リルヒスチジン溶液に等量の 0. 02mol/ Lリン酸緩衝液 (pH7. 0)あるいは 0. 6mmol/L ε フルクトシルリジン溶液を混合 して、 0. 3mmolZLフルクトシルバリン試料
、 0. 3mmolZLフルクトシルバリルヒスチジン試料、あるいは ε フルクトシルリジンと の混合試料 (各基質の濃度は 0. 3mmolZL)とした。
[0045] (2)試料の測定
日立 7150形自動分析装置を用いて、以下の操作により各試料の測定を行った。 <第一試薬 >
実施例 1の第一試薬のうち、 pH5. 5と pH6. 5のもの、及び比較例 1のうち pH8. 0 のものを使用した。
<第二試薬 >
実施例 1の第二試薬のうち、 pH5. 5と pH6. 5のもの、及び比較例 1のうち pH8. 0 のものを使用した。
(第一試薬と第二試薬は共通の pHの組み合わせで使用した。）
[0046] 実施例 1と同様に操作を行い、フルクトシルバリン試料の測定値に対するフルクトシ ルバリンと ε —フルクトシルリジンとの混合試料の測定値の比（（fV+fK) ZfV)、及び フルクトシルバリルヒスチジン試料の測定値に対するフルクトシルバリルヒスチジンと ε -フルクトシルリジンとの混合試料の測定値の比（ (fVH + fK) /fVH)を算出し評 価した。結果を表 3に示す。
[0047] [表 3]
Figure imgf000014_0001
[0048] 表 3から明らかなように、実施例 3では、比較例 3と比べて ε —フルクトシルリジンの 影響が大きく軽減できて 、ることがわ力つた。
[0049] [実施例 4] ヘモグロビン Alc (HbAlc) %の測定
(1)試料の調製
EDTAを抗凝固剤として含む採血管を用いて被検者 15人力も常法により採血した 全血を、冷室にー晚静置して赤血球を沈降させた。沈降した赤血球層より 10 Lを 採取し、これに、 0. 1%トリトン X— 100水溶液 300 Lをカ卩ぇ混合し、血球溶血液 試料を調製した。
[0050] (2)試料の測定
日立 7150形自動分析装置を用いて、以下の操作により各試料の測定を行った。 <第一試薬 >
1単位 ZmL プロティナーゼ K
2mmol/L WST— 3 (同仁化学社製）
0. 02mol/L リン酸緩衝液 (pH8. 0) <第二試薬 >
4単位 ZmL フルクトシルペプチドォキシダーゼ（FPOX— CE、キッコ一マン社製） 20単位 ZmL パーォキシダーゼ (III) (東洋紡社製）
80 μ mol/L DA— 64 (和光純薬工業社製）
7500単位 ZmL トヨチーム NEP (東洋紡社製） *
37. 5mmol/L NaCl
0. 2mol/L リン酸緩衝液（実施例 4 : pH6. 0、比較例 4 :pH8. 0)
*それぞれのトヨチーム NEPは、 10万単位 ZmLを 500mmolZL NaClを含む 20 mmolZLのリン酸緩衝液（実施例 4 :pH6. 0、比較例 4 :pH8. 0)に対し、 4°Cで 4時 間透析した後用いた。
* *本発明及び比較例の反応液の最終 pHは、それぞれ 6. 7及び 8. 0である。
[0051] 各試料 20 μ Lに第一試薬 240 μ Lを加え、 37°Cで 5分間加温後の吸光度を測定し た（吸光度 ΠΙ)、次いで第二試薬 80 Lを加え、 37°Cで 5分間加温後の吸光度を測 定した（吸光度 IV)。尚、各々の試料の吸光度 ΠΙ及び吸光度 IVから、式 Bを用いて 各試料中のフルクトシルペプチド量に基づく吸光度変化量（吸光度 V)を算出した。 式 B：吸光度 V =吸光度 IV— (吸光度 ΠΙ X (20 + 240) / (20 + 240 + 80) ) 上記の吸光度 ΠΙは、総ヘモグロビン濃度に比例するので、ヘモグロビン Ale値（％ )既知の血球溶血液 (ヘモグロビン Ale値 8. 6%)を上記と同様に操作した場合の 吸光度 ΠΙ及び Vと比較し、各試料のヘモグロビン Ale値（％)を算出した。実施例 4、 比較例 4により求めたヘモグロビン Ale値を、ラテックス法を原理とする巿販キット「ラ ピディア Alc」（富士レビォ社製）により測定した各試料中のヘモグロビン Ale値（％) ( 参照例）と比較した。結果を表 4に示した。
[0052] [表 4] HbA 1 c値 （％)
試料 N o .
