KR20070023661A

KR20070023661A - 당화 단백질의 측정 방법

Info

Publication number: KR20070023661A
Application number: KR1020067018284A
Authority: KR
Inventors: 유리코 다니구치; 도모히사 니시오; 가즈노리 사이토
Original assignee: 다이이치 가가쿠 야쿠힝 가부시키가이샤
Priority date: 2004-03-17
Filing date: 2005-03-16
Publication date: 2007-02-28

Abstract

단백질 분해효소의 분해작용을 제어하여 정밀도 좋게 당화 단백질, 당화 펩티드 또는 당화 아미노산을 측정방법 및 그의 측정방법에 이용되는 측정시약을 제공한다.

당화단백질 함유 시료를 단백질 분해효소로 처리하여 유리된 당화 펩티드 또는 당화 아미노산에 대응하는 옥시다제를 작용시켜, 생성하는 과산화수소를 퍼옥시다제 및 피산화성 정색시약을 이용하여 측정하는 방법에 있어서, 옥시다제 작용 전의 반응액을 pH 1∼5로 조정함을 특징으로 하는 당화 단백질, 당화 펩티드 또는 당화 아미노산의 측정 방법 및 이들의 측정용 시약.

Description

당화 단백질의 측정 방법 {METHOD OF MEASURING GLYCOPROTEIN}

본 발명은 시료중의 당화 단백질, 당화 펩티드 또는 당화 아미노산의 측정 방법 및 그의 측정 방법에 이용되는 당화 단백질의 측정용 시약에 관한 것이다.

당화 단백질은 단백질이 비효소적으로 당화된 단백질로, 당 쪽의 알데히드기와 단백질 쪽의 아미노기가 쉬프 염기를 형성한 후, 아마도리 전이(Amadori rearrangement)를 거쳐 형성되는 아마도리 화합물이다. 당화 단백질은 생체내에 널리 존재하고 있으며, 이 중 혈액중의 당화단백질의 농도는 혈액 중에 용해되어 있는 글루코오스 등의 단당(單糖)의 농도에 의존하고 있다. 당화 단백질로서는 단백질의 아미노 말단의 α-아미노기가 당화된 것(예를 들면, 당화 헤모글로빈), 단백질의 내부 리진 잔기의 ε-아미노기가 당화된 것(예를 들면, 당화 알부민)을 들 수가 있으며, 혈청중의 당화 알부민의 농도나 적혈구 중의 당화 헤모글로빈과 비당화 헤모글로빈과의 존재비는, 과거의 일정기간의 평균 혈당치를 반영하는 것으로부터, 당뇨병의 진단, 병상의 관리, 치료 효과의 판정 등 임상 진단의 지표로서 사용되고 있다.

당화 단백질의 측정 방법으로서는 효소법이 있다(예를 들면, 특허 문헌 1 및 2 참조). 효소법은 시료중의 당화 단백질에 단백질 분해효소를 작용시키고, 다음 공정의 기질로 되는 당화 펩티드 또는 당화 아미노산을 유리시키는 전처리 공정 및 유리된 기질에 당화 펩티드 특이 효소 또는 당화 아미노산 특이 효소(예를 들면, 옥시다제)를 작용시켜 검출 가능한 생성물(예를 들면, 과산화수소)을 생성시키고, 이 검출 가능한 생성물을 측정하는 공정으로 이루어진다.

효소법에 의한 당화 단백질 측정에서는 단백질 분해효소가 발색반응에 제공되는 기질의 생성을 담당하고 있다. 따라서, 소정 시간 내에 충분한 당해 기질을 공급하기 위해서는 단백질 분해효소를 많이 사용할 필요가 있다. 그런데, 단백질 분해효소는 시료 중의 당화 단백질뿐만 아니라, 측정계에 존재하는 측정에 필수적인 효소(예를 들면, 옥시다제)도 동시에 분해하기 때문에, 단백질 분해효소가 고농도로 존재하면, 본래 측정되어야 하는 당화 단백질의 측정 정밀도가 저하하는 문제점이 있다.

한편, 과산화수소의 측정 방법으로서는 퍼옥시다제(POD) 존재하에서 4-아미노안티피린(4-AA), 3-메틸-2-벤조티아졸리논히드라존(MBTH) 등의 커플러와 페놀계, 아닐린계 또는 톨루이딘계의 색원체와의 산화 축합에 의해 색소를 생성하는 트린더 시약류, POD 존재하에서 직접 산화 정색하는 로이코 색소를 이용하는 방법 등이 범용되고 있다. 로이코 색소로서는 수용성을 개선한 트리페닐메탄계의 로이코 색소가 알려져 있으며(특허 문헌 3 참조), 특히 고감도 측정에 유용하다.

특허 문헌 1: 일본국 특허공개 평5-192193호 공보

특허 문헌 2: 일본국 특허공개 2001-95598호 공보

특허 문헌 3: 일본국 특허공개 평3-206896호 공보

따라서, 본 발명은 단백질 분해효소의 분해작용을 제어하여 정밀도가 양호한 당화 단백질, 당화 펩티드 또는 당화 아미노산을 측정하는 방법 및 그의 측정 방법에 이용되는 측정 시약을 제공하는 데에 있다.

본 발명자들은 이러한 실정을 감안하여 예의 연구한 결과, 당화 단백질의 효소적 측정법에 있어서, 당화 펩티드 특이 효소 또는 당화 아미노산 특이 효소 작용 전의 반응액을 pH 1∼5로 조정함으로써, 단백질 분해효소의 분해작용을 제어하여 당화 단백질 등이 정밀도 좋게 측정할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 당화 단백질 함유 시료를 단백질 분해효소로 처리하고, 유리된 당화 펩티드 또는 당화 아미노산에 대응하는 옥시다제를 작용시켜 생성되는 과산화수소를 퍼옥시다제 및 피산화성 정색시약을 이용하여 측정하는 방법에 있어서, 이 옥시다제 작용 전의 반응액을 pH 1∼5로 조정하는 것을 특징으로 하는 당화 단백질, 당화 펩티드 또는 당화 아미노산의 측정 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한, 적어도 (1)당화 펩티드 또는 당화 아미노산에 작용하여 과산화수소를 생성하는 옥시다제, (2) 반응액을 pH 1∼5로 조정하기 위한 용액 및 (3) 퍼옥시다제를 함유하는 당화 단백질, 당화 펩티드 또는 당화 아미노산 측정용 시약을 제공하는 것이다.

본 발명에 의하면, 단백질 분해효소의 분해작용을 제어하여 당화 단백질, 당화 펩티드 또는 당화 아미노산을 정밀도 좋게 측정할 수 있다. 본 발명의 측정 방법은 간편하기 때문에, 임상 검사의 분야에서 극히 유용하다.

도 1은 산성 시약에 트리톤 X-100을 첨가했을 경우의 헤모글로빈 농도 측정의 결과(실시예 3)를 나타내는 도이다.

도 2는 산성 시약에 EMAL 20C(EMAL 20C)를 첨가했을 경우의 헤모글로빈 농도 측정 결과(실시예 3)를 나타내는 도이다.

도 3은 산성 시약에 계면활성제를 첨가하지 않은 경우의 헤모글로빈 농도 측정의 결과(비교예 3)를 나타내는 도이다.

도 4는 본 발명에 의한 HbAlc치와 "Rapidia HbAlc"에 의한 HbAlc 치와의 상관성(실시예 4)을 나타내는 도이다.

도 5는 본 발명에 의한 HbAlc치과 "Rapidia HbAlc"에 의한 HbAlc치와의 상관성(실시예 4)을 나타내는 도이다.

도 6은 본 발명에 의한 HbAlc치와 "Rapidia HbAlc"에 의한 HbAlc치와의 상관성(실시예 5)을 나타내는 도이다.

도 7은 본 발명에 의한 HbAlc치와 "Rapidia HbAlc에 의한 HbAlc치와의 상관성(실시예 6)을 나타내는 도이다.

[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]

본 발명에 있어서의 당화 단백질은 전술한 바와 같이, 단백질이 글루코오스 등의 알도오즈와 비효소적으로 결합하여 생성한 것이면 어떤 것이라도 좋다. 예를 들면, 생체 유래의 당화 단백질로서 당화 알부민, 당화 헤모글로빈 등이 있으며, 본 발명은 예를 들면, 헤모글로빈 Alc(HbAlc)의 측정에 매우 적합하게 이용된다.

당화 단백질을 함유하는 시료로서는 전혈, 혈구, 혈청, 혈장, 골수액, 땀, 오줌, 눈물, 침, 피부, 점막, 모발 등의 생체 시료를 들 수 있다. 또, 당화 단백질은 주스, 조미료 등의 식품 일반적으로도 함유되어 있다. 이들 시료 중, 전혈, 혈구, 혈청, 혈중이 바람직하다. 이들 시료는 그대로 또는 여과나 투석 처리한 후에 측정에 제공해도 좋고, 또 측정해야할 당화 단백질을 적당히 농축, 추출, 또는 물이나 완충액에 희석해도 괜찮다.

본 발명에서는 먼저, 당화 단백질을 함유하는 시료에 단백질 분해효소를 작용시켜 당화 펩티드(예를 들면, 푸락토실 펩티드 등), 당화 아미노산(예를 들면, 푸락토실 아미노산 등)을 유리시킨다. 생체 시료나 식품 중에는 단백질 분해효소를 작용시키기 전에 이미 당화 단백질이 분해되어 유리된 펩티드나 아미노산에, 글루코오스가 결합한 후, 아마도리 전이를 거쳐 생성된 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산도 포함되어 있으나, 이들도 유리된 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산에 포함된다.

단백질 분해효소로서는 단백질 분해활성, 펩티드 분해활성을 가지고 있으면 특히 제한되지 않지만, 당화 단백질로부터 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산을 단시간에 효율적으로 유리시키는 것이 보다 바람직하다. 특히, 당화 단백질이 HbAlc인 경우에는 푸락토실 바릴 펩티드 또는 푸락토실 바릴 히스티딘을 유리시키는 것이 바람직하고, 푸락토실 바릴 히스티딘을 유리시키는 것이 특히 바람직하다.

푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산을 유리시키는 단백질 분해효소로서는 바실러스속, 아스페르길러스속 또는 스트렙토마이세스속의 미생물 유래, 동물유래, 식물유래 등의 것을 들 수 있다. 또한, 메타로프로테이나제, 중성 프로테아제 또는 알칼리성 프로테아제에 속하는 것, 전기 미생물의 유전자를 재조합 조작하여 얻어지는 것도 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 화학 수식의 유무도 묻지 않는다.