実施例 4 比較例 4 参照例
1 5. 2 10. 0 6. 0
2 4. 5 - 17. 0 5. 8
3 5. 4 -7. 2 6. 9
4 5. 0 一 4. 4 5. 7
5 4. 5 — 31. 4 5. 2
6 3. 9 -22. 4 4. 7
7 4. 4 -28. 7 4. 8
8 5. 5 一 8. 3 7. 0
9 5. 9 5. 6 7. 2
10 6. 8 5. 9 7. 5
1 1 6. 8 一 2. 9 8. 4
12 9. 1 49. 1 8. 8
13 8. 2 23. 9 8. 7
14 8. 9 27. 1 9. 6
15 1. 5 1 1. 5 1 1. 5
相関係数 0. 97 0. 74
[0053] 表 4より明らかなように、比較例 4では本来起こりえない負の値となってしまう場合が あるのに対し、本発明の測定方法は、比較例に比べて参照例との相関性が良いこと が判明した。よって、本発明の測定方法では、ヘモグロビン由来の ε フルクトシルリ ジン又はフルクシルリジルペプチドの影響を受けることなく試料中のヘモグロビン A1 c値 (％)を測定できる。
[0054] [実施例 5] ヘモグロビン Ale値（％)の測定（1)試料の調製
実施例 4と同様にヒト血球試料 35例より、血球溶血液試料を調製した。
[0055] (2)試料の測定
日立 7150形自動分析装置を用いて、以下の操作により各試料の測定を行った。 <第一試薬 >
1単位 ZmL プロティナーゼ K
0.2% プライサーフ A208B (第一工業製薬社製）
0.02mol/L リン酸緩衝液 (pH8.0)
<第二試薬 >
4単位 ZmL フルクトシルペプチドォキシダーゼ（FPOX— CE、キッコ一マン社製) 20単位 ZmL パーォキシダーゼ (III) (東洋紡社製） 80 μ mol/L TPM-PS (同仁化学社製）
7500単位 ZmL トヨチーム NEP (東洋紡社製） *
37. 5mmol/L NaCl
0. 2mol/L ジン酸緩衝液（pH5. 5、 6. 0、 7. 0、 8. 0)
*それぞれのトヨチーム NEPは、 10万単位 ZmLを 500mmolZLの NaClを含む 2 OmmolZLのリン酸緩衝液（pH5. 5、 6. 0、 7. 0、 8. 0)に対し、 4。Cで 4時間透析し た後用いた。
[0056] 試料 20 μ Lに、第一試薬 240 μ Lを加え、波長 600nmにおける吸光度（吸光度 VI )を、試料の代わりに生理食塩水を用い同様に操作したもの (試薬ブランク)を対照に 測定した。次いで 37°Cで 5分間加温した後、第二試薬 80 Lをカ卩え、 37°Cで 5分間 加温後の波長 600nmの吸光度（吸光度 VII)を試薬ブランクを対照に測定した。これ ら 4種の反応液の最終 pHは、それぞれ 6. 4、 6. 7、 7. 2、 8. 0であり、ヘモグロビン Ale値 (％)は、実施例 4と同様にして算出した。参照例として市販キット「ラビディア A lcj (富士レビオネ土製)を用い、製造元指定の方法にて測定した。実施例 5ならびに比 較例 5によるヘモグロビン Ale値（％)と参照例によるヘモグロビン Ale値（％)との相 関関係を図 1に示した。また、本発明法および比較例のそれぞれについて、参照例 に対する相関係数、及び参照例の測定値との差の参照例の測定値に対するパーセ ント（％バイアス）の平均値を表 5に示した。
[0057] [表 5]
Figure imgf000017_0001
[0058] 本発明の測定方法は、参照例とよく一致していることが判明した。本発明の測定方 法では、ヘモグロビン由来の ε 一フルクトシルリジン又はフルクシルリジルペプチドの 影響を受けることなく試料中のヘモグロビン Ale値（％)を測定できる。
[0059] [実施例 6] フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素の保存安 定性の確認
( 1)酵素液の調製 下記の処方で酵素液を調製した。
50mmol/L 緩衝液（pH6. 0) *
*緩衝剤の種類はリン酸カリウム、クェン酸ナトリウム及び N-(2-ァセトアミド)ィミノ 二酢酸 (ADA)の 3種類
5単位 ZmL パーォキシダーゼ (III) (東洋紡社製）
1単位/ mL フルクトシルペプチドォキシダーゼ（FPOX— CE,キッコ一マン社製） [0060] (2)酵素液の保存
前記の 3種類の酵素液それぞれを 4°C、 37°Cに 1晚放置した。
[0061] (3)酵素液中の酵素活性の測定
日立 7170形自動分析装置を用いて、以下の操作により酵素液中の酵素活性を測 し 7こ。
<希釈酵素液 >
前記の 3種類の酵素液それぞれを、 100mmol/L リン酸緩衝液 (pH7. 5)により 2倍に希釈して測定に使用した。
<酵素活性測定用第一試薬 >
0. 5mmol/L N—ェチルー N— ( 2—ヒドロキシー 3 スルホプロピル） m—トルイジン (TOOS)
0. 5mmol/L 4ーァミノアンチピリン
1単位 ZmL パーォキシダーゼ (III) (東洋紡社製）
100mmol/L リン酸緩衝液 (pH7. 5)
<酵素活性測定用第二試薬 >
150mmol/L フルクトシルグリシン水溶液