이러한 단백질 분해효소로서는 예를 들면, 프로테이나제 K, 트립신, 파파인, 프로나제 등 연구 용도의 시판품으로서 용이하게 입수할 수 있는 것, 뉴트럴 프로테아제, 토요짐 NEP(이상, Toyobo Co., Ltd.제), 스미짐 LP, 스미짐 FP, 스미짐 MP(이상, Shin Nihon Chemical Co., Ltd.제), 써모아제 P, 프로틴 A, 프로틴 p(이상, Daiwa Kasei K. K.제), Actinase AS, Actinase PF, Actinase E(Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.제), 우마미자임, 프로테아제 S, "아마노" G, 프로테아제 A "아마노" G, 프로테아제 P "아마노" 3G(이상, Amano Enzyme Inc.제) 등 공업용으로서 시판되고 있는 것을 들 수 있다. 상기 단백질 분해효소는 단독으로 사용해도, 또는 2종 이상을 조합하여 사용해도 괜찮다.

상기 단백질 분해효소 중, 스트렙토마이세스·그리세우스(Streptomyces griseus) 유래의 것은 푸락토실 바릴 히스티딘을 단독으로 효율적으로 유리시키기 때문에, 특히 바람직하다. 스트렙토마이세스·그리세우스 유래의 단백질 분해효소로서는 구체적으로는 Actinase AS, Actinase AF, Actinase E(모두 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.제), 프로나제 E(Calbiochem-Novabiochem제, Sigma제) 등 을 들 수 있다. 또한, 바실러스속 유래의 단백질 분해효소도 바람직하고, 구체적으로는 프로틴 PC10F(Daiwa Kasei K. K.제), 토요짐(Toyobo Co., Ltd.제) 등을 들 수 있다.

더욱이, 전기 단백질 분해효소는 바람직한 pH가 5.5∼10, 즉, pH 1∼5의 분해활성이 pH 5.5∼10에서의 분해활성과 비교하여 낮은 것이 바람직하다. 단백질 분해효소의 활성은 카제인을 기질로 하는 방법이나 단백질 분해효소를 당화 펩티드 등에 작용시키고, 그의 전후의 시료를 캐피러리 전기 영동법으로 비교함으로써 확인할 수 있다.

시료의 처리 조건은 이용하는 단백질 분해효소가 측정 대상이 되는 당화 단백질에 작용하여, 당화 펩티드나 당화 아미노산을 단시간에 효율적으로 유리될 수 있는 조건이면, 어떤 조건이라도 좋다. 이용되는 단백질 분해효소의 농도는 시료 중의 당화 단백질의 양이나 처리 조건 등에 의해 적의 선택할 수 있으나, 일례로서 스트렙토마이세스·그리세우스 유래의 단백질 분해효소(예를 들면, Actinase E, Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.제)를 0.0001∼500 mg/mL, 바람직하기로는 0.001∼300mg/mL를 첨가한다.

단백질 분해효소로 처리할 때의 pH는 특히 제한되지 않지만, 사용하는 효소에 대해서 최적이 되도록 적당한 pH 조정제, 예를 들면 완충액에 의해 pH 5.5∼10으로 조정할 수 있다. 완충액으로서는 특히 제한은 없고, 인산, 프탈산, 시트르산, 트리스, 말레인산, 숙신산, 타르타르산, 옥살산, 아세트산, 붕산, 굿의 완충액 등을 들 수 있다. 완충액의 농도도 특히 제한은 없지만, 0.00001∼2 mol/L가 바람직 하고, 0.001∼1 mol/L가 특히 바람직하다. 처리 온도는 10∼40℃가 바람직하다. 얻어진 처리액은, 그대로 또는 필요에 따라 적당히 가열, 원심분리, 농축, 희석 등을 해도 좋다.

본 발명의 측정 방법에서는 당화 펩티드 특이 효소 또는 당화 아미노산 특이 효소(당화펩티드 또는 당화 아미노산에 작용해 과산화수소를 생성하는 옥시다제이며, 이하 "과산화수소 생성 옥시다제"라 한다.)를 작용시키기 전의 반응액을 pH 1∼5로 조정한다. 특히 바람직하기로는 pH 1∼4이다. pH 1∼5로 조정함으로써, 과산화수소 생성 옥시다제에 대한 단백질 분해효소의 분해작용을 제어할 수 있다. 본 명세서에 있어서, "과산화수소 생성 옥시다제 작용 전의 반응액"이란, 시료를 단백질 분해효소로 처리하여 얻어진 반응액을 의미하지만, 단백질 분해효소에 의한 처리전의 시료 용액과 처리 후의 반응액을 포함한 반응액이라도 좋다. 따라서, 후자의 경우에는 단백질 분해효소 처리전의 시료 용액을 pH 1∼5로 조정한 후, 처리 중, 처리 후에 있어서도 해 pH가 유지되고 있는 것이 필요하다. 처리 전부터 시료 용액의 pH를 1∼5로 조정하는 경우에는 단백질 분해효소의 사용량이나 처리 시간을 늘려도 좋다.

pH의 조정제로서는 산성 pH 조건으로 할 수 있는 것이면 특히 제한되지 않으며, 염산, 질산, 황산, 인산 등의 무기산, 글리신, 프탈산, 말레인산, 시트르산, 타르타르산, 옥살산, 숙신산, 아세트산, 젖산 등의 유기산을 사용할 수 있다. 무기산 또는 유기산의 농도는 특히 제한되지 않는다. 과산화수소 생성 옥시다제, 작용 전의 반응액을 pH 1∼5로 하고, 다시 과산화수소 생성 옥시다제의 반응 시에 pH 4 ∼9로 조정할 수 있는 농도이면 좋고, 0.0001∼1000 mM이 바람직하다.

과산화수소 생성 옥시다제 작용 전의 반응액에는 폴리옥시에틸렌 구조를 가지는 비이온계 계면활성제 또는 음이온계 계면활성제를 첨가해도 좋다. 이들 계면활성제를 당화 단백질 함유 시료 또는 단백질 분해효소에 의한 처리 후의 반응액에 첨가함으로써, 적혈구로부터 헤모글로빈을 꺼내 반응에 제공하기 위한 전처리로서 사용할 수 있을 뿐만이 아니고, 시약 또는 시료 유래의 탁도의 발생을 억제할 수 있다

비이온계 계면활성제로서는 폴리옥시에틸렌 알킬에테르류, 폴리옥시에틸렌 알킬페닐에테르류, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 축합물류, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 다환형 계면활성제 등을 들 수 있으며, 폴리옥시에틸렌 알킬페닐에테르류가 바람직하다. 음이온계 계면활성제로서는 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 황산염류, 폴리옥시에틸렌 알킬페닐에테르 황산염류, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 인산류, 폴리옥시에틸렌 알킬술포숙신산류, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르카르복실산염류, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르술폰산염류 등을 들 수 있으며, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 인산류, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 황산염류 또는 알킬술포숙신산류, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 황산염류가 바람직하고, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 황산염류가 특히 바람직하다.

계면활성제의 사용량은 과산화수소 생성 옥시다제 작용 전의 반응액중, 0.0001∼10%가 바람직하고, 특히 0.001∼10%가 바람직하다.

pH 1∼5로 조정된 반응액에는 다시, 과산화수소에 퍼옥시다제와 함께 작용시켜 색소를 생성시키는 피산화성 정색시약을 첨가할 수 있다. pH 1∼5의 용액 중에서는 이 피산화성 정색시약의 안정성이 높고, 경시적으로 나타내는 비특이적인 발색이 억제된다. 피산화성 정색시약으로서는 과산화수소와 반응하여 정색하는 것이면 어떤 것이라도 좋다. 예를 들면, 4-아미노안티피린과 3-메틸-2-벤조티아졸리논히드라존 등의 커플러와 아닐린계 화합물과의 조합, 로이코 색소 등을 들 수 있으며, 그 중에서도 로이코 색소가 바람직하다.

로이코 색소로서는 특히 제한은 없지만, 트리페닐메탄 유도체, 페노티아진 유도체, 디페닐아민 유도체 등을 사용할 수 있다. 트리페닐메탄 유도체로서는 일본국 특허공개 평3-206896호 공보, 일본국 특허공개 평6-197795호 공보 등에 기재의 수용성이 높은 화합물, 페노티아진 유도체로서는 일본국 특허공고 소60-33479호 공보에 기재의 화합물, 디페닐아민 유도체로서는 일본국 특허공고 소60-33479호 공보, 일본국 특허공개 소62-93261호 공보 등에 기재된 화합물을 사용할 수 있다. 이들 중에서, 로이코말라카이트 그린, 로이코크리스탈 바이오렛, N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 나트륨염(DA-64; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.제), 10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진 나트륨염(DA-67: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.제), 10-(N-메틸카르바모일)-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진(MCDP: Dojindo Laboratories제), N,N,N',N',N",N"-헥사-(3-술포프로필)-4,4',4"-트리아미노트리페닐메탄(TPM-PS: Dojindo Laboratories제) 등이 바람직하고, TPM-PS, DA-64, DA-67 또는 MCDP가 보다 바람직하고, TPM-PS 또는 MCDP가 특히 바람직하다. 로이코 색소는 통상, 용액 중에서는 보존 안정성이 낮으나, pH 1∼5의 용액 중에서는 장기간 안정하다.

그 이외, 디아미노벤지딘, 히드록시페닐프로피온산, 테트라메틸벤지딘, 오르토페닐렌디아민 등이 사용할 수 있다.

단백질 분해효소의 처리에 의해 유리된 당화 펩티드 또는 당화 아미노산은 이들에 과산화수소 생성 옥시다제를 반응시켜, 생성한 과산화수소를 측정함으로서 측정할 수 있다.

이러한 과산화수소 생성 옥시다제로서는 푸락토실 펩티드 등의 당화펩티드 또는 푸락토실 아미노산 등의 당화 아미노산을 대사할 수 있는 것이면 특히 제한되지 않고, 미생물 유래, 동물 유래, 식물유래 등의 어느 것이라도 좋고, 또한 이 미생물의 유전자 재조합에 의해 생산되는 것이어도 좋다. 또, 화학 수식의 유무도 묻지 않는다. 구체적으로는 푸락토실 아미노산옥시다제(일본국 특허공개 2003-79386호 공보 및 국제 공개 제 97/20039호 팜플렛), 케타민옥시다제(일본국 특허공개 평5-192193호 공보), 푸락토실 펩티드 옥시다제(일본국 특허공개 2001-95598호 공보 및 일본국 특허공개 2003-235585호 공보) 등을 들 수 있으며, 푸락토실 펩티드옥시다제가 특히 바람직하다. 푸락토실 펩티드옥시다제로서는 코리네박테리움 속균이 생산하는 푸락토실 아미노산옥시다제를 개변한 효소(일본국 특허공개 2001-95598호 공보), 사상균 유래의 푸락토실 펩티드옥시다제(일본국 특허공개 2003-235585호 공보) 등을 들 수 있다. FPOX-CE 또는 FPOX-EE(모두 Kikkoman Corporation제)가 특 히 매우 적합하다. 이들 과산화수소 생성 옥시다제는 용액 상태에서도, 건조 상태에서도 좋고, 불용성 담체에 유지 또는 결합되고 있어도 좋고, 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.