[0062] 希釈酵素液 6. 5 Lに、酵素活性測定第一試薬 182 Lを加え、 37°Cで 5分間加 温した。次いで酵素活性測定用第二試薬 26 Lを加え、酵素活性測定用第二試薬 添加後 2分一 3分の 546nmにおける吸光度の変化量を測定した。 4°C保存した酵素 液の吸光度変化量を 100%とし、 37°C保存した酵素液の吸光度変化量を相対値で 表わし、安定性を評価した。
[0063] リン酸カリウム緩衝液では 95%、クェン酸ナトリウム緩衝液では 98%、 ADA緩衝液 では 89%の相対活性が測定され、これらの緩衝剤力 フルクトシルペプチド又はフ ルクトシルアミノ酸の測定用酵素の保存安定性に優れていることが確認された。

Claims

請求の範囲
[1] フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸に、 pH4. 0—7. 0でフルクトシルぺ プチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素を特異的に作用させ、得られる生成物 を pH4. 0-7. 0にて測定することを特徴とする、フルクトシルペプチド又はフルクトシ ルアミノ酸の測定におけるフルクトシルリジン類の影響の軽減方法。
[2] 糖化蛋白質含有試料を蛋白質分解酵素で処理し、遊離するフルクトシルペプチド 又はフルクトシルアミノ酸に、 ρΗ4. 0—7. 0でフルクトシルペプチド又はフルクトシル アミノ酸の測定用酵素を特異的に作用させ、得られる生成物を ρΗ4. 0-7. 0にて測 定することを特徴とする、試料中の糖ィ匕蛋白質の測定におけるフルクトシルリジン類 の影響の軽減方法。
[3] 糖ィ匕蛋白質が糖ィ匕ヘモグロビンである請求項 2記載のフルクトシルリジン類の影響 の軽減方法。
[4] 蛋白質分解酵素が、バチルス属、ァスペルギルス属又はストレプトマイシス属の微 生物由来、あるいは該微生物の遺伝子を組換え操作して得られるものである請求項
2又は 3記載のフルクトシルリジン類の影響の軽減方法。
[5] フルクトシルペプチドがフルクトシルバリルヒスチジンである請求項 1一 4の!、ずれか
1項記載のフルクトシルリジン類の影響の軽減方法。
[6] フルクトシルアミノ酸がフルクトシルバリンである請求項 1一 4の!、ずれか 1項記載の フルクトシルリジン類の影響の軽減方法。
[7] フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素がフルクトシルぺプチ ドォキシダーゼである請求項 1一 6のいずれ力 1項記載のフルクトシルリジン類の影響 の軽減方法。
[8] 得られる生成物が過酸ィ匕水素である請求項 1一 7のいずれ力 1項記載のフルクトシ ルリジン類の影響の軽減方法。
[9] 少なくとも、（Α)蛋白質分解酵素、 (Β) ρΗ4. 0-7. 0でフルクトシルペプチド又は フルクトシルアミノ酸に特異的に作用して過酸ィ匕水素を生成するォキシダーゼ及び（
C)過酸ィ匕水素を測定するための試薬を含むフルクトシルリジン類の影響を軽減した 糖化蛋白質測定用試薬。
[10] フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸に、 pH4. 0-7. 0で、少なくとも (A) フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素、（B)過酸化水素を測 定するための試薬及び (C)糖酸ィ匕分解酵素を作用させることを特徴とする、フルクト シルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定におけるフルクトシルリジン類の影響の 軽減方法。
[11] 糖化蛋白質含有試料を蛋白質分解酵素で処理して得られるフルクトシルペプチド 又はフルクトシルアミノ酸に、 pH4. 0-7. 0で、少なくとも（A)フルクトシルペプチド 又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素、（B)過酸ィ匕水素を測定するための試薬及 び (C)糖酸化分解酵素を作用させることを特徴とする、糖化蛋白質の測定における フルクトシルリジン類の影響の軽減方法。
[12] 糖ィ匕蛋白質が糖ィ匕ヘモグロビンである請求項 11記載のフルクトシルリジン類の影 響の軽減方法。
[13] 蛋白質分解酵素が、バチルス属、ァスペルギルス属又はストレプトマイシス属の微 生物由来、あるいは該微生物の遺伝子を組換え操作して得られるものである請求項
11又は 12記載のフルクトシルリジン類の影響の軽減方法。
[14] フルクトシルペプチドがフルクトシルノ リルヒスチジンである請求項 10— 13のいず れカゝ 1項記載のフルクトシルリジン類の影響の軽減方法。
[15] フルクトシルアミノ酸がフルクトシルバリンである請求項 10— 13のいずれ力 1項記載 のフルクトシルリジン類の影響の軽減方法。
[ 16] フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素がフルクトシルぺプチ ドォキシダーゼである請求項 10— 15のいずれ力 1項記載のフルクトシルリジン類の 影響の軽減方法。
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