과산화수소 생성 옥시다제의 사용량은 효소의 종류에 따라 다르나, 0.001∼1000 단위/mL가 바람직하고, 특히 0.1∼500 단위/mL가 바람직하다. 작용시킬 때의 pH는 사용하는 효소의 최적 pH를 고려하여 pH 4∼9가 되도록 완충액을 이용해 조정한다. 작용 온도는 통상의 효소 반응에 이용되는 온도이고, 10∼40℃가 바람직하다. 완충액으로서는 전술한 것을 사용할 수 있다. 완충액의 농도도 특히 제한되지 않지만, 0.00001∼2 mol/L이 바람직하고, 0.001∼1 mol/L이 특히 바람직하다.

상기 옥시다제는 필요에 따라, 다른 효소, 조효소 등을 조합하여 사용할 수 있다. 다른 효소로서는 디아포라제, 또는 푸락토실 바린을 기질로 하지 않는 아미노산 대사 효소 등을 들 수 있으며, 아스코르빈산 옥시다제, 빌리루빈옥시다제 등의 혈액 중의 협잡 성분을 처리하기 위한 효소도 사용할 수 있다. 조효소로서는, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 환원형(NADH), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드산(NADP), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 환원형 인산(NADPH), 티오 NAD, 티오 NADP 등을 들 수 있다.

퍼옥시다제는 서양 고추냉이, 미생물 등 유래의 것을 0.01∼100 단위/mL의 농도로 사용하는 것이 바람직하다.

과산화수소는 퍼옥시다제와 피산화성 정색시약을 이용하는 효소적 방법에 의해, 단시간에 그리고 간편하게 측정할 수 있다. 과산화수소의 측정은 통상, 과산화 수소 생성 옥시다제를 작용시켜 과산화수소를 발생시키는 공정에 연속하여 행해지지만, 과산화수소의 측정 용액은 전기 기재의 완충액을 이용하여 pH 4∼9로 조정하는 것이 바람직하다. 발색 정도(흡광도 변화량)는 분광 광도계에 의해 측정하고, 표준으로 하는 농도 기존의 당화 펩티드, 당화 아미노산 등의 흡광도와 비교하여, 시료중의 당화 단백질, 당화 펩티드 또는 당화 아미노산을 측정할 수 있다. 측정에는 통상의 자동 분석장치를 이용할 수 있다.

본 발명의 당화 단백질 측정용 시약은 적어도 (1) 당화 펩티드 또는 당화 아미노산에 작용하여 과산화수소를 생성하는 옥시다제, (2) 반응액을 pH 1∼5로 조정하기 위한 용액 및 (3) 퍼옥시다제를 포함한다. 각각의 성분의 구체적 내용에 대해서는 전술한 바와 같다. 여기서, 상기 (2)의 "pH 1∼5 로 조정하기 위한 용액"이란, 전기 기재의 pH 조정제에 의해 조정된 용액을 의미하여, 또한, "반응액"이란, 시료를 단백질 분해효소로 처리해 얻어진 반응액을 의미하지만, 단백질 분해효소에 의한 처리 전의 시료 용액과 처리 후의 반응액을 포함한 반응액이라도 좋다.

본 발명의 당화 단백질 측정용 시약에는 더욱 단백질 분해효소를 포함해도 좋다. 또한, 그 이외, 혈액 중의 협잡성분을 처리하는 효소; 반응 조정제; 안정화제; 알부민 등의 단백질류; 염화나트륨, 염화칼륨, 페로시안화칼륨 등의 염; 리진, 알라닌, 아스파라긴산, 글루타민산 등의 아미노산, 펩티드, 폴리아미노산류; 환원성 물질의 영향 회피를 위한 테트라졸륨염; 항생물질, 아지화나트륨, 붕산 등의 방부제; 양이온성 계면활성제 등도 첨가할 수 있다.

본 발명의 당화 단백질 측정용 시약은 용액 상태뿐만 아니라, 건조 상태나 겔 상태로 제공할 수 있다. 또한, 유리병, 플라스틱 용기 등에 충전 이외, 불용성 담체에의 도포, 합침 등의 형태로 제공할 수 있다. 용액 상태로 장기 보존하는 경우에는 일반적으로는 보존 용기를 차광하는 것이 바람직하다.

실시예

이하 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]단백질 분해효소의 제어 효과

(1) 시료의 조제

단백질 분해효소(Actinase E, Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.제)를 0, 1, 5, 10 mg/mL가 되도록 정제수에 녹여 시료로 했다.

(2) 측정

<제1 시약>

3 μM 푸락토실 바린

20 μM TPM-PS(N, N, N', N', N", N"-헥사-(3-술포프로필)-4,4', 4"-트리아미노트리페닐메탄, Dojindo Laboratories제)

10 mM 말레인산액(pH 3)

<제 ２시약>

4 단위/mL 푸락토실 펩티드 산화 효소(FPOX-CE, Kikkoman Corporation제)

20 단위/mL POD(Toyobo Co., Ltd.제)

200 mM 시트르산 완충액(pH 6)

각 시료 20 μL에 제 1시약 240 μL를 가하고, 37℃에서 5분간 가온한 후, 제 ２시약을 80 μL를 가하고, 37℃에서 5분간 가온한 후, 히타치 7150형 자동 분석장치를 이용하여 파장 600 nm에서 흡광도를 측정했다. 시료 중의 단백질 분해효소 농도가 0 mg/mL의 경우의 측정치를 100으로 하여 흡광도의 변화량의 상대치를 구했다. 결과를 표 1에 나타낸다.

[비교예 1]

제 1시약의 말레인산액을 0.1 N 수산화나트륨 액을 이용하여 pH 7로 조정한 이외는 실시예 1과 동일하게 흡광도를 측정했다.

[표 1]

시료 중의 Actinase E 농도(mg/mL)	실시예 1	비교예 1
0	100.0	100.0
1	95.6	91.4
5	78.5	71.2
10	71.4	54.9

표 1로부터 명백한 바와 같이, 제 1반응을 pH 1∼5로 행한 경우에는 단백질 분해효소에 의한 FPOX-CE나 POD의 분해가 억제되는 것이 확인되었다.

[실시예 2]당화 헤모글로빈의 측정

<용혈 시약>

2% EMAL 20C^*(Kao Corporation제)

1mg/mL Actinase E(Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.제)

20mM HEPES (2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산) 완충액(pH 8).

* EMAL 20C: 폴리옥시에틸렌(3) 라우릴에테르 황산나트륨

<산성 시약>

0.1% 트리톤 X-100

20 μM TPM-PS(Dojindo Laboratories제)

0.05% 아지화나트륨

5mM 말레인산액(pH 2.8)

<효소 시약>

20 단위/mL POD(Toyobo Co., Ltd.제)

4 단위/ mL FPOX-CE(Kikkoman Corporation제)

200 mM 시트르산 완충액(pH 6)

(1) 용혈 시료의 조제

시판 킷 "Rapidia HbA1c"(Fujirebio Inc.제)에 의해 HbA1c 농도 기존의 사람 혈구를 시료로서 이용하여 시료 10 μL에 용혈 시약 300 μL를 가하여 용혈시료로 했다.

(2) 측정

용혈 시료 20 μL에 산성 시약 240 μL를 가하고, 37℃에서 5분간 가온한 후, 파장 600nm의 흡광도를 측정하고, 다시 이 반응액에 효소 시약 80 μL를 가하고 37℃에서 5분간 반응시키고, 파장 600 nm의 흡광도 변화량을 측정했다. 결과를 표 2에 나타낸다.

[비교예 2]

산성 시약 대신에 아래와 같은 중성 시약을 이용하는 이외는 실시예 2와 동일하게 했다.

<중성 시약>

0.1% 트리톤 X-100

20 μM TPM-PS(Dojindo Laboratories제)

0.05% 아지화나트륨

5mM 말레인산액(pH 7)

[표 2]

사람 혈구시료의 HbAlc(%)	실시예 (mOD)	비교예 (mOD)
6.5	23.8	22.4
5.9	21.7	13.2
5.7	24.7	14.1
5.2	15.7	10.5
5.3	16.9	8.7
5.1	15.2	10.3
4.8	16.6	8.3
4.4	11.8	3.6
3.7	9.7	6.7
평균	17.3	10.9
상관계수	0.92	0.88

표 2로부터 명백한 바와 같이, 실시예 2의 측정값은 비교예 2보다 높고, 기존 농도와의 상관계수도 비교예 2보다 크고, 단백질 분해효소에 의한 시약중의 다른 효소에의 영향이 경감되어 있는 것을 알았다.

[실시예 3] 헤모글로빈 농도의 측정

(1) 시료의 조제

10 μL의 사람 혈구액에 200 μL의 1% EMAL 20C를 가하여 혼합하여 용혈시키 고, 이것을 다시 1% EMAL 20C 액으로 5단계 희석하여 시료로 했다.

(2) 측정

시료 20 μL에 50 mM 시트르산 완충액으로 이루어진 시약을 240 μL 가하고, 37℃에서 5분간 가온 후, 파장 600 nm의 흡광도를 측정했다. 또, 시트르산 완충액으로 하여 pH를 3, 4, 5로 각각 조정하고, 이것에 계면활성제로서 0.5% 트리톤 X-100 또는 1% EMAL 20C를 첨가한 것을 조제했다. 결과를 도 1, 2에 나타낸다.

[비교예 3]

계면활성제를 제외한 이외는 실시예 3과 동일하게 했다. 결과를 도 3 에 나타낸다.

도 1∼3으로부터 명백한 바와 같이, 시트르산 완충액에 계면활성제를 첨가한 경우에는 헤모글로빈 농도의존적인 흡광도 변화가 인정되었다. 한편, 계면활성제를 첨가하지 않은 경우에는 사람 혈구 용혈 시료와 산성 시약과의 혼합에 의한 탁도 때문에, 단계 희석에 따른 흡광도를 얻을 수 없었다.

[실시예 4] HbA1c 농도의 측정

<용혈 시약 1>

2% EMAL 20C(Kao Corporation제)

1 mg/mL Actinase E(Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.제)

20 mM HEPES 완충액(pH 8)

<용혈 시약 2>

2% EMAL 20C(Kao Corporation제)

1 mg/mL Actinase E(Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.제)

260 μM TPM-PS(Dojindo Laboratories제)

20 mM HEPES(pH 8)

<산성 시약 1>

0.1% 트리톤 X-100

20 μM TPM-PS(Dojindo Laboratories제)

5 mM 말레인산액(pH3)

<산성 시약 2>

0.1% 트리톤 X-100

5 mM 말레인산액(pH3)

<효소 시약>

20 단위/mL POD(Toyobo Co., Ltd.제)

3 단위/mL FPOX-CE(Kikkoman Corporation제)

200 mM 시트르산 완충액(pH 6)

(1) 용혈 시료의 조제

사람 혈구 시료 10예를 이용하여, 각 혈구 시료 10 μL에 용혈 시약 1 또는 용혈 시약 2를 300 μL 가하여 용혈 시료를 각각 조제했다. 또, 다음의 측정은 용혈 시료의 조제에 있어서 용혈 시약 1을 이용했을 경우는 산성 시약 1을 (A), 및 동일하게 용혈 시약 2를 이용했을 경우는 산성 시약 2를 (B) 이용해 실시했다.

(2) 측정

용혈 시료 20 μL 산성 시약 240 μL를 가하고, 37℃에서 5 분간 가온한 후, 파장 600 nm의 흡광도를 측정하여 헤모글로빈 농도에 의존한 측정값(samp Hb)을 구했다. 또, 이 반응액에 효소 시약 80 μL를 가하고, 37℃에서 5분간 반응시켰다. 파장 600nm의 흡광도 변화량을 측정하고, HbAlc 농도에 의존한 측정값(samp A1)을 구하고, 이들과 HbA1c 농도(%) 기존 시료를 이용하여 동일하게 조작했을 경우의 헤모글로빈 농도에 의존한 측정값(std Hb)과 HbA1c 농도에 의존한 측정값(std A1)으로부터, 하기식에 의해 HbAlc치(%)를 산출했다.

HbAlc(%) =std HbA1 × (std Hb/std A1) × (samp A1/samp Hb)

(std HbA1; HbAlc 농도 기지 시료의 HbAlc(%) 값)

면역학적 측정 방법에 의해 시판 킷 "Rapidia HbAlc"(Fujirebio Inc.제)에 의해 측정한 HbA1c값(%)(참조예)와의 상관성을 도 4, 도 5에 나타낸다.

도 4, 도 5로부터 명백한 바와 같이, 본 발명 법은 Rapidia HbAlc와 양호한 상관성을 나타낸다.

[실시예 5] HbAlc 농도의 측정

<용혈 시약>

2% EMAL 20C(Kao Corporation제)

1 mg/mL Actinase E(Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.제)

20 mM HEPES(pH 8)

<산성 시약>

0.1% 트리톤 X-100

20 μM MCDP(10-(N-메틸카르바모일)-3,7-비스(디메틸아미노)-10H 페노티아진, Dojindo Laboratories제)

10 mM 말레인산액(pH 3)

<효소 시약>

20 단위/mL POD(Toyobo Co., Ltd.제)

4 단위/mL FPOX-CE(Kikkoman Corporation제)

200 mM 시트르산 완충액(pH 6)

(1) 용혈 시료의 조제

사람 혈구 시료 10 μL에 용혈 시약 300 μL를 가하여 용혈 시료를 조제했다.

(2) 측정

용혈 시료 10 μL 산성 시약 240 μL를 가하고, 37℃에서 5분간 가온한 후, 파장 600 nm의 흡광도를 측정하여 헤모글로빈 농도에 의존한 측정값을 구했다. 또, 본 반응액에 효소 시약 80 μL를 가하고 37℃에서 5분간 반응시키고, 파장 600 nm의 흡광도 변화량을 측정하여 HbA1c 농도에 의존한 측정값을 구하고, 실시예 4와 동일하게 HbA1c값(%)을 산출했다. "Rapidia HbA1c"(Fujirebio Inc.제)에 의해 측정한 HbA1c값(%)과의 상관성을 도 6에 나타낸다.

도 6으로부터 명백한 바와 같이, 본 발명 법은 Rapidia HbA1c와 양호한 상관성을 나타냈다.

[실시예 6] HbA1c 농도의 측정

<용혈 시약>

2% EMAL 20C(Kao Corporation제)

10 mg/mL 프로틴 PC10F(Daiwa Kasei K. K.제)

20 mM HEPES(pH 8)

<산성 시약>

0.1% 트리톤 X-100

20 μM TPM-PS(Dojindo Laboratories제)

10 mM 말레인산액(pH 3)

<효소 시약>

20 단위/mL POD(Toyobo Co., Ltd.제)

3 단위/mL FPOX-CE(Kikkoman Corporation제)

200 mM 시트르산 완충액(pH 6)

(1) 용혈 시료의 조제

(2) 측정

용혈 시료 10 μL에 산성 시약 240 μL를 가하고, 37℃에서 5분간 가온한 후, 파장 600nm의 흡광도를 측정하여 헤모글로빈 농도에 의존한 측정값을 구했다. 또, 본 반응액에 효소 시약 80 μL를 가하고, 37℃에서 5분간 반응시키고, 파장 600nm의 흡광도 변화량을 측정하여 HbA1c 농도에 의존한 측정값을 구하고, 실시예 4와 동일하게 HbA1c값(%)을 산출했다. "Rapidia HbA1c"(Fujirebio Inc.제)에 의해 측정한 HbA1c값(%)(참조예)와의 상관성을 도 7에 나타낸다.

도 7로부터 명백한 바와 같이, 본 발명 법은 Rapidia HbA1c와 양호한 상관성을 나타냈다.

[실시예 7] TPM-PS의 안정화-1

하기 각 수용액에 TPM-PS의 농도가 60 μM가 되도록 용해한 후, 37℃로 보존하고, 파장 600 nm에서의 흡광도를 측정했다. 표 3에, 0시간 후, 2주간 후, 3주간 후의 흡광도를 나타낸다.

[표 3]

수용액	0시간 후	22주간 후	3주간 후
20mM PB-K(pH 8)	0.023	0.132	0.215
5 mM 타르타르산(pH 2.8)	0.024	0.064	0.088
5 mM 말레인산 (pH 2.5)	0.023	0.050	0.072
5 mM 시트르산(pH 8)	0.022	0.057	0.080

* PB-K: 인산칼륨액

표 3으로부터 명백한 바와 같이, TPM-PS는 pH 1∼5의 수용액 중에서는 비특이적인 발색이 억제되어 안정함을 알았다.

실시예 8 TPM-PS의 안정성-2

하기의 각 수용액에 TPM-PS의 농도가 100 μM가 되도록 용해한 후, 25℃에서 10일간 보존하고, 파장 600nm에서 흡광도를 측정했다. 결과를 표 4에 나타낸다.

[표 4]

	보존액의 pH	10일간의 변화량(OD)
HCl-KCl	1 2	-0.01 0.01
100mM 글리신-HCl	2 3	0.00 -0.01
100mM 시트르산 완충액	3 4 5	-0.01 0.08 0.05
100mM 인산칼륨 완충액	6 7 8	0.22 0.16 0.17
대조(정제수)	미조정	0.22

표 4로부터 명백한 바와 같이, TPM-PS는 pH 1∼5의 수용액중에서는 흡광도의 변화량이 작아 안정한 것을 알았다.

실시예 9 MCDP의 안정성

MCDP를 메탄올에 녹여 4 mM로 한 후, 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 하기 각 수용액에 100 μM가 되도록 용해했다. 37℃에서 24시간 보존하고, 파장 600 nm에서의 흡광도를 측정했다. 결과를 표 5에 나타낸다.

[표 5]

	보존액의 pH	24시간의 변화량(OD)
HCl-KCl	1 2	0.01 0.01
50 mM 글리신-HCl	2 3	0.00 0.00
50 mM 시트르산 완충액	3 4 5	0.01 0.06 0.12
50 mM 인산칼륨 완충액	6 7 8	0.83 1.43 1.51
대조(정제수)	미조정	0.71

표 5로부터 분명한 것 같이, MCDP는 pH l∼5의 수용액 중에서는 흡광도의 변화량이 작고, 비특이적인 발색이 억제되어 안정함을 알았다.

Claims

당화 단백질 함유 시료를 단백질 분해효소로 처리하여 유리된 당화 펩티드 또는 당화 아미노산에 대응하는 옥시다제를 작용시켜, 생성하는 과산화수소를 퍼옥시다제 및 피산화성 정색시약을 이용하여 측정하는 방법에 있어서, 옥시다제 작용 전의 반응액을 pH 1∼5로 조정함을 특징으로 하는 당화 단백질, 당화 펩티드 또는 당화 아미노산의 측정 방법.
제 1항에 있어서, 당화 단백질이 당화 헤모글로빈인 것이 특징인 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단백질 분해효소가 바실러스속, 아스페르길러스속 또는 스트렙토마이세스속 유래 또는 이 미생물의 유전자 재조합에 의해 얻어진 것이고, 그의 최적 pH가 5.5∼10이고, 또한, 단독 또는 복수로 푸락토실 바릴 히스티딘을 유리시킴을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 3항의 어느 1항에 있어서, 단백질 분해효소가 스트렙토마이세스 ·그리세우스(Streptomyces griseus) 유래의 미생물에 의해 얻어진 것이고, 그의 최적 pH가 5.5∼10이고, 더욱이 단독으로 푸락토실 바릴 히스티딘을 유리시키는 것이 특징인 방법.
제 1항 내지 제 4항의 어느 1항에 있어서, 옥시다제 작용 전의 반응액이 폴리옥시에틸렌 구조를 가지는 음이온성계면 활성제 또는 비이온 계면활성제를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법
제 1항 내지 제 5항의 어느 1항에 있어서, pH 1∼5로 조정된 반응액이 피산화성 정색시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 피산화성 정색시약이 트리페닐메탄계, 페노티아진계 및 디페닐아민계로부터 선택된 로이코 색소인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 트리페닐메탄계 로이코 색소가, N,N,N',N',N",N"-헥사-(3-술포프로필)-4,4',4"-트리아미노트리페닐메탄인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 페노티아진계 로이코 색소가 10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진 또는 10-(N-메틸카르바모일)-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 9항의 어느 1항에 있어서, pH의 조정을 염산, 황산, 인산 및 유기산으로부터 선택되는 1종 이상을 이용해 행함을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 유기산이 글리신, 말레인산 또는 시트르산인 것을 특징으로 하는 방법.
적어도 (1) 당화 펩티드 또는 당화 아미노산에 작용하여 과산화수소를 생성하는 옥시다제, (2) 반응액을 pH 1∼5로 조정하기 위한 용액 및 (3) 퍼옥시다제를 포함한 당화 단백질, 당화 펩티드 또는 당화 아미노산 측정용 시약